CN109477109B - 靶向人lmna的寡核苷酸类似物 - Google Patents

Abstract

提供了靶向LMNA的反义寡核苷酸，其用于降低编码早衰蛋白的一种或多种异常剪接的LMNA mRNA同种型的表达。

Description

靶向人LMNA的寡核苷酸类似物

关于序列表的声明

与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且据此以引用方式并入到本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是120178_503WO_SEQUENCE_LISTING.txt。所述文本文件为约6.5KB，于2017年4月26日创建，并且通过EFS web以电子方式提交。

技术领域

本公开大体上涉及靶向人核纤层蛋白A的反义化合物。

背景技术

早年衰老综合症(Hutchinson-Gilford progeria syndrome,HGPS)是一种罕见的遗传性病症，其特征是早发性动脉硬化和血管平滑肌细胞(SMC)的退化。HGPS本身最显著地表现为受影响儿童的加速、过早衰老。患有HGPS的儿童具有进行性症状，诸如生长迟缓、脱发、皮下脂肪减少和骨异常。平均寿命为12年，其中最常见的死亡原因是心肌梗塞或中风。

大多数HGPS病例是由核纤层蛋白A(LMNA)基因中的单点突变引起的，从而导致产生早衰蛋白(progerin)，其是核纤层蛋白A的截短剪接突变体。单点突变是核纤层蛋白A(LMNA)基因的外显子11中的从头沉默取代(1824C>T，Gly608Gly)。所述取代激活了隐蔽的剪接供体位点，这导致产生具有内部缺失50个氨基酸的显性失活突变体核纤层蛋白A蛋白。所述突变蛋白，命名为早衰蛋白，积聚在核膜上，从而引起特征性的核突起(nuclearblebbing)((Scaffidi和Misteli 2005；Cao,Blair等2011))。

已知可使用二氨基磷酸酯吗啉代寡核苷酸(phosphorodiamidate morpholinooligonucleotide,PMO)，或更具体地，剪接转换寡核苷酸(splice-switchingoligonucleotide,SSO)来校正异常剪接。SSO通过在位点处或附近杂交来阻断异常剪接位点，从而阻止由细胞剪接机构的识别。示例性SSO对核酸酶具有抗性，并且所得的双链结构消除了由RNA酶H进行RNA切割的可能性。已证明SSO在体外和体内均有效地修复地中海贫血和杜兴肌营养不良症的剪接模式。(Kinali,Arechavala-Gomeza等2009；Svasti,Suwanmanee等2009)。通过在细胞培养物(Scaffidi和Misteli 2005)和相关动物模型(Osorio,Navarro等2011)中使用靶向激活的隐蔽剪接位点的修饰反义寡核苷酸校正异常剪接事件，已显示与HGPS相关的LMNA的异常剪接减少。

PCT公开WO 2013/086441和WO 2013/086444公开了靶向人lmna的反义寡聚物和使用靶向人lmna的寡核苷酸类似物治疗早衰样核纤层蛋白病的方法，但没有公开本公开的反义寡聚物化合物和其使用方法。

鉴于LMNA在HGPS中的作用，需要调节LMNA前mRNA的剪接以消除早衰蛋白表达的寡核苷酸。

发明内容

本公开的实施方案整体涉及反义寡聚物药物组合物和使用其调节LMNA前mRNA的异常剪接的方法。在一个方面，本公开的特征在于一种具有10至40个核碱基的修饰的反义寡核苷酸。修饰的反义寡核苷酸包括与LMNA的前mRNA内的靶区域互补的靶向序列。

在某些实施方案中，反义寡聚物是式(I)的化合物：

或其药学上可接受的盐，

其中每个Nu是核碱基，它们一起形成靶向序列；

Z是8至38的整数；

T选自：

并且

G是选自-C(O)(CH₂)₅NH-CPP-R^a、-C(O)(CH₂)₂NH-CPP-R^a、-C(O)(CH₂)₂NHC(O)(CH₂)₅NH-CPP-R^a、-C(O)CH₂NH-CPP-R^a和以下结构的细胞穿透肽(“CPP”)和接头部分：

其中CPP通过CPP羧基末端处的酰胺键连接到接头部分，并且R^a通过酰胺键连接到CPP氨基末端，其中R^a选自H、乙酰基、苯甲酰基和硬脂酰基。在一些实施方案中，R^a是乙酰基。

在各个方面，本公开的反义寡核苷酸包括式(II)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

其中每个Nu是核碱基，它们一起形成靶向序列；

Z是8至38的整数；并且

G是选自-C(O)(CH₂)₅NH-CPP-R^a、-C(O)(CH₂)₂NH-CPP-R^a、

C(O)(CH₂)₂NHC(O)(CH₂)₅NH-CPP-R^a、-C(O)CH₂NH-CPP-R^a和以下结构的细胞穿透肽(“CPP”)和接头部分：

其中CPP通过CPP羧基末端处的酰胺键连接到接头部分，并且R^a通过酰胺键连接到CPP氨基末端，其中R^a选自H、乙酰基、苯甲酰基和硬脂酰基。在一些实施方案中，R^a是乙酰基。

在一些实施方案中，CPP选自SEQ ID NO:5-21。在一些实施方案中，G选自SEQ IDNO:22-25。

在各种实施方案中，G(如式(I)和(II)中所述)选自：

C(O)CH₂NH-CPP和下式：

其中CPP通过CPP羧基末端处的酰胺键连接到接头部分，并且R^a通过酰胺键连接到CPP氨基末端，并且其中CPP-R^a选自：

(-R₆-R^a)，其中R^a选自H、乙酰基、苯甲酰基和硬脂酰基。在一些实施方案中，R^a是乙酰基。

在一些实施方案中，G(如式(I)和(II)中所述)具有下式：

其中R^a选自H、乙酰基、苯甲酰基和硬脂酰基，并且J是4至9的整数。在某些实施方案中，J是6。

在各种实施方案中，CPP-R^a(如式(I)和(II)中所述)具有下式：

其中R^a选自H、乙酰基、苯甲酰基和硬脂酰基，并且J是4至9的整数。在某些实施方案中，CPP是SEQ ID NO:11。在各种实施方案中，J是6。在一些实施方案中，R^a选自H和乙酰基。例如，在一些实施方案中，R^a是H。在某些实施方案中，R^a是乙酰基。

在一些实施方案中，G选自SEQ ID NO:22-25。在某些实施方案中，G是SEQ ID NO:25。

在某些实施方案中，G是在寡聚物的3’端处共价键合到本公开的反义寡聚物的-C(O)CH₂NH-R₆-R^a，其中R^a是H、乙酰基、苯甲酰基或硬脂酰基以封端R₆的氨基末端。在一些实施方案中，R^a是乙酰基。在这些非限制性实例中，CPP-R^a是–R₆-R^a并且接头是-C(O)CH₂NH-，(即甘氨酸)。G＝-C(O)CH₂NH-R₆-R^a的这个具体实例还由以下结构例示：

其中R^a选自H、乙酰基、苯甲酰基和硬脂酰基。在一些实施方案中，R^a是乙酰基。

在各种实施方案中，CPP-R^a是-R₆-R^a，还例示为下式：

其中R^a选自H、乙酰基、苯甲酰基和硬脂酰基。在某些实施方案中，CPP是SEQ IDNO:11。在一些实施方案中，R^a是乙酰基。

在一些实施方案中，CPP-R^a是–(RXR)₄-R^a，还例示为下式：

在各种实施方案中，CPP-R^a是–R-(FFR)₃-R^a，还例示为下式：

在一些实施方案中，本公开的反义寡聚物(包括例如，式(I)和(II)的反义寡聚物的一些实施方案)的靶向序列，选自：

a)SEQ ID NO:3(CTGAGCCGCTGGCAGATGCCTTGTC)其中Z是23；和

b)SEQ ID NO:4(GAGGAGATGGGTCCACCCACCTGGG)其中Z是23。

在本公开的另一方面，提供了治疗疾病(诸如与人LMNA相关的疾病或病状)的方法。在某些实施方案中，所述方法用于治疗早衰样疾病或相关病状，诸如早衰样核纤层蛋白病(诸如HGPS)、年龄相关病状或心血管疾病(诸如动脉粥样硬化)。

在另外的方面，本公开提供了包含本公开反义寡聚物和药学上可接受的载体的药物组合物。

因此，在另一方面，在其他实施方案中，本公开还提供了通过施用包含如本文所述的反义寡核苷酸和药学上可接受的赋形剂的药物组合物来治疗早衰样核纤层蛋白病的方法。

本公开的这些和其他方面将在参考以下详述时变得显而易见。为此，本文阐述了各种参考文献，其更详细地描述了某些背景信息、程序、化合物和/或组合物并且各自据此全文以引用方式并入。

附图说明

图1示出来自用PPMO1(7mg/kg、20mg/kg或60mg/kg)、PPMO2(7mg/kg、20mg/kg或60mg/kg)或盐水对照处理12周的小鼠的心脏的核纤层蛋白A和早衰蛋白的ddPCR分析结果。

图2示出来自用PPMO1(7mg/kg、20mg/kg或60mg/kg)、PPMO2(7mg/kg、20mg/kg或60mg/kg)或盐水对照处理12周的小鼠的降主动脉的核纤层蛋白A和早衰蛋白的ddPCR分析结果。

图3示出来自用PPMO1(7mg/kg、20mg/kg或60mg/kg)、PPMO2(7mg/kg、20mg/kg或60mg/kg)或盐水对照处理12周的小鼠的四头肌的核纤层蛋白A和早衰蛋白的ddPCR分析结果。

图4示出来自用PPMO1(7mg/kg、20mg/kg或60mg/kg)、PPMO2(7mg/kg、20mg/kg或60mg/kg)或盐水对照处理12周的小鼠的肝脏的核纤层蛋白A和早衰蛋白的ddPCR分析结果。

具体实施方式

本公开涉及如本文所述的寡核苷酸和含有其的组合物以及体外方法，其中所述寡核苷酸例如通过调节LMNA前mRNA的剪接来抑制突变LMNA蛋白mRNA的表达。

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与由本公开所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管在实施或测试本公开时可使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但描述示例性方法和材料。出于本公开的目的，下文定义以下术语。

冠词“一(a/an)”在本文中用于指代冠词的一个或多于一个(即至少一个)语法对象。举例来说，“一个要素”意指一个要素或多于一个要素。

“约”意指份量、水平、数值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达参考份量、水平、数值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的30％、25％、20％、25％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

“编码序列”意指有助于编码基因的多肽产物的任何核酸序列。相比之下，术语“非编码序列”是指不有助于编码基因的多肽产物的任何核酸序列。

在整篇本说明书中，除非上下文另外需要，否则用词“包含”将被理解成暗示包括一个所述步骤或要素或一组步骤或要素，但不排除任何其他步骤或要素或任何其他组步骤或要素。

“由......组成”意指包括并限于短语“由......组成”之后的任何内容。因此，短语“由......组成”表示所列出的要素是必需的或强制性的，并且没有其他要素可以存在。“基本上由......组成”意指包括在所述短语之后列出的任何要素，并且限于不干扰或有助于本公开中针对所列出要素指定的活性或作用的其他要素。因此，短语“基本上由......组成”表示所列出要素是必需的或强制性的，但其他要素是任选的并且可以存在或不存在，这取决于它们是否实质上影响所列出要素的活性或作用。

术语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对原则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”互补。互补性可以是“部分的”，其中根据碱基配对原则仅匹配核酸碱基中的一些。或者，核酸之间可存在“完全”或“总”互补性。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交的效率和强度具有显著影响。尽管常常期望完美互补性，但一些实施方案可包括相对于靶RNA的一处或多处、但优选6、5、4、3、2或1处错配。包括在寡聚物内的任何位置处的变化。在某些实施方案中，寡聚物末端附近的序列变化通常优于内部的变化，并且如果存在，通常在5'和/或3'末端的约6、5、4、3、2或1个核苷酸内。

术语“细胞穿透肽”或“CPP”可互换使用并且是指阳离子细胞穿透肽，还称为转运肽、载体肽或肽转导结构域。如本文所示，所述肽具有在给定细胞培养群体的30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％(包括其间的所有整数)的细胞内诱导细胞穿透的能力，并且在全身施用时允许体内多个组织内的大分子易位。

术语“反义寡聚物”或“反义化合物”或“反义寡核苷酸”或“寡核苷酸”可互换使用，并且是指环状亚基的序列，每个环状亚基带有碱基配对部分，通过亚基间键相连，允许碱基配对部分通过Watson-Crick碱基配对与核酸(通常是RNA)中的靶序列杂交，以在靶序列内形成核酸:寡聚物异源双链体。环状亚基可基于核糖或另一种戊糖，或者在某些实施方案中，基于吗啉代基团(参见以下的吗啉代寡聚物的描述)。还考虑了肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)和2'-O-甲基寡核苷酸，以及本领域已知的其他反义试剂。

