TW202035692A

TW202035692A - 含有反義寡核苷酸之組成物及其用於治療裘馨氏肌肉萎縮症之用途

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Publication number: TW202035692A
Application number: TW108122381A
Authority: TW
Inventors: 宇野朋典; 夏川資; 江川洋一; 佐藤洋平
Original assignee: 日商日本新藥股份有限公司
Priority date: 2018-06-26
Filing date: 2019-06-26
Publication date: 2020-10-01
Also published as: JP2023171731A; CO2020015685A2; IL279692A; KR20210023988A; JP7345466B2; SG11202011554PA; US20210261963A1; WO2020004675A1; EP3815696A4; AU2019293687A1; JPWO2020004675A1; PH12020552078A1; EP3815696A1; ECSP20083454A; ZA202007682B; CN112399849A; BR112020026542A2; CA3101321A1; MX2020013880A; CL2020003367A1

Abstract

本發明係有關含有反義寡核苷酸之組成物及其用於治療裘馨氏肌肉萎縮症之用途。本發明尤其有關以處置之投予量投予時，對於治療裘馨氏肌肉萎縮症為有效之上述組成物及其使用。

Description

含有反義寡核苷酸之組成物及其用於治療裘馨氏肌肉萎縮症之用途

本發明係有關可跳讀人類肌營養不良蛋白基因第53號之外顯子之反義寡聚物之用法用量及含有該寡聚物之醫藥組成物。

裘馨氏肌肉萎縮症(DMD)於出生男性約3,500人中有1人發症之頻率最高之高基因性進行性肌肉萎縮症。於乳幼兒期雖顯示與正常人類幾乎相同之運動機能，於4至5歲時看到肌力降低。之後肌力持續降低，至12歲時變成不能步行，於20歲左右因心衰竭或呼吸器官衰竭導致死亡之嚴重疾病。現在對於DMD尚無有效之治療法，強烈需求開發新的治療藥。

已知DMD之原因為肌營養不良蛋白基因突變。肌營養不良蛋白基因存在於X染色體，為由220萬鹼基對之DNA組成之巨大基因。從DNA轉錄為mRNA前驅體，再藉由剪接除去內含子，合成結合79之外顯子之mRNA。從該mRNA轉譯為3,685之胺基酸，生成肌營養不良蛋白質。肌營養不良蛋白質參予維持肌肉細胞的膜安定性，於使肌肉細胞不易被破壞為必要者。DMD患者之肌營養不良蛋白基因由於具有突變，肌肉細胞中具有機能之肌營養不良蛋白蛋白質幾乎未表現。因此，於DMD患者體內無法維持肌肉細胞之構造，多量之鈣離子流入肌肉細胞內。其結果產生類似炎症之反應，纖維化進展，成為肌肉細胞再生困難。

貝克氏肌肉萎縮症(BMD)之原因亦為肌營養不良蛋白基因突變，其症狀雖然因肌肉萎縮呈現肌力降低，惟通常與DMD比較，其症狀較輕，肌力降低之進行亦較慢，許多情況為於成人期發症。DMD與BMD之臨床症狀不同，認為是取決於藉由突變，肌營養不良蛋白之mRNA轉譯為肌營養不良蛋白質時胺基酸之讀框是被破壞或被維持(非專利文獻1)。亦即，於DMD藉由胺基酸讀框具有移碼突變，具有機能之肌營養不良蛋白質幾乎未表現，於BMD藉由突變，外顯子一部分缺失，為了維持胺基酸讀框，僅管不完全，亦會產生具有機能之肌營養不良蛋白質。

作為DMD之治療法，期待外顯子跳讀法。該方法為改變剪接，修復肌營養不良蛋白mRNA之胺基酸讀框，誘導部分機能經恢復之肌營養不良蛋白質表現之方法(非專利文獻2)。成為外顯子跳讀的對象之胺基酸序列部分缺失。因此於該治療表現之肌營養不良蛋白質雖然變得比正常者短，由於維持胺基酸讀框，部份保持肌肉細胞安定化之機能。因此，藉由外顯子跳讀，DMD期待可呈現與比較輕症之BMD相同之症狀。外顯子跳讀法經過小鼠或狗之動物實驗，對於人類DMD患者進行臨床試驗。

外顯子跳讀可藉由將5’或3’剪接部位之任一部位或雙方或外顯子之內部與作為標的之反義核酸之結合而誘導。外顯子只於雙方剪接部位藉由剪接體複合物認識時包含於mRNA。因此，藉由將剪接部位以反義核酸靶定，可誘導外顯子跳讀。又，外顯子為了於剪接機制中被認識，認為於外顯子剪接增強子(ESE)的SR蛋白質之結合為必要，靶定ESE亦可誘導外顯子的跳讀。

肌營養不良蛋白基因之變異依DMD患者而異，根據基因變異之位置或種類之反義核酸為必要。至今，根據西澳大學之Steve Wilton人等對於所有79個外顯子製作誘導外顯子跳讀之反義核酸(非專利文獻3)、根據荷蘭之Annemieke Aartsma-Rus人等對於39種類之外顯子製作誘導外顯子跳讀之反義核酸(非專利文獻4)。

所有DMD患者之約10%認為可以將第53號之外顯子(以下，稱為「外顯子53」)跳讀治療。近年來從複數研究機關有對於將肌營養不良蛋白基因之外顯子53作為外顯子跳讀之標的之研究之報告(專利文獻1至4；非專利文獻5及6)。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]：國際公開公報WO 2006/000057

[專利文獻2]：國際公開公報WO 2004/048570

[專利文獻3]：美國專利公開公報US 2010/0168212

[專利文獻4]：國際公開公報WO 2010/048586

[非專利文獻]

[非專利文獻1]：Monaco A. P. et al., Genomics 1988; 2: p. 90-95

[非專利文獻2]：Matsuo M., Brain Dev 1996; 18: p. 167-172

[非專利文獻3]：Wilton S. D. et al., Molecular Therapy 2007: 15: p. 1288-96

[非專利文獻4]：Annemieke Aartsma-Rus et al., (2002) Neuromuscular Disorders 12: S71-S77

[非專利文獻5]：Linda J. Popplewell et al., (2010) Neuromuscular Disorders, vol. 20, no. 2, p. 102-10

[非專利文獻6]：Bladen C. L. et al., Human Mutation (2015) 36:395-402

本發明非限定的為如以下所述。

<1>

一種醫藥組成物，係含有與由人類肌營養不良蛋白基因之第53號外顯子之5’末端至第36至56號核苷酸構成之序列為互補的鹼基序列所成之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物，且為用於治療人類患者之裘馨氏肌肉萎縮症者，

前述治療包含將反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物對上述人類患者以40mg/kg至80mg/kg之量每週1次進行靜脈內投予。

<2>

如前述<1>所述之醫藥組成物，其中，將前述反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物對前述人類患者以40mg/kg之量每週1次進行靜脈內投予。

<3>

如前述<1>所述之醫藥組成物，其中，將前述反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物對前述人類患者以80mg/kg之量每週1次進行靜脈內投予。

<4>

如前述<1>所述之醫藥組成物，其中，前述人類患者為於肌營養不良蛋白基因具有由外顯子43-52、45-52、47-52、48-52、49-52、50-52或52構成之群組選擇之任一種外顯子缺損而造成之變異。

<5>

如前述<1>所述之醫藥組成物，其中，於前述人類患者，治療前肌營養不良蛋白質之表現藉由西方墨點法或質量分析之測定，在健康人之1%以下。

<6>

如前述<5>所述之醫藥組成物，其中，於前述人類患者，於治療前未看到肌營養不良蛋白蛋白質之表現。

<7>

如前述<1>所述之醫藥組成物，其中，前述反義寡聚物之鹼基部分之序列為包含序列編號3所示之序列。

<8>

如前述<1>所述之醫藥組成物，其中，前述反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物為Viltolarsen或其均等物。

<9>

如前述<1>所述之醫藥組成物，其中，該醫藥組成物以2.5至500mg/mL或10至100mg/mL之濃度包含前述反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物。

<10>

如前述<1>所述之醫藥組成物，其中，該醫藥組成物以25mg/mL之濃度包含前述反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物。

<11>

如前述<1>所述之醫藥組成物，其中，該醫藥組成物以50mg/mL之濃度包含前述反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物。

<12>

如前述<1>所述之醫藥組成物，其中，該醫藥組成物另含有由等張化劑、pH調整劑及溶劑構成之群組選擇之至少一種成分。

<13>

如前述<12>所述之醫藥組成物，其中，前述等張化劑為由氯化鈉、氯化鉀、葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、海藻糖及甘油構成之群組選擇之至少一種。

<14>

如前述<12>或<13>所述之醫藥組成物，其中，前述pH調整劑為由鹽酸、氫氧化鈉、檸檬酸、乳酸、磷酸鹽(磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀)及單乙醇胺構成之群組選擇之至少一種。

<15>

如前述<12>至<14>中任一項所述之醫藥組成物，其中，前述溶劑為水。

<16>

如前述<1>所述之醫藥組成物，其中，該醫藥組成物為含有2.5至500mg/mL或10至100mg/mL濃度之反義寡聚物、8至10mg/mL濃度之氯化鈉且pH為7.2至7.4之水溶液。

<17>

如前述<1>所述之醫藥組成物，其中，該醫藥組成物藉由前述治療產生由以下(1)至(6)構成之群組選擇之至少一種效果：

(1)患者骨骼肌中肌營養不良蛋白質表現量之平均值，與基準線比較，於投予24週後增加9倍以上；

(2)從起立時間(TTSTAND)獲得之速度變化，與基準線比較，投予24週後於25週時為-0.055次/秒以上；

(3)從10公尺跑步/步行時間(TTRW)獲得之速度變化，與基準線比較，投予24週後於25週時為-0.025公尺/秒以上；

(4)從爬4階梯之時間(TTCLIMB)獲得之速度變化，與基準線比較，投予24週後於25週時為-0.060次/秒以上；

(5)北極星步行能力評估(NSAA)得分之變化，與基準線比較，投予24週後於25週時為-2.2分以上；及

(6)6分鐘步行試驗(6MWT)之變化，與基準線比較，投予24週後於25週時為-7.5公尺以上。

<18>

如前述<1>所述之醫藥組成物，其中，該醫藥組成物在7至9歲裘馨氏肌肉萎縮症之人類患者中進行前述治療84週時產生由以下(1)至(6)構成之群組選擇之至少一種效果：

(1)從治療開始至第85週，喪失起立能力之患者未達20%；

(2)從治療開始至第85週，不能爬4階梯之患者未達10%；

(3)從治療開始至第85週，喪失自立步行能力之患者未達10%；

(4)從治療開始至第85週，未觀察到10公尺跑步/步行之速度因年齡增加而減少；

(5)從治療開始至第85週，未觀察到爬4階梯之速度因年齡增加而減少；及

(6)從治療開始至第85週，未觀察到起立的速度因年齡增加而減少。

<19>

如前述<1>所述之醫藥組成物，其中，該醫藥組成物在10至12歲裘馨氏肌肉萎縮症之人類患者中進行前述治療84週時產生由以下(1)至(6)構成之群組選擇之至少一種效果：

(1)從治療開始至第85週，喪失起立能力之患者未達60%；

(2)從治療開始至第85週，不能爬4階梯之患者未達50%；

(3)從治療開始至第85週，喪失自立步行能力之患者未達50%；

(5)從治療開始至第85週，觀察到爬4階梯之速度增加之時期；及

(6)從治療開始至第85週，觀察到起立的速度增加之時期。

<20>

一種裘馨氏肌肉萎縮症之治療方法，為包含將含有與由人類肌營養不良蛋白基因之第53號外顯子之5’末端至第36至56號核苷酸構成之序列為互補的鹼基序列所構成之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物之醫藥組成物以下列方式進行投與，

將前述反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物對人類患者以40mg/kg至80mg/kg之量每週1次進行靜脈內投予。

<20-1>

如前述<20>所述之治療方法，其中，藉由前述治療方法產生如申請專利範圍第17項所述之至少一種效果、如申請專利範圍第18項所述之至少一種效果或如申請專利範圍第19項所述之至少一種效果。

<21>

一種前述之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物，為於人類患者裘馨氏肌肉萎縮症之治療方法中使用之與由人類肌營養不良蛋白基因之第53號外顯子之5’末端至第36至56號核苷酸構成之序列為互補的鹼基序列所構成者，

將前述反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物對前述人類患者以40mg/kg至80mg/kg之量每週1次進行靜脈內投予。

<21-1>

如前述<21>所述之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物，藉由前述投予，產生如申請專利第17項所述之至少一種效果、如申請專利範圍第18項所述之至少一種效果或如申請專利範圍第19項所述之至少一種效果。

<22>

一種反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物的用途，係用於製造用以治療人類患者裘馨氏肌肉萎縮症之醫藥組成物，該反義寡聚物為與由人類肌營養不良蛋白基因之第53號外顯子之5’末端至第36至56號核苷酸構成之序列為互補的鹼基序列所構成者，

作為其他之態樣，本發明非限定的為如以下所述。

[1]：一種包含以約40mg/kg/週之用量於被驗者靜脈內投予NS-065/NCNP-01之步驟之用於治療具有適合藉由外顯子53跳讀治療之裘馨氏肌肉萎縮症之被驗者的方法。

[2]：一種包含以約80mg/kg/週之用量於被驗者靜脈內投予NS-065/NCNP-01之步驟之用於治療具有適合藉由外顯子53跳讀治療之裘馨氏肌肉萎縮症之被驗者的方法。

[3]：一種包含以40mg/kg/週以上80mg/kg/週以下之用量於被驗者靜脈內投予NS-065/NCNP-01之步驟之用途治療具有適合藉由外顯子53跳讀治療之裘馨氏肌肉萎縮症之被驗者的方法。

[4]：如[1]所述之方法，其中，該投予者為含有2.5mg/mL以上500mg/mL以下濃度之NS-065/NCNP-01；及

作為等張劑之8.55mg/mL以上9.45mg/mL以下濃度之氯化鈉之水溶液，該水溶液具有約7.3之pH。

[5]：如[2]所述之方法，其中，該投予者為含有2.5mg/mL以上500mg/mL以下濃度之NS-065/NCNP-01；及

[6]：如[3]所述之方法，其中，該投予者為含有2.5mg/mL以上500mg/mL以下濃度之NS-065/NCNP-01；及

[7]：一種包含以約40mg/kg/週之用量於被驗者靜脈內投予NS-065/NCNP-01之步驟，用以於具有適合藉由外顯子53跳讀治療之裘馨氏肌肉萎縮症之被驗者誘導肌營養不良蛋白質產生的方法。

[8]：一種包含以約80mg/kg/週之用量於被驗者靜脈內投予NS-065/NCNP-01之步驟，用以於具有適合藉由外顯子53跳讀治療之裘馨氏肌肉萎縮症之被驗者誘導肌營養不良蛋白質產生的方法。

[9]：一種包含以約40mg/kg/週以上80mg/kg/週以下之用量於被驗者靜脈內投予NS-065/NCNP-01之步驟，用以於具有適合藉由外顯子53跳讀治療之裘馨氏肌肉萎縮症之被驗者誘導肌營養不良蛋白質產生的方法。

