ES2876939T3 - Péptidos penetradores de células que tienen un dominio hidrófobo central - Google Patents

Péptidos penetradores de células que tienen un dominio hidrófobo central Download PDF

Info

Publication number
ES2876939T3
ES2876939T3 ES12756546T ES12756546T ES2876939T3 ES 2876939 T3 ES2876939 T3 ES 2876939T3 ES 12756546 T ES12756546 T ES 12756546T ES 12756546 T ES12756546 T ES 12756546T ES 2876939 T3 ES2876939 T3 ES 2876939T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
pip
peptide
pmo
domain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES12756546T
Other languages
English (en)
Inventor
Michael John Gait
Andrey Alexandrovich Arzumanov
Amer F Saleh
Matthew J A Wood
Corinne Betts
Taeyoung Koo
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
United Kingdom Research and Innovation
Original Assignee
United Kingdom Research and Innovation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1115014.1A external-priority patent/GB201115014D0/en
Priority claimed from GBGB1211740.4A external-priority patent/GB201211740D0/en
Application filed by United Kingdom Research and Innovation filed Critical United Kingdom Research and Innovation
Application granted granted Critical
Publication of ES2876939T3 publication Critical patent/ES2876939T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C07K14/003—Peptide-nucleic acids (PNAs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/02—Linear peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Abstract

Un péptido, que tiene una estructura de secuencia primaria compuesta por al menos tres dominios, teniendo la disposición: [Dominio 1] aminoterminal - [Dominio 2] - [Dominio 3] carboxiterminal en la que: (i) El dominio 1 comprende una secuencia elegida entre: RXRZ3 [SEQ ID NO: 762] en la que Z3 se selecciona de uno de: RBRRXR [SEQ ID NO: 763 RBRRX [SEQ ID NO: 764] RBRX [SEQ ID NO: 765] RBRXR [SEQ ID NO: 766] BRX [SEQ ID NO: 767] BX [SEQ ID NO: 768] RBR [SEQ ID NO: 769] RB [SEQ ID NO: 770] o RBRR [SEQ ID NO: 771] (ii) El dominio 2 comprende una secuencia que contiene al menos 3 de los aminoácidos Z1, Z2, F, L, I [SEQ ID NO: 798], en la que Z1 es Y o I y Z2 es Q o R, y en la que el dominio 2 no contiene una secuencia primaria contigua aminoterminal a carboxiterminal de ILFQY [SEQ ID NO: 799], ILFQ [SEQ ID NO: 800] o ILIQ [SEQ ID NO: 801], (iii) El dominio 3 comprende una secuencia elegida entre: RXRBRXRB [SEQ ID NO: 772] XRBRXRB [SEQ ID NO: 773] RXRRBRB [SEQ ID NO: 774] BRXRB [SEQ ID NO: 775] XRRBRB [SEQ ID NO: 776] RRBRB [SEQ ID NO: 777] XRBRB [SEQ ID NO: 778] RBRXRB [SEQ ID NO: 779] RXRBRB [SEQ ID NO: 780] o BRBRB [SEQ ID NO: 781] en la que X = ácido aminohexanoico, B = β-alanina.

Description

DESCRIPCIÓN
Péptidos penetradores de células que tienen un dominio hidrófobo central
Campo de la invención
La presente invención se refiere a péptidos, en particular, aunque no exclusivamente, a péptidos penetradores de células y a conjugados de un péptido penetrador de células y una molécula de carga.
Antecedentes de la invención
Los oligonucleótidos (ON) que se dirigen a secuencias de ARN esenciales han encontrado numerosas aplicaciones recientes en la modulación de la expresión génica en las células y como posibles tratamientos12. Una ventaja mecánica de los ON bloqueantes estéricos sobre los ON antisentido inductores de RNasa H y los reactivos de ARNip inductores de RISC es una mayor especificidad, ya que es menos probable que la unión de un ON a un ARN incorrecto desencadene un efecto biológico no deseado fuera de la diana. En segundo lugar, se puede utilizar una gama mucho más amplia de análogos de ON sintéticos, ya que no existe ningún requisito para el reconocimiento molecular por parte de una enzima de escisión del ARN del hospedador.
Los más importantes entre los análogos de ON útiles como bloqueantes estéricos son aquellos con cadenas principales no cargadas, tales como los ácidos nucleicos peptídicos (PNA, del inglés 'peptide nucleic acids' )3 y los oligonucleótidos de fosforodiamidato morfolino (PMO, del inglés 'phosphorodiamidate morpholino oligonucleotides')4 Se han utilizado ON PNA y PMO in vivo para aplicaciones dirigidas al ARN para el desarrollo de tratamientos5. En cultivo celular, se observa que tanto PNA como PMO entran en las células solo de manera bastante pobre y, por lo tanto, se ha realizado un gran esfuerzo para desarrollar procedimientos para mejorar la administración celular. Particularmente útil ha sido la unión de péptidos penetradores de células (CPP, del inglés 'cell penetrating peptides'), tales como penetratina, Tat (48-60), Transportán y (R-Ahx-R)4 (Ahx = ácido aminohexanoico), con la esperanza de que su poder de translocación celular observado como péptidos se pueda utilizar cuando se conjuguen con PNA o PMO6-9.
Un ensayo valioso para evaluar la actividad de ON bloqueantes estéricos es el establecido por Kole y sus colegas, que implica la corrección por corte y empalme de un intrón de p-globina de talasemia anómalo mediante un ON sintético de 18 mer (sitio 705) en el núcleo de las células HeLa pLuc705 y posterior regulación positiva de luciferasa de luciérnaga indicadora10. Este ensayo tiene un intervalo dinámico muy alto, de modo que incluso los niveles de actividad muy bajos se pueden medir como una lectura de luminiscencia positiva. En el presente ensayo se han probado conjugados CPP-PNA dirigidos al sitio de corte y empalme 705 y se han informado de niveles de actividad moderados para varios CPP diferentes cuando el conjugado CPP-PNA se incuba con células HeLa pLuc705 en ausencia de un agente de transfección añadido, mientras que PNA solo está inactivo11-13. En nuestros laboratorios, se encontró que mientras que los conjugados Tat-PNA o (Lys)s-PNA requirieron incubación conjunta con cloroquina 100 pM, un agente endosomolítico, para ver una actividad significativa en el ensayo1415, la actividad en el intervalo de pM para las construcciones (R-Ahx-R)4-PNA y (R-Ahx-R)4-PMO pudieron obtenerse en ausencia de cloroquina716.
También se ha informado de un CPP en el que se añadieron seis restos de Arg al extremo N del conocido CPP penetratina1718. R6-Penetratina (R6Pen) conjugado con disulfuro a un PNA complementario al ARN del elemento sensible a la transactivación del VIH-1 mostró una actividad significativa en un ensayo de inhibición de la transactivación dependiente de Tat indicador de luciferasa de células HeLa que requería administración nuclear y unión a ARN TAR para inhibir la expresión de la luciferasa18.
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es un trastorno muscular ligado al cromosoma X causado principalmente por mutaciones sin sentido o de cambio de marco en el gen de la distrofina, que ocurre con una frecuencia de aproximadamente 1 de cada 3500 nacimientos de varones vivos y las terapias potenciales son muy necesarias29. Los pacientes con DMD sufren un desgaste muscular intenso y progresivo, mientras que la distrofia muscular de Becker más leve es causada por eliminaciones en el marco que dan como resultado la expresión de una proteína acortada pero parcialmente funcional. Se ha demostrado que los oligonucleótidos (ON) antisentido específicos de secuencia inducen omisión de exón dirigida para corregir el marco de lectura del ARNm de distrofina mutado, de modo que se producen formas de distrofina más cortas con una actividad similar a la de la distrofia muscular de Becker3031. Se han realizado estudios en modelos celulares, en un modelo de ratón mdx distrófico que contiene una mutación sin sentido en el exón 2331-33, y en un modelo de perro que ha mostrado una gran promesa para el enfoque de omisión de exón. La actividad biológica se logra como resultado de la unión del ON al pre-ARNm de distrofina en los núcleos de las células musculares para provocar una alteración de los patrones de corte y empalme mediante un mecanismo de "bloqueo estérico".
Los pacientes con DMD a menudo padecen degeneración del músculo cardíaco, lo que conduce a formas de enfermedad cardíaca tales como la miocardiopatía y la miocardiopatía dilatada ligada al cromosoma X. Por tanto, se necesitan CPP que permitan una mejor expresión de distrofina funcional o parcialmente funcional en el músculo cardíaco.
Los oligonucleótidos antisentido son actualmente la intervención terapéutica más prometedora para la distrofia muscular de Duchenne. Los oligonucleótidos antisentido modulan el corte y empalme del pre-ARNm de la distrofina, restaurando así específicamente el marco de lectura de la distrofina y generando una proteína distrofina truncada pero semifuncional. Los desafíos en el desarrollo de este enfoque son la administración sistémica de oligonucleótidos antisentido relativamente deficiente y la corrección ineficaz de la distrofina en los tejidos musculares no esqueléticos afectados, incluyendo el corazón.
Uno de los factores más importantes que determinan la eficacia de la omisión de exón es la química de los ON. El más utilizado ha sido el 2'-O-metilo fosforotioato (2'OMePS). Esta cadena principal se probó inicialmente en un ensayo clínico de fase I dirigido al exón 51 del pre-ARNm de distrofina en pacientes con DMD que implicaba inyección intramuscular34. Se llevó a cabo un ensayo de fase I similar utilizando un oligonucleótido fosforodiamidato morfolino (PMO)35. Recientemente se han completado ensayos clínicos de fase II que implican administración sistémica en pacientes con DMD químicas de tanto 2'OMePS (Goermans NM y col., (2011) New England J. Med., 364, 1513-1522) como PMO (Cirak, S. y col. (2011) The Lancet, doi:10.1016/S0140-6736(11)60756-3). Los estudios en ratones han sugerido niveles más elevados de omisión de exón y restauración de la expresión de distrofina utilizando PMO en comparación con 2'OMePS35. Los PMO son moléculas no iónicas y se considera que es menos probable que formen interacciones no deseadas con las moléculas intracelulares de las células diana.