这种反义寡聚物可被设计成阻断或抑制mRNA的翻译或抑制天然前mRNA剪接加工，或诱导靶mRNA的降解，并且可以说是“针对”或“靶向”与其杂交的靶序列。在某些实施方案中，靶序列是围绕或包括mRNA的AUG起始密码子、加工前的mRNA的3'或5'剪接位点或分支点的区域。靶序列可在外显子内或内含子内或其组合。剪接位点的靶序列可包括mRNA序列，其具有在加工前mRNA中正常剪接受体接点下游1至约25个碱基对处的5'端部。剪接位点的示例性靶序列是加工前mRNA的任何区域，其包括剪接位点或完全包含在外显子编码序列内或跨越剪接受体或供体位点。当其以上述方式靶向靶标的核酸时，寡聚物更一般地被说成“靶向”生物相关靶标，诸如在本公开中，编码核纤层蛋白A蛋白的人LMNA基因前mRNA。示例性靶向序列包括SEQ ID NO:3或4

包括反义寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:3或4中的一个或多个、基本上由其组成或由其组成。还包括这些反义寡聚物的变体，包括与SEQ ID NO:3或4中的任一个具有80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％(包括其间的所有整数)序列同一性或序列同源性的变体寡聚物，和/或与这些序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的变体，优选调节细胞中早衰蛋白表达的那些变体。还包括SEQ ID NO:3或4中任一个或多个的寡核苷酸，其包含合适数量的阳离子或其他修饰的键，如本文所述，例如，每个2-5个不带电荷的键最多约1个，诸如每10个不带电荷的键约4-5个，和/或包含与其连接的细胞穿透转运肽，也如本文所述。

“PMO+”是指包含任何数量的(1-哌嗪基)亚膦酰氧、(1-(4-(ω-胍基-烷酰基))-哌嗪基)亚膦酰氧键(A2和A3)的二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物，其已在先前描述了(参见例如，PCT公开WO2008/036127，其全文以引用方式并入本文)。

“PMO-X”是指本文公开的二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物，其包含至少一个(B)键或所公开末端修饰中的至少一个，并且如PCT公开WO2011/150408和美国专利公开US2012/0065169中所公开，所述文献以引用的方式整体并入本文。可用于本文的其他PMO-X二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物可见于2011年11月18日提交的美国临时申请号61/561,806中，其全文以引用方式并入本文。

“氨基磷酸酯”基团包含具有三个连接的氧原子和一个连接的氮原子的磷，而“二氨基磷酸酯”基团包含具有两个连接的氧原子和两个连接的氮原子的磷。在本文和共同未决的美国临时申请号61/349,783和美国专利申请号11/801,885所述寡聚物的不带电荷或修饰的亚基间键中，一个氮总是悬挂在主链上。二氨基磷酸酯键中的第二个氮通常是吗啉代环结构中的环氮。

“硫代氨基磷酸酯”或“硫代二氨基磷酸酯”键分别是氨基磷酸酯或二氨基磷酸酯键，其中一个氧原子(通常是悬挂在骨架上的氧)被硫替换。

“亚基间键”是指连接两个吗啉代亚基的键，例如结构(I)。

如本文所用的“带电荷”、“不带电荷”、“阳离子”和“阴离子”是指在近中性pH(例如约6至8)下化学部分的主要状态。例如，所述术语可指在生理pH(也就是说，约7.4)下化学部分的主要状态。

如本文所用，“反义寡核苷酸”、“反义寡聚物”或“寡核苷酸”是指核苷酸或核苷酸类似物的线性序列，其允许核碱基通过Watson-Crick碱基配对与RNA中的靶序列杂交，以在靶序列内形成寡聚物:RNA异源双链体。术语“反义寡核苷酸”、“修饰的反义寡核苷酸”、“反义寡聚物”、“寡聚物”和“化合物”可互换使用以指代寡聚物。环状亚基可基于核糖或另一种戊糖，或者在某些实施方案中，基于吗啉代基团(参见以下的吗啉代寡聚物的描述)。

术语“寡核苷酸类似物”是指具有以下的寡核苷酸：(i)修饰的骨架结构，例如，除在天然寡核苷酸和多核苷酸中发现的标准磷酸二酯键之外的骨架，和(ii)任选地，修饰的糖部分，例如，吗啉代部分而不是核糖或脱氧核糖部分。寡核苷酸类似物通过Watson-Crick碱基配对至标准多核苷酸碱基支持能够氢键合的碱基，其中类似物骨架以允许寡核苷酸类似物分子与标准多核苷酸中的碱基之间以序列特异性方式进行这种氢键合的方式呈现碱基(例如，单链RNA或单链DNA)。示例性类似物是具有基本上不带电荷的含磷骨架的那些。

寡核苷酸类似物中基本上不带电荷的含磷骨架是其中亚基键中的大多数，例如其键的50-100％之间，通常至少60％至100％或75％或80％是不带电荷的，并且含有单个磷原子的骨架。反义寡核苷酸和寡核苷酸类似物可含有约8至40个亚基，通常约8-25个亚基，并且优选约12至25个亚基(包括其间的所有整数和范围)。在某些实施方案中，寡核苷酸可具有与靶序列的精确序列互补性或接近互补性，如以下所定义。

寡核苷酸的“亚基”是指包含嘌呤或嘧啶碱基配对部分的一个核苷酸(或核苷酸类似物)单元。所述术语可指具有或不具有连接的亚基间键的核苷酸单元，但当提及“带电荷亚基”时，所述电荷通常位于亚基间键(例如，磷酸酯或硫代磷酸酯键或阳离子键)内。

嘌呤或嘧啶碱基配对部分，在本文中还简称为“核碱基”、“碱基(base)”或“碱基(bases)”，可以是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶或肌苷。还包括碱诸如吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲基乙氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，核糖胸苷)、5-卤代尿苷(例如，5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿苷)、丙炔、Q核苷(quesosine)、2-硫尿核苷、4-硫尿核苷、怀丁苷、怀丁氧苷、4-乙酰替丁、5-(羧基羟甲基)尿苷、5'-羧甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧甲基氨基甲基尿苷、β-D-半乳糖Q核苷、1-甲基腺苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、3-甲基胞苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲基羰基甲基尿苷、5-甲基氧基尿苷、5-甲基-2-硫尿核苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、β-D-甘露糖基Q核苷、尿苷-5-羟乙酸、2-硫代胞苷、苏氨酸衍生物等(Burgin等,1996,Biochemistry,35:14090；Uhlman和Peyman,supra)。在这方面，“修饰的碱基”意指除腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)之外的核苷酸碱基，如上所述；此类碱基可在反义分子中的任何位置处使用。本领域技术人员将理解，取决于寡聚物的用途，T和U是可互换的。例如，对于其他反义化学物质，诸如更像RNA的2'-O-甲基反义寡核苷酸，T碱基可显示为U。

术语“靶向序列”是寡聚物或寡聚物类似物中与RNA基因组中的“靶序列”互补(另外，意指基本上互补)的序列。反义寡聚物的完整序列或仅一部分可与靶序列互补。例如，在具有20-30个碱基的寡聚物中，约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个可以是与靶区域互补的靶向序列。通常，靶向序列由寡聚物中的连续碱基形成，但可替代地可由非连续序列形成，所述序列当例如从寡聚物的相对端部放在一起时，构成跨越靶序列的序列。

“靶向序列”可与靶序列具有“接近”或“基本”互补性，并且出于本公开的目的仍然起作用，也就是说，仍然是“互补的”。优选地，本公开中采用的寡聚物类似物化合物与10个核苷酸中的靶序列具有至多一个错配，并且优选20个中的至多一个错配。可替代地，所采用的反义寡聚物与如本文指定的示例性靶向序列具有至少90％序列同一性，并且优选至少95％序列同一性。

如本文所用，术语“TEG”、“EG3”或“三甘醇尾”是指例如在其3'或5’-端部处与寡核苷酸缀合的三甘醇部分。例如，在一些实施方案中，“TEG”包括下式的部分：

“氨基酸亚基”或“氨基酸残基”可指α-氨基酸残基(-CO-CHR-NH-)或β-或其他氨基酸残基(例如，–CO-(CH₂)_nCHR-NH-)，其中R是侧链(其可包括氢)并且n是1至7，优选1至4。

术语“天然存在的氨基酸”是指存在于自然界中发现的蛋白质中的氨基酸，诸如在蛋白质生物合成期间利用的20种(L)-氨基酸以及其他氨基酸诸如4-羟基脯氨酸、羟赖氨酸、锁链素、异锁链素、同型半胱氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸。术语“非天然氨基酸”是指不存在于自然界中发现的蛋白质中的那些氨基酸，实例包括β-丙氨酸(β-Ala)、6-氨基己酸(Ahx)和6-氨基戊酸。“非天然氨基酸”的另外实例包括但不限于(D)-氨基酸、正亮氨酸、正缬氨酸、对氟苯丙氨酸、乙硫氨酸等，它们是本领域技术人员已知的。

“有效量”或“治疗有效量”是指作为单剂量或作为一系列剂量的一部分向哺乳动物受试者施用的治疗性化合物(诸如反义寡聚物)的量，其有效产生期望的治疗效果(例如，癌细胞对化学治疗剂的敏化作用)。对于反义寡聚物，通常通过抑制所选择靶序列的翻译或天然剪接加工来实现这种效果。靶向LMNA mRNA的“有效量”还涉及有效调节早衰蛋白表达的量。

“增强(enhance/enhancing)”或“增加(increase/increasing)”或“刺激(stimulate/stimulating)”通常是指一种或反义化合物或组合物与由无反义化合物或对照化合物引起的反应相比，在细胞中产生或引起更大生理反应(即下游效应)的能力。“增加”或“增强”的量通常是“统计上显著”的量，并且可包括是由无反义化合物(不存在试剂)或对照化合物产生量的1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多倍(例如，500、1000倍)(包括1与超过1之间的所有整数和小数点)，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加。

术语“减少”或“抑制”通常可涉及本公开的一种或多种反义化合物“降低”相关生理或细胞反应的能力，如根据诊断领域的常规技术所测量。相关的生理或细胞反应(体内或体外)对于本领域技术人员而言将显而易见，并且可包括例如通过mRNA和/或蛋白质水平测量的早衰蛋白表达的降低。与由无反义化合物或对照组合物产生的反应相比，反应中的“减少”可能是“统计学上显著的”，并且可包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％减少，包括其间的所有整数。

术语“靶序列”是指寡核苷酸或反义试剂所针对的靶RNA的一部分，也就是说，寡核苷酸将通过互补序列的Watson-Crick碱基配对而与其杂交的序列。在某些实施方案中，靶序列可以是包含内含子和外显子靶序列两者的前mRNA的连续区域。在某些其他实施方案中，靶序列将仅由内含子或外显子序列组成。

术语“靶向序列”或“反义靶向序列”是指寡核苷酸或其他反义试剂中与RNA基因组中的靶序列互补(另外，意指基本上互补)的序列。反义化合物的完整序列或仅一部分可与靶序列互补。例如，在具有20-30个碱基的寡核苷酸中，约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个碱基可以是与靶区域互补的靶向序列。通常，靶向序列由连续碱基形成，但可替代地可由非连续序列形成，所述序列当例如从寡核苷酸的相对端部放在一起时，构成跨越靶序列的序列。

当杂交以反平行构型发生时，靶序列和靶向序列被描述为彼此“互补”。靶向序列可与靶序列具有“接近”或“基本”互补性，并且出于本公开的目的仍然起作用，也就是说，其仍然可在功能上“互补”。在某些实施方案中，寡核苷酸可与10个核苷酸中的靶序列具有至多一个错配，并且优选20个中的至多一个错配。可替代地，寡核苷酸可与如本文所述的示例性反义靶向序列具有至少90％序列同一性，并且优选至少95％序列同一性。

如果寡聚物在生理条件下与靶杂交，则寡核苷酸与靶多核苷酸“特异性杂交”，其中Tm基本上大于45℃、优选至少50℃，并且通常为60℃-80℃或更高。这种杂交优选地对应于严格的杂交条件。在给定的离子强度和pH下，Tm是50％的靶序列与互补多核苷酸杂交时的温度。同样，这种杂交可以反义寡聚物与靶序列的“接近”或“基本”互补性，以及以精确的互补性发生。

“同源性”是指相同或构成保守取代的氨基酸的百分数。可使用序列比较程序诸如GAP确定同源性(Deveraux等,1984,Nucleic Acids Research 12,387-395)。以这种方式，可通过将空位插入到比对中来比较与本文引用的那些序列相似或基本上不同的序列，此类空位例如通过GAP使用的比较算法来确定。

如本文所用，术语“序列同一性”或例如包含“与之50％相同的序列”是指在比较窗口中序列在逐个核苷酸的基础上或逐个氨基酸的基础上相同的程度。因此，“序列同一性百分比”可通过以下来计算：比较比较窗口中的两个最佳比对序列、确定在两个序列中出现相同核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数量以得到匹配位置的数量、将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)，并且将结果乘以100以得到序列同一性百分比。

用于描述两种或更多种多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本同一性”。“参考序列”的长度为至少8或10但通常15至18且经常至少25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基。因为两个多核苷酸可各自包含(1)两个多核苷酸之间相似的序列(即，完整多核苷酸序列的仅一部分)，和(2)两个多核苷酸之间趋异的序列，因此两个(或更多个)多核苷酸之间的序列比较通常通过在“比较窗口”中比较两个多核苷酸的序列来进行以鉴定和比较序列相似性的局部区域。“比较窗口”是指至少6(通常约50至约100，更通常约100至约150)个连续位置的概念性片段，其中在两个序列最佳比对之后，将一个序列与相同数量的连续位置的参考序列比较。对于两个序列的最佳比对，比较窗口可包括与参考序列(其不包括添加或缺失)相比约20％或更少的添加或缺失(即，空位)。

用于比对比较窗口的序列的最佳比对可通过算法的计算机化实现(WisconsinGenetics Software Package Release 7.0,Genetics Computer Group,575 ScienceDrive Madison,WI,USA中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过检查和由所选择的各种方法中的任一种产生的最佳比对(即，导致比较窗口中的同源性百分比最高)来进行。还可参考BLAST程序家族，例如像Altschul等,1997,Nucl.Acids Res.25:3389所公开。序列分析的详细讨论可见于Ausubel等,“Current Protocols in Molecular Biology,”JohnWiley&Sons Inc,1994-1998,第15章。

“对核酸酶具有抗性”的寡聚分子(寡聚物)是指其骨架以非杂交或杂交形式；对由体内常见的细胞外和细胞内核酸酶引起的核酸酶切割基本上具有抗性的分子；也就是说，所述寡聚物在寡聚物暴露的体内在正常核酸酶条件下显示很少或没有核酸酶切割。

当试剂可通过除被动扩散穿过细胞膜之外的机制进入细胞时，试剂“被哺乳动物细胞主动摄取”。例如，可通过“主动转运”或“易化转运”来转运试剂，“主动转运”是指通过例如ATP依赖性转运机制使试剂转运穿过哺乳动物细胞膜，“易化转运”是指通过需要将试剂与转运蛋白结合，然后促进结合的试剂穿过膜的转运机制使反义试剂转运穿过细胞膜。对于主动和易化转运两者，寡核苷酸类似物优选地具有基本上不带电荷的骨架，如下所定义。

“异源双链体”是指反义寡核苷酸与靶RNA的互补部分之间的双链体。“对核酸酶具有抗性的异源双链体”是指由反义寡聚物与其互补靶标结合形成的异源双链体，使得所述异源双链体基本上对细胞内和细胞外核酸酶(诸如RNA酶H，其能够切割双链RNA/RNA或RNA/DNA复合物)引起的体内降解具有抗性。

如本文所用，术语“体液”包括从受试者获得的各种样品类型，包括尿液、唾液、血浆、血液、脊髓液或生物来源的其他样品，诸如皮肤细胞或真皮碎片，并且可指悬浮在其中或液体培养基及其溶质中的细胞或细胞碎片。

在测试测量与对照测量之间进行比较时使用术语“相对量”。相比于与对照样本反应的量，在反应中形成络合物的试剂的相对量是与测试样本反应的量。对照样本可在相同的测定中单独运行，或者它可以是同一样品的一部分(例如，组织切片中恶性区域周围的正常组织)。

个体或细胞的“治疗”是作为改变个体或细胞中疾病或病理学的自然过程的手段而提供的任何类型的干预。治疗包括但不限于施用例如药物组合物，并且可预防性地或在病理事件开始或与病原体接触之后进行。治疗包括对本文所述的与炎症等相关的疾病或病状的症状或病理学的任何期望的作用。

还包括“预防性”治疗，其可涉及降低所治疗的疾病或病状的进展速率、延迟所述疾病或病状的发作，或降低其发病的严重程度。“治疗”或“预防”不一定表示完全根除、治愈或预防疾病或病状或其相关症状。

野生型基因或基因产物是在群体中最经常观察到的基因，并且因此任意设计成基因的“正常”或“野生型”形式。

LMNA靶向

实例包括靶向SEQ ID NO:1和/或2的反义寡核苷酸，讨论如下。

某些反义寡核苷酸可包含与包括野生型序列(SEQ ID NO:1)和/或在HGPS患者中发现的序列(如SEQ ID NO:2中所示)的人LMNA基因中外显子11的一个或多个碱基互补的靶向序列。这些靶序列在下表1中示出：

表1.示例性LMNA靶序列

实例包括与LMNA外显子11(SEQ ID NO:1或2)完全互补的反义寡核苷酸，包括还与表1中在SEQ ID NO:1和2中加下划线的LMNA外显子11的隐蔽剪接位点(例如，CAGGTGGGC/T)互补的那些反义寡核苷酸。

在某些实施方案中，靶标与反义靶向序列之间的互补程度足以形成稳定的双链体。反义寡聚物与靶RNA序列的互补区域可短至8-11个碱基、但优选12-15个碱基或更多，例如12-20个碱基、12-25或15-25个碱基，包括这些范围之间的所有整数和范围。约14-15个碱基的反义寡聚物通常足够长以在靶mRNA中具有独特的互补序列。在某些实施方案中，可能需要最小长度的互补碱基以实现必需的结合Tm，如下所讨论。

在某些实施方案中，长至40个碱基的寡聚物可能是合适的，其中至少最少数量的碱基，例如10-12个碱基，与靶序列互补。然而，一般来说，在小于约30的寡聚物长度下优化细胞中的易化或主动摄取。对于PMO寡聚物，如以下进一步描述，结合稳定性和摄取的最佳平衡通常发生在18-30个碱基的长度下。包括由约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基组成的反义寡聚物(例如PNA、LNA、2'-OMe、MOE，PMO)，其中至少约6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续和/或非连续碱基与本文所述的靶序列(包括SEQ ID NO:1和/或2的靶序列，或其变体)互补。

在某些实施方案中，反义寡聚物可与LMNA前mRNA核酸靶序列100％互补，或者它们可包括错配，例如，以适应变体，只要在寡聚物与靶序列之间形成的异源双链体足够稳定以承受细胞核酸酶和可能在体内发生的其他降解或置换模式的作用。以下讨论不太容易被核酸酶切割的寡聚物骨架。如果存在，则错配针对杂交双链体的端部区域的不稳定性比在中间的不稳定性小。根据广为理解的双链体稳定性原理，允许的错配数量将取决于寡聚物的长度、双链体中G:C碱基对的百分比，以及双链体中错配的位置。尽管这种反义寡聚物不一定与靶序列100％互补，但稳定且特异性地结合靶序列是有效的，使得核酸靶标的生物活性，例如早衰蛋白的表达被调节。

在某些实施方案中，诸如PMO寡聚物，可通过使用不带电荷和阳离子二氨基磷酸酯键的混合物来增强寡聚物的反义活性。寡聚物中阳离子键的总数可从1至10(包括其间的所有整数)变化，并且散布在整个寡聚物中。优选地，带电键合的数量是至少2个且不超过总骨架键合的一半，例如在2、3、4、5、6、7或8个带正电荷的键合之间，并且优选地每个带电键合沿着骨架被至少1、2、3、4或5个不带电荷的键合分开。

用于靶向人LMNA前mRNA的示例性反义序列在下表2中示出。反义寡核苷酸可包含这些靶向序列的全部或一部分。

表2.示例性HGPS靶向序列*

反义寡核苷酸化合物

本公开的反义寡核苷酸通常(a)具有被哺乳动物细胞主动摄取的能力，和(b)一旦摄取，以大于约45℃的m与靶RNA形成双链体。在某些实施方案中，寡聚物骨架可以是基本上不带电荷的，并且优选地，可被认为是用于跨细胞膜的主动或易化转运的底物。寡聚物与靶RNA形成稳定双链体的能力还可涉及寡聚物骨架的其他特征，包括反义寡聚物相对于靶标的长度和互补程度、G:C与A:T碱基匹配的比率，以及任何错配碱基的位置。反义寡聚物抵抗细胞核酸酶的能力可促进试剂的存活和最终递送至细胞质。

反义寡聚物可采用多种反义化学物质。寡聚物化学物质的实例包括但不限于氨基磷酸酯吗啉代寡聚物和二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)、硫代磷酸酯修饰的寡聚物、2’O-甲基修饰的寡聚物、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚物、2’O-MOE修饰的寡聚物、2’-氟修饰的寡聚物、2’O,4’C-乙烯桥接核酸(ENA)、三环-DNA、三环-DNA硫代磷酸酯核苷酸、2’-O-[2-(N-甲基氨甲酰基)乙基]修饰的寡聚物、吗啉代寡聚物、肽缀合的氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PPMO)、具有磷原子的二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物，其具有(i)与吗啉代环的氮原子的共价键，和(ii)与(1,4-哌嗪)-1-基取代基或取代的(1,4-哌嗪)-1-基(PMOplus)的第二共价键；以及具有磷原子的二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物，其具有(i)与吗啉代环的氮原子的共价键和(ii)与4-氨基哌啶-1-基(即APN)或4-氨基哌啶-1-基(PMO-X)化学物质衍生物的环氮的第二共价键，包括任何前述的组合。一般来说，PNA和LNA化学物质可利用较短的靶向序列，因为它们相对于PMO和2'O-Me修饰的寡聚物具有相对高的靶结合强度。可组合硫代磷酸酯和2'O-Me-修饰的化学物质以产生2'O-Me-硫代磷酸酯骨架。参见，例如，PCT公开号WO2013/112053和WO2009/008725，其据此全文以引用方式并入。

在一些情况下，反义寡聚物诸如PMO可与细胞穿透肽(CPP)缀合以促进细胞内递送。肽缀合的PMO称为PPMO，并且某些实施方案包括描述于PCT公开号WO2012/150960中的那些，其全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，可使用与例如，如本文所述的反义寡聚物的3’末端缀合或连接的富含精氨酸的肽序列。在某些实施方案中，可使用与例如，如本文所述的反义寡聚物的5'末端缀合或连接的富含精氨酸的肽序列。

1.肽核酸(PNA)

肽核酸(PNA)是DNA的类似物(其中骨架与脱氧核糖骨架在结构上是同形的)，其由与嘧啶或嘌呤碱基连接的N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元组成。含有天然嘧啶和嘌呤碱基的PNA遵循Watson-Crick碱基配对原则与互补寡聚物杂交，并且在碱基对识别方面模拟DNA(Egholm,Buchardt等1993)。PNA的骨架由肽键而不是磷酸二酯键形成，使得它们非常适合反义应用(参见以下结构)。所述骨架是不带电荷的，从而导致PNA/DNA或PNA/RNA双链体表现出大于正常的热稳定性。PNA不被核酸酶或蛋白酶识别。PNA的非限制性实例描绘如下：

尽管天然结构发生了根本性的结构变化，但PNA能够以螺旋形式与DNA或RNA进行序列特异性结合。PNA的特征包括对互补DNA或RNA的高结合亲和力、由单碱基错配引起的去稳定作用、对核酸酶和蛋白酶的抗性、与DNA或RNA的杂交不依赖于盐浓度以及与同型嘌呤DNA的三链体形成。PANAGENE^TM已开发了其专有的Bts PNA单体(Bts；苯并噻唑-2-磺酰基)和专有的寡聚方法。使用Bts PNA单体的PNA寡聚化由脱保护、偶联和加帽的重复循环构成。PNA可使用本领域已知的任何技术合成产生。对于制备PNA，参见，例如，美国专利号6,969,766、7,211,668、7,022,851、7,125,994、7,145,006和7,179,896。还参见美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262。PNA化合物的进一步教导可见于Nielsen等,Science,254:1497-1500,1991。前述中的每个均全文以引用方式并入。

2.锁核酸(LNA)

反义寡聚物化合物还可含有“锁核酸”亚基(LNA)。“LNA”是称为桥接核酸(BNA)的一类修饰的成员。BNA的特征在于共价键，其将核糖环的构象锁定在C30-内(北)糖皱褶中。对于LNA，桥由2’-O与4’-C位置之间的亚甲基构成。LNA增强骨架预组织和碱基堆积以增加杂交和热稳定性。

LNA的结构可见于例如，Wengel等,Chemical Communications(1998)455；Tetrahedron(1998)54:3607,and Accounts of Chem.Research(1999)32:301)；Obika等,Tetrahedron Letters(1997)38:8735；(1998)39:5401,and Bioorganic MedicinalChemistry(2008)16:9230，其据此全文以引用方式并入。LNA的非限制性实例描绘如下：

本公开的化合物可并入一个或多个LNA；在一些情况下，所述化合物可完全由LNA构成。用于合成单个LNA核苷亚基的方法及其并入寡聚物中的方法描述于，例如，美国专利号7,572,582、7,569,575、7,084,125、7,060,809、7,053,207、7,034,133、6,794,499和6,670,461中，其中的每个均全文以引用方式并入。典型的亚基间接头包括磷酸二酯和硫代磷酸酯部分；可替代地，可采用不含磷的接头。进一步的实施方案包括含LNA的化合物，其中每个LNA亚基被DNA亚基分开。某些化合物由交替的LNA和DNA亚基构成，其中亚基间接头是硫代磷酸酯。

2'O,4'C-乙烯桥接核酸(ENA)是BNA类的另一成员。非限制性实例描绘如下：

ENA寡聚物及其制备描述于Obika等,Tetrahedron Lett 38(50):8735中，其据此全文以引用方式并入。本公开的化合物可并入一个或多个ENA亚基。

3.硫代磷酸酯

“硫代磷酸酯”(或S-寡聚物)是正常DNA的变体，其中非桥接氧中的一个被硫替换。硫代磷酸酯的非限制性实例描绘如下：

核苷酸间键的硫化降低了核酸内切酶和核酸外切酶(包括5'至3'和3’至5’DNAPOL1核酸外切酶、核酸酶S1和P1、RNA酶、血清核酸酶和蛇毒磷酸二酯酶)的作用。硫代磷酸酯通过两种主要途径制备：通过二硫化碳中元素硫的溶液在膦酸氢盐上的作用，或通过用二硫化四乙基秋兰姆(TETD)或3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物(BDTD)的硫化亚磷酸三酯的方法制备(参见，例如，Iyer等,J.Org.Chem.55,4693-4699,1990，其据此全文以引用方式并入)。后一种方法避免了元素硫在大多数有机溶剂中的不溶和二硫化碳的毒性问题。TETD和BDTD方法还产生更高纯度的硫代磷酸酯。

4.三环-DNA和三环-硫代磷酸酯核苷酸

三环-DNA(tc-DNA)是一类受约束的DNA类似物，其中通过引入环丙烷环来修饰每个核苷酸以限制骨架的构象灵活性并优化扭转角γ的骨架几何形状。含人碱基(Homobasic)腺嘌呤和胸腺嘧啶的tc-DNA与互补RNA形成非常稳定的A-T碱基对。三环-DNA及其合成描述于PCT专利申请公开号WO 2010/115993中，其据此全文以引用方式并入。本公开的化合物可并入一个或多个三环-DNA核苷酸；在一些情况下，所述化合物可完全由三环-DNA核苷酸构成。

三环-硫代磷酸酯核苷酸是具有硫代磷酸酯亚基间键的三环-DNA核苷酸。三环-硫代磷酸酯核苷酸及其合成描述于PCT专利申请公开号WO 2013/053928中，其据此全文以引用方式并入。本公开的化合物可并入一个或多个三环-DNA核苷酸；在一些情况下，所述化合物可完全由三环-DNA核苷酸构成。三环-DNA/三环-硫代磷酸酯核苷酸的非限制性实例描绘如下：

5. 2’O-甲基、2’O-MOE和2'-F寡聚物

“2'O-Me寡聚物”分子在核糖分子的2'-OH残基处携带甲基。2'-O-Me-RNA显示出与DNA相同(或相似)的行为，但保护免受核酸酶降解。2'-O-Me-RNA还可与硫代磷酸酯寡聚物(PTO)组合以便进一步稳定化。可根据本领域的常规技术合成2'O-Me寡聚物(磷酸二酯或硫代磷酸酯)(参见，例如，Yoo等,NucleicAcids Res.32:2008-16,2004，其据此全文以引用方式并入)。2’O-Me寡聚物的非限制性实例描绘如下：

2’O-Me寡聚物还可包含硫代磷酸酯键(2’O-Me硫代磷酸酯寡聚物)。2’O-甲氧基乙基寡聚物(2’-O MOE)，如2’O-Me寡聚物，在核糖分子的2’-OH残基处携带甲氧基乙基，并且在Martin等,Helv.Chim.Acta,78,486-504,1995中讨论，其据此全文以引用方式并入。2’O-MOE核苷酸的非限制性实例描绘如下：

与前述烷基化的2’OH核糖衍生物相反，2’-氟寡聚物在2'位置处具有氟基团，代替2’OH。2’-F寡聚物的非限制性实例描绘如下：

2’-氟寡聚物进一步描述于PCT申请公开号WO 2004/043977中，其据此全文以引用方式并入。本公开的化合物可并入一个或多个2’O-甲基、2’O-MOE和2’-F亚基，并且可利用本文所述的任何亚基间键。在一些情况下，本公开的化合物可完全由2’O-甲基、2’O-MOE或2’-F亚基构成。本公开化合物的一个实施方案完全由2’O-甲基亚基构成。

6. 2'-O-[2-(N-甲基氨甲酰基)乙基]寡核苷酸(MCE)

MCE是可用于本公开化合物的2’O修饰的核糖核苷的另一个实例。此处，将2’OH衍生为2-(N-甲基氨甲酰基)乙基部分以增加核酸酶抗性。MCE寡聚物的非限制性实例描绘如下：

MCE及其合成描述于Yamada等,J.Org.Chem.,76(9):3042-53中，其据此全文以引用方式并入。本公开的化合物可并入一个或多个MCE亚基。

7.立体特异性寡聚物

立体特异性寡聚物是通过合成方法固定每个含磷键的立体化学特性，从而产生基本上纯的单一寡聚物的那些寡聚物。立体特异性寡聚物的非限制性实例描绘如下：

在以上实例中，寡聚物的每个磷均具有相同的立体化学特性。另外的实例包括上述寡聚物。例如，LNA、ENA、三环-DNA、MCE、2’O-甲基、2’O-MOE、2’-F和基于吗啉代的寡聚物可用立体特异性含磷的核苷间键(例如像，硫代磷酸酯、磷酸二酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯或其他含磷的核苷间键)来制备。立体特异性寡聚物、用于制备此类寡聚物的制备方法、手性控制合成、手性设计和手性助剂详述于例如PCT申请公开号WO2015/107425、WO2015/108048、WO 2015/108046、WO2015/108047、WO2012/039448、WO2010/064146、WO2011/034072、WO2014/010250、WO2014/012081、WO2013/0127858和WO2011/005761中，其中的每个均据此全文以引用方式并入。

8.基于吗啉代的寡聚物

基于吗啉代的寡聚物是指包含支持核碱基的吗啉代亚基并且含有吗啉环而不是核糖的寡聚物。示例性核苷间键包括，例如，氨基磷酸酯或二氨基磷酸酯核苷间键，其将一个吗啉代亚基的吗啉环氮连接到相邻吗啉代亚基的4’环外碳。每个吗啉代亚基均包含嘌呤或嘧啶核碱基，其有效通过碱基特异性氢键与寡核苷酸中的碱基结合。

基于吗啉代的寡聚物(包括反义寡聚物)及其合成详述于例如美国专利号5,698,685；5,217,866；5,142,047；5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,521,063；5,506,337和美国专利申请号12/271,036；12/271,040；和PCT公开号WO2009/064471和WO2012/043730以及Summerton等1997,Antisense and Nucleic Acid Drug Development,7:187-195中，其据此全文以引用方式并入。在寡聚物结构内，磷酸基团通常被称为形成寡聚物的“核苷间键”。RNA和DNA的天然存在的核苷间键是3'至5'磷酸二酯键。“氨基磷酸酯”基团包含具有三个连接的氧原子和一个连接的氮原子的磷，而“二氨基磷酸酯”基团包含具有两个连接的氧原子和两个连接的氮原子的磷。在本文所述的基于吗啉代的寡聚物的不带电荷或阳离子亚基间键中，一个氮总是悬挂在主链上。二氨基磷酸酯键中的第二个氮通常是吗啉环结构中的环氮。

“PMO-X”是指具有磷原子的基于二氨基磷酸酯吗啉代的寡聚物，其具有(i)与吗啉环的氮原子的共价键和(ii)与4-氨基哌啶-1-基(即APN)或4-氨基哌啶-1-基衍生物的环氮的第二共价键。示例性PMO-X寡聚物公开于PCT申请号PCT/US2011/38459和PCT公开号WO2013/074834中，其据此全文以引用方式并入。PMO-X包括“PMO-apn”或“APN”，其是指包含至少一个核苷间键的PMO-X寡聚物，其中磷原子与吗啉代基团连接并且与4-氨基哌啶-1-基(即APN)的环氮连接。在具体的实施方案中，包含如表2中列出的靶向序列的反义寡聚物包含至少一个含APN的键或含APN衍生物的键。各种实施方案包括基于吗啉代的寡聚物，其具有约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％含APN/APN衍生物的键，其中其余键(如果小于100％)是不带电荷的键，例如，总核苷间键中的约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个是含APN/APN衍生物的键。

在某些实施方案中，反义寡聚物是式(I)的化合物：

或其药学上可接受的盐，

其中每个Nu是核碱基，它们一起形成靶向序列；

Z是8至38的整数；

T选自：

并且

G是细胞穿透肽(“CPP”)和接头部分。

在一些实施方案中，G选自-C(O)(CH₂)₅NH-CPP-R^a、C(O)(CH₂)₂NH-CPP-R^a、-C(O)(CH₂)₂NHC(O)(CH₂)₅NH-CPP-R^a、C(O)CH₂NH-CPP-R^a和以下结构：

其中CPP通过CPP羧基末端处的酰胺键连接到接头部分，并且R^a是通过酰胺键连接到CPP氨基末端R^a的部分，其中R^a选自H、乙酰基、苯甲酰基和硬脂酰基。在一些实施方案中，R^a是乙酰基。在一些实施方案中，CPP选自SEQ ID NO:5–21。在某些实施方案中，G选自SEQID NO:22-25。在一些实施方案中，CPP是SEQ ID NO:11。在某些实施方案中，G是SEQ ID NO:25。

在某些实施方案中，G选自：-C(O)CH₂NH-CPP-R^a和

其中CPP通过CPP羧基末端处的酰胺键连接到接头部分，R^a通过酰胺键连接到CPP氨基末端，其中R^a选自H、乙酰基、苯甲酰基和硬脂酰基，并且CPP选自SEQ ID NO:5–21。在一些实施方案中，CPP是SEQ ID NO:11。在一些实施方案中，R^a是乙酰基。

在一些实施方案中，T是

在各个方面，本公开的反义寡核苷酸包括式(II)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

其中每个Nu是核碱基，它们一起形成靶向序列；

Z是8至38的整数；并且

G是细胞穿透肽(“CPP”)和接头部分。

在一些实施方案中，G选自-C(O)(CH₂)₅NH-CPP-R^a、C(O)(CH₂)₂NH-CPP-R^a、-C(O)(CH₂)₂NHC(O)(CH₂)₅NH-CPP-R^a、C(O)CH₂NH-CPP-R^a和以下结构：

其中CPP通过CPP羧基末端处的酰胺键连接到接头部分，并且R^a是通过酰胺键连接到CPP氨基末端R^a的部分，其中R^a选自H、乙酰基、苯甲酰基和硬脂酰基。在一些实施方案中，R^a是乙酰基。在一些实施方案中，CPP选自SEQ ID NO:5–21。在某些实施方案中，G选自SEQID NO:22-25。在一些实施方案中，CPP是SEQ ID NO:11。在某些实施方案中，G是SEQ ID NO:25。

在某些实施方案中，G选自：-C(O)CH₂NH-CPP-R^a和

其中CPP通过CPP羧基末端处的酰胺键连接到接头部分，R^a通过酰胺键连接到CPP氨基末端，其中R^a选自H、乙酰基、苯甲酰基和硬脂酰基，并且CPP选自SEQ ID NO:5–21。在一些实施方案中，CPP是SEQ ID NO:11。在某些实施方案中，G选自SEQ ID NO:24或25。在一些实施方案中，G是SEQ ID NO:25。

在一些实施方案中，本公开的反义寡聚物(包括例如，式(I)和(II)的反义寡聚物的一些实施方案)的靶向序列，选自：

a)SEQ ID NO:3(CTGAGCCGCTGGCAGATGCCTTGTC)其中Z是23；和

b)SEQ ID NO:4(GAGGAGATGGGTCCACCCACCTGGG)其中Z是23。

肽转运蛋白

PMO的CPP和富含精氨酸的肽缀合物(PPMO)

在某些实施方案中，反义寡核苷酸与细胞穿透肽(在本文中称为“CPP”)缀合。在一些实施方案中，CPP是富含精氨酸的肽。术语“富含精氨酸”是指具有至少2个，并且优选2、3、4、5、6、7或8个精氨酸残基的CPP，每个残基任选地被一个或多个不带电荷的疏水性残基隔开，并且任选地含有约6-14个氨基酸残基。如下所释，CPP优选地在其羧基末端处通过接头与反义寡核苷酸的3’和/或5’端连接，所述接头还可以是一个或多个氨基酸，并且优选地还在其氨基末端处被取代基R^a加帽，其中R^a选自H、乙酰基、苯甲酰基或硬脂酰基。在一些实施方案中，R^a是乙酰基。

表3:示例性CPP(SEQ ID NO:5-21)和CPP和接头部分组合(SEQ ID NO:22-25)

CPP、其合成以及与寡聚物缀合的方法进一步描述于美国申请公开号2012/0289457和PCT专利申请公开号WO 2004/097017、WO 2009/005793和WO 2012/150960中，其公开内容全文以引用方式并入本文中。

在各种实施方案中，G(如式(I)和(II)中所述)，G是选自-C(O)(CH₂)₅NH-CPP-R^a、-C(O)(CH₂)₂NH-CPP-R^a、-C(O)(CH₂)₂NHC(O)(CH₂)₅NH-CPP-R^a、-C(O)CH₂NH-CPP-R^a和以下结构的细胞穿透肽(“CPP”)和接头部分：

其中CPP通过CPP羧基末端处的酰胺键连接到接头部分，并且R^a是通过酰胺键连接到CPP氨基末端R^a的部分，其中R^a选自H、乙酰基、苯甲酰基和硬脂酰基。在一些实施方案中，R^a是乙酰基。在一些实施方案中，CPP包含或选自SEQ ID NO:5-21。在一些实施方案中，G包含或选自SEQ ID NO:22-25。在某些实施方案中，CPP是SEQ ID NO:11。在一些实施方案中，G是SEQ ID NO:25。

在一些实施方案中，G(如式(I)和(II)中所述)具有下式：

其中R^a选自H、乙酰基、苯甲酰基和硬脂酰基，并且J是4至9的整数。在某些实施方案中，J是6。

在各种实施方案中，CPP-R^a(如式(I)和(II)中所述)具有下式：

其中R^a选自H、乙酰基、苯甲酰基和硬脂酰基，并且J是4至9的整数。在某些实施方案中，CPP是SEQ ID NO:11。在各种实施方案中，J是6。在一些实施方案中，R^a选自H和乙酰基。例如，在一些实施方案中，R^a是H。在某些实施方案中，R^a是乙酰基。

在一些实施方案中，G包含或选自SEQ ID NO:22-25。在某些实施方案中，G是SEQID NO:25。

在某些实施方案中，包括例如，式(I)和(II)的反义寡聚物，G是在寡聚物的3’端处共价键合到本公开反义寡聚物的-C(O)CH₂NH-R₆-R^a，其中R^a是H、乙酰基、苯甲酰基或硬脂酰基以封端R₆的氨基末端。在一些实施方案中，R^a是乙酰基。在这些非限制性实例中，CPP是–R₆-R^a并且接头是-C(O)CH₂NH-，(即甘氨酸)。G＝-C(O)CH₂NH-R₆-R^a的这个具体实例还由以下结构例示：

其中R^a选自H、乙酰基、苯甲酰基和硬脂酰基。在一些实施方案中，R^a是乙酰基。

在各种实施方案中，CPP-R^a是-R₆-R^a，其中CPP是SEQ ID NO:11，还例示为下式：

其中R^a选自H、乙酰基、苯甲酰基和硬脂酰基。在某些实施方案中，CPP是SEQ IDNO:11。在一些实施方案中，R^a是乙酰基。

在一些实施方案中，CPP-R^a具有式–(RXR)₄-R^a，其中CPP是SEQ ID NO:16，还例示为下式：

在各种实施方案中，CPP-R^a是–R-(FFR)₃-R^a，其中CPP是SEQ ID NO:21，还例示为下式：

在各种实施方案中，G是选自-C(O)(CH₂)₅NH-CPP-R^a、-C(O)(CH₂)₂NH-CPP-R^a、C(O)(CH₂)₂NHC(O)(CH₂)₅NH-CPP-R^a、-C(O)CH₂NH-CPP-R^a和以下结构的细胞穿透肽(“CPP”)和接头部分：

其中CPP通过CPP羧基末端处的酰胺键连接到接头部分，并且R^a通过酰胺键连接到CPP氨基末端，其中R^a选自H、乙酰基、苯甲酰基和硬脂酰基，并且其中CPP-R^a选自：

(-R₆-R^a)。在一些实施方案中，R^a是乙酰基。

此外，在一些实施方案中，本公开的反义寡聚物是式(III)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

每个Nu是核碱基，它们一起形成选自以下的靶向序列(5’至3’)：

a)SEQ ID NO:3(CTGAGCCGCTGGCAGATGCCTTGTC)其中Z是23；和

b)SEQ ID NO:4(GAGGAGATGGGTCCACCCACCTGGG)其中Z是23；

并且R^a选自H、乙酰基、苯甲酰基和硬脂酰基。

在一些实施方案中，靶向序列是SEQ ID NO:3(CTGAGCCGC TGGCAGATGCCTTGTC)并且Z是23。在某些实施方案中，靶向序列是SEQ ID NO:4(GAGGAGATGGGTCCACCCACCTGGG)并且Z是23。在一些实施方案中，R^a是乙酰基。

在本公开的反义寡聚物的一些实施方案，包括例如，式(III)的反义寡聚物的一些实施方案中，反义寡聚物可具有式(IV)：

或其药学上可接受的盐，其中：

每个Nu是核碱基，它们一起形成选自以下的靶向序列(5’至3’)：

a)SEQ ID NO:3(CTGAGCCGCTGGCAGATGCCTTGTC)其中Z是23；和

b)SEQ ID NO:4(GAGGAGATGGGTCCACCCACCTGGG)其中Z是23；

并且R^a选自H、乙酰基、苯甲酰基和硬脂酰基。

在一些实施方案中，靶向序列是SEQ ID NO:3(CTGAGCCGCTGGCAGATGCCTTGTC)并且Z是23。在某些实施方案中，靶向序列是SEQ ID NO:4(GAGGAGATGGGTCCACCCACCTGGG)并且Z是23。在一些实施方案中，R^a是乙酰基。

在一些实施方案中，式(III)的反义寡聚物化合物具有式(IV)，其中靶向序列是SEQ ID NO:3(CTGAGCCGCTGGCAGATGCCTTGTC)并且Z是23。在一些实施方案中，式(III)的反义寡聚物化合物具有式(IV)，其中靶向序列是SEQ ID NO:4(GAGGAGATGGGTCCACCCACCTGGG)并且Z是23。

在一些实施方案中，反义寡聚物是式(V)的化合物或其药学上可接受的盐，选自：

在一些实施方案中，式(V)的反义寡聚物具有式(Va)。在某些实施方案中，式(V)的反义寡聚物具有式(Vb)。

在一些实施方案中，本公开的反义寡聚物包括例如，式(III)、式(IV)、式(V)、式(Va)和式(Vb)的化合物，是药学上可接受的盐。在某些实施方案中，药学上可接受的盐是HCl(盐酸)盐。例如，在一些实施方案中，式(III)的化合物是HCl盐。在某些实施方案中，式(III)的化合物是0.6HCl盐。在一些实施方案中，式(IV)的化合物是HCl盐。在某些实施方案中，式(IV)的化合物是0.6HCl盐。在一些实施方案中，式(V)的化合物是HCl盐。在某些实施方案中，式(V)的化合物是0.6HCl盐。在一些实施方案中，式(Va)的化合物是HCl盐。在某些实施方案中，式(Va)的化合物是0.6HCl盐。在一些实施方案中，式(Vb)的化合物是HCl盐。在某些实施方案中，式(Vb)的化合物是0.6HCl盐。

在本公开的反义寡聚物的一些实施方案，包括例如，式(V)的反义寡聚物的一些实施方案中，反义寡聚物可以是式(VI)的化合物或其药学上可接受的盐，选自：

在一些实施方案中，式(VI)的反义寡聚物具有式(VI a)。在某些实施方案中，式(VI)的反义寡聚物具有式(VI b)。在某些实施方案中，式(V)的反义寡聚物化合物具有式(VI a)。在一些实施方案中，式(V)的反义寡聚物化合物具有式(VI b)。

在一些实施方案中，本公开的反义寡聚物包括例如，式(VI)、式(VI a)和式(VI b)的化合物，是药学上可接受的盐。在某些实施方案中，药学上可接受的盐是HCl(盐酸)盐。例如，在一些实施方案中，式(VI)的化合物是HCl盐。在某些实施方案中，式(VI)的化合物是0.6HCl盐。在一些实施方案中，式(VI a)的化合物是HCl盐。在某些实施方案中，式(VI a)的化合物是0.6HCl盐。在一些实施方案中，式(VI b)的化合物是HCl盐。在某些实施方案中，式(VI b)的化合物是0.6HCl盐。

为清楚起见，式(V)和(VI)的反义寡聚物的结构式是从5’至3’的连续结构式，并且为了便于说明紧凑形式的整个结构式，在此提出标记为“分解A”、“分解B”和“分解C”的各种说明性分解。技术人员理解，例如，每个标识“分解A”显示在这些点处结构式图解的继续。对于式(V)和(VI)的反义寡聚物的结构式中的每个“分解B”和“分解C”的情况也是如此。以上描述或本文使用的图解分解不旨在表示或技术人员也不会将其理解成意指式(V)和(VI)的反义寡聚物的结构式的实际中止。

使用方法和药物制剂

本发明涉及用于通过向受试者施用如本文所述的反义寡核苷酸或含有其的药物组合物来治疗有需要的受试者的早衰样疾病(诸如核纤层蛋白病)和相关疾病或病状的方法，其中所述寡核苷酸通过调节LMNA前mRNA的剪接来抑制突变LMNA蛋白mRNA的表达。在某些方面，例如，这些和相关方法可应用于治疗临床环境中的早衰样核纤层蛋白病，其中早衰蛋白表达与疾病(诸如HGPS)相关。通过同时或顺序地实施本发明的方法与其他治疗，这些和相关的实施方案还可与治疗或减少早衰样核纤层蛋白病的方法相结合。

除早衰样核纤层蛋白病之外，本文所述的结果可推广到衰老过程和相关的病状和疾病。这是因为HGPS在许多方面与正常衰老过程密切相关。HGPS继续被认为是可用的衰老模型(Fossel,J.Pediatr Endocrinol Metab 13增刊6:1477-1481,2000)。例如，与动脉粥样硬化的联系非常强烈，尤其是冠状动脉。另外，HGPS中的脱发类似于在高龄受试者中所见的脱发。此外，如Hayflick和其他人(Hayflick,N Engl J Med 295:1302-1308,1976)多年前所描述，HGPS的主要细胞特征是早期细胞衰老。HGPS成纤维细胞中有限数量的细胞分裂类似于来源于老年个体的成纤维细胞中所见的细胞分裂。通过研究进一步探讨了这一点，所述研究显示HGPS成纤维细胞和来源于老年人的成纤维细胞的基因表达模式的相似性，将它们与来源于年轻人的成纤维细胞区别开来(Ly等,Science 287:2486-2492,2000)。

因此，应理解，如本文所述的用于治疗早衰样疾病或相关病状的方法可包括治疗早衰样核纤层蛋白病(诸如HGPS)，或另一种早衰样疾病或病状、年龄相关病状、心血管疾病或病状(诸如动脉粥样硬化)等。

应理解，使用本发明方法的有效体内治疗方案可根据寡核苷酸施用的持续时间、剂量、频率和途径以及治疗中受试者的状况(即预防性施用相比于针对现有病状的施用)而变化。因此，这种体内疗法将经常需要通过适合于治疗中特定类型疾病的测试以及剂量或治疗方案的相应调整来监测，以便实现最佳治疗结果。

在某些实施方案中，本发明的方法采用适用于治疗性递送如本文所述反义寡聚物的制剂或组合物。因此，在某些实施方案中，本发明的方法采用药学上可接受的组合物，其包含治疗有效量的本文所述寡聚物或试剂中的一种或多种，与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制。虽然本发明的寡聚物有可能单独施用，但优选将所述化合物作为药物制剂(组合物)施用。

用于递送核酸分子的方法描述于例如Akhtar等,1992,Trends Cell Bio.,2:139；和Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics编辑Akhtar；Sullivan等,PCT申请公开号WO 94/02595中。这些和其他方案可用于递送实际上任何核酸分子，包括本发明的分离的寡聚物。

如下详述，用于本发明方法中的药物组合物可被特别配制来以固体或液体形式施用，所述形式包括适合于以下的那些：(1)口服施用，例如灌服剂(水性或非水性溶液或混悬液)、片剂(例如以经颊、舌下和全身性吸收为目标的那些)、大丸剂、粉剂、颗粒剂、用于施用至舌的糊剂；(2)胃肠外施用，例如通过作为例如无菌溶液或混悬液、或持续释放制剂进行皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射；(3)局部施用，例如作为施用至皮肤的霜剂、软膏剂或控制释放贴片或喷雾剂；(4)阴道内或直肠内，例如作为子宫托、霜剂或泡沫；(5)舌下；(6)经眼部；(7)经皮；或(8)经鼻。

本文采用短语“药学上可接受的”指在合理医学判断范围内、适用于与人类和动物组织接触而没有过量毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症、与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

如本文所用的短语“药学上可接受的载体”意指将主题化合物从身体的一个器官或部分携带或转运至身体的另一器官或部分时涉及的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬脂酸)或溶剂囊封材料。各载体在可与制剂的其他成分相容、并且不损伤患者的意义上必须是“可接受的”。

可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括但不限于：(1)糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素和它的衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)黄芪胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9)油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油以及大豆油；(10)二醇，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇以及聚乙二醇；(12)酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)褐藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液(Ringer’s solution)；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；以及(22)药物制剂中采用的其他无毒相容性物质。

适用于与本发明的反义寡聚物一起配制的试剂的另外非限制性实例包括：PEG缀合的核酸、磷脂缀合的核酸、含有亲脂性部分的核酸、硫代磷酸酯；P-糖蛋白抑制剂(诸如Pluronic P85)，其可增强药物进入各种组织中；生物可降解的聚合物，诸如聚(DL-丙交酯-共乙交酯)微球，其用于植入后的缓释递送(Emerich,DF等,1999,Cell Transplant,8,47-58)Alkermes公司Cambridge,Mass.；和负载的纳米颗粒，诸如由聚氰基丙烯酸正丁酯制成的那些纳米颗粒，其可递送药物穿过血脑屏障并可改变神经元摄取机制(ProgNeuropsychopharmacol Biol Psychiatry,23,941-949,1999)。

本发明的方法特征还在于包含表面修饰的脂质体的组合物的用途，所述脂质体含有聚(乙二醇)脂质(PEG-修饰的、支化的和非支化的或其组合，或长循环脂质体或隐形脂质体)。本发明的寡聚物还可包含各种分子量的共价连接的PEG分子。这些制剂提供了一种用于增加药物在靶组织中的积聚的方法。此类药物载体对由单核吞噬细胞系统(MPS或RES)进行的调理作用和消除有抗性，由此使囊封药物的血液循环时间能够更长并且增强其组织暴露(Lasic等Chem.Rev.1995,95,2601-2627；Ishiwata等,Chem.Pharm.Bull.1995,43,1005-1011)。此类脂质体已被证明可能通过外渗在肿瘤中选择性地积聚，并且在新血管化的靶组织中捕获(Lasic等,Science 1995,267,1275-1276；Oku等,1995,Biochim.Biophys.Acta,1238,86-90)。长循环脂质体增强了DNA和RNA的药代动力学和药效动力学，特别是与已知在MPS组织中积聚的常规阳离子脂质体相比(Liu等,J.Biol.Chem.1995,42,24864-24870；Choi等,PCT公开号WO 96/10391；Ansell等,PCT公开号WO 96/10390；Holland等,PCT公开号WO 96/10392)。基于它们避免在代谢侵袭性MPS组织(诸如肝脏和脾脏)中积聚的能力，与阳离子脂质体相比，长循环脂质体还可能更大程度地保护药物免受核酸酶降解。

在进一步的实施方案中，本发明的方法包括被制备用于递送的寡聚物组合物，如美国专利号6,692,911、7,163,695和7,070,807中所述。在这点上，在一个实施方案中，本发明提供了一种在包含赖氨酸和组氨酸(HK)共聚物的组合物中的本发明寡聚物，如美国专利号7,163,695、7,070,807和6,692,911中所述，其是单独的或与PEG(例如，支化或未支化的PEG或两者的混合物)组合，与PEG和靶向部分或与交联剂组合的任何前述物质组合。在某些实施方案中，本发明提供了在包含葡糖酸修饰的多组氨酸或葡糖酸化的多组氨酸/转铁蛋白-聚赖氨酸的组合物中的反义寡聚物。本领域技术人员还将认识到，具有与His和Lys相似特性的氨基酸可在组合物中被取代。

在某些方法中，本文所述的寡聚物可含有碱性官能团，诸如氨基或烷基氨基，并且因此能够与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。在这方面，术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的相对无毒的无机酸和有机酸加成盐。这些盐可在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备，或者通过使为其游离碱形式的纯化的本发明化合物与合适的有机酸或无机酸分别反应，并且在随后的纯化过程中分离由此形成的盐来制备。代表性盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。(参见，例如，Berge等(1977)“Pharmaceutical Salts”,J.Pharm.Sci.66:1-19)。

主题寡聚物的药学上可接受的盐包括化合物的常规无毒盐或季铵盐，例如来自无毒有机或无机酸。例如，此类常规无毒盐包括来源于无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的那些盐；以及从有机酸制备的盐，所述有机酸诸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、软脂酸、马来酸、羟基马来酸、苯基乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲烷磺酸、乙烷二磺酸、草酸、异硫羰酸等。

在某些方法中，本发明的寡聚物可含有一个或多个酸性官能团，并且因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些情况下，术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的相对无毒的无机碱和有机碱加成盐。这些盐同样可在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备，或者通过使为其游离酸形式的纯化化合物与合适的碱诸如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐与氨或与药学上可接受的有机伯胺、仲胺或叔胺分别反应来制备。代表性的碱或碱土金属盐包括锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铝盐等。可用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。(参见，例如，Berge等,同上)。

润湿剂、乳化剂和润滑剂诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于所述组合物中。

药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

用于本发明的本发明方法的制剂包括适用于经口、经鼻、局部(包括经颊和舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外施用的那些制剂。制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。可与载体材料组合以产生单剂型的活性成分的量将根据所治疗的宿主，特别是施用模式而变化。可与载体材料组合以产生单剂型的活性成分的量通常将是产生治疗效果的所述化合物的量。通常，在一百份中，此量将为约0.1％至约99％的活性成分，优选约5％至约70％，最优选约10％至约30％。

在某些实施方案中，用于本发明方法的制剂包含选自环糊精、纤维素、脂质体、胶束形成剂的赋形剂，例如，胆汁酸和聚合物载体，例如，聚酯和聚酸酐；以及本发明的寡聚物。在某些实施方案中，前述制剂提供口服生物可利用的本发明寡聚物。

制备这些制剂或组合物的方法包括使本发明寡聚物与载体和任选的一种或多种辅助成分缔合的步骤。一般来说，通过将本发明的化合物与液体载体或精细分开的固体载体或两者均匀且密切地缔合，并且然后，如果必要，使产物成形来制备制剂。

适用于口服施用的本发明中使用的制剂可为以下形式：胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用经调味的基质，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、粉剂、颗粒剂或作为水性液体或非水性液体中的溶液或混悬液、或作为水包油或油包水液体乳剂、或作为酏剂或糖浆剂、或作为软锭剂(pastille)(使用惰性基质，诸如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为漱口水等，每种均含有预定量的本发明化合物作为活性成分。本发明的寡聚物还可作为大丸剂、药糖剂或糊剂施用。

在本发明中用于口服施用的固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、糖锭剂、粉剂、颗粒剂、含片等)中，可将所述活性成分与一种或多种药学上可接受的载体(诸如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或以下中的任一种进行混合：(1)填充剂或增充剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如像羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)湿润剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐以及碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，诸如石蜡；(6)吸收加速剂，诸如季铵化合物和表面活性剂，诸如泊洛沙姆和十二烷基硫酸钠；(7)润湿剂，例如像鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯和非离子表面活性剂；(8)吸收剂，诸如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、硬脂酸锌、硬脂酸钠、硬脂酸及其混合物；(10)着色剂；以及(11)控释剂，诸如交聚维酮或乙基纤维素。在胶囊剂、片剂以及丸剂的情况下，所述药物组合物还可包含缓冲剂。在使用此类赋形剂如乳糖(lactose)或乳糖(milksugar)以及高分子量聚乙二醇等的软外壳和硬外壳的明胶胶囊中还可采用类似类型的固体组合物作为填充剂。

片剂可通过压制或模制来制备，任选地含有一种或多种辅助成分。压制的片剂可使用粘合剂(例如明胶或羟丙基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如羧甲基淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备。模制片剂可通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂湿润的粉末状化合物的混合物来制备。

根据本发明使用的药物组合物的片剂和其他固体剂型，诸如糖锭剂、胶囊剂、丸剂以及颗粒剂，可任选地用包衣和外壳(诸如制药领域熟知的肠溶衣和其他包衣)进行压痕或制备。还可使用例如用于提供期望释放特征的不同比例的羟丙基纤维素、其他聚合物基质、脂质体和/或微球将它们配制成用于提供其中所含活性成分的缓慢释放或控制释放。它们可被配制用于快速释放，例如冷冻干燥。可通过例如过滤通过截留细菌的过滤器或通过在使用前即刻掺入为可溶于无菌水或一些其他无菌可注射介质的无菌固体组合物形式的灭菌剂来对它们进行灭菌。这些组合物还可任选地含有遮光剂并且还可为仅在或优先在胃肠道的某一部分任选以延迟方式释放所述活性成分的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。如果适当，则活性成分还可为具有上述赋形剂中的一种或多种的微囊封化形式。

用于口服施用本发明化合物的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、混悬液、糖浆剂和酏剂。除活性成分之外，所述液体剂型可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如像，水或其他溶剂、增溶剂以及乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(具体地说，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油以及芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇以及脱水山梨醇的脂肪酸酯及其混合物。

除惰性稀释剂之外，所述口服组合物还可包含助剂，诸如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、矫味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。

除活性化合物之外，混悬液还可含有助悬剂，例如像乙氧基化异十八醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂以及黄蓍胶及其混合物。

用于直肠或阴道施用的制剂可作为栓剂呈现，所述栓剂可通过将一种或多种本发明化合物与一种或多种合适的无刺激性赋形剂或载体(包括例如，可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸酯)混合来制备，并且所述栓剂在室温下为固体，但在体温下为液体并且因此在直肠或阴道腔中将熔化并且释放所述活性化合物。

用于局部或经皮施用如本文提供的寡聚物的制剂或剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液、贴剂以及吸入剂。可在无菌条件下将所述活性寡聚物与药学上可接受的载体以及与可能必需的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。除本发明的活性化合物之外，所述软膏剂、糊剂、霜剂和凝胶剂可含有赋形剂，诸如动物和蔬菜脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石以及氧化锌或其混合物。

除本发明的寡聚物之外，粉剂和喷雾剂可含有赋形剂，诸如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙以及聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂可另外地含有常规推进剂，诸如氯氟烃和挥发性未取代的烃(诸如丁烷或丙烷)。

经皮贴剂具有向身体提供本发明寡聚物的受控递送的附加优点。此类剂型可通过将寡聚物溶解或分散在适当的介质中来制得。吸收增强剂还可用于增加试剂穿过皮肤的通量。除本领域已知的其他方法之外，这种通量的速率可通过提供速率控制膜或通过将试剂分散在聚合物基质或凝胶中来控制。

适用于肠胃外施用的药物组合物可包含一种或多种本发明的寡聚物，其与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性溶液或非水性溶液、分散液、混悬液或乳液，或可在临使用前复原成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末组合，所述无菌等渗水性溶液或非水性溶液、分散液、混悬液或乳液或无菌粉末可含有糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质或悬浮剂或增稠剂。可用于本发明药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。适当流动性可例如通过使用涂覆材料(诸如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持。

这些组合物也可含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。微生物对主题寡聚物的作用的预防可通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等来确保。还可合乎需要的是在组合物中包括等渗剂，诸如糖、氯化钠等。另外，可通过包含延迟吸收的试剂诸如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射药物形式的延迟吸收。

在一些情况下，为了延长药物的作用，需要减缓皮下注射或肌肉内注射的药物的吸收。除本领域已知的其他方法之外，这可通过使用具有低水溶性的结晶或无定形材料的液体混悬液来完成。药物的吸收速率则取决于其溶解速率，而溶解速率又可取决于晶体尺寸和晶形。可替代地，通过将药物溶解或悬浮于油媒介物中来完成肠胃外施用的药物形式的延迟吸收。

可注射贮库形式可通过在生物可降解聚合物诸如聚丙交酯-聚乙交酯中形成主题寡聚物的微胶囊基质来制得。取决于寡聚物与聚合物的比率和所采用的具体聚合物的性质，可控制寡聚物释放的速率。其他生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还可通过将药物截留在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备贮库式可注射制剂。

当本发明的寡聚物作为药物向人和动物施用时，它们可本身给予或作为含有例如0.1％至99％(更优选10％至30％)与药学上可接受的载体组合的活性成分的药物组合物给予。

如上所述，用于本发明的制剂或制品可口服、肠胃外、局部或直肠给予。它们通常以适用于每种施用途径的形式给予。例如，它们以片剂或胶囊剂形式，通过注射、吸入、眼用洗剂、软膏剂、栓剂等施用，通过注射、输注或吸入施用；通过洗剂或软膏剂局部施用；以及通过栓剂直肠施用。

如本文所用的短语“肠胃外施用”和“以肠胃外方式施用”意指除肠内和局部施用之外的施用模式，通常通过注射来施用，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。

如本文所用的短语“全身施用”、“全身地施用”、“外周施用”和“外周地施用”意指不同于直接进入中枢神经系统而施用化合物、药物或其他材料，使得其进入患者系统，并且因此进行新陈代谢和其他类似过程，例如皮下施用。

无论选择何种施用途径，可通过本领域技术人员已知的常规方法将本发明中使用的寡聚物(其可以合适的水合形式使用)和/或本发明的药物组合物配制成药学上可接受的剂型。本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能有所变化，以便获得对于特定患者、组合物和施用模式有效实现期望治疗反应而对患者不具毒性的活性成分的量。

所选剂量水平将取决于多种因素，包括所采用的本发明特定寡聚物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所采用的特定寡聚物的排泄或代谢速率、吸收的速率和程度、治疗持续时间、与所采用的特定寡聚物组合使用的其他药物、化合物和/或物质、所治疗患者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状况和先前的病史以及医学领域中熟知的类似因素。

具有本领域中的普通技艺的医师或兽医能够容易地判定和开具有效量的所需药物组合物。例如，医生或兽医可以水平低于达到期望治疗效果所需的水平开始药物组合物中采用的本发明化合物的剂量，并逐渐增加剂量直到达到期望效果。一般来说，本发明化合物的合适的每日剂量将为化合物有效产生治疗效果的最低剂量的量。这种有效剂量将通常取决于上述因素。通常，当用于所指出效果时，本发明化合物对患者的经口、静脉内、脑室内和皮下剂量将在每天每千克体重约0.0001至约100mg范围内。

如果需要，则活性化合物的有效日剂量可任选地以单位剂型以在全天内以适当间隔分开施用的两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量施用。在某些情况下，给药是每天一次施用。在某些实施方案中，根据需要，给药是每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月一次或多次施用以治疗所期望病状。

反义分子可通过本领域技术人员已知的各种方法向细胞施用，所述方法包括但不限于在脂质体中包封、离子电渗疗法或掺入到如本文所述和本领域已知的其他媒介物(诸如水凝胶、环糊精、生物可降解的纳米胶囊和生物粘附性微球)中。在某些实施方案中，微乳化技术可用于改善亲脂性(水不溶性)药物试剂的生物利用度。实例包括Trimetrine(Dordunoo,S.K.等,Drug Development and Industrial Pharmacy,17(12),1685-1713,1991和REV 5901(Sheen,P.C.等,J Pharm Sci 80(7),712-714,1991)。除其他益处之外，微乳化通过优先将吸收引导至淋巴系统而不是循环系统由此绕过肝脏，并且防止肝胆循环中化合物的破坏来提供增强的生物利用度。

在本发明的一个方面，制剂含有由如本文提供的寡聚物和至少一种两亲性载体形成的胶束，其中所述胶束具有小于约100nm的平均直径。更优选的实施方案提供平均直径小于约50nm的胶束，并且甚至更优选的实施方案提供平均直径小于约30nm，或甚至小于约20nm的胶束。

虽然考虑了所有合适的两亲性载体，但目前优选的载体通常是具有通常认可为安全(GRAS)状态，并且当溶液与复杂的水相(诸如在人胃肠道中发现的一种水相)接触时可溶解本发明化合物并在稍后阶段使其微乳化的那些载体。通常，满足这些要求的两亲性成分具有2-20的HLB(亲水性至亲脂性平衡)值，并且它们的结构含有C-6至C-20范围内的直链脂族基团。实例是聚乙二醇化的脂肪甘油酯和聚乙二醇。

两亲性载体的实例包括饱和和单不饱和聚乙二醇化的脂肪酸甘油酯，诸如由完全或部分氢化的各种植物油获得的那些。此类油可有利地由三-、二-和单-脂肪酸甘油酯和相应脂肪酸的二-和单-聚乙二醇酯组成，其中特别优选的脂肪酸组合物包括癸酸4％-10％、癸酸3％-9％、月桂酸40％-50％、肉豆蔻酸14％-24％、棕榈酸4％-14％和硬脂酸5％-15％。另一类可用的两亲性载体包括部分酯化的脱水山梨糖醇和/或山梨糖醇，与饱和或单不饱和脂肪酸(SPAN-系列)或相应的乙氧基化类似物(TWEEN-系列)。

可商购获得的两亲性载体可能是特别可用的，包括Gelucire系列、Labrafil、Labrasol或Lauroglycol(均由Gattefosse Corporation,Saint Priest,France制造和分销)、PEG-单油酸酯、PEG-二油酸酯、PEG-单月桂酸酯和二月桂酸酯、卵磷脂、聚山梨醇酯80等(由美国和全球的许多公司生产和分销)。

在某些实施方案中，递送可通过使用脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等发生，以便将本发明的组合物引入到合适的宿主细胞中。特别地，本发明的组合物可配制用于包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球、纳米颗粒等中进行递送。可使用已知和常规技术进行此类递送媒介物的配制和使用。

适用于本发明的亲水性聚合物是易溶于水的、可共价连接到形成囊泡的脂质，并且在体内耐受而没有毒性作用(即，是生物相容性的)的那些聚合物。合适的聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(也称为聚丙交酯)、聚乙醇酸(也称为聚乙交酯)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物和聚乙烯醇。在某些实施方案中，聚合物的分子量为约100或120道尔顿至约5,000或10,000道尔顿，或约300道尔顿至约5,000道尔顿。在其他实施方案中，聚合物是分子量为约100至约5,000道尔顿或分子量为约300至约5,000道尔顿的聚乙二醇。在某些实施方案中，聚合物是750道尔顿的聚乙二醇(PEG(750))。聚合物还可由其中的单体数量来定义；本发明的优选实施方案利用至少约三种单体的聚合物，诸如由三种单体组成的PEG聚合物(大约150道尔顿)。

可适用于本发明的其他亲水性聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺和衍生的纤维素诸如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素。

在某些实施方案中，用于本发明的制剂包含选自由以下组成的组的生物相容性聚合物：聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物、聚乙烯聚合物、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物、纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酸酐、聚(邻)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、多糖、蛋白质、聚透明质酸、聚氰基丙烯酸酯及其共混物、混合物或共聚物。

环糊精是环状低聚糖，由6、7或8个葡萄糖单元组成，分别由希腊字母α、β或γ表示。葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键连接。由于糖单元的椅子构象，所有仲羟基(在C-2、C-3处)位于环的一侧上，而C-6处的所有伯羟基位于另一侧上。结果，外表面是亲水性的，从而使环糊精是水溶性的。相比之下，环糊精的腔是疏水性的，因为它们由原子C-3和C-5的氢以及类似醚的氧排成行。这些基质允许与各种相对疏水性化合物(包括例如，类固醇化合物诸如17α-雌二醇)络合(参见，例如，van Uden等Plant Cell Tiss.Org.Cult.38:1-3-113(1994))。络合通过范德华相互作用和氢键形成发生。关于环糊精化学的一般综述，参见,Wenz,Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.,33:803-822(1994)。

环糊精衍生物的物理化学特性很大程度上取决于取代的种类和程度。例如，它们在水中的溶解度范围从不溶性(例如，三乙酰基-β-环糊精)至147％可溶(w/v)(G-2-β-环糊精)。另外，它们可溶于许多有机溶剂中。环糊精的特性使得能够通过增加或减小其溶解度来控制各种制剂组分的溶解度。

已描述了许多环糊精及其制备方法。例如Parmeter(I),等(美国专利号3,453,259)和Gramera,等(美国专利号3,459,731)描述了电中性环糊精。其他衍生物包括具有阳离子特性的环糊精[Parmeter(II)，美国专利号3,453,257]、不溶性交联环糊精(Solms，美国专利号3,420,788)和具有阴离子特性的环糊精[Parmeter(III)，美国专利号3,426,011]。在具有阴离子特性的环糊精衍生物中，羧酸、亚磷酸、三价膦酸、膦酸、磷酸、硫代膦酸、硫代亚磺酸和磺酸已附加到母体环糊精[参见，Parmeter(III)，同上]。此外，磺基烷基醚环糊精衍生物已由Stella等描述(美国专利号5,134,127)。

脂质体由至少一个包封水性内部隔室的脂质双层膜组成。脂质体可通过膜类型和尺寸来表征。小单层囊泡(SUV)具有单个膜，并且通常直径在0.02与0.05μm之间；大单层囊泡(LUVS)通常大于0.05μm。寡层大囊泡和多层囊泡具有多个(通常是同心的)膜层，并且通常大于0.1μm。具有几个非同心膜的脂质体，即包含在较大囊泡内的几个较小的囊泡被称为多泡囊泡。

本发明方法的一个方面使用包含含有本发明寡聚物的脂质体的制剂，其中配制脂质体膜以提供具有增加的携带能力的脂质体。可替代地或另外地，本发明的化合物可包含在脂质体的脂质体双层内或吸附在其上。本发明的寡聚物可与脂质表面活性剂聚集并携带在脂质体的内部空间内；在这些情况下，配制脂质体膜以抵抗活性剂-表面活性剂聚集体的破坏作用。

根据本发明方法的一个实施方案，脂质体的脂质双层含有用聚乙二醇(PEG)衍生的脂质，使得PEG链从脂质双层的内表面延伸到由脂质体包封的内部空间中，并且从脂质双层的外部延伸进入周围环境中。

包含在本发明方法的脂质体内的活性剂是为溶解形式的。表面活性剂和活性剂(诸如含有感兴趣活性剂的乳液或胶束)的聚集体可截留在根据本发明的脂质体的内部空间内。表面活性剂用于分散和溶解活性剂，并且可选自任何合适的脂族、环脂族或芳族表面活性剂，包括但不限于具有不同链长(例如，约C14至约C20)的生物相容性溶血磷脂酰胆碱(LPC)。聚合物衍生的脂质诸如PEG-脂质也可用于胶束形成，因为它们将起到抑制胶束/膜融合的作用，并且因为向表面活性剂分子中加入聚合物降低了表面活性剂的CMC并有助于胶束形成。优选的是具有微摩尔范围的CMC的表面活性剂；较高CMC表面活性剂可用于制备截留在本发明脂质体内的胶束。

根据本发明方法使用的脂质体可通过本领域已知的多种技术中的任一种来制备。参见例如，美国专利号4,235,871；公布的PCT申请号WO 96/14057；New RRC,Liposomes:Apractical approach,IRL Press,Oxford(1990),第33-104页；Lasic DD,Liposomesfromphysics to applications,Elsevier Science Publishers BV,Amsterdam,1993。例如，本发明的脂质体可通过将用亲水性聚合物衍生的脂质扩散到预先形成的脂质体中来制备，诸如通过将预先形成的脂质体暴露于由脂质接枝聚合物构成的胶束，其脂质浓度对应于脂质体中所期望的衍生化脂质的最终摩尔百分比。含有亲水性聚合物的脂质体还可通过本领域已知的均质化、脂质场水合或挤出技术形成。

在另一个示例性配制程序中，首先通过超声处理将活性剂分散在溶血磷脂酰胆碱或容易地溶解疏水性分子的其他低CMC表面活性剂(包括聚合物接枝的脂质)中。然后将所得活性剂的胶束混悬液用于再水合含有合适摩尔百分比的聚合物接枝的脂质或胆固醇的干燥脂质样品。然后使用如本领域已知的挤出技术将脂质和活性剂混悬液形成脂质体，并且通过标准柱分离将所得脂质体与未包封的溶液分离。

在本发明方法的一个方面，制备脂质体以在选定的尺寸范围内具有基本上均匀的尺寸。一种有效的按尺寸分选(sizing)方法包括通过具有所选择的均匀的孔径的一系列聚碳酸酯膜将脂质体的水性混悬液挤出；膜的孔径将大致对应于通过经由这种膜挤出产生的脂质体的最大尺寸。参见例如，美国专利号4,737,323(1988年4月12日)。在某些实施方案中，可将试剂诸如

和

用于将多核苷酸或蛋白质引入到细胞中。

用于本发明方法的制剂的释放特征取决于包封材料、包封药物的浓度和释放调节剂的存在。例如，可将释放操作为pH依赖性的，例如，如在胃中使用仅在低pH下释放的pH敏感性包衣，或如在肠中使用仅在较高pH下释放的pH敏感性包衣。肠溶包衣可用于防止在通过胃之前发生释放。包封在不同材料中的多种包衣或氨腈的混合物可用于在胃中获得初始释放，随后在肠中释放。还可通过包含盐或成孔剂来操作释放，所述盐或成孔剂可通过从胶囊扩散来增加水摄取或药物释放。改变药物溶解度的赋形剂也可用于控制释放速率。还可掺入增强基质降解或从基质中释放的试剂。它们可被加入到药物中，作为单独的相加入(即作为颗粒)，或者可根据化合物共溶在聚合物相中。在大多数情况下，所述量应为0.1％至30％(w/w聚合物)。降解增强剂的类型包括无机盐(诸如硫酸铵和氯化铵)、有机酸(诸如柠檬酸、苯甲酸和抗坏血酸)、无机碱(诸如碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、碳酸锌和氢氧化锌)和有机碱(诸如硫酸鱼精蛋白、精胺、胆碱、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺)，以及表面活性剂(诸如

和

)。可为基质添加微观结构的成孔剂(即，水溶性化合物诸如无机盐和糖)作为颗粒加入。所述范围通常为1％至30％(w/w聚合物)。

还可通过改变颗粒在肠中的停留时间来操作摄取。例如，这可通过用粘膜粘合剂聚合物涂覆颗粒或选择粘膜粘合剂聚合物作为包封材料来实现。实例包括具有游离羧基的大多数聚合物，诸如脱乙酰壳多糖、纤维素，并且尤其是聚丙烯酸酯(如本文所用，聚丙烯酸酯是指包括丙烯酸酯基团和修饰的丙烯酸酯基团的聚合物，诸如氰基丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯)。

寡聚物可被配制成包含在外科手术或医疗装置或植入物内，或适于通过其释放。在某些方面，植入物可用寡聚物涂覆或以其他方式处理。例如，水凝胶或其他聚合物(诸如生物相容性和/或生物可降解的聚合物)可用于用本发明的组合物涂覆植入物(即所述组合物可通过使用水凝胶或其他聚合物适合于与医疗装置一起使用)。用于用试剂涂覆医疗装置的聚合物和共聚物在本领域中是熟知的。植入物的实例包括但不限于支架、药物洗脱支架、缝合线、假体、血管导管、透析导管、血管移植物、假体心脏瓣膜、心脏起搏器、植入式心律转复除颤器、IV针、用于骨固定和形成的装置，诸如销、螺钉、板和其他装置，以及用于伤口愈合的人造组织基质。

除本文提供的方法之外，用于根据本发明使用的寡聚物可通过类推其他药物被配制用于以任何方便的方式施用以在人或兽医学中使用。在炎症治疗中，反义寡聚物及其相应的制剂可单独施用或与其他治疗策略组合施用。

根据本发明的方法，反义寡聚物递送的途径包括但不限于各种全身途径，包括口服和肠胃外途径，例如，静脉内、皮下、腹膜内和肌肉内，以及吸入、经皮、肺部和局部递送。适合于治疗中受试者的病状，适当的途径可由本领域技术人员确定。例如，用于在治疗皮肤病状中递送反义寡聚物的适当途径可包括局部递送，而反义寡聚物用于治疗呼吸病状(例如，COPD)的递送可包括吸入、经鼻或肺部递送。寡聚物还可直接递送到炎症感染部位或血流中。

反义寡聚物可在生理学上可接受的任何方便的媒介物中施用。这种组合物可包括由本领域普通技术人员采用的各种标准药学上可接受的载体中的任一种。实例包括但不限于盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、水、含水乙醇、乳液(诸如油/水乳液或甘油三酯乳液)、片剂和胶囊。合适的生理学上可接受的载体的选择将根据所选择施用模式而变化。

在一些情况下，如上所述，脂质体可用于促进反义寡核苷酸摄取进入细胞中。(参见例如，Williams,S.A.,Leukemia 10(12):1980-1989,1996；Lappalainen等,AntiviralRes.23:119,1994；Uhlmann等,antisense oligonucleotides:a new therapeuticprinciple,Chemical Reviews,第90卷,No.4,第544-584页,1990；Gregoriadis,G.,第14章,Liposomes,Drug Carriers in Biology and Medicine,第287-341页,AcademicPress,1979)。水凝胶还可用作反义寡聚物施用的媒介物，例如，如PCT申请公开号WO 93/01286或PCT申请号US1992/005305中所述。可替代地，寡核苷酸可以微球或微粒施用。(参见例如，Wu,G.Y.和Wu,C.H.,J.Biol.Chem.262:4429-4432,1987)。可替代地，使用与反义寡聚物络合的充气微泡可增强向靶组织的递送，如美国专利号6,245,747中所述。

还可使用缓释组合物。这些可包括为定形物品，诸如膜或微胶囊形式的半透性聚合物基质。

在某些实施方案中，反义化合物可以有效产生至少200-400nM反义寡聚物的峰值血液浓度的量和方式施用。通常，通常以规则的间隔施用一个或多个剂量的反义寡聚物持续约一至两周的时间段。口服施用的优选剂量是每70kg约1-100mg寡聚物。在一些情况下，大于100mg寡聚物/患者的剂量可能是必要的。对于静脉内施用，优选的剂量是每70kg约1mg至500mg寡聚物。反义寡聚物可以规则的间隔施用持续短时间段例如，每天施用持续两周或更短时间。然而，在一些情况下，寡聚物在较长时间段内间歇施用。可在施用抗生素或其他治疗性治疗之后或同时进行施用。基于治疗中受试者的免疫测定、其他生物化学测试和生理学检查的结果，可如所指出调整治疗方案(剂量、频率、途径等)。

在本说明书中引用的所有公布和专利申请均以引用的方式并入本文，如同明确地且单独地指示每一个单个的公布或专利申请以引用的方式并入。

可组合上述各个实施方案以提供进一步的实施方案。2016年4月29日提交的美国临时申请62/330,027全文以引用方式并入本文。根据以上详细说明，可对实施方案进行这些和其他变化。一般来说，在以下权利要求书中，所使用的术语不应解释为将权利要求限制于本说明书和权利要求书中公开的具体实施方案，而应解释为包括连同与所述权利要求所规定的全部范围等效物一起的所有可能的实施方案。因此，所述权利要求不受本公开的限制。

尽管为了清楚理解的目的，已通过举例说明和实施例相当详细地描述了前述公开，但根据本公开的教义，本领域的普通技术人员将显而易见的是，可另外对本公开进行某些改变和修改而不背离所附权利要求的精神和范围。以下实施例仅以说明方式提供，而并不起限制作用。本领域技术人员将容易地识别各种非关键性参数，所述参数可能发生改变或修改而产生基本上类似的结果。

序列表

实施例

材料

1.HGPS小鼠模型

人BAC克隆RP11-702H12(RPCI-11人BAC文库，儿童医院奥克兰研究所(Children’sHospital Oakland Research Institute),Oakland,CA的BACPAC资源中心)含有来自染色体1q的164.4kb基因组DNA的插入物，其包括LMNA基因(25.4kb)和其他三个已知基因UBQLN4、MAPBPIP和RAB25。用含有G608G突变的穿梭片段进行BAC克隆RP11-702H12的重组靶向，所述G608G突变通过PCR从HGPS成纤维细胞系AG11498(Coriell Cell Repositories，NIA系列)的基因组DNA产生。HGPS的人BACG608G转基因小鼠模型在所有组织中表达突变的人LMNA蛋白，称为早衰蛋白。小鼠出现与HGPS患者大致相同的病理学。在杂合状态下，小鼠展示出具有变硬的无反应性血管弹性的主要动脉中血管平滑肌细胞(VSMC)的损失。在纯合状态下，小鼠显示出更多的进行性VSMC损失，伴有外膜增厚、整体脂肪营养不良、绷紧干燥的皮肤、毛发稀疏、脊柱后凸、关节挛缩和步态受限。具有两个转基因拷贝的这些小鼠在6-8个月龄时过早死亡。

2.PPMO

“Gly”表示通过甘氨酸羧基处的酰胺键连接到3’末端吗啉代亚基环氮，并且还通过与甘氨酸NH₂的酰胺键连接在肽的CPP羧基末端处的甘氨酸接头。“R”是精氨酸并且“Ac”是乙酰基。

实施例1

用靶向LMNA的PPMO治疗后HGPS小鼠的DDPCR分析

进行数字液滴PCR(ddPCR)实验以测量用PPMO1(SEQ ID NO:3)和PPMO2(SEQ IDNO:4)治疗后HGPS转基因小鼠中早衰蛋白和野生型LMNA的表达水平。将总共37只小鼠分配到以下测试组中：

从4周龄开始按照上表对小鼠给药，并且在12周后处死。使用标准Trizol程序(Ambion)从心脏、肝脏、四头肌和主动脉提取RNA。使用标准iScript^TM cDNA合成程序(Bio-Rad)从0.5μg总RNA制备cDNA，并且通过ddPCR分析剪接抑制。实验结果在图1-4中列出。

参考文献

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Claims (12)

1.一种式(III)的反义寡聚物化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

每个Nu是核碱基，它们一起形成选自以下的靶向序列，序列方向为5’至3’：

a)SEQ ID NO:3，其序列为CTGAGCCGCTGGCAGATGCCTTGTC，其中Z是23；和

b)SEQ ID NO:4，其序列为GAGGAGATGGGTCCACCCACCTGGG，其中Z是23；

其中R^a是乙酰基。

2.如权利要求1所述的反义寡聚物化合物，其中所述靶序列是SEQ ID NO:3，其序列为CTGAGCCGCTGGCAGATGCCTTGTC，并且Z是23。

3.如权利要求1所述的反义寡聚物化合物，其中所述靶序列是SEQ ID NO:4，其序列为GAGGAGATGGGTCCACCCACCTGGG，并且Z是23。

4.如权利要求1所述的反义寡聚物化合物，其中所述反义寡聚物化合物是式(IV)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中每个Nu是核碱基，它们一起形成靶向序列，序列方向为5'至3'，其中所述靶向序列是SEQ ID NO:3，其序列为CTGAGCCGCTGGCAGATGCCTTGTC，并且Z是23。

5.如权利要求1所述的反义寡聚物化合物，其中所述反义寡聚物化合物是式(IV)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中每个Nu是核碱基，它们一起形成靶向序列，序列方向为5'至3'，其中所述靶向序列是SEQ ID NO:4，其序列为GAGGAGATGGGTCCACCCACCTGGG，并且Z是23。

6.一种反义寡聚物化合物或其药学上可接受的盐，其选自：

7.如权利要求6所述的反义寡聚物化合物，其中所述反义寡聚物化合物是：

8.如权利要求6所述的反义寡聚物化合物，其中所述反义寡聚物化合物是：

9.一种反义寡聚物化合物或其药学上可接受的盐，其选自：

10.如权利要求1-9中任一项所述的反义寡聚物化合物，其中所述反义寡聚物化合物是0.6HCl的药学上可接受的盐。

11.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-10中任一项所述的反义寡聚物化合物和药学上可接受的载体。

12.根据权利要求1-10中任一项所述的反义寡聚物化合物或如权利要求11所述的药物组合物在制备用于治疗有需要的受试者的早年衰老综合症的药物中的用途。

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