TW201919655A

TW201919655A - 治療肌肉萎縮症的方法

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Publication number: TW201919655A
Application number: TW107130738A
Authority: TW
Inventors: 愛德華Ｍ凱
Original assignee: 美商薩羅塔治療公司
Priority date: 2017-08-31
Filing date: 2018-08-31
Publication date: 2019-06-01
Also published as: JP2023138867A; IL272791A; WO2019046755A1; AU2018326780A1; KR20200046069A; MA50062A; SG11202001074RA; EP3675836A4; MX2020002038A; JP2020532504A; AR112538A1; US20230038956A1; EP3675836A1; CN111417388A; CO2020004034A2; CA3073736A1

Abstract

本發明尤其提供用於治療肌肉萎縮症之改良組合物及方法。舉例而言，本發明提供藉由投與有效量之格羅狄森治療具有適合於外顯子53跳躍之DMD基因突變之杜興氏肌肉萎縮症患者的方法。

Description

治療肌肉萎縮症的方法

本發明係關於治療患者之肌肉萎縮症的改良方法。其亦提供適用於促進人類肌縮蛋白基因中外顯子53跳躍之組合物。

在多種遺傳疾病中，突變對基因最終表現之效應可經由在剪接過程中靶向外顯子跳躍的過程來調節。在正常功能蛋白由於其中的突變而過早終止的情況下，經由反義技術恢復一些功能蛋白產生的方式已證明可經由在剪接過程中進行干預，且若與致病突變相關之外顯子可自一些基因特異性缺失，則有時可產生縮短的蛋白質產物，其具有與天然蛋白質相似的生物特性或具有足夠的生物活性以改善由與外顯子相關之突變引起的疾病(參見例如Sierakowska, Sambade等人1996；Wilton, Lloyd等人1999；van Deutekom, Bremmer-Bout等人2001；Lu, Mann等人2003；Aartsma-Rus, Janson等人2004)。

杜興氏肌肉萎縮症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)係由蛋白質肌縮蛋白之表現缺陷引起。肌縮蛋白為一種桿狀細胞質蛋白，且為經由細胞膜將肌纖維之細胞骨架與周圍細胞外基質連接起來的蛋白質複合物之重要部分。肌縮蛋白在肌纖維中起重要的結構作用，連接細胞外基質及細胞骨架。N端區結合肌動蛋白，而C端末端為肌縮蛋白糖蛋白複合物(DGC)之一部分，其跨越肌纖維膜。已表明，mdx小鼠之肌縮蛋白缺陷的肌纖維表現出對收縮誘導之肌纖維膜破裂的易感性增加(參見Petrof等人1993；Cirak等人2012)。

編碼該蛋白質的基因含有79個外顯子，其分佈在超過2百萬個核苷酸的DNA上。改變外顯子閱讀框架，或引入終止密碼子，或特徵在於移除整個框架外之外顯子或一或多個外顯子重複的任何外顯子突變有可能破壞功能性肌縮蛋白的產生，從而導致DMD。

疾病發作可在出生時記錄，肌酸激酶水準升高，且在出生後的第一年可能存在顯著的運動缺陷。到七八歲時，大多數患有DMD之患者步態愈來愈緩慢，且正在喪失自地面站起身及爬樓梯的能力；到10至14歲時，大多數均依賴輪椅。DMD為致命的；患病個體通常在十幾歲或二十出頭時死於呼吸及/或心臟衰竭。DMD之持續進展允許在疾病的所有階段進行治療性干預；然而，治療目前僅限於糖皮質激素，其與許多副作用相關，包括體重增加、行為改變、青春期變化、骨質疏鬆症、庫與氏症面容(Cushingoid facies)、生長抑制及白內障。因此，開發更好的療法來治療此疾病之根本原因勢在必行。

已發現一種不太嚴重的肌肉萎縮症形式，貝克爾肌肉萎縮症(Becker muscular dystrophy，BMD)，其中突變(通常為一或多個外顯子的缺失)沿著整個肌縮蛋白轉錄物產生正確的閱讀框架，使得mRNA轉譯成蛋白質不會過早終止。若在突變的肌縮蛋白前mRNA的加工中上游及下游外顯子的連接保持基因的正確閱讀框架，則結果為mRNA編碼具有短內部缺失的蛋白質，其保留一些活性，從而導致貝克爾表型。

多年來，已知不改變肌縮蛋白之閱讀框架的外顯子的缺失將產生BMD表型，而引起框移之外顯子缺失將導致DMD (Monaco, Bertelson等人1988)。一般而言，改變閱讀框架且因此中斷正確的蛋白質轉譯的肌縮蛋白突變(包括點突變及外顯子缺失)導致DMD。亦應注意，一些BMD及DMD患者具有覆蓋多個外顯子的外顯子缺失。

最新測試剪接轉換寡核苷酸(SSO)用於治療DMD之安全性及功效的臨床試驗係基於SSO技術藉由剪接體之空間阻斷誘導前mRNA的替代性剪接(Cirak等人, 2011；Goemans等人, 2011；Kinali等人, 2009；van Deutekom等人, 2007)。然而，儘管此等試驗成功，但可用於治療DMD之藥理學選項仍為有限的。

因此，仍需要用於產生肌縮蛋白及治療患者之肌肉萎縮症(諸如DMD及BMD)之改良的組合物及方法。

本發明至少部分基於顯示用外顯子53跳躍反義寡核苷酸格羅狄森(golodirsen)治療使患者之肌縮蛋白顯著增加超過基線的臨床跡象。此外，觀察到外顯子跳躍與重生肌縮蛋白之間的正相關。

因此，在一些態樣中，本發明提供用於治療有需要之患者之杜興氏肌肉萎縮症(DMD)的方法，該患者具有適合於外顯子53跳躍之DMD基因突變，該方法包含向該患者投與一定劑量的格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽。

在一些態樣中，本發明提供用於恢復mRNA閱讀框架以在患有杜興氏肌肉萎縮症(DMD)之有需要之患者中誘導外顯子跳躍的方法，該患者具有適合於外顯子53跳躍之DMD基因突變，該方法包含向該患者投與一定劑量的格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽。

在一些態樣中，本發明提供用於增加患有杜興氏肌肉萎縮症(DMD)之有需要之患者的肌縮蛋白產生的方法，該患者具有適合於外顯子53跳躍之DMD基因突變，該方法包含向該患者投與一定劑量的格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽。

在一些態樣中，劑量以4 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg或50 mg/kg患者體重之劑量投與。

在一些態樣中，劑量以單劑量投與。在一些態樣中，劑量每週投與一次。在一些態樣中，劑量為靜脈內投與的。在一些態樣中，劑量為藉由輸注靜脈內投與的。在一些態樣中，劑量為藉由輸注經35-60分鐘之時段靜脈內投與的。在一些態樣中，劑量為藉由皮下注射靜脈內投與的。

在一些態樣中，患者至多40歲、至多30歲或至多21歲。在一些態樣中，患者為1至21歲。在一些態樣中，患者為5至21歲。在一些態樣中，患者為6至15歲。

在一些態樣中，本發明提供根據前述或相關態樣中之任一者之方法，其中該患者具有選自包括以下之群之DMD基因的突變：外顯子3至52、4至52、5至52、6至52、9至52、10至52、11至52、13至52、14至52、15至52、16至52、17至52、19至52、21至52、23至52、24至52、25至52、26至52、27至52、28至52、29至52、30至52、31至52、32至52、33至52、34至52、35至52、36至52、37至52、38至52、39至52、40至52、41至52、43至52、42至52、45至52、47至52、48至52、49至52、50至52、54至58、54至61、54至63、54至64、54至66、54至76、54至77及外顯子52。

在一些態樣中，本發明提供根據前述或相關態樣中之任一者之方法，其中該患者係長期投與格羅狄森。在一些態樣中，患者係投與格羅狄森至少48週。在一些態樣中，患者係投與格羅狄森超過一年、超過兩年、超過三年、超過四年、超過五年、超過十年、超過二十年或超過三十年。

在一些態樣中，本發明提供根據前述或相關態樣中之任一者之方法，其中該患者在投與格羅狄森之前服用穩定劑量之皮質類固醇至少6個月。在一些態樣中，患者在投與格羅狄森之前服用穩定劑量之皮質類固醇至少6個月且在投與格羅狄森期間保持服用皮質類固醇。

在一些態樣中，本發明提供根據前述或相關態樣中之任一者之方法，其中格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽調配為醫藥組合物。在一些態樣中，格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽調配為具有50 mg/mL濃度之醫藥組合物。在一些態樣中，格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽調配為具有50 mg/mL濃度且以100 mg/2 mL之劑型存在的醫藥組合物。在一些態樣中，格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽調配為具有50 mg/mL濃度且以500 mg/2 mL之劑型存在的醫藥組合物。在一些態樣中，劑型包含在單次用小瓶中。

在一些態樣中，格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽調配為包含格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。在一些態樣中，醫藥學上可接受之載劑為磷酸鹽緩衝溶液。

在一些態樣中，本發明提供根據前述或相關態樣中之任一者之方法，其中外顯子跳躍係藉由反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)來量測。

在一些態樣中，本發明提供根據前述或相關態樣中之任一者之方法，其中該方法增加患者之肌縮蛋白產生。在一些態樣中，肌縮蛋白產生係藉由西方墨點分析來量測。在一些態樣中，肌縮蛋白產生係藉由免疫組織化學(IHC)來量測。

在一些態樣中，本發明提供根據前述或相關態樣中之任一者之方法，其進一步包含在投與格羅狄森之前，確認患者具有適合於外顯子53跳躍之DMD基因突變。

在一些態樣中，本發明提供格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療有需要之患者之杜興氏肌肉萎縮症(DMD)，該患者具有適合於外顯子53跳躍之DMD基因突變，其中治療包含每週一次向該患者投與30 mg/kg伊特普森(eteplirsen)之單次靜脈內劑量。

在一些態樣中，本發明提供格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽，其用於恢復mRNA閱讀框架以在患有杜興氏肌肉萎縮症(DMD)之有需要之患者中誘導外顯子跳躍，該患者具有適合於外顯子53跳躍之DMD基因突變，其中治療包含每週一次向該患者投與30 mg/kg伊特普森之單次靜脈內劑量。

在一些態樣中，本發明提供格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽，其用於增加患有杜興氏肌肉萎縮症(DMD)之有需要之患者的肌縮蛋白產生，該患者具有適合於外顯子53跳躍之DMD基因突變，其中治療包含每週一次向該患者投與30 mg/kg伊特普森之單次靜脈內劑量。

本發明之實施例係關於用於治療肌肉萎縮症(諸如DMD)之方法，其係藉由投與經特定設計以誘導人類肌縮蛋白基因之外顯子53跳躍的反義寡核苷酸格羅狄森。肌縮蛋白在肌肉功能中起重要作用，且各種肌肉相關疾病之特徵在於此基因之突變形式。因此，在某些實施例中，本文所述之方法可用於誘導人類肌縮蛋白基因之突變形式(諸如DMD中發現之突變的肌縮蛋白基因)的外顯子53跳躍。

因此，本發明係關於藉由誘導患者之外顯子53跳躍來治療肌肉萎縮症(諸如DMD)的方法。此外，本發明係關於用於恢復mRNA閱讀框架以誘導患有DMD之患者之外顯子跳躍的方法。本發明亦關於用於增加患有DMD之患者之肌縮蛋白產生的方法。

除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解相同的含義。雖然與本文所述之彼等方法及材料類似或等效的任何方法及材料可用於本發明之實踐或測試，但所述方法及材料較佳。出於本發明之目的，以下術語定義如下。 I. 定義

「約」意謂相對於參考數量、水準、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度，數量、水準、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度變化至多30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。

如本文關於個體或患者所用之「適合於外顯子53跳躍」意欲包括具有肌縮蛋白基因之一或多個突變的個體及患者，其中不存在肌縮蛋白基因之外顯子53跳躍，導致閱讀框架在框架外，從而破壞前mRNA轉譯，導致個體或患者不能產生肌縮蛋白。肌縮蛋白基因之以下外顯子突變的非限制性實例適合於外顯子53跳躍，包括例如缺失：外顯子3至52、4至52、5至52、6至52、9至52、10至52、11至52、13至52、14至52、15至52、16至52、17至52、19至52、21至52、23至52、24至52、25至52、26至52、27至52、28至52、29至52、30至52、31至52、32至52、33至52、34至52、35至52、36至52、37至52、38至52、39至52、40至52、41至52、43至52、42至52、45至52、47至52、48至52、49至52、50至52、54至58、54至61、54至63、54至64、54至66、54至76、54至77或外顯子52。確定患者是否具有適合於外顯子跳躍之肌縮蛋白基因突變完全在熟習此項技術者之能力範圍內(參見例如Aartsma-Rus等人(2009) Hum Mutat. 30:293-299，Gurvich等人, Hum Mutat. 2009; 30(4) 633-640及Fletcher等人(2010) Molecular Therapy 18(6) 1218-1223.)。

術語「反義寡聚物」及「反義化合物」及「反義寡核苷酸」及「寡聚物」及「寡核苷酸」在本發明中可互換使用，且係指藉由次單元間鍵聯而連接之環狀次單元序列，其中各環狀次單元由以下組成：(i)核糖或其衍生物；及(ii)與其結合之鹼基配對部分，使得鹼基配對部分之順序形成藉由沃森-克里克鹼基配對(Watson-Crick base pairing)與核酸(通常RNA)中之靶序列互補的鹼基序列，從而在靶序列內形成核酸:寡聚物異雙螺旋。在某些實施例中，寡聚物為PMO。在其他實施例中，反義寡核苷酸為2'-O-甲基硫代磷酸。在其他實施例中，本發明之反義寡核苷酸為肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)或橋連核酸(BNA)，諸如2'-O,4'-C-乙烯橋連核酸(ENA)。

術語「互補」及「互補性」係指兩個或更多個寡聚物(亦即各自包含核鹼基序列)藉由沃森-克里克鹼基配對規則彼此相關。舉例而言，核鹼基序列「T-G-A (5'→3')」與核鹼基序列「A-C-T (3'→5')」互補。互補性可為「部分的」，其中給定核鹼基序列之少於全部核鹼基根據鹼基配對規則與另一核鹼基序列匹配。舉例而言，在一些實施例中，給定核鹼基序列與另一核鹼基序列之間的互補性可為約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。或者，給定核鹼基序列與另一核鹼基序列之間可能存在「完全」或「完美」(100%)互補性以繼續該實例。核鹼基序列之間的互補程度對序列之間的雜交效率及強度具有顯著影響。

「肌縮蛋白」為一種桿狀細胞質蛋白，且為經由細胞膜將肌纖維之細胞骨架與周圍細胞外基質連接起來的蛋白質複合物之重要部分。肌縮蛋白含有多個功能結構域。舉例而言，肌縮蛋白含有在約胺基酸14-240處之肌動蛋白結合結構域及在約胺基酸253-3040處之中心桿結構域。此大的中心結構域係由約109個胺基酸之24個血影蛋白樣三螺旋元件形成，其與α-輔肌動蛋白及血影蛋白具有同源性。重複序列通常間雜有四個富含脯胺酸之非重複序列區段，亦稱為鉸鏈區。重複序列15及16由18個胺基酸之鏈段分隔開，其似乎為肌縮蛋白之蛋白水解裂解提供主要位點。大部分重複序列之間的序列一致性範圍介於10-25%。一個重複序列含有三個α-螺旋：1、2及3。α-螺旋1及3各自由7個螺旋轉角形成，可能經由疏水介面作為捲曲螺旋相互作用。α-螺旋2具有更複雜的結構且由甘胺酸或脯胺酸殘基分隔開的四個及三個螺旋轉角之區段形成。各重複序列由兩個外顯子編碼，通常在α-螺旋2之第一部分中在胺基酸47與48之間間雜有內含子。另一內含子在重複序列中之不同位置處發現，通常分散在螺旋-3上。肌縮蛋白亦在約胺基酸3080-3360處含有富含半胱胺酸之結構域)，包括富含半胱胺酸之鏈段(亦即280個胺基酸中之15個半胱胺酸)，其顯示與黏菌(盤基網柄菌(Dictyostelium discoideum)) α-輔肌動蛋白之C端結構域同源。羧基端結構域在約胺基酸3361-3685處。

肌縮蛋白之胺基端結合於F-肌動蛋白，且羧基端結合於肌纖維膜處之肌縮蛋白相關蛋白複合物(DAPC)。DAPC包括肌縮蛋白聚糖、肌聚糖、整合素及小窩蛋白，且此等組分中之任一者的突變引起常染色體遺傳性肌肉萎縮症。當肌縮蛋白不存在時，DAPC不穩定，其導致成員蛋白水準降低，且繼而導致進行性纖維損傷及膜滲漏。在各種形式的肌肉萎縮症中，諸如杜興氏肌肉萎縮症(DMD)及貝克爾肌肉萎縮症(BMD)，肌肉細胞產生改變且功能缺陷形式的肌縮蛋白，或根本不產生肌縮蛋白，其主要歸因於基因序列之突變導致錯誤的剪接。如上所述，主要表現缺陷型肌縮蛋白或完全缺乏肌縮蛋白或肌縮蛋白樣蛋白質導致肌肉退化的快速進展。在此方面，「缺陷型」肌縮蛋白之特徵可為在某些患有DMD或BMD之個體中產生的肌縮蛋白形式，如此項技術中已知，或不存在可偵測的肌縮蛋白。

「外顯子」係指核酸編碼蛋白質之限度部分，或在加工前(或前體) RNA之任一部分已藉由剪接移除後以RNA分子之成熟形式呈現的核酸序列。成熟RNA分子可為信使RNA (mRNA)或非編碼RNA之功能形式，諸如rRNA或tRNA。人類肌縮蛋白基因具有約79個外顯子。

「內含子」係指未轉譯成蛋白質之核酸區域(在基因內)。內含子為非編碼部分，其轉錄成前體mRNA (前mRNA)，且隨後在成熟RNA形成期間藉由剪接移除。

「有效量」或「治療有效量」係指作為單劑量或作為一系列劑量之一部分投與哺乳動物個體以有效產生所需治療效果之治療性化合物(諸如反義寡聚物，包括例如格羅狄森)的量。對於反義寡聚物，此效果可藉由抑制所選靶序列之轉譯或天然剪接加工或外顯子跳躍增加肌縮蛋白產生來實現。

在一些實施例中，有效量為至少約4 mg/kg、至少10 mg/kg或至少20 mg/kg反義寡聚物或包括反義寡聚物之組合物，持續一段時間以治療個體。在一些實施例中，有效量為至少約4 mg/kg、至少10 mg/kg或至少20 mg/kg反義寡聚物或包括反義寡聚物之組合物，以增加個體之肌縮蛋白陽性纖維的數量。在各種實施例中，有效量為至少約4 mg/kg、至少10 mg/kg至約20 mg/kg、20 mg/kg至約30 mg/kg、約25 mg/kg至約30 mg/kg或約30 mg/kg至約50 mg/kg。在一些實施例中，有效量為約30 mg/kg或約50 mg/kg。

在各種實施例中，有效量為至少約4 mg/kg、至少10 mg/kg或至少20 mg/kg反義寡聚物或包括反義寡聚物之組合物，以增加個體之肌縮蛋白產生。在各種實施例中，有效量為至少約4 mg/kg、至少10 mg/kg至約20 mg/kg、20 mg/kg至約30 mg/kg、約25 mg/kg至約30 mg/kg或約30 mg/kg至約50 mg/kg。在一些實施例中，有效量為約30 mg/kg或約50 mg/kg。

在某些實施例中，有效量為至少約4 mg/kg、至少10 mg/kg或至少20 mg/kg反義寡聚物或包括反義寡聚物之組合物，以例如在6 MWT中穩定、維持或提高患者之行走距離相對於健康同級不足20%。在各種實施例中，有效量為至少約4 mg/kg、至少10 mg/kg至約20 mg/kg、20 mg/kg至約30 mg/kg、約25 mg/kg至約30 mg/kg或約30 mg/kg至約50 mg/kg。在一些實施例中，有效量為約30 mg/kg或約50 mg/kg。

在某些實施例中，有效量為至少約4 mg/kg、10 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg或約30 mg/kg至約50 mg/kg，持續至少24週、至少36週或至少48週，從而增加個體之肌縮蛋白陽性纖維的數量。在某些實施例中，個體之肌縮蛋白陽性纖維的增加為正常的至少20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%。在一些實施例中，治療使患者之肌縮蛋白陽性纖維的數量增加至正常的20-60%或30-50%。

在某些實施例中，有效量為至少約4 mg/kg、至少約10 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg或約30 mg/kg至約50 mg/kg，持續至少24週、至少36週或至少48週，以例如在6 MWT中穩定或提高患者之行走距離相對於健康同級不足20%。

在各種實施例中，有效量為至少約4 mg/kg、至少約10 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg或約30 mg/kg至約50 mg/kg，持續至少24週、至少36週或至少48週，從而增加患者之肌縮蛋白產生。在一些實施例中，相對於健康同級，增加的肌縮蛋白產生為約0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1%、1.01%、1.5%、2%、2.01%、2.5%、3%、3.01%、3.5%、4%、4.01%、4.5%、5%、5.01%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、10%、10.5%、11%、11.5%、12%、12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%、15%、15.5%、16%、16.5%、17%、17.5%、18%、18.5%、19%、19.5%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、40%、45%、50%、55%或60%。在某些實施例中，相對於健康同級，肌縮蛋白產生可增加約0.1%至0.5%、0.5%至0.9%、0.8%至1%、0.9%至1.2%、0.9%至1.0%、0.9%至1.01%、1%至1.01%、1%至1.5%、1.5%至2%、1.9%至2.0%、1.9%至2.01%、2%至2.01%、2%至2.5%、2.5%至3%、2.9%至3.0%、2.9%至3.01%、2%至3.01%、3%至3.5%、3.5%至4%、4%至4.5%、4.5%至5%、5%至6%、6%至7%、7%至8%、8%至9%、9%至10%、1%至2%、1%至3%、1%至5%、2%至4%、2%至5%、4%至6%、5%至8%、8%至10%、1%至5%、2%至6%、3%至7%、4%至8%、5%至10%、10%至12%、12%至15%、15%至20%、17%至20%、20%至22%、20%至25%、25%至30%或30%至35%。

「增強(enhance/enhancing)」或「增加(increase/increasing)」或「刺激(stimulate/stimulating)」一般係指與由無反義寡核苷酸或對照化合物引起之反應相比，一或多種反義寡核苷酸(包括例如格羅狄森)或其醫藥組合物在細胞或個體中產生或引起更大生理反應(亦即下游效應)的能力。可量測之生理反應可包括肌縮蛋白之功能形式的表現(或產生)增加，或肌肉組織中之肌縮蛋白相關生物活性增加，以及自此項技術之理解及本文描述顯而易見的其他反應。亦可量測增加之肌肉功能，包括肌肉功能增加或改良約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。亦可量測表現功能性肌縮蛋白之肌肉纖維的百分比，包括約1%、2%、5%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之肌肉纖維中的肌縮蛋白表現增加。舉例而言，已顯示，若25-30%之纖維表現肌縮蛋白，則可發生約40%之肌肉功能改良(參見例如DelloRusso等人, Proc Natl Acad Sci USA 99: 12979-12984, 2002)。在一些實施例中，相對於健康同級，增加的肌縮蛋白產生為約0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1%、1.01%、1.5%、2%、2.01%、2.5%、3%、3.01%、3.5%、4%、4.01%、4.5%、5%、5.01%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、10%、10.5%、11%、11.5%、12%、12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%、15%、15.5%、16%、16.5%、17%、17.5%、18%、18.5%、19%、19.5%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、40%、45%、50%、55%或60%。在某些實施例中，相對於健康同級，肌縮蛋白產生可增加約0.1%至0.5%、0.5%至0.9%、0.8%至1%、0.9%至1.2%、0.9%至1.0%、0.9%至1.01%、1%至1.01%、1%至1.5%、1.5%至2%、1.9%至2.0%、1.9%至2.01%、2%至2.01%、2%至2.5%、2.5%至3%、2.9%至3.0%、2.9%至3.01%、2%至3.01%、3%至3.5%、3.5%至4%、4%至4.5%、4.5%至5%、5%至6%、6%至7%、7%至8%、8%至9%、9%至10%、1%至2%、1%至3%、1%至5%、2%至4%、2%至5%、4%至6%、5%至8%、8%至10%、1%至5%、2%至6%、3%至7%、4%至8%、5%至10%、10%至12%、12%至15%、15%至20%、17%至20%、20%至22%、20%至25%、25%至30%或30%至35%。如本文所用，「增加的肌縮蛋白產生」、「肌縮蛋白產生增加」或其類似者係指個體之肌縮蛋白、肌縮蛋白樣蛋白質或功能性肌縮蛋白中之至少一者的產生增加。

「增加的」或「增強的」量通常為「統計學上顯著之」量，且可包括由無反義寡核苷酸(不存在藥劑)或對照化合物產生之量的1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50倍或更多倍(例如500、1000倍)(包括其間且大於1的所有整數及小數點)，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加。

術語「減少」或「抑制」可大體上關於本發明之一或多種反義化合物「降低」相關生理或細胞反應，諸如本文所述之疾病或病況的症狀的能力，如根據診斷技術之常規技術所量測。相關生理或細胞反應(活體內或活體外)對於熟習此項技術者將為顯而易見的，且可包括肌肉萎縮症之症狀或病理的減少，或肌縮蛋白缺陷形式(諸如在患有DMD或BMD之個體中表現之肌縮蛋白改變形式)之表現減少。與由無反義化合物或對照組合物產生之反應相比，反應之「減少」可為統計學上顯著的，且可包括1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%減少，包括其間的所有整數。

如本文所用，術語「功能」及「功能性」及其類似術語係指生物功能、酶功能或治療功能。

「功能性」肌縮蛋白一般係指通常與某些患有DMD或BMD之個體體內存在的改變或「缺陷」形式之肌縮蛋白相比，具有足夠生物活性以減少肌肉組織之進行性降解(否則為肌肉萎縮症之特徵)的肌縮蛋白。在某些實施例中，功能性肌縮蛋白可具有野生型肌縮蛋白之活體外或活體內生物活性之約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100% (包括其間所有整數)，如根據此項技術中之常規技術所量測。作為一個實例，活體外肌肉培養物之肌縮蛋白相關活性可根據肌管大小、肌原纖維組織(或解組)、收縮活性及乙醯膽鹼受體之自發性聚集來量測(參見例如Brown等人, Journal of Cell Science. 112:209-216, 1999)。動物模型亦為用於研究疾病發病機制之寶貴資源，且提供測試肌縮蛋白相關活性之方式。兩種使用最廣泛的DMD研究動物模型為mdx小鼠及金毛獵犬肌肉萎縮症(GRMD)狗，其均為肌縮蛋白陰性(參見例如Collins及Morgan, Int J Exp Pathol 84: 165-172, 2003)。此等及其他動物模型可用於量測各種肌縮蛋白之功能活性。包括截短形式之肌縮蛋白，諸如由本發明之某些外顯子跳躍反義寡核苷酸產生之彼等形式。

術語「嗎啉基」、「嗎啉基寡聚物」或「PMO」係指具有以下通用結構之磷醯二胺嗎啉基寡聚物：B = 核鹼基如Summerton, J.等人,Antisense & Nucleic Acid Drug Development , 7: 187-195 (1997)之圖2中所述。如本文所述之嗎啉基意欲涵蓋前述通用結構之所有立體異構體(及其混合物)及組態。嗎啉基寡聚物之合成、結構及結合特徵詳述於美國專利第5,698,685號、第5,217,866號、第5,142,047號、第5,034,506號、第5,166,315號、第5,521,063號、第5,506,337號、第8,076,476號及第8,299,206號中，其均以引用的方式併入本文中。在某些實施例中，嗎啉基在寡聚物之5'或3'端與「尾部」部分結合以增加其穩定性及/或溶解度。例示性尾部包括：

「格羅狄森」，亦憑藉其代號「SRP-4053」而為人所知，為具有鹼基序列5'- GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3' (SEQ ID NO:1)之PMO。格羅狄森係以CAS登記號1422959-91-8登記。化學名稱包括：all - P - ambo -[P ,2',3'-三去氧-P -(二甲基胺基)-2',3'-亞胺基-2',3'-斷](2'a®5')(G-T-T-G-C-C-T-C-C-G-G-T-T-C-T-G-A-A-G-G-T-G-T-T-C) 5'-[4-({2-[2-(2-羥基乙氧基)乙氧基]乙氧基}羰基)-N ,N -二甲基哌嗪-1-磷醯胺酸] 格羅狄森具有以下結構：且亦由以下化學結構表示：

為了清楚起見，本發明之結構(包括例如上方格羅狄森之結構)自5'至3'為連續的，且為了便於以緊湊的形式描繪整個結構，已包括標記為「斷點A」及「斷點B」之各種圖解斷點。如熟習此項技術者應理解，例如「斷點A」之各指示展示在此等點處之結構的圖解接續。熟習此項技術者理解，對於上述結構中之「斷點B」的情況亦如此。然而，圖解斷點中無一者意欲表明，熟習此項技術者亦不將其理解成意味著上述結構的實際中斷。

如本文所用，結構式內使用的一組括號表示括號之間的結構特徵為重複的。在一些實施例中，所用括號可為「[」及「]」，且在某些實施例中，用於表示重複結構特徵的括號可為「(」及「)」。在一些實施例中，括號之間結構特徵的重複迭代次數為括號外指示的數字，諸如2、3、4、5、6、7等。在各種實施例中，括號之間結構特徵的重複迭代次數由括號外指示的變數諸如「Z」表示。

如本文所用，在直鍵或波浪鍵結構式內相對於對掌性碳或磷原子繪製的鍵表明該對掌性碳或磷之立體化學為不確定的且意欲包括所有形式的對掌性中心。此類圖解之實例描繪如下：。

如本文所用，片語「非經腸投藥」及「非經腸投與」意謂除經腸及局部投藥以外的投藥模式，通常藉由注射，且包括但不限於靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛膜下、脊柱內及胸骨內注射及輸注。

片語「醫藥學上可接受」意謂物質或組合物必須在化學上及/或毒理學上與構成調配物之其他成分及/或正用其治療的個體相容。

如本文所用，片語「醫藥學上可接受之載劑」意謂任何類型的無毒、惰性的固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、囊封材料或調配助劑。可充當醫藥學上可接受之載劑之材料的一些實例為糖，諸如乳糖、葡萄糖及蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及乙酸纖維素；粉末狀黃蓍；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，諸如可可脂及栓劑蠟；油，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油；二醇，諸如丙二醇；酯，諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；瓊脂；緩衝劑，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；褐藻酸；無熱原質水；等張鹽水；林格氏溶液(Ringer's solution)；乙醇及磷酸鹽緩衝溶液，以及其他無毒相容性潤滑劑，諸如月桂基硫酸鈉及硬脂酸鎂，以及著色劑、脫模劑、包衣劑、甜味劑、調味劑及芳香劑、防腐劑及抗氧化劑亦可根據配製者之判斷存在於組合物中。

肌縮蛋白合成或產生之術語「恢復」一般係指在用如本文所述之反義寡聚物治療後，患有肌肉萎縮症之患者產生肌縮蛋白，包括截短形式之肌縮蛋白。在一些實施例中，治療使得患者之肌縮蛋白產生增加1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100% (包括其間的所有整數)。在一些實施例中，治療使個體之肌縮蛋白陽性纖維的數量增加至正常的至少20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約95%至100%。在其他實施例中，治療使個體之肌縮蛋白陽性纖維的數量增加至正常的約20%至約60%、或約30%至約50%。治療後患者之肌縮蛋白陽性纖維的百分比可藉由使用已知技術之肌肉活組織檢查來測定。舉例而言，肌肉活組織檢查可取自於適合之肌肉，諸如患者之肱二頭肌。

對陽性肌縮蛋白纖維百分比之分析可在治療前及/或治療後或在整個治療過程中的時間點進行。在一些實施例中，治療後活組織檢查取自於治療前活組織檢查之對側肌肉。可使用任何適合之肌縮蛋白分析進行治療前及治療後肌縮蛋白表現研究。在一些實施例中，使用作為肌縮蛋白標記物之抗體，諸如單株或多株抗體，對來自肌肉活組織檢查之組織切片進行免疫組織化學偵測。舉例而言，可使用MANDYS106抗體，其為肌縮蛋白之高度靈敏標記物。可使用任何適合之二級抗體。

在一些實施例中，肌縮蛋白陽性纖維之百分比係藉由將陽性纖維的數量除以計數的總纖維來計算。正常肌肉樣品具有100%肌縮蛋白陽性纖維。因此，肌縮蛋白陽性纖維之百分比可表示為正常的百分比。當計數治療後肌肉之肌縮蛋白陽性纖維時，為了控制治療前肌肉以及回復纖維中痕量級肌縮蛋白的存在，可使用各患者之治療前肌肉切片設定基線。此可用作在該患者之治療後肌肉切片中計數肌縮蛋白陽性纖維的臨限值。在其他實施例中，抗體染色之組織切片亦可用於使用Bioquant影像分析軟體(Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, TN)之肌縮蛋白定量。總肌縮蛋白螢光信號強度可報導為正常的百分比。另外，使用單株或多株抗肌縮蛋白抗體之西方墨點分析可用於測定肌縮蛋白陽性纖維之百分比。舉例而言，可使用來自Novacastra之抗肌縮蛋白抗體NCL-Dys1。肌縮蛋白陽性纖維之百分比亦可藉由測定肌聚糖複合物(β,γ)及/或神經元NOS之組分的表現來分析。

在一些實施例中，用本發明之反義寡聚物(諸如格羅狄森)治療減緩或減少在無治療之情況下將預期患有DMD之患者的進行性呼吸肌功能障礙及/或衰竭。在一些實施例中，用本發明之反義寡聚物治療可減少或消除在無治療之情況下所預期之對通氣輔助的需要。在一些實施例中，用於追蹤疾病病程以及評估潛在治療干預之呼吸功能的量測包括最大吸氣壓力(MIP)、最大呼氣壓力(MEP)及用力肺活量(FVC)。MIP及MEP分別量測個人在吸氣及呼氣期間可產生的壓力水準，且為呼吸肌力量的靈敏量測。MIP為隔肌無力之量度。

在一些實施例中，MEP可在其他肺功能測試(包括MIP及FVC)變化之前下降。在某些實施例中，MEP可為呼吸功能障礙之早期指標。在某些實施例中，FVC可用於量測在最大吸氣後強制呼氣期間排出之空氣的總體積。在患有DMD之患者中，FVC隨著身體生長而增加，直至青少年時期。然而，隨著生長緩慢或因疾病進展而生長停滯，且肌無力進展，肺活量進入下降階段，且在10至12歲後以每年平均約8%至8.5%之速率下降。在某些實施例中，所預測之MIP百分比(針對體重調整之MIP)、所預測之MEP百分比(針對年齡調整之MEP)及所預測之FVC百分比(針對年齡及身高調整之FVC)為支持性分析。

如本文所用，「個體」或「患者」包括表現出症狀或處於表現症狀風險下之任何動物，其可用本發明之反義寡核苷酸治療，諸如患有DMD或BMD或處於罹患DMD或BMD風險下，或具有與此等病況相關之症狀中之任一者(例如肌纖維損失)或處於具有該等症狀中之任一者風險下的個體。適合之個體(患者)包括實驗室動物(諸如小鼠、大鼠、兔或天竺鼠)、農畜及家畜或寵物(諸如貓或狗)。包括非人類靈長類動物，較佳人類患者。亦包括在具有適合於外顯子53跳躍之肌縮蛋白基因突變之個體中產生肌縮蛋白的方法。

如本文所用，「兒科患者」為1至21歲(包括1歲及21歲)之患者。

如本文所用，片語「全身投藥」、「全身投與」、「外周投藥」及「外周投與」意謂化合物、藥物或其他材料除直接投與中樞神經系統以外的投藥，使其進入患者之系統且因此，進行代謝及其他類似過程，例如皮下投藥。

如本文所用，「長期投藥」係指連續、規則、長期的治療性投藥，亦即定期給藥而基本上沒有中斷。舉例而言，每日一次，持續至少數週或數月或數年的時間段，以用於治療患者之肌肉萎縮症的目的。舉例而言，每週一次，持續至少數月或數年的時間段，以用於治療患者之肌肉萎縮症的目的(例如每週一次，持續至少六週；每週一次，持續至少12週；每週一次，持續至少24週；每週一次，持續至少48週；每週一次，持續至少72週；每週一次，持續至少96週；每週一次，持續至少120週；每週一次，持續至少144週；每週一次，持續至少168週；每週一次，持續至少180週；每週一次，持續至少192週；每週一次，持續至少216週；或每週一次，持續至少240週)。

如本文所用，「定期投藥」係指在劑量間具有一定間隔的投藥。舉例而言，定期投藥包括可以固定間隔(例如每週、每月)重複進行的投藥。

如本文所用，「安慰劑」係指不具有治療效果且可用作對照的物質。

如本文所用，「安慰劑對照」係指接受安慰劑而非組合療法、反義寡核苷酸、非類固醇消炎化合物及/或另一種醫藥組合物的個體或患者。安慰劑對照可具有與個體或患者相同的突變狀態，具有相似的年齡、相似的行走能力及或接受相同的伴隨藥物治療(包括類固醇等)。

片語「靶向序列」、「鹼基序列」或「核鹼基序列」係指寡聚物之核鹼基序列，其與靶前mRNA之核苷酸序列互補。在本發明之一些實施例中，靶前mRNA中之核苷酸序列為命名為H53A(+36+60)之肌縮蛋白前mRNA中之外顯子53黏接位點。

個體(例如哺乳動物，諸如人類)或細胞之「治療」為用於試圖改變個體或細胞之自然進程之任何類型的干預。治療包括但不限於投與寡聚物或其醫藥組合物，且可預防性地或在病理事件開始或與病原體接觸後進行。治療包括對與肌縮蛋白相關之疾病或病況(如在某些形式之肌肉萎縮症中)之症狀或病理的任何期望的效應，且可包括例如所治療之疾病或病況之一或多種可量測標記物的最小變化或改良。亦包括「預防性」治療，其可用於降低所治療之疾病或病況的進展速率，延緩該疾病或病況之發作，或降低其發作之嚴重程度。「治療」或「預防」不一定表示完全根除、治癒或預防疾病或病況或其相關症狀。

在一些實施例中，用本發明之反義寡聚物治療增加肌縮蛋白產生，延緩疾病進展，減緩或減少步行喪失，減少肌肉炎症，減少肌肉損傷，改良肌肉功能，減少肺功能喪失及/或增強肌肉再生，其為在無治療之情況下所預期的或在無治療之情況下所預期的。在一些實施例中，治療維持、延緩或減緩疾病進展。在一些實施例中，治療維持步行或減少步行的喪失。在一些實施例中，治療維持肺功能或減少肺功能的喪失。在一些實施例中，治療維持或增加患者之穩定行走距離，如藉由例如6分鐘行走測試(6MWT)所量測。在一些實施例中，治療維持或減少行走/跑步10公尺的時間(亦即10公尺行走/跑步測試)。在一些實施例中，治療維持或減少自仰臥站立的時間(亦即站立時間測試)。在一些實施例中，治療維持或減少爬升四個標準樓梯的時間(亦即四階爬升測試)。在一些實施例中，治療維持或減少患者之肌肉炎症，如藉由例如MRI (例如腿部肌肉之MRI)所量測。在一些實施例中，MRI量測T2及/或脂肪分數以鑑定肌肉退化。MRI可鑑別由炎症、水腫、肌肉損傷及脂肪浸潤引起的肌肉結構及組成的變化。

在一些實施例中，用本發明之反義寡聚物治療增加肌縮蛋白產生。在一些實施例中，相對於健康同級，增加的肌縮蛋白產生為約0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1%、1.01%、1.5%、2%、2.01%、2.5%、3%、3.01%、3.5%、4%、4.01%、4.5%、5%、5.01%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、10%、10.5%、11%、11.5%、12%、12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%、15%、15.5%、16%、16.5%、17%、17.5%、18%、18.5%、19%、19.5%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、40%、45%、50%、55%或60%。在某些實施例中，相對於健康同級，肌縮蛋白產生可增加約0.1%至0.5%、0.5%至0.9%、0.8%至1%、0.9%至1.2%、0.9%至1.0%、0.9%至1.01%、1%至1.01%、1%至1.5%、1.5%至2%、1.9%至2.0%、1.9%至2.01%、2%至2.01%、2%至2.5%、2.5%至3%、2.9%至3.0%、2.9%至3.01%、2%至3.01%、3%至3.5%、3.5%至4%、4%至4.5%、4.5%至5%、5%至6%、6%至7%、7%至8%、8%至9%、9%至10%、1%至2%、1%至3%、1%至5%、2%至4%、2%至5%、4%至6%、5%至8%、8%至10%、1%至5%、2%至6%、3%至7%、4%至8%、5%至10%、10%至12%、12%至15%、15%至20%、17%至20%、20%至22%、20%至25%、25%至30%或30%至35%。

在某些實施例中，用本發明之反義寡聚物治療增加肌縮蛋白產生且減緩或減少在無治療之情況下所預期的步行喪失。舉例而言，治療可穩定、維持、改良或增加個體之行走能力(例如步行之穩定)。在一些實施例中，治療維持或增加患者之穩定行走距離，如藉由例如McDonald等人(Muscle Nerve, 2010; 42:966-74，以引用的方式併入本文中)所述之6分鐘行走測試(6MWT)所量測。6分鐘行走距離(6MWD)之變化可表示為絕對值、百分比變化或%預測值變化。在一些實施例中，治療維持或提高個體在6MWT中之穩定行走距離相對於健康同級不足20%。相對於健康同級之典型表現，DMD患者在6MWT中之表現可藉由計算%預測值來確定。舉例而言，男性之%預測之6MWD可使用以下等式計算：196.72 + (39.81 × 年齡) - (1.36 × 年齡² ) + (132.28 × 身高(公尺))。對於女性，%預測之6MWD可使用以下等式計算：188.61 + (51.50 × 年齡) - (1.86 × 年齡² ) + (86.10 × 身高(公尺)) (Henricson等人PLoS Curr., 2012, 版本2，以引用的方式併入本文中)。

在一些實施例中，用反義寡聚物治療使患者之穩定行走距離自基線增加至大於3、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或50公尺(包括其間所有的整數)。在一些實施例中，相對於健康同級，增加的肌縮蛋白產生為約0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1%、1.01%、1.5%、2%、2.01%、2.5%、3%、3.01%、3.5%、4%、4.01%、4.5%、5%、5.01%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、10%、10.5%、11%、11.5%、12%、12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%、15%、15.5%、16%、16.5%、17%、17.5%、18%、18.5%、19%、19.5%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、40%、45%、50%、55%或60%。在某些實施例中，相對於健康同級，肌縮蛋白產生可增加約0.1%至0.5%、0.5%至0.9%、0.8%至1%、0.9%至1.2%、0.9%至1.0%、0.9%至1.01%、1%至1.01%、1%至1.5%、1.5%至2%、1.9%至2.0%、1.9%至2.01%、2%至2.01%、2%至2.5%、2.5%至3%、2.9%至3.0%、2.9%至3.01%、2%至3.01%、3%至3.5%、3.5%至4%、4%至4.5%、4.5%至5%、5%至6%、6%至7%、7%至8%、8%至9%、9%至10%、1%至2%、1%至3%、1%至5%、2%至4%、2%至5%、4%至6%、5%至8%、8%至10%、1%至5%、2%至6%、3%至7%、4%至8%、5%至10%、10%至12%、12%至15%、15%至20%、17%至20%、20%至22%、20%至25%、25%至30%或30%至35%。

DMD患者之肌肉功能喪失可能發生在正常兒童生長及發育背景下。實際上，儘管肌肉損傷為進行性的，但患有DMD之較年幼兒童經約1年之過程可在6MWT期間展示行走距離增加。在一些實施例中，將來自DMD患者之6MWD與典型發育之對照個體及來自年齡及性別匹配之個體的現有標準化資料進行比較。在一些實施例中，可使用針對標準化資料擬合之基於年齡及身高的方程來解釋正常生長及發育。此類方程可用於將6MWD轉換成DMD個體之百分比預測(%預測)值。在某些實施例中，對%預測之6MWD資料的分析代表解釋正常生長及發育之方法，且可顯示在早期(例如小於或等於7歲)之功能增益代表DMD患者之穩定而非改良的能力(Henricson等人PLoS Curr., 2012, 版本2，以引用的方式併入本文中)。

提出且公開反義分子命名系統以區分不同反義分子(參見Mann等人, (2002) J Gen Med 4, 644-654)。當測試數種略微不同的反義分子時，此命名法變得特別相關，所有反義分子均指向同一目標區域，如下所示： H#A/D(x:y)。

第一個字母表示物種(例如H：人類，M：鼠類，C：犬類)。「#」表示目標肌縮蛋白外顯子數目。「A/D」分別表示外顯子開始及結束時之受體或供體剪接位點。(x y)表示黏接座標，其中「-」或「+」分別表示內含子或外顯子序列。舉例而言，A(-6+18)表示目標外顯子之前的內含子的最後6個鹼基及目標外顯子的前18個鹼基。最接近的剪接位點將為受體，因此此等座標前面會有「A」。描述供體剪接位點處之黏接座標可為D(+2-18)，其中最後2個外顯子鹼基及前18個內含子鹼基對應於反義分子之黏接位點。完全外顯子黏接座標將由A(+65+85)表示，亦即自該外顯子開始的第65個與第85個核苷酸之間的位點。 II. 反義寡核苷酸

根據本發明之方法使用靶向肌縮蛋白基因之前mRNA以實現外顯子53跳躍的反義寡核苷酸。

此類反義寡核苷酸可經設計以阻斷或抑制mRNA轉譯或抑制天然前mRNA剪接加工，且可稱為「針對」或「靶向」於其雜交之靶序列。靶序列通常為包括mRNA之AUG起始密碼子、轉譯抑制寡聚物、或經預處理之mRNA的剪接位點、剪接抑制寡聚物(SSO)的區域。剪接位點之靶序列可包括在經預處理之mRNA中具有其正常剪接受體接合點下游5'端1至約25個鹼基對的mRNA序列。在一些實施例中，靶序列可為經預處理之mRNA的任何區域，其包括剪接位點或完全包含在外顯子編碼序列內或跨越剪接受體或供體位點。當寡聚物以上述方式靶向目標核酸時，更通常稱為「靶向」生物相關目標，諸如蛋白質、病毒或細菌。

在某些實施例中，反義寡核苷酸與肌縮蛋白前mRNA之外顯子53目標區域特異性雜交且誘導外顯子53跳躍。在某些實施例中，與肌縮蛋白前mRNA之外顯子53目標區域雜交且誘導外顯子53跳躍的反義寡核苷酸為磷醯二胺嗎啉基寡聚物(PMO)。

在某些實施例中，反義寡核苷酸為格羅狄森。

格羅狄森屬於一類獨特的新型合成反義RNA治療劑，稱為磷醯二胺嗎啉基寡聚物(PMO)，其為天然核酸結構的重新設計。格羅狄森為與肌縮蛋白前mRNA之外顯子53目標區域雜交且誘導外顯子53跳躍的PMO。格羅狄森可藉由逐步固相合成，採用上文引用之參考文獻及另外國際專利申請案序號PCT/US17/40318 (其全部內容以引用的方式明確併入本文中)中詳述的方法來製備。

PMO基於活體內非臨床觀察結果提供潛在的臨床優勢。PMO併入對RNA糖環之修飾以保護其免受核酸酶之酶促降解，從而確保活體內穩定性。PMO與天然核酸及其他反義寡核苷酸類別之區別在於部分經由使用6員合成嗎啉基環，其置換RNA、DNA及許多其他合成反義RNA寡核苷酸中發現的5員呋喃核糖基環。

PMO特有的不帶電荷的磷醯二胺鍵被認為可能會降低與蛋白質的脫靶結合。PMO具有連接各嗎啉基環之不帶電荷的磷醯二胺鍵，而非其他臨床階段合成反義RNA寡核苷酸中所用之帶負電的硫代磷酸酯鍵。

治療由DMD 基因中之框架外突變引起之DMD的潛在治療方法係由稱為BMD之較弱形式的營養不良而想到，BMD由同框突變引起。將框架外突變轉化成同框突變之能力將假設保留mRNA閱讀框架且產生內部縮短但具功能性的肌縮蛋白。格羅狄森經設計以實現此目標。

格羅狄森靶向肌縮蛋白前mRNA且誘導外顯子53之跳躍，使其自成熟的剪接mRNA轉錄物中排除或跳過。藉由跳躍外顯子53，破壞的閱讀框架恢復成同框突變。雖然DMD由各種基因亞型構成，但格羅狄森經特定設計以跳躍肌縮蛋白前mRNA之外顯子53。適合於跳躍外顯子53之DMD突變包括與外顯子53相連之外顯子的缺失(亦即包括外顯子52或外顯子54之缺失)，且構成DMD患者之子群(8%)。

格羅狄森之25個核鹼基的序列經設計以與肌縮蛋白前mRNA之外顯子53內的特定靶序列互補。格羅狄森中之各嗎啉基環與DNA中發現的四個雜環核鹼基(腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤及胸腺嘧啶)中之一者連接。

格羅狄森與所靶向之前mRNA序列的雜交干擾前mRNA剪接複合物的形成且使外顯子53自成熟mRNA缺失。格羅狄森之結構及構形允許與互補序列之序列特異性鹼基配對。舉例而言，伊特普森為經設計以跳躍肌縮蛋白前mRNA之外顯子51的PMO，其允許與肌縮蛋白前mRNA之外顯子51中所含之互補序列進行序列特異性鹼基配對。使用外顯子跳躍恢復肌縮蛋白閱讀框架

含有全部79個外顯子之正常肌縮蛋白mRNA將產生正常的肌縮蛋白。

缺失肌縮蛋白基因之完整外顯子的肌縮蛋白mRNA通常導致DMD。

另一種外顯子跳躍PMO伊特普森跳躍外顯子51以恢復mRNA閱讀框架。由於外顯子49以完整密碼子結束且外顯子52以密碼子之第一個核苷酸開始，故藉由外顯子跳躍缺失外顯子51恢復閱讀框架，使得產生具有完整肌縮蛋白聚糖結合位點之內部縮短的肌縮蛋白。

非臨床研究支持使用外顯子跳躍恢復肌縮蛋白mRNA開放閱讀框架來改善DMD表型的可行性。在DMD之營養不良動物模型中的許多研究表明，藉由外顯子跳躍恢復肌縮蛋白引起肌肉力量及功能之可靠改良(Sharp 2011；Yokota 2009；Wu 2008；Wu 2011；Barton-Davis 1999；Goyenvalle 2004；Gregorevic 2006；Yue 2006；Welch 2007；Kawano 2008；Reay 2008；van Putten 2012)。其引人注目的實例來自一項研究，其中將外顯子跳躍(使用PMO)療法後之肌縮蛋白水準與相同組織中之肌肉功能進行比較。在營養不良的mdx 小鼠中，用小鼠特異性PMO治療之脛骨前(TA)肌在應激誘導收縮後維持其最大力容量之~75%，而未治療之對側TA肌肉僅維持其最大力容量之~25% (p ＜0.05) (Sharp 2011)。在另一項研究中，3隻營養不良的CXMD 狗(在2-5個月齡)接受外顯子跳躍療法，使用特異性針對其基因突變之PMO，一週一次，持續5至7週，或每隔一週，持續22週。在外顯子跳躍療法後，所有3隻狗均表現出在骨骼肌中廣泛的全身肌縮蛋白表現，以及相對於基線維持或改良的步行(15 m跑步測試)。相比之下，未治療之年齡匹配的CXMD 狗在研究過程中顯示出步行的顯著減少(Yokota 2009)。

在mdx小鼠及表現整個人類DMD轉錄物之人類化DMD (hDMD)小鼠模型中，已顯示PMO在等莫耳濃度下具有比硫代磷酸酯更多的外顯子跳躍活性(Heemskirk 2009)。在正常人類骨骼肌細胞或具有適合於外顯子51跳躍之不同突變的DMD患者肌肉細胞中使用反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)及西方墨點(WB)的活體外實驗將伊特普森(PMO)鑑別為外顯子51跳躍之強效誘導劑。在hDMD小鼠模型中已活體內證實伊特普森誘導之外顯子51跳躍(Arechavala-Gomeza 2007)。

分析與肌縮蛋白前mRNA之外顯子53目標區域特異性雜交且誘導外顯子53跳躍之反義寡核苷酸之效應的臨床結果包括肌縮蛋白陽性纖維百分比(PDPF)、六分鐘行走測試(6MWT)、步行喪失(LOA)、北極星移動評定(NSAA)、肺功能測試(PFT)、無外部支持(自仰臥位)起身之能力、重新肌縮蛋白產生及其他功能量測自基線增加。

格羅狄森已在臨床研究中經研究。研究 4053-101

研究4053-101為SRP-4053 (格羅狄森)在DMD患者中之I/II期研究。此研究為2部分、隨機、雙盲、安慰劑對照、劑量滴定、安全性、耐受性及藥物動力學研究(第1部分)，隨後為SRP-4053在適合於外顯子53跳躍之杜興氏肌肉萎縮症患者中之開放標記功效及安全性評估(第2部分)。主要結果量測包括不良事件發生率[時間範圍：約12週(第1部分)]、6分鐘行走測試(6MWT)自基線之變化[時間範圍：144週(第2部分)]及肌縮蛋白陽性纖維百分比[時間範圍：48週(第2部分)]。次要結果量測包括血漿中之藥物濃度[時間範圍：約12週(第1部分)]、預測之最大吸氣壓力(MIP)%、預測之最大呼氣壓力(MEP)%[時間範圍：144週(第2部分)]。此研究之其他詳情見於www.clinicaltrials.gov (NCT02310906)。 III. 調配物及投藥模式

在某些實施例中，本發明提供適用於治療性遞送如本文所述之反義寡核苷酸的調配物或醫藥組合物。因此，在某些實施例中，本發明提供醫藥學上可接受之組合物，其包含與一或多種醫藥學上可接受之載劑(添加劑)及/或稀釋劑一起調配的治療有效量之本文所述之反義寡核苷酸中之一或多者。雖然本發明之反義寡核苷酸可單獨投與，但較佳以醫藥調配物(組合物)形式投與該化合物。

用於遞送核酸分子之方法描述於例如Akhtar等人, 1992, Trends Cell Bio., 2:139；及Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, Akhtar編；Sullivan等人, PCT WO 94/02595中。此等及其他方案可用於遞送實際上任何核酸分子，包括本發明之反義寡核苷酸。

如下詳述，本發明之醫藥組合物可專門調配用於以固體或液體形式投藥，包括適於以下之彼等形式：(1)經口投藥，例如灌藥(水性或非水性溶液或懸浮液)、錠劑(例如針對頰內、舌下及全身吸收之錠劑)、大丸劑、散劑、顆粒劑、施用於舌頭之糊劑；(2)非經腸投藥，例如藉由以例如無菌溶液或懸浮液或持續釋放調配物形式皮下、肌肉內、靜脈內或硬膜外注射；(3)局部施用，例如以乳膏、軟膏或控制釋放貼片或噴霧形式施用於皮膚；(4)陰道內或直腸內，例如以子宮托、乳膏或泡沫形式；(5)舌下；(6)經眼；(7)經皮；或(8)經鼻。

可充當醫藥學上可接受之載劑之材料的一些實例包括：(1)糖，諸如乳糖、葡萄糖及蔗糖；(2)澱粉，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；(3)纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及乙酸纖維素；(4)粉末狀黃蓍；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石；(8)賦形劑，諸如可可脂及栓劑蠟；(9)油，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油；(10)二醇，諸如丙二醇；(11)多元醇，諸如丙三醇、山梨糖醇、甘露醇及聚乙二醇；(12)酯，諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩衝劑，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；(15)褐藻酸；(16)無熱原質水；(17)等張鹽水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20) pH緩衝溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯及/或聚酸酐；及(22)醫藥調配物中使用的其他無毒性相容物質。

適用於與本發明之反義寡核苷酸一起調配之試劑的額外非限制性實例包括：PEG結合之核酸、磷脂結合之核酸、含有親脂部分之核酸、硫代磷酸酯、P-醣蛋白抑制劑(諸如普洛尼克(Pluronic) P85)，其可增強藥物進入各種組織；生物可降解聚合物，諸如聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)微球體，用於植入後之持續釋放遞送(Emerich, D F等人, 1999, Cell Transplant, 8, 47-58) Alkermes, Inc. Cambridge, Mass.；及負載之奈米粒子，諸如由聚氰基丙烯酸丁酯製成之奈米粒子，其可遞送藥物跨越血腦屏障且可改變神經元吸收機制(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949, 1999)。

本發明亦關於包含經表面修飾之脂質體之組合物的用途，該等經表面修飾之脂質體含有聚(乙二醇)脂質(經PEG修飾、分支鏈及非分支鏈或其組合，或長循環脂質體或隱形脂質體)。本發明之反義寡核苷酸亦可包含各種分子量之共價連接的PEG分子。此等調配物提供增加靶組織中藥物積聚量的方法。此類藥物載劑藉由單核吞噬細胞系統(MPS或RES)抵抗助噬及消除，從而使經囊封藥物之血液循環時間更長且組織暴露增強(Lasic等人 Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627；Ishiwata等人, Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011)。已顯示此類脂質體在腫瘤中選擇性積聚，可能藉由外滲及在新生血管化靶組織中捕捉(Lasic等人, Science 1995, 267, 1275-1276；Oku等人, 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86-90)。長循環脂質體增強DNA及RNA之藥物動力學及藥效動力學，尤其與已知在MPS組織中積聚之習知陽離子脂質體相比(Liu等人, J. Biol. Chem. 1995, 42, 24864-24870；Choi等人, 國際PCT公開案第WO 96/10391號；Ansell等人, 國際PCT公開案第WO 96/10390號；Holland等人, 國際PCT公開案第WO 96/10392號)。與陽離子脂質體相比，長循環脂質體亦可更大程度地保護藥物免受核酸酶降解，此係基於其避免在代謝侵襲性MPS組織諸如肝臟及脾臟中積聚之能力。

在另一個實施例中，本發明包括製備用於遞送之反義寡核苷酸醫藥組合物，如美國專利第6,692,911號、第7,163,695號及第7,070,807號中所述。在此方面，在一個實施例中，本發明提供本發明之寡聚物，其單獨或與PEG (例如分支鏈或未分支鏈PEG或兩者之混合物)組合、與PEG及靶向部分組合或前述任一者與交聯劑組合在包含離胺酸及組胺酸(HK)之共聚物(如美國專利第7,163,695號、第7,070,807號及第6,692,911號中所述)的組合物中。在某些實施例中，本發明提供反義寡核苷酸，其在包含經葡萄糖酸修飾之聚組胺酸或經葡萄糖酸化之聚組胺酸/運鐵蛋白-聚離胺酸之醫藥組合物中。熟習此項技術者亦將認識到，具有與His及Lys類似特性之胺基酸可在組合物內經取代。

本文所述之反義寡核苷酸的某些實施例可含有鹼性官能基，諸如胺基或烷基胺基，因此能夠與醫藥學上可接受之酸形成醫藥學上可接受之鹽。在此方面，術語「醫藥學上可接受之鹽」係指本發明化合物之相對無毒的無機及有機酸加成鹽。此等鹽可在投藥媒劑或劑型製造過程中就地製備，或藉由使本發明之純化化合物以其游離鹼形式與適合之有機或無機酸單獨反應，且在後續純化期間分離因此形成的鹽。代表性鹽包括氫溴酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、乙酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、順丁烯二酸鹽、反丁烯二酸鹽、丁二酸鹽、酒石酸鹽、萘二甲酸鹽、甲磺酸鹽、葡庚糖酸鹽、乳糖酸鹽及月桂基磺酸鹽及其類似物。(參見例如Berge等人 (1977) 「Pharmaceutical Salts」, J. Pharm. Sci. 66:1-19)。

本發明反義寡核苷酸之醫藥學上可接受之鹽包括該化合物之習知無毒鹽或四級銨鹽，例如來自無毒有機或無機酸。舉例而言，此類習知無毒鹽包括衍生自無機酸之彼等鹽，諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、胺磺酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽及其類似物；及自有機酸製備之鹽，諸如乙酸鹽、丙酸鹽、丁二酸鹽、乙醇酸鹽、硬脂酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、抗壞血酸鹽、棕櫚酸鹽、順丁烯二酸鹽、羥基順丁烯二酸鹽、苯乙酸鹽、麩胺酸鹽、苯甲酸鹽、水楊酸鹽、對胺基苯磺酸鹽、2-乙醯氧基苯甲酸鹽、反丁烯二酸鹽、甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、乙二磺酸鹽、草酸鹽、異硫磺酸鹽及其類似物。

在某些實施例中，本發明之反義寡核苷酸可含有一或多個酸性官能基，因此能夠與醫藥學上可接受之鹼形成醫藥學上可接受之鹽。在此等情況下，術語「醫藥學上可接受之鹽」係指本發明化合物之相對無毒的無機及有機鹼加成鹽。此等鹽可同樣在投藥媒劑或劑型製造過程中就地製備，或藉由使純化化合物以其游離酸形式與適合鹼(諸如醫藥學上可接受之金屬陽離子的氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽)、與氨或與醫藥學上可接受之有機一級、二級或三級胺單獨反應來製備。代表性鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽包括鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽及鋁鹽及其類似物。可用於形成鹼加成鹽之代表性有機胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪及其類似物。(參見例如Berge等人, 見上文)。

濕潤劑、乳化劑及潤滑劑(諸如月桂基硫酸鈉及硬脂酸鎂)以及著色劑、脫模劑、包衣劑、甜味劑、調味劑及芳香劑、防腐劑及抗氧化劑亦可存在於組合物中。

醫藥學上可接受之抗氧化劑之實例包括：(1)水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及其類似物；(2)油溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基大茴香醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚及其類似物；及(3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸及其類似物。

本發明之調配物包括適用於經口、經鼻、局部(包括頰內及舌下)、直腸、陰道及/或非經腸投藥之調配物。調配物可方便地以單位劑型存在且可藉由藥劑學技術中熟知之方法製備。可與載劑材料組合以產生單一劑型之活性成分之量將視所治療之宿主、特定投藥模式而變化。可與載劑材料組合以產生單一劑型之活性成分之量一般為產生治療效果之化合物的量。一般而言，以100%計，此量在約0.1%至約99%活性成分，較佳約5%至約70%，最佳約10%至約30%之範圍內。

在某些實施例中，本發明之調配物包含選自環糊精、纖維素、脂質體、微胞形成劑(例如膽汁酸)及聚合物載劑(例如聚酯及聚酸酐)之賦形劑；及本發明之寡聚物。在某些實施例中，前述調配物使得本發明之寡聚物經口生物可用。

製備此等調配物或醫藥組合物之方法包括使本發明之反義寡核苷酸與載劑及視情況選用之一或多種附屬成分締合的步驟。一般而言，藉由使本發明化合物與液體載劑或細粉狀固體載劑或兩者均一且緊密地締合且隨後(必要時)使產物成形來製備調配物。

適用於經口投藥之本發明之調配物可呈膠囊、扁囊劑、丸劑、錠劑、口含錠(使用調味基質，通常為蔗糖及阿拉伯膠或黃蓍)、散劑、顆粒劑之形式，或呈水性或非水性液體中之溶液或懸浮液形式，或呈水包油或油包水液體乳劑形式，或呈酏劑或糖漿形式，或呈片劑(使用惰性基質，諸如明膠及甘油，或蔗糖及阿拉伯膠)形式及/或呈漱口劑形式及其類似形式，各含有預定量之本發明化合物作為活性成分。本發明之反義寡核苷酸亦可以大丸劑、舐劑或糊劑形式投與。

在用於經口投藥之本發明之固體劑型(膠囊、錠劑、丸劑、糖衣藥丸、散劑、顆粒劑、口含錠及其類似物)中，活性成分可與一或多種醫藥學上可接受之載劑(諸如檸檬酸鈉或磷酸二鈣)及/或以下任一者混合：(1)填充劑或增量劑，諸如澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇及/或矽酸；(2)黏合劑，諸如羧甲基纖維素、褐藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯啶酮、蔗糖及/或阿拉伯膠；(3)保濕劑，諸如甘油；(4)崩解劑，諸如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯澱粉、褐藻酸、某些矽酸鹽及碳酸鈉；(5)溶液阻滯劑，諸如石蠟；(6)吸收促進劑，諸如四級銨化合物，及界面活性劑，諸如泊洛沙姆(poloxamer)及月桂基硫酸鈉；(7)濕潤劑，諸如鯨蠟醇、單硬脂酸甘油酯及非離子界面活性劑；(8)吸收劑，諸如高嶺土及膨潤土；(9)潤滑劑，諸如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉、硬脂酸鋅、硬脂酸鈉、硬脂酸及其混合物；(10)著色劑；及(11)控制釋放劑，諸如交聯普維酮(crospovidone)或乙基纖維素。在膠囊、錠劑及丸劑之情況下，醫藥組合物亦可包含緩衝劑。類似類型之固體醫藥組合物亦可用作使用諸如乳糖以及高分子量聚乙二醇及其類似物之賦形劑的軟及硬殼明膠膠囊中之填充劑。

錠劑可藉由視情況與一或多種附屬成分一起壓縮或模製來製造。可使用黏合劑(例如明膠或羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如羥基乙酸澱粉鈉或交聯羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑來製備壓縮錠劑。模製錠劑可藉由在適合的機器中模製用惰性液體稀釋劑濕潤之粉末狀化合物的混合物來製造。

本發明之醫藥組合物之錠劑及其他固體劑型(諸如糖衣藥丸、膠囊、丸劑及顆粒劑)可視情況經刻痕或製備成具有包衣及殼層，諸如腸溶包衣及醫藥調配技術中熟知之其他包衣。其亦可使用例如不同比例之羥丙基甲基纖維素以提供所需釋放特徵、其他聚合物基質、脂質體及/或微球體來調配以便提供其中活性成分之緩慢或控制釋放。其可調配用於快速釋放，例如冷凍乾燥。其可藉由例如經由細菌截留過濾器過濾或藉由併入滅菌劑來滅菌，呈臨用前可溶解於無菌水或一些其他無菌可注射介質中之無菌固體組合物形式。此等醫藥組合物亦可視情況含有遮光劑且可為視情況以延遲方式僅僅或優先在胃腸道之某一部分中釋放活性成分之組合物。可使用之包埋組合物之實例包括聚合物質及蠟。活性成分亦可適當時與一或多種上述賦形劑一起呈微囊封形式。

用於經口投與本發明化合物之液體劑型包括醫藥學上可接受之乳液、微乳液、溶液、懸浮液、糖漿及酏劑。除活性成分以外，液體劑型可含有常用於此項技術中之惰性稀釋劑(諸如水或其他溶劑)、增溶劑及乳化劑，諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(尤其為棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油及芝麻油)、甘油、四氫呋喃醇、聚乙二醇及脫水山梨糖醇之脂肪酸酯及其混合物。

除惰性稀釋劑以外，經口醫藥組合物亦可包括佐劑，諸如濕潤劑、乳化劑及懸浮劑、甜味劑、調味劑、著色劑、芳香劑及防腐劑。

除活性化合物以外，懸浮液亦可含有懸浮劑，例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇及脫水山梨糖醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂及黃蓍及其混合物。

用於直腸或陰道投藥之調配物可以栓劑形式呈現，其可藉由將一或多種本發明化合物與一或多種適合之無刺激性賦形劑或載劑混合來製備，該等賦形劑或載劑包含例如可可脂、聚乙二醇、栓劑蠟或水楊酸鹽，其在室溫下為固體，但在體溫下為液體，因此會在直腸或陰道腔中熔融且釋放活性化合物。

用於局部或經皮投與如本文所提供之寡聚物的調配物或劑型包括散劑、噴霧劑、軟膏、糊劑、乳膏、洗劑、凝膠、溶液、貼片及吸入劑。活性反義寡核苷酸可在無菌條件下與醫藥學上可接受之載劑，以及與可能需要之任何防腐劑、緩衝劑或推進劑混合。除本發明之活性化合物以外，軟膏、糊劑、乳膏及凝膠可含有賦形劑，諸如動物及植物脂肪、油、蠟、石蠟、澱粉、黃蓍、纖維素衍生物、聚乙二醇、聚矽氧、膨潤土、矽酸、滑石及氧化鋅，或其混合物。

除本發明之寡聚物以外，散劑及噴霧劑可含有賦形劑，諸如乳糖、滑石、矽酸、氫氧化鋁、矽酸鈣及聚醯胺粉末，或此等物質之混合物。噴霧劑可另外含有習用推進劑，諸如氯氟烴及揮發性未經取代之烴，諸如丁烷及丙烷。

經皮貼片具有提供控制本發明之寡聚物向身體之遞送的額外優勢。此類劑型可藉由將寡聚物溶解或分散於適當介質中來製備。亦可使用吸收增進劑來增加藥劑通過皮膚之通量。除此項技術中已知的其他方法以外，可藉由提供速率控制膜或將藥劑分散在聚合物基質或凝膠中來控制此類通量之速率。

適用於非經腸投藥之醫藥組合物可包含一或多種本發明之反義寡核苷酸與一或多種醫藥學上可接受之無菌等張水性或非水性溶液、分散液、懸浮液或乳液，或可僅在使用之前復原成無菌可注射溶液或分散液之無菌散劑的組合，其可含有糖、醇、抗氧化劑、緩衝液、抑菌劑、使得調配物與預期接受者之血液等張之溶質或懸浮劑或增稠劑。可用於本發明之醫藥組合物中之適合之水性及非水性載劑的實例包括水、乙醇、多元醇(諸如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇及其類似物)及其適合之混合物、植物油(諸如橄欖油)及可注射之有機酯(諸如油酸乙酯)。可例如藉由使用包衣材料(諸如卵磷脂)、藉由在分散體之情況下維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。

此等醫藥組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑及分散劑。藉由包含各種抗細菌劑及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸及其類似物，可確保防止微生物對本發明反義寡核苷酸之作用。亦可能需要在組合物中包括等張劑，諸如糖、氯化鈉及其類似物。另外，可藉由包含延遲吸收劑(諸如單硬脂酸鋁及明膠)來延長可注射醫藥形式之吸收。

在一些情況下，為延長藥物之效果，期望減緩皮下或肌肉內注射之藥物吸收。除此項技術中已知的其他方法以外，此可藉由使用水溶性差之結晶或無定形材料的液體懸浮液來實現。藥物吸收速率則視其溶解速率而定，而溶解速率又可視晶體大小及結晶型而定。或者，藉由將藥物溶解或懸浮於油性媒劑中來實現非經腸投與之藥物形式的延遲吸收。

可藉由在生物可降解聚合物諸如聚丙交酯-聚乙交酯中形成本發明反義寡核苷酸之微膠囊基質來製備可注射積存形式。視寡聚物與聚合物之比率及所用特定聚合物的性質而定，可控制寡聚物釋放速率。其他生物可降解聚合物的實例包括聚(原酸酯)及聚(酸酐)。亦可藉由將藥物包覆於與身體組織相容之脂質體或微乳液中來製備儲槽式可注射調配物。

當本發明之反義寡核苷酸作為醫藥投與人類及動物時，其本身可給與或以含有例如0.1至99% (更佳10至30%)活性成分與醫藥學上可接受之載劑之組合的醫藥組合物形式給與。

如上文所指出，本發明之調配物或製劑可經口、非經腸、局部或經直腸給與。其通常以適用於各投藥途徑之形式給與。舉例而言，其係以錠劑或膠囊形式投與，藉由注射、吸入投與，以眼部洗劑、軟膏、栓劑等形式投與，藉由注射、輸注或吸入投與，藉由洗劑或軟膏局部投與，及藉由栓劑經直腸投與。

無論選擇何種投藥途徑，本發明之反義寡核苷酸(其可以適合之水合形式使用)及/或本發明之醫藥組合物可藉由熟習此項技術者已知的習知方法調配成醫藥學上可接受之劑型。可改變本發明之醫藥組合物中活性成分的實際劑量水準，以便獲得針對特定患者、組合物及投藥模式有效地達成所需治療反應而對患者無不可接受之毒性的活性成分之量。

所選劑量水準將視多種因素而定，包括所用本發明之特定寡聚物或其酯、鹽或醯胺的活性，投藥途徑，投藥時間，所用特定寡聚物之排泄或代謝速率，吸收速率及程度，治療持續時間，與所用特定寡聚物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料，所治療患者之年齡、性別、體重、病況、一般健康狀況及先前病史，以及醫學技術中熟知之類似因素。

具有此項技術普通技能之醫師或獸醫可容易地確定及開具所需醫藥組合物之有效量。舉例而言，醫師或獸醫可以低於為達成所需治療效果所需之水準的醫藥組合物中所用之本發明化合物的劑量開始，且逐漸增加劑量直至達成所需效果。一般而言，本發明化合物之適合日劑量為有效產生治療效果之最低劑量的化合物量。此類有效劑量將一般視上述因素而定。一般而言，當用於所指示之效果時，用於患者之本發明化合物的經口、靜脈內、腦室內及皮下劑量在每天每公斤體重約0.0001至約100 mg範圍內。

在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸係以一般約4-160 mg/kg、10-160 mg/kg或20-160 mg/kg之劑量投與。在一些情況下，可能需要大於160 mg/kg之劑量。在一些實施例中，諸如靜脈內投藥之非經腸劑量為約0.5 mg至160 mg/kg。在一些實施例中，反義寡核苷酸係以約4 mg/kg、10 mg/kg、11 mg/kg、12 mg/kg、14 mg/kg、15 mg/kg、17 mg/kg、20 mg/kg、21 mg/kg、25 mg/kg、26 mg/kg、27 mg/kg、28 mg/kg、29 mg/kg、30 mg/kg、31 mg/kg、32 mg/kg、33 mg/kg、34 mg/kg、35 mg/kg、36 mg/kg、37 mg/kg、38 mg/kg、39mg/kg、40mg/kg、41mg/kg、42mg/kg、43mg/kg、44mg/kg、45mg/kg、46mg/kg、47mg/kg、48mg/kg、49mg/kg 50mg/kg、51mg/kg、52mg/kg、53mg/kg、54mg/kg、55mg/kg、56mg/kg、57mg/kg、58mg/kg、59mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg、100mg/kg、105mg/kg、110mg/kg、115mg/kg、120mg/kg、125mg/kg、130mg/kg、135mg/kg、140mg/kg、145mg/kg、150mg/kg、155mg/kg、160mg/kg之劑量投與，包括其間的所有整數。在一些實施例中，寡聚物係以30 mg/kg投與。在一些實施例中，寡聚物係以40 mg/kg投與。在一些實施例中，寡聚物係以60 mg/kg投與。在一些實施例中，寡聚物係以80 mg/kg投與。在一些實施例中，寡聚物係以160 mg/kg投與。在一些實施例中，寡聚物係以50 mg/kg投與。

必要時，活性化合物之有效日劑量可以兩次、三次、四次、五次、六次或更多次亞劑量投與，此等亞劑量視情況以單位劑型在一天內以適當時間間隔單獨投與。在某些情形中，給藥為每天一次投藥。在某些實施例中，給藥為按需要每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12週，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月一或多次投藥，以維持功能性肌縮蛋白之所需表現。在某些實施例中，給藥為每週一次投藥。在某些實施例中，給藥為每兩週一或多次投藥。在一些實施例中，給藥為每兩週一次投藥。在各種實施例中，給藥為每月一或多次投藥。在某些實施例中，給藥為每月一次投藥。

在各種實施例中，反義寡核苷酸每週以4 mg/kg投與。在各種實施例中，反義寡核苷酸每週以10 mg/kg投與。在各種實施例中，反義寡核苷酸每週以20 mg/kg投與。在各種實施例中，反義寡核苷酸每週以30 mg/kg投與。在一些實施例中，反義寡核苷酸每週以40 mg/kg投與。在一些實施例中，反義寡核苷酸每週以60 mg/kg投與。在一些實施例中，反義寡核苷酸每週以80 mg/kg投與。在一些實施例中，反義寡核苷酸每週以100 mg/kg投與。在一些實施例中，反義寡核苷酸每週以160 mg/kg投與。如本文所用，每週應理解為具有此項技術所接受之每一週的含義。

在各種實施例中，反義寡核苷酸每兩週以4 mg/kg投與。在各種實施例中，反義寡核苷酸每兩週以10 mg/kg投與。在各種實施例中，反義寡核苷酸每兩週以20 mg/kg投與。在各種實施例中，反義寡核苷酸每兩週以30 mg/kg投與。在一些實施例中，反義寡核苷酸每兩週以40 mg/kg投與。在一些實施例中，反義寡核苷酸每兩週以60 mg/kg投與。在一些實施例中，反義寡核苷酸每兩週以80 mg/kg投與。在一些實施例中，反義寡核苷酸每兩週以100 mg/kg投與。在一些實施例中，反義寡核苷酸每兩週以160 mg/kg投與。如本文所用，每兩週(biweekly)應理解為具有此項技術所接受之每兩週(every two weeks)的含義。

在各種實施例中，反義寡核苷酸每三週以4 mg/kg投與。在各種實施例中，反義寡核苷酸每三週以10 mg/kg投與。在各種實施例中，反義寡核苷酸每三週以20 mg/kg投與。在各種實施例中，反義寡核苷酸每三週以30 mg/kg投與。在一些實施例中，反義寡核苷酸每三週以40 mg/kg投與。在一些實施例中，反義寡核苷酸每三週以60 mg/kg投與。在一些實施例中，反義寡核苷酸每三週以80 mg/kg投與。在一些實施例中，反義寡核苷酸每三週以100 mg/kg投與。在一些實施例中，反義寡核苷酸每三週以160 mg/kg投與。如本文所用，每三週應理解為具有此項技術所接受之每三週一次的含義。

在各種實施例中，反義寡核苷酸每月以4 mg/kg投與。在各種實施例中，反義寡核苷酸每月以10 mg/kg投與。在各種實施例中，反義寡核苷酸每月以20 mg/kg投與。在各種實施例中，反義寡核苷酸每月以30 mg/kg投與。在一些實施例中，反義寡核苷酸每月以40 mg/kg投與。在一些實施例中，反義寡核苷酸每月以60 mg/kg投與。在一些實施例中，反義寡核苷酸每月以80 mg/kg投與。在一些實施例中，反義寡核苷酸每月以100 mg/kg投與。在一些實施例中，反義寡核苷酸每月以160 mg/kg投與。如本文所用，每月應理解為具有此項技術所接受之每個月的含義。

如此項技術中應理解，每週、每兩週、每三週或每月投藥可為如上文所論述之一或多次投藥或亞劑量。

核酸分子可藉由熟習此項技術者已知的各種方法投與細胞，包括但不限於脂質體囊封、藉由離子電滲或藉由併入其他媒劑(諸如水凝膠、環糊精、生物可降解奈米膠囊及生物黏附性微球體)中，如本文所述及此項技術中已知。在某些實施例中，微乳化技術可用於改良親脂性(水不溶性)藥劑之生物可用性。實例包括Trimetrine (Dordunoo, S. K.等人, Drug Development and Industrial Pharmacy, 17(12), 1685-1713, 1991及REV 5901 (Sheen, P. C.等人, J Pharm Sci 80(7), 712-714, 1991)。除其他益處以外，微乳化藉由優先引導淋巴系統而非循環系統吸收，藉此繞過肝臟且防止化合物在肝膽循環中遭到破壞來提供增強之生物可用性。

在本發明之一個態樣中，調配物含有由如本文所提供之寡聚物及至少一種兩親媒性載劑形成的微胞，其中微胞之平均直徑小於約100 nm。更佳之實施例提供平均直徑小於約50 nm之微胞，甚至更佳之實施例提供平均直徑小於約30 nm或甚至小於約20 nm之微胞。

雖然涵蓋所有適合之兩親媒性載劑，但當前較佳載劑一般為具有普遍認為安全(GRAS)狀態且當溶液與複雜水相(諸如發現於人類胃腸道中之水相)接觸時可溶解本發明化合物且後期將其微乳化之彼等載劑。通常，滿足此等要求之兩親媒性成分之HLB (親水-親脂平衡)值為2-20，且其結構含有在C-6至C-20範圍內之直鏈脂族基團。實例為聚乙二醇化之脂肪甘油酯及聚乙二醇。

兩親媒性載劑之實例包括飽和及單不飽和的聚乙二醇化脂肪酸甘油酯，諸如由完全或部分氫化之各種植物油獲得的飽和及單不飽和的聚乙二醇化脂肪酸甘油酯。此類油宜由三脂肪酸甘油酯、二脂肪酸甘油酯及單脂肪酸甘油酯以及相應脂肪酸之二聚乙二醇酯及單聚乙二醇酯組成，其中尤其較佳之脂肪酸組合物包括癸酸4-10、癸酸3-9、月桂酸40-50、肉豆蔻酸14-24、棕櫚酸4-14及硬脂酸5-15%。另一類有用的兩親媒性載劑包括部分酯化的脫水山梨糖醇及/或山梨糖醇、飽和或單不飽和脂肪酸(SPAN系列)或相應乙氧基化類似物(TWEEN系列)。

市售兩親媒性載劑可為特別有用的，包括Gelucire系列、Labrafil、Labrasol或Lauroglycol (全部由Gattefosse Corporation, Saint Priest, France製造及分銷)、PEG-單油酸酯、PEG-二油酸酯、PEG-單月桂酸酯及二月桂酸酯、卵磷脂、聚山梨醇酯80等(由美國及全球之許多公司生產及分銷)。

在某些實施例中，遞送可藉由使用脂質體、奈米膠囊、微粒、微球體、脂質粒子、囊泡及其類似物來進行，以將本發明之醫藥組合物引入適合之宿主細胞中。特定言之，本發明之醫藥組合物可調配用於囊封在脂質粒子、脂質體、囊泡、奈米球、奈米粒子或其類似物中遞送。可使用已知及習知技術進行此類遞送媒劑之調配及使用。

適用於本發明之親水性聚合物為易溶於水，可共價連接至囊泡形成脂質，且活體內可耐受而無毒性作用(亦即生物相容性)之親水性聚合物。適合之聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(亦稱為聚丙交酯)、聚乙醇酸(亦稱為聚乙交酯)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物及聚乙烯醇。在某些實施例中，聚合物之分子量為約100或120道爾頓至約5,000或10,000道爾頓，或約300道爾頓至約5,000道爾頓。在其他實施例中，聚合物為分子量為約100至約5,000道爾頓，或分子量為約300至約5,000道爾頓之聚乙二醇。在某些實施例中，聚合物為750道爾頓之聚乙二醇(PEG(750))。聚合物亦可由其中之單體數量來定義；本發明之一較佳實施例利用至少約三種單體之聚合物，此類PEG聚合物由三種單體組成(約150道爾頓)。

可適用於本發明之其他親水性聚合物包括聚乙烯吡咯啶酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥丙基甲基丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺、聚二甲基丙烯醯胺及衍生纖維素(諸如羥甲基纖維素或羥乙基纖維素)。

在某些實施例中，本發明之調配物包含選自由以下組成之群之生物相容性聚合物：聚醯胺、聚碳酸酯、聚伸烷、丙烯酸與甲基丙烯酸酯之聚合物、聚乙烯聚合物、聚乙交酯、聚矽氧烷、聚胺基甲酸酯及其共聚物、纖維素、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、乳酸與乙醇酸之聚合物、聚酸酐、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己內酯)、多醣、蛋白質、聚玻尿酸、聚氰基丙烯酸酯及其摻合物、混合物或共聚物。

環糊精為由6、7或8個葡萄糖單元組成之環狀寡醣，分別由希臘字母α、β或γ表示。葡萄糖單元由α-1,4-糖苷鍵連接。由於糖單元之椅型構形，所有二級羥基(在C-2、C-3處)位於環之一側上，而在C-6處之所有一級羥基位於另一側。因此，外部表面為親水性的，使得環糊精水可溶。相比之下，環糊精之腔為疏水性的，因為其由原子C-3及C-5之氫及由類醚氧裝襯。此等基質允許與多種相對疏水性化合物，包括例如類固醇化合物(諸如17α-雌二醇)複合(參見例如van Uden等人Plant Cell Tiss. Org. Cult. 38:1-3-113 (1994))。複合藉由凡得瓦爾力相互作用(Van der Waals interaction)及藉由氫鍵形成來進行。關於環糊精之化學性質之一般綜述，參見Wenz, Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 33:803-822 (1994)。

環糊精衍生物之物理化學特性很大程度上視取代之種類及程度而定。舉例而言，其於水中之溶解度在不溶(例如三乙醯基-β-環糊精)至147%可溶(w/v) (G-2-β-環糊精)範圍內。另外，其可溶於多種有機溶劑中。環糊精之特性使得能夠藉由增加或降低其溶解度來控制各種調配物組分之溶解度。

已描述多種環糊精及其製備方法。舉例而言，Parmeter (I)等人(美國專利第3,453,259號)及Gramera等人(美國專利第3,459,731號)描述電中性環糊精。其他衍生物包括具有陽離子特性之環糊精[Parmeter (II)，美國專利第3,453,257號]、不溶交聯環糊精(Solms，美國專利第3,420,788號)及具有陰離子特性之環糊精[Parmeter (III)，美國專利第3,426,011號]。在具有陰離子特性之環糊精衍生物中，已將羧酸、亞磷酸、亞膦酸、膦酸、磷酸、硫膦酸、硫亞磺酸及磺酸附加至親本環糊精[參見Parmeter (III)，見上文]。此外，Stella等人(美國專利第5,134,127號)已描述磺烷基醚環糊精衍生物。

脂質體由至少一個封閉水性內部隔室之脂質雙層膜組成。脂質體可由膜類型及大小表徵。小單層囊泡(SUV)具有單個膜且通常直徑在0.02與0.05 μm之間；大單層囊泡(LUVS)通常大於0.05 μm。寡層大囊泡及多層囊泡具有多個(通常同心)膜層且通常大於0.1 μm。具有數個非同心膜之脂質體，亦即數個較小囊泡包含在較大囊泡內，稱為多囊泡性囊泡。

本發明之一個方面係關於包含含有本發明之反義寡核苷酸之脂質體的調配物，其中脂質體膜經調配以提供攜帶能力增加之脂質體。或者或另外，本發明化合物可含於脂質體之脂質體雙層內或吸附至脂質體之脂質體雙層上。本發明之反義寡核苷酸可與脂質界面活性劑聚集且攜帶於脂質體之內部空間內；在此等情況下，脂質體膜經調配以抵抗活性劑-界面活性劑聚集體之破壞作用。

根據本發明之一個實施例，脂質體之脂質雙層含有用聚乙二醇(PEG)衍生之脂質，以使得PEG鏈自脂質雙層之內表面延伸至脂質體囊封之內部空間，且自脂質雙層之外部延伸至周圍環境。

本發明脂質體中所含有之活性劑呈溶解形式。界面活性劑與活性劑之聚集體(諸如含有相關活性劑之乳液或微胞)可截留於根據本發明之脂質體之內部空間內。界面活性劑起分散及溶解活性劑之作用，且可選自任何適合之脂族、環脂族或芳族界面活性劑，包括但不限於不同鏈長(例如約C14至約C20)之生物相容性溶血磷脂醯膽鹼(LPG)。聚合物衍生之脂質(諸如PEG-脂質)亦可用於形成微胞，因為其將起抑制微胞/膜融合之作用，且因為將聚合物添加至界面活性劑分子會降低界面活性劑之CMC且有助於形成微胞。較佳為具有微莫耳範圍之CMO的界面活性劑；較高CMC界面活性劑可用於製備包埋在本發明脂質體內的微胞。

根據本發明之脂質體可藉由此項技術中已知的多種技術中之任一者來製備。參見例如美國專利第4,235,871號；公開之PCT申請案WO 96/14057；New RRC, Liposomes: A practical approach, IRL Press, Oxford (1990), 第33-104頁；Lasic DD, Liposomes from physics to applications, Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam, 1993。舉例而言，本發明脂質體可藉由將用親水性聚合物衍生之脂質擴散於預先形成之脂質體中，諸如藉由將預先形成之脂質體暴露於由脂質接枝聚合物構成之微胞(脂質濃度對應於脂質體中所需之衍生脂質之最終莫耳百分比)來製備。含有親水性聚合物之脂質體亦可藉由如此項技術中已知之均質化、脂質場水合或擠壓技術形成。

在另一例示性調配程序中，首先藉由音波處理將活性劑分散於容易溶解疏水分子之溶血磷脂醯膽鹼或其他低CMC界面活性劑(包括聚合物接枝的脂質)中。隨後，將所得活性劑之微胞懸浮液用於使含有適合莫耳百分比之聚合物接枝的脂質或膽固醇的乾燥脂質樣品復水。隨後使用此項技術中已知的擠出技術將脂質及活性劑懸浮液形成脂質體，且藉由標準管柱分離將所得脂質體與未囊封之溶液分離。

在本發明之一個態樣中，脂質體經製備具有在所選尺寸範圍內之基本上均勻的尺寸。一種有效定尺寸方法涉及擠壓脂質體之水性懸浮液穿過一系列具有選定均勻孔隙尺寸之聚碳酸酯膜，該膜之孔隙尺寸大致與藉由擠壓穿過該膜產生之最大脂質體尺寸相對應。參見例如美國專利第4,737,323號(1988年4月12日)。在某些實施例中，可使用諸如DharmaFECT®及Lipofectamine®之試劑將多核苷酸或蛋白質引入細胞中。

本發明調配物之釋放特徵視囊封材料、囊封藥物之濃度及釋放調節劑之存在而定。舉例而言，可例如使用僅在如胃中之低pH或如腸中之較高pH下釋放之pH敏感包衣將釋放調節為pH依賴性。可使用腸溶包衣來防止在通過胃之前發生釋放。可使用囊封於不同材料中之多個氰胺包衣或混合物在胃中獲得初始釋放，繼而隨後在腸中釋放。亦可藉由包含鹽或造孔劑來操控釋放，該等鹽或造孔劑可藉由自膠囊擴散來增加水吸收或藥物釋放。亦可使用調節藥物溶解度之賦形劑來控制釋放速率。亦可併入增強基質降解或自基質釋放之試劑。其可添加至藥物中，作為單獨的相(亦即作為微粒)添加，或可共溶於聚合物相中，視化合物而定。在大多數情況下，量應在0.1%與30% (w/w聚合物)之間。降解增強劑之類型包括無機鹽，諸如硫酸銨及氯化銨；有機酸，諸如檸檬酸、苯甲酸及抗壞血酸；無機鹼，諸如碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸鈣、碳酸鋅、及氫氧化鋅；及有機鹼，諸如硫酸魚精蛋白、精胺、膽鹼、乙醇胺、二乙醇胺及三乙醇胺；及界面活性劑，諸如Tween®及Pluronic®。將微觀結構添加至基質的造孔劑(亦即水溶性化合物，諸如無機鹽及糖)係以微粒形式添加。範圍通常在1%與30% (w/w聚合物)之間。

亦可藉由改變粒子在消化道中之停留時間來操控吸收。此可例如藉由用黏膜黏附聚合物將粒子包覆包衣或選擇黏膜黏附聚合物作為囊封材料來達成。實例包括大部分具有自由羧基之聚合物，諸如聚葡萄胺糖、纖維素，且尤其包括聚丙烯酸酯(如本文所用，聚丙烯酸酯係指包括丙烯酸酯基及經改質丙烯酸酯基(諸如氰基丙烯酸酯基及甲基丙烯酸酯基)之聚合物)。

反義寡核苷酸可經調配以包含在手術或醫療裝置或植入物內，或適於藉由手術或醫療裝置或植入物釋放。在某些態樣中，可用反義寡核苷酸塗佈或以其他方式處理植入物。舉例而言，水凝膠或其他聚合物，諸如生物相容性及/或生物可降解聚合物，可用於用本發明之醫藥組合物塗佈植入物(亦即該組合物可適於藉由使用水凝膠或其他聚合物與醫療裝置一起使用)。用於用藥劑塗佈醫療裝置之聚合物及共聚物為此項技術中熟知的。植入物之實例包括但不限於支架、藥物溶離支架、縫合線、假體、血管導管、透析導管、血管移植物、假體心臟瓣膜、心臟起搏器、可植入心律轉複除顫器、IV針、用於骨定型及形成之裝置(諸如銷、螺釘、板及其他裝置)以及用於傷口癒合之人造組織基質。

除本文所提供之方法以外，根據本發明使用之反義寡核苷酸可與其他醫藥類似地調配用於以任何方便的方式投藥以用於人類醫學或獸醫學中。反義寡核苷酸及其相應調配物可單獨或與治療肌肉萎縮症之其他治療策略組合投與，諸如成肌細胞移植、幹細胞療法、投與胺基醣苷抗生素、蛋白酶體抑制劑及上調療法(例如上調肌營養相關蛋白，肌縮蛋白之一種常染色體旁系同源物)。

在一些實施例中，額外治療劑可在投與本發明之反義寡核苷酸之前、同時或之後投與。舉例而言，反義寡核苷酸可與類固醇及/或抗生素組合投與。在某些實施例中，反義寡核苷酸投與具有背景類固醇理論(例如間歇性或長期/持續背景類固醇療法之患者。舉例而言，在一些實施例中，患者在投與反義寡聚物之前已用皮質類固醇治療，且繼續接受類固醇療法。在一些實施例中，類固醇為糖皮質激素或潑尼松(prednisone)。

所描述之投藥途徑預期僅作為指導，因為熟習此項技術者將能夠容易地確定最佳投藥途徑及用於任何特定動物及病況之任何劑量。已嘗試多種用於活體外及活體內將功能性新遺傳物質引入細胞的方法(Friedmann (1989) Science, 244:1275-1280)。此等方法包括將有待表現之基因整合至經修飾之反轉錄病毒中(Friedmann (1989)見上文；Rosenberg (1991) Cancer Research 51(18), 增刊: 5074S-5079S)；整合至非逆轉錄病毒載體(例如腺相關病毒載體)中(Rosenfeld等人, (1992) Cell, 68:143-155；Rosenfeld等人, (1991) Science, 252:431-434)；或經由脂質體遞送與異源啟動子-強化子元件連接之轉殖基因(Friedmann (1989), 見上文；Brigham等人, (1989) Am. J. Med. Sci., 298:278-281；Nabel等人, (1990) Science, 249:1285-1288；Hazinski等人, (1991) Am. J. Resp. Cell Molec. Biol., 4:206-209；及Wang及Huang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 84:7851-7855)；與基於陽離子之配體特異性轉運系統偶合(Wu及Wu (1988) J. Biol. Chem., 263:14621-14624)或使用裸DNA表現載體(Nabel等人(1990), 見上文)；Wolff等人(1990) Science, 247:1465-1468)。將轉殖基因直接注射至組織中僅產生局部表現(Rosenfeld (1992)見上文)；Rosenfeld等人(1991)見上文；Brigham等人(1989)見上文；Nabel (1990)見上文；及Hazinski等人(1991)見上文)。Brigham等人小組(Am. J. Med. Sci. (1989) 298:278-281及Clinical Research (1991) 39 (摘要))已報導在靜脈內或氣管內投與DNA脂質體複合物後僅對小鼠肺進行活體內轉染。人類基因療法程序之綜述文章的一個實例為：Anderson, Science (1992) 256:808-813。

在另一個實施例中，本發明之醫藥組合物可另外包含如Han等人, Nat. Comms. 7, 10981 (2016)中所提供之碳水化合物，其全部內容以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，本發明之醫藥組合物可包含5%己糖碳水化合物。舉例而言，本發明之醫藥組合物可包含5%葡萄糖、5%果糖或5%甘露糖。在某些實施例中，本發明之醫藥組合物可包含2.5%葡萄糖及2.5%果糖。在一些實施例中，本發明之醫藥組合物可包含選自以下之碳水化合物：以5體積%之量存在的阿拉伯糖、以5體積%之量存在的葡萄糖、以5體積%之量存在的山梨糖醇、以5體積%之量存在的半乳糖、以5體積%之量存在的果糖、以5體積%之量存在的木糖醇、以5體積%之量存在的甘露糖、各以2.5體積%之量存在的葡萄糖及果糖之組合、以及以5.7體積%之量存在的葡萄糖、以2.86體積%之量存在的果糖及以1.4體積%之量存在的木糖醇之組合。 IV. 套組

本發明亦提供用於治療患有遺傳疾病(例如DMD)之患者的套組，該套組包含至少一種封裝在適合容器中之反義分子(例如格羅狄森)以及其使用說明書。套組亦可含有外周試劑，諸如緩衝劑、穩定劑等。本領域一般技術者應瞭解，上述方法之應用廣泛應用於鑑定適用於治療許多其他疾病之反義分子。實例

所有實例均來源於以下正在進行的首次人類臨床試驗，該試驗測試SRP-4053之安全性及功效。本文報導之結果在第48週在研究之第2部分期間獲得。 SRP-4053在DMD患者中之I/II期研究 ClinicalTrials.gov識別符：NCT02310906

此為評定SRP-4053在具有適合於外顯子53跳躍之缺失的杜興氏肌肉萎縮症(DMD)患者中之安全性、耐受性、功效及藥物動力學的首次人類多劑量2部分研究。材料及方法研究藥物

原料藥格羅狄森(又名SRP-4053)為具有本文所述之化學結構的PMO，由Sarepta Therapeutics, Inc供應。格羅狄森藥品以50 mg/mL之濃度調配為在一次性小瓶中供應之無菌、等張的磷酸鹽緩衝水溶液。在臨床環境中經由IV輸注投藥之前，用生理鹽水(0.9%氯化鈉注射液)稀釋藥品。患者：資格

符合條件的患者為6至15歲，具有適合於跳躍外顯子53之DMD基因的框架外缺失。入選準則 ： · 藉由基因型確認診斷患有DMD。 · 左右二頭肌或另一上臂肌群完整。 · 肺及心臟功能穩定。 · 在研究方案中所規定之6MWT、北極星移動評定及起立(Gowers)測試之表現最差。 · 服用穩定劑量之皮質類固醇至少6個月。排除準則： · 先前用實驗藥劑BMN-195 (SMT C1100)或PRO053治療。 · 目前或先前在研究開始前12週內用任何其他實驗性治療進行治療。 · 在最近3個月內進行重大手術。 · 存在其他臨床重大疾病。 · 在最近3個月內物理療法方案發生重大變化。可應用其他入選及排除準則。研究設計

研究設計之彙總展示於圖1及緊接下方的表格中。詳細描述：

第 1 部分： 隨機、安慰劑對照之劑量滴定以評定4種劑量水準之SRP-4053在基因型確認的具有適合於外顯子53跳躍之缺失的DMD患者中的安全性、耐受性及藥物動力學。篩選 / 基線：

具有經確認適合於外顯子53篩選之突變的DMD患者參與4至6週的篩選期以確保合格。進行治療前腿部肌肉MRI及肌肉MRS (在具有MRS能力之選擇部位)且獲得皮膚及肌肉活檢體。進行功能測試(6分鐘行走測試[6MWT]、北極星移動評定[NSAA]及其他功能量測，且採集潛在疾病相關生物標記物的血液樣品。亦在篩選期間進行肺功能測試(PFT)、心動回聲圖(ECHO)及ECG。劑量滴定：

患者隨機分組(2:1)以接受SRP-4053或安慰劑。患者接受劑量水準遞增之安慰劑或SRP-4053的每週IV輸注，各持續至少2週：第1-2週每週4 mg/kg；第3-4週每週10 mg/kg；第5-6週每週20 mg/kg；及自第7週開始，每週30 mg/kg。一旦最後一名患者接受30 mg/kg之第二劑量，獨立的DMC在第2部分開始給藥之前審查第1部分的累積安全性資料。DMC審查第1部分之安全性資料，且建議在研究之開放標記段(第2部分)進行每週一次30 mg/kg IV輸注。

第 2 部分： 與具有不適合於外顯子53跳躍之缺失的未治療之對照DMD患者相比，SRP-4053在來自第1部分之患者連同新入選的具有適合於外顯子53跳躍之缺失的DMD患者中的開放標記評估。

第2部分為每週一次SRP-4053 30 mg/kg IV輸注在患者中之安全性及功效與具有不適合於外顯子53跳躍之突變的未治療之DMD患者並行對照組相比的144週開放標記評估。篩選 / 基線：

來自第1部分之患者(SRP-4053及安慰劑)繼續進入第2部分。新的具有適合於外顯子53跳躍之缺失的DMD患者入選開放標記SRP-4053治療，治療組中總共25名患者。具有不適合於外顯子53跳躍之缺失，否則符合資格準則的至多24名DMD患者亦入選第2部分以充當未治療之對照組。所有新的第2部分患者的資格在4至6週的篩選期期間得以確認。持續 144 週的開放標記治療：

在第2部分中，治療組中之所有患者以IV輸注形式接受每週一次30 mg/kg的SRP-4053，持續144週。新的第2部分經治療之患者在基線進行皮膚及肌肉活組織檢查，且所有經治療之患者均需要在第2部分第48週進行第二次肌肉活組織檢查。患者亦進行功能測試(如上文第1部分所述)及PFT，且每12至24週進行一次ECG。在研究過程中持續監測及收集不良事件及伴隨藥物治療。在確認研究資格後，除體檢及實驗室評定時程縮短且無PK採樣或活組織檢查以外，未治療之對照組中的患者進行與第2部分中經治療之患者相同的研究程序。主要結果量度： · 不良事件發生率[時間範圍：約12週(第1部分)] · 臨床實驗室異常(血液學、化學、凝血、尿分析)之發生率[時間範圍：約12週(第1部分)] · 生命徵象及體檢異常之發生率[時間範圍：約12週(第1部分)] · ECG及ECHO異常之發生率[時間範圍：約12週(第1部分)] · 6分鐘行走測試(6MWT)自基線之變化[時間範圍：基線至第144週(第2部分)] · 藉由西方墨點測定肌縮蛋白水準[時間範圍：基線至第48週(第2部分)]次要結果量度： · 血漿中之藥物濃度[時間範圍：約12週(第1部分)] · 肺功能測試[時間範圍：基線至第144週(第2部分)] 最大呼氣壓力(MEP)%，最大吸氣壓力(MIP)% · 藉由IHC測定肌縮蛋白陽性纖維之百分比[時間範圍：基線至第48週(第2部分)] · 外顯子53跳躍[時間範圍：基線至第48週(第2部分)] 其他結果量度： · 不良事件發生率[時間範圍：144週(第2部分)] · 臨床實驗室異常(血液學、化學、凝血、尿分析)之發生率[時間範圍：144週(第2部分)] · 生命徵象及體檢異常之發生率[時間範圍：144週(第2部分)] · ECG及ECHO異常之發生率[時間範圍：144週(第2部分)] · 免疫原性[時間範圍：144週(第2部分)] 實例1：生化功效評定

自25名參與多部位首次人類試驗評估每週藉由靜脈內輸注投與30 mg/kg SRP-4053之安全性、耐受性及肌縮蛋白產生的患者獲得基線及治療中肱二頭肌的配對肌肉活檢體(ClinicalTrials.gov識別符：NCT02310906)。對於每次手術，切除兩塊肌肉：A塊及B塊。對於所有分析，分別分析A塊及B塊。

藉由最佳化方法檢查肌肉活檢體以評定肌縮蛋白量(西方墨點，主要生物學端點)及外顯子跳躍(RT-PCR)。新穎的自動化影像分析(MuscleMap™)使用免疫組織化學來評定肌縮蛋白之定位(平均纖維強度)。

對於西方墨點分析：A塊及B塊在一式兩份凝膠上運行 = 4次測試取平均值

對於RT-PCR分析：A塊及B塊一式四份地運行= 8次測試取平均值

對於IHC分析：A塊及B塊在1級及2級運行= 4次測試取平均值基線特徵：

經格羅狄森治療之群組中25名患者的基線特徵彙總在表1中。呈現適合於外顯子53跳躍之五種不同的基因型(在45-52；48-52；49-52；50-52；及52處之突變缺失)。十七名患者最初接受研究第1部分中之安慰劑，隨後轉換成SRP-4053治療，或入選SRP-4053治療研究之第2部分。八名患者在研究之第1部分及第2部分接受SRP-4053。總共25名患者接受SRP-4053。表1.基線人口統計學及疾病特徵 1. 基線為第一劑研究藥物(安慰劑或SRP-4053)之前的最後記錄值 2. 基線為第一劑研究藥物(安慰劑或SRP-4053)之前最後一次就診的第1天及第2天的平均值外顯子跳躍之測定： RT - PCR 分析：

在每一研究設計之基線及48週藉由RT-PCR量測外顯子跳躍。對於RT-PCR分析，使用Trizol試劑套組按照製造商方案自細胞分離RNA。使用NanoDrop測定RNA之濃度及純度。藉由RT-PCR用根據表2之突變配對正向引子及反向引子量測外顯子53跳躍。表2.用於偵測外顯子53跳躍之引子

經跳躍及未跳躍之產物產生根據表3之擴增子大小。表3.各患者突變之外顯子53跳躍及未跳躍之擴增子產物大小的彙總

在對RNA進行RT-PCR後，使用LabChip GX分析樣品，LabChip GX使用凝膠毛細管電泳。使用以下等式計算外顯子跳躍百分比：(經跳躍之條帶的曲線下面積)/(經跳躍及未跳躍之條帶的曲線下面積)×100。

RT-PCR結果之彙總顯示於表4中。接受至少48週劑量之SRP-4053的所有25名患者在外顯子跳躍中呈現超過基線水準的增加(p＜0.001)。表4.RT-PCR結果確認DMD患者之外顯子跳躍

圖2展示研究中25名患者中每一名的RT-PCR資料(基線及SRP-4053治療後48週)，由此確定其外顯子跳躍相對於基線水準的增加(p＜0.001)。肌縮蛋白產生之測定：西方墨點分析

對於西方墨點分析，組織以約5 mm直徑之9至18×20 μm組織切片於133 μL緩衝液中之比率用均質化緩衝液(4% SDS、4 M尿素、125 mM tris-HCl (pH 6.8))均質化。收集相應溶解物，且使用RC DC蛋白質分析套組按照製造商的說明書(BioRad Cat. 500-0122)進行蛋白質定量。使用均質化緩衝液1:10稀釋組織提取物樣品，使其落入BSA標準曲線之範圍內。製備樣品，使得28 µl樣品含有40 µg蛋白質、1×最終濃度NuPAGE LDS樣品緩衝液(Life Technologies Cat. NP0008, Carlsbad, California, USA)及1×最終濃度NuPAGE還原劑(10×) (Life Technologies Cat. NP0004)。將蛋白質樣品在105℃下加熱5分鐘後，將樣品離心且將清液層負載於NuPAGE Novex 12孔、1 mm、微型3-8%聚丙烯醯胺參乙酸酯凝膠(Life Technologies Cat. EA0375)上，每一泳道負載40 μg總蛋白。凝膠在室溫下在150伏下運行，直至染料前端離開凝膠。使用NuPAGE轉移緩衝液(Life Technologies NP006-1)、10%甲醇及0.1% NuPAGE抗氧化劑(Life Technologies NP0005)將所得蛋白質凝膠在室溫下在30伏下轉移至PVDF膜(Life Technologies Cat. LC2007)，持續75分鐘。

在蛋白質轉移後，將PVDF膜浸沒於TTBS緩衝液(1× TBS (Amresco Cat. J640-4L)，0.1% (v/v) tween-20)中。將膜轉移至阻斷緩衝液(含5% (w/v)脫脂奶粉(Lab Scientific Cat. M0841)之TTBS)且在4℃下輕輕搖動浸泡隔夜。在阻斷後，將膜在室溫下在使用阻斷緩衝液1:20稀釋的DYS1 (Leica Cat. NCL-DYS1)中培育60分鐘，或在室溫下在用阻斷緩衝液1:100,000稀釋的抗α輔肌動蛋白抗體(Sigma-Aldrich Cat. NA931V)中培育20分鐘，隨後洗滌六次(每次用TTBS洗滌五分鐘)。使用阻斷緩衝液1:40,000稀釋與辣根過氧化酶(GE Healthcare Cat. NA931V)結合之抗小鼠IgG，且將其添加至膜中45分鐘(DYS1)或15分鐘(α-輔肌動蛋白)，隨後再洗滌六次。使用ECL Prime Western偵測套組(GE Healthcare Cat. RPN2232)，將膜暴露於凝膠且相應地顯影。使用ImageQuant TL Plus軟體(版本8.1)掃描及分析顯影膜，且使用Graphpad軟體進行線性回歸分析。

各西方墨點凝膠包括使用自正常組織提取及摻入DMD組織提取物中用於4%、2%、1%、0.5%、0.25%之最終正常對照之總蛋白製備的5點肌縮蛋白標準曲線(參見例如圖5A及圖5B)。如上所述處理標準曲線樣品。呈正常對照肌縮蛋白水準之百分比(%NC)形式的肌縮蛋白水準係藉由將肌縮蛋白條帶強度與凝膠標準曲線相比較來確定。

如藉由西方墨點所量測之正常肌縮蛋白的平均%自基線之0.09%增加至治療中的1.02% (範圍0.09-4.3%)，代表自基線+0.93%之平均變化(p＜0.001)。

西方墨點結果之彙總顯示於表5中。如藉由西方墨點所量測，患者表現出肌縮蛋白相對於基線之統計學上顯著的增加。表5.西方墨點結果確認DMD患者之肌縮蛋白產生

圖3展示研究中25名患者中每一名的西方墨點資料(基線及SRP-4053治療後48週)，由此確定其肌縮蛋白相對於基線之統計學上顯著的增加。

觀察到外顯子跳躍與重生肌縮蛋白之間的正相關(Spearman-r = 0.500，p =0.011)。

對平均纖維強度之分析顯示重生肌縮蛋白高於基線之統計學上顯著之增加(p＜0.001)，且肌縮蛋白正確地定位於肌纖維膜(圖4A-5B)。

在所有患者中均觀察到外顯子跳躍及肌纖維膜肌縮蛋白定位。

IHC陽性肌縮蛋白纖維百分比之彙總顯示於表6中。如藉由IHC所量測，所有患者均表現出陽性肌縮蛋白纖維百分比相對於基線之統計學上顯著之增加。表6.IHC結果

如表5及6以及圖4A-5B中可見，西方墨點資料與PDPF及強度相關，表明DMD患者之肌縮蛋白產生由用SRP-4053治療引起。 *********************

本說明書中所引用之所有公開案及專利申請案均以引用的方式併入本文中，就如同各個別公開案或專利申請案特定地且個別地指示以引用的方式併入一般。

圖 1 為DMD患者研究設計中SRP-4053之I/II期研究的流程圖概述。

圖 2 描繪上述研究中25名患者中之每一者的RT-PCR資料(基線及SRP-4053治療後48週)

圖 3 描繪上述研究中25名患者中之每一者的西方墨點資料(基線及SRP-4053治療後48週)。

圖 4A 描繪來自基線及治療中之單個患者(實例1)的肌肉活檢體針對層黏連蛋白進行染色以顯示總肌纖維的免疫螢光染色。

圖 4B 描繪來自圖4A之肌肉活檢體的切片(1-3)針對肌縮蛋白進行染色的免疫螢光染色。

圖 5A 描繪來自基線及治療中之單個患者(實例2)的肌肉活檢體針對層黏連蛋白進行染色以顯示總肌纖維的免疫螢光染色。

圖 5B 描繪來自圖5A之肌肉活檢體的切片(1-3)針對肌縮蛋白進行染色的免疫螢光染色。

Claims

一種用於治療有需要之患者之杜興氏肌肉萎縮症(DMD)的方法，該患者具有適合於外顯子53跳躍之DMD基因突變，該方法包含向該患者投與一定劑量的格羅狄森(golodirsen)或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項1之方法，其中該劑量係以4 mg/kg該患者體重之劑量投與。
如請求項1之方法，其中該劑量係以10 mg/kg該患者體重之劑量投與。
如請求項1之方法，其中該劑量係以20 mg/kg該患者體重之劑量投與。
如請求項1之方法，其中該劑量係以30 mg/kg該患者體重之劑量投與。
如請求項1之方法，其中該劑量係以40 mg/kg該患者體重之劑量投與。
如請求項1之方法，其中該劑量係以50 mg/kg該患者體重之劑量投與。
如請求項1至7之方法，其中該劑量係作為單劑量投與。
如請求項1至8之方法，其中該劑量係每週投與一次。
如請求項1至9之方法，其中該劑量係靜脈內投與的。
如請求項10之方法，其中該劑量係藉由輸注靜脈內投與的。
如請求項11之方法，其中該劑量係藉由輸注經35至60分鐘之時段靜脈內投與的。
如請求項8之方法，其中該劑量係藉由皮下注射靜脈內投與的。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者至多40歲。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者至多30歲。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者至多21歲。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者為1至21歲。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者為5至21歲。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者為6至15歲。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者具有選自由以下組成之群之DMD基因的突變：外顯子3至52、4至52、5至52、6至52、9至52、10至52、11至52、13至52、14至52、15至52、16至52、17至52、19至52、21至52、23至52、24至52、25至52、26至52、27至52、28至52、29至52、30至52、31至52、32至52、33至52、34至52、35至52、36至52、37至52、38至52、39至52、40至52、41至52、43至52、42至52、45至52、47至52、48至52、49至52、50至52、54至58、54至61、54至63、54至64、54至66、54至76、54至77及外顯子52。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係長期投與格羅狄森。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森至少48週。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過一年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過兩年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過三年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過四年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過五年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過十年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過二十年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過三十年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者在投與格羅狄森之前服用穩定劑量之皮質類固醇至少6個月。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者在投與格羅狄森之前服用穩定劑量之皮質類固醇至少6個月且在投與格羅狄森期間保持服用皮質類固醇。
如前述請求項中任一項之方法，其中格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽調配為醫藥組合物。
如前述請求項中任一項之方法，其中格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽調配為醫藥組合物。
如前述請求項中任一項之方法，其中格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽調配為具有50 mg/mL濃度之醫藥組合物。
如請求項33之方法，其中格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽調配為具有50 mg/mL濃度且以100 mg/2 mL之劑型存在的醫藥組合物。
如請求項33之方法，格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽具有50 mg/mL濃度且以500 mg/2 mL之劑型存在。
如請求項35或36之方法，其中該劑型包含在單次用小瓶中。
如請求項33至37之方法，其中格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽調配為包含格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
如請求項38之方法，其中該醫藥學上可接受之載劑為磷酸鹽緩衝溶液。
一種用於恢復mRNA閱讀框架以在患有杜興氏肌肉萎縮症(DMD)之有需要之患者中誘導外顯子跳躍的方法，該患者具有適合於外顯子53跳躍之DMD基因突變，該方法包含向該患者投與一定劑量的格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項40之方法，其中該劑量係以4 mg/kg該患者體重之劑量投與。
如請求項40之方法，其中該劑量係以10 mg/kg該患者體重之劑量投與。
如請求項40之方法，其中該劑量係以20 mg/kg該患者體重之劑量投與。
如請求項40之方法，其中該劑量係以30 mg/kg該患者體重之劑量投與。
如請求項40之方法，其中該劑量係以40 mg/kg該患者體重之劑量投與。
如請求項40之方法，其中該劑量係以50 mg/kg該患者體重之劑量投與。
如請求項40至46之方法，其中該劑量係作為單劑量投與。
如請求項40至47之方法，其中該劑量係每週投與一次。
如請求項40至48之方法，其中該劑量係靜脈內投與的。
如請求項49之方法，其中該劑量係藉由輸注靜脈內投與的。
如請求項50之方法，其中該劑量係藉由輸注經35至60分鐘之時段靜脈內投與的。
如請求項47之方法，其中該劑量係藉由皮下注射靜脈內投與的。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者至多40歲。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者至多30歲。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者至多21歲。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者為1至21歲。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者為5至21歲。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者為6至15歲。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者具有選自由以下組成之群之DMD基因的突變：外顯子3至52、4至52、5至52、6至52、9至52、10至52、11至52、13至52、14至52、15至52、16至52、17至52、19至52、21至52、23至52、24至52、25至52、26至52、27至52、28至52、29至52、30至52、31至52、32至52、33至52、34至52、35至52、36至52、37至52、38至52、39至52、40至52、41至52、43至52、42至52、45至52、47至52、48至52、49至52、50至52、54至58、54至61、54至63、54至64、54至66、54至76、54至77及外顯子52。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係長期投與格羅狄森。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森至少48週。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過一年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過兩年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過三年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過四年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過五年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過十年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過二十年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過三十年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者在投與格羅狄森之前服用穩定劑量之皮質類固醇至少6個月。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者在投與格羅狄森之前服用穩定劑量之皮質類固醇至少6個月且在投與格羅狄森期間保持服用皮質類固醇。
如前述請求項中任一項之方法，其中格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽調配為醫藥組合物。
如前述請求項中任一項之方法，其中格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽調配為醫藥組合物。
如前述請求項中任一項之方法，其中格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽調配為具有50 mg/mL濃度之醫藥組合物。
如請求項72之方法，其中格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽調配為具有50 mg/mL濃度且以100 mg/2 mL之劑型存在的醫藥組合物。
如請求項72之方法，格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽具有50 mg/mL濃度且以500 mg/2 mL之劑型存在。
如請求項74或75之方法，其中該劑型包含在單次用小瓶中。
如請求項72至76之方法，其中格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽調配為包含格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
如請求項77之方法，其中該醫藥學上可接受之載劑為磷酸鹽緩衝溶液。
如請求項40至78中任一項之方法，其中外顯子跳躍係藉由反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)來量測。
如請求項1至79中任一項之方法，其中該方法增加該患者之肌縮蛋白產生。
如請求項80之方法，其中該肌縮蛋白產生係藉由西方墨點分析來量測。
如請求項80之方法，其中該肌縮蛋白產生係藉由免疫組織化學(IHC)來量測。
一種用於增加患有杜興氏肌肉萎縮症(DMD)之有需要之患者的肌縮蛋白產生的方法，該患者具有適合於外顯子53跳躍之DMD基因突變，該方法包含向該患者投與一定劑量的格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項80之方法，其中該劑量係以4 mg/kg該患者體重之劑量投與。
如請求項80之方法，其中該劑量係以10 mg/kg該患者體重之劑量投與。
如請求項80之方法，其中該劑量係以20 mg/kg該患者體重之劑量投與。
如請求項80之方法，其中該劑量係以30 mg/kg該患者體重之劑量投與。
如請求項80之方法，其中該劑量係以40 mg/kg該患者體重之劑量投與。
如請求項80之方法，其中該劑量係以50 mg/kg該患者體重之劑量投與。
如請求項80至86之方法，其中該劑量係作為單劑量投與。
如請求項80至87之方法，其中該劑量係每週投與一次。
如請求項80至88之方法，其中該劑量係靜脈內投與的。
如請求項89之方法，其中該劑量係藉由輸注靜脈內投與的。
如請求項90之方法，其中該劑量係藉由輸注經35至60分鐘之時段靜脈內投與的。
如請求項89之方法，其中該劑量係藉由皮下注射靜脈內投與的。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者至多40歲。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者至多30歲。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者至多21歲。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者為1至21歲。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者為5至21歲。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者為6至15歲。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者具有選自由以下組成之群之DMD基因的突變：外顯子3至52、4至52、5至52、6至52、9至52、10至52、11至52、13至52、14至52、15至52、16至52、17至52、19至52、21至52、23至52、24至52、25至52、26至52、27至52、28至52、29至52、30至52、31至52、32至52、33至52、34至52、35至52、36至52、37至52、38至52、39至52、40至52、41至52、43至52、42至52、45至52、47至52、48至52、49至52、50至52、54至58、54至61、54至63、54至64、54至66、54至76、54至77及外顯子52。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係長期投與格羅狄森。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森至少48週。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過一年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過兩年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過三年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過四年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過五年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過十年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過二十年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者係投與格羅狄森超過三十年。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者在投與格羅狄森之前服用穩定劑量之皮質類固醇至少6個月。
如前述請求項中任一項之方法，其中該患者在投與格羅狄森之前服用穩定劑量之皮質類固醇至少6個月且在投與格羅狄森期間保持服用皮質類固醇。
如前述請求項中任一項之方法，其中格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽調配為醫藥組合物。
如前述請求項中任一項之方法，其中格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽調配為醫藥組合物。
如前述請求項中任一項之方法，其中格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽調配為具有50 mg/mL濃度之醫藥組合物。
如請求項113之方法，其中格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽調配為具有50 mg/mL濃度且以100 mg/2 mL之劑型存在的醫藥組合物。
如請求項113之方法，格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽具有50 mg/mL濃度且以500 mg/2 mL之劑型存在。
如請求項112或113之方法，其中該劑型包含在單次用小瓶中。
如請求項111至116之方法，其中格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽調配為包含格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
如請求項117之方法，其中該醫藥學上可接受之載劑為磷酸鹽緩衝溶液。
如請求項80至118中任一項之方法，其中該肌縮蛋白產生係藉由西方墨點分析來量測。
如請求項80至118中任一項之方法，其中該肌縮蛋白產生係藉由免疫組織化學(IHC)來量測。
如前述請求項中任一項之方法，其進一步包含在投與格羅狄森之前，確認該患者具有適合於外顯子53跳躍之DMD基因突變。
格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療有需要之患者的杜興氏肌肉萎縮症(DMD)，該患者具有適合於外顯子53跳躍之DMD基因突變，其中該治療包含每週一次向該患者投與30 mg/kg伊特普森(eteplirsen)之單次靜脈內劑量。
格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽，其用於恢復mRNA閱讀框架以在患有杜興氏肌肉萎縮症(DMD)之有需要之患者中誘導外顯子跳躍，該患者具有適合於外顯子53跳躍之DMD基因突變，其中該治療包含每週一次向該患者投與30 mg/kg伊特普森之單次靜脈內劑量。
格羅狄森或其醫藥學上可接受之鹽，其用於增加患有杜興氏肌肉萎縮症(DMD)之有需要之患者的肌縮蛋白產生，該患者具有適合於外顯子53跳躍之DMD基因突變，其中該治療包含每週一次向該患者投與30 mg/kg伊特普森之單次靜脈內劑量。