Yin y Wood han examinado otro análogo no iónico llamado ácidos nucleicos peptídicos (PNA) mediante inyección intramuscular en ratones mdx y han encontrado una inducción significativa de omisión de exones y producción de distrofina23. Tanto los PMO como los PNA se consideran análogos de ON no tóxicos con una elevada especificidad de secuencia que tienen un potencial significativo para el desarrollo farmacéutico. Se ha demostrado que el PMO con omisión de exón se tolera bien en ratones con una dosis de 960 mg/kg (Sazani, P. y col. (2011) Int, J. Toxocol, 30, 322-333) y a 320 mg/kg en monos (Sazani, P. y col. (2011) Int. J. Toxicol, 30, 313-321).
Varios grupos de investigación han estado trabajando en el diseño de CPP (a veces llamados péptidos de translocación de membrana) que cuando se conjugan con ON no iónicos (tales como PNA o PMO) ayudan a su administración a las células (pero no a los tipos iónicos) y, por lo tanto, aumentan la actividad biológica del ON. En el caso de PMO, se ha divulgado un péptido que contiene aminoácidos (R-Ahx-R)4-Ahx-B naturales y no naturales que cuando se conjugan con PMO da como resultado niveles más elevados de actividad de bloqueo estérico en varias células y modelos in vivo36. Esto se ha investigado en estudios de DMD en ratones mdx37.
Para ser útil para aplicaciones in vivo, se prefiere que los CPP demuestren una penetración eficaz de las membranas celulares y nucleares, particularmente cuando se unen a una carga tal como PNA o PMO, para permitir una corrección de corte y empalme eficaz, por ejemplo, CE50 de aproximadamente 0,90 pM o menos según lo medido por el ensayo de luciferasa de corrección de corte y empalme de Kole y col. Además, el CPP debe tener una buena estabilidad sérica para resistir la degradación antes de la penetración celular. Para aplicaciones terapéuticas, los CPP también deben tener una baja toxicidad.
Anteriormente se creó una serie de CPP para la conjugación con una carga de PNA que tiene la secuencia de bases de 20 mer GGCCAAACCTCGGCTTACCT [SEQ ID No : 309] (llamada PNADMD) o con una carga de PMO que tiene la secuencia de bases de 25 mer GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT [SEQ ID NO: 310] (llamado PMODMD). Tanto PNADMD como PMODMD se utilizan comúnmente como análogos de oligonucleótidos adecuados para la omisión de exón en células musculares mdx (in vitro) y en ratones mdx (in vivo). Pip 5e-PMODMD presentó omisión de exón y restauración de la expresión de distrofina en células musculares H2K de ratón diferenciadas y en un modelo de ratón mdx con DMD, incluyendo inducción de la producción de distrofina en el músculo cardíaco. Pip 5e tiene la secuencia: RXRRBRRXRILFQYRXRBRXRBC [SEQ ID NO: 1] y se divulga en el documento WO2009/147368 y en Yin y col. (Molecular Therapy Vol.19, N.° 71295-1303, julio de 2011). La secuencia del péptido Pip 5e se puede dividir en tres dominios, dos dominios ricos en arginina (RXRRBRRXR y RXRBRXRB) y un núcleo central hidrófobo (ILFQY). Se encontró que Pip-5e tiene una buena actividad en la administración de PMODMD en el músculo cardíaco.
Wu y col. (Nucleic Acids Research, 2007, Vol. 35, N.° 15 5182-5191) informó que los conjugados CPP-PMOF (F representa un marcador 3'-carboxifluoresceína) en los que se habían insertado restos X o B en una secuencia de oligonucleótidos-R aumentaron la actividad de corrección de corte y empalme y la captación celular y ayudaron a la unión al suero, pero que los conjugados no entraron en las células de manera tan eficaz como los conjugados con R8-y R9-. También se informó que el número de restos X afecta tanto a la actividad nuclear antisentido como a la toxicidad de los conjugados, con péptidos de más de 5 restos X que presentan toxicidad dependiente del tiempo y de la concentración a 60 pM en líneas celulares. Se sugiere mantener el número de restos X en menos de 5 para reducir la toxicidad. También se informó que la reducción del número de repeticiones RX o RB en (RX)n o (RB)n reduce la captación celular y reduce la capacidad de corrección de corte y empalme (en el ensayo de células HeLa).
Abes y col., (Nucleic Acids Research, 2008, 36, 6353-6354) analizan las moléculas de CPP que tienen una estructura (RXR)n-PMO e informan que de varias moléculas espaciadoras (X) probadas, un espaciador lineal C 4 (Abu), C6 (Ahx) o C8 (Acy) es el más eficaz.
Saleh y col. (Bioconjugate Chem. Vol. 21, N.° 101902-1911 (2010)) informaron que el aumento del número de restos de arginina en una disposición lineal (RXR)n a 12 y 16 para conjugados con PNA aumenta la capacidad de corrección de corte y empalme en un ensayo de células HeLa, pero también aumenta de la toxicidad celular. La ramificación de la cadena (2 o 4 ramas) no dio como resultado una actividad mejorada. Se toleraron ramas de 2 cadenas y algunas ramas de 4 cadenas para construcciones de 12 y 16 argininas, pero no para construcciones de 8 argininas.
Por tanto, aumentando el número de restos espaciadores, tales como X, parece aumentar la toxicidad y reducir la eficacia de la entrada celular en comparación con los péptidos oligoR, pero también puede aumentar la actividad de corrección de corte y empalme. Por otro lado, un elevado número de restos R parece conducir a una mayor eficacia de entrada celular pero también a una mayor toxicidad, lo cual no es deseable. Por tanto, se requieren CPP que proporcionen un equilibrio entre una buena eficacia de entrada celular y una baja toxicidad. Además, es deseable que el CPP muestre propiedades favorables in vivo, tales como dirigir una elevada omisión de exón y producción de distrofina en el modelo de ratón, mdx, en todo tipo de músculos, incluyendo el corazón.
El documento WO2011/064552 describe una construcción adecuada para la administración de un compuesto biológicamente activo a las células, que comprende un péptido cargado positivamente; un péptido de administración dirigida; y el compuesto biológicamente activo; en el que el péptido cargado positivamente está unido de manera covalente al péptido de administración dirigida y el compuesto biológicamente activo está unido de manera covalente o no covalente al péptido quimérico de administración celular resultante.
Boisguerin y col., 2011 (J. Control. Rel. 156: 146-153) describe la administración sistémica del péptido antiapoptótico BH4 utilizando CPP para prevenir lesiones por isquemia-reperfusión cardíaca in vivo.
Ivanova y col., 2008 (Nuc. Ac. Res. 36 (20: 6418-6428) describe conjugados PNA-péptido de penetración celular mejorados para la redirección del corte y empalme en las células HeLa y la omisión de exón en modelo de ratón mdx.
Sumario de la invención
Los inventores han creado ahora una nueva serie de CPP y han evaluado su capacidad para facilitar la entrada celular de moléculas de carga conjugadas y la toxicidad celular de los CPP.
Inesperadamente, los inventores han identificado que la secuencia lineal aminoterminal a carboxiterminal (es decir, la secuencia primaria) del dominio central hidrófobo no es esencial para la actividad de penetración celular, y que la presencia de los aminoácidos centrales, en lugar de su secuencia principal, es el factor importante. Así pues, se han dado cuenta de que la relación estructura-actividad no depende de una estructura proporcionada por un orden de secuencia lineal particular de aminoácidos en el núcleo hidrófobo, sino que depende de la presencia de determinados aminoácidos en el núcleo hidrófobo. Esto ha permitido a los inventores diseñar una nueva serie de péptidos penetradores de células, descrita en el presente documento.
Por tanto, los inventores han identificado una nueva serie de péptidos penetradores de células prometedores. Los péptidos pueden actuar como fracciones portadoras para facilitar el movimiento de una carga a través de las membranas celulares y nucleares y, opcionalmente, para administrar cargas a tipos de órganos particulares (tales como el corazón). También se proporcionan conjugados péptido-carga.
Se han preparado y probado cuatro series de péptidos novedosos como conjugados péptido-PMO de carga. Los péptidos y las cargas unidas se muestran en las figuras 18 y 41 y se resumen a continuación:
Pip-6a, Pip-6b, Pip-6c, Pip-6d, Pip-6e, Pip-6f, Pip-6g, Pip-6h, Pipe-6i [SEQ ID NO: 2 a 10];
Pip-7a, Pip-7b, Pip-7c, Pip-7d, Pip-7b2, Pipe-7c2 [SEQ ID NO: 11 a 16];
Pip-8a, Pip-8b, Pip-8c, Pip-8c2, Pip-8d, Pip-8d2, Pip-8d3 [SEQ ID NO: 17 a 20 y 317 a 319]; o
Pip-9b, Pip-9b2, Pip-9c, Pip-9c2, Pip-9c3, Pip-9d, Pip-9d2, Pip-9d3, Pip-9d4 [SEQ ID NO: 320 a 328].
Pip-6a [SEQ ID NO: 2], Pip-6b [SEQ ID NO: 3], Pip-6c [SEQ ID NO: 4], Pip-6d [SEQ ID NO: 5], Pip-6e [SEQ ID NO: 6], Pip-6f [SEQ ID NO: 7], Pip-6g [SEQ ID NO: 8], Pip-6h [SEQ ID NO: 9] y Pip-6i [SEQ ID NO: 10] conjugados con PMODMD muestran niveles elevados de omisión de exón en células de ratón mdx in vitro. Pip-6a, Pip-6b y Pip-6f mantuvieron la omisión de exón y la producción de distrofina en el músculo cardíaco en ratones mdx (es decir, in vivo), comparable a Pip-5e. Pip-8b, Pip-8c, Pip-9b, Pip-9b2 y Pip-9c que también han mostrado una restauración eficaz de la distrofina en el tibial anterior (Ta), diafragma, cuádriceps y corazón, sin toxicidad aparente.
Por consiguiente, se espera que el componente peptídico penetrador de células de los conjugados CPP-PMO probados y los péptidos que tienen una identidad de secuencia y estructura sustancialmente similares sean útiles para facilitar la penetración celular y nuclear de cargas tales como oligonucleótidos antisentido que incluyen PNA, PMO, ARNip, péptidos y proteínas, así como pequeñas moléculas.
Por consiguiente, la presente invención proporciona péptidos que son útiles para facilitar la captación de dichas cargas a través de las membranas celulares, tales como la membrana plasmática de una célula de mamífero y/o la membrana nuclear de una célula de mamífero. Los péptidos pueden denominarse "péptidos penetradores de células" y pueden conjugarse con una carga para facilitar el transporte de la carga a través de la membrana.
Los péptidos de acuerdo con la invención tienen una secuencia que es una molécula única químicamente contigua. La secuencia de péptidos puede estar compuesta de aminoácidos y no aminoácidos opcionales, por ejemplo, restos espaciadores aminohexanoicos. Por ejemplo, en algunas partes del péptido, un espaciador de ácido aminohexanoico puede unirse químicamente al extremo carboxiterminal de un primer aminoácido y al extremo aminoterminal de un segundo aminoácido, uniendo así, de manera química, los dos aminoácidos. En la presente memoria descriptiva, un aminoácido se cuenta como un "resto" y una molécula espaciadora o un aminoácido no natural también se cuenta como un "resto".
Los péptidos pueden incluir aminoácidos modificados y de origen no natural. Preferentemente, cualquier resto espaciador y aminoácidos modificados o no se unen a restos adyacentes mediante un enlace peptídico covalente (amida) [-C(=O)NH-].
Cada péptido comprende o consiste en 3 dominios en la siguiente disposición lineal:
[Dominio 1] aminoterminal -[Dominio 2] -[Dominio 3] carboxiterminal
Cada dominio tiene características de secuencia comunes, pero la secuencia exacta de cada dominio es susceptible de variación y modificación. Por tanto, es posible una gama de secuencias para cada dominio. La combinación de cada posible secuencia de dominio produce una gama de secuencias de péptidos que forman parte de la presente invención.
La secuencia peptídica central está representada por la secuencia de aminoácidos contigua (y espaciador opcional) a los dominios 1 a 3. Puede estar presente una secuencia de enlace opcional dispuesta para permitir el enlace a la carga, normalmente en el extremo C del dominio 3.
En la siguiente descripción se utiliza el código estándar de aminoácidos de una letra. Los aminoácidos no naturales y las moléculas espaciadoras se denominan mediante el siguiente código de una letra:
X = cualquiera de ácido aminohexanoico, ácido aminobutírico, ácido aminocaprílico, p-alanilo, p-aminobenzoilo, isonipecotilo o
4-aminobutirilo,
B = p-alanina
R = arginina
El dominio 1 es una secuencia rica en arginina y puede tener 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más aminoácidos de longitud. Preferentemente, el dominio 1 tiene 5, 6, 7, 8 o 9 restos (por ejemplo, X, B o R).
Preferentemente, el dominio 1 tiene dos o más aminoácidos catiónicos con aminoácidos hidrófobos o grupos espaciadores que separan algunos de los aminoácidos catiónicos. En realizaciones preferidas, el aminoácido catiónico es arginina (R). Preferentemente, el dominio 1 tiene al menos 2 restos de arginina, y preferentemente uno de 2, 3, 4, 5 o 6 restos de arginina. En algunas realizaciones, el dominio 1 contiene 3, 4, 5, 6 o más restos de arginina.
El dominio 1 tiene preferentemente una longitud máxima inferior a 15 restos, más preferentemente inferior a 13 restos y una longitud mínima de 4 restos (por ejemplo, X, B o R).
Las secuencias del dominio 1 preferidas se eligen del grupo de:
RXRRBRRXR [SEQ ID NO: 782]
RXRRBRRX [SEQ ID NO: 783]
RXRRBRX [SEQ ID NO: 784]
RXRBRX [SEQ ID NO: 785]
RXRBX [SEQ ID NO: 790]
RXRRBRXR [SEQ ID NO: 786]
RXRRBR [SEQ ID NO: 787]
RXRRB [SEQ ID NO: 788] o
RXRRBRR [SEQ ID NO: 789].
El dominio 2 contiene la secuencia de aminoácidos central. Este comprende una secuencia que contiene al menos 3 de los aminoácidos Z1Z2FLI, en el que Z1 es Y o I y Z2 es Q o R. Los aminoácidos Z1Z2FLI pueden estar en cualquier orden. Los inventores han descubierto que la secuencia primaria del dominio 2 (es decir, el orden desde el extremo N al C) no es esencial para la actividad de penetración celular. En algunas realizaciones particularmente preferidas, el dominio 2 no contiene una secuencia primaria contigua aminoterminal a carboxiterminal de ILFQY, ILFQ o ILIQ, aunque puede contener estos aminoácidos en un orden de secuencia primaria contigua aminoterminal a carboxiterminal diferente.
La secuencia del dominio 2 puede contener 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos adicionales en uno o ambos extremos aminoterminal o carboxiterminal de la secuencia. Preferentemente no hay ninguno, uno o dos aminoácidos en el extremo aminoterminal y ninguno, uno o dos aminoácidos en el extremo carboxiterminal. Así pues, el dominio 2 puede tener una longitud de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos. El dominio 2 es preferentemente un dominio hidrófobo.
El dominio 2 tiene preferentemente una longitud máxima inferior a 10 restos, más preferentemente inferior a 7 restos y una longitud mínima de 3 restos, más preferentemente 4 o 5 restos (las longitudes respectivas incluyen grupos espaciadores, por ejemplo, X, y aminoácidos no naturales). En realizaciones preferidas, el dominio 2 tiene 3, 4, 5 o 6 restos (incluyendo grupos espaciadores, por ejemplo, X y aminoácidos no naturales). Los aminoácidos adicionales pueden ser de cualquier tipo.
El dominio 3 es un dominio catiónico y preferentemente tiene una secuencia elegida entre:
RXRBRXRB [SEQ ID NO 772]
XRBRXRB [SEQ ID NO 773]
RXRRBRB [SEQ ID NO: 774]
BRXRB [SEQ ID NO: 775]
XRRBRB [SEQ ID NO: 776]
RRBRB [SEQ ID NO 777]
XRBRB [SEQ ID NO: 778]
RBRXRB [SEQ ID NO: 779]
RXRBRB [SEQ ID NO: 780] o
BRBRB [SEQ ID NO 781]
Preferentemente, el dominio 3 tiene dos o más aminoácidos catiónicos con aminoácidos hidrófobos o grupos espaciadores que separan algunos de los aminoácidos catiónicos. En realizaciones preferidas, el aminoácido catiónico es arginina (R). Preferentemente, el dominio 3 tiene al menos 2, 3 o 4 restos de arginina. En algunas realizaciones, el dominio 3 contiene 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más restos de arginina.
En algunas realizaciones, el dominio 3 tiene una longitud mínima de 3 aminoácidos y una longitud máxima de 15 restos (incluyendo los grupos espaciadores, por ejemplo, X y aminoácidos no naturales). En algunas realizaciones, la longitud mínima, incluyendo los grupos espaciadores, es 4 o más y la longitud máxima, incluyendo los grupos espaciadores, es 12 o menos. En algunas realizaciones, el dominio 3 tiene una longitud de uno de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 restos.
El número total de restos de arginina en los dominios 1, 2 y 3 combinados puede ser del 30 al 60 % del número total de restos y puede ser uno del 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 % o el 60 %. En algunas realizaciones, el número total de restos de arginina en los dominios 1, 2 y 3 combinados puede estar en el intervalo del 30 al 50 % del número total de restos, o en el intervalo del 30 % al 45 % o del 30 al 40 %, o del 35 al 45 %.
El uso de ácido aminohexanoico y p-alanina en los dominios 1 y 3 es ventajoso porque ayuda a minimizar la inmunogenia del péptido y aumenta la resistencia a la proteólisis.
Puede disponerse un enlazador para permitir el enlace químico del péptido a la carga. El enlazador también puede actuar como un espaciador para separar la parte del dominio 1 a 3 del péptido de la carga. Es posible una variedad de secuencias enlazadoras, incluyendo secuencias que tienen un resto de cisteína carboxiterminal que permite la formación de un enlace disulfuro, tioéter o tiol-maleimida. Otras formas de unir el péptido a la carga incluyen el uso de un aldehído carboxiterminal para formar una oxima, el uso de una reacción de clic o formación de un enlace morfolino con un aminoácido básico en el péptido que puede ir seguido de una secuencia espaciadora antes del dominio 3 que comprende: X o B o XB o BX.
La secuencia enlazadora puede tener una longitud de 1,2, 3, 4, 5 o más aminoácidos y/o restos (incluyendo los grupos espaciadores). La secuencia enlazadora puede elegirse del grupo de: BCys, XCys, Cys, GGCys, BBCys, BXCys, XBCys, X, XX, B, BB, BX o XB. Cualquier B o X puede ser reemplazado por otro espaciador, que, por ejemplo, se puede elegir entre 4-aminobutirilo (Aib) e isonicopecotilo.
La secuencia enlazadora puede formar parte de la carga a la que se va a unir el péptido. En algunas realizaciones, la unión de la carga se realiza directamente al extremo carboxiterminal de la secuencia del dominio 3. Así pues, en algunas realizaciones no se requiere una secuencia enlazadora, o se proporciona mediante el enlace de la carga y la secuencia del dominio 3.
De acuerdo con lo anterior, los péptidos de acuerdo con la invención se pueden representar como sigue:
Z4YQFLIZ5 [SEQ ID NO 791]
Z4IQFLI,Z5 [SEQ ID NO: 792]
Z4YRFLIZ5 [SEQ ID NO 793]
Z4YRFRLIZ5 [SEQ ID NO: 794]
Z4FQILYZ5 [SEQ ID NO 795]
Z4QFLIZ5 [SEQ ID NO: 796]
(continuación)
Z4QFLZ5 [SEQ ID NO: 797]
en los que Z4 es elegido de uno de
RXRRBRRXR [SEQ ID NO: 782]
RXRRBRRX [SEQ ID NO: 783]
RXRRBRX [SEQ ID NO: 784]
RXRBRX [SEQ ID NO: 785]
RXRRBRXR [SEQ ID NO: 786]
RXRRBR [SEQ ID NO: 787]
RXRRB [SEQ ID NO: 788] o
RXRRBRR [SEQ ID NO: 789]
y Z5 es elegido de uno de
RXRBRXRB [SEQ ID NO: 772]
XRBRXRB [SEQ ID NO: 773]
RXRRBRB [SEQ ID NO: 774]
BRXRB [SEQ ID NO: 775]
XRRBRB [SEQ ID NO: 776]
RRBRB [SEQ ID NO 777]
XRBRB [SEQ ID NO: 778]
RBRXRB [SEQ ID NO: 779]
RXRBRB [SEQ ID NO: 780] o
BRBRB [SEQ ID NO 781]
en los que Z5 puede comprender opcionalmente un enlazador en el extremo carboxiterminal, que puede ser uno de BCys, XCys, Cys, GGCys, BBCys, BXCys o XBCys, X, XX, B, BB, BX o XB.
Los péptidos preferidos pueden comprender, o consistir en, una secuencia elegida entre una de las SEQ ID NO 2 a 308 o 317 a 761 (Figura 18, figuras 23 a 30 y figura 41).
Los péptidos de acuerdo con la presente invención se pueden elegir entre cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 3, 6 o 7.
Excluyendo la molécula de carga, los péptidos de acuerdo con la presente invención pueden tener una longitud máxima de 40 restos, más preferentemente 30 restos, y aún más preferentemente una de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 restos y una longitud mínima de 10 restos, más preferentemente una de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 restos (la longitud máxima y mínima incluye cualquier molécula espaciadora, por ejemplo, X y aminoácidos no naturales o modificados).
Los péptidos de acuerdo con la presente invención se pueden proporcionar como conjugados péptido-carga en los que el péptido comprende además una molécula de carga unida químicamente (preferentemente unida de manera covalente) al péptido en el extremo aminoterminal o carboxiterminal del péptido, preferentemente en el extremo carboxiterminal. El enlace químico puede ser mediante de un enlace disulfuro, enlace tioéter o tiol-maleimida, o mediante enlace amida a través del ácido carboxílico carboxiterminal.
La molécula de carga puede ser cualquier molécula pequeña, por ejemplo, un fármaco de molécula pequeña, péptido, péptido cíclico, proteína, fármaco o medicamento (por ejemplo, de peso molecular inferior a 10.000 Da, preferentemente inferior a 5.000 Da o inferior a 3000 Da y, en algunos casos, inferior a 1000 Da). La molécula de carga puede ser un ácido nucleico, oligonucleótido antisentido (tal como PNA, PMO, LNA) o ARNip. Las moléculas de carga preferidas son análogos de oligonucleótidos eléctricamente neutros tales como PNA o PMO.
En una realización, la carga es PNA705 (CCTCTTACCTCAGTTACA [SEQ ID NO: 316]). En otra realización, la carga es PNADMD (SEQ ID NO: 309). En otra realización, la carga es PmOdMD (SEQ ID nO: 310). La molécula de carga puede tener al menos un 80 %, preferentemente al menos un 90 %, de identidad de secuencia con uno de PNADMD (SEQ ID NO: 309) o PMODMD (SEQ ID NO: 310). Pueden añadirse restos de lisina a uno o ambos extremos de estas moléculas de PNA o PMO para mejorar la solubilidad en agua. Puede añadirse cisteína en el extremo C o en el extremo N para permitir la formación de enlaces disulfuro o bromoacetilación para la conjugación con tioéter o para la conjugación con tiol-maleimida.
Los péptidos de acuerdo con la presente invención se pueden proporcionar en forma aislada o purificada, con o sin una molécula de carga.
Los derivados de los péptidos también forman parte de la presente invención. Los derivados de péptidos incluyen variantes de una secuencia de péptidos dada (por ejemplo, una de las SEQ ID NO: 2 a 308) que tienen una identidad de secuencia de aminoácidos sustancial (por ejemplo, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 %) con respecto al péptido de longitud completa y preferentemente tienen la misma o mejor actividad de omisión de exón o viabilidad celular. Los derivados de péptidos pueden tener 1, 2 o 3 aminoácidos o moléculas espaciadoras más o menos que una de las SEQ ID NO: 2 a 308.
El porcentaje (%) de identidad de secuencia se define como el porcentaje de restos (incluyendo los grupos espaciadores) en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de la secuencia indicada dada (denominada SEQ ID NO.) después de alinear las secuencias e introducir huecos si fuese necesario, para lograr la máxima identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. La identidad de secuencia se calcula preferentemente a lo largo de toda la longitud de las secuencias respectivas.
La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de varias formas conocidas por un experto en la materia, por ejemplo, utilizando un programa informático disponible públicamente tal como el programa informático ClustalW 1.82. T-coffee o Megalign (DNASTAR). Cuando se utiliza dicho programa informático, los parámetros predeterminados, por ejemplo, la penalización por hueco y penalización por extensión, se utilizan preferentemente. Los parámetros predeterminados de ClustalW 1.82 son:
Penalización por apertura de hueco de proteínas = 10,0, Penalización por extensión de hueco de proteínas = 0,2, Matriz de proteínas = Gonnet, ENDGAP proteína/ADN = -1, GAPDIST proteína/ADN = 4.
Los derivados de péptidos también pueden comprender reemplazos de aminoácidos conservativos que, por ejemplo, puede estar entre aminoácidos dentro de los siguientes grupos:
(i) glicina, alanina, serina, treonina;
(ii) ácido glutámico y ácido aspártico;
(iii) arginina, histidina y lisina;
(iv) asparagina y glutamina;
(v) isoleucina, leucina y valina;
(vi) fenilalanina, tirosina y triptófano.
Los péptidos de acuerdo con la presente invención muestran preferentemente una elevada actividad cuando se conjugan con PMODMD en la omisión de exón en células musculares H2K de ratón diferenciadas (Yin y col. (Molecular Therapy Vol.19, N.° 71295-1303, julio de 2011). Preferentemente la CE50 establecida en el presente ensayo es inferior a 2 pM. En algunas realizaciones, la CE50 establecida en el presente ensayo es inferior a 1 pM, inferior a 0,9 pM, inferior a 0,8 pM, inferior a 0,7 pM o inferior a 0,6 pM. Los péptidos de acuerdo con la presente invención presentan preferentemente mayor o la misma actividad (es decir, tienen una CE50 menor o igual) en el ensayo de células de omisión de exón como uno de Pip-5e o (RXRRBR)2XB [SEQ ID NO: 311].
Los péptidos de acuerdo con la presente invención presentan preferentemente una mayor estabilidad en suero después de dos horas en suero (por ejemplo, suero de ratón o humano) en comparación con R6Pen y preferentemente una estabilidad en suero equivalente (u opcionalmente mejor) en comparación con Pip-5e o (RXRRBR)2XB [SEQ ID NO: 311]. La estabilidad en suero se puede medir mediante la adición de una alícuota de Pip-PMO (10 nmoles) al suero de ratón al 100 % (100 pl) y la incubación a 37 °C durante 120 o 240 min. Cada reacción se diluye con solución i.m. de guanidinio-HCl (300 pl) y acetonitrilo enfriado con hielo (600 pl). Las muestras se mezclan y se mantienen a -20 °C, y las proteínas séricas precipitadas se separan mediante centrifugación (13000 rpm, 5 min). Después de la centrifugación, se recoge el sobrenadante, se liofiliza y el resto se disuelve en agua para análisis de degradación de péptidos mediante espectrometría de masas MALDI-TOF y mediante HPLC de fase inversa. Las condiciones de la HPLC son: Columna, C18 fase inversa (250 x 4,6 mm); Disolvente A, TFA al 0,1 %, disolvente B, acetonitrilo al 90 %, disolvente A al 10 %; Gradiente, disolvente B del 10 % al 50 % en 25 minutos.
En los péptidos y conjugados de péptidos de la presente invención, los aminoácidos, los espaciadores de aminoácidos y las moléculas de carga están todos preferentemente unidos químicamente mediante enlaces covalentes.
Pueden proporcionarse péptidos y conjugados péptido-carga de acuerdo con la presente invención para su uso en un procedimiento de tratamiento médico. El tratamiento médico puede requerir preferentemente la administración de la molécula de carga a una célula y, opcionalmente, al núcleo de la célula.
Por consiguiente, se proporcionan péptidos y/o conjugados péptido-carga para su uso en el tratamiento de enfermedades. También se proporciona el uso de un péptido y/o un conjugado péptido-carga en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades. También se proporciona un procedimiento de tratamiento de un paciente o sujeto que necesita tratamiento para una enfermedad que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido y/o un conjugado péptido-carga al paciente o sujeto. Preferentemente, el componente de carga de un conjugado péptido-carga comprende un principio activo (por ejemplo, un agente farmacéutico) capaz de tratar, prevenir o mejorar la enfermedad.
Las enfermedades a tratar pueden incluir cualquier enfermedad en la que la penetración mejorada de la célula y/o la membrana nuclear por una molécula farmacéutica o terapéutica pueda conducir a un efecto terapéutico mejorado. Las enfermedades a tratar pueden incluir afecciones causadas por (total o parcialmente) deficiencias de corte y empalme, por ejemplo, distrofia muscular de Duchenne (DMD), distrofia muscular de Becker y otras enfermedades musculares tales como la distrofia muscular de la cintura y extremidades (LGMD), distrofia muscular facioescapulohumeral, distrofia muscular congénita, distrofia muscular oculofaríngea (OMD), distrofia muscular distal y distrofia muscular de Emery-Dreifuss (EDMD), así como la enfermedad de Menkes38, la p-talasemia39, corrección de corte y empalme de la proteína T para aliviar la demencia frontotemporal, parkinsonismo y atrofia muscular espinal39, síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford40, ataxia-telangiectasia mutada (ATM)41, atrofia muscular en la columna, distrofia miotónica 1 o cáncer. Los genes implicados en la patogenia de algunas de estas enfermedades incluyen distrofina (distrofia muscular de Duchenne y distrofia muscular de Becker), DMPK (DM de tipo DM1), ZNF9 (DM de tipo DM2), PABPN1 (OMD), emerina, lamina A o lamina C (EDMD), miotilina (LGMD-1A), lamina A/C (LGMD-1B), caveolina-3 (LGMD-1C), calpaína-3 (LGMD-2A), disferlina (LGMD-2B y miopatía de Miyoshi), Y-sarcoglicano LGMD-2C), a-sarcoglicano (LGMD-2D), p-sarcoglicano (LGMD-2E), ó-sarcoglicano (LGMD-2F y CMD1L), teletonina (LGMD-2G), TRIM32 (LGMD-2H), proteína relacionada con fukutina (LGMD-2I), titina (LGMD-2J) y O-manosiltransferasa-1 (Lg Md -2K).
En dichos casos de enfermedades que implican defectos de corte y empalme, la carga puede comprender un oligonucleótido, PNA, PMO u otros tipos de oligonucleótidos, incluyendo LNA, capaz de prevenir o corregir el defecto de corte y empalme y/o aumentar la producción de (por ejemplo, número de) moléculas de ARNm empalmadas correctamente. La presente invención, por supuesto, no se limita a moléculas de carga capaces de corregir un defecto de corte y empalme. Las moléculas de carga pueden incluir otras moléculas de oligonucleótidos, PNA, PMO o LNA, tales como moléculas de oligonucleótidos capaces de dirigirse a ARNm o microARN, por ejemplo, ARNip o ARNhc para la atenuación de la expresión génica, así como moléculas no oligonucleotídicas.
Los péptidos de acuerdo con la presente invención conjugados con PMODMD han demostrado una eficacia excelente en la omisión de exones en el músculo cardíaco, lo que conduce a la producción de fibras que contienen distrofina. Dado que la insuficiencia cardíaca es una de las principales causas de muerte en pacientes que padecen DMD, los péptidos de acuerdo con la presente invención son particularmente útiles en el tratamiento de la DMD mediante la conjugación con un oligonucleótido (por ejemplo, PNA o PMO) capaz de inducir una omisión de exón que conduce a la producción de distrofina normal en el tejido cardíaco, particularmente en el músculo cardíaco. Esto es particularmente importante a la luz del éxito de los ensayos clínicos de fase II (2'OMe y PMO) que solo restauran la distrofina en el tejido esquelético. Existe una preocupación de que esto pueda aumentar la carga de trabajo del corazón, progresando/acelerando así la progresión de la enfermedad cardíaca. Los conjugados péptido-PMOD-MD se consideran especialmente útiles en el tratamiento de la DMD.
Así pues, los péptidos de acuerdo con la presente invención son particularmente útiles para la administración de moléculas de carga al tejido cardíaco, particularmente al músculo cardíaco. Por consiguiente, los conjugados péptidocarga de acuerdo con la presente invención se proporcionan para su uso en el tratamiento de enfermedades o afecciones del corazón o del músculo cardíaco, o que se manifiestan en el corazón o el músculo cardíaco, tales como enfermedades del corazón y miocardiopatía.
Las enfermedades del músculo cardíaco a tratar pueden ser cardiopatía coronaria, cardiopatía congénita, miocardiopatía isquémica, hipertensiva, inflamatoria o intrínseca. La miocardiopatía intrínseca incluye los siguientes trastornos (con genes asociados): miocardiopatía dilatada (distrofina, G4.5, actina, desmina, ó-sarcoglicano, troponina T, cadena pesada de p-miosina, a-tropomiosina, cadena respiratoria mitocondrial), miocardiopatía dilatada con enfermedad de conducción (lamina A/C), miocardiopatía hipertrófica (cadena pesada de p-miosina, troponina T, troponina I, a-tropomiosina, proteína C que se une a la miosina, cadena ligera esencial de miosina, cadena ligera reguladora de miosina, titina), miocardiopatía hipertrófica con síndrome de Wolff-Parkinson-White (AMPK, cadena respiratoria mitocondrial) y no compactación del ventrículo izquierdo (G4.5, a-distrobrevina).
El paciente o sujeto a tratar puede ser cualquier animal o ser humano. El paciente o sujeto puede ser un mamífero no humano, pero es más preferentemente un paciente humano. El paciente o sujeto puede ser hombre o mujer.
Los medicamentos y las composiciones farmacéuticas de acuerdo con los aspectos de la presente invención pueden formularse para su administración por varias vías, incluyendo, pero sin limitación, parenteral, intravenosa, intrarterial, intramuscular, intratumoral, intraperitoneal, subcutánea, oral y nasal. Los medicamentos y composiciones se pueden formular en forma líquida o sólida. Se pueden formular formulaciones líquidas para la administración mediante inyección en una región seleccionada del cuerpo humano o animal.
La administración es preferentemente en una "cantidad terapéuticamente eficaz", siendo ésta suficiente para mostrar beneficio al individuo. La dosis real administrada, y la velocidad y el tiempo de administración, dependerán de la naturaleza y la intensidad de la enfermedad que se esté tratando. La prescripción de tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la dosificación, etc., es responsabilidad de los médicos generales y otros médicos y normalmente tiene en cuenta el trastorno que se va a tratar, el estado del paciente individual, el lugar de administración, el procedimiento de administración y otros factores conocidos por los médicos. Se pueden encontrar ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados anteriormente en Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a edición, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins.
Los péptidos y los conjugados péptido-carga también se proporcionan para su uso en procedimientos in vitro. Por ejemplo, se proporciona el uso de un péptido y/o un conjugado péptido-carga en un ensayo de omisión de exón o ensayo de viabilidad celular. Además, los péptidos y los conjugados péptido-carga se proporcionan para su uso en un modelo de ratón con DMD, el ratón mdx, para la omisión de exón y la producción de distrofina.
El término "in vitro" pretende abarcar experimentos con células en cultivo, mientras que el término "in vivo" pretende abarcar experimentos con organismos multicelulares inalterados.
También se proporciona un ácido nucleico que codifica un péptido de acuerdo con la presente invención. También se proporciona un vector de ácido nucleico, por ejemplo, un plásmido, que tiene una secuencia reguladora, por ejemplo, un promotor, operativamente unido a un ácido nucleico que codifica un péptido de acuerdo con la presente invención. El vector es preferentemente capaz de expresar el péptido cuando se transfecta en una célula adecuada, por ejemplo, una célula de mamífero, bacteriana o fúngica. Los ácidos nucleicos se pueden proporcionar en forma aislada o purificada.
En esta memoria descriptiva, la expresión "unido operativamente" puede incluir la situación en la que una secuencia de nucleótidos seleccionada y una secuencia de nucleótidos reguladora están unidas covalentemente de tal manera que coloque la expresión de una secuencia codificante de nucleótidos bajo la influencia o el control de la secuencia reguladora. Por tanto, una secuencia reguladora está unida operativamente a una secuencia de nucleótidos seleccionada si la secuencia reguladora es capaz de efectuar la transcripción de una secuencia codificante de nucleótidos que forma parte o toda la secuencia de nucleótidos seleccionada. Cuando sea apropiado, la transcripción resultante puede, a continuación, traducirse en un péptido deseado.
De acuerdo con lo anterior, se proporcionan los siguientes aspectos y realizaciones de la presente divulgación.
En un aspecto de la presente divulgación, se proporciona un péptido que tiene una estructura de secuencia primaria compuesta por al menos tres dominios, teniendo la disposición:
[Dominio 1] aminoterminal -[Dominio 2] -[Dominio 3] carboxiterminal
en la que
el número de restos R (arginina) en los dominios 1 y 3 combinados es de al menos 5,
el número de restos X en los dominios 1 y 3 combinados es al menos 1,
el número de restos B en los dominios 1 y 3 combinados es al menos 2,
en la que X = ácido aminohexanoico y B = p-alanina,
y en la que
el dominio 2 comprende una secuencia que contiene al menos 3 de los aminoácidos Z1Z2FLI, en el que Z1 es Y o I y Z2 es Q o R, y
el dominio 2 no contiene una secuencia primaria contigua aminoterminal a carboxiterminal de ILFQY, ILFQ o ILIQ.
El número total de restos en los dominios 1 a 3 combinados es preferentemente no más de 50, más preferentemente no más de 40, y lo más preferentemente está entre 20 y 30.
En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un péptido que tiene una estructura de secuencia primaria compuesta por al menos tres dominios, teniendo la disposición:
[Dominio 1] aminoterminal -[Dominio 2] -[Dominio 3] carboxiterminal en la que:
(i) El dominio 1 comprende una secuencia elegida entre:
RXRZ3 [SEQ ID NO: 762]
en la que Z3 se selecciona de uno de:
RBRRXR [SEQ ID NO: 763]
RBRRX [SEQ ID NO: 764]
RBRX [SEQ ID NO: 765]
RBRXR [SEQ ID NO: 766]
BRX [SEQ ID NO: 767]
BX [SEQ ID NO: 768]
RBR [SEQ ID NO: 769]
RB [SEQ ID NO: 770] o
RBRR [SEQ ID NO: 771]
(ii) El dominio 2 comprende una secuencia que contiene al menos 3 de los aminoácidos Z1Z2FLI, en el que Z1 es Y o I y Z2 es Q o R, y en la que el dominio 2 no contiene una secuencia primaria contigua aminoterminal a carboxiterminal de ILFQY, ILFQ o ILIQ,
(iii) El dominio 3 comprende una secuencia elegida entre:
RXRBRXRB [SEQ ID NO 772]
XRBRXRB [SEQ ID NO: 773]
RXRRBRB [SEQ ID NO: 774]
BRXRB [SEQ ID NO: 775]
XRRBRB [SEQ ID NO: 776]
RRBRB [SEQ ID NO 777]
XRBRB [SEQ ID NO: 778]
RBRXRB [SEQ ID NO: 779]
RXRBRB [SEQ ID NO: 780] o
BRBRB [SEQ ID NO 781]
en la que X = ácido aminohexanoico y B = p-alanina.
En algunas realizaciones, el dominio 2 comprende una secuencia primaria contigua aminoterminal a carboxiterminal elegida de YQFLI, IQFLI, YRFLI, YRFRLI, FQILY, QFLI o QFL. En algunas realizaciones, el dominio 2 tiene 4 o 5 aminoácidos. 7. En algunas realizaciones, el dominio 2 tiene 0, 1, 2 o 3 restos R.
En algunas realizaciones, el dominio 1 comprende, o consiste en, una secuencia elegida entre:
RXRRBRRXR [SEQ ID NO: 782]
RXRRBRRX [SEQ ID NO: 783]
RXRRBRX [SEQ ID NO: 784]
RXRBRX [SEQ ID NO: 785]
RXRRBRXR [SEQ ID NO: 786]
RXRRBR [SEQ ID NO: 787]
RXRRB [SEQ ID NO: 788] o
RXRRBRR [SEQ ID NO: 789].
comprende o consiste en una secuencia elegida entre
RXRBRXRB [SEQ ID NO: 772]
XRBRXRB [SEQ ID NO: 773]
RXRRBRB [SEQ ID NO: 774]
BRXRB [SEQ ID NO: 775]
XRRBRB [SEQ ID NO: 776]
RRBRB [SEQ ID NO: 777]
XRBRB [SEQ ID NO: 778]
RBRXRB [SEQ ID NO: 779]
RXRBRB [SEQ ID NO: 780] o
BRBRB [SEQ ID NO: 781].
En algunas realizaciones, el péptido tiene entre 6 y 12 restos R, preferentemente uno de 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 restos R. El dominio 2 puede tener 1,2 o 3 restos R. El dominio 1 puede tener 6 restos R o menos, por ejemplo, 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6 restos R. El dominio 3 puede tener 4 restos R o menos, por ejemplo, 0, 1,2, 3 o 4 restos R. Los restos R pueden ser D-Arginina o L-Arginina, o una mezcla de ambos.
En algunas realizaciones preferidas, los dominios 1 y 3 solo contienen restos R, X y B, o solo tienen 1 o 2 restos que no son X o B.
Así pues, el dominio 1 puede tener cualquier combinación de (i) 2 a 6 restos R, (ii) 1 a 3 restos X y (iii) 1 a 2 restos B, y preferentemente no tiene más de 10 restos de longitud y tiene 0, 1 o 2 restos que no son R, X o B. El dominio 3 puede tener cualquier combinación de (a) 2 a 5 restos R, (b) 1 a 3 restos X y (c) 1 a 3 restos B, y preferentemente no tiene más de 9 restos de longitud y tiene 0, 1 o 2 restos que no son R, X o B.
En algunas realizaciones, el péptido tiene una longitud máxima de 30 restos, incluyendo aminoácidos naturales y restos X y B. Así pues, en algunas realizaciones, el dominio 1 puede tener una longitud de 4 a 12 restos, El dominio 2 puede tener una longitud de 3 a 9 restos y el dominio 3 puede tener una longitud de 4 a 12 restos, en los que las longitudes incluyen aminoácidos naturales y restos X y B.
En algunas realizaciones, el péptido comprende, o consiste en, una secuencia elegida entre una de las SEQ ID NO: 2 a 308 o 317 a 661 (Figuras 18, 23 a 30 y 41). En algunas realizaciones, el péptido comprende, o consiste en, una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con una de las SEQ ID NO: 2 a 308 o 317 a 761 (Figura 18, 23 a 30 y 41).
En algunas realizaciones, el péptido comprende, o consiste en, la secuencia de los dominios 1 a 3 de uno de Pip-6a, Pip-6b, Pip-6c, Pip-6d, Pip-6e, Pip-6f, Pip-6g, Pip-6h, Pipe-6i [SEQ ID NO: 2 a 10]; Pip-7a, Pip-7b, Pip-7c, Pip-7d, Pip-7b2, Pipe-7c2 [SEQ ID NO: 11 a 16]; o Pip-8a, Pip-8b, Pip-8c, Pip-8c2, Pip-8d, Pip-8d2, Pip-8d3 [SEQ ID NO: 17 a 20 y 317 a 319]; o Pip-9b, Pip-9b2, Pip-9c, Pip-9c2, Pip-9c3, Pip-9d, Pip-9d2, Pip-9d3, Pip-9d4 [SEQ ID NO: 320 a 328] o una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de los dominios 1 a 3 de uno de Pip-6a, Pip-6b, Pip-6c, Pip-6d, Pip-6e, Pip-6f, Pip-6g, Pip-6h, Pipe-6i [SEQ ID NO: 2 a 10]; Pip-7a, Pip-7b, Pip-7c, Pip-7d, Pip-7b2, Pipe-7c2 [SEQ ID NO: 11 a 16]; o Pip-8a, Pip-8b, Pip-8c, Pip-8c2, Pip-8d, Pip-8d2, Pip-8d3 [SEQ ID NO: 17 a 20 y 317 a 319]; o Pip-9b, Pip-9b2, Pip-9c, Pip-9c2, Pip-9c3, Pip-9d, Pip-9d2, Pip-9d3, Pip-9d4 [SEQ ID NO: 320 a 328].
En algunas realizaciones, el péptido comprende además una secuencia enlazadora en el extremo C. La secuencia enlazadora se puede elegir entre BCys, XCys, Cys, GGCys, BBCys, BXCys, XBCys, BX o XB.
En algunas realizaciones, el péptido se conjuga químicamente con una molécula de carga. La conjugación puede estar en el extremo C del péptido.
La molécula de carga se puede elegir entre un ácido nucleico, ácido nucleico peptídico (PNA), oligonucleótido de fosforodiamidato morfolino (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA), oligonucleótido antisentido, ARN de interferencia pequeño (ARNip), péptido, péptido cíclico, proteína o fármaco. La molécula de carga puede tener un peso molecular inferior a 5.000 Da. En algunas realizaciones, la molécula de carga es PNADMD [SEQ ID NO: 309] o PMODMD [SEQ ID NO: 310] o una molécula que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con uno de PNADMD [SEQ ID NO: 309] o PMODMD [SEQ ID NO: 310].
En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica o un medicamento que comprende un péptido de acuerdo con la presente invención. La composición farmacéutica o el medicamento pueden comprender además un diluyente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto de la presente invención se proporciona un péptido de acuerdo con la presente invención para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad. En otro aspecto de la presente invención se proporciona el uso de un péptido de acuerdo con la presente invención en la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de una enfermedad.
En un aspecto adicional de la presente divulgación se proporciona un procedimiento de tratamiento de una enfermedad en un paciente que necesita tratamiento, comprendiendo el procedimiento administrar un péptido de acuerdo con la presente invención al paciente.
En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un ácido nucleico aislado, codificando el ácido nucleico aislado un péptido o un conjugado péptido-carga de acuerdo con cualquier aspecto o realización de la presente invención. También se proporciona un vector de ácido nucleico que tiene una secuencia reguladora unida operativamente a dicho ácido nucleico.
Miméticos de péptidos
El diseño de miméticos para un compuesto conocido farmacéutica o biológicamente activo es un enfoque conocido para el desarrollo de productos farmacéuticos y terapéuticos basados en una molécula "de partida". Esto podría ser deseable cuando el compuesto activo sea difícil o costoso de sintetizar o cuando no sea adecuado para un procedimiento de administración particular, por ejemplo, algunos péptidos pueden ser principios activos inadecuados para composiciones orales ya que tienden a degradarse rápidamente por las proteasas en el tubo digestivo. El diseño, la síntesis y las pruebas de miméticos se utilizan generalmente para evitar seleccionar aleatoriamente un gran número de moléculas en busca de una propiedad diana.
Hay varias etapas que se toman comúnmente en el diseño de un mimético a partir de un compuesto que tiene una propiedad diana dada. En primer lugar, se determinan las partes particulares del compuesto que son claves y/o importantes para determinar la propiedad diana. En el caso de un péptido, esto se puede hacer mediante la variación sistemática los restos de aminoácidos en el péptido, por ejemplo, mediante la sustitución de cada resto por turno. Estas partes o restos que constituyen la región activa del compuesto se conocen como su "farmacóforo".
Una vez que se ha encontrado el farmacóforo, su estructura se modela de acuerdo con sus propiedades físicas, por ejemplo, estereoquímica, unión, tamaño y/o carga, utilizando datos de una variedad de fuentes, por ejemplo, técnicas espectroscópicas, datos de difracción de rayos X y RMN. En este procedimiento de modelado se pueden utilizar análisis computacional, mapeo de similitud (que modela la carga y/o el volumen de un farmacóforo, en lugar de la unión entre átomos) y otras técnicas.
En una variante de este enfoque, se modelan la estructura tridimensional del ligando y su compañero de unión. Esto puede ser especialmente útil cuando el ligando y/o el compañero de unión cambian de conformación al unirse, permitiendo que el modelo tenga esto en cuenta en el diseño del mimético.
A continuación, se selecciona una molécula molde sobre la que se pueden injertar grupos químicos que imitan al farmacóforo. La molécula molde y los grupos químicos injertados en ella se pueden seleccionar convenientemente para que el mimético sea fácil de sintetizar, sea probable que sea farmacológicamente aceptable y no se degrade in vivo, mientras que conserva la actividad biológica de la molécula de partida. El mimético o miméticos encontrados por este enfoque se pueden seleccionar para ver si tienen la propiedad diana o en qué medida la presentan. Después se pueden llevar a cabo más optimizaciones o modificaciones para llegar a uno o más miméticos finales para pruebas in vivo o clínicas.
Con respecto a la presente invención, se proporciona un procedimiento que comprende la etapa de modificar la estructura del péptido, seguida opcionalmente por la prueba del péptido modificado en un ensayo de corrección de corte y empalme o un ensayo de omisión de exón y/o en un ensayo de viabilidad celular. Este procedimiento de modificación del péptido o mimético del péptido puede repetirse varias veces, según se desee, hasta que se identifique un péptido que tenga la corrección de corte y empalme o la actividad de omisión de exón y/o la viabilidad celular deseada.
Las etapas de modificación empleadas pueden comprender truncar la longitud del péptido o mimético del péptido (esto puede implicar sintetizar un péptido o mimético de péptido de longitud más corta), sustitución de uno o más restos de aminoácidos o grupos químicos y/o modificar químicamente el péptido o mimético de péptido para aumentar la viabilidad celular, resistencia a la degradación, transporte a través de las membranas celulares y/o resistencia al aclaramiento del cuerpo y/o para proporcionar actividad en la omisión de exón y la producción de distrofina en un modelo de ratón mdx con DMD, incluyendo en el músculo cardíaco.
La invención incluye la combinación de los aspectos y características preferidas descritas excepto cuando dicha combinación es claramente inadmisible o se evita expresamente.
Los encabezados de sección usados en el presente documento tienen fines organizativos solamente y no deben interpretarse como limitantes de la materia objeto descrita.
Ahora se ilustrarán aspectos y realizaciones de la presente invención, a modo de ejemplo, con referencia a las figuras adjuntas. Otros aspectos y realizaciones resultarán evidentes para los expertos en la materia.
Breve descripción de las figuras
Las realizaciones y experimentos que ilustran los principios de la invención se analizarán ahora con referencia a las figuras adjuntas en las que:
Figura 1. Gráfico que muestra la actividad de omisión de exón de los PMO-péptidos (Pip-5e, Pip-6a, Pip-6b, Pip-6c, Pip-6d, Pip-6e, Pip-6f) en miotubos musculares H2K diferenciados de ratón mdx. Los miotubos H2K mdx se incubaron con conjugados de péptido-PMO a concentraciones que variaban entre 0,125 pM y 1 pM sin el uso de reactivo de transfección. Los productos de la RT-PCR con cebadores internos se examinaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2 %. La actividad de omisión de exón se presenta como el porcentaje de omisión de A23 calculado mediante densitometría.
Figura 2. Gráfico que muestra la actividad de omisión de exón de los PMO-péptidos (Pip-6g, Pip-6h, Pip-7a, Pip-7b, Pip-7c, Pip-7d) en miotubos musculares H2K mdx.
Figura 3. Gráfico que muestra la actividad de omisión de exón de los PMO-péptidos (Pip-6i, Pip-7b2, Pip-7c2, Pip-8a, Pip-8b, Pip-8c) en miotubos musculares H2K mdx.
Figura 4. Gráfico que muestra la actividad de omisión de exón de los PMO-péptidos (Pip-7b, Pip-7b2, Pip-8b (cada uno tiene 8 Arg), péptido B (RXRRBR)2XB)) en miotubos musculares H2K mdx.
Figura 5. Gráfico que muestra la actividad de omisión de exón de los PMO-péptidos (Pip-7c, Pip-7c2, Pip-8c (cada uno tiene 7 Arg), péptido B (RXRRBR)2XB)) en miotubos musculares H2K mdx.
Figura 6. Gráfico que muestra los resultados de la cuantificación de proteínas por transferencia Western de PMO-péptidos (Pip-6a, Pip-6b, Pip-6c, Pip-6d, Pip-6e, Pip-6f, Pip-5e) en diferentes tejidos musculares de ratón en ratones mdx (TA = tibial anterior, Cuádr. = cuádriceps, Gastro. = gastrocnemio, diafr. = músculos del diafragma, corazón = músculo cardíaco).
Figura 7. Gráficos que muestran los resultados de qPCR de la actividad de omisión de exón en (A) cuádriceps, (B) diafragma y (C) tejido cardíaco de ratones mdx para Pip-6a, Pip-6b, Pip-6c, Pip-6d, Pip-6e, Pip-6f y Pip-5e.
Figura 8. Gráficos que muestran los resultados cuantitativos de la transferencia Western de la actividad de omisión de exón en (A) tibial anterior, (B) cuádriceps, (C) diafragma y (D) tejido cardíaco de ratones mdx para Pip-6a, Pip-6b, Pip-6c, Pip-6d, Pip-6e, Pip-6f y Pip-5e.
Figura 9. Resultados representativos de RT-PCR que muestran actividad de omisión de exón en diferentes tejidos musculares de ratones mdx para PMO-péptidos Pip-6a, Pip-6b, Pip-6c, Pip-6d, Pip-6e, Pip-6f y Pip-5e.
Figura 10. Transferencias Western representativas que muestran actividad de omisión de exón en diferentes tejidos musculares de ratones mdx para PMO-péptidos Pip-6a, Pip-6b, Pip-6c, Pip-6d, Pip-6e, Pip-6f y Pip-5e.
Figura 11. Conjunto de datos individuales que muestra la actividad de omisión de exón en el tejido muscular de ratones mdx para Pip-5e-PMO. (A) Resultados de RT-PCR, (B) Transferencia Western, (C) Gráfico de datos de transferencia Western cuantificados.
Figura 12. Conjunto de datos individuales que muestra la actividad de omisión de exón en el tejido muscular de ratones mdx para Pip-6a-PMO. (A) Resultados de RT-PCR, (B) Transferencia Western, (C) Gráfico de datos de transferencia Western cuantificados.
Figura 13. Conjunto de datos individuales que muestra la actividad de omisión de exón en el tejido muscular de ratones mdx para Pip-6b-PMO. (A) Resultados de RT-PCR, (B) Transferencia Western, (C) Gráfico de datos de transferencia Western cuantificados.
Figura 14. Conjunto de datos individuales que muestra la actividad de omisión de exón en el tejido muscular de ratones mdx para Pip-6c-PMO. (A) Resultados de RT-PCR, (B) Transferencia Western, (C) Gráfico de datos de transferencia Western cuantificados.
Figura 15. Conjunto de datos individuales que muestra la actividad de omisión de exón en el tejido muscular de ratones mdx para Pip-6d-PMO. (A) Resultados de RT-PCR, (B) Transferencia Western, (C) Gráfico de datos de transferencia Western cuantificados.
Figura 16. Conjunto de datos individuales que muestra la actividad de omisión de exón en el tejido muscular de ratones mdx para Pip-6e-PMO. (A) Resultados de RT-PCR, (B) Transferencia Western, (C) Gráfico de datos de transferencia Western cuantificados.
Figura 17. Conjunto de datos individuales que muestra la actividad de omisión de exón en el tejido muscular de ratones mdx para Pip-6f-PMO (A) Resultados de RT-PCR, (B) Transferencia Western, (C) Gráfico de datos de transferencia Western cuantificados.
Figura 18. Tabla que muestra la secuencia de aminoácidos de Pip-5e, Pip-6a, Pip-6b, Pip-6c, Pip-6d, Pip-6e, Pip-6f, Pip-6g, Pip-6h, Pip-6i, Pip-7a, Pip-7b, Pip-7c, Pip-7d, Pip-7b2, Pip7c2, Pip-8a, Pip-8b, Pip8c, Pip-8c2. También se indican el número total de restos en los dominios 1,2 y 3 y el número de restos Arg, X y B.
Figura 19. Gráfico que muestra la viabilidad celular de péptido B-PMO, Pip-5e-PMO, Pip-6a-PMO, Pip-6c-PMO, Pip-6f-PMO, Pip-6h-PMO en función de la concentración de Pip-PMO añadido.
Figura 20. Gráfico que muestra la viabilidad celular de péptido B-PMO, Pip-7a-PMO, Pip-8a-PMO (que contiene 9 restos de Arg) en función de la concentración de Pip-PMO añadido.
Figura 21. Gráfico que muestra la viabilidad celular de péptido B-PMO, Pip-7b-PMO, Pip-7b2-PMO, Pip-8b-PMO (que contiene 8 restos de Arg) y B-MSP-PMO (RXRRBRRXRRBRASSLNIAX [SEQ ID NO: 910], Yin, H. y col, (2010) Mol. Ther. 18, 1822-1827) en función de la concentración de Pip-PMO añadido.
Figura 22. Gráfico que muestra la viabilidad celular de péptido B-PMO, Pip-7c-PMO, Pip-7c2-PMO, Pip-8c-PMO (que contiene 7 restos de Arg) en función de la concentración de Pip-PMO añadido.
Figura 23. Tabla que muestra las secuencias de péptidos de los dominios 1 a 3 de acuerdo con la presente invención. Todas las secuencias contienen la secuencia del dominio 2 YQFLI [SEQ ID NO: 802], con secuencias del dominio 1 seleccionadas de RXRRBRRXR [SEQ ID NO: 782], RXRRBRRX [SEQ ID NO: 783], RXRRBRX [SEQ ID NO: 784], RXRRBRXR [SEQ ID NO: 786], RXRBRX [SEQ ID NO: 785], RXRBX [SEQ ID NO: 790], RXRRBR [SEQ ID NO: 787], RXRRB [SEQ ID NO: 788], RXRRBRR [SEQ ID NO: 789], y secuencias del dominio 3 seleccionadas de RXRBRXRB [SEQ ID NO: 722], XRBRXRB [SEQ ID NO: 773], RXRRBRB [SEQ ID NO: 774], BRXRB [SEQ ID NO: 775], XRRBRB [SEQ ID NO: 776], RRBRB [SEQ ID NO: 777], XRBRB [SEQ ID NO: 778], RBRXRB [SEQ ID NO: 779], RXRBRB [SEQ ID NO: 780], BRBRB [SEQ ID NO: 781].
Figura 24. Tabla que muestra las secuencias de péptidos de los dominios 1 a 3 de acuerdo con la presente invención. Todas las secuencias contienen la secuencia del dominio 2 IQFLI [SEQ ID NO: 803], con secuencias del dominio 1 seleccionadas de RXRRBRRXR, RXRRBRRX, RXRRBRX, RXRRBRXR, RXRBRX, RXRBX, RXRRBR, RXRRB, RXRRBRR y secuencias del dominio 3 seleccionadas de RXRBRXRB, XRBRXRB, RXRRBRB, BRXRB, XRRBRB, RRBRB, XRBRB, RBRXRB, RXRBRB, BRBRB.
Figura 25. Tabla que muestra las secuencias de péptidos de los dominios 1 a 3 de acuerdo con la presente invención. Todas las secuencias contienen la secuencia del dominio 2 QFLI [SEQ ID NO: 807], con secuencias del dominio 1 seleccionadas de RXRRBRRXR, RXRRBRRX, RXRRBRX, RXRRBRXR, RXRBRX, RXRBX, RXRRBR, RXRRB, RXRRBRR y secuencias del dominio 3 seleccionadas de RXRBRXRB, XRBRXRB, RXRRBRB, BRXRB, XRRBRB, RRBRB, XRBRB, RBRXRB, RXRBRB, BRBRB.
Figura 26. Tabla que muestra las secuencias de péptidos de los dominios 1 a 3 de acuerdo con la presente invención. Todas las secuencias contienen la secuencia del dominio 2 QFL [SEQ ID NO: 808], con secuencias del dominio 1 seleccionadas de RXRRBRRXR, RXRRBRRX, RXRRBRX, RXRRBRXR, RXRBRX, RXRBX, RXRRBR, RXRRB, RXRRBRR y secuencias del dominio 3 seleccionadas de RXRBRXRB, XRBRXRB, RXRRBRB, BRXRB, XRRBRB, RRBRB, XRBRB, RBRXRB, RXRBRB, BRBRB.
Figura 27. Tabla que muestra las secuencias de péptidos de los dominios 1 a 3 de acuerdo con la presente invención. Todas las secuencias contienen la secuencia del dominio 2 YRFLI [SEQ ID NO: 804], con secuencias del dominio 1 seleccionadas de RXRRBRRXR, RXRRBRRX, RXRRBRX, RXRRBRXR, RXRBRX, RXRBX, RXRRBR, RXRRB, RXRRBRR y secuencias del dominio 3 seleccionadas de RXRBRXRB, XRBRXRB, RXRRBRB, BRXRB, XRRBRB, RRBRB, XRBRB, RBRXRB, RXRBRB, BRBRB.
Figura 28. Tabla que muestra las secuencias de péptidos de los dominios 1 a 3 de acuerdo con la presente invención. Todas las secuencias contienen la secuencia del dominio 2 FQILY [SEQ ID NO: 806], con secuencias del dominio 1 seleccionadas de RXRRBRRXR, RXRRBRRX, RXRRBRX, RXRRBRXR, RXRBRX, RXRBX, RXRRBR, RXRRB, RXRRBRR y secuencias del dominio 3 seleccionadas de RXRBRXRB, XRBRXRB, RXRRBRB, BRXRB, XRRBRB, RRBRB, XRBRB, RBRXRB, RXRBRB, BRBRB.
Figura 29. Tabla que muestra las secuencias de péptidos de los dominios 1 a 3 de acuerdo con la presente invención. Todas las secuencias contienen la secuencia del dominio 2 YRFRLI [SEQ ID NO: 805], con secuencias del dominio 1 seleccionadas de RXRRBRRXR, RXRRBRRX, RXRRBRX, RXRRBRXR, RXRBRX, RXRBX, RXRRBR, RXRRB, RXRRBRR y secuencias del dominio 3 seleccionadas de RXRBRXRB, XRBRXRB, RXRRBRB, BRXRB, XRRBRB, RRBRB, XRBRB, RBRXRB, RXRBRB, BRBRB.
Figura 30. Tabla que muestra las secuencias de péptidos de los dominios 1 a 3 de acuerdo con la presente invención. Todas las secuencias contienen la secuencia del dominio 2 ILFRY [SEQ ID NO: 811], con secuencias del dominio 1 seleccionadas de RXRRBRRXR, RXRRBRRX, RXRRBRX, RXRRBRXR, RXRBRX, RXRBX, RXRRBR, RXRRB, RXRRBRR y secuencias del dominio 3 seleccionadas de RXRBRXRB, XRBRXRB, RXRRBRB, BRXRB, XRRBRB, RRBRB, XRBRB, RBRXRB, RXRBRB, BRBRB.
Figura 31. Tablas estadísticas para los valores medios cuantitativos de tinción inmunohistoquímica para el control C57BL10, mdx sin tratamiento y ratones mdx tratados Pip6-PMO, después de una sola inyección i.v. de 12,5 mg/kg. Tablas de significación estadística para la tinción inmunohistoquímica de cuádriceps, diafragma y músculos del corazón para ratones mdx tratados con Pip6a-f en relación con ratones mdx no tratados. La significación estadística se determinó utilizando un modelo estadístico multinivel de medidas repetidas (**** = p <0,0001, *** = p <0,001, ** = p <0,01, * = p <0,05, N/S = no significativo).
Figura 32. Tablas estadísticas para los valores medios cuantitativos de tinción inmunohistoquímica para el control C57BL10, mdx sin tratamiento y ratones mdx tratados Pip6-PMO, después de una sola inyección i.v. de 12,5 mg/kg. Tablas de significación estadística para la tinción inmunohistoquímica de cuádriceps, diafragma y músculos del corazón para ratones mdx tratados con Pip6a-f en relación con ratones tratados con Pip5e. La significación estadística se determinó utilizando un modelo estadístico multinivel de medidas repetidas (**** = p <0,0001, *** = p <0,001, ** = p <0,01, * = p <0,05, N/S = no significativo).
Figura 33. Procedimiento de conjugación química para derivados de Pip5e-PMO. Procedimiento de conjugación de péptido a PMO AO. Los péptidos se conjugaron con PMO a través de un enlace amida en el extremo 3' de PMO, seguido de purificación mediante HPLC y se analizaron mediante MALDI-TOF MS. HBTU: Hexafluorofosfato de 2-(IH-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio, HOBt, 1-hidroxibenzotriazol monohidrato, DIEA: diisopropiletilamina.
Figura 34. Corte y empalme de distrofina y restauración de proteínas en ratones de control C57BL10, mdx sin tratar, tratados con Pip6-PMO con núcleo hidrófobo de 5 aa y tratados con Pip5e-PMO después de una sola inyección i.v. de 12,5 mg/kg. (A) Cuantificación de la tinción inmunohistoquímica de distrofina en relación con la contratinción de laminina de control en cuádriceps, diafragma y músculos del corazón de ratones C57BL10, mdx sin tratar y mdx tratados. Se representan gráficamente los valores de intensidad relativa para cada región de interés (120 regiones) y se calcula el promedio de la estimación del modelo (presentado en b) a partir de un modelo estadístico multinivel de medidas repetidas. Para las tablas de significación estadística, véanse las figuras 31 y 32. La puntuación de recuperación porcentual se representa a continuación. (c) Porcentaje de omisión del exón A23 según lo determinado por PCR cuantitativa en tiempo real (q-RT) en cuádriceps, diafragma y músculos del corazón. (d) Imágenes representativas de PCR en tiempo real (RT) que demuestran la omisión de exón (omitido) en TA, cuádriceps, gastrocnemio, diafragma, músculos del corazón y del abdomen. La banda superior indica la transcripción de longitud completa (LC) o sin omitir. (e) Imágenes de transferencia Western representativas para cada tratamiento. Se cargaron diez microgramos de proteína total (TA, cuádriceps, gastrocnemio, diafragma, músculos del corazón y del abdomen) en relación con controles C57BL10 al 50 % (5 |jg de proteína) y al 10 % (1 |jg), y se normalizaron al control de carga de a-actinina (para cuantificación, véase la figura 38a).
Figura 35. Corte y empalme de distrofina y restauración de proteínas en ratones de control C57BL10, mdx sin tratar y tratados con Pip6-PMO con núcleo hidrófobo acortado (Pip6c y Pip6d) en comparación con Pip5e-PMO después de una sola inyección i.v. de 12,5 mg/kg. (a) Cuantificación de la tinción inmunohistoquímica de distrofina en relación con la contratinción de laminina de control en cuádriceps, diafragma y músculos del corazón de ratones C57BL10, mdx sin tratar y mdx tratados. Se representan gráficamente los valores de intensidad relativa para cada región de interés (120 regiones) y se calcula el promedio de la estimación del modelo (presentado en b) a partir de un modelo estadístico multinivel de medidas repetidas. Para las tablas de significación estadística, véanse las figuras 31 y 32. La puntuación de recuperación porcentual se representa a continuación. (c) Porcentaje de omisión del exón A23 según lo determinado por PCR cuantitativa en tiempo real (q-RT) en cuádriceps, diafragma y músculos del corazón. (d) Imágenes representativas de PCR en tiempo real (Rt) que demuestran la omisión de exón (omitido) en TA, cuádriceps, gastrocnemio, diafragma, músculos del corazón y del abdomen. La banda superior indica la transcripción de longitud completa (LC) o sin omitir. (e) Imágenes de transferencia Western representativas para cