KR20210023988A

KR20210023988A - 안티센스 올리고뉴클레오티드를 함유하는 조성물 및 듀시엔형 근이영양증의 치료로의 그의 사용

Info

Publication number: KR20210023988A
Application number: KR1020217001037A
Authority: KR
Inventors: 도모노리 우노; 다카시 나츠카와; 요우이치 에가와; 요우헤이 사토우
Original assignee: 니뽄 신야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2018-06-26
Filing date: 2019-06-26
Publication date: 2021-03-04
Also published as: IL279692A; JP2023171731A; PE20210630A1; US20210261963A1; US20240158792A1; ZA202007682B; CO2020015685A2; JPWO2020004675A1; BR112020026542A2; EP3815696A1; ECSP20083454A; CN112399849A; WO2020004675A1; PH12020552078A1; TW202035692A; CL2020003367A1; AU2019293687A1; SG11202011554PA; JP7345466B2; CA3101321A1

Abstract

본 발명은 안티올리고뉴클레오티드를 함유하는 조성물 및 듀시엔형 근이영양증을 치료하기 위한 그 사용에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 처치의 투여량으로 투여한 경우에 듀시엔형 근이영양증의 치료에 유효한 상기 조성물 및 그의 사용에 관한 것이다.

Description

안티센스 올리고뉴클레오티드를 함유하는 조성물 및 듀시엔형 근이영양증의 치료로의 그의 사용

본 발명은 인간 디스트로핀 유전자의 제53번째 엑손의 스키핑을 가능하게 하는 안티센스 올리고머의 용법 용량 및 그 올리고머를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.

듀시엔형 근이영양증(DMD)은 출생 남자 약 3,500명에 1명이 발증하는 가장 빈도가 높은 유전성 진행성 근위축증이다. 유유아기에는 정상의 인간과 거의 다름없는 운동기능을 나타내지만, 만4∼5세경부터 근력 저하가 보인다. 그 후 근력 저하는 진행되어 만12세경까지 보행 불능이 되고, 20대에서 심부전 또는 호흡기부전에 의해 죽음에 이르는 위중한 질환이다. 현재, DMD에 대한 유효한 치료법은 없어, 새로운 치료약의 개발이 강하게 요구되고 있다.

DMD는 디스트로핀 유전자의 변이가 원인인 것이 알려져 있다. 디스트로핀 유전자는 X염색체에 존재하여, 220만 염기쌍의 DNA로 이루어지는 거대한 유전자이다. DNA로부터 mRNA 전구체로 전사되고, 또한 스플라이싱에 의해 인트론이 제거되어 79의 엑손이 결합한 mRNA가 합성된다. 이 mRNA로부터 3,685의 아미노산으로 번역되어, 디스트로핀 단백질이 생성된다. 디스트로핀 단백질은 근세포의 막 안정성의 유지에 관여하고 있어, 근세포를 파괴시키기 어렵게 하기 위해 필요하다. DMD 환자의 디스트로핀 유전자는 변이를 갖기 때문에, 근세포에 있어서 기능을 갖는 디스트로핀 단백질이 거의 발현되지 않는다. 이 때문에 DMD 환자 체내에서는, 근세포의 구조를 유지할 수 없게 되어, 다량의 칼슘 이온이 근세포 내에 흘러 들어간다. 그 결과, 염증과 비슷한 반응이 생겨, 섬유화가 진행되기 때문에 근세포가 재생되기 어려워진다.

베커형 근이영양증(BMD)도 디스트로핀 유전자의 변이가 원인인데, 그 증상은 근위축에 의한 근력 저하를 나타내지만 일반적으로 DMD과 비교하여 가볍고, 근력 저하의 진행도 느려, 대부분의 경우, 성인기에 발증한다. DMD와 BMD의 임상증상의 차이는, 변이에 의해 디스트로핀의 mRNA가 디스트로핀 단백질로 번역될 때의 아미노산 리딩 프레임이 파괴되거나, 또는 유지되는가에 따른 것으로 생각되고 있다(비특허문헌 1). 즉, DMD에서는, 아미노산 리딩 프레임이 어긋나는 변이를 가짐으로써, 기능을 갖는 디스트로핀 단백질이 거의 발현되지 않지만, BMD에서는 변이에 의해 엑손의 일부는 결실되어 있는데, 아미노산 리딩 프레임은 유지되어 있기 때문에 불완전하면서도 기능을 갖는 디스트로핀 단백질이 생산된다.

DMD의 치료법으로서, 엑손 스키핑법이 기대되고 있다. 이 방법은 스플라이싱을 개변함으로써 디스트로핀의 mRNA의 아미노산 리딩 프레임을 수복하여, 부분적으로 기능을 회복한 디스트로핀 단백질의 발현을 유도하는 방법이다(비특허문헌 2). 엑손 스키핑의 대상이 되는 아미노산 서열부분은 상실되게 된다. 그 때문에 이 치료로 발현되는 디스트로핀 단백질은 정상의 것보다 짧아지는데, 아미노산 리딩 프레임이 유지되기 때문에 근세포를 안정화하는 기능이 부분적으로 유지된다. 따라서, 엑손 스키핑에 의해, DMD는 보다 경증의 BMD와 동일한 증상을 나타내게 될 것으로 기대되고 있다. 엑손 스키핑법은 마우스나 개에 의한 동물실험을 거쳐, 인간 DMD 환자에 대한 임상시험이 행하여지고 있다.

엑손 스키핑은 5' 또는 3' 스플라이스 부위 중 어느 하나 또는 양쪽, 또는 엑손의 내부를 표적으로 하는 안티센스 핵산의 결합에 의해 유도할 수 있다. 엑손은 양쪽 스플라이스 부위가 스플라이소솜 복합체에 의해 인식된 경우만 mRNA에 포함된다. 따라서, 스플라이스 부위를 안티센스 핵산으로 타겟팅함으로써, 엑손 스키핑을 유도할 수 있다. 또한, 엑손이 스플라이싱의 기구에 인식되기 위해서는 엑손 스플라이싱 인핸서(ESE)로의 SR 단백질의 결합이 필요하다고 생각되고 있어, ESE를 타겟팅하는 것으로도 엑손의 스키핑을 유도할 수 있다.

디스트로핀 유전자의 변이는 DMD 환자에 따라 상이하기 때문에, 유전자 변이의 장소나 종류에 따른 안티센스 핵산이 필요해진다. 지금까지, 서오스트레일리아 대학의 Steve Wilton 등에 의해 79개 모든 엑손에 대해 엑손 스키핑을 유도하는 안티센스 핵산이 제작되어 있고(비특허문헌 3), 네덜란드의 Annemieke Aartsma―Rus 등에 의해 39종류의 엑손에 대해 엑손 스키핑을 유도하는 안티센스 핵산이 제작되어 있다(비특허문헌 4).

전체 DMD 환자의 10% 정도는 제53번째의 엑손(이하, 「엑손 53」이라 함)을 스키핑함으로써 치료 가능하다고 생각되고 있다. 최근 들어서는, 디스트로핀 유전자의 엑손 53을 엑손 스키핑의 타겟으로 한 연구에 대해서, 복수의 연구기관으로부터 보고가 이루어져 있다(특허문헌 1∼4；비특허문헌 5 및 6).

국제공개공보 WO 2006／000057 국제공개공보 WO 2004／048570 미국 특허공개공보 US 2010／0168212 국제공개공보 WO 2010／048586

Monaco A. P. et al., Genomics 1988；2：p.90―95 Matsuo M., Brain Dev 1996；18：p.167―172 Wilton S. D. et al., Molecular Therapy 2007：15：p.1288―96 Annemieke Aartsma―Rus et al., (2002) Neuromuscular Disorders 12：S71―S77 Linda J. Popplewell et al., (2010) Neuromuscular Disorders, vol.20, no.2, p.102―10 Bladen C. L. et al., Human Mutation (2015) 36：395―402

발명의 개요

본 발명은 비한정적으로 아래와 같다.

＜1＞

인간 디스트로핀 유전자의 제53번째 엑손의 5' 말단부터 제36∼56번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물을 함유하는, 인간 환자의 듀시엔형 근이영양증을 치료하기 위한 의약 조성물로서,

상기 치료는 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물이 40 ㎎／㎏∼80 ㎎／㎏으로 상기 인간 환자에게 주 1회 정맥 내 투여하는 것을 포함하는, 상기 의약 조성물.

＜2＞

상기 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물이 40 ㎎／㎏으로 상기 인간 환자에게 주 1회 정맥 내 투여되는, 상기 ＜1＞에 기재된 의약 조성물.

＜3＞

상기 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물이 80 ㎎／㎏으로 상기 인간 환자에게 주 1회 정맥 내 투여되는, 상기 ＜1＞에 기재된 의약 조성물.

＜4＞

상기 인간 환자가 디스트로핀 유전자에 엑손 43―52, 45―52, 47―52, 48―52, 49―52, 50―52 또는 52로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 엑손이 결손된 변이를 갖는, 상기 ＜1＞에 기재된 의약 조성물.

＜5＞

상기 인간 환자에게 있어서의 치료 전 디스트로핀 단백질의 발현이 웨스턴 블로팅 또는 질량분석에 의한 측정에서 건강한 정상인의 1% 이하인, 상기 ＜1＞에 기재된 의약 조성물.

＜6＞

상기 인간 환자에게 있어서 치료 전에 디스트로핀 단백질의 발현이 보이지 않는, 상기 ＜5＞에 기재된 의약 조성물.

＜7＞

상기 안티센스 올리고머의 염기부분의 서열이 서열번호 3에 나타내는 서열로 이루어지는, 상기 ＜1＞에 기재된 의약 조성물.

＜8＞

상기 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물이 빌톨라르센(Viltolarsen) 또는 그의 동등품인, 상기 ＜1＞에 기재된 의약 조성물.

＜9＞

상기 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물을 2.5∼500 ㎎／㎖ 또는 10∼100 ㎎／㎖의 농도로 포함하는, 상기 ＜1＞에 기재된 의약 조성물.

＜10＞

상기 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물을 25 ㎎／㎖의 농도로 포함하는, 상기 ＜1＞에 기재된 의약 조성물.

＜11＞

상기 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물을 50 ㎎／㎖의 농도로 포함하는, 상기 ＜1＞에 기재된 의약 조성물.

＜12＞

등장화제, pH 조정제 및 용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 추가로 포함하는, 상기 ＜1＞에 기재된 의약 조성물.

＜13＞

상기 등장화제가 염화나트륨, 염화칼륨, 글루코오스, 프룩토오스, 말토오스, 수크로오스, 락토오스, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 트레할로오스 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 상기 ＜12＞에 기재된 의약 조성물.

＜14＞

상기 pH 조정제가 염산, 수산화나트륨, 구연산, 젖산, 인산염(인산수소나트륨, 인산이수소나트륨, 인산이수소칼륨) 및 모노에탄올아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 상기 ＜12＞ 또는 ＜13＞에 기재된 의약 조성물.

＜15＞

상기 용매가 물인, 상기 ＜12＞ 내지 ＜14＞ 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.

＜16＞

2.5∼500 ㎎／㎖ 또는 10∼100 ㎎／㎖ 농도의 안티센스 올리고머, 8∼10 ㎎／㎖ 농도의 염화나트륨을 포함하고, 또한 pH가 7.2∼7.4의 수용액인, 상기 ＜1＞에 기재된 의약 조성물.

＜17＞

상기 치료에 의해, 아래의 (1)∼(6)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효과가 발생하는, 상기 ＜1＞에 기재된 의약 조성물：

(1) 환자의 골격근에 있어서의 디스트로핀 단백질 발현량의 평균값이 베이스라인과 비교하여, 24주간의 투여 후에 9배 이상으로 증가하는 것；

(2) 일어서기 시간(TTSTAND)으로부터 얻어지는 속도의 변화가 베이스라인과 비교하여, 24주간의 투여 후 25주 시에 －0.055회／초 이상인 것；

(3) 10 미터 주행／보행 시간(TTRW)으로부터 얻어지는 속도의 변화가 베이스라인과 비교하여, 24주간의 투여 후 25주 시에 －0.025 미터／초 이상인 것；

(4) 4단 계단 오르기 시간(TTCLIMB)으로부터 얻어지는 속도의 변화가 베이스라인과 비교하여, 24주간의 투여 후 25주 시에 －0.060회／초 이상인 것；

(5) 노스·스타 보행능력 평가(NSAA)의 스코어 변화가 베이스라인과 비교하여, 24주간의 투여 후 25주 시에 －2.2 스코어 이상인 것；및

(6) 6분간 보행 시험(6MWT)의 변화가 베이스라인과 비교하여, 24주간의 투여 후 25주 시에 －7.5 미터 이상인 것.

＜18＞

만7∼9세의 듀시엔형 근이영양증의 인간 환자에게 상기 치료를 84주간 행한 경우에, 아래의 (1)∼(6)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효과가 발생하는, 상기 ＜1＞에 기재된 의약 조성물：

(1) 치료 개시로부터 제85주까지 일어서기 능력을 상실하는 환자가 20% 미만인 것；

(2) 치료 개시로부터 제85주까지 4단 계단 오르기가 불가능해지는 환자가 10% 미만인 것；

(3) 치료 개시로부터 제85주까지 자립보행능력을 상실하는 환자가 10% 미만인 것；

(4) 치료 개시로부터 제85주까지 10 미터 주행／보행의 속도에 가령에 의한 감소가 보이지 않는 것；

(5) 치료 개시로부터 제85주까지 4단 계단 오르기의 속도에 가령에 의한 감소가 보이지 않는 것；

및

(6) 치료 개시로부터 제85주까지 일어서기의 속도에 가령에 의한 감소가 보이지 않는 것.

＜19＞

만10∼12세의 듀시엔형 근이영양증의 인간 환자에게 상기 치료를 84주간 행한 경우에, 아래의 (1)∼(6)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효과가 발생하는, 상기 ＜1＞에 기재된 의약 조성물：

(1) 치료 개시로부터 제85주까지 일어서기 능력을 상실하는 환자가 60% 미만인 것；

(2) 치료 개시로부터 제85주까지 4단 계단 오르기가 불가능해지는 환자가 50% 미만인 것；

(3) 치료 개시로부터 제85주까지 자립보행능력을 상실하는 환자가 50% 미만인 것；

및

(4) 치료 개시로부터 제85주까지 10 미터 주행／보행의 속도에 가령에 의한 감소가 보이지 않는 것.

(5) 치료 개시로부터 제85주까지 4단 계단 오르기의 속도가 증가하는 시기가 보이는 것；

및

(6) 치료 개시로부터 제85주까지 일어서기의 속도가 증가하는 시기가 보이는 것.

＜20＞

인간 디스트로핀 유전자의 제53번째 엑손의 5' 말단부터 제36∼56번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 수화물을 함유하는 의약 조성물을,

상기 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물을 40 ㎎／㎏∼80 ㎎／㎏으로 인간 환자에게 주 1회 정맥 내 투여하는 것을 포함하는, 듀시엔형 근이영양증의 치료방법.

＜20―1＞

상기 치료방법에 의해, 청구항 17에 기재된 하나 이상의 효과, 청구항 18에 기재된 하나 이상의 효과 또는 청구항 19에 기재된 하나 이상의 효과가 발생하는, 상기 ＜20＞에 기재된 치료방법.

＜21＞

인간 환자의 듀시엔형 근이영양증의 치료방법에 사용하기 위한 인간 디스트로핀 유전자의 제53번째 엑손의 5' 말단부터 제36∼56번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 수화물로서,

상기 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 수화물이 40 ㎎／㎏∼80 ㎎／㎏으로 상기 인간 환자에게 주 1회 정맥 내 투여되는,

상기 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 수화물.

＜21―1＞

상기 투여에 의해, 청구항 17에 기재된 하나 이상의 효과, 청구항 18에 기재된 하나 이상의 효과 또는 청구항 19에 기재된 하나 이상의 효과가 발생하는, 상기 ＜21＞에 기재된 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 수화물.

＜22＞

인간 환자의 듀시엔형 근이영양증을 치료하기 위한 의약 조성물의 제조를 위한 인간 디스트로핀 유전자의 제53번째 엑손의 5' 말단부터 제36∼56번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 수화물의 사용으로서,

상기 사용.

또한, 다른 태양으로서, 본 발명은 비한정적으로 아래와 같다.

［1］：약 40 ㎎／㎏／주의 용량으로 피험자에게 NS―065／NCNP―01을 정맥 내 투여하는 공정을 포함하는, 엑손 53 스키핑에 의한 치료에 적합한 듀시엔형 근이영양증을 갖는 피험자를 치료하기 위한 방법.

［2］：약 80 ㎎／㎏／주의 용량으로 피험자에게 NS―065／NCNP―01을 정맥 내 투여하는 공정을 포함하는, 엑손 53 스키핑에 의한 치료에 적합한 듀시엔형 근이영양증을 갖는 피험자를 치료하기 위한 방법.

［3］：40 ㎎／㎏／주 이상 80 ㎎／㎏／주 이하의 용량으로 피험자에게 NS―065／NCNP―01을 정맥 내 투여하는 공정을 포함하는, 엑손 53 스키핑에 의한 치료에 적합한 듀시엔형 근이영양증을 갖는 피험자를 치료하기 위한 방법.

［4］：투여되는 것이,

2.5 ㎎／mL 이상 500 ㎎／mL 이하 농도의 NS―065／NCNP―01；및

등장화제로서, 8.55 ㎎／mL 이상 9.45 ㎎／mL 이하 농도의 염화나트륨

을 포함하는 수용액이며,

당해 수용액이 약 7.3의 pH를 갖는, ［1］에 기재된 방법.

［5］：투여되는 것이,

2.5 ㎎／mL 이상 500 ㎎／mL 이하 농도의 NS―065／NCNP―01；및

을 포함하는 수용액이며,

당해 수용액이 약 7.3의 pH를 갖는, ［2］에 기재된 방법.

［6］：투여되는 것이,

2.5 ㎎／mL 이상 500 ㎎／mL 이하 농도의 NS―065／NCNP―01；및

을 포함하는 수용액이며,

당해 수용액이 약 7.3의 pH를 갖는, ［3］에 기재된 방법.

［7］：약 40 ㎎／㎏／주의 용량으로 피험자에게 NS―065／NCNP―01을 정맥 내 투여하는 공정을 포함하는, 엑손 53 스키핑에 의한 치료에 적합한 듀시엔형 근이영양증을 갖는 피험자에 있어서, 디스트로핀 단백질 생산을 유도하기 위한 방법.

［8］：약 80 ㎎／㎏／주의 용량으로 피험자에게 NS―065／NCNP―01을 정맥 내 투여하는 공정을 포함하는, 엑손 53 스키핑에 의한 치료에 적합한 듀시엔형 근이영양증을 갖는 피험자에 있어서, 디스트로핀 단백질 생산을 유도하기 위한 방법.

［9］：40 ㎎／㎏／주 이상 80 ㎎／㎏／주 이하의 용량으로 피험자에게 NS―065／NCNP―01을 정맥 내 투여하는 공정을 포함하는, 엑손 53 스키핑에 의한 치료에 적합한 듀시엔형 근이영양증을 갖는 피험자에 있어서, 디스트로핀 단백질 생산을 유도하기 위한 방법.

［10］：투여되는 것이,

2.5 ㎎／mL 이상 500 ㎎／mL 이하 농도의 NS―065／NCNP―01；및

을 포함하는 수용액이며,

당해 수용액이 약 7.3의 pH를 갖는, ［7］에 기재된 방법.

［11］：투여되는 것이,

2.5 ㎎／mL 이상 500 ㎎／mL 이하 농도의 NS―065／NCNP―01；및

을 포함하는 수용액이며,

당해 수용액이 약 7.3의 pH를 갖는, ［8］에 기재된 방법.

［12］：투여되는 것이,

2.5 ㎎／mL 이상 500 ㎎／mL 이하 농도의 NS―065／NCNP―01；및

을 포함하는 수용액이며,

당해 수용액이 약 7.3의 pH를 갖는, ［9］에 기재된 방법.

상기 ［1］∼［12］에 있어서, NS―065／NCNP―01(본 명세서에 있어서, 「Viltolarsen」이라고도 함)은, 그의 동등품이어도 된다. 또한, 상기 ［1］∼［12］에 있어서, 피험자는 인간 환자여도 된다.

본 발명에 의해, Viltolarsen의 안정한 조성을 갖는, 듀시엔형 근이영양증 치료용 의약 조성물이 제공된다. 또한, Viltolarsen을 포함하는 의약 조성물에 대해, 효과적인 듀시엔형 근이영양증의 치료효과를 나타내며 또한 인간 환자에게 안전한 범위의 Viltolarsen의 용법·용량이 제공된다. 당해 의약 조성물에 의해, 낮은 부작용으로 듀시엔형 근이영양증의 증상을 효과적으로 경감시킬 수 있다.

도 1은 미국 제2상 용량 설정 시험 NS―065／NCNP―01―201의 디자인을 나타내는 도면이다.
도 2는 웨스턴 블롯법을 사용한 골격근에 있어서의 de novo 디스트로핀 단백질 발현량의 측정결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 미국／캐나다 제2상 용량 설정 시험 NS―065／NCNP―01―201의 디자인을 나타내는 도면이다.
도 4는 24주간에 걸친 시간 기능 검사에 있어서의 베이스라인으로부터의 변화의 비교를 나타내는 도면으로, 5개의 그래프에 있어서 「Viltolarsen」은 NS―065／NCNP―01의 국제 일반명(INN)이다.
도 5는 Viltolarsen의 브리톤―로빈손 완충액(pH 3∼11) 중의 안정성 평가결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 Viltolarsen의 인산칼륨―붕사 완충액(pH 6∼9) 중에 있어서의 안정성 평가결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 121℃에 있어서의 pH 조정제의 검토결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 각 운동기능 시험결과의 베이스라인으로부터의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 9는 85주 시(초회 투여로부터 84주 경과)까지의 Viltolarsen 투여군(40 ㎎／㎏ 투여군과 80 ㎎／㎏ 투여군)의 각 피험 환자에 있어서의 6분간 보행 시험결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 85주 시(초회 투여로부터 84주 경과)까지의 Viltolarsen 투여군(40 ㎎／㎏ 투여군과 80 ㎎／㎏ 투여군)의 각 피험 환자에 있어서의 노스·스타 보행능력 테스트의 스코어를 나타내는 그래프이다.
도 11은 85주 시(초회 투여로부터 84주 경과)까지의 Viltolarsen 투여군(40 ㎎／㎏ 투여군과 80 ㎎／㎏ 투여군)의 각 피험 환자에 있어서의 일어서기 시간 시험의 속도결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 85주 시(초회 투여로부터 84주 경과)까지의 Viltolarsen 투여군(40 ㎎／㎏ 투여군과 80 ㎎／㎏ 투여군)의 각 피험 환자에 있어서의 4단 계단 오르기 시간 시험의 속도결과를 나타내는 그래프이다.
도 13은 85주 시(초회 투여로부터 84주 경과)까지의 Viltolarsen 투여군(40 ㎎／㎏ 투여군과 80 ㎎／㎏ 투여군)의 각 피험 환자에 있어서의 10 m 보행／주행 시간 시험의 속도결과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 49주 시(초회 투여로부터 48주 경과)의 Viltolarsen 투여군(40 ㎎／㎏ 투여군과 80 ㎎／㎏ 투여군)의 각 피험 환자에 있어서의 WB에 의한 디스트로핀 정량값의 베이스라인으로부터의 디스트로핀 발현량의 변화와 일어서기 시간 시험의 베이스라인으로부터의 속도변화의 상관을 나타내는 그래프이다.
도 15는 49주 시(초회 투여로부터 48주 경과)의 Viltolarsen 투여군(40 ㎎／㎏ 투여군과 80 ㎎／㎏ 투여군)의 각 피험 환자에 있어서의 WB에 의한 디스트로핀 정량값의 베이스라인으로부터의 디스트로핀 발현량의 변화와 4단 계단 오르기 시간 시험의 베이스라인으로부터의 속도변화의 상관을 나타내는 그래프이다.
도 16은 49주 시(초회 투여로부터 48주 경과)의 Viltolarsen 투여군(40 ㎎／㎏ 투여군과 80 ㎎／㎏ 투여군)의 각 피험 환자에 있어서의 WB에 의한 디스트로핀 정량값의 베이스라인으로부터의 디스트로핀 발현량의 변화와 10 m 보행／주행 시간 시험의 베이스라인으로부터의 속도변화의 상관을 나타내는 그래프이다.

아래에 본 발명을 상세하게 설명한다. 아래의 실시형태는 본 발명을 설명하기 위한 예시로, 본 발명을 이 실시형태만으로 한정하는 취지는 아니다. 본 발명은 그 요지를 일탈하지 않는 한, 다양한 형태로 실시할 수 있다.

또한, 본 명세서에 있어서 인용한 모든 문헌, 및 공개공보, 특허공보 기타 특허문헌은 참조로써 본 명세서에 포함시키는 것으로 한다. 또한, 본 명세서는 2018년 6월 26일에 출원된 이 출원 우선권 주장의 기초가 되는 미국 가특허출원(US62／690,270) 및 2018년 10월 1일에 출원된 이 출원 우선권 주장의 기초가 되는 미국 가특허출원(US62／739,386)의 명세서 및 도면에 기재된 내용을 포함한다.

I. 제1 형태

본 발명은 제1 형태로서, 듀시엔형 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy；DMD)을 치료하기 위한 의약 조성물을 제공한다. 즉, 본 발명의 의약 조성물은 인간 디스트로핀 유전자의 제53번째 엑손의 5' 말단부터 제36∼56번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머(이하, 「본 발명의 올리고머」라고도 함) 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물을 함유하는, 인간 환자의 듀시엔형 근이영양증을 치료하기 위한 의약 조성물로서,

상기 치료는 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물이 40 ㎎／㎏∼80 ㎎／㎏으로 상기 인간 환자에게 주 1회 정맥 내 투여되는 것을 포함하는, 상기 의약 조성물을 제공한다.

［인간 디스트로핀 유전자의 제53번째의 엑손］

본 발명에 있어서, 「유전자」에는 게놈 유전자 이외에, cDNA, mRNA 전구체 및 mRNA도 포함된다. 바람직하게는 유전자는 mRNA 전구체, 즉, pre―mRNA이다.

인간 게놈에 있어서, 인간 디스트로핀 유전자는 유전자좌 Xp21.2에 존재한다. 인간 디스트로핀 유전자는 3.0 Mbp의 사이즈를 가지고 있어, 기지의 인간 유전자로서는 최대의 유전자이다. 단, 인간 디스트로핀 유전자의 코드영역은 겨우 14 kb에 불과하고, 이 코드영역은 79개의 엑손으로서 디스트로핀 유전자 내에 분산되어 있다(Roberts, RG., et al., Genomics, 16：536―538(1993)). 인간 디스트로핀 유전자의 전사물인 pre―mRNA는 스플라이싱을 받아 14 kb의 성숙 mRNA를 생성한다. 인간의 야생형 디스트로핀 유전자의 성숙 mRNA의 염기서열은 공지이다(GenBank Accession No.NM＿004006).

인간의 야생형 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 염기서열을 서열번호 1에 나타낸다.

본 발명의 의약 조성물은 인간 디스트로핀 유전자의 제53번째 엑손의 5' 말단부터 제36∼56번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머(본 발명의 올리고머) 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물을 함유한다.

여기서, 본 발명의 올리고머는 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑에 의해, DMD형 디스트로핀 유전자로 코드되는 단백질을, BMD형 디스트로핀 단백질로 개변하는 것을 목적으로 제작된 것이다. 따라서, 본 발명의 올리고머의 엑손 스키핑의 대상이 되는 디스트로핀 유전자의 엑손 53에는 야생형뿐 아니라, 변이형도 포함된다.

변이형의 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53은 구체적으로는, 서열번호 1의 염기서열에 대해, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 본 명세서 중 「폴리뉴클레오티드」란, DNA 또는 RNA를 의미한다.

또한, 염기서열의 동일성은 카린 및 알츄얼에 의한 알고리즘 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264―2268, 1990；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：5873, 1993)를 사용하여 결정할 수 있다. BLAST의 알고리즘에 기초한 BLASTN이나 BLASTX로 불리는 프로그램이 개발되어 있다(Altschul SF, et al：J Mol Biol 215：403, 1990). BLASTN을 사용하여 염기서열을 해석하는 경우는, 파라미터는 예를 들면 score＝100, wordlength＝12로 한다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용한다.

본 명세서 중 「상보적인 염기서열」이란, 대상이 되는 염기서열과 왓슨―크릭쌍을 형성하는 염기서열에 한정되는 것이 아니라, 동요 염기쌍(Wobble base pair)을 형성하는 염기서열도 포함한다. 여기서, 왓슨―크릭쌍이란, 아데닌―티민, 아데닌―우라실 및 구아닌―시토신 사이에 수소결합이 형성되는 염기쌍을 의미하고, 동요 염기쌍이란, 구아닌―우라실, 이노신―우라실, 이노신―아데닌 및 이노신―시토신 사이에 수소결합이 형성되는 염기쌍을 의미한다. 또한, 「상보적인 염기서열」이란, 대상이 되는 염기서열과 100%의 상보성을 가지고 있지 않아도 되고, 예를 들면 대상이 되는 염기서열에 대해 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 비상보적 염기가 포함되어 있어도 되며, 또한, 대상이 되는 염기서열에 대해 1염기, 2염기, 3염기, 4염기 또는 5염기 짧은 염기서열이어도 된다.

엑손 53의 5' 말단부터 제36∼56번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열(서열번호 2) 및 동 서열에 상보적인 염기서열(서열번호 3)의 예를 아래의 표 1에 나타낸다.

여기서 티민 「T」와 우라실 「U」는 상호 교환 가능하며, 「T」여도 「U」여도 본 발명의 올리고머의 엑손 스키핑 활성에 본질적으로 영향은 발생시키지 않기 때문에, 이 출원에서는 서열번호에 나타내어지는 염기서열의 「T」가 「U」여도 동일 서열번호로 나타내게 된다. 따라서, 이 출원에 개시되는 서열은 필연적으로 「T」의 서열 및 「U」의 서열 양자를 포함한다.

따라서, 본 발명의 올리고머는 그의 염기 부분의 서열이 서열번호 3에 나타내는 서열로 이루어지는 것이어도 된다. 또한, 본 발명의 올리고머는 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑을 가능하게 하는 한, 타겟 서열에 대해 100% 상보적인 염기서열을 가지고 있지 않아도 된다. 예를 들면 본 발명의 올리고머에는, 타겟 서열인 서열번호 2에 대해 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 비상보적 염기가 포함되어 있어도 되고, 또한, 대상이 되는 염기서열에 대해 1염기, 2염기, 3염기, 4염기 또는 5염기 짧은 염기서열이어도 된다.

인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑의 발생 여부는 디스트로핀 발현세포(예를 들면 인간 횡문근육종 세포)에 본 발명의 올리고머를 도입하고, 상기 디스트로핀 발현세포의 total RNA로부터, 인간 디스트로핀 유전자의 mRNA의 엑손 53의 주변영역을 RT―PCR 증폭하여, 이 PCR 증폭산물에 대해 nested PCR 또는 시퀀스 해석을 행함으로써 확인할 수 있다. 또는, 본 발명의 올리고머가 투여된 환자 유래의 샘플에 있어서, RT―PCR, 웨스턴 블롯, 질량분석 등의 수법에 의해, 엑손 53의 양을 측정함으로써도, 스키핑의 발생 여부를 확인할 수 있다.

스키핑 효율은 인간 디스트로핀 유전자의 mRNA를 피검세포로부터 회수하여, 그 mRNA 중 엑손 53이 스킵한 밴드의 폴리뉴클레오티드량 「A」와, 엑손 53이 스킵하지 않은 밴드의 폴리뉴클레오티드량 「B」를 측정하여, 이들 「A」 및 「B」의 측정값을 토대로, 아래의 식에 따라 계산할 수 있다.

스키핑 효율(%)＝A／(A＋B)×100

본 발명의 올리고머로서는, 올리고뉴클레오티드, 모르폴리노 올리고머, 또는 펩티드 핵산(Peptide Nucleic Acid：PNA) 올리고머를 들 수 있다. 본 발명의 올리고머는 모르폴리노 올리고머가 바람직하다.

상기 올리고뉴클레오티드(이하, 「본 발명의 올리고뉴클레오티드」라 함)는 뉴클레오티드를 구성단위로 하는 본 발명의 올리고머로, 이러한 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 수식 뉴클레오티드 중 어느 것이어도 된다.

수식 뉴클레오티드란, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 구성하는 핵산염기, 당부분 및 인산 결합부분의 전부 또는 일부가 수식되어 있는 것을 말한다.

핵산염기로서는, 예를 들면 아데닌, 구아닌, 히포크산틴, 시토신, 티민, 우라실 또는 이들의 수식 염기를 들 수 있다. 이러한 수식 염기로서는, 예를 들면 슈도우라실, 3―메틸우라실, 디히드로우라실, 5―알킬시토신(예를 들면 5―메틸시토신), 5―알킬우라실(예를 들면 5―에틸우라실), 5―할로우라실(5―브로모우라실), 6―아자피리미딘, 6―알킬피리미딘(6―메틸우라실), 2―티오우라실, 4―티오우라실, 4―아세틸시토신, 5―(카르복시히드록시메틸)우라실, 5'―카르복시메틸아미노메틸―2―티오우라실, 5―카르복시메틸아미노메틸우라실, 1―메틸아데닌, 1―메틸히포크산틴, 2,2―디메틸구아닌, 3―메틸시토신, 2―메틸아데닌, 2―메틸구아닌, N6―메틸아데닌, 7―메틸구아닌, 5―메톡시아미노메틸―2―티오우라실, 5―메틸아미노메틸우라실, 5―메틸카르보닐메틸우라실, 5―메틸옥시우라실, 5―메틸―2―티오우라실, 2―메틸티오―N6―이소펜테닐아데닌, 우라실―5―옥시초산, 2―티오시토신, 퓨린, 2,6―디아미노퓨린, 2―아미노퓨린, 이소구아닌, 인돌, 이미다졸, 크산틴 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.

당부분의 수식으로서는, 예를 들면 리보스의 2' 위치의 수식 및 당의 그 밖의 부분의 수식을 들 수 있다. 리보스의 2' 위치의 수식으로서는, 예를 들면 리보스의 2' 위치의 ―OH기를 OR, R, R'OR, SH, SR, NH₂, NHR, NR₂, N₃, CN, F, Cl, Br, I로 치환하는 수식을 들 수 있다. 여기서, R은 알킬 또는 아릴을 나타낸다. R'는 알킬렌을 나타낸다.

당의 그 밖의 부분의 수식으로서는, 예를 들면 리보스 또는 디옥시리보스의 4' 위치의 O를 S로 치환한 것, 당의 2' 위치와 4' 위치를 가교한 것, 예를 들면 LNA(Locked Nucleic Acid) 또는 ENA(2'―O,4'―C―Ethylene―bridged Nucleic Acids) 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.

인산 결합부분의 수식으로서는, 예를 들면 포스포디에스테르 결합을 포스포로티오에이트 결합, 포스포로디티오에이트 결합, 알킬포스포네이트 결합, 포스포로아미데이트 결합, 보라노포스페이트 결합(Enya et al：Bioornic ＆ Medicinal Chemistry, 2008, 18, 9154―9160)으로 치환하는 수식을 들 수 있다(예를 들면 일본국 특허 재공표공보 제2006／129594호 및 제2006／038608호를 참조).

알킬로서는, 직쇄상 또는 분지쇄상의 탄소수 1∼6의 알킬이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면 메틸, 에틸, n―프로필, 이소프로필, n―부틸, 이소부틸, sec―부틸, tert―부틸, n―펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, tert―펜틸, n―헥실, 이소헥실을 들 수 있다. 당해 알킬은 치환되어 있어도 되며, 이러한 치환기로서는, 예를 들면 할로겐, 알콕시, 시아노, 니트로를 들 수 있고, 이들이 1∼3개 치환되어 있어도 된다.

시클로알킬로서는, 탄소수 5∼12의 시클로알킬이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 시클로데실, 시클로도데실을 들 수 있다.

할로겐으로서는, 불소, 염소, 브롬, 요오드를 들 수 있다.

알콕시로서는, 직쇄상 또는 분지쇄상의 탄소수 1∼6의 알콕시, 예를 들면 메톡시, 에톡시, n―프로폭시, 이소프로폭시, n―부톡시, 이소부톡시, sec―부톡시, tert―부톡시, n―펜틸옥시, 이소펜틸옥시, n―헥실옥시, 이소헥실옥시 등을 들 수 있다. 특히, 탄소수 1∼3의 알콕시가 바람직하다.

아릴로서는, 탄소수 6∼10의 아릴이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면 페닐, α―나프틸, β―나프틸을 들 수 있다. 특히 페닐이 바람직하다. 당해 아릴은 치환되어 있어도 되며, 이러힌 치환기로서는, 예를 들면 알킬, 할로겐, 알콕시, 시아노, 니트로를 들 수 있고, 이들이 1∼3개 치환되어 있어도 된다.

알킬렌으로서는, 직쇄상 또는 분지쇄상의 탄소수 1∼6의 알킬렌이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면 메틸렌, 에틸렌, 트리메틸렌, 테트라메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌, 2―(에틸)트리메틸렌, 1―(메틸)테트라메틸렌을 들 수 있다.

아실로서는, 직쇄상 또는 분지쇄상의 알카노일 또는 알로일을 들 수 있다. 알카노일로서는, 예를 들면 포르밀, 아세틸, 2―메틸아세틸, 2,2―디메틸아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 펜타노일, 2,2―디메틸프로피오닐, 헥사노일 등을 들 수 있다. 알로일로서는, 예를 들면 벤조일, 톨루오일, 나프토일을 들 수 있다. 이러한 알로일은 치환 가능한 위치에 있어서 치환되어 있어도 되고, 알킬로 치환되어 있어도 된다.

본 발명의 올리고머가 올리고뉴클레오티드인 태양에 있어서, 동 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 리보스의 2' 위치의 ―OH기가 메톡시로 치환되고, 인산 결합부분이 포스포로티오에이트 결합인, 아래 일반식으로 표시되는 기를 구성단위로 하는 것이어도 된다.

(식 중, Base는 핵산염기를 나타낸다.)

이러한 올리고뉴클레오티드는 각종 자동합성장치(예를 들면 AKTA oligopilotplus 10／100(GE Healthcare))를 사용하여 용이하게 합성하는 것이 가능하고, 또는 제3자 기관(예를 들면 Promega사 또는 Takara사) 등에 위탁하여 제작하는 것도 가능하다.

본 발명의 올리고머가 모르폴리노 올리고머인 경우, 동 모르폴리노 올리고머는 아래 일반식으로 표시되는 기를 구성단위로 하는 것이어도 된다.

(식 중, Base는 상기와 동일한 정의이고；

W는 아래 중 어느 하나의 식으로 표시되는 기를 나타낸다.

(식 중, X는 ―CH₂R¹, ―O―CH₂R¹, ―S―CH₂R¹, ―NR²R³ 또는 F를 나타내고；

R¹은 H, 알킬을 나타내며；

R² 및 R³는 동일 또는 상이하고, H, 알킬, 시클로알킬, 또는 아릴를 나타내고；

Y₁은 0, S, CH₂ 또는 NR¹을 나타내며；

Y₂는 0, S 또는 NR¹을 나타내고；

Z는 0 또는 S를 나타낸다.))

모르폴리노 올리고머는 바람직하게는 아래의 식으로 표시되는 기를 구성단위로 하는 올리고머(포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(이하,「PMO」라 함))이다.

(식 중, Base, R², R³는 상기와 동일한 정의이다.)

모르폴리노 올리고머는 예를 들면 국제공개공보 제1991／009033호, 또는 국제공개공보 제2009／064471호에 따라 제조할 수 있다. 특히, PMO는 국제공개공보 제2009／064471호에 기재된 방법에 따라 제조하거나, 또는 아래에 나타내는 방법에 따라 제조할 수 있다.

PMO의 하나의 태양으로서, 예를 들면 다음의 일반식(I)으로 표시되는 화합물(이하, PMO(I)라 함)을 들 수 있다.

［식 중, 각 Base, R², R³는 상기와 동일한 정의이고；

n은 1∼99의 범위 내에 있는 임의의 정수이며, 바람직하게는 18∼28의 범위 내에 있는 임의의 정수이다.］

PMO(I)은 공지의 방법에 따라 제조할 수 있고, 사용되는 화합물 및 시약은 PMO의 제조에 일반적으로 사용되고 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 또한, 제조는 액상법 또는 고상법(매뉴얼 또는 시판의 고상 자동합성기를 사용함)으로 실시할 수 있다. 고상법으로 PMO를 제조하는 경우, 조작 순서의 간편화 및 합성의 정확성 면에서 자동합성기를 사용하는 방법이 바람직하다.

펩티드 핵산은 아래 일반식으로 표시되는 기를 구성단위로 하는 본 발명의 올리고머이다.

［식 중, Base는 상기와 동일한 정의이다.］

펩티드 핵산은 예를 들면 아래의 문헌에 따라 제조할 수 있다.

1) P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science, 254, 1497(1991)

2) M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg, Jacs., 114, 1895(1992)

3) K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt, J. Org. Chem., 59, 5767(1994)

4) L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175(1995)

5) T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80(1997)

또한, 본 발명의 올리고머는 5' 말단이 아래 화학식 (1)∼(3) 중 어느 하나의 기여도 된다. 바람직하게는 (3)―OH이다.

이하, 상기 (1), (2) 및 (3)으로 나타내어지는 기를, 각각 「기(1)」, 「기(2)」 및 「기(3)」으로 부른다.

본 발명의 올리고머의 의약적으로 허용 가능한 염의 예로서는, 나트륨염, 칼륨염, 리튬염과 같은 알칼리 금속염, 칼슘염, 마그네슘염과 같은 알칼리토류금속염；알루미늄염, 철염, 아연염, 구리염, 니켈염, 코발트염 등의 금속염；암모늄염；t―옥틸아민염, 디벤질아민염, 모르폴린염, 글루코사민염, 페닐글리신알킬에스테르염, 에틸렌디아민염, N―메틸글루카민염, 구아니딘염, 디에틸아민염, 트리에틸아민염, 디시클로헥실아민염, N,N'―디벤질에틸렌디아민염, 클로로프로카인염, 프로카인염, 디에탄올아민염, N―벤질―페네틸아민염, 피페라진염, 테트라메틸암모늄염, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄염과 같은 유기 아민염；불화수소산염, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염과 같은 할로겐화수소산염；질산염, 과염소산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염；메탄설폰산염, 트리플루오로메탄설폰산염, 에탄설폰산염과 같은 저급 알칸설폰산염；벤젠설폰산염, p―톨루엔설폰산염과 같은 아릴설폰산염；초산염, 말산염, 푸마르산염, 숙신산염, 구연산염, 타르타르산염, 옥살산염, 말레산염 등의 유기산염；글리신염, 리신염, 아르기닌염, 오르니틴염, 글루타민산염, 아스파라긴산염과 같은 아미노산염 등을 들 수 있다. 이들 염은 공지의 방법으로 제조할 수 있다. 또는 본 발명의 올리고머는 그의 수화물의 형태에 있어도 된다.

다른 태양에서는, 본 발명의 올리고머는 빌톨라르센(Viltolarsen) 또는 그의 동등품이어도 된다.

Viltolarsen이란, NS―065／NCNP―01의 국제 일반명(INN)이다. 본 명세서에 있어서, NS―065／NCNP―01은 NS―065／NCNP―01, NS―065／NCNP―01(Viltolarsen) 또는 Viltolarsen이라고도 칭하여진다.

NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)은 엑손 53 스키핑에 의한 치료에 적합한 듀시엔형 근이영양증(DMD) 환자의 치료를 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드 원약이다. NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)은 미국 특허 제9,079,934B2호에 있어서 「PMO No.8」으로서 개시되어 있는 화합물로, 염기부분의 서열이 서열번호 35(5'―CCTCCGGTTC TGAAGGTGTTC―3', 본 명세서에 있어서의 서열번호 3)에 의해 표시되고, ―OH의 5' 말단을 갖는다. 본 명세서에는 미국 특허 제9,079,934B2호는 그 내용 전체가 참조로써 포함된다. 미국 특허 제9,079,934B2호는 또한 PMO No.8, 즉, NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)을 합성하는 방법을 개시한다.

NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)은 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드보다도 높은 안전성을 제공할 것으로 예상되는 모르폴리노 골격을 갖는다. 예를 들면 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드인 드리사퍼센(drisapersen)(BioMarin에 의함)의 개발은 안전상의 우려 때문에 중단되어 있으나, 모르폴리노올리고뉴클레오티드인 에테플러센(eteplirsen)(Sarepta에 의한 Exondys51(등록상표))은 FDA에 의해 승인되어 있다. drisapersen 및 eteplirsen 양자는 엑손 51 스키핑에 의한 치료에 적합한 DMD 환자를 위한 것이다. Eteplirsen은 미국 특허 제9,506,058B2호에 개시되어, 그 내용 전체가 참조로써 본 명세서에 포함된다.

미국 특허 제9,079,934B2호에 개시되어 있는 바와 같이, NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)은 엑손 43―52, 45―52, 47―52, 48―52, 49―52, 50―52 또는 52를 포함하는, 특이적인 엑손이 결손되어 있는 DMD 환자에 있어서 기능성 디스트로핀 단백질을 생성하기 때문에, 특이적으로 엑손 53 스키핑 활성을 나타내도록 설계되었다. 특정 엑손을 스킵함으로써 이론적으로 치료 가능한 DMD를 일으키는 돌연변이의 예는, Aartsma―Rus 등, 2002의 표 3에 나타내어져 있다. Aartsma―Rus 등의 문헌의 내용은, 그 전체가 참조로써 포함된다(Annemieke Aartsma―Rus, Mattie Bremmer―Bout, Anneke A. M. Janson, Johan T. den Dunnen, Gert―Jan B. van Ommen, and Judith C. T. van Deutekom, "Targeted exon skipping as apotential gene correction therpy for Duchenne muscular dystrophy", Neuromuscular Disorders, Vol. 12, pp.S71―S77(2002)).

Viltolarsen의 「동등품」이란, Viltolarsen의 후발 의약품 또는 그의 유효 성분이 되는 화합물이다. 이러한 동등품은 Viltolarsen의 임상시험에서 확인된 안전성 및 유효성에 기초하여, 동등품 자체에 대해서는 임상시험을 거치지 않고 약사법 상의 제조판매 승인을 얻고 있어, Viltolarsen과 유사한 엑손 53 스키핑 활성을 갖는 것이 기대된다. 어느 태양에서는, Viltolarsen의 「동등품」은 Viltolarsen과 동일한 염기서열을 갖고, 그의 핵산염기, 당부분 및 인산 결합부분의 전부 또는 일부가 Viltolarsen과 동일하게 수식되어 있거나, 또는 상이하게 수식되어 있는 것을 포함한다. 이들 수식의 태양은 상기한 태양과 동일하다. 또한, Viltolarsen의 「동등품」은 프리체, 의약적으로 허용 가능한 염 또는 수화물의 형태여도 된다.

2. 의약품 조성물

본 발명의 의약 조성물은 수용액의 형태여도 된다. 본 발명의 의약 조성물은 본 발명의 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물을 2.5∼500 ㎎／㎖, 5∼450 ㎎／㎖, 10∼400 ㎎／㎖, 15∼350 ㎎／㎖, 20∼300 ㎎／㎖, 20∼250 ㎎／㎖, 20∼200 ㎎／㎖, 20∼150 ㎎／㎖, 20∼100 ㎎／㎖, 20∼50 ㎎／㎖, 20∼40 ㎎／㎖, 20∼30 ㎎／㎖, 23∼27 ㎎／㎖, 24∼26 ㎎／㎖ 또는 25 ㎎／㎖의 농도로 포함하고 있어도 된다. 또는, 본 발명의 의약 조성물은 본 발명의 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물을 10∼100 ㎎／㎖, 15∼95 ㎎／㎖, 20∼80 ㎎／㎖, 25∼75 ㎎／㎖, 30∼70 ㎎／㎖, 35∼65 ㎎／㎖, 40∼60 ㎎／㎖, 45∼55 ㎎／㎖, 47∼53 ㎎／㎖, 48∼52 ㎎／㎖, 49∼51 ㎎／㎖, 또는 50 ㎎／㎖의 농도로 포함하고 있어도 된다.

본 발명의 의약 조성물에 있어서, 수용액 중 Viltolarsen의 농도는 변경되어도 된다. Viltolarsen의 수용액을 조제하기 위해, 예를 들면 250 ㎎의 Viltolarsen을, 0.5 mL∼100 mL의 물에 혼합(2.5 ㎎／mL∼500 ㎎／mL의 Viltolarsen 농도에 상당), 보다 바람직하게는 1 mL∼50 mL의 물에 혼합(5 ㎎／mL∼250 ㎎／mL의 Viltolarsen 농도에 상당), 가장 바람직하게는 5 mL∼10 mL의 물에 혼합(25 ㎎／mL∼50 ㎎／mL의 Viltolarsen 농도에 상당)해도 된다.

본 발명의 의약 조성물의 투여형태는 정맥 내 투여이다. 본 발명의 의약 조성물을 취할 수 있는 제형으로서는, 예를 들면 주사액(점적액을 포함)이다.

본 발명의 의약 조성물은 등장화제, pH 조정제 및 용매로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 추가로 포함하고 있어도 된다.

본 발명의 의약 조성물에 포함되는 등장화제는 염화나트륨, 염화칼륨, 글루코오스, 프룩토오스, 말토오스, 수크로오스, 락토오스, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 트레할로오스, 글리세린으로부터 선택되는 하나 이상이어도 된다.

Viltolarsen을 250 ㎎ 포함하는 주사에 적합한 10 mL의 수용액은, 등장화제로서 72.0 ㎎ 이상 108.0 ㎎ 이하의 염화나트륨(염화나트륨 농도 7.2 ㎎／mL∼10.8 ㎎／mL에 상당), 보다 바람직하게는 81.0 ㎎ 이상 99.0 ㎎ 이하의 염화나트륨(염화나트륨 농도 8.1 ㎎／mL∼9.9 ㎎／mL에 상당), 가장 바람직하게는 85.5 ㎎ 이상 94.5 ㎎ 이하의 염화나트륨(염화나트륨 농도 8.55 ㎎／mL∼9.45 ㎎／mL에 상당)을 포함하고 있어도 된다.

등장화제로서는, 인산 완충제를 사용해도 된다. 이러한 인산 완충제로서는, 구연산 완충제, 젖산 완충제, 초산 완충제 등을 들 수 있다. 또한, 등장화제로서, 당류(글루코오스 이외)를 사용해도 된다. 이러한 당의 예로서는, 소르비톨 및 만니톨을 들 수 있다. Viltolarsen을 함유하는 조성물을 조제할 때, 복수의 등장화제를 동일하게 사용해도 된다.

본 발명의 의약 조성물에 포함되는 pH 조정제는 염산, 황산, 인산, 초산, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 트리에탄올아민, 구연산, 젖산, 인산염(인산수소나트륨, 인산이수소나트륨, 인산이수소칼륨), 모노에탄올아민으로부터 선택되는 하나 이상이어도 된다.

본 발명의 올리고머, 예를 들면 Viltolarsen에 대해서 인산 완충제를 사용하는 경우, 인산 완충제의 농도는 100 mM 미만인 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 의약 조성물은 인산 완충제의 농도가 90 mM 이하, 80 mM 이하, 70 mM 이하, 60 mM 이하, 50 mM 이하, 40 mM 이하, 30 mM 이하, 20 mM 이하, 10 mM 이하 또는 5 mM 이하로 조정되어 있거나, 또는 인산 완충액을 포함하지 않는 것이어도 된다.

본 발명의 의약 조성물에 포함되는 용매는 물이어도 된다.

Viltolarsen을 포함하는 주사에 적합한 수용액의 pH는 6.0 이상 8.5 이하, 보다 바람직하게는 6.5 이상 8.0 이하, 가장 바람직하게는 7.0 이상 7.5 이하여도 된다.

본 발명의 올리고머는 광범위의 pH에 있어서 안정성을 나타내는데, 본 발명의 의약 조성물은 pH가 7.0∼7.5, 7.0∼7.4, 7.1∼7.5, 7.1∼7.4, 7.2∼7.5, 7.2∼7.4, 7.3∼7.5, 7.3∼7.4 또는 7.3으로 조정되어 있는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 의약 조성물은 2.5∼500 ㎎／㎖ 또는 10∼100 ㎎／㎖ 농도의 본 발명의 올리고머, 8∼10 ㎎／㎖ 농도의 염화나트륨을 포함하고, 또한 pH가 7.2∼7.4인 수용액이어도 된다.

또는, 본 발명의 의약 조성물은 25 ㎎／㎖ 농도의 본 발명의 올리고머를 포함하고, 또한 pH가 7.3으로 조정되며, 완충제를 포함하지 않는 수용액이어도 된다. 이 의약 조성물에 있어서, pH의 조정은 염산 및／또는 수산화나트륨을 사용해서 행하여진다.

본 발명의 의약 조성물의 예로서, 미국／캐나다 제2상 임상 프로그램에 있어서 사용한 250 ㎎의 Viltolarsen을 함유하는 주사용 조성물을 아래의 표 2에 나타낸다. 표 2에 나타내는 의약 조성물을, 아래에서는 「NS―065／NCNP―01(Viltolarsen) 주사액 250 ㎎」으로 칭한다.

또한, 「NS―065／NCNP―01(Viltolarsen) 주사액 250 ㎎」의 조성에 있어서, 주사용수 및 등장화제의 염화나트륨의 값을 약 절반량으로 하고, 총량을 5 mL로 해도 된다. 이러한 조성의 Viltolarsen을 50 ㎎／mL의 농도로 포함하는 의약 조성물도, 본 발명에 포함된다.

Viltolarsen을 함유하는 수용액의 부피는 NS―065／NCNP―01 및 사용되는 등장화제의 농도, 및 Viltolarsen과 사용되는 등장화제 사이의 중량비가 상기 설명과 동등하게 유지되는 한, 증감되어도 된다.

Viltolarsen을 포함하는 조성물은 또한, 근육조직으로의 Viltolarsen의 송달을 촉진하기 위한 담체를 포함하고 있어도 된다. 이러한 담체로서는, 의약적으로 허용 가능한 것이라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 양이온성 담체(예를 들면 양이온성 리포솜 및 양이온성 폴리머) 및 바이러스 엔벨로프를 사용한 담체를 들 수 있다. 양이온성 리포솜으로서는, 예를 들면 2―O―(2―디에틸아미노에틸)카르바모일―1,3―O―디올레오일글리세롤 및 인지질을 필수성분으로 하는 리포솜, 올리고펙타민(등록상표)(서모 피셔 사이언티픽사 제조), 리포펙틴(등록상표)(서모 피셔 사이언티픽사 제조), 리포펙타민(등록상표)(서모 피셔 사이언티픽사 제조), 리포펙타민(등록상표) 2000(서모 피셔 사이언티픽사 제조), DMRIE―C(서모 피셔 사이언티픽사 제조), GeneSilencer(등록상표)(Gene Therapy Systems사 제조, TransMessenger(등록상표)(QIAGEN사 제조), TransIT―TKO®(양이온성 폴리머의 예는 JetSI(등록상표)(GeneX India Bioscience 제조) 및 Jet―PEI(등록상표)(폴리에틸렌이민, GeneX India Bioscience 제조) 등을 들 수 있다. 바이러스 엔벨로프를 사용한 캐리어로서는, 예를 들면 GenomeOne(등록상표)(HVJ―E 리포솜, 이시하라 산업 주식회사 제조)을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 의약 조성물은 유화 보조제(예를 들면 탄소수 6∼22의 지방산이나 그의 의약적으로 허용 가능한 염, 알부민, 덱스트란)나 안정화제(예를 들면 콜레스테롤, 포스파티딘산)를 포함해도 된다.

Viltolarsen과 담체를 포함하는 본 발명의 의약 조성물에 있어서, Viltolarsen과 담체(즉, 담체／Viltolarsen)의 중량비는 사용하는 담체의 종류에 따라 변경해도 되고, 적절하게는 0.1∼100의 범위, 바람직하게는 1∼50의 범위, 보다 바람직하게는 10∼20의 범위이다.

Viltolarsen을 함유하는 수용액은 정맥 내 점적 또는 점적에 의해 환자에게 투여할 수 있다.

3. 효능·효과 및 용법·용량

본 발명의 의약 조성물을 치료에 사용하는 경우, 본 발명의 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물이 40 ㎎／㎏∼80 ㎎／㎏으로 인간 환자에게 주 1회 정맥 내 투여된다(이하, 「본 발명의 용법·용량」이라 함). 또는, 본 발명의 용법·용량은 본 발명의 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물이 40 ㎎／㎏으로 인간 환자에게 주 1회 정맥 내 투여되는 것이어도 된다. 또는, 본 발명의 용법·용량은 본 발명의 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물이 80 ㎎／㎏으로 인간 환자에게 주 1회 정맥 내 투여되는 것이어도 된다. 여기서, 용량의 단위「㎎／㎏」에 있어서 분자인 「㎎」은 본 발명의 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물의 양을 밀리그램으로 나타내는 것이고, 분모인 「㎏」은 인간 환자의 체중 1 킬로그램을 나타낸다.

NS―065／NCNP―01(Viltolarsen) 주사액 250 ㎎은 엑손 53 스키핑에 의한 치료에 적합한 DMD 환자의 치료를 목적으로 한 주 1회의 점적 정맥주사를 위해 개발되었다. 미국／캐나다의 제2상 임상 프로그램은 2 용량의 Viltolarsen：40 ㎎／㎏／주 및 80 ㎎／㎏／주를 평가하도록 설계되었다. 여기서, ㎏은 환자의 체중 단위이다. 예를 들면 체중 40 ㎏의 환자에 대해서 40 ㎎／㎏／주의 경우, 1주간에 1회, 상기 환자에게 1,600 ㎎(＝40 ㎎×40)의 Viltolarsen을 투여하는 것을 의미한다.

4. 질환

DMD는 디스트로핀 유전자에 있어서의 기능 상실 돌연변이에 의해 생기는 근질환으로, 환자의 근육에 있어서의 디스트로핀 단백질의 상실을 초래한다(Hoffman 등, 1987). 디스트로핀 유전자는 X 염색체 상에 있어, 높은 자연 돌연변이율을 나타내, 연구된 모든 세계의 집단에 있어서, DMD의 발생률은 생존 출산된 남성 5,000명에 1명이다. 최근의 평가에서는, 글로벌 환자 데이터베이스에서 평가된 7,149명의 DMD 환자의 10.1%가 엑손 53 스키핑에 의한 치료에 적합한 것이 나타내어졌다(Bladen et al., 2015). 임상증상은 전형적으로는 약년 취학시기(만4∼6세까지)에 나타나고, 이환된 남아는 근위 근력 저하(예를 들면 계단을 오르는 것의 곤란성, 또는 달리는 것의 곤란성)에 기인하여, 동 연령의 아동과 신체적으로 대응하는 것에 곤란성을 나타낸다. 마루로부터 일어서기의 곤란성은 전형적인 Gower의 움직임을 사용하여 입위(立位)를 달성하는 환자의 대부분에 보인다(즉, 입위를 달성하기 위해 다리, 무릎 및 대퇴에 손 지지를 사용함)(Hoffman EP, Brown RH, and Kunkel LM.(1987). Dystrophin：the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell 51,919―928. 및 Bladen CL, Salgado D, Monges S, Foncuberta ME, Kekou K, Kosma K, Dawkins H, Lamont L, Roy AJ, Chamova T, Guergueltcheva V, Chan S, Korngut L, Campbell C, Dai Y, Wang J, Barisic N, Brabec P, Lahdetie J, Walter MC, Schreiber-Katz O, Karcagi V, Garami M, Viswanathan V, Bayat F, Buccella F, Kimura E, Koeks Z, van den Bergen JC, Rodrigues M, Roxburgh R, Lusakowska A, Kostera―Pruszczyk A, Zimowski J, Santos R, Neagu E, Artemieva S, Rasic VM, Vojinovic D, Posada M, Bloetzer C, Jeannet PY, Joncourt F, Diaz―Manera J, Gallardo E, Karaduman AA, Topaloglu H, El Sherif R, Stringer A, Shatillo AV, Martin AS, Peay HL, Bellgard MI, Kirschner J, Flanigan KM, Straub V, Bushby K, Verschuuren J, Aartsma―Rus A, Beroud C, Lochmuller H. (2015). The TREAT―NMD DMD Global Database：analysis of more than 7,000 Duchenne muscular dystrophy mutations. Hum Mutat. 36(4)：395―402).

DMD 환자의 근육조직은 만성염증을 나타내고, 근육의 변성 및 재생의 발작을 수반하여, 근육소모, 장애 및 조기사에 이른다. 환자는 전형적으로는 생후 20년까지 보행을 상실하고, 30년까지 일상생활의 대부분의 면에서의 지원을 필요로 하게 된다. 이 질환은 통상 청년기 또는 성인기 조기의 사망으로 이어지는데, 인공호흡기 보조장치의 사용은 때로는 수명을 40년까지 연장시키는데 50년까지 연장시키는 일은 드물다.

피험자에 있어서의 DMD 유전자 변이는 다중 연결 의존성 프로브 증폭(MLPA)의 사용에 의해 검출할 수 있다(Murugan 등, 2010). Murugan 등에 의한 이 논문의 내용 전체가 참고로서 원용된다(Sakthivel Murugan S. M., Arthi Chandramohan and Bremadesam Raman Lakshmi, "Use of multiplex ligation―dependent probe amplification(MLPA) for Duchenne muscular dystrophy(DMD) gene mutation analysis," Indian Journal of Medical Research, Vol. 132, pp.303―311(September 2010).).

본 발명의 의약 조성물에 의한 치료의 대상이 되는 인간 환자(이하, 「본 발명의 대상이 되는 환자」라 함)는 의사에 의해 DMD를 이환하고 있다고 진단된 환자라면 특별히 한정되지 않으나, 어느 태양에서는, 디스트로핀 유전자에 43―52, 45―52, 47―52, 48―52, 49―52, 50―52 또는 52로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 엑손이 결손된 변이를 갖는 환자여도 된다.

또한, 본 발명의 대상이 되는 환자는 본 발명의 의약 조성물 또는 본 발명의 올리고머를 사용하는 치료 전에 디스트로핀 단백질의 발현이 웨스턴 블로팅 또는 질량분석에 의한 측정에서 건강한 정상인(100%)의 1% 이하인 것을 특징으로 하고 있어도 된다. 여기서 「건강한 정상인」이란, 디스트로핀 단백질에 관한 질환을 갖지 않는 인간이다. 건강한 정상인에 있어서의 디스트로핀 단백질의 발현량은, 일반적으로 알려진 값을 사용해도 되고, 개별의 건강한 정상인으로부터 얻어진 값을 사용해도 된다. 또한, 본 발명의 대상이 되는 환자는 본 발명의 의약 조성물 또는 본 발명의 올리고머를 사용한 치료 전에는 디스트로핀 단백질의 발현이 보이지 않는 것을 특징으로 하고 있어도 된다. 「디스트로핀 단백질의 발현이 보이지 않는」다는 것은, 디스트로핀 단백질의 발현량이 웨스턴 블로팅 또는 질량분석에 의한 측정에서, 음성 대조와 같은 정도의 발현량인 것, 또는 검출한계 이하의 값인 것을 의미한다. 또한, 웨스턴 블롯 및 질량분석은 당분야에서 통상 사용되는 방법이라면 특별히 한정되지 않는다. 웨스턴 블롯 및 질량분석의 일례로서 본 실시예에 있어서의 실험수법을 참조할 수 있다.

5. 치료 이론

DMD는 위중한 유전성 근장애인데, 가장 일반적으로는 디스트로핀 유전자로부터의 하나 이상의 엑손이 결실되어, 아웃·오브·프레임(Out of Frame) 아미노산 번역이 생김으로써 일어난다. 이로써 근육기능에 중요한 환자의 기능성 디스트로핀 단백질이 발현되지 않게 된다. 보다 중증도가 낮은 형태의 장애인 베커 근이영양증(BMD)은 디스트로핀 유전자 중에 하나 이상의 엑손이 존재하지 않는데, 나머지 엑손이 인프레임에서 아미노산 번역되는 경우에 가장 일반적으로 생긴다. BMD 환자는 일반적으로 질환의 진행이 느리고, 장애 정도가 낮다. DMD 환자의 의학적 처치는 일반적으로 사지 근육에 있어서의 증상의 발증을 지연시키기 위한 글루코코르티코이드 처치나 호흡의 서포트를 포함한다. 2018년 2월의 FDA의 최종 가이던스 「Duchenne Muscular Dystrophy and Related Dystrophinopathies：Developing Drugs for Treatment Guidance for Industry.」(https：／／www.fda.gov／downloads／Drugs／GuidanceComplianceRegulatoryInformation／Guidances／UCM450229.pdf.에서 입수 가능)에 나타내어져 있는 바와 같이, DMD 환자에게는 중대한 언멧 메디컬 니즈(Unmet Medical Needs)가 존재한다.

DMD 환자를 치료하기 위한 하나의 치료적 접근은 기능적 디스트로핀 단백질을 생산하여 DMD 환자를 BMD 표현형으로 이행시키는 것을 목적으로 「엑손 스키핑」 전략을 사용하는 것이다. 엑손 스키핑은 결실된 엑손 옆의 엑손의 스키핑을 유도하여, 이로써 아미노산 리딩 프레임을 회복시킬 수 있다(Cirak 등, 2011；Voit 등, 2014；Yokota 등, 2012). 엑손 53의 스키핑에 의해, 정상보다도 약간 짧으나 부분적으로 기능활성을 유지하는 디스트로핀 단백질이 발현되게 된다. NS―065／NCNP―01(Viltolarsen) 주사액 250 ㎎은 DMD 표현형을, 환자의 질환 진행이 느려지고, 환자의 생활의 질이 개선되는, BMD의 보다 경도의 질환으로 시프트시키는 것이 기대된다(Cirak S, Arechavala―Gomeza V, Guglieri M, Feng L, Torelli S, Anthony K, Abbs S, Garralda ME, Bourke J, Wells DJ, Dickson G, Wood MJ, Wilton SD, Straub V, Kole R, Shrewsbury SB, Sewry C, Morgan JE, Bushby K, Muntoni F.(2011). Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment：an open―label, phase 2, doseescalation study. Lancet 378：595―605., Voit T, Topaloglu H, Straub V, Muntoni F, Deconinck N, Campion G, De Kimpe SJ, Eagle M, Guglieri M, Hood S, Liefaard L, Lourbakos A, Morgan A, Nakielny J, Quarcoo N, Ricotti V, Rolfe K, Servais L, Wardell C, Wilson R, Wright P, Kraus JE.(2014). Safety and efficacy of drisapersen for the treatment of Duchenne muscular dystrophy(DEMAND II)：an exploratory, randomised, placebo―controlled phase 2 study. Lancet Neurol. 13(10)：987―96., 및 Yokota T, Nakamura A, Nagata T, Saito T, Kobayashi M, Aoki Y, Echigoya Y, Partridge T, Hoffman EP, Takeda S.(2012). Extensive and Prolonged Restoration of Dystrophin Expression with Vivo―Morpholino―Mediated Multiple Exon Skipping in Dystrophic Dogs. Nucleic Acid Ther 22(5)：306―15.).

따라서, 본 발명의 의약 조성물을, 전술한 본 발명의 용법·용량에 따라 인간 환자에게 투여함으로써, DMD를 치료하는 것이 가능하다.

여기서 「치료」란, 환자에 있어서의 DMD의 증상을 경감시키는 것을 의미한다.

본 발명의 의약 조성물을 본 발명의 용법·용량에 따라 사용한 치료는 아래의 (1)∼(6)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효과를 발생시킬 수 있다(괄호 안은 평균±표준편차를 나타냄)：

(2) 일어서기 시간(TTSTAND)으로부터 얻어지는 속도의 변화가 베이스라인과 비교하여, 24주간의 투여 후 25주 시에 －0.055회／초 이상 또는 0.024±0.075초 이상인 것；

(3) 10 미터 주행／보행 시간(TTRW)으로부터 얻어지는 속도의 변화가 베이스라인과 비교하여, 24주간의 투여 후 25주 시에 －0.025 미터／초 이상 또는 0.227±0.251 미터／초 이상인 것；

(4) 4단 계단 오르기 시간(TTCLIMB)으로부터 얻어지는 속도의 변화가 베이스라인과 비교하여, 24주간의 투여 후 25주 시에 －0.060회／초 이상 또는 0.032±0.088회／초 이상인 것；

(5) 노스·스타 보행능력 평가(NSAA)의 스코어 변화가 베이스라인과 비교하여, 24주간의 투여 후 25주 시에 －2.2 스코어 이상 또는 0.8±2.9 스코어 이상인 것；및

(6) 6분간 보행 시험(6MWT)의 변화가 베이스라인과 비교하여, 24주간의 투여 후 25주 시에 －7.5 미터 이상 또는 28.9±36.3 미터 이상인 것.

상기 (1)∼(6)에 있어서 「베이스라인」이란, 미처치 환자군에 있어서의 평균값을 의미한다. 또한 (2)∼(6)에 있어서의 「변화」는 평균값의 변화를 의미한다.

어느 실시태양에서는, 본 발명의 의약 조성물을, 전술한 본 발명의 용법·용량에 따라 만7∼9세의 듀시엔형 근이영양증의 인간 환자에게 84주간 투여하는 경우에 있어서, 아래의 (7)∼(12)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효과가 발생할 수 있다：

(7) 치료 개시로부터 제85주까지 일어서기 능력을 상실하는 환자가 20% 미만인 것；

(8) 치료 개시로부터 제85주까지 4단 계단 오르기가 불가능해지는 환자가 10% 미만인 것；

(9) 치료 개시로부터 제85주까지 자립보행능력을 상실하는 환자가 10% 미만인 것；

(10) 치료 개시로부터 제85주까지 10 미터 주행／보행의 속도에 가령에 의한 감소가 보이지 않는 것；

(11) 치료 개시로부터 제85주까지 4단 계단 오르기의 속도에 가령에 의한 감소가 보이지 않는 것；및

(12) 치료 개시로부터 제85주까지 일어서기의 속도에 가령에 의한 감소가 보이지 않는 것.

상기 (7)∼(12)의 효과는 치료를 개시한 주를 제1주로 정하고, 제1주∼제85주까지, 제1주∼제80주까지, 제1주∼제75주까지, 제1주∼제70주까지, 제1주∼제65주까지, 제1주∼제60주까지 중 어느 하나의 시점에서 발생해도 된다.

어느 실시태양에서는, 본 발명의 의약 조성물을, 전술한 본 발명의 용법·용량에 따라, 만10∼12세의 듀시엔형 근이영양증의 인간 환자에게 투여함으로써, 아래의 (13)∼(18)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효과가 발생한다：

(13) 치료 개시로부터 제85주까지 일어서기 능력을 상실하는 환자가 60% 미만인 것；

(14) 치료 개시로부터 제85주까지 4단 계단 오르기가 불가능해지는 환자가 50% 미만인 것；

(15) 치료 개시로부터 제85주까지 자립보행능력을 상실하는 환자가 50% 미만인 것；

및

(16) 치료 개시로부터 제85주까지 10 미터 주행／보행의 속도에 가령에 의한 감소가 보이지 않는 것.

(17) 치료 개시로부터 제85주까지 4단 계단 오르기의 속도가 증가하는 시기가 보이는 것；및

(18) 치료 개시로부터 제85주까지 일어서기의 속도가 증가하는 시기가 보이는 것.

상기 (13)∼(18)의 효과는 치료를 개시한 주를 제1주로 정하고, 제1주∼제85주까지, 제1주∼제80주까지, 제1주∼제75주까지, 제1주∼제70주까지, 제1주∼제65주까지, 제1주∼제60주까지 중 어느 하나의 시점에서 발생해도 된다.

즉, 본 발명의 의약 조성물은 상기 (1)∼(18)의 효과의 하나 이상을 발생시킬 수 있다.

II. 제2 형태

본 발명은 그 제2 형태의 형태에 있어서,

상기 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물을 40 ㎎／㎏∼80 ㎎／㎏으로 상기 인간 환자에게 주 1회 정맥 내 투여하는 것을 포함하는, 듀시엔형 근이영양증의 치료방법(이하, 「본 발명의 치료방법」이라 함)을 제공한다.

본 발명의 치료방법의 각 구성의 의미는, 이미 항목 「I. 제1 형태」에서 본 발명의 의약 조성물의 구성에 대해서 설명한 것과 동일하다.

또한, 본 발명의 치료방법은 항목 「I. 제1 형태」의 부항목 「5. 치료 이론」에서 설명한 (1)∼(18)의 효과의 하나 이상을 발생시킬 수 있다.

III. 제3 형태

또한, 본 발명은 그 제3 형태의 형태에 있어서,

상기 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 수화물(이하, 「본 발명의 용도 특정 형태」라 함)을 제공한다.

본 발명의 용도 특정 형태의 각 구성의 의미는, 이미 항목 「I. 제1 형태」에서 본 발명의 의약 조성물의 구성에 대해서 설명한 것과 동일하다.

또한, 본 발명의 용도 특정 형태는, 항목 「I. 제1 형태」의 부항목 「5. 치료 이론」에서 설명한 (1)∼(18)의 효과의 하나 이상을 발생시킬 수 있다.

IV. 제4 형태

또한, 본 발명은 그 제4 형태의 형태에 있어서,

상기 사용(이하, 「본 발명의 스위스타입 사용」이라 함)을 제공한다.

본 발명의 스위스타입 사용의 각 구성의 의미는, 이미 항목 「I. 제1 형태」에서 본 발명의 의약 조성물의 구성에 대해서 설명한 것과 동일하다.

또한, 본 발명의 스위스타입 사용은, 항목 「I. 제1 형태」의 부항목 「5. 치료 이론」에서 설명한 (1)∼(18)의 효과의 하나 이상을 발생시킬 수 있다.

아래에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하는데, 본 발명은 실시예에 나타내어지는 범위에 한정되는 것은 아니다.

［실시예］

［제조예］

(1) 아미노메틸폴리스티렌 수지에 담지된 4―｛［(2S,6R)―6―(4―벤즈아미드―2―옥소피리미딘―1―일)―4―트리틸모르폴린―2―일］메톡시｝―4―옥소부탄산의 제조

공정 1：4―｛［(2S,6R)―6―(4―벤즈아미드―2―옥소피리미딘―1(2H)―일)―4―트리틸모르폴린―2―일］메톡시｝―4―옥소부탄산의 제조

아르곤 분위기하, N―｛1―［(2R,6S)―6―(히드록시메틸)―4―트리틸모르폴린―2―일］―2―옥소―1,2―디히드로피리미딘―4―일｝벤즈아미드 22.0 g과 4―디메틸아미노피리딘(4―DMAP) 7.04 g을 디클로로메탄 269 mL에 현탁하고, 무수 숙신산 5.76 g을 첨가하여, 실온에서 3시간 교반하였다. 반응액에 메탄올 40 mL를 첨가하고, 감압 농축하였다. 잔사에 초산에틸과 0.5 M의 인산이수소칼륨 수용액을 사용하여 추출조작을 행하였다. 얻어진 유기층을 0.5 M의 인산이수소칼륨 수용액, 물, 포화식염수의 순으로 세정하였다. 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조하고, 감압 농축하여, 25.9 g의 목적물을 얻었다.

공정 2： 아미노메틸폴리스티렌 수지에 담지된 4―｛［(2S,6R)―6―(4―벤즈아미드―2―옥소피리미딘―1―일)―4―트리틸모르폴린―2―일］메톡시｝―4―옥소부탄산의 제조

4―｛［(2S,6R)―6―(4―벤즈아미드―2―옥소피리미딘―1(2H)―일)―4―트리틸모르폴린―2―일］메톡시｝―4―옥소부탄산 23.5 g을 피리딘(탈수) 336 mL에 용해하고, 4―DMAP 4.28 g, 1―에틸―3―(3―디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염 40.3 g을 첨가하였다. 이어서, 아미노메틸폴리스티렌 수지 1% DVB 가교(도쿄 화성공업사 제조, A1543) 25.0 g, 트리에틸아민 24 mL를 첨가하고, 실온에서 4일간 진탕하였다. 반응 후, 수지를 여과하여 취하였다. 얻어진 수지를 피리딘, 메탄올, 디클로로메탄의 순으로 세정하고, 감압 건조하였다. 얻어진 수지에 테트라히드로푸란(탈수) 150 mL, 무수 초산 15 mL, 2,6―루티딘 15 mL를 첨가하고, 실온에서 2시간 진탕하였다. 수지를 여과하여 취하고, 피리딘, 메탄올, 디클로로메탄의 순으로 세정하고, 감압 건조하여, 33.7 g의 목적물을 얻었다.

당해 목적물의 로딩량은 공지의 방법을 사용하여, 수지 1 g당의 트리틸의 몰량을 409 ㎚에 있어서의 UV 흡광도를 측정함으로써 결정하였다. 수지의 로딩량은 397.4 ㎛ol／g이었다.

UV 측정 조건

기기：U―2910(히타치 제작소)

용매：메탄설폰산

파장：265 ㎚

ε값：45000

(2) PMO No.8의 제조

PMO No.8은 엑손 53 중 「제36∼56번째」를 표적서열로 하며, 5' 말단의 기는 「기(3)」이고, 염기부분의 서열은 서열번호 3으로 표시된다.

아미노메틸폴리스티렌 수지에 담지된 4―｛［(2S,6R)―6―(4―벤즈아미드―2―옥소피리미딘―1(2H)―일)―4―트리틸모르폴린―2―일］메톡시｝―4―옥소부탄산(참고예 1) 2 g(800 ㎛ol)을 반응조에 옮겨 넣고, 디클로로메탄 30 mL를 첨가하여, 30분간 정치하였다. 또한, 디클로로메탄 30 mL로 2회 세정한 후, 아래 합성 사이클을 개시하였다. 표기 화합물의 염기서열이 되도록, 각 사이클에 있어서 목적하는 모르폴리노 모노머 화합물을 첨가하였다.

또한, 디블록 용액으로서는, 트리플루오로초산(2당량)과 트리에틸아민(1당량)의 혼합물을 3%(w／v)가 되도록, 1%(v／v)의 에탄올과 10%(v／v)의 2,2,2―트리플루오로에탄올을 함유하는 디클로로메탄 용액으로 용해한 것을 사용하였다. 중화 용액으로서는, N,N―디이소프로필에틸아민을 5%(v／v)가 되도록, 25%(v／v)의 2―프로판올을 함유하는 디클로로메탄 용액으로 용해한 것을 사용하였다. 커플링 용액 A로서는, 모르폴리노 모노머 화합물을 0.15 M가 되도록, 10%(v／v)의 N,N―디이소프로필에틸아민을 함유하는 1,3―디메틸―2―이미다졸리디논으로 용해한 것을 사용하였다. 커플링 용액 B로서는, N,N―디이소프로필에틸아민을 10%(v／v)가 되도록, 1,3―디메틸―2―이미다졸리디논으로 용해한 것을 사용하였다. 캡핑 용액으로서는, 디클로로메탄에 대해 20%(v／v)의 무수 초산과 30%(v／v)의 2,6―루티딘을 용해한 것을 사용하였다.

상기에서 합성한 PMO가 담지된 아미노메틸폴리스티렌 수지를 반응용기로부터 회수하여, 2시간 이상 실온에서 감압 건조하였다. 건조한 아미노메틸폴리스티렌 수지에 담지된 PMO를 반응용기에 넣고, 28% 암모니아수―에탄올(1／4) 200 mL를 첨가하고, 55℃에서 15시간 교반하였다. 아미노메틸폴리스티렌 수지를 여과 분별하고, 물―에탄올(1／4) 50 mL로 세정하였다. 얻어진 여액을 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 20 mM의 초산―트리에틸아민 완충액(TEAA 완충액)과 아세토니트릴의 혼합용매(4／1) 100 mL에 용해하고, 멤브레인 필터로 여과하였다. 얻어진 여액을 역상 HPLC로 정제하였다. 사용한 조건은 아래와 같다.

각 프랙션을 분석하여, 아세토니트릴―물(1／1) 100 mL로 목적물을 회수하여, 에탄올 200 mL를 첨가하고, 감압 농축하였다. 추가로, 감압 건조하여, 백색 고체를 얻었다. 얻어진 고체에 10 mM의 인산 수용액 300 mL를 첨가하여 현탁시켰다. 2 M의 인산 수용액 10 mL를 첨가하고, 15분간 교반하였다. 추가로, 2 M의 수산화나트륨 수용액 15 mL를 첨가하여 중화하였다. 추가로, 2 M의 수산화나트륨 수용액 15 mL를 첨가하여 알칼리성으로 하고, 멤브레인 필터(0.45 ㎛)로 여과하였다. 10 mM의 수산화나트륨 수용액 100 mL로 세정하고, 수용액으로서 목적물을 얻었다.

얻어진 목적물을 함유하는 수용액을 음이온 교환 수지 칼럼으로 정제하였다. 사용한 조건은 아래와 같다.

각 프랙션을 분석(HPLC)하여, 목적물을 수용액으로서 얻었다. 얻어진 수용액에 0.1 M의 인산 완충액(pH 6.0) 225 mL를 첨가하여 중화하였다. 멤브레인 필터(0.45 ㎛)로 여과하였다. 이어서, 아래 조건에서 한외여과를 행하여 탈염하였다.

여액을 농축하여, 약 250 mL의 수용액을 얻었다. 얻어진 수용액을 멤브레인 필터(0.45 ㎛)로 여과하였다. 얻어진 수용액을 동결 건조하여 백색 면상 고체로서 1.5 g의 목적 화합물을 얻었다.

ESI―TOF―MS 계산값：6924.82

측정값：6923.54

［실시예 1］미국 제2상 시험

제II상 용량 설정 시험 「NS―065／NCNP―01―201 시험」이 2016년 12월에 「IND127474」하에 개시되었다. 본 시험은 ClinicalTrials. gov 인식번호 「NCT02740972」로서 「Safety and Dose Finding Study of NS―065／NCNP―01 in Boys With Duchenne Muscular Dystrophy(DMD)」의 표제하에 행하여졌다. 본 시험의 임상시험 실시계획서는 https：／／www.clinicaltrials.gov／ct2／show／study／NCT02740972로부터 입수 가능하며, 그 내용 전체가 참고로서 원용된다. 본 시험은 엑손 53 스키핑에 의한 치료에 적합한 듀시엔형 근이영양증(DMD) 환자에 있어서, 점적 정맥주사로서 송달되는 고용량(80 ㎎／㎏) 및 저용량(40 ㎎／㎏)의 NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)의 안전성을 평가하는 것을 주된 목적으로 하였다. 또한, 인용성(인용성), 근육기능 및 근력, 약물동태 및 약력학이 추가적인 목적으로서 포함되었다.

보다 구체적으로는, 제II상 다시설 2기간 무작위화 플라세보 대조 용량 설정 시험으로, DMD의 만 4세 이상 10세 미만의 외래 남아에게 NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)을 주 1회 24주간 점적 투여하였다. 2개의 용량 레벨 코호트를 포함시켰다. 기간 1은 이중맹검 양식으로 시험하였다. 환자는 무작위로 NS―065／NCNP―01(Viltolarsen) 또는 플라세보를, 참가의 최초 4주간(기간 1) 주 1회 점적 정맥주사되고, 이어서 NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)을 5∼24주간(20주간의 실약 치료―기간 2) 점적 정맥주사되었다. 40 ㎎／㎏ 용량 코호트의 기간 1로부터의 안전성 데이터의 분석은, 80 ㎎／㎏ 용량 코호트에 환자를 등록하기 전에 완료하였다. 24주간의 시험을 완료한 환자는 비맹검 연장시험을 받을 수 있었다.

임상적 유효성은 정기적으로 예정된 시험 내원 시에 평가하였다. 모든 환자는 베이스라인 시에 이두근 생검을 받고, 24주째에 2회째의 근생검을 받았다.

안전성은 유해사상(AE), 혈액 및 뇨의 실험실 시험, 심전도(ECG), 활력징후, 및 시험 전체에 걸친 신체검사를 수집함으로써 평가하였다. NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)의 약물동태를 평가하기 위해, 4회의 시험 내원 시에 연속 혈액 샘플을 채취하였다.

＜임상시험(治驗)의 종류：개입(임상시험)＞

·실제 등록：16명의 참가자.

·할당：무작위화.

·개입 모델：병렬 할당.

·마스킹：Quadruple(참가자, 케어 제공자, 임상시험 책임 의사, 아웃컴 평가자).

·주요 목적：치료.

·실제 시험 개시일：2016년 12월.

·초회 완료일：2018년 3월.

＜환자군과 개입＞

·실험：NS―065／NCNP―01(Viltolarsen) 40 ㎎／㎏

엑손 53 스키핑에 의한 치료에 적합한 유전자 결실을 갖는 DMD가 확인된 6명의 환자에게, NS―065／NCNP―01(Viltolarsen) 40 ㎎／㎏ 용량을 주 1회 24주간 점적 정맥주사하였다.

·실험：NS―065／NCNP―01(Viltolarsen) 80 ㎎／㎏

엑손 53 스키핑에 의한 치료에 적합한 유전자 결실을 갖는 DMD가 확인된 6명의 환자에게, NS―065／NCNP―01(Viltolarsen) 80 ㎎／㎏ 용량을 주 1회 24주간 점적 정맥주사하였다.

·플라세보 비교제：플라세보

각 용량군의 2명 또는 3명의 환자에게 4주간, 주 1회, 점적 정맥주사로서 플라세보를 투여한 후, 20주간의 오픈 라벨 처치를 행하였다.

＜선택기준＞

·만4세 이상, 10세 미만의 남성.

·엑손 53의 스키핑치료에 의한 디스트로핀 mRNA 리딩 프레임의 회복에 적합한 디스트로핀 유전자에 있어서의 DMD 돌연변이(단수 또는 복수)를 갖는 것이 확인되어 있는 것

·보조장치 없이 독립적으로 걸을 수 있는 것

·일어서기까지의 시간, 달리기／걷기까지의 시간, 및 평가를 상승시키기까지의 시간

·글루코코르티코이드의 적어도 3개월간의 안정 투여

＜제외기준＞

·임상시험약의 초회 투여 전 4주간 이내의 급성 질환.

·증후성 심근증의 증거. (조사 시의 무증후성 심장 이상은 제외하지 않음)

·약물요법에 대한 중증의 알레르기 또는 과민증

·임상시험 책임 의사의 의견에 있어서, 임상시험으로의 참가를 방해하는 위중한 행동상 또는 인지상의 문제

·임상시험 책임 의사의 의견에 의한, 안전성에 영향을 미칠 가능성이 있거나, 치료 및 추적 조사가 바르게 완료될 전망이 낮거나, 또는 임상시험결과의 평가를 손상시키는, 이전 또는 진행 중의 병상, 병력, 신체 소견 또는 임상검사값 이상

·현재 또는 임상시험약 투여 개시 전 3개월 이내에 다른 임상시험약의 복용

·NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)의 최초의 예상되는 투여 전 3개월 이내에 수술을 받았거나, 또는 시험기간에 외과수술을 예정하고 있었던 환자

·이전에 본 시험에 참가한 환자 또는 NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)이 투여되고 이전에 다른 시험에 참가했던 환자

다시 요약하자면, 엑손 53 스키핑 치료에 적합하고, 또한 3개월 이상의 글루코코르티코이드 투여에 있어서 안정한 16명의 남성 환자에게 40 ㎎／㎏／주 및 80 ㎎／㎏／주 용량을 시험하는, 24주간의 2 코호트 시험이었다. 각 코호트의 플라세보군 환자는 유해사상(안전성 아웃컴)의 대조로서 최초의 4주간의 무작위화 기간을 받았다. 이어서, 플라세보 처치 환자 및 활성 처치 환자 양쪽을, 20주간의 처치 기간에 걸쳐 시험을 계속시켰다. NS―065／NCNP―01―201 시험에서는, NS―065／NCNP―01(Viltolarsen) 주사액을 40 ㎎／㎏／주의 저용량 및 80 ㎎／㎏／주의 고용량의 2개의 용량 코호트로 20∼24주간 투여하고, 디스트로핀 단백질의 de novo 발현에 미치는 영향을 평가하였다(도 1을 참조). 시험 NS―065／NCNP―01―201의 목표는 웨스턴 블롯(WB)법(프라이머리 서로게이트 엔드 포인트)을 사용하여 측정한 골격근에 있어서의 디스트로핀 단백질의 de novo 발현에 기초하여, 안전하고 유효한 용량을 동정하는 것이었다. 세컨더리 서로게이트 엔드 포인트에는, de novo 디스트로핀 단백질 발현의 면역형광(IF) 염색 및 질량분석 검출, 및 de novo 디스트로핀 mRNA 레벨의 RT―PCR 검출이 포함되었다. 제2상 시험의 세컨더리 엔드 포인트로서 몇 가지의 기능적인 엔드 포인트도 포함되었다. 시험 NS―065／NCNP―01―201 엔드 포인트는 아래와 같다：

＜프라이머리 엔드 포인트＞

·NS―065／NCNP―01(Viltolarsen) 주사액의 저용량(40 ㎎／㎏／주) 및 고용량(80 ㎎／㎏／주) 정맥 내(IV) 투여의 안전성 및 인용성

·치료의 20∼24주간 후에 근육에 있어서의 디스트로핀 단백질의 유도를 웨스턴 블롯에 의해 측정하고, 이를 NS―065／NCNP―01(Viltolarsen) 주사액의 저 및 고IV 용량의 효과로 하였다.

도 1에 있어서, 아래 절반에 나타낸 「고용량：80 ㎎／㎏／주」의 시계열은 위 절반에 나타낸 「저용량：40 ㎎／㎏／주」의 시계열로부터 뒤의 시간에 상쇄되고 있어, 저용량 투여에서 안전성이 확인된 후에만 고용량 투여가 개시된 것을 나타내고 있다.

측정내용：

1. mRNA 분석을 위한 실시간 중합 효소 연쇄 반응(RT―PCR)에 의해 측정한 근육에 있어서의 디스트로핀 mRNA의 유도(타임 프레임 20∼24주의 처치)

RT―PCR은 디스트로핀 RNA의 변화된 스플라이싱을 측정한다. 이 방법에 있어서, mRNA는 동결 근생검으로부터 단리되어, cDNA로 역전사된다. PCR 프라이머는 디스트로핀 mRNA 상의 엑손 53 부위에 인접하여 설계된다. 스플라이싱된 디스트로핀 mRNA의 특정 버전에 대응하는 RT―PCR 밴드를 겔전기영동에 의해 가시화하여, 상이한 mRNA 아이소폼의 양을 비교한다. 약제가 RNA 표적에 잘 결합하는 경우, 엑손 53은 얻어지는 mRNA 전사물로부터 제외된다.

2. 단백질 분석을 위한 웨스턴 블롯에 의해 측정되는 근육에서 유도된 디스트로핀 단백질. (타임 프레임：20∼24주간의 처치)

주요한 생화학적 결과의 측정은 면역 블로팅(웨스턴 블롯)에 의한 디스트로핀 생산량의 약물 유발성 증가의 측정으로, 디스트로핀 면역 블로팅은 가용화된 근육 생검 동결 절편을 사용하고, 단백질은 겔전기영동(SDS―PAGE), 니트로셀룰로오스로의 일렉트로 블로팅, 이어서, 디스트로핀 단백질을 검출하기 위한 항체와의 니트로셀룰로오스의 인큐베이션을 거쳐, 분자량에 의해 분획된다. 이어서, 환자의 생검으로부터의 디스트로핀에 대한 면역 블로팅 시그널을, 동일한 겔(혼합 DMD 및 정상 대조) 상의 디스트로핀의 표준곡선의 시그널과 비교한다. 이로써, 근육 중의 디스트로핀 함량의 반정량적 평가가 제공된다.

미국 제2상 시험：유효성

아웃컴 측정 1

아웃컴 측정 1(즉, de novo 디스트로핀 mRNA 레벨의 RT―PCR 검출)에 대해서 얻어진 결과는, 아래와 같다.

아웃컴 측정 2

아웃컴 측정 2(즉, 웨스턴 블롯법을 사용한 골격근에 있어서의 de novo 디스트로핀 단백질 발현량의 측정)에 대해서 얻어진 결과는 베이스라인의 평균값과 치료 중의 평균값 사이에서 비교하여, 베이스라인으로부터 19.0배의 증가(40 ㎎／㎏／주로 24주간) 및 9.8배의 증가(80 ㎎／㎏／주로 24주간), 및 각 환자의 증가율의 평균값으로서 계산하여, 27.2배의 증가(40 및 80 ㎎／㎏／주로 24주간)를 나타내었다. 얻어진 데이터를 아래의 표 8 및 도 2에 요약한다.

NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)에 의한 디스트로핀 회복의 정도(40 또는 80 ㎎／㎏／주, 24주)는 2016년에 사렙타·테라퓨틱스사에 의해 발매된 엑손 51 스키핑에 의한 치료에 적합한 Exondys51(등록상표)(eteplirsen)(30 ㎎／㎏／주, 48 및 180주)에 대해서 이전에 보고된 회복의 정도와 비교하여 적게 추측하더라도 약 3∼7배 또는 8.8∼9.7배 높았다. 구체적으로는, 비교를 위해 Exondys51(등록상표)(eteplirsen)의 대응하는 웨스턴 블롯 데이터를 아래에 나타낸다. NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)이 24주간 투여된 16명의 환자 중 3명에서는, 디스트로핀 레벨은 베이스라인으로부터 10%를 초과하여 증가하고 있었다. NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)을 24주간 투여한 환자 16예 중 12예에서는, 디스트로핀값의 3% 이상의 상승이 확인되었다. 호프만(Hoffman) 등은 「베커형 디스트로피 및 이상한 디스트로핀 표현형의 듀시엔(정상 레벨의 디스트로핀의 3% 미만)을 갖는 환자 중에서, 임상 표현형의 중증도와 디스트로핀 평가결과 사이에 명확한 보정이 있었다」고 보고하고 있다(Eric P. Hoffman, et al., "Characterization of Dystrophin in Muscle―Biopsy Specimens from Patients with Duchenne's of Becker's Muscular Dystrophy." N. Engl. J. Med., 318：1363―1368(1988)).

·eteplirsen 웨스턴 블로팅：2.8배 증가(0.16%에서 0.44%로의 변화(30 ㎎／㎏／주, 48주간)). (「평가 가능한 결과가 얻어진 12예에 있어서, 디스트로핀 농도는 치료 전에서는 건강한 피험자의 디스트로핀 농도의 0.16%±0.12%(평균±표준편차)이고, EXONDYS51 투여 48주간 후에서는 0.44%±0.43%(p＜0.05)였다」)

(https：／／www.fda.gov／downloads／AdvisoryCommittees／CommitteesMeetingMaterials／PediatricAdvisoryCommittee／UCM557917.pdf로부터 입수 가능)

·eteplirsen 웨스턴 블로팅：3.1배(0.3%에서 0.93%로의 변화)(30 ㎎／㎏／주, 180주간). (「단지신근(EDB)의 생검으로부터의 웨스턴 블롯에서는 디스트로핀 레벨은 평균하여 정상값의 약 0.3%였으나, 그 범위는 검출 불능으로부터 정상값의 약 1% 이상까지였다.」「이 출원인이 사용한 가장 정확한 정량적 방법인 웨스턴 블롯법에서는, eteplirsen 처치로부터 약 3.5년 후의 평균 디스트로핀 레벨은 건강한 피험자의 0.93%±0.84%였다(평균±표준편차))

(https：／／www.fda.gov／downloads／advisorycommittees／committeesmeetingmaterials／drugs／peripheralandcentralnervoussystemdrugsadvisorycommittee／ucm497063.pdf.로부터 입수 가능)

·eteplirsen 웨스턴 블롯：180주에서 0.93%, 범위는 0%∼2.47%(30 ㎎／㎏／주, 180주)였다(Kenji Rowel Q Lim,et al., "Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy." Drug Des. Devel. Ther., 11：533―545(2017)

https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／pmc／articles／PMC5338848／).

·또한, 「eteplirsen에 대해서 180주째에 실시된 시험에서는, 30 ㎎／㎏과 50 ㎎／㎏의 주 투여량에 따른 디스트로핀 생산량에 대한 용량 반응에 차는 보이지 않았다. 이는 이 접근이 다른 엑손에 대해서는 유효하지 않을 가능성을 시사한다」(Kenji Rowel Q Lim, et al., "Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy." Drug Des. Devel. Ther., 11：533―545(2017) https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／pmc／articles／PMC5338848／)

엑손 53 스키핑에 의한 치료에 적합한 DMD 환자용 모르폴리노올리고뉴클레오티드인 SRP―4053(golodirsen；Sarepta에 의함)과의 비교에 있어서도, 관찰되는 디스트로핀 레벨의 증가량에 있어서, Viltolarsen에서는 보다 우수한 효과가 얻어지는 것이 나타내어졌다. 구체적으로는, 비교 목적을 위해, Viltolarsen의 24주간의 투여가 아니라, 48주간의 투여 후에 얻어진 SRP―4053(golodirsen)의 대응하는 웨스턴 블롯 데이터를 아래에 나타낸다.

·golodirsen 웨스턴 블롯：0.095%에서 1.019%로의 변화(48주간 30 ㎎／㎏). (「디스트로핀 단백질의 평균 증가량은 웨스턴 블롯 측정(본 시험의 생물학적 프라이머리 엔드 포인트)에 있어서, 정상값의 0.095%(p＜0.001)의 평균 베이스라인과 비교하여, 정상값의 1.019%로 증가하였다. 이는 베이스라인으로부터 10.7배의 증가를 나타낸다.」)

(http：／／investorrelations.sarepta.com／news―releases／news―release―details／sarepta―therapeutics―announces―positive―results―its―study.로부터 입수 가능)

·golodirsen 웨스턴 블롯：최소 0.09%, 최대 4.30%(30 ㎎／㎏／주로 48주간. 25예 중 2예에서 3% 이상의 디스트로핀값의 상승이 확인되었다(22nd International Congress of the World Muscle Society(3―7 October 2017, St. Malo, France), http：／／www.google.co.jp／url？sa＝t＆source＝web＆cd＝2＆ved＝2ahUKEwid7ZTQ9OrbAhUETLwKHX3xDk8QFjABegQIARAB＆url＝http%3A%2F%2Finvestorrelations.sarepta.com%2Fstatic―files%2F64d8d897―2e4a―4119―80b4―115cbae17993＆usg＝AOvVaw1Amh1Mq1VauvLkPvYWfVdR).

미국 제2상 시험：안전성

NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)을 고용량 및 저용량(40 ㎎／㎏／주 및 80 ㎎／㎏／주)을 투여한 DMD 환자 16예의 안전성 데이터에 대해서는, 시험의 실시, 데이터의 질, 또는 참가자의 안전성에 커다란 우려는 없었다. 36주간의 시점에서 치료를 중지한 참가자는 없었다. 구체적으로는, 위중한 유해사상은 없고, 중지에 이른 유해사상도 없으며, 약제 관련 유해사상도 없었다. 모든 유해사상은 경도 또는 중등도였다.

［실시예 2］미국／캐나다의 제2상 시험

제I상 용량 설정 시험 「NS―065／NCNP―01―201 시험」이 2016년 12월에 「IND127474」하에 개시되었다. 본 시험은 ClinicalTrials. gov 인식번호 「NCT02740972」로서 「Safety and Dose Finding Study of NS―065／NCNP―01 in Boys With Duchenne Muscular Dystrophy(DMD)」의 표제하에 행하여졌다. 본 시험의 임상시험 실시계획서는 https：／／www.clinicaltrials.gov／ct2／show／study／NCT02740972에서 입수 가능하고, 그 내용 전체가 참고로서 원용된다. 본 시험은 엑손 53 스키핑에 의한 치료에 적합한 듀시엔형 근이영양증(DMD) 환자에 있어서, 점적 정맥주사로서 송달되는 고용량(80 ㎎／㎏) 및 저용량(40 ㎎／㎏)의 NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)의 안전성을 평가하는 것을 주된 목적으로 하였다. 또한, 인용성, 근육기능 및 근력, 약물동태, 및 약력학이 추가적인 목적으로서 포함되었다.

보다 구체적으로는, 제II상 다시설 2기간 무작위화 플라세보 대조 용량 설정 시험으로, DMD의 만4세 이상 10세 미만의 외래 남아에게 NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)을 주 1회 24주간 점적 투여하였다. 2개의 용량 레벨 코호트를 포함시켰다. 기간 1은 이중맹검 양식으로 시험하였다. 환자는 무작위로 NS―065／NCNP―01(Viltolarsen) 또는 플라세보를, 참가의 최초의 4주간(기간 1) 주 1회 점적 정맥주사되고, 이어서 NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)을, 5∼24주간(20주간의 실약 치료―기간 2) 점적 정맥 주사되었다. 40 ㎎／㎏ 용량 코호트의 기간 1로부터의 안전성 데이터의 분석은, 80 ㎎／㎏ 용량 코호트에 환자를 등록하기 전에 완료하였다. 24주간의 시험을 완료한 환자는 비맹검 연장시험을 받을 수 있었다.

＜임상시험(治驗)의 종류：개입(임상시험)＞

·실제 등록：16명의 참가자.

·할당：무작위화.

·개입 모델：병렬 할당.

·주요 목적：치료.

·실제 시험 개시일：2016년 12월.

·초회 완료일：2018년 3월.

＜환자군과 개입＞

·실험：NS―065／NCNP―01(Viltolarsen) 40 ㎎／㎏

·실험：NS―065／NCNP―01(Viltolarsen) 80 ㎎／㎏

엑손 53 스키핑에 의한 치료에 적합한 유전자 결실을 갖는 DMD가 확인된 5명의 환자에게, NS―065／NCNP―01(Viltolarsen) 80 ㎎／㎏ 용량을 주 1회 24주간 점적 정맥주사하였다.

·플라세보 비교제：플라세보

40 ㎎／㎏ 용량군의 2명의 환자 및 80 ㎎／㎏ 용량군의 3명의 환자에게 4주간, 주 1회, 점적 정맥주사로서 플라세보를 투여한 후, 20주간의 오픈 라벨 처치를 행하였다.

＜선택기준＞

·동의 시에 만4세 이상이고, 초회 점적 정맥주사 시에 만10세 미만의 남성.

·엑손 53의 스키핑 치료에 의한 디스트로핀 mRNA 리딩 프레임의 회복에 적합한 디스트로핀 유전자에 있어서의 DMD 돌연변이(단수 또는 복수)를 갖는 것이 확인되어 있는 것.

·보조장치 없이 독립적으로 걸을 수 있는 것

·운동기능 평가자가 일어서기 시간(TSTAND), 10 미터 주행／보행 시간(TTRW), 및 4단 계단 오르기 시간(TTCLIMB)의 평가를 실시 가능하다고 판단한 환자

·글루코코르티코이드의 적어도 3개월간의 안정 투여

＜제외기준＞

·임상시험약의 초회 투여 전 4주간 이내의 급성 질환.

·증후성 심근증의 증거(조사 시의 무증후성 심장 이상은 제외하지 않음)

·약물요법에 대한 중증의 알레르기 또는 과민증

·현재 또는 임상시험약 투여 개시 전 3개월 이내에 다른 임상시험약의 복용.

·이전에 본 시험에 참가한 환자 또는 NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)이 투여된 다른 시험에 참가했던 환자

다시 요약하자면, 엑손 53 스키핑에 의한 치료에 적합하고, 또한 3개월 이상의 글루코코르티코이드 투여에 있어서 안정한 16명의 남성 환자에게 40 ㎎／㎏／주 및 80 ㎎／㎏／주 용량을 시험하는, 24주간의 2 코호트 시험이었다. 각 코호트의 플라세보군 환자는 유해사상(안전성 아웃컴)의 대조로서 최초의 4주간의 무작위화 기간을 받았다. 이어서, 플라세보 처치 환자 및 활성 처치 환자 양쪽을, 20주간의 처치 기간에 걸쳐 시험을 계속시켰다. NS―065／NCNP―01―201 시험에서는, NS―065／NCNP―01(Viltolarsen) 주사액 250 ㎎을 40 ㎎／㎏／주의 저용량 및 80 ㎎／㎏／주의 고용량의 2개의 용량 코호트로 20∼24주간 투여하고, 디스트로핀 단백질의 de novo 발현에 미치는 영향을 평가하였다(도 1을 참조). 시험 NS―065／NCNP―01―201의 목표는 웨스턴 블롯(WB)법(프라이머리 서로게이트 엔드 포인트)을 사용하여 측정한 골격근에 있어서의 디스트로핀 단백질의 de novo 발현에 기초하여, 안전하고 유효한 용량을 동정하는 것이었다. 세컨더리 서로게이트 엔드 포인트에는, de novo 디스트로핀 단백질 발현의 면역형광(IF) 염색 및 질량분석 검출, 및 de novo 디스트로핀 mRNA 레벨의 RT―PCR 검출이 포함되었다. 제2상 시험의 세컨더리 엔드 포인트로서 몇 가지의 운동기능적인 엔드 포인트도 포함되었다. 시험 NS―065／NCNP―01―201의 엔드 포인트는 아래와 같다：

＜프라이머리 엔드 포인트＞

·NS―065／NCNP―01(Viltolarsen) 주사액 250 ㎎의 저용량(40 ㎎／㎏／주) 및 고용량(80 ㎎／㎏／주) 정맥 내(IV) 투여의 안전성 및 인용성

·치료의 20∼24주간 후에 근육에 있어서의 디스트로핀 단백질의 유도를 웨스턴 블롯에 의해 측정하고, 이를 NS―065／NCNP―01(Viltolarsen) 주사액 250 ㎎의 저 및 고IV 용량의 효과로 하였다.

·NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)의 혈중 약물 농도

＜세컨더리 엔드 포인트＞

·NS―065／NCNP―01(Viltolarsen) 주사액 250 ㎎의 저용량 및 고용량 정맥주사가, 20∼24주간의 치료 후에 근육 중의 디스트로핀 mRNA 및 단백질의 유도에 미치는 효과를, RT―PCR법에 의한 mRNA 분석, 및 면역형광 염색 및 질량분석법에 의한 단백질 분석으로 측정함으로써 평가한다.

·NS―065／NCNP―01(Viltolarsen) 주사액 250 ㎎의 저용량 및 고용량의 정맥 내 투여가, 20∼24주간의 치료 후에 근력, 가동성, 및 기능적 운동능력에 미치는 영향을 조사하기 위해, 일어서기 시간(TSTAND), 10 미터 주행／보행 시간(TTRW), 4단 계단 오르기 시간(TTCLIMB), 노스·스타 보행능력 평가(NSAA), 6분간 보행 시험(6MWT), 및 정량적 근육 시험(QMT)을 대응하는 자연력 대조군과의 비교에 있어서 측정하였다.

도 3에 있어서, 아래 절반에 나타낸 「고용량：80 ㎎／㎏／주」의 시계열은 위 절반에 나타낸 「저용량：40 ㎎／㎏／주」의 시계열로부터 나중의 시간에 상쇄되고 있어, 저용량 투여에서 안전성이 확인된 후에만 고용량 투여가 개시된 것을 나타내고 있다.

미국／캐나다 제2상 시험 세컨더리 엔드 포인트：외부의 무치료 자연력군(국제 신경근 연구 그룹(CINRG)의 듀시엔형의 자연력의 연구(DNHS))과의 비교에 있어서의 시간 기능 검사

미국／캐나다 제2상 시험 NS―065／NCNP―01―201에 등록된 환자를, 베이스라인, 13주째, 및 25주째에 근육기능에 대해서 임상적으로 평가하였다. 본 시험의 목적에 있어서 4주간의 플라세보 기간에 대해서 보정은 행하지 않았다. 이들 평가에는 몇 가지 타입의 시간 기능 검사가 포함되었다：앙와위로부터의 일어서기 시간(TTSTAND)；10 미터 주행／보행 시간(TTRW)；4단 계단 오르기 시간(TTCLIMB)；6분간 보행 시험(6MWT)；및 노스·스타 보행능력 평가(NSAA). 경시변화를 CINRG DNHS로 시험한 대응하는 환자에 있어서의 질환 궤적과 비교하였다.

CINRG DNHS란 440명의 DMD 환자 각각을 여러 해에 걸쳐 추적한 시험이다(토탈 시험기간은 약 10년간). CINRG는 국제 신경근 연구 그룹(Cooperative International Neuromuscular Research Group)을 가리키고, 「신경근병 환자과 그 가족의 생활에 좋은 영향을 부여하고자 하는 공통의 목표를 공유하는 학술·연구센터의 의학·과학연구자의 컨소시엄」(http：／／www.cinrgresearch.org／)이다. DNHS는 듀시엔형의 자연력의 연구(Duchenne natural History Study)를 나타내고, CINRG(http：／／www.cinrgresearch.org／Duchenne―Natural―history／로부터)에 의해 확립된 「Duchenne muscular dystrophy(DMD)에 있어서의 오늘날까지의 최대 프로스펙티브 다시설 자연력 연구」이다(McDonald CM, Henricson EK, Abresch RT, Han JJ, Escolar DM, Florence JM, Duong T, Arrieta A, Clemens PR, Hoffman EP, and Cnaan A, "CINRG Investigators. The cooperative international neuromuscular research group Duchenne natural history study―alongitudinal investigation in the era of glucocorticoid therapy：design of protocol and the methods used," Muscle Nerve., 48(1), 32―54(2013)., Henricson EK, Abresch RT, Cnaan A, Hu F, Duong T, Arrieta A, Han J, Escolar DM, Florence JM, Clemens PR, Hoffman EP, and McDonald CM, "CINRG Investigators. The cooperative international neuromuscular research group Duchenne natural history study：glucocorticoid treatment preserves clinically meaningful functional milestones and reduces rate of disease progression as measured by manual muscle testing and other commonly used clinical trial outcome measures," Muscle Nerve., 48(1), 55―67(2013). 및 McDonald CM, Henricson EK, Abresch RT, Duong T, Joyce NC, Hu F, Clemens PR, Hoffman EP, Cnaan A, and Gordish―Dressman H, "CINRG Investigators. Long―term effects of glucocorticoids on function, quality of life, and survival in patients with Duchenne muscular dystrophy：a prospective cohort study," Lancet, 391(10119), 451―461(2018)).

NS―065／NCNP―01―201 시험은 CINRG 네트워크에 참가하고 있는 임상시설에 의해 실시하였다. 표준조작 절차(임상 매뉴얼) 및 임상 평가자 훈련 프로토콜은 NS―065／NCNP―01―201 임상시험 및 CINRG DNHS와 매우 유사하였다. NS―065／NCNP―01―201 대 CNRG DNHS에 등록된 환자의 대응(매칭)은, 아래의 기준을 사용하여 행하였다.

·베이스라인 시의 연령이 만4세부터 10.5세 미만의 남아.

·12개월 이상의 시간 기능 테스트 데이터를 갖는 환자.

·지역：북미(미국, 캐나다).

·스테로이드가 적어도 3개월간 투여되고 있고, 12／24개월의 관찰기간을 통해 스테로이드를 지속 투여받을 것

·다른 임상시험으로의 불참가

NS―065／NCNP―01―201 임상시험에 등록된 환자에 매칭된 환자에 대한 CINRG DNHS 데이터베이스의 문의는, 엑손 53 스키핑에 의한 치료에 적합한 디스트로핀 돌연변이는 특정하지 않았으나, 엑손 3―7 결실을 갖는 환자 및 엑손 44 스키핑에 의한 치료에 적합한 디스트로핀 결실을 갖는 환자는 제외하고, 그 결과 아래의 표 9에 나타내어지는 69명의 피험자가 얻어졌다. 엑손 3―7 결실을 갖는 환자 및 엑손 44 스키핑에 의한 치료에 적합한 디스트로핀 결실을 갖는 환자를 제외한 이유는, 이들 환자가 비교적 경도의 증상을 나타내는 것이 보고되어 있었기 때문이다.

표 9의 가장 위의 행에 있어서, 「엑손(Exon) 53 스킵」이란, 엑손 53 스키핑에 의한 치료에 적합한 DMD 환자를 의미하고, 「비엑손 53 스킵」은 다른 모든 환자를 의미한다(단, 상기 제외사항에 유의). 표 9의 아래 열에 있어서, 「커다란 결실／중복 없음」은 점 돌연변이(엑손 스키핑에 의한 치료에 부적합)와 같은 다른 카테고리를 포함한다.

6MWT의 데이터를 갖는 CINRG DNHS 환자의 수는 다른 평가항목의 환자의 수보다도 적었다. 그 이유는 6MWT가 CINRG DNHS 프로토콜의 후기에 추가되었기 때문에, 다른 시간 기능 검사와 비교하여 데이터량이 한정되어 버렸기 때문이다.

NS―065／NCNP―01―201에 등록된 16명의 환자와 CINRG DNHS에 등록된 69명의 환자의 24주간에 걸친 질환의 궤적을 비교한 바, 24주간의 시간 프레임에 있어서 자연력 비교군의 환자가 시간 기능 검사에 있어서 기능 저하를 나타내는 것을 알 수 있었다. 대조적으로, NS―065／NCNP―01―201에 등록된 환자는 24주간의 같은 기간에 있어서 시간 기능 검사에 있어서 평균값으로서 개선을 나타내었다. 이들 개선 중 3개는 통계적 유의성에 도달하였다：TTRW(13주째 및 25주째)；TSTAND(25주째)；및 6MWT(25주째). 40 ㎎／㎏／주 및 80 ㎎／㎏／주의 NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)의 용량 사이에 통계적 유의차는 관찰되지 않았다.

도 4(합계 5개의 그래프와 하나의 표)는 NS―065／NCNP―01―201에 등록된 환자(청색 실선으로 「Viltolarsen」으로서 나타내어짐)와 CINRG DNHS에 있어서 매칭된 환자(적색 파선으로 「DNHS」로서 나타내어짐)에 있어서의 24주간에 걸친 시간 기능 검사에 있어서의 베이스라인으로부터의 변화의 비교를 나타낸다.

도 4의 5개의 그래프에 있어서, 「Viltolarsen」은 NS―065／NCNP―01의 국제 일반명(INN)이다. 또한, 모든 그래프에 있어서, 베이스라인으로부터의 변화를 반복 측정(MMRM) 분석을 위한 제한최우(REML) 베이스의 혼합 모델을 사용하여, Viltolarsen 투여군과 CINRG DNHS 환자군 사이에서 비교하였다.

(1) 시간 기능 검사(Timed Function Test)

시간 기능 검사는 TTSTAND, TTRW, TTCLIMB, 6MWT였다. TSTAND 및 TTRW는 별개의 평가항목으로서 사전에 특정되어, 시간 및 6점 만점 평가의 스케일을 토대로 평가되었다. TSTAND 및 TTRW는 NSAA의 구성항목이기도 하다. 따라서, 그들을 1회 측정하여 그 데이터를 독립형 엔드 포인트로서 사용하여, 추가로 조합해서 NSAA 시험의 일부로서 사용하였다. TSTAND 및 TTRW는 조합된 NSAA 스케일과의 관계에 대해서 아래에서 추가로 설명된다. TTCLIMB를 사용하여, 환자가 4단 계단을 오르는데 소요된 시간(초)을 평가하였다. 상기 「미국／캐나다 제2상 시험」에 기재된 임상 프로토콜에서는, TTCLIMB 시험이 NSAA의 일부로서 실시하였다고 잘못 기재되어 있는 것에 유의해야 한다.

6MWT는 많은 질환에 있어서 널리 사용되고, 받아들여지고 있는 시험으로, 그중에서도 본 시험에서 사용한 것은 DMD에 적합한 버전이다. 이 시험은 1)기능적 운동상태, 및 2)운동에 대한 통합된 전체적인 반응을 임상적으로 평가하는, 간단하고, 표준화된, 저기술로, 비용효과가 높은 평가수단이라고 생각되고 있다. 본 시험을 실시함에 있어서, 2점(콘)을 25 미터 떨어뜨려 설치하고, 환자에게 콘 사이를 신속하고 안전하게 6분간에 걸쳐 보행하도록 의뢰하였다. 환자가 6분간 걸은 총거리(미터)를 기록하였다. 임상평가자는 환자가 최초의 50 미터에 소요된 걸음수와 6분간에 보행한 총거리(미터)를 측정하였다(Craig M. McDonald, MD, Erik K. Henricson, MPH, Jay J. Han, MD, R. Ted Abresch MS, Alina Nicorici, BS, Gary L. Elfring, MS, Leone Atkinson MD, PhD, Allen Reha BS, Samit Hirawat MD, and Langdon L. Miller MD, "The 6―minute Walk Test as a New Outcome Measure in Duchenne Muscular Dystrophy," Muscle ＆ Nerve, Vol. 41, pp.500―510, April 2010, Wiley Periodicals, Inc. 및 Craig M. McDonald, MD, Erik K. Henricson, MPH, R. Ted Abresch, MS, Julaine Florence, PhD, Michelle Eagle, PhD, Eduard Gappmaier, PhD, Allan M. Glanzman, DPT, Robert Spiegel, MD, Jay Barth, MD, Gary Elfring, MS, Allen Reha, MS, and Stuart W. Peltz, PhD, "The 6―minute Walk Test and Other Clinical Endpoints in Duchenne Muscular Dystrophy：Reliability, Concurrent Validity, and Minimal Clinically Important Differences from a Multicenter Study," Muscle ＆ Nerve, Vol. 48, pp.357―368, September 2013, Wiley Periodicals, Inc.).

정량적 근육검사(QMT) 평가는 정적 수축 시에 만들어지는 근력을 측정하도록 설계되어, 신경근 질환에 있어서의 근력 저하를 측정하기 위해 충분히 확립된 방법이다. 이 방법에서는 CINRG 정량 근육 시스템(CQMS)을 사용하였다. CQMS는 DMD를 앓는 아이의 적합성을 증가시키는 시청각 피드백 프로세스를 포함한다. 환자는 등을 지지하는 기구를 구비한 검사 테이블 위에 놓이고, 이로써 수동으로 등을 안정화시킬 필요성을 배제하였다. 단회 실시 투여(single practice administration) 후, 각 환자는 스코어 부여에 의한 QMT 평가를 완료하였다(2개의 검사를 행하여, 2개의 값 중 높은 쪽을 데이터 분석에 사용하였다). QMT는 변형 게이지를 구비한 직접 컴퓨터 인터페이스를 사용하여, 힘을 파운드로서 기록함으로써 행하였다. 시험 위치 및 시험 순서를 표준화하였다. 아래에 열거한 근육군의 양쪽 시험을 행하였다(Mayhew JE, Florence JM, Mayhew TP, Henricson EK, Leshner RT, Mccarter RJ, et al., "Reliable surrogate outcome measures in multicenter clinical trials of Duchenne muscular dystrophy," Muscle ＆ Nerve, 2007；35(1)：36―42. Epub 2006／09／14.)：

·핸드그립.

·팔꿈치 굴근(이두근).

·팔꿈치 신근(삼두근).

·무릎 굴근(햄스트링).

·무릎 신근(사두근).

QMT에 대해서는 팔꿈치 신근을 제외하고, 24주간의 처치기간에 걸쳐 모든 파라미터에 있어서 강도의 평균값에 약간의 감소가 관찰되었다. 그러나 팔꿈치 신근에는 강도의 약간의 증가(개선)가 보였다. 어느 항목에 있어서도 25주째에서의 베이스라인으로부터의 변화에 통계적 유의차는 없었다.

강도·기능 시험은 TTSTAND, TTRW, TTCLIMB, NSAA, 6MWT, QMT의 순으로 실시하였다.

(2) 노스·스타 보행능력 평가(NSAA)

NSAA는 본래는 적어도 10 미터의 보행이 가능한 DMD를 앓는 남아를 위해 설계되어, 임상의의 채점에 의한 17항목으로 이루어지는 기능평가계이다(E. S. Mazzone, S. Messina, G. Vasco, M. Main, M. Eagle, A.D'Amico, L. Doglio, L. Politano, F. Cavallaro, S. Frosini, L. Bello, F. Magri, A. Corlatti, E. Zucchini, B. Brancalion, F. Rossi, M. Ferretti, M. G. Motta, M. R. Cecio, A. Berardinelli, P. Alfieri, T. Mongini, A. Pini, G. Astrea, R. Battini, G. Comi, E. Pegoraro, L. Morandi, M. Pane, C. Angelini, C. Bruno, M. Villanova, G. Vita, M. A. Donati, E. Bertini, and E. Mercuri, "Reliability of the North Star Ambulatory Assessment in a multicentric setting," Neuromuscular Disorders, Vol.19, Issue 7, pp.458―461, Jul 2009, Elsevier B.V.). 이 평가 툴은 일어서기, 플로어로부터의 일어서기, 정해진 스텝, 호핑, 및 러닝을 포함하는 기능적 활동을 평가한다. 평가는 2＝시험내용을 정상으로 실행하는 능력；1＝수정된 방법 또는 보조가 있으면 시험내용을 실행할 수 있다；및 0＝시험을 실행할 수 없다고 하는 3점 평가척도에 기초한다. 따라서 총스코어는 이들 평가에 있어서, 0(완전히 보행 불능)에서 34(장애 없음)까지의 범위가 될 수 있다. 개개의 시험항목의 스코어와 합계 스코어를 기록하였다. TSTAND 및 TTRW는 NSAA의 일부로서 실행하였다.

·TTSTAND는 DMD 환자의 표준적인 임상검사로서 행하여지는 루틴 시험이다. 이 시험에서는, 환자가 바닥에 평평하게 눕는 것부터 서기까지에 소요된 시간을 사용하여 평가한다. 시험을 실행하는데 필요한 초수와, 및 환자가 어떻게 입위에 도달했는지를 6점 만점으로 평가한 점수를 기록하였다.

·TTRW를 사용하여, 환자가 10 미터 보행／주행하는데 소요된 시간(초 단위)을 평가하였다(주행／보행의 질에 대한 6점 만점 평가 스케일을 포함한다).

미국／캐나다의 제2상 시험：안전성

고용량 및 저용량의 NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)(40 ㎎／㎏／주 또는 80 ㎎／㎏／주)을 투여한 DMD 환자 16예의 안전성 데이터에 대해서는, 시험의 실시, 데이터의 질, 또는 참가자의 안전성에 커다란 우려는 없었다. 48주간의 시점에서 치료를 중지한 참가자는 없었다. 구체적으로는, NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)의 투여 중지 또는 감량을 필요로 한 TEAE(치료 시에 발현한 유해사상)는 확인되지 않았다. 모든 유해사상은 경도 또는 중등도였다.

［실시예 3］Viltolarsen의 안정성으로의 pH의 영향

(가) pH 안정성 평가(1)

용액의 액성과 Viltolarsen의 안정성의 관계를 조사하기 위해, 브리톤―로빈손(Britton―Robinson) 완충액(pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11)을 사용하여, 각종 pH 용액 중에서의 Viltolarsen의 안정성을 평가하였다.

［시험 조건］

약액 농도：Viltolarsen 2 ㎎／mL

용해액：브리톤―로빈손 완충액(pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11)

보존 조건：(1) 121℃(오토클레이브 처리)에서 10, 30 또는 60분；또는

(2) 80℃ 항온기 중에서 4 또는 7일

엔드 포인트：외관(육안 확인), pH(pH계), 순도 시험(HPLC법), 회수율(잔존율)(HPLC법)

HPLC 조건：

유량：매분 1.0 mL

검출기：자외 흡광광도계(측정파장：264 ㎚)

칼럼：안지름 4.6 ㎜, 길이 15 ㎝의 스테인리스관에 3.5 ㎛의 액체 크로마토그래피용 옥타데실실릴화 실리카겔을 충전하였다(Waters, X―bridge C18).

칼럼 온도：60℃

이동상：

·인산수소이나트륨 1.42 g을 물 약 750 mL에 녹이고, 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 pH 12.0로 조제한 후, 물을 첨가하여 1000 mL로 하였다(P액).

·P액 700 mL에 아세토니트릴 300 mL를 첨가하고, 브롬화 테트라부틸암모늄 16.12 g을 녹였다(이동상 A).

·P액 300 mL에 아세토니트릴 300 mL를 첨가하고, 브롬화 테트라부틸암모늄 9.67 g을 녹였다(이동상 B).

·이동상의 송액：이동상 A／B (100 vol%／0 vol%)에서 (0 vol%／100 vol%)로 30분에 걸쳐 변경하였다.

본 실시예 및 아래의 실시예에 있어서, 순도 시험의 값으로서 불순물을 포함하는 검출된 전체 피크의 면적의 합계를 100으로 한 경우의 Viltolarsen의 주 피크의 면적의 백분율(주 피크면 백(%))을 나타낸다.

［시험 결과］

시험 결과를 표 10 및 도 5에 나타낸다. 「ST」란, 같은 약액 농도로 정제수에 희석한 Viltolarsen 수용액으로, 시험 시에 그때마다 조제하였다(보존은 행하지 않았다). 그 결과, Viltolarsen은 산성영역의 용액 중에서는 불안정하였지만, 중성∼약알칼리성의 용액 중에서는 비교적 안정하였다.

(나) pH―안정성 평가(2)

Viltolarsen의 안정한 pH영역을 더욱 상세하게 조사하기 위해, 인산칼륨―붕사 완충액(pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0 또는 9.2)을 사용하여, pH 6∼9의 각종 pH용액 중에서의 Viltolarsen의 안정성을 평가하였다.

［시험 조건］

약액 농도：Viltolarsen 2 ㎎／mL

용해액：인산칼륨―붕사 완충액(pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0 또는 9.2)

(2) 80℃ 항온기 중에서 1, 4, 7 또는 14일

HPLC 조건：

칼럼 온도를 50℃로 한 이외는 (가)와 동일.

［시험 결과］

시험 결과를 표 11 및 도 6에 나타낸다. 그 결과, Viltolarsen은 pH 7∼7.5의 용액 중에서 가장 안정하였다.

［실시예 4］제제의 안정성에 대한 pH 조정제의 영향

본 실시예는 Viltolarsen 주사액을 안정한 pH역(pH 7∼7.5)으로 조정하기 위한 pH 조정제를 선택하는 것을 목적으로 한다. 각종 pH 조정제(10 mM KH₂PO₄, 10 mM Na₂HPO₄, 10 mM KH₂PO₄―Na₂HPO₄ 또는 100 mM KH₂PO₄Na₂HPO₄)를 첨가하여 안정한 pH로 조정한 10 ㎎／mL Viltolarsen 용액의 안정성을 평가하였다.

［시험 조건］

약액 농도：Viltolarsen 10 ㎎／mL

약액 처방：아래 표 12와 같음

보존 조건：121℃(오토클레이브 처리)에서 30∼60분까지

［시험 결과］

시험 결과를 표 13 및 도 7에 나타낸다. 그 결과, Viltolarsen은 완충제 없는 경우라도 인산 완충제 있는 경우와 동등 이상으로 안정하였다. 특히, 고농도의 인산 완충액(본 실시예에서는 100 mM KH₂PO₄―Na₂HPO₄) 중보다도 안정하였다.

［실시예 5］완충제와 다량체 생성의 관계

Viltolarsen은 보존 조건에 따라서는 다량체가 형성되어, 단량체의 순도가 저하되는 경우가 있다. 본 실시예에 있어서, 등장화제로서 염화나트륨을 0.9% 첨가한 50 ㎎／mL의 Viltolarsen 약액에, 추가로 각종 완충제를 첨가했을 때의 다량체의 생성을 측정하였다.

［시험 조건］

약액 농도：Viltolarsen 50 ㎎／mL

보존 조건：60℃ 항온기 중에서 5일까지

엔드 포인트：다량체(HPLC법, SEC 칼럼)

분석 조건：

검출기：자외 흡광광도계(측정파장：260 ㎚)

칼럼：안지름 7.8 ㎜, 길이 30 ㎝의 스테인리스관에 7 ㎛의 액체 크로마토그래피용 스티렌계 비닐 폴리머 겔을 충전하고, 그 칼럼 2개를 직렬로 접속하였다(TSK gel G3000 PWXL, 7 ㎛, 7.8 ㎜×30 ㎝, 도소).

칼럼 온도：25℃

이동상：인산이수소나트륨 이수화물 15.6 g을 물 750 mL에 녹이고, 수산화나트륨 시액을 첨가하여 pH를 7.3으로 조정한 후, 물을 첨가하여 1000 mL로 하였다. 이 액 800 mL에 아세토니트릴 200 mL를 첨가하였다.

유량：Viltolarsen의 단량체의 유지시간이 약 21분이 되도록 조정하였다.

면적 측정범위：Viltolarsen의 단량체의 피크까지의 범위

［시험 결과］

시험 결과를 표 14에 나타낸다. 그 결과, 50 mM 인산 완충액(인산이수소나트륨·이수화물·인산수소이나트륨：NaH₂PO₄·2H₂O―Na₂HPO₄)이나 구연산 완충액(구연산삼나트륨·이수화물)을 첨가함으로써, 다량체의 생성이 증가하였다.

［실시예 6］용해성의 검토(100 ㎎／mL)

주사액의 고농도화의 검토를 실시하였다.

［시험 조건］

약액：아래의 2종류

여과 필터：PVDF제(Millex GV, 0.22 ㎛, 33 ㎜, Millipore)

엔드 포인트：외관(육안 확인), pH(pH계), 순도 시험(HPLC법), 여과 후의 회수율(HPLC법)

［시험 결과］

시험 결과를 표 16에 나타낸다. 100 ㎎／mL의 Viltolarsen 주사액을 조제한 바, 용해성이나 멸균 필터에 의한 여과에 문제는 없어, 무색 징명(澄明)의 용액이 되었다. 냉소 보존 후에는 점성이 생기기는 했지만 외관에 변화는 없었다. 이상의 것으로부터, 100 ㎎／mL의 주사액은 조제 가능한 것을 알 수 있었다.

［실시예 7］용해성의 검토(50 ㎎／mL)

50 ㎎／mL의 약액의 용해성을 평가하였다. 약액을 조제하여, 용해성이나 멸균 필터에 의한 여과를 행하였다.

［시험 조건］

약액：

여과 필터：PVDF제(밀리디스크 카트리지 필터, 0.22 ㎛, MCGL40S03／1개＋MCGL40S03／2개, 머크)

엔드 포인트：외관(육안 확인), pH(pH계), 순도 시험(HPLC법), 정량(HPLC법)

［시험 결과］

시험 결과를 표 18에 나타낸다. 그 결과, 50 ㎎／mL는 무색 징명의 용액이 되고, 여과 전후에서의 함량에 변화는 없었다. 이상의 것으로부터, 50 ㎎／mL의 주사액은 조제 가능하고 스케일 업도 문제없었다.

아래의 실시예 8∼10에서는, 실시예 2의 임상시험에 참가한 환자로부터 얻어진 샘플, 또는 실시예 2의 임상시험에 참가한 환자에 대해서 시험을 행하였다.

［실시예 8］

디스트로핀 단백질의 질량분석에 의한 정량

(실험방법)

개요：생물학적 분석법

샘플은 SDS―PAGE 전기영동에 의해 단백질의 분리를 행하고, 겔내에서 트립신에 의한 효소소화를 행하여 펩티드 단편으로 하였다. 펩티드 단편을 겔 조각으로부터 추출하여, 건조시켰다. 펩티드를 재용해하여 역상 칼럼에 의한 HPLC―MS／MS로의 디스트로핀 단백질의 동정과 정량을 행하였다. 검량선의 범위는 정상 대조군의 디스트로핀 단백질량을 100%으로 한 경우의 1%∼25%이고, 농도는 표준화 단백질에 필라민 C를 사용하여 피크 면적비로부터 산출하였다. 회귀식에는 최소 제곱법을 사용하여, y＝mx＋b(y：피크 면적비, x：%디스트로핀)의 식을 얻었다.

겔내 소화

LC―MS／MS 분석으로 측정하는 샘플은 SDS―PAGE(SDS：도데실황산나트륨, PAGE：폴리아크릴아미드 전기영동)하고, 분자량에 의한 단백질의 분리를 행하여, 겔내 소화로 얻었다. 각 겔은 표준곡선을 구성하는 검량체(0.0%, 1.0%, 3.0%, 10.0%, 25.0% 디스트로핀), 안정 동위체 표지 아미노산을 첨가하여 배양한 인간 근관세포로부터 추출한 단백질(SILAC) 12.5 ㎍, blank, 임상시험 4 샘플의 합계 11 샘플로 구성하였다. 겔에는 12 레인이 있고, 나머지 1 레인은 분자량 마커에 사용하였다. 검량체는 5종류의 비DMD 근생검, 2종류의 DMD 근생검으로부터의 단백질 추출액을 혼합하여 제작하였다. DMD 근생검은 빙엄턴(Binghamton) 대학으로부터 입수하여, 윤리심사를 마쳤다. 본 실시예에 앞서, Western Blot에 의해 각 근생검의 디스트로핀량을 사전에 측정해 두었다. 동결 절편 제작장치에 의해 근생검으로부터 두께 10 ㎛의 연속 절편 70장을 얻었다. 근절편은 사전에 드라이아이스 상에서 식혀 둔 마이크로 튜브로 옮겼다. Thermo Scientific사의 프로테아제와 포스파타아제 저해제를 첨가한 RIPA 완충제를 사용하여, 근절편으로부터 단백질을 추출하였다. 추출액의 단백질 농도는 BCA protein assay kit(Pierce)를 사용해서 정량하였다. 전기영동에 제공하는 샘플은 각 샘플이 50 ㎍의 단백질을 포함하도록 하고, SILAC를 12.5 ㎍ 첨가해서 조정하였다. 검량체와 임상 샘플에는 %디스트로핀을 구할 때의 내부표준으로서, SILAC 추출액을 첨가하고 있다. NuPAGE 3―8% Tris―Acetate 겔을 사용하여 150 V 75분간의 전기영동을 행하였다. 갤 영동은 동일 샘플에 대해 2장의 겔(겔 A와 겔 B)을 사용하여, duplicate로 실시하였다. 전기영동을 마친 겔은 메탄올：물：초산(50：45：5)으로 30분간의 고정을 하고, 물로 교환하여 재수화를 2회 행하였다. 쿠마시 블루 염색을 1시간 행하였다. 겔의 탈색은 4℃하에서 하룻밤 행하였다. 분자량 마커로 460 kDa 내지 268 kDa 범위의 디스트로핀 단백질이 존재하는 겔을 잘라내고, 물：아세토니트릴(50：50)로 2번 세정하였다. 트립신(Gold mass spectrometry grade, Promega Corporation)을 사용하여 겔내 소화하고, 펩티드 단편을 얻어, 감압 원심으로 건조하였다. 디스트로핀의 펩티드 단편은 －80℃에서 보관해 두고, Q Exactive Nano―LC―MS／MS로의 분석에 사용하였다.

시험 샘플

임상시험에 참가한 환자는 16명으로, 각 환자로부터 투여 전후의 근생검을 얻었다. 32 검체로부터 duplicate를 위해 64 샘플의 분석을 행하였다. 또한, 4 검체의 duplicate가 되는 8 샘플은 재분석을 실시하였기 때문에, 합계 72 샘플을 분석하였다.

LC―MS／MS에 의한 분석

고속 액체 크로마토그래피 시스템 Dionex Ultimate 3000 RSLCnano(ThermoFisher Scientific)와 질량분석장치 Q Exactive Plus(HBMS：High Resolution Mass Spectrometer)(ThermoFisher Scientific)를 조합한 액체 크로마토그래피 질량분석법(LC―MS／MS)에 의해, 얻어진 펩티드 단편을 분석하였다.

건조 펩티드 단편은 2% 아세토니트릴(ACN)＋0.1% 트리플루오로초산(TFA)을 사용하여 재용해하였다. LC―MS／MS로의 시료 도입에는 인젝션 루프 5 μL Dinoex nanoViper sample loop(ThermoFisher Scientific)를 사용하였다.

아래의 조건에서 액체 크로마토그램을 행하였다.

분석 칼럼：역상 칼럼 Acclaim Pepmap RSLC C18 15 ㎝×75 ㎛, 입자경 3 ㎛, EASY SPRAY(Thermo Fisher)

분석 칼럼 온도：50℃

이동상 A：1% 포름산(HCOOH), 이동상 B：0.1% 포름산 ACN

유속：0.500 μL／min(NC)

시료 주입 모드：Partial loop(loop size 5 μL)

시료 주입량：1.00―4.00 μL

오토 샘플러 온도：10℃

실행시간：40.00분

질량분석장치는 아래의 조건에서 사용하였다.

이온원：Thermo Fisher EASY―Spray

이온 모드：양이온

스캔：병렬 반응 모니터링

크롬 피크 폭(반치전폭)：10초

최소 총사이클 시간：40분

분해능：17,500

자동 이득 제어(Automatic Gain Control) 타겟：1e5

최대 시료 주입시간：50밀리초

사중극형 질량검출기 분리폭：1.0 m／z 단위

스펙트럼 데이터：프로파일

Mass 허용범위：10 ppm

Typical Tunable Parameters(Dystrophin Tune File)

Spray Voltage：1.8 kV

Capillary Temperature：275℃

S―Lens RF―Level：70

크로마토그래프로부터 Thermo Scientific사의 LC Quan version 3.0에 의해 데이터 수집을 행하였다. Mass의 허용범위는 20 ppm, 적분 알고리즘은 ICIS로 하였다. 검량체 1% 또는 다른 검량체의 디스트로핀의 피크 면적이 10000 부근 이하인 경우는 다음의 것에 유의하였다. 검량체 0%와 비교하여, 디스트로핀과 필라민 C 모두 얻어진 펩티드와 표지 펩티드의 피크 면적비가 신뢰할 수 있는 수치이고, %디스트로핀에 흐트러짐을 미치지 않는 것을 확인하였다.

디스트로핀과 필라민 C의 피크 면적은 프로덕트 이온에 일치하는 피크 면적을 합계함으로써 계산하였다. 디스트로핀의 피크 면적은 디스트로핀의 1종류의 펩티드 단편(DYST2 아미노산 서열：IFLTEQPLEGLEK(서열번호 4))으로부터 얻었다. 필라민 C의 피크 면적은 필라민 C의 2종류의 펩티드 단편(FILC1 아미노산 서열：VAVGQEQAFSVNTR(서열번호 6), FILC2 아미노산 서열：SPFVVNVAPPLDLSK(서열번호 8))의 평균값으로 하였다.

검량체와 각 임상 샘플에 있어서의 디스트로핀 단백질 레벨(디스트로핀과 필라민 C의 피크 면적비)은 아래의 식으로부터 계산하였다. 0%의 검량체로부터도 디스트로핀이 검출되었기 때문에, 각 검량체의 디스트로핀 단백질 레벨의 수치로부터 검량체 0%의 디스트로핀 단백질 레벨의 수치를 빼서 보정하였다. Excel의 템플레이트를 사용하여, 겔마다 검량체로부터 %디스트로핀과 디스트로핀 단백질 레벨의 수치의 회귀 직선을 구하고, 임상 샘플의 디스트로핀 단백질 레벨의 수치로부터 임상 샘플의 %디스트로핀을 얻었다.

(결과)

분석한 각 샘플의 %디스트로핀은 사전에 규정한 합격·불합격 기준에 따라, 채택을 결정한다. 측정한 72 샘플 중, 60 샘플이 기준을 만족시켰다. 측정결과를 표 25 및 26에 나타낸다. 각 검체는 duplicate의 샘플을 사용하여 시험을 행하고 있으나, 40 ㎎／㎏ 투여군의 2 환자(표 25의 환자 E 및 F)로부터 얻어진 투여 전후 4 검체에 대해서는, 한쪽 샘플(겔 B)이 기준을 만족시키지 못하였기 때문에, 얻어진 측정값은 1 샘플(겔 A)로부터의 하나뿐이 되었다. 즉, 40 ㎎／㎏ 투여군에서는 투여 전의 8 검체 16 샘플 중 14 샘플을 측정할 수 있었다. 1 샘플이 1%를 나타내고, 11 샘플은 정량한계 이하였다. 또한, 25주 시의 8 검체 16 샘플 중 14 샘플을 측정할 수 있었다. 1 검체가 2회의 측정 모두 정량한계 이하가 된 것 외에는, 1% 이상의 디스트로핀이 검출되었다.

80 ㎎／㎏ 투여군에서는 투여 전의 8 검체 16 샘플 모두가 정량한계 미만이 되었다. 또한, 25주 시의 8 검체 16 샘플에서는, 모든 샘플에 있어서 정량한계 이상의 디스트로핀이 검출되어, 평균으로 4.2%였다.

이상으로부터 Viltolarsen의 40 ㎎／㎏ 및 80 ㎎／㎏의 투여에 의해 디스트로핀 단백질의 발현이 회복되는 것이 확인되었다.

［실시예 9］

운동기능 시험(13, 25주 시(초회 투여로부터 12, 24주 경과 시))

(실험방법)

본 제(劑)군의 운동기능 평가를 자연력군을 대조로 하여 비교하였다. 자연력군은 미국의 근이영양증의 임상시험 네트워크인 cooperative international neuromuscular research group(CINRG)이 실시한 Duchenne natural history study(CINRG DNHS)로 불리는 연구로부터, 베이스라인 시의 데이터에 기초하여 선택하였다.

CINRG DNHS는 남성 440명의 DMD 환자를 대상으로 한 종단적 자연력 연구로, 2006년부터 2016년의 데이터를 수집하여, 베이스라인 시, 1년째에 4회, 2년째에 2회, 그 후 연 1회, 최장 10년간 내원하는 것으로 하고 있었다. 각 내원 시에는 시간 기능 검사, 근력 검사, 앙케이트에 의한 기능 검사, 폐기능 검사, 생활의 질의 평가가 실시되었다. 201 시험은 CINRG에 소속된 시설에 의해 실시되고, 표준조작 절차서(SOP) 및 임상 평가자 훈련 절차서는 양 시험 간에 일치시켰다.

본 시험의 대조로서, CINRG DNHS로부터 201 시험의 연령, 스테로이드 사용상황 및 지역 등의 주요한 등록기준을 포함하는 아래의 기준을 만족시키는 환자를 선택하였다.

·최저 12개월의 시간 기능 검사 데이터가 있다［베이스라인 시의 일어서기 시간(TTSTAND), 4단 계단 오르기 시간(TTCLIMB) 및 10 m 보행／주행 시간(TTRW)의 데이터가 필요］.

·베이스라인 시에 만4세부터 10세 미만

·북아메리카(미국 또는 캐나다)

·코르티코스테로이드를 최저 3개월간 투여하고, 12―24개월의 관찰기간을 통해 계속해서 사용하고 있다.

·다른 엑손 스킵약의 임상시험에 동시에 동록하지 않았다.

·아래의 유전적 적격성 기준을 만족시킨다.

(선택기준)：

유전자 검사 결과가 있는 환자

중복 변이를 갖는 환자

넌센스 변이 또는 프레임 시프트를 일으키는 미소 변이를 갖는 환자

(제외기준)：

프로모터로부터 엑손 8 사이에 변이가 있는 환자(병상의 진행이 느리다는 보고 (1)Hum Mutat. 2018；39：1193―1202 및 (2)Hum Mutat. 2008；29(5)：728―37이 있는 것으로부터 제외하였다)

엑손 44 스키핑에 의한 치료에 적합한 환자(병상의 진행이 느리다는 보고 (1)이 있는 것으로부터 제외하였다)

인프레임 변이를 갖는 환자

그 결과, 남아 DMD 환자 65예가 상기 기준을 만족시키고, 그중 9예는 엑손 53 스키핑에 의한 치료에 적합한 DMD 환자(엑손 53 스킵군), 56예는 엑손 53 스키핑에 의한 치료에 적합하지 않은 DMD 환자(비엑손 53 스킵군)였다.

(결과)

Viltolarsen의 치료를 받은 피험자(Viltolarsen 투여군) 16예와 CINRG DNHS의 자연력군(DNHS군) 65예에 있어서의 13주 시와 25주 시에 있어서의 투여 전 또는 베이스라인으로부터의 시간 기능 검사［6분간 보행 시험(6MWT), 일어서기 시간(TTSTAND)의 속도, 4단 계단 오르기 시간(TTCLIMB)의 속도, 10 미터 주행／보행 시간(TTRW)의 속도］와 노스·스타 보행능력 평가(NSAA)의 변화를 비교하였다.

본 실시예에서 사용하고 있는 해석방법에서는, 「투여 전 값」 또는 베이스라인을 결과에 영향을 미치는 배경인자인 공변량으로 하고, 13주 시와 25주 시의 데이터를 특정 피험자에서 반복 측정된 값(repeated measures)으로서 사용하여 MMRM 해석을 행하였다. 그 결과, 6분간 보행 거리 및 10 미터 주행／보행 시간의 속도로 본 실시예의 Viltolarsen 투여군 쪽이 유의하게 개선되어 있었다. 또한, 그 밖의 모든 운동기능 시험에 있어서도 본 제군 쪽이 자연력의 경과보다 개선되어 있었다.

도 8은 13주 투여 시(초회 투여로부터 12주 경과 시) 및 25주 투여 시(초회 투여로부터 24주 경과 시)의 Viltolarsen 투여군과 CINRG 자연력 대조군(DNHS)에 있어서의 각 운동기능 시험 결과의 베이스라인으로부터의 변화를 나타내는 그래프이다. 변화량은 베이스라인으로부터, 13주 시, 25주 시까지의 변화량의 최소 평균 제곱, 에러바는 표준오차, P값은 MMRM을 사용해서 산출하였다.

Viltolarsen 투여군과 DNHS의 각 시점에 있어서의 샘플 수는 아래와 같았다.

［실시예 10］

운동기능 시험(85주 시(초회 투여로부터 84주 경과 시)까지)

(실험방법)

시간 기능 검사［6분간 보행 시험(6MWT), 일어서기 시간(TTSTAND), 4단 계단 오르기 시간(TTCLIMB), 10 미터 주행／보행 시간(TTRW)］와 노스·스타 보행능력 평가(NSAA)는 초회 투여 1주간 전과, 초회 투여 시(1주 시)부터 12주가 경과하는 시점마다(13, 25, 37, 49, 61, 73, 85주 시) 측정하였다. 201 시험은 CINRG에 소속된 시설에 의해 실시되고, 운동기능 시험은 CINRG의 DNHS에서 사용된 표준조작 절차서(SOP) 및 임상 평가자 훈련 절차서에 일치시켜서 행하여졌다. 피험자가 아이인 것도 있어, 시험 실시에 대한 흥미가 지속되지 않는 등의 이유로, 시험에 의해서는 실시할 수 없는 항목이 있었다.

(결과)

결과를 도 9∼도 16에 나타낸다. 노스·스타 보행능력 평가에서는, Viltolarsen 투여군의 만5세 이상의 많은 환자에 있어서 스코어가 유지 또는 향상되었다. 이탈리아와 영국의 자연력 데이터를 토대로, 임상시험과 같은 환자 엔트리 기준을 두어 1, 2년 후의 NSAA 스코어의 변화를 연구한 문헌에 의하면, 엑손 53 스키핑 대상 치료 환자의 1년간의 평균 변화량은 ―4.1 포인트였다(J Neurol Neurosurg Psychicary 87, 149―55, 2016). 문헌의 엔트리 기준에 일치하는 Viltolarsen 투여군의 환자의 48주 경과 시의 변화량은 ＋1.3 포인트였다. DHNS의 결과를 보고한 문헌(Muscle Nerve 48, 55―67, 2013)에 있어서 만7세부터 9세의 DMD 환자 중 20%가 일어서기 능력을 상실하는데, Viltolarsen 투여군에서는 해당하는 환자는 없었다. 만7세부터 9세의 DMD 환자 중 10%는 4단 계단 오르기가 불가능해지는데, Viltolarsen 투여군에서는 해당하는 환자는 없었다. 속도는 가령과 함께 감소해 가는데, Viltolarsen 투여군에서는 전체로서는 속도의 상승이 보였다. 만7세부터 9세의 DMD 환자 중 10%는 자립보행능력을 상실하는데, NSP에서는 해당하는 환자는 없었다. 또한 10 미터 주행／보행 시간의 속도는 가령과 함께 감소되어 가는데, Viltolarsen 투여군에서는 전체로서는 속도의 상승이 보였다. WB에 의한 디스트로핀 정량값의 베이스라인으로부터의 디스트로핀 발현량의 변화와 일어서기 시간 시험, 4단 계단 오르기 시험, 10 m 보행／주행 시험의 베이스라인으로부터의 48주간에서의 속도 변화에 대해서, 상관 유무와 직선 회귀식을 Excel로 계산하였다. 일어서기 시간 시험과 10 미터 주행／보행 시험에 관해서는, 디스트로핀 발현량과 속도 변화에 있어서 유의한 상관관계가 있어(P＜0.05), 디스트로핀의 증가에 수반하여 운동기능의 속도 변화가 상승하는 것이 시사되었다.

산업상 이용가능성

본 발명에 의해, NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)의 안정한 조성을 갖는, 듀시엔형 근이영양증 치료용 의약 조성물이 제공된다. 또한, NS―065／NCNP―01(Viltolarsen)을 포함하는 의약 조성물에 관하여, 효과적인 DMD 치료를 나타내고 또한 인간 환자에게 안전한 범위의 용법·용량이 제공된다. 당해 의약 조성물에 의해, 낮은 부작용으로 듀시엔형 근이영양증의 증상을 효과적으로 경감시킬 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> NIPPON SHINYAKU CO., LTD. <120> COMPOSITION CONTAINING ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE AND USE THEREOF TO TREAT DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY <130> G2329 <150> US 62/690,270 <151> 2018-06-26 <150> US 62/739,386 <151> 2018-10-01 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 212 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ttgaaagaat tcagaatcag tgggatgaag tacaagaaca ccttcagaac cggaggcaac 60 agttgaatga aatgttaaag gattcaacac aatggctgga agctaaggaa gaagctgagc 120 aggtcttagg acaggccaga gccaagcttg agtcatggaa ggagggtccc tatacagtag 180 atgcaatcca aaagaaaatc acagaaacca ag 212 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gaacaccttc agaaccggag g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 3 cctccggttc tgaaggtgtt c 21 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 4 Ile Phe Leu Thr Glu Gln Pro Leu Glu Gly Leu Glu Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 5 Val Ala Val Gly Gln Glu Gln Ala Phe Ser Val Asn Thr Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 6 Ser Pro Phe Val Val Asn Val Ala Pro Pro Leu Asp Leu Ser Lys 1 5 10 15

Claims

인간 디스트로핀 유전자의 제53번째 엑손의 5' 말단부터 제36∼56번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물을 함유하는, 인간 환자의 듀시엔형 근이영양증을 치료하기 위한 의약 조성물로서,
상기 치료는 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물이 40 ㎎／㎏∼80 ㎎／㎏으로 상기 인간 환자에게 주 1회 정맥 내 투여하는 것을 포함하는, 상기 의약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물이 40 ㎎／㎏으로 상기 인간 환자에게 주 1회 정맥 내 투여되는, 의약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물이 80 ㎎／㎏으로 상기 인간 환자에게 주 1회 정맥 내 투여되는, 의약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 인간 환자가 디스트로핀 유전자에 엑손 43―52, 45―52, 47―52, 48―52, 49―52, 50―52 또는 52로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 엑손이 결손된 변이를 갖는, 의약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 인간 환자에게 있어서의 치료 전 디스트로핀 단백질의 발현이 웨스턴 블로팅 또는 질량분석에 의한 측정에서 건강한 정상인의 1% 이하인, 의약 조성물.
제5항에 있어서,
상기 인간 환자에게 있어서 치료 전에 디스트로핀 단백질의 발현이 보이지 않는, 의약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 안티센스 올리고머의 염기부분의 서열이 서열번호 3에 나타내는 서열로 이루어지는, 의약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물이 빌톨라르센(Viltolarsen) 또는 그의 동등품인, 의약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물을 2.5∼500 ㎎／㎖ 또는 10∼100 ㎎／㎖의 농도로 포함하는, 의약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물을 25 ㎎／㎖의 농도로 포함하는, 의약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물을 50 ㎎／㎖의 농도로 포함하는, 의약 조성물.
제1항에 있어서,
등장화제, pH 조정제 및 용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 추가로 포함하는, 의약 조성물.
제12항에 있어서,
상기 등장화제가 염화나트륨, 염화칼륨, 글루코오스, 프룩토오스, 말토오스, 수크로오스, 락토오스, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 트레할로오스 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 의약 조성물.
제12항 또는 제13항에 있어서,
상기 pH 조정제가 염산, 수산화나트륨, 구연산, 젖산, 인산염(인산수소나트륨, 인산이수소나트륨, 인산이수소칼륨) 및 모노에탄올아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 의약 조성물.
제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 용매가 물인, 의약 조성물.
제1항에 있어서,
2.5∼500 ㎎／㎖ 또는 10∼100 ㎎／㎖ 농도의 안티센스 올리고머, 8∼10 ㎎／㎖ 농도의 염화나트륨을 포함하고, 또한 pH가 7.2∼7.4의 수용액인, 의약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 치료에 의해, 아래의 (1)∼(6)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효과가 발생하는, 의약 조성물：
(1) 환자의 골격근에 있어서의 디스트로핀 단백질 발현량의 평균값이 베이스라인과 비교하여, 24주간의 투여 후에 9배 이상으로 증가하는 것；
(2) 일어서기 시간(TTSTAND)으로부터 얻어지는 속도의 변화가 베이스라인과 비교하여, 24주간의 투여 후 25주 시에 －0.055회／초 이상인 것；
(3) 10 미터 주행／보행 시간(TTRW)으로부터 얻어지는 속도의 변화가 베이스라인과 비교하여, 24주간의 투여 후 25주 시에 －0.025 미터／초 이상인 것；
(4) 4단 계단 오르기 시간(TTCLIMB)으로부터 얻어지는 속도의 변화가 베이스라인과 비교하여, 24주간의 투여 후 25주 시에 －0.060회／초 이상인 것；
(5) 노스·스타 보행능력 평가(NSAA)의 스코어 변화가 베이스라인과 비교하여, 24주간의 투여 후 25주 시에 －2.2 스코어 이상인 것；및
(6) 6분간 보행 시험(6MWT)의 변화가 베이스라인과 비교하여, 24주간의 투여 후 25주 시에 －7.5 미터 이상인 것.
제1항에 있어서,
만7∼9세의 듀시엔형 근이영양증의 인간 환자에게 상기 치료를 84주간 행한 경우에, 아래의 (1)∼(6)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효과가 발생하는, 의약 조성물：
(1) 치료 개시로부터 제85주까지 일어서기 능력을 상실하는 환자가 20% 미만인 것；
(2) 치료 개시로부터 제85주까지 4단 계단 오르기가 불가능해지는 환자가 10% 미만인 것；
(3) 치료 개시로부터 제85주까지 자립보행능력을 상실하는 환자가 10% 미만인 것；
(4) 치료 개시로부터 제85주까지 10 미터 주행／보행의 속도에 가령에 의한 감소가 보이지 않는 것；
(5) 치료 개시로부터 제85주까지 4단 계단 오르기의 속도에 가령에 의한 감소가 보이지 않는 것；및
(6) 치료 개시로부터 제85주까지 일어서기의 속도에 가령에 의한 감소가 보이지 않는 것.
제1항에 있어서,
만10∼12세의 듀시엔형 근이영양증의 인간 환자에게 상기 치료를 84주간 행한 경우에, 아래의 (1)∼(6)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효과가 발생하는, 의약 조성물：
(1) 치료 개시로부터 제85주까지 일어서기 능력을 상실하는 환자가 60% 미만인 것；
(2) 치료 개시로부터 제85주까지 4단 계단 오르기가 불가능해지는 환자가 50% 미만인 것；
(3) 치료 개시로부터 제85주까지 자립보행능력을 상실하는 환자가 50% 미만인 것；
및
(4) 치료 개시로부터 제85주까지 10 미터 주행／보행의 속도에 가령에 의한 감소가 보이지 않는 것.
(5) 치료 개시로부터 제85주까지 4단 계단 오르기의 속도가 증가하는 시기가 보이는 것；및
(6) 치료 개시로부터 제85주까지 일어서기의 속도가 증가하는 시기가 보이는 것.
인간 디스트로핀 유전자의 제53번째 엑손의 5' 말단부터 제36∼56번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 수화물을 함유하는 의약 조성물을,
상기 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 그의 수화물을 40 ㎎／㎏∼80 ㎎／㎏으로 인간 환자에게 주 1회 정맥 내 투여하는 것을 포함하는, 듀시엔형 근이영양증의 치료방법.
인간 환자의 듀시엔형 근이영양증의 치료방법에 사용하기 위한 인간 디스트로핀 유전자의 제53번째 엑손의 5' 말단부터 제36∼56번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 수화물로서,
상기 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 수화물이 40 ㎎／㎏∼80 ㎎／㎏으로 상기 인간 환자에게 주 1회 정맥 내 투여되는,
상기 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 수화물.
인간 환자의 듀시엔형 근이영양증을 치료하기 위한 의약 조성물의 제조를 위한 인간 디스트로핀 유전자의 제53번째 엑손의 5' 말단부터 제36∼56번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 수화물의 사용으로서,
상기 안티센스 올리고머 또는 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 수화물이 40 ㎎／㎏∼80 ㎎／㎏으로 상기 인간 환자에게 주 1회 정맥 내 투여되는,
상기 사용.