[10]：如[7]所述之方法，其中，該投予者為含有2.5mg/mL以上500mg/mL以下濃度之NS-065/NCNP-01；及

[11]：如[8]所述之方法，其中，該投予者為含有2.5mg/mL以上500mg/mL以下濃度之NS-065/NCNP-01；及

[12]：如[9]所述之方法，其中，該投予者為含有2.5mg/mL以上500mg/mL以下濃度之NS-065/NCNP-01；及

於上述[1]至[12]，NS-065/NCNP-01(於本說明書中亦稱為「Viltolarsen」)亦可為其均等物。又，於上述[1]至[12]，被驗者亦可為人類患者。

藉由本發明可提供具有Viltolarsen之安定組成之裘馨氏肌肉萎縮症治療用之醫藥組成物。又，關於含有Viltolarsen之醫藥組成物，可提供可發揮有效的裘馨氏肌肉萎縮症之治療效果且在人類患者安全範圍之Viltolarsen之用法、用量。藉由該醫藥組成物，可以低副作用有效的減輕裘馨氏肌肉萎縮症之症狀。

第1圖表示美國第2期用量設定試驗NS-065/NCNP-01-201之設計。

第2圖表示於使用西方墨點法之骨骼肌中重生肌營養不良蛋白質表現量之測定結果。

第3圖表示美國/加拿大第2期用量設定試驗NS-065/NCNP-01-201之設計。

第4圖表示於經過24週之時間機能檢查中從基準線之變化之比較。於5個圖，「Viltolarsen」為NS-065/NCNP-01之國際一般名(INN)。

第5圖表示評估Viltolarsen在伯瑞坦-羅比森(Britton-Robinson)緩衝液(pH 3至11)中之安定性之結果。

第6圖表示評估Viltolarsen在磷酸鉀-硼砂緩衝液(pH 6至9)中之安定性之結果。

第7圖表示於121℃之pH調整劑之檢討結果。

第8圖為表示各運動機能試驗結果從基準線之變化圖。

第9圖表示至85週時(從初次投予經過84週)於Viltolarsen投予群(40mg/kg投予群及80mg/kg投予群)之各被驗患者中步行6分鐘試驗之結果圖。

第10圖表示至85週時(從初次投予經過84週)於Viltolarsen投予群(40mg/kg投予群及80mg/kg投予群)之各被驗患者中北極星步行能力測試分數圖。

第11圖表示至85週時(從初次投予經過84週)於Viltolarsen投予群(40mg/kg投予群及80mg/kg投予群)之各被驗患者中起立時間試驗之速度結果圖。

第12圖表示至85週時(從初次投予經過84週)於Viltolarsen投予群(40mg/kg投予群及80mg/kg投予群)之各被驗患者中爬4階梯時間試驗之速度結果圖。

第13圖表示至85週時(從初次投予經過84週)於Viltolarsen投予群(40mg/kg投予群及80mg/kg投予群)之各被驗患者中步行10m/跑步時間試驗之速度結果圖。

第14圖於49週時(從初次投予經過48週)於Viltolarsen投予群(40mg/kg投予群及80mg/kg投予群)之各被驗患者中藉由WB(西方墨點法)從肌營養不良蛋白定量值之基準線之肌營養不良蛋白表現量之變化及起立時間試驗之從基準線之速度變化關連圖。

第15圖於49週時(從初次投予經過48週)於Viltolarsen投予群(40mg/kg投予群及80mg/kg投予群)之各被驗患者中藉由WB(西方墨點法)從肌營養不良蛋白定量值之基準線之肌營養不良蛋白表現量之變化及從爬4階梯時間試驗之基準線之速度變化關連圖。

第16圖於49週時(從初次投予經過48週)於Viltolarsen投予群(40mg/kg投予群及80mg/kg投予群)之各被驗患者中藉由WB(西方墨點法)從肌營養不良蛋白定量值之基準線之肌營養不良蛋白表現量之變化及從步行10m/跑步時間試驗之基準線之速度變化關連圖。

以下，將本發明加以詳細說明。以下之實施形態為用於說明本發明之例示，本發明不只限於該等實施形態。本發明只要不脫離其要旨，可以種種形態實施。

又，於本說明書中引用之所有文獻及公開公報、專利公報其他之專利文獻作為參照編入本說明書中。又，本說明書包含以主張於2018年6月26日提出專利申請之本專利優先權為基礎之美國臨時專利申請(US62/690,270)及以主張以於2018年10月1日提出專利申請之本專利優先權為基礎之美國臨時專利申請(US62/739,386)之說明書及圖式中記載之內容。

I.第一形態

本發明之第一形態為提供用於治療裘馨氏肌肉萎縮症之醫藥組成物。亦即，本發明之醫藥組成物為含有與由人類肌營養不良蛋白基因之第53號外顯子之5’末端至第36至56號核苷酸構成之序列為互補的鹼基序列所構成之反義寡聚物(以下，亦稱為「本發明之寡聚物」)或其醫藥上容許之鹽或其水合物，為用於治療人類患者之裘馨氏肌肉萎縮症之醫藥組成物，

前述治療包含將反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物對前述人類患者以40mg/kg至80mg/kg之量每週1次進行靜脈內投予而提供前述醫藥組成物。

[人類肌營養不良蛋白基因之第53號外顯子]

於本發明，「基因」除了基因組基因以外亦包含cDNA、mRNA前驅體及mRNA。較佳基因為mRNA前驅體，亦即為pre-mRNA。

於人類基因組，人類肌營養不良蛋白基因存在於基因座Xp21.2。人類肌營養不良蛋白基因具有3.0Mbp之大小，作為已知之人類基因為最大之基因。惟，人類肌營養不良蛋白基因之編碼區域不超過14kb，該編碼區域分散於作為79個外顯子之肌營養不良蛋白基因內(Roberts,RG.,et al.,Genomics,16：536-538(1993))。為人類肌營養不良蛋白基因之轉錄物之pre-mRNA接受剪接，生成14kb之成熟mRNA。人類野生型肌營養不良蛋白基因之成熟mRNA之鹼基序列為公知(GenBank Accession No.NM_004006)。

序列編號1表示人類野生型肌營養不良蛋白基因之外顯子53之鹼基序列。

本發明之醫藥組成物含有與由人類肌營養不良蛋白基因之第53號外顯子之5’末端至第36至56號核苷酸構成之序列為互補的鹼基序列所構成之反義寡聚物(本發明之寡聚物)或其醫藥上容許之鹽或其水合物。

此處，本發明之寡聚物為藉由人類肌營養不良蛋白基因之外顯子53跳讀，將以DMD型肌營養不良蛋白基因編碼之蛋白質改變為BMD型肌營養不良蛋白蛋白質為目的製造者。因此，於作為本發明寡聚物之外顯子跳讀對象之肌營養不良蛋白基因之外顯子53，不僅是野生型，亦包含變異型。

變異型之人類肌營養不良蛋白基因之外顯子53具體而言，對於序列編號1之鹼基序列，可列舉具有90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7% 以上、99.8%以上或99.9%以上同一性之多核苷酸。本說明書中，「多核苷酸」係指DNA或RNA。

又，鹼基序列之同一性可使用藉由Karlin及Altschul的演算法BLAST(局部相似性基本對準查詢工具(Basic Local Alignment Search Tool))(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268,1990；Proc Natl Acad Sci USA 90：5873,1993)決定。己開發以BLAST之演算法為基礎之稱為BLASTN或BLASTX之程式(Altschul SF,et al：J Mol Biol 215：403,1990)。於使用BLASTN分析鹼基序列時，參數作成例如得分(score)=100、字長(word length)=12。使用BLAST及Gapped BLAST程序時，使用各程式之預設參數。

本說明書中，「互補的鹼基序列」不只限於成為對象之鹼基序列及形成華生-克立克(Watson-Crick)對之鹼基序列，亦包含形成搖擺鹼基對(Wobble base pair)之鹼基序列。此處，華生-克立克對係指於腺嘌呤-胸腺嘧啶、腺嘌呤-脲嘧啶及鳥嘌呤-胞嘧啶間形成氫鍵之鹼基對，搖擺鹼基對係指於鳥嘌呤-脲嘧啶、肌苷酸-脲嘧啶、肌苷酸-腺嘌呤及肌苷酸-胞嘧啶間形成氫鍵之鹼基對。又，「互補的鹼基序列」與作為對象之鹼基序列亦可不具有100%互補性，例如，對於作為對象之鹼基序列可含有1個、2個、3個、4個或5個非互補的鹼基，又，對於成為對象之鹼基序列，亦可為短1鹼基、2鹼基、3鹼基、4鹼基或5鹼基之鹼基序列。

以下之表1表示由從外顯子53之5’末端至第36至56號核苷酸構成之序列(序列編號2)及與同序列互補的鹼基序列(序列編號3)之例。

[表1]

此處，胸腺嘧啶「T」與脲嘧啶「U」可相互交換，由於為「T」或為「U」，對於本發明寡聚物之外顯子跳讀活性不產生本質上的影響，因此，於本專利申請，即使序列編號表示之鹼基序列的「T」為「U」也以同一序列編號表示。因此，於本專利申請中所揭示之序列，必然的包含「T」之序列及「U」之序列兩者。

因此，本發明之寡聚物其鹼基部分之序列亦可為包含序列編號3所示之序列者。又，本發明之寡聚物只要可將人類肌營養不良蛋白基因之外顯子53跳讀，對於標的序列可為不具有100%互補的鹼基序列。例如本發明之寡聚物，對於為標的序列之序列編號2，亦可含有1個、2個、3個、4個或5個非互補的鹼基，又，對於作為對象之鹼基序列，亦可為短1鹼基、2鹼基、3鹼基、4鹼基或5鹼基之鹼基序列。

人類肌營養不良蛋白基因之外顯子53的跳讀是否產生可藉由於肌營養不良蛋白表現細胞(例如人類橫紋肌肉瘤細胞)中導入本發明之寡聚物，從前述肌營養不良蛋白表現細胞之total RNA將人類肌營養不良蛋白基因之mRNA之外顯子53周邊區域進行RT-PCR擴增，對於該PCR擴增產物進行巢氏PCR(nested PCR)或測序分析確認。或於源自投予本發明寡聚物之患者的試樣藉由RT-PCR、西方點墨法、質量分析等手法測定外顯子53之量亦可確認跳讀是否產生。

跳讀效率可由從被檢細胞回收人類肌營養不良蛋白基因之mRNA，測定該mRNA中外顯子53跳讀帶之多核苷酸量「A」及外顯子53未跳讀帶之多核苷酸量「B」，以該等「A」及「B」之測定值為基礎，依照以下之式計算之。

跳讀效率(%)=A/(A+B)×100

本發明之寡聚物可列舉寡核苷酸、N-嗎啉基寡聚物或肽核酸(Peptide Nucleic Acid：PNA)寡聚物。本發明之寡聚物較佳為N-嗎啉基寡聚物。

前述寡核苷酸(以下，稱為「本發明之寡核苷酸」)為將核苷酸作為構成單位之本發明之寡聚物，相關之核苷酸可為核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸或修飾核苷酸中之任一種。

修飾核苷酸為將構成核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸之核酸鹼基、糖部分及磷酸結合部分的全部或一部分經修飾者。

核酸鹼基可列舉例如腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、脲嘧啶或該等之修飾鹼基。相關之修飾鹼基可列舉例如假脲嘧啶、3-甲基脲嘧啶、二氫脲嘧啶、5-烷基胞嘧啶(例如5-甲基胞嘧啶)、5-烷基脲嘧啶(例如5-乙基脲嘧啶)、5-鹵脲嘧啶(5-溴脲嘧啶)、6-氮雜嘧啶、6-烷基嘧啶(6-甲基脲嘧啶)、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、4-乙醯基胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)脲嘧啶、5’-羧基甲胺基甲基-2-硫脲嘧啶、5-羧基甲胺基甲基脲嘧啶、1-甲基腺嘌呤、1-甲基次黃嘌呤、2,2-二甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲氧基胺基甲基-2-硫脲嘧啶、5-甲胺基甲基脲嘧啶、5-甲基羰基甲基脲嘧啶、5-甲氧基脲嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、脲嘧啶-5-氧基乙酸、2-硫胞嘧啶、嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、異鳥嘌呤、吲哚、咪唑、黃嘌呤等，惟，不只限於該等例。

糖部分之修飾可列舉例如核糖2’位之修飾及糖其他部分之修飾。核糖2’位之修飾可列舉例如將核糖2’位之-OH基置換為OR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br、I之修飾。此處，R表示烷基或芳基。R’表示伸烷基。

糖其他部分之修飾可列舉例如將核糖或去氧核糖4’位之O置換為S者、將糖2'位及4'位橋聯者，例如鎖核酸(LNA(Locked Nucleic Acid))或ENA(2'-O,4'-C-乙烯-橋聯核酸(2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids))等，惟，不只限於該等例。

磷酸結合部分之修飾可列舉例如將磷酸二酯鍵以硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基磷酸酯鍵、亞磷醯胺鍵、硼烷磷酸酯鍵(Enya et al：Bioorganic & Medicinal Chemistry,2008,18,9154-9160)置換修飾(例如，參照日本專利再公表公報第2006/129594號及第2006/038608號)。

烷基較佳為直鏈狀或支鏈狀之碳數為1至6之烷基。具體而言，可列舉例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、新戊基、第三戊基、正己基、異己基。該烷基可經取代，相關之取代基可列舉例如鹵素、烷氧基、氰基、硝基，該等可經1至3個取代。

環烷基較佳為碳數5至12之環烷基。具體而言，可列舉例如環戊基、環己基、環庚基、環辛基、環癸基、環十二碳基。

鹵素可列舉氟、氯、溴、碘。

烷氧基為直鏈狀或支鏈狀之碳數為1至6之烷氧基，可列舉例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、第二丁氧基、第三丁氧基、正戊基氧基、異戊基氧基、正己基氧基、異己基氧基等。較佳為碳數1至3之烷氧基。

芳基較佳為碳數6至10之芳基。具體而言，可列舉例如苯基、α-萘基、β-萘基。較佳為苯基。該芳基可經取代，相關之取代基可列舉例如烷基、鹵素、烷氧基、氰基、硝基，該等可以1至3個取代。

伸烷基較佳為直鏈狀或支鏈狀之碳數1至6之伸烷基。具體而言，可列舉例如亞甲基、伸乙基、三亞甲基、四亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、2-(乙基)三亞甲基、1-(甲基)四亞甲基。

醯基可列舉直鏈狀或支鏈狀之烷醯基或芳醯基。烷醯基可列舉例如甲醯基、乙醯基、2-甲基乙醯基、2，2-二甲基乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、戊醯基、2,2-二甲基丙醯基、己醯基等。芳醯基可列舉例如苯甲醯基、甲苯醯基、萘醯基。相關之芳醯基可於可經取代之位置進行取代，亦可以烷基取代。

於本發明之寡聚物為寡核苷酸之態樣，同寡核苷酸較佳為核糖2’位之-OH基以甲氧基取代，磷酸鍵部分為硫代磷酸酯鍵，以下述一般式表示之基作為構成單位者。

(式中，Base表示核酸鹼基)

該等寡核苷酸使用各種自動合成裝置(例如AKTA oligopilot plus 10/100(GE Healthcare公司製造))可容易地合成或可以委託第三者機關(例如Promega公司或Takara公司)等製作。

本發明之寡聚物為N-嗎啉基寡聚物時，同N-嗎啉基寡聚物可為將下述一般式表示之基作為構成單位者。

(式中，Base與前述者同意義；

W表示以下任一式表示之基。

(式中，X表示-CH₂R¹、-O-CH₂R¹、-S-CH₂R¹、-NR²R³或F；

R¹表示H、烷基；

R²及R³可相同亦可不同，表示H、烷基、環烷基或芳基；

Y₁表示O、S、CH₂或NR¹；

Y₂表示O、S或NR¹；

Z表示O或S))

N-嗎啉基寡聚物較佳為將以下式表示之基作為構成單位之寡聚物(磷醯二胺基酯N-嗎啉基寡聚物(以下，稱為「PMO」))。

(式中，Base、R²、R³與前述者同意義。)

N-嗎啉基寡聚物可依照例如國際公開公報第1991/009033號或國際公開公報第2009/064471號製造。尤其是PMO可依照國際公開公報第2009/064471號中記載之方法製造或依照以下表示之方法製造。

作為PMO之1種態樣，可列舉例如一般式(I)表示之化合物(以下，稱為PMO(I))。

[式中，各Base、R²、R³與前述者同意義；

n為1至99範圍內之任意整數，較佳為18至28範圍內之任意整數。]

PMO(I)可依照公知之方法製造，所使用之化合物及試藥只要是於製PMO製造時通常使用者即可，並無特別限制。又，製造可以液相法或固相法(使用手動或市售之固相自動合成機)實施。以固相法製造PMO時，從操作步驟之簡便化及合成之正確性點而言，以使用自動合成機之方法較理想。

肽核酸為將下述一般式表示之基作為構成單位之本發明之寡聚物。

[式中，Base與前述者同意義。]

肽核酸可依照例如以下之文獻製造。

1)P.E.Nielsen,M.Egholm,R.H.Berg,O.Buchardt，Science,254,1497(1991)

2)M.Egholm,O.Buchardt,P.E.Nielsen,R.H.Berg，Jacs.,114,1895(1992)

3)K.L.Dueholm,M.Egholm,C.Behrens,L.Christensen,H.F.Hansen,T.Vulpius,K.H.Petersen,R.H.Berg,P.E.Nielsen,O.Buchardt，J.Org.Chem.,59,5767(1994)

4)L.Christensen,R.Fitzpatrick,B.Gildea,K.H.Petersen,H.F.Hansen,T.Koch,M.Egholm，O.Buchardt,P.E.Nielsen,J.Coull,R.H.Berg,J.Pept.Sci.,1,175(1995)

5)T.Koch,H.F.Hansen,P.Andersen,T.Larsen,H.G.Batz,K.Otteson,H.Orum,J.Pept.Res.,49,80(1997)

又，本發明之寡聚物5’末端可為下述化學式(1)至(3)中之任一種基。較佳為(3)-OH。

以下，將上述(1)、(2)及(3)表示之基分別稱為「基(1)」、「基(2)」及「基(3)」。

本發明之寡聚物醫藥上容許之鹽之例可列舉如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽之鹼金屬鹽；如鈣鹽、鎂鹽之鹼土金屬鹽；鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等金屬鹽；銨鹽；第三辛胺鹽、二苯甲胺鹽、嗎啉鹽、葡萄糖胺鹽、苯甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基還原葡糖胺鹽、胍鹽、二乙胺鹽、三乙胺鹽、二環己胺鹽、N,N'-二苯甲基乙二胺鹽、氯普魯卡因鹽、普魯卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-苯甲基-苯乙胺鹽、哌嗪鹽、四甲基銨鹽、三(羥甲基)胺基甲烷鹽之有機胺鹽；如氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽之氫鹵酸鹽；如硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽；如甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、乙磺酸鹽之低級烷基磺酸鹽；如苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽之芳基磺酸鹽；如乙酸鹽、蘋果酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽等有機酸鹽；如甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽之胺基酸鹽等。該等鹽可以公知之方法製造。本發明之寡聚物亦可為其水合物之形態。

於其他態樣，本發明之寡聚物可為Viltolarsen或其均等物。

Viltolarsen為NS-065/NCNP-01之國際一般名(INN)。於本說明書，NS-065/NCNP-01亦稱為NS-065/NCNP-01、NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)或Viltolarsen。

NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)為用於治療適合藉由外顯子53跳讀治療之裘馨氏肌肉萎縮症(DMD)患者之反義寡核苷酸原藥。NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)為以「PMO NO.8」揭示於美國專利第9,079,934B2號之化合物，鹼基部分之序列以序列編號35(5’-CCTCCGGTTC TGAAGGTGTTC-3’、本說明書中之序列編號3)表示，具有-OH之5’末端。於本說明書，參照美國專利第9,079,934B2號所有內容編入。美國專利第9,079,934B2號另揭示合成PMO NO.8，亦即NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)之方法。

NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)具有預想可提供比硫代磷酸酯寡核苷酸更高安全性之N-嗎啉基骨架。例如，於開發為硫代磷酸酯寡核苷酸之drisapersen(源自拜瑪林製藥公司(Biomarin))雖因為有安全上之顧慮而中斷，而為N-嗎啉基寡核苷酸之eteplirsen(源自Sarepta公司之Exondys51(註冊商標))己被FDA承認。Drisapersen及eteplirsen兩者都適用於藉由外顯子51跳讀治療之DMD患者。Eteplirsen揭示於美國專利第9,506,058B2號，參照其所有內容編入本說明書中。

如美國專利第9,079,934B2號中之揭示，NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)係設計為於含有外顯子43-52、45-52、47-52、48-52、49-52、50-52或52之特異性外顯子缺損之DMD患者生成機能性肌營養不良蛋白蛋白質，顯示特異性外顯子53跳讀活性。藉由將特定之外顯子跳讀，引起理論上可治療DMD之突然變異之例，揭示Aartsma-Rus等，2002年文獻之表3。參照Aartsma-Rus等之文獻內容，全部編入(Annemieke Aartsma-Rus,Mattie Bremmer-Bout,Anneke A.M.Janson,Johan T.den Dunnen,Gert-Jan B.van Ommen,and Judith C.T.van Deutekom,"Targeted exon skipping as a potential gene correction therapy for Duchenne muscular dystrophy," Neuromuscular Disorders,Vol.12,pp．S71-S77(2002))。

Viltolarsen之「均等物」為Viltolarsen之學各藥醫藥品或成為其有效成分之化合物。該等均等物可基於Viltolarsen臨床試驗所確認之安全性及有效性，對於均等物本體，不經過臨床試驗，直接得到藥事法上核准之製造販賣，期待具有與Viltolarsen類似之外顯子53跳讀活性。於某一態樣，Viltolarsen之「均等物」有與Viltolarsen同一鹼基序列，其核酸鹼基、糖部分及磷酸結合部分全部或一部分與Viltolarsen同一地經修飾，又，亦包含經不同修飾者。該等修飾之態樣與上述之態樣相同。又，Viltolarsen之「均等物」亦可為游離體、醫藥上容許之鹽或水合物之形態。

2.醫藥品組成物

本發明之醫藥組成物亦可為水溶液之形態。本發明之醫藥組成物可含有本發明之寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物2.5至500mg/mL、5至450mg/mL、10至400mg/mL、15至350mg/mL、20至300mg/mL、20至250mg/mL、20至200mg/mL、20至150mg/mL、20至100mg/mL、20至50mg/mL、20至40mg/mL、20至30mg/mL、23至27mg/mL、24至26mg/mL或25mg/mL之濃度。又，本發明之醫藥組成物亦可含有本發明之寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物10至100mg/mL、15至95mg/mL、20至80mg/mL、25至75mg/mL、30至70mg/mL、35至65mg/mL、40至60mg/mL、45至55mg/mL、47至53mg/mL、48至52mg/mL、49至51mg/mL、或50mg/mL之濃度。

於本發明之醫藥組成物，可變更水溶液中Viltolarsen之濃度。為了調製Viltolarsen之水溶液，例如可將250mg之Viltolarsen於0.5mL至100mL 之水中混合(相當於2.5mg/mL至500mg/mL之Viltolarsen濃度)，更佳為於1mL至50mL之水中混合(相當於5mg/mL至250mg/mL之Viltolarsen濃度)，最佳為於5mL至10mL之水中混合(相當於25mg/mL至50mg/mL之NViltolarsen濃度)。

本發明醫藥組成物之投予形態為靜脈內投予。本發明之醫藥組成物可採取之劑形為例如注射液(包含點滴液)。

本發明之醫藥組成物可再含有自等張化劑、pH調整劑及溶劑選擇之至少一種成分。

本發明之醫藥組成物中含有之等張化劑可為自氯化鈉、氯化鉀、葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、海藻糖、甘油選擇之至少一種。

含有Viltolarsen 250mg，適用於注射之10mL水溶液可含有作為等張化劑之72.0mg以上108.0mg以下之氯化鈉(相當於氯化鈉濃度7.2mg/mL至10.8mg/mL)，更佳為81.0mg以上99.0mg以下之氯化鈉(相當於氯化鈉濃度8.1mg/mL至9.9mg/mL)，最佳為85.5mg以上94.5mg以下之氯化鈉(相當於氯化鈉濃度8.55mg/mL至9.45mg/mL)。

等張化劑可使用磷酸緩衝液。該等磷酸緩衝液可列舉檸檬酸緩衝液、乳酸緩衝液、乙酸緩衝液等。又，等張化劑亦可使用糖類(葡萄糖以外)。該等糖之例可列舉山梨糖醇及甘露醇。於調製含有Viltolarsen之組成物時，同樣的可使用複數之等張化劑。

本發明之醫藥組成物中含有之pH調整劑可為自鹽酸、硫酸、磷酸、乙酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、三乙醇胺、檸檬酸、乳酸、磷酸鹽(磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀)、單乙醇胺選擇之至少一種。

本發明之寡聚物例如對於Viltolarsen使用磷酸緩衝劑時，磷酸緩衝劑之濃度較佳為未達100mM。因此，本發明之醫藥組成物可將磷酸緩衝劑之濃度調整為90mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下、50mM以下、40mM以下、30mM以下、20mM以下、10mM以下或5mM以下或是亦可不含有磷酸緩衝液。

本發明之醫藥組成物中含有之溶劑亦可為水。

含有Viltolarsen，適用於注射之水溶液之pH為6.0以上8.5以下，較佳為6.5以上8.0以下，最佳為7.0以上7.5以下。

本發明之寡聚物雖於廣範圍之pH中顯示安定性，惟，本發明之醫藥組成物較佳為將pH調整為7.0至7.5、7.0至7.4、7.1至7.5、7.1至7.4、7.2至7.5、7.2至7.4、7.3至7.5、7.3至7.4或7.3。

又，本發明之醫藥組成物可為含有2.5至500mg/mL或10至100mg/mL濃度之本發明之寡聚物、8至10mg/mL濃度之氯化鈉且pH為7.2至7.4之水溶液。

或本發明之醫藥組成物亦可為含有25mg/mL濃度之本發明之寡聚物且pH調整為7.3，未含緩衝劑之水溶液。於該醫藥組成物，pH的調整可使用鹽酸及/或氫氧化鈉進行。

作為本發明醫藥組成物之例，以下表2中表示於美國/加拿大第2期臨床程序中使用之含有Viltolarsen 250mg之注射用組成物。於以下，將表2中表示之醫藥組成物稱為「NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)注射液250mg」。

[表2]表2「NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)注射液250mg」 (10mL中250mg或同等之25mg/mL)之組成

¹鹽酸及氫氧化鈉之「適量」為用於調整pH為7.3之「充分量」，同時為對於組成物之等張性無實質影響之量。

又，於「NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)注射液250mg」之組成，可將注射用水及等張化劑之氯化鈉之值作成約半量，將總量作成5mL。該等組成相關之含有Viltolarsen 50mg/mL濃度之醫藥組成物亦包含於本發明中。

含有Viltolarsen之水溶液之體積只要NS-065/NCNP-01、使用之等張化劑之濃度及Viltolarsen使用之等張化劑間之重量比可維持與上述說明者同等，亦可增減。

含有Viltolarsen之組成物亦可含有用於促進將Viltolarsen送達到肌肉組織之載體。該等載體只要是醫藥上所容許者即可，並無特別限制，可列舉例如使用陽離子性載體(例如陽離子性脂質體及陽離子性聚合物)及病毒包膜之載體。陽離子性脂質體為例如將2-O-(2-二乙胺基乙基)胺基甲醯基-1,3-O-二油醯基甘油及磷脂質作為必須成分之脂質體，可列舉Oligofectamine(註冊商標)(賽默飛世爾科技(Thermo Fisher Scientific)公司(製造)、Lipofectin(註冊商標)(賽默飛世爾科技公司製造)、Lipofectamine(註冊商標)(賽默飛世爾科技公司製造)、Lipofectamine(註冊商標)2000(賽默飛世爾科技公司製造)、DMRIE-C(賽默飛世爾科技公司製造)、GeneSilencer(註冊商標)(Gene Therapy Systems公司製造)、TransMessenger(註冊商標)(Qiagen公司製造)、TransIT-TKO^®(陽離子性聚合物之例、JetSI(註冊商標)(GeneX India Bioscience公司製造)及Jet-PEI(註冊商標)(聚乙烯亞胺、GeneX India Bioscience公司製造)等。使用病毒包膜之載體可列舉例如GenomeOne(註冊商標)(HVJ-E脂質體、石原產業(股)公司製造。

再者，本發明之醫藥組成物亦可含有乳化輔助劑(例如碳數6至22之脂肪酸或其醫藥上容許之鹽、白蛋白、葡聚糖)或安定化劑(例如膽固醇、磷脂酸)。

於含有Viltolarsen及載體之本發明之醫藥組成物，Viltolarsen與載體(亦即載體/Viltolarsen)之重量比可對應使用之載體種類加以變更，適當為0.1至100之範圍，較佳為1至50之範圍，更佳為10至20之範圍。

含有Viltolarsen之水溶液可藉由靜脈內點滴或點滴投予於患者。

3.效能/效果及用法/用量

於使用本發明之醫藥組成物治療時，將本發明之寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物對人類患者以40mg/kg至80mg/kg之量每週1次進行靜脈內投予(以下，稱為「本發明之用法/用量」)。本發明之用法/用量可為將本發明之寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物對人類患者以40mg/kg之量每週1次進行靜脈內投予。又，本發明之用法/用量亦可為將本發明之寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物對人類患者以80mg/kg之量每週1次進行靜脈內投予。此處，於用量之單位「mg/kg」中分子之「mg」為將本發明之寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物之量以毫克表示者，分母之「kg」表示人類患者之體重1公斤。

NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)注射液250mg係為了以適合藉由外顯子53跳讀治療之DMD患者為目的，以每週1次進行點滴靜注而開發者。美國/加拿大之第2期臨床程序為將2用量之Viltolarsen：40mg/kg/週及80mg/kg/週進行評估而設計者。此處，kg為患者體重之單位。例如於體重40kg之患者若是40mg/kg/週，即為於前述患者以每週1次投予1,600mg(=40mg×40)之Viltolarsen。

4.疾病

DMD為於肌營養不良蛋白基因中藉由機能喪失突然變異引起之肌肉疾病，造成患者之肌肉中肌營養不良蛋白蛋白質喪失(Hoffman人等，1987)。肌營養不良蛋白基因存在於X染色體上，顯示高自然突然變異率，於全世界所有研究之集團，DMD之發生率於生存出產之男性每5,000人中有1人。於最近之評估，以全球患者資料庫進行評估之7,149人DMD患者之10.1%顯示適合藉由外顯子53跳讀之治療(Bladen et al,2015)。臨床症狀典型於年輕就學時期(4至6歲)時呈現，起因為罹病之男性近位肌力降低(例如爬階梯之困難性或跑步之困難性)，與同年齡兒童之身體對應顯示困難性。從地板起立之困難性使用典型之Gower動作達成立位之患者幾乎看不到(亦即，為了達成立位，於腳、膝蓋及大腿使用手支持)(Hoffman EP,Brown RH,and Kunkel LM.(1987).Dystrophin：the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.Cell 51,919-928.及Bladen CL,Salgado D,Monges S,Foncuberta ME,Kekou K,Kosma K,Dawkins H,Lamont L,Roy AJ,Chamova T,Guergueltcheva V,Chan S,Korngut L,Campbell C,Dai Y,Wang J,Bari

i

N,Brabec P,Lahdetie J,Walter MC,Schreiber-Katz O,Karcagi V,Garami M,Viswanathan V,Bayat F,Buccella F,Kimura E,Koeks Z,van den Bergen JC,Rodrigues M,Roxburgh R,Lusakowska A,Kostera-Pruszczyk A,Zimowski J,Santos R,Neagu E,Artemieva S,Rasic VM,Vojinovic D,Posada M,Bloetzer C,Jeannet PY,Joncourt F,Díaz-Manera J,Gallardo E,Karaduman AA,Topalo

lu H,El Sherif R,Stringer A,Shatillo AV,Martin AS,Peay HL,Bellgard MI,Kirschner J,Flanigan KM,Straub V,Bushby K,Verschuuren J,Aartsma-Rus A,Béroud C,Lochmüller H.(2015).The TREAT-NMD DMD Global Database：analysis of more than 7,000 Duchenne muscular dystrophy mutations.Hum Mutat.36(4)：395-402)。

DMD患者之肌肉組織顯示慢性炎症，伴隨肌肉變性及再生之發作導致肌肉消耗、障礙及早期死。患者典型的至出生後20年喪失步行，至30年於日常生活上需要多方面支援。該疾病通常與青年期或成人期早期死亡有關，使用人工呼吸器輔助裝置壽命雖可延長至40年，惟，很少能延長至50年。

被驗者之DMD基因變異可藉由使用多重連接探針擴增技術(MLPA)檢出(Murugan人等，2010)。參考Murugan人等該論文之所有內容援用之(Sakthivel Murugan S.M.,Arthi Chandramohan and Bremadesam Raman Lakshmi,“Use of multiplex ligation-dependent probe amplification(MLPA)for Duchenne muscular dystrophy(DMD)gene mutation analysis,”Indian Journal of Medical Research,Vol.132,pp.303-311(September 2010).)。

成為藉由本發明醫藥組成物治療之對象之人類患者(以下，亦稱為「成為本發明對象之患者」)只要是經由醫師診斷為罹患DMD之患者即可，並無特別限制，惟，於某一態樣，亦可為於肌營養不良蛋白基因中具有自外顯子43- 52、45-52、47-52、48-52、49-52、50-52或52構成之群組所選擇之任一外顯子缺損而造成之變異之患者。

又，成為本發明對象之患者之特徵亦可為於使用本發明之醫藥組成物或本發明之寡聚物治療前，肌營養不良蛋白質之表現藉由西方墨點法或質量分析測定在健康人(100%)之1%以下者。此處，「健康人」為未具有與肌營養不良蛋白質相關之疾病之人類。於健康人肌營養不良蛋白質之表現量可使用通常所知之值，亦可使用從個別健康人獲得之值。又，成為本發明對象之患者亦可具有於使用本發明之醫藥組成物或本發明之寡聚物治療前未看到肌營養不良蛋白質之表現為特徵者。「未看到肌營養不良蛋白質之表現」係指肌營養不良蛋白質之表現量藉由西方墨點法或質量分析測定為與陰性對照為同程度之表現量，或為檢出界限以下之值。又，西方點墨法及質量分析只要是於該領域通常使用之方法即可，並無特別限制。西方點墨法及質量分析之一例可參照本實施例中之實驗手法。

5.治療理論

DMD為重度之遺傳性肌肉障礙，最通常的為由於肌營養不良蛋白基因之1個以上外顯子缺失，產生失框(out of frame)胺基酸轉譯所引起的。藉由此，於肌肉機能為重要之患者之機能性肌營養不良蛋白質未表現。為更重症度之低形態障礙之貝克氏肌肉萎縮症(BMD)，雖然於肌營養不良蛋白基因中有1個以上外顯子不存在，惟，剩下之外顯子於框架內進行胺基酸轉譯時為最常發生的。BMD患者通常疾病之進行緩慢，障礙程度低。DMD患者之醫學處置通常包含延遲四肢肌肉症狀發症之糖皮質素處置或呼吸支持。如於2018年2月FDA之最終指引「Duchenne Muscular Dystrophy and Related Dystrophinopathies：Developing Drugs for Treatment Guidance for Industry.」(可於https：//www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM450229.pdf.取得)所示，於DMD患者存在有重大之未被滿足的醫療需求。

用於治療DMD患者之1種治療途徑為以產生機能性肌營養不良蛋白質，將DMD患者移轉為BMD表現型為目的，使用「外顯子跳讀」戰略。外顯子跳讀誘導缺失之外顯子跳讀隣接之外顯子，藉由此可使胺基酸讀框恢復(Cirak人等，2011；Voit人等，2014；Yokota人等，2012)。藉由外顯子53之跳讀，成為比正常稍短，表現保持部分機能活性之肌營養不良蛋白質。NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)注射液250mg期待可將DMD表現型移轉為患者的疾病進行變慢，患者的生活品質改善、比BMD更輕度之疾病(Cirak S,Arechavala-Gomeza V,Guglieri M,Feng L,Torelli S,Anthony K,Abbs S,Garralda ME,Bourke J,Wells DJ,Dickson G,Wood MJ,Wilton SD,Straub V,Kole R,Shrewsbury SB,Sewry C,Morgan JE,Bushby K,Muntoni F.(2011).Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment：an open-label,phase 2,dose-escalation study.Lancet 378：595-605.、Voit T,Topaloglu H,Straub V,Muntoni F,Deconinck N,Campion G,De Kimpe SJ,Eagle M,Guglieri M,Hood S,Liefaard L,Lourbakos A,Morgan A,Nakielny J,Quarcoo N,Ricotti V,Rolfe K,Servais L,Wardell C,Wilson R,Wright P,Kraus JE.(2014).Safety and efficacy of drisapersen for the treatment of Duchenne muscular dystrophy(DEMAND II)：an exploratory,randomised,placebo-controlled phase 2 study.Lancet Neurol.13(10)：987-96.及Yokota T,Nakamura A,Nagata T,Saito T,Kobayashi M,Aoki Y,Echigoya Y,Partridge T,Hoffman EP,Takeda S.(2012).Extensive and Prolonged Restoration of Dystrophin Expression with Vivo-Morpholino-Mediated Multiple Exon Skipping in Dystrophic Dogs.Nucleic Acid Ther 22(5)：306-15.)。

因此，藉由將本發明之醫藥組成物依照前述本發明之用法/用量投予於人類患者，可治療DMD。

此處，「治療」係指減輕患者之DMD症狀。

依照本發明之用法用量使用本發明醫藥組成物之治療可產生由以下(1)至(6)構成之群組選擇之至少一種效果(括弧內表示平均±標準偏差)：

(1)患者之骨骼肌中肌營養不良蛋白質表現量之平均值，與基準線比較，於投予24週後增加9倍以上；

(2)從起立時間(TTSTAND)獲得之速度變化，與基準線比較，於投予24週後，於25週時為-0.055次/秒以上或0.024±0.075秒以上；

(3)從10公尺跑步/步行時間(TTRW)獲得之速度變化，與基準線比較，於投予24週後，於25週時為-0.025公尺/秒以上或0.227±0.251公尺/秒以上；

(4)從爬4階梯時間(TTCLIMB)獲得之速度變化，與基準線比較，於投予24週後，於25週時為-0.060次/秒以上或0.032±0.088次/秒以上；

(5)北極星步行能力評估(NSAA)得分之變化，與基準線比較，於投予24週後，於25週時為-2.2分以上或0.8±2.9分以上；及

(6)步行6分鐘試驗(6MWT)之變化，與基準線比較，於投予24週後，於25週時為-7.5公尺以上或28.9±36.3公尺以上。

於上述(1)至(6)，「基準線」係指於未處置患者群之平均值。又，(2)至(6)之「變化」係指平均值之變化。

於某一實施態樣，將本發明之醫藥組成物依照前述本發明之用法/用量於7至9歲裘馨氏肌肉萎縮症之人類患者投予84週時，可產生由以下(7)至 (12)構成之群組選擇之至少一種效果：

(7)從開始治療至第85週，喪失起立能力之患者未達20%；

(8)從開始治療至第85週，不能爬4階梯之患者未達10%；

(9)從開始治療至第85週，喪失自立步行能力之患者未達10%；

(10)從開始治療至第85週，未觀察到10公尺跑步/步行之速度因年齡增加而減少；

(11)從開始治療至第85週，未觀察到爬4階梯之速度因年齡增加而減少；及

(12)從開始治療至第85週，未觀察到起立之速度因年齡增加而減少。

上述(7)至(12)相關之效果，將開始治療之週設定為第1週，可於第1週至第85週、第1週至第80週、第1週至第75週、第1週至第70週、第1週至第65週、第1週至第60週之任一時點產生。

於某一實施態樣，將本發明之醫藥組成物依照前述本發明之用法/用量於10至12歲裘馨氏肌肉萎縮症之人類患者投予，可產生由以下(13)至(18)構成之群組選擇之至少一種效果：

(13)從開始治療至第85週，喪失起立能力之患者未達60%；

(14)從開始治療至第85週，不能爬4階梯之患者未達50%；

(15)從開始治療至第85週，喪失自立步行能力之患者未達50%；

(16)從開始治療至第85週，未觀察到10公尺跑步/步行之速度因年齡增加而減少；

(17)從開始治療至第85週，觀察到爬4階梯之速度增加的時期；及

(18)從開始治療至第85週，觀察到起立之速度增加的時期。

上述(13)至(18)相關之效果，將開始治療之週設定為第1週，可於第1週至第85週、第1週至第80週、第1週至第75週、第1週至第70週、第1週至第65週、第1週至第60週之任一時點產生。

亦即，本發明之醫藥組成物可產生上述(1)至(18)之相關效果之至少一種。

II.第二形態

本發明於第二形態之形態，

提供含有與由人類肌營養不良蛋白基因之第53號外顯子之5’末端至第36至56號核苷酸構成之序列為互補的鹼基序列所構成之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物之醫藥組成物，

包含將前述反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物以40mg/kg至80mg/kg，於前述人類患者每週1次進行靜脈內投予之裘馨氏肌肉萎縮症之治療方法(以下，亦稱為「本發明之治療方法」)。

本發明治療方法相關之各構成之意義都與於項目「I.第一形態」對於本發明醫藥組成物相關之構成之說明相同。

又，本發明之治療方法可產生於項目「I.第一形態」副項目「5.治療理論」中說明之(1)至(18)相關之效果之至少一種。

III.第三形態

再者，本發明於其第三形態之形態，

提供為於人類患者裘馨氏肌肉萎縮症之治療方法中使用之與由人類肌營養不良蛋白基因之第53號外顯子之5’末端至第36至56號核苷酸構成之序列為互補的鹼基序列所構成之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物，

將前述反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物對前述人類患者以40mg/kg至80mg/kg之量每週1次進行靜脈內投予，

前述反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物(以下，亦稱為「本發明用途之特定形態」)。

本發明用途之特定形態相關之各構成意義都與於項目「I.第一形態」對於本發明醫藥組成物相關構成之說明相同。

又，本發明用途之特定形態可產生於項目「I.第一形態」副項目「5.治療理論」中說明之(1)至(18)相關之效果之至少一種。

IV.第四形態

再者，本發明於其第四形態之形態，

提供一種反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物的用途，係用於製造用以治療人類患者裘馨氏肌肉萎縮症之醫藥組成物，該反義寡聚物係與由人類肌營養不良蛋白基因之第53號外顯子之5’末端至第36至56號核苷酸構成之序列為互補的鹼基序列所構成者，

前述反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物以40mg/kg至80mg/kg之用量對前述人類患者每週1次進行靜脈內投予找，

前述使用(以下，稱為「本發明之瑞士型用途」)。

本發明之瑞士型用途相關之各構成意義都與於項目「I.第一形態」對於本發明醫藥組成物相關構成之說明相同。

又，本發明之瑞士型用途可產生於項目「I.第一形態」副項目「5.治療理論」中說明之(1)至(18)相關之效果之至少一種。

以下列舉實施例對本發明做更詳細之說明，惟，本發明不只限於該實施例表示之範圍。

[實施例]

[製造例]

(1)擔載於胺基甲基聚苯乙烯樹脂之4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸之製造

步驟1：製造4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸

於氬氣大氣下，將N-{1-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-2-側氧基-1,2-二氫嘧啶-4-基}苯甲醯胺22.0g及4-二甲基胺基吡啶(4-DMAP)7.04g懸濁於二氯甲烷269mL中，加入琥珀酸酐5.76g，於室溫攪拌3小時。於反應液中加入甲醇40mL，減壓濃縮之。於殘渣中使用乙酸乙酯及0.5M磷酸二氫鉀水溶液進行萃取操作。將獲得之有機層依序以0.5M磷酸二氫鉀水溶液、水、飽和食鹽水洗淨。獲得之有機層以硫酸鈉乾燥，減壓濃縮，獲得目的物25.9g。

步驟2：製造擔載於胺基甲基聚苯乙烯樹脂之4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸

將4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸23.5g溶解於吡啶(脫水)336mL，加入4-DMAP4.28g、1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽40.3g。接著，加入胺基甲基聚苯乙烯樹脂1%DVB交聯(東京化成工業公司製造、A1543)25.0g、三乙胺24mL，於室溫振盪4日。反應後濾取樹脂。將獲得之樹脂依序以吡啶、甲醇、二氯甲烷洗淨，減壓乾燥之。於獲得之樹脂中加入四氫呋喃(脫水)150mL、乙酸酐15mL、2,6-二甲基吡啶15mL，於室溫振盪2小時。濾取樹脂，依序以吡啶、甲醇、二氯甲烷洗淨，減壓乾燥，獲得目的物33.7g。

該目的物之負荷量可使用公知之方法，藉由於409nm之UV吸光度測定之每1g樹脂之三苯甲基莫耳量決定。樹脂之負荷量為397.4μmol/g。

UV測定條件

機器：U-2910(日立製作所)

溶劑：甲磺酸

波長：265nm

ε值：45000

(2)製造PMO NO.8

PMO NO.8為將外顯子53中之「第36至56號」作為標的序列，5’末端之基為「基(3)」，鹼基部分之序列表示於序列編號3。

將擔載於胺基甲基聚苯乙烯樹脂之4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸(參考例1)2g(800μmol)移至反應槽中，添加二氯甲烷30mL，靜置30分鐘。再以二氯甲烷30mL洗淨2次後開始下述合成循環。於各循環添加所期待之N-嗎啉基單體化合物使成為標記化合物之鹼基序列。

[表3]

又，去封端溶液使用將三氟乙酸(2當量)與三乙胺(1當量)之混合物以含有1%(v/v)乙醇及10%(v/v)2,2,2-三氟乙醇之二氯甲烷溶液溶解使成為3%(w/v)者。中和溶液使用將N,N-二異丙基乙胺以含有25%(v/v)2-丙醇之二氯甲烷溶液溶解使成為5%(v/v)者。偶合溶液A使用將N-嗎啉基單體化合物以含有10%(v/v)N,N-二異丙基乙胺之1,3-二甲基-2-咪唑啉酮溶解使成為0.15M者。偶合溶液B使用將N,N-二異丙基乙胺以1,3-二甲基-2-咪唑啉酮溶解使成為10%(v/v)者。封蓋溶液使用對於二氯甲烷將20%(v/v)乙酸酐及30%(v/v)2,6-二甲基吡啶溶解者。

將於上述合成之PMO所擔載之胺基甲基聚苯乙烯樹脂從反應容器中回收，於室溫減壓乾燥2小時以上。將擔載於經乾燥之胺基甲基聚苯乙烯樹脂之PMO放入反應容器中，加入28%氨水-乙醇(1/4)200mL，於55℃攪拌15小時。濾別胺基甲基聚苯乙烯樹脂，以水-乙醇(1/4)50mL洗淨。將獲得之濾液減壓濃縮之。將獲得之殘渣溶解於20mM乙酸-三乙胺緩衝液(TEAA緩衝液)與乙腈之混合溶劑(4/1)100mL中，以膜濾器過濾。將獲得之濾液以逆相HPLC精製。使用之條件如以下所述。

[表4]

分析各分液，以乙腈-水(1/1)100mL將目的物回收，添加乙醇200mL，減壓濃縮之。再減壓乾燥，獲得白色固體。於獲得之固體中加入10mM磷酸水溶液300mL，懸濁之。加入2M磷酸水溶液10mL，攪拌15分鐘。再加入2M氫氧化鈉水溶液15mL中和之。再加入2M氫氧化鈉水溶液15mL作成鹼性，以膜濾器(0.45μm)過濾之。以10mM氫氧化鈉水溶液100mL清洗，獲得作為水溶液之目的物。

將含有獲得之目的物之水溶液以陰離子交換樹脂管柱精製。使用之條件如以下所述。

[表5]

分析(HPLC)各分液，獲得作為水溶液之目的物。於獲得之水溶液中添加0.1M磷酸緩衝液(pH 6.0)225mL中和之。以膜濾器(0.45μm)過濾之。接著，以下述之條件進行超濾，脫鹽之。

[表6]

將濾液濃縮，獲得約250mL之水溶液。將獲得之水溶液以膜濾器(0.45μm)過濾之。將獲得之水溶液凍結乾燥，獲得作為目的化合物之白色綿狀固體1.5g

ESI-TOF-MS計算值：6924.82

測定值：6923.54

[實施例1]美國第2期試驗

第II期用量設定試驗「NS-065/NCNP-01-201試驗」於2016年12月以「IND127474」為基礎開始。本試驗作為ClinicalTrials.gov認識編號「NCT02740972」，以「Safety and Dose Finding Study of NS-065/NCNP-01 in Boys With Duchenne Muscular Dystrophy(DMD)」之標題為基礎進行。本試驗之治驗實施計劃書可從https：//www.Clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT02740972取得，其內容全部引用作為參考。本試驗以於適合藉由外顯子53跳讀治療之裘馨氏肌肉萎縮症(DMD)患者評估作為點滴靜注送達之高用量(80mg/kg)及低用量(40mg/kg)之NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)之安全性為主要目的。又，亦包含以忍容性、肌肉機能及肌力、藥物動態及藥力學構成之目的。

更具體而言，為第II期多中心2期間隨機安慰劑對照用量設定試驗，於DMD之4歲以上未達10歲之門診男孩將NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)以每週1次點滴投予24週。包含2個用量水平組別(level cohort)。期間1以雙盲檢樣式試驗。患者隨機於參加之最初4週(期間1)每週1次點滴靜注NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)或安慰劑，接著，將NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)以5至24週(20週間的實藥治療-期間2)點滴靜注。從40mg/kg用量組別之期間1之安全性數值分析於將患者於80mg/kg用量組別中登錄前完成。完成24週試驗之患者可接受非盲檢延長試驗。

臨床的有效性可於所預定之定期試驗來院時進行評估。所有患者於基準線時接受二頭肌生檢，於第24週接受第2次之肌生檢。

安全性藉由收集不良事件(Adverse Event)、血液及尿之實驗室試驗、心電圖(ECG)、生命徵象及經過試驗全體之身體檢查進行評估。為了評估NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)之藥物動態，於4次之試驗來院時連續採取之血液試樣。

<治驗的種類：介入(臨床試驗)>

‧實際之登錄：16人參加者。

‧分配：隨機。

‧介入模型：並列分配。

‧掩蔽：4部份(quadruple)(參加者、護理提供者、治驗責任醫師、臨床成果評估者)。

‧主要目的：治療。

‧實際試驗之開始日：2016年12月。

‧初次完成日：2018年3月。

<患者群及介入>

‧實驗：NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)40mg/kg

於確認適合藉由外顯子53跳讀治療，具有基因缺失之DMD患者6人中將NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)40mg/kg用量以每週1次點滴注射24週。

‧實驗：NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)80mg/kg

於確認適合藉由外顯子53跳讀治療，具有基因缺失之DMD患者6人中將NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)80mg/kg用量以每週1次點滴注射24週。

‧安慰劑比較劑：安慰劑

於各用量群之2人或3人患者，以每週1次點滴靜注投予安慰劑4週之後進行20週之開放處置。

<選擇基準>

‧4歲以上未達10歲之男性。

‧確認於適合藉由外顯子53跳讀治療使肌營養不良蛋白mRNA讀框恢復之肌營養不良蛋白基因中具有DMD突然變異(單數或複數)

‧無輔助裝置可獨立步行

‧至起立的時間、至跑步/步行之及至評估上昇之時間

‧糖皮質素至少安定投予3個月

<除外基準>

‧治驗藥初次投予前4週以內之急性疾病。

‧症候性心肌症之證據。(不排除調查時之無症候性心臟異常)

‧對於藥物療法有重度過敏或過敏症

‧於治驗責任醫師之意見有會防礙參加治驗之嚴重行動上或認知上的問題

‧根據治驗責任醫師之意見有可能會影響安全性、治療及追踨調查要完全完成之可能性低或會損壞治驗結果評估之以前或進行中之病狀、病歴、身體所見或臨床檢查值異常

‧現在或治驗藥投予開始前3個月以內有服用其他之治驗藥。

‧於預定NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)最初投予前3個月以內有接受手術或於試驗期間有預定外科手術之患者

‧以前參加過本試驗之患者或投予NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)前有參加其他試驗之患者

再度總結，為適合藉由外顯子53跳讀治療且於投予糖皮質素3個月以上為安定之16人男性患者中進行40mg/kg/週及80mg/kg/週用量試驗、24週之2組別試驗。各組別之安慰劑群患者作為不良事件(安全性臨床成果)之對照，接受最初4週之隨機期間。接著，將安慰劑處置患者及活性處置患者雙方經過20週處置期間繼續試驗。NS-065/NCNP-01-201試驗為將NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)注射液以40mg/kg/週之低用量及80mg/kg/週之高用量之2種用量組別投予20至24週，評估於肌營養不良蛋白質之重生表現帶來的影響(參照第1圖)。試驗NS-065/NCNP-01-201之目標為以使用西方點墨法(WB)法(主要替代療效指標(primary surrogate endpoint)測定之於骨骼肌中肌營養不良蛋白質之重生表現為基礎，鑑定安全且有效之用量。次要替代療效指標包含重生肌營養不良蛋白蛋白質表現之免疫螢光(IF)染色及質量分析檢出及重生肌營養不良蛋白mRNA水平之RT-PCR檢出。作為第2期試驗之次要療效指標包含數種之機能性療效指標。試驗NS-065/NCNP-01-201之療效指標如以下所述：

<主要療效指標>

‧靜脈內(IV)投予NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)注射液之低用量(40mg/kg/週)及高用量(80mg/kg/週)之安全性及容忍性

‧於治療20至24週後藉由西方點墨法測定肌肉中肌營養不良蛋白質之誘導，將此作為NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)注射液之低及高IV用量之效果。

於第1圖，下半部表示之「高用量：80mg/kg/週」時間系列於從下半部所示之「低用量：40mg/kg/週」時間系列之後之時間達到平衡，只於確認以低用量投予之安全性後再開始高用量投予。

測定內容：

1.藉由用於mRNA分析之即時聚合酶連鎖反應(RT-PCR)測定之於肌肉中肌營養不良蛋白mRNA之誘導(時間框架20至24週之處置)

RT-PCR為測定肌營養不良蛋白RNA經變化之剪接。於該方法，mRNA從凍結肌生檢分離，逆轉錄為cDNA。PCR引子設計為鄰接於肌營養不良蛋白mRNA上外顯子53部位。藉由凝膠電泳將對應經剪接之肌營養不良蛋白mRNA特定版本之RT-PCR帶可視化，比較不同mRNA異構物之量。藥劑順利結合於RNA標的時，外顯子53從獲得之mRNA轉錄物排除。

2.以藉由用於分析蛋白質之西方點墨法測定之肌肉誘導之肌營養不良蛋白質。(時間框架：20至24週之處置)

主要生化學結果之測定為藉由免疫墨點法(西方點墨法)測定肌營養不良蛋白產生量之藥物誘發性增加。肌營養不良蛋白免疫墨點法使用可經溶化之肌肉生檢凍結切片，蛋白質經過凝膠電泳(SDS-PAGE)、於硝化纖維之電墨點法，接著與用於檢出肌營養不良蛋白蛋白質之抗體之硝化纖維培育，根據分子量進行分劃。接著，將對於源自患者生檢之肌營養不良蛋白之免疫墨點法信號與相同凝膠(混合DMD及正常對照)上肌營養不良蛋白之標準曲線之信號進行比較。藉由此可提供肌肉中肌營養不良蛋白含量之半定量評估。

美國第2期試驗：有效性

成果測定1

成果測定1(亦即，重生肌營養不良蛋白mRNA水平之RT-PCR檢出)獲得之結果如以下所述。

[表7]

成果測定2

對於成果測定2(亦即，使用西方墨點法測定骨骼肌中重生肌營養不良蛋白蛋白質表現量)獲得之結果，比較基準線之平均值及治療中之平均值，計算從基準線增加19.0倍(以40mg/kg/週，24週)及增加9.8倍(以80mg/kg/週，24週間)及各患者增加率之平均值，顯示增加27.2倍(40及80mg/kg/週，24週)。獲得之數值總結於以下之表8及第2圖。

[表8]

藉由NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)肌營養不良蛋白恢復之程度(40或80mg/kg/週、24週)與於2016年由Sarepta Therapeutics公司發售之對於適合藉由外顯子51跳讀治療之Exondys51(註冊商標)(eteplirsen)(30mg/kg/週、48及180週)以前所報告之恢復程度相比，起碼高約3至7倍或8.8至9.7倍。具體而言，為了比較，以下表示對應Exondys51(註冊商標)(eteplirsen)之西方點墨法數值。於投予NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)24週之16人患者中有3人肌營養不良蛋白水平從基準線增加超過10%。於投予NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)24週之患者16例中之12例看到肌營養不良蛋白值上昇3%以上。霍夫曼(Hoffman)人等於具有「貝克氏肌肉萎縮症及異常肌營養不良蛋白表現型之裘馨氏(正常水平之肌營養不良蛋白未達3%)之患者中在臨床表現型之重症度及肌營養不良蛋白評估之結果之間有明確的補正」之報告(Eric P.Hoffman,et al.,“Characterization of Dystrophin in Muscle-Biopsy Specimens from Patients with Duchenne’s of Becker’s Muscular Dystrophy.”N.Engl.J.Med.,318：1363-1368(1988))。

‧eteplirsen西方墨點法：增加2.8倍(從0.16%變化為0.44%(30mg/kg/週、48週間))。(「於可評估之結果獲得之12例中肌營養不良蛋白濃度於治療前為健康被驗者肌營養不良蛋白濃度之0.16%±0.12%(平均±標準偏差)，EXONDYS5投予148週後為0.44%±0.43%(P<0.05)」)(可從https：//www.fda.gov/downloads/AdvisoryCommittees/CommitteesMeetingMaterials/PediatricAdvisoryCommittee/UCM557917.pdf取得)

‧eteplirsen西方墨點法：3.1倍(從0.3%變化為0.93%)(30mg/kg/週、180週)。(於從「伸趾短肌(EDB)(Extensor digitorum brevis muscle)生檢之西方點墨法，肌營養不良蛋白水平平均，為正常值之約0.3%，惟，其範圍由於不能檢出，為至正常值之約1%以上」「本專利申請人使用之為最正確定量方法之西方墨點法從eteplirsen處置約3.5年後之平均肌營養不良蛋白水平為健康被驗者之0.93%±0.84%(平均±標準偏差))(可從https：//www.fda.gov/downloads/advisorycommittees/committeesmeetingmaterials/drugs/peripheralandcentralnervoussystemdrugsadvisorycommittee/ucm497063.pdf.取得)

‧eteplirsen西方點墨法：於180週為0.93%，範圍為0%至2.47%(30mg/kg/週、180週)(Kenji Rowel Q Lim,et al.,“Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy.”Drug Des.Devel.Ther.,11：533-545(2017)https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5338848/)。

‧再者，「對於eteplirsen於第180週實施之試驗，藉由30mg/kg及50mg/kg之週投予量對於肌營養不良蛋白產生量之用量反應看不到有差異。暗示該途徑對於其他外顯子可能無效」(Kenji Rowel Q Lim,et al.,“Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy.”Drug Des.Devel.Ther.,11：533-545(2017)https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5338848/)

與適合藉由外顯子53跳讀治療之DMD患者用之N-嗎啉基寡核苷酸之SRP-4053(golodirsen；Sarepta公司製造)比較中，於觀察到之肌營養不良蛋白水平之增加量中，Viltolarsen顯示獲得更優越之效果。具體而言，為了比較之目的，將Viltolarsen不投予24週，將對應投予48週間後獲得之SRP-4053(golodirsen)之西方點墨法數值表示於下。

‧golodirsen西方點墨法：從0.095%變化為1.019%(48週30mg/kg)。(「肌營養不良蛋白蛋白質之平均增加量於西方點墨法測定(本試驗之生物學上之主要療效指標)，與正常值0.095%(P<0.001)之平均基準線比較，增加為正常值之1.019%。表示從基準線增加10.7倍」)(可從http：//investorrelations.sarepta.com/news-releases/news-release-details/sarepta-therapeutics-announces-positive-results-its-study.取得)

‧golodirsen西方點墨法：最小0.09%、最大4.30%(30mg/kg/週，48週)。25例中有2例看到肌營養不良蛋白值上昇3%以上(22nd International Congress of the World Muscle Society(3-7 October 2017,St.Malo,France),http：//www.google.co.jp/url？sa=t&source=web&cd=2&ved=2ahUKEwid7ZTQ9Orb AhUETLwKHX3xDk8QFjABegQIARAB&url=http%3A%2F%2Finvestorrelations.s arepta.com%2Fstatic-files%2F64d8d897-2e4a-4119-80b4-115cbae17993&usg=AOvVaw1Amh1Mq1VauvLkPvYWfVdR)。

美國第2期試驗：安全性

對於投予NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)高用量及低用量(40mg/kg/週及80mg/kg/週)之DMD患者16例之安全性數值，於試驗之實施、數值之質或參加者之安全性無很大之疑慮。於36週之時點無中止治療之參加者。具體而言，無嚴重之不良事件，無達到需中止之不良事件，亦無與藥劑有關之不良事件。所有之不良事件都為輕度或中度。

[實施例2]美國/加拿大的第2期試驗

更具體而言，為第II期多中心2期間隨機安慰劑對照用量設定試驗，於DMD之4歲以上未達10歲之門診男孩將NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)以每週1次點滴投予24週。包含2個用量水平組別(level cohort)。期間1以雙重盲檢樣式試驗。患者隨機於參加之最初4週(期間1)每週1次點滴靜注NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)或安慰劑，接著，將NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)以5至24週(20週間的實藥治療-期間2)點滴靜注。從40mg/kg用量組別之期間1之安全性數值分析於將患者於80mg/kg用量組別中登錄前完成。完成24週試驗之患者可接受非盲檢延長試驗。

<治驗的種類：介入(臨床試驗)>

‧實際之登錄：16人參加者。

‧分配：隨機。

‧介入模型：並列分配。

‧主要目的：治療。

‧實際試驗之開始日：2016年12月。

‧初次完成日：2018年3月。

<患者群及介入>

‧實驗：NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)40mg/kg

於確認適合藉由外顯子53跳讀治療，具有基因缺失之DMD患者6人中將NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)40mg/kg用量以每週1次點滴靜注24週。

‧實驗：NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)80mg/kg

於確認適合藉由外顯子53跳讀治療，具有基因缺失之DMD患者6人中將NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)80mg/kg用量以每週1次點滴靜注24週。

‧安慰劑比較劑：安慰劑

於40mg/kg用量群之2人患者及80mg/kg用量群之3人患者以每週1次點滴靜注投予安慰劑4週之後進行20週之開放處置。

<選擇基準>

‧同意時為4歲以上，初次點滴靜注時為未滿10歲之男性。

‧無輔助裝置可獨立步行

‧運動機能評估者為可實施起立時間(TSTAND)、10公尺跑步/步行時間(TTRW)及爬4階梯時間(TTCLIMB)之評估及判斷之患者

‧糖皮質素至少安定投予3個月

<除外基準>

‧治驗藥初次投予前4週以內之急性疾病。

‧對於藥物療法有重度過敏或過敏症

‧現在或治驗藥投予開始前3個月以內有服用其他之治驗藥。

再度總結，為適合藉由外顯子53跳讀治療且於投予糖皮質素3個月以上為安定之16人男性患者中進行40mg/kg/週及80mg/kg/週用量試驗之24週2組別試驗。各組別之安慰劑群患者作為不良事件(安全性成果)之對照，接受最初4週之隨機期間。接著，將安慰劑處置患者及活性處置患者雙方經過20週處置期間繼續試驗。NS-065/NCNP-01-201試驗為將NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)注射液250mg以40mg/kg/週之低用量及80mg/kg/週之高用量之2種用量組別投予20至24週，評估肌營養不良蛋白蛋白質之重生表現帶來的影響(參照第3圖)。試驗NS-065/NCNP-01-201之目標為以使用西方點墨法(WB)(主要替代療效指標(primary surrogate endpoint)測定之於骨骼肌中肌營養不良蛋白質之重生表現為基礎，鑑定安全且有效之用量。次要替代療效指標包含重生肌營養不良蛋白質表現之免疫螢光(IF)染色及質量分析檢出及重生肌營養不良蛋白mRNA水平之RT-PCR檢出。作為第2期試驗之次要療效指標包含數種之機能性療效指標。試驗NS-065/NCNP-01-201之終點如以下所述：

<主要療效指標>

‧靜脈內(IV)投予NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)注射液250mg之低用量(40mg/kg/週)及高用量(80mg/kg/週)之安全性及容忍性

‧於治療20至24週後藉由西方點墨法測定肌肉中肌營養不良蛋白質之誘導，將此作為NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)注射液250mg之低及高IV用量之效果。

‧NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)之血中藥物濃度

<次要療效指標>

‧NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)注射液250mg之低用量及高用量靜注於治療20至24週後藉由RT-PCR法之mRNA分析、藉由免疫螢光染色及質量分析法之蛋白質分析測定評估肌肉中肌營養不良蛋白mRNA及蛋白質之誘導帶來之效果

‧NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)注射液250mg之低用量及高用量靜脈內投予為了研究於治療20至24週後於肌力、可動性及機能性運動能力帶來之影響，對應起立時間(TSTAND)、10公尺跑步/步行時間(TTRW)、爬4階梯時間(TTCLIMB)、北極星步行能力評估(NSAA)、6分鐘步行試驗(6MWT)及定量肌肉試驗(QMT)與自然病程對照群比較測定之。

於第3圖，下半部表示之「高用量：80mg/kg/週」時間系列於從下半部所示之「低用量：40mg/kg/週」時間系列之後之時間達到平衡，只於確認以低用量投予之安全性後再開始高用量投予。

美國/加拿大第2期試驗次要療效指標：與外部無治療自然病程群(國際神經肌研究群組(CINRG)之裘馨氏型自然病程之研究(DNHS))比較之時間機能檢查

將登錄於美國/加拿大第2期試驗NS-065/NCNP-01-201之患者於基準線、第13週及第25週對於肌肉機能進行臨床評估。於本試驗之目的，對於4週之安慰劑期間未進行補正。該等評估包含數種型之時間機能檢查：從仰臥起立之時間(TTSTAND)；10公尺跑步/步行時間(TTRW)；爬4階梯時間(TTCLIMB)；步行6分鐘試驗(6MWT)及北極星步行能力評估(NSAA)。將經時變化與以CINRG DNHS試驗之對應患者之疾病軌跡進行比較。

CINRG DNHS為將440人之DMD患者各個經過數年追踪之試驗(總試驗期間為約10年)。CINRG係指國際神經肌研究群組(Cooperative International Neuromuscular Research Group)，「共有以給予神經肌病患者與其家族生活良好影響為共通目標之學術/研究中心之醫學/科學研究者之財團」(http：//www.cinrgsearch.org/)。DNHS表示裘馨氏型之自然病程研究(Duchenne natural History Study)，至今為於藉由CINRG(源自http：//www.cinrgsearch.org/Duchenne-Natural-history/)確立之「Duchenne muscular dystrophy(DMD)中最有希望之多中心自然病程研究」(McDonald CM,Henricson EK,Abresch RT,Han JJ,Escolar DM,Florence JM,Duong T,Arrieta A,Clemens PR,Hoffman EP,and Cnaan A,“CINRG Investigators.The cooperative international neuromuscular research group Duchenne natural history study-a longitudinal investigation in the era of glucocorticoid therapy：design of protocol and the methods used,”Muscle Nerve.,48(1),32-54(2013).、Henricson EK,Abresch RT,Cnaan A,Hu F,Duong T,Arrieta A,Han J,Escolar DM,Florence JM,Clemens PR,Hoffman EP,and McDonald CM,“CINRG Investigators.The cooperative international neuromuscular research group Duchenne natural history study：glucocorticoid treatment preserves clinically meaningful functional milestones and reduces rate of disease progression as measured by manual muscle testing and other commonly used clinical trial outcome measures,”Muscle Nerve.,48(1),55-67 (2013).及McDonald CM,Henricson EK,Abresch RI,Duong T,Joyce NC,Hu F,Clemens PR,Hoffman EP,Cnaan A,and Gordish-Dressman H,“CINRG Investigators.Long-term effects of glucocorticoids on function,quality of life,and survival in patients with Duchenne muscular dystrophy：a prospective cohort study,”Lancet,391(10119),451-461(2018))。

NS-065/NCNP-01-201試驗藉由參加CINRG網路之臨床設施實施。標準操作步驟(臨床手冊)及臨床評估者訓練計劃書與NS-065/NCNP-01-201臨床試驗及CINRG DNHS非常類似。NS-065/NCNP-01-201對於登錄於CINRG DNHS之患者之對應(匹配)使用以下之基準進行。

‧基準線時之年齡從4歲至未滿10.5歲之男孩。

‧具有12個月以上時間機能測試數值之患者。

‧地區：北美(美國、加拿大)。

‧類固醇至少投予3個月，經過觀察12/24個月持續投予類固醇

‧不參加其他之臨床試驗

對於登錄於NS-065/NCNP-01-201臨床試驗之患者匹配之患者之CINRG DNHS資料庫之查詢，適合藉由外顯子53跳讀治療之肌營養不良蛋白突然變異並無特定，惟將具有外顯子3-7缺失之患者及具有適合藉由外顯子44跳讀治療之肌營養不良蛋白缺失之患者除外，其結果獲得以下表9所示之69人被驗者。排除具有外顯子3-7缺失之患者及具有適合藉由外顯子44跳讀治療之肌營養不良蛋白缺失之患者之理由為源自該等患者顯示較輕度症狀之報告。

[表9]

於表9最上面一行，「外顯子53跳讀」係指適合藉由外顯子53跳讀治療之DMD患者，「非外顯子53跳讀」係指其他之所有患者(惟，需注意上述之除外事項)。於表9下列，「無大缺失/重複」包含如點突然變異(不適合藉由外顯子跳讀之治療)之其他類別。

具有6MWT數值之CINRG DNHS患者數比其他評估項目之患者數少。其理由為6MWT是於CINRG DNHS計劃書之後期追加的，與其他之時間機能檢查比較，數值之量受限。

於比較登錄於NS-065/NCNP-01-201之16人患者與登錄於CINRG DNHS之69人患者經過24週之疾病軌跡時明瞭於24週之時間範圍，自然病程比較群之患者於時間機能檢查呈現機能降低。相對的，登錄於NS-065/NCNP-01-201之患者於24週之相同期間，於時間機能檢查顯示改善平均值。該等改善中之3種達到統計上之顯著性：TTRW(第13週及第25週)；TSTAND(第25週)；及6MWT(第25週)。於40mg/kg/週及80mg/kg/週之NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)用量之間未觀察到統計上之顯著差異。

第4圖(合計5個圖及1個表)為登錄於NS-065/NCNP-01-201之患者(藍色實線表示「Viltolarsen」)及於CINRG DNHS中匹配之患者(紅色點線表示「DNHS」)中經過24週之於時間機能檢查從基準線之變化之比較。

於第4圖之5個圖，「Viltolarsen」為NS-065/NCNP-01之國際一般名(INN)。又，於所有之圖，將從基準線之變化使用為了反復測定(MMRM)分析之限制最大可能(REML)基礎之混合模型，於Viltolarsen投予群及CINRG DNHS患者群之間進行比較。

(1)時間機能檢查(Timed Function Test)

時間機能檢查為TTSTAND，TTRW，TTCLIMB，6MWT。TSTAND及TTRW作為個別之評估項目，於事前特定，以時間及6點滿點評估之規模為基礎進行評估。TSTAND及TTRW亦有NSAA之構成項目。因此，將該等測定1次，將該數值作為獨立型療效指標使用，再者，將其組合，作為NSAA試驗之一部分使用。以下再對於TSTAND及TTRW與經組合之NSAA規模之關係加以說明。使用TTCLIMB，評估患者爬4階梯所需之時間(秒)。於上述「美國/加拿大第2期試驗」中記載之臨床計劃書，TTCLIMB試驗需留意誤記載為作為NSAA之一部分實施。

6MWT為於多數疾病廣泛被使用、採納之試驗，其中，於本試驗使用者為適合DMD之版本。該試驗認為是用於臨床評估1)機能性運動狀態及2)對於運動總合之全體反應，為簡單、經標準化、以低技術且費用效果高之評估手段。於實施本試驗，將2點(圓錐)距離25公尺設置，使患者可依賴地於圓錐間迅速且安全的步行6分鐘。記錄患者於6分鐘之間步行之總距離(公尺)。臨床評估者測定患者最初50公尺所需之步數及步行6分鐘之總距離(公尺)(Craig M.McDonald,MD,Erik K.Henricson,MPH,Jay J.Han,MD,R.Ted Abresch MS,Alina Nicorici,BS,Gary L.Elfring,MS,Leone Atkinson MD,PhD,Allen Reha BS,Samit Hirawat MD,and Langdon L.Miller MD,“The 6-minute Walk Test as a New Outcome Measure in Duchenne Muscular Dystrophy,”Muscle & Nerve,Vol.41,pp.500-510,April 2010,Wiley Periodicals,Inc.及Craig M.McDonald,MD,Erik K.Henricson,MPH,R.Ted Abresch,MS,Julaine Florence,PhD,Michelle Eagle,PhD,Eduard Gappmaier,PhD,Allan M.Glanzman,DPT,Robert Spiegel,MD,Jay Barth,MD,Gary Elfring,MS,Allen Reha,MS,and Stuart W.Peltz,PhD,“The 6-minute Walk Test and Other Clinical Endpoints in Duchenne Muscular Dystrophy：Reliability,Concurrent Validity,and Minimal Clinically Important Differences from a Multicenter Study,”Muscle & Nerve,Vol.48,pp.357-368,September 2013,Wiley Periodicals,Inc.)。

定量性肌肉檢查(QMT)評估設計為測定靜收縮時產生之肌力，用於測定於神經肌疾病之肌力降低為十分確立之方法。於該方法使用CINRG定量肌肉系統(CQMS)。CQMS包含增加罹患DMD之兒童適合性之視聽覺反饋過程。將患者放在具備支撐背部機構之檢查桌上，由此排除以手動使背部安定化之必要性。單次實施投予(single practice administration)後附上各患者之得分，完成QMT評估(進行2次檢查，將2個值中之高值於數據分析中使用)。QMT使用具備應變規之直接電腦介面，力量以磅記錄進行。將試驗位置及試驗順序標準化。進行以下列舉之肌肉群之兩側試驗(Mayhew JE,Florence JM,Mayhew TP,Henricson EK,Leshner RT,Mccarter RJ,et al.,“Reliable surrogate outcome measures in multicenter clinical trials of Duchenne muscular dystrophy,”Muscle & Nerve,2007；35(1)：36-42.Epub 2006/09/14.)：

‧有力的握手(handgrip)。

‧肘屈肌(二頭肌)。

‧肘伸肌(三頭肌)。

‧膝屈肌(腿筋(hamstring))。

‧膝伸肌(四頭肌)。

對於QMT，排除肘伸肌，經過24週之處置期間觀察到所有參數中強度之平均值僅稍微減少。惟，於肘伸肌看到強度稍微增加(改善)。於任一項目，從第25週基準線之變化無統計上的顯著差異。

強度.機能試驗依TTSTAND、TTRW、TTCLIMB、NSAA、6MWT、QMT之順序實施。

(2)北極星步行能力評估(NSAA)

NSAA本來是為了至少可跑步10公尺之罹患DMD之男孩而設計的，為藉由臨床醫之採點，由17項目構成之機能評估系(E.S.Mazzone,S.Messina,G.Vasco,M.Main,M.Eagle,A.D’Amico,L.Doglio,L.Politano,F.Cavallaro,S.Frosini,L.Bello,F.Magri,A.Corlatti,E.Zucchini,B.Brancalion,F.Rossi,M.Ferretti, M.G.Motta,M.R.Cecio,A.Berardinelli,P.Alfieri,T.Mongini,A.Pini,G.Astrea,R.Battini,G.Comi,E.Pegoraro,L.Morandi,M.Pane,C.Angelini,C.Bruno,M.Villanova,G.Vita,M.A.Donati,E.Bertini,and E.Mercuri,“Reliability of the North Star Ambulatory Assessment in a multicentric setting,”Neuromuscular Disorders,Vol.19,Issue 7,pp.458-461,Jul 2009,Elsevier B.V.)。該評估工具包含站起來、從地板起立、決定之步調、跳躍及跑步之機能性活動。評估以2=正常實行試驗內容之能力；1=只要修正方法或有補助即可實行試驗內容；及0=不能實行試驗之3點評估尺度為基礎。因此，總得分於該等評估中為從0(完全不能步行)至34(無障礙)之範圍。記錄個個試驗項目之得分及合計得分。TSTAND及TTRW作為NSAA之一部分實行。

‧TTSTAND為作為DMD患者標準臨床檢查進行之例行試驗。於該試驗使用患者從平躺於地板到起立為止所需之時間進行評估。為了實行試驗，記錄將必要之秒數及患者如何達到站立位置以6點為滿點評估之點數。

‧使用TTRW，評估患者10公尺跑步/跑步所需之時間(秒單位)(包含對於跑步/步行之質之6點滿點評估規模)。

美國/加拿大之第2期試驗：安全性

對於投予高用量及低用量NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)(40mg/kg/週或80mg/kg/週)之DMD患者16例之安全性數值，試驗之實施、數值之質或參加者之安全性都無很大之疑慮。於48週之時點，無中止治療的參加者。具體而言，未看到需要中止或減量NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)之投予之TEAE(於治療時表現之不良事件)。所有之不良事件(不良事件)都為輕度或中度。

[實施例3]pH於Viltolarsen安定性之影響

(a)pH安定性評估(1)

為了研究溶液之液性與Viltolarsen安定性之關係，使用伯瑞坦-羅比森(Britton-Robinson)緩衝液(pH 3,4,5,6,7,8,9,10或11)評估Viltolarsen於各種pH溶液中之安定性。

[試驗條件]

藥液濃度：Viltolarsen 2mg/mL

溶解液：伯瑞坦-羅比森緩衝液(pH 3,4,5,6,7,8,9,10或11)

保存條件：(1)於121℃(高壓滅菌鍋處理)10,30或60分鐘；或

(2)於80℃恆溫器中4或7日

終點：外觀(目視確認)、pH(pH計)、純度試驗(HPLC法)、回收率(殘存率)(HPLC法)

HPLC條件：

流量：每分鐘1.0mL

檢出器：市外吸光光度計(測定波長：264nm)

管柱：將3.5μm之液體層析法用之用十八烷基矽基化矽膠填充於內徑4.6mm、長度15cm之不鏽鋼管中(Waters，X-bridge C18)。

管柱溫度：60℃

移動相：

‧將磷酸氫二鈉1.42g溶於水約750mL中，加入氫氧化鈉水溶液調製成pH12.0後加入水，作成1000mL(P液)。

‧於P液700mL中加入乙腈300mL，將四丁基溴化銨16.12g溶解(移動相A)。

‧於P液300mL中加入乙腈300mL，將四丁基溴化銨9.67g溶解(移動相B)。

‧移動相之送液：以30分鐘從移動相A/B(100vol%/0vol%)變更為(0vol%/100vol%)。

於本實施例及以下之實施例，純度試驗之值表示將檢出含有不純物之所有峰面積合計作為100時Viltolarsen主要峰面積之百分率(主峰面百(%))。

[試驗結果]

表10及第5圖表示試驗結果。「ST」為以相同藥液濃度稀釋於精製水之Viltolarsen水溶液，每次於試驗時才調製(不保存)。其結果，Viltolarsen於酸性領域之溶液中為不安定，惟，於中性至弱鹼性之溶液中比較安定。

[表10]

(b)pH-安定性評估(2)

為了更詳細研究Viltolarsen之安定pH領域使用磷酸鉀-硼砂緩衝液(pH 6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0或9.2)，評估Viltolarsen於pH 6至9各種pH溶液中之安定性。

[試驗條件]

藥液濃度：Viltolarsen 2mg/mL

溶解液：磷酸鉀-硼砂緩衝液(pH 6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0或9.2)

保存條件：(1)於121℃(高壓滅菌鍋處理)10,30或60分鐘；或

(2)於80℃恆溫器中1,4,7或14日

HPLC條件：

除了管柱溫度為50℃之外，與(a)相同。

[試驗結果]

表11及第6圖表示試驗結果。其結果為Viltolarsen於pH 7至7.5之溶液中最安定。

[表11]

[實施例4]pH調整劑對於製劑安定性之影響

本實施例以選擇pH調整劑將Viltolarsen注射液調整為安定pH領域(pH 7至7.5)為目的。評估添加各種pH調整劑(10mM KH₂PO₄、10mM Na₂HPO₄、10mM KH₂PO₄-Na₂HPO₄或100mM KH₂PO₄-Na₂HPO₄)調整為安定pH之10mg/mL Viltolarsen溶液之安定性。

[試驗條件]

藥液濃度：Viltolarsen 10mg/mL

藥液處方：如下述表12所述

保存條件：於121℃(高壓滅菌鍋處理)30至60分鐘

[表12]

[試驗結果]

表13及第7圖表示試驗結果。其結果為Viltolarsen即使於無緩衝劑之情況，亦有與有磷酸緩衝劑時同等以上之安定性。尤其是比於高濃度之磷酸緩衝液(於本實施例為100mM KH₂PO₄-Na₂HPO₄)中更安定。

[表13]

[實施例5]緩衝劑與聚合體生成之關係

Viltolarsen藉由保存條件形成聚合體，單體之純度降低。於本實施例測定於添加作為等張化劑之氯化鈉0.9%之50mg/mL Viltolarsen藥液中再添加各種緩衝劑時聚合體之生成。

[試驗條件]

藥液濃度：Viltolarsen 50mg/mL

保存條件：於60℃恆溫器中至5日

終點：聚合體(HPLC法、SEC管柱)

分析條件：

檢出器：紫外線吸光光度計(測定波長：260nm)

管柱：於內徑7.8mm、長度30cm之不鏽鋼管中填充7μm之液體層析法用之苯乙烯系乙烯聚合物凝膠，將該管柱2支串聯連接(TSK gel G3000 PWXL、7μm、7.8mm×30cm、東索公司製造)。

管柱溫度：25℃

移動相：將磷酸二氫鈉二水合物15.6g溶解於水750mL，加入氫氧化鈉試液，將pH調整為7.3之後加入水，作成1000mL。於該液800mL中加入乙腈200mL。

流量：調整使Viltolarsen單體保持時間為約21分鐘。

面積測定範圍：至Viltolarsen單體的峰為止之範圍

[試驗結果]

表14表示試驗結果。其結果藉由添加50mM磷酸緩衝液(磷酸二氫鈉‧二水合物-磷酸氫二鈉：NaH₂PO₄‧2H₂O-Na₂HPO₄)或檸檬酸緩衝液(檸檬酸三鈉‧二水合物)，聚合體之生成增加。

[表14]

[實施例6]溶解性之檢討(100mg/mL)

實施注射液高濃度化之檢討。

[試驗條件]

藥液：下述2種類

[表15]

過濾器：PVDF製(Millex GV,0.22μm,33mm,Millipore)

終點：外觀(目視確認)、pH(pH計)、純度試驗(HPLC法)、過濾後之回收率(HPLC法)

[試驗結果]

表16表示試驗結果。於調製100mg/mL之Viltolarsen注射液時藉由溶解性或滅菌過濾器過濾沒問題，成為無色澄明之溶液。於冷處保存後雖然產生黏性，但外觀上無變化。經由此明瞭可調製100mg/mL之注射液。

[表16]

[實施例7]溶解性之檢討(50mg/mL)

評估50mg/mL藥液之溶解性。調製藥液，藉由溶解性或滅菌過濾器進行過濾。

[試驗條件]

藥液：

[表17]

過濾器：PVDF製(微盤濾芯過濾器(Millidisk® Cartridge Filters,0.22μm,MCGL40S03/1個+MCGL40S03/2個，默克公司製造)

終點：外觀(目視確認)、pH(pH計)、純度試驗(HPLC法)、定量(HPLC法)

[試驗結果]

表18表示試驗結果。其結果50mg/mL成為無色澄明之溶液，過濾前後之含量無變化。經由此明瞭可調製50mg/mL之注射液，規模放大亦無問題。

[表18]

以下之實施例8至10為對於從參加實施例2之臨床試驗之患者獲得之試樣或參加實施例2之臨床試驗之患者進行試驗。

[實施例8]

藉由質量分析定量肌營養不良蛋白質

(實驗方法)

概要：生物學的分析法

試樣為藉由SDS-PAGE電泳進行蛋白質之分離，於凝膠內藉由胰蛋白酶進行酵素分解，作為肽片段。從凝膠片萃取肽片段，乾燥之。將肽再溶解，藉由逆相管柱以HPLC-MS/MS進行肌營養不良蛋白質之鑑定及定量。檢量曲線之範圍於將正常對照之肌營養不良蛋白蛋白質量作為100%時為1%至25%，濃度於標準化蛋白質中使用細絲蛋白C，從峰面積比算出。迴歸分析使用最小2乘法，獲得y=mx+b(y：峰面積比、x：%肌營養不良蛋白)之式。

凝膠內分解

以LC-MS/MS分析測定之試樣為進行SDS-PAGE(SDS：十二烷基硫酸鈉、PAGE：聚丙烯醯胺電泳)，藉由分子量進行蛋白質分離，於凝膠內分解獲得。各凝膠以從構成標準曲線之檢量體(0.0%,1.0%,3.0%,10.0%,25.0%肌營養不良蛋白)、從加入穩定同位素標識胺基酸培養之人類肌管細胞萃取之蛋白質(SILAC)12.5μg、對照組、臨床試驗4試樣合計11試樣構成。於凝膠有12列，剩下的1列於分子量標記中使用。檢量體為將源自5種非DMD肌生檢、2種DMD肌生檢之蛋白質萃取液混合，製作之。DMD肌生檢從賓漢姆頓大學(Binghamton大)取得，完成倫理審查。於本實施例之前先藉由西方點墨法預先測定各肌生檢之肌營養不良蛋白量。藉由凍結切片製作裝置從肌生檢獲得厚度10μm之連續切片70張。將肌切片移至預先於乾冰上冷卻之微管中。使用加入Thermo Scientific公司製造之蛋白酶及磷酸酶阻礙劑之RIPA緩衝液，從肌切片萃取蛋白質。使用BCA(蛋白質分析套件(protein assay kit)(Pierce))定量萃取液之蛋白質濃度。供給電泳之試樣為添加SILAC 12.5μg調整使各試樣含有50μg之蛋白質。於檢量體及臨床試樣加入SILAC萃取液作為尋求%肌營養不良蛋白時之內部標準，使用NuPAGE 3-8% Tris-Acetate凝膠，進行150V 75分鐘之電泳。凝膠泳動對於同一試樣使用2張凝膠(凝膠A及凝膠B)，重複實施。完成電泳之凝膠以甲醇：水：乙酸(50：45：5)固定30分鐘，於水中交換，進行再水合2次。進行考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)染色1小時。於4℃下進行凝膠脫色一晚。切出分子量標記460kDa至268kDa範圍之肌營養不良蛋白質存在之凝膠，以水：乙腈(50：50)洗淨2次。使用胰蛋白酶(質譜分析等級(Gold mass spectrometry grade),Promega Corporation公司製造)進行凝膠內分解，獲得肽片段，於減壓離心乾燥之。肌營養不良蛋白之肽片段先於-80℃保管，於以Q Exactive Nano-LC-MS/MS分析時使用。

試驗試樣

於參加臨床試驗之患者16名，從各患者獲得投予前後之肌生檢。32檢體為了重複進行64試樣之分析。又，4檢體重複構成之8試樣由於實施再分析，合計分析72試樣。

藉由LC-MS/MS之分析

藉由將高速液體層析法用之系統Dionex Ultimate 3000 RSLCnano(ThermoFisher Scientific)與質量分析裝置Q Exactive Plus(HRMS：High Resolution Mass Spectrometer)(ThermoFisher Scientific)組合之液體層析質量分析法(LC-MS/MS)分析獲得之肽片段。

乾燥肽片段使用2%乙腈(ACN)+0.1%三氟乙酸(TFA)再溶解。使用注射環5μL Dinoex nano Viper sample loop(ThermoFisher Scientific)，於LC-MS/MS中導入試料。

以下述之條件進行液體層析。

分析管柱：逆相管柱Acclaim Pepmap RSLC C18 15cm×75μm、粒徑3μm、EASY SPRAY(Thermo Fisher)

分析管柱溫度：50℃

移動相A：1%甲酸(HCOOH)、移動相B：0.1%甲酸CAN

流速：0.500μL/min(NC)

試料注入模型：Partial loop(loop size 5μL)

試料注入量：1.00-4.00μL

自動進樣器溫度：10℃

實行時間：40.00分鐘

[表19]

質量分析裝置以下述之條件使用。

離子源：Thermo Fisher EASY-Spray

離子模型：陽離子

掃描：並聯反應監控

鉻峰寬(半值全寬)：10秒

最小總循環時間：40分鐘

分解能：17,500

自動增益控制(Automatic Gain Control)標的：1e5

最大試料注入時間：50微秒

四級桿質量檢出器分離幅：1.0m/z單位

光譜數值：profile

Mass容許範圍：10ppm

典型可調式參數(Typical Tunable Parameters)(Dystrophin Tune File)

噴霧電壓(Spray Voltage)：1.8kV

毛細管溫度(Capillary Temperature)：275℃

S-Lens RF-Level：70

[表20]

[表21]

保持時間為變化至±1.5分。

[表22]

分析對象外之試樣：將SILAC以空白稀釋

從層析藉由Thermo Scientific公司之LC Quan version 3.0進行數據之收集。Mass之容許範圍為20ppm，積分算法為ICIS。檢量體1%或其他檢量體肌營養不良蛋白之峰面積為10000左右以下時，需留意以下之情況。與檢量體0%比較，同時獲得肌營養不良蛋白及細絲蛋白C之肽與標識肽之峰面積比為可信賴之數值，確認不會擾亂%肌營養不良蛋白。

肌營養不良蛋白與細絲蛋白C之峰面積為將與產品離子一致之峰面積合計計算。肌營養不良蛋白之峰面積從肌營養不良蛋白之1種肽片段(DYST2胺基酸序列：IFLTEQPLEGLEK(序列編號4))獲得。細絲蛋白C之峰面積為細絲蛋白C之2種肽片段(FILC1胺基酸序列：VAVGQEQAFSVNTR(序列編號6)、FILC2胺基酸序列：SPFVVNVAPPLDLSK(序列編號8))之平均值。

[表23]

檢量體及各臨床試樣中肌營養不良蛋白質水平(肌營養不良蛋白與細絲蛋白C之峰面積比)從以下之公式計算。為了從0%之檢量體亦能檢出肌營養不良蛋白，將從各檢量體肌營養不良蛋白質水平之數值減去檢量體0%之肌營養不良蛋白質水平之數值校正。使用Excel之樣版，尋求每個凝膠從檢量體至%肌營養不良蛋白及肌營養不良蛋白質水平之數值之線性回歸，從臨床試樣之肌營養不良蛋白質水平之數值獲得臨床試樣之%肌營養不良蛋白。

[表24]

(結果)

分析之各試樣之%肌營養不良蛋白於事前藉由是否合乎規定之基準決定採擇。測定之72試樣中有60試樣滿足基準。表25及26表示測定結果。各檢體雖使用重複之試樣進行試驗，惟，對於從40mg/kg投予群之2患者(表25之患者E及F)獲得之投予前後4檢體，一方之試樣(凝膠B)未滿足基準，獲得之測定值為只從1試樣(凝膠A)之1種。亦即，於40mg/kg投予群，投予前之8檢體16試樣中可測定14試樣。1試樣表示1%，11試樣為定量界限以下。又，25週時之8檢體16試樣中可測定14試樣。除了1檢體2次之測定同時為定量界限以下之外，檢出1%以上之肌營養不良蛋白。

於80mg/kg投予群，投予前之8檢體16試樣全都未達定量界限。又，於25週時之8檢體16試樣，於所有之試樣都檢出定量界限以上之肌營養不良蛋白，平均為4.2%。

從以上確認藉由投予Viltolarsen 40mg/kg及80mg/kg，肌營養不良蛋白蛋白質之表現恢復。

[表25]

NR：於報告書記載不能(只於檢量體2點獲得肌營養不良蛋白之峰面積，未達檢查合格基準。)

BLQ：定量界限(1%)以下

[表26]

BLQ：定量界限(1%)以下

*：由於1%肌營養不良蛋白檢量體之峰面積值低，未達3%為定量界限以下。

[實施例9]

運動機能試驗(13、25週時(初次投予經過12、24週時))

(實驗方法)

將自然病程群作為對照，比較本劑群運動機能之評估。自然病程群為從為美國肌營養不良之臨床試驗網路cooperative international neuromuscular research group(CINRG)實施之稱為Duchenne natural history study(CINRG DNHS)之研究，以基準線時之數值為基礎選擇之。

CINRG DNHS為將男性440名之DMD患者作為對象之縱貫性自然病程研究，收集從2006年至2016年之數值，於基準線時、第1年4次、第2年2次，之後每1年1次，最長10年到院。於每次到院時實施時間機能檢查、肌力檢查、藉由問卷之機能檢查、肺機能檢查、生活品質之評估。201試驗於CINRG所屬之設施實施，標準操作步驟書(SOP)及臨床評估者訓練步驟書於兩試驗間為一致。

作為本試驗之對照，從CINRG DNHS選擇滿足包含201試驗之年齡、類固醇使用狀況及地域等之主要登錄基準之以下基準之患者。

‧有最少12個月之時間機能檢查數值[基準線時之起立時間(TTSTAND)、爬4階梯時間(TTCLIMB)及10m步行/跑步時間(TTRW)之數值為必要]。

‧於基準線時為4歲至未滿10歲

‧北美(美國或加拿大)

‧皮質類固醇最少投予3個月，經過12-24個月之觀察期間繼續使用。

‧未同時於其他外顯子跳讀藥之臨床試驗中登錄。

‧滿足下述之基因適格性基準。

(選擇基準)：

有基因檢查結果之患者

具有重複變異之患者

具有引起無義變異或框移之微小變異之患者

(除外基準)：

於從啟動子至外顯子8之間有變異之患者(有病狀進行慢之報告(1)Hum Mutat.2018；39：1193-1202及(2)Hum Mutat.2008；29(5)：728-37者除外)

適合藉由外顯子44跳讀治療之患者(從有病狀進行慢之報告(1)中除外)

具有框內變異之患者

其結果，男孩DMD患者65例滿足上述基準，其中9例為適合藉由外顯子53跳讀治療之DMD患者(外顯子53跳讀群)、56例為不適合藉由外顯子53跳讀治療之DMD患者(非外顯子53跳讀群)。

[表27]

(結果)

於接受Viltolarsen治療之被驗者(Viltolarsen投予群)16例及CINRG DNHS之自然病程群(DNHS群)65例中比較於13週時及25週時投予前或從基準線之時間機能檢查[6分鐘步行試驗(6MWT)、起立時間(TTSTAND)之速度、爬4階梯時間 (TTCLIMB)之速度、10公尺跑步/步行時間(TTRW)之速度]及北極星步行能力評估(NSAA)之變化。

本實施例使用之解析方法為作為影響「投予前值」或基準線結果之背景因子之共變量，將13週時及25週時之數值作為於特定被驗者重複測定之值(repeated measures)使用，進行MMRM解析。其結果，本實施例之Viltolarsen投予群於6分鐘步行距離及10公尺跑步/步行時間之速度有意義地改善。又，於其他之所有運動機能試驗，本劑群都比自然病程之經過更改善。

第8圖表示13週投予時(從初次投予經過12週時)及25週投予時(從初次投予經過24週時)Viltolarsen投予群及於CINRG自然病程對照群(DNHS)中各運動機能試驗結果從基準線之變化圖。變化量為從基準線至13週時、25週時之變化量之最小2乘平均，誤差線為標準誤差，P值為使用MMRM算出。

以下為於Viltolarsen投予群及DNHS各時點之試樣數。

[表28]

[表29]

[實施例10]

運動機能試驗(至85週(從初次投予經過84週))

(實驗方法)

時間機能檢查[6分鐘步行試驗(6MWT)、起立時間(TTSTAND)、爬4階梯時間(TTCLIMB)、10公尺跑步/步行時間(TTRW)]及北極星步行能力評估(NSAA)於初次投予1週間前及從初次投予時(1週時)經過12週之每個時間點(13,25,37,49,61,73,85週時)測定。201試驗於CINRG所屬之設施實施，運動機能試驗與於CINRG之DNHS中使用之標準操作步驟書(SOP)及臨床評估者訓練步驟書一致。被驗者亦有小孩，有於試驗實施時不能維持興趣等理由未實施試驗之項目。

(結果)

第9圖至第16圖表示結果。於北極星步行能力評估，於Viltolarsen投予群5歲以上之多數患者得分維持或提高。根據將義大利及英國之自然病程數值為基礎，設立如臨床試驗之患者納入基準，研究1、2年後NSAA得分之變化之文獻，外顯子53跳讀對象治療患者1年間之平均變化量為-4.1點(J Neurol Neurosurg Psychicary 87,149-55,2016)。與文獻納入基準一致之Viltolarsen投予群之患者經過48週時之變化量為+1.3點。於報告DHNS結果之文獻(Muscle Nerve 48,55-67,2013)，7歲至9歲之DMD患者中20%喪失起立之能力，於Viltolarsen投予群無相當之患者。從7歲至9歲之DMD患者中10%不能爬4階梯，於Viltolarsen投予群無相當之患者。速度雖隨著加齡增加而減少，惟，於Viltolarsen投予群全體都觀察到速度上昇。於7歲至9歲之DMD患者中10%喪失自立步行能力，惟於NSP無相當之患者。又，10公尺跑步/步行時間之速度雖隨著年齡增加而減少，惟，於Viltolarsen投予群全體觀察到速度上昇。對於從藉由WB之肌營養不良蛋白定量值之基準線之肌營養不良蛋白表現量之變化及起立時間試驗、爬4階梯試驗、10m步行/跑步試驗之基準線48週間之速度變化，以Excel計算有無相關及直線迴歸式。關於起立時間試驗及10公尺跑步/步行試驗，於肌營養不良蛋白表現量與速度變化有有意義之相關關係(P<0.05)，暗示隨著肌營養不良蛋白之增加，運動機能之速度變化上昇。

[產業之利用可能性]

藉由本發明提供具有NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)之安定組成之裘馨氏肌肉萎縮症治療用之醫藥組成物。又，提供關於含有NS-065/NCNP-01(Viltolarsen)之醫藥組成物，發揮有效果之DMD治療且於人類患者為安全範圍之用法‧用量。藉由該醫藥組成物，可以低副作用，有效果的減輕裘馨氏肌肉萎縮症之症狀。

<110> 日商日本新藥股份有限公司

<120> 含有反義寡核苷酸之組成物及其用於治療裘馨氏肌肉萎縮症之用途

<130> G2329

<150> US 62/690,270

<151> 2018-06-26

<150> US 62/739,386

<151> 2018-10-01

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 212

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens))

<400> 1

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 3

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成肽

<400> 4

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成肽

<400> 5

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成肽

<400> 6

Claims

一種醫藥組成物，係含有與由人類肌營養不良蛋白基因之第53號外顯子之5’末端至第36至56號核苷酸構成之序列為互補的鹼基序列所構成之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物，且為用於治療人類患者之裘馨氏肌肉萎縮症者，

前述治療包含將反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物對上述人類患者以40mg/kg至80mg/kg之量每週1次進行靜脈內投予。
如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中，將前述反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物對前述人類患者以40mg/kg之量每週1次進行靜脈內投予。
如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中，將前述反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物對前述人類患者以80mg/kg之量每週1次進行靜脈內投予。
如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中，前述人類患者為於肌營養不良蛋白基因具有由外顯子43-52、45-52、47-52、48-52、49-52、50-52或52構成之群組選擇之任一種外顯子缺損而造成之變異。
如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中，於前述人類患者，治療前肌營養不良蛋白質之表現藉由西方墨點法或質量分析之測定，為健康人之1%以下。
如申請專利範圍第5項所述之醫藥組成物，其中，於前述人類患者，於治療前未看到肌營養不良蛋白質之表現。
如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中，前述反義寡聚物之鹼基部分之序列為包含序列編號3中所示之序列。
如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中，前述反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物為Viltolarsen或其均等物。
如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中，該醫藥組成物以2.5至500mg/mL或10至100mg/mL之濃度含有前述反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物。
如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中，該醫藥組成物以25mg/mL之濃度含有前述反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物。
如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中，該醫藥組成物以50mg/mL之濃度含有前述反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物。
如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中，該醫藥組成物另含有由等張化劑、pH調整劑及溶劑構成之群組選擇之至少一種成分。
如申請專利範圍第12項所述之醫藥組成物，其中，前述等張化劑為由氯化鈉、氯化鉀、葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、海藻糖及甘油構成之群組選擇之至少一種。
如申請專利範圍第12項或第13項所述之醫藥組成物，其中，前述pH調整劑為由鹽酸、氫氧化鈉、檸檬酸、乳酸、磷酸鹽(磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀)及單乙醇胺構成之群組選擇之至少一種。
如申請專利範圍第12項至第14項中任一項所述之醫藥組成物，其中，前述溶劑為水。
如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中，該醫藥組成物為含有2.5至500mg/mL或10至100mg/mL濃度之反義寡聚物、8至10mg/mL濃度之氯化鈉且pH為7.2至7.4之水溶液。
如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中，藉由前述治療產生由以下(1)至(6)構成之群組選擇之至少一種效果：

(1)患者骨骼肌中肌營養不良蛋白質表現量之平均值，與基準線比較，於投予24週後增加9倍以上；

(2)從起立時間(TTSTAND)獲得之速度變化，與基準線比較，投予24週後於25週時為-0.055次/秒以上；

(3)從10公尺跑步/步行時間(TTRW)獲得之速度變化，與基準線比較，投予24週後於25週時為-0.025公尺/秒以上；

(4)從爬4階梯之時間(TTCLIMB)獲得之速度變化，與基準線比較，投予24週後於25週時為-0.060次/秒以上；

(5)北極星步行能力評估(NSAA)得分之變化，與基準線比較，投予24週後於25週時為-2.2分以上；及

(6)6分鐘步行試驗(6MWT)之變化，與基準線比較，投予24週後於25週時為-7.5公尺以上。
如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中，在7至9歲裘馨氏肌肉萎縮症之人類患者中進行前述治療84週時產生由以下(1)至(6)構成之群組選擇之至少一種效果：

(1)從治療開始至第85週，喪失起立能力之患者未達20%；

(2)從治療開始至第85週，不能爬4階梯之患者未達10%；

(3)從治療開始至第85週，喪失自立步行能力之患者未達10%；

(4)從治療開始至第85週，未觀察到10公尺跑步/步行之速度因年齡增加而減少；

(5)從治療開始至第85週，未觀察到爬4階梯之速度因年齡增加而減少；及

(6)從治療開始至第85週，未觀察到起立的速度因年齡增加而減少。
如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中，在10至12歲裘馨氏肌肉萎縮症之人類患者中進行前述治療84週時產生由以下(1)至(6)構成之群組選擇之至少一種效果：

(1)從治療開始至第85週，喪失起立能力之患者未達60%；

(2)從治療開始至第85週，不能爬4階梯之患者未達50%；

(3)從治療開始至第85週，喪失自立步行能力之患者未達50%；

(4)從治療開始至第85週，未觀察到10公尺跑步/步行之速度因年齡增加而減少；

(5)從治療開始至第85週，觀察到爬4階梯之速度增加之時期；及

(6)從治療開始至第85週，觀察到起立的速度增加之時期。
一種裘馨氏肌肉萎縮症之治療方法，包含將含有與由人類肌營養不良蛋白基因之第53號外顯子之5’末端至第36至56號核苷酸構成之序列為互補的鹼基序列所構成之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物之醫藥組成物以下列方式進行投與，

將前述反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物對人類患者以40mg/kg至80mg/kg之量每週1次進行靜脈內投予。
一種反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物，為於治療人類患者裘馨氏肌肉萎縮症之方法中使用之與由人類肌營養不良蛋白基因之第53號外顯子之5’末端至第36至56號核苷酸構成之序列為互補的鹼基序列所構成者，

將前述反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物對前述人類患者以40mg/kg至80mg/kg之量每週1次進行靜脈內投予。
一種反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物之用途，係用於製造用以治療人類患者裘馨氏肌肉萎縮症之醫藥組成物，該反義寡聚物為與由人類肌營養不良蛋白基因之第53號外顯子之5’末端至第36至56號核苷酸構成之序列為互補的鹼基序列所構成者，

將前述反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或其水合物對前述人類患者以40mg/kg至80mg/kg之量每週1次進行靜脈內投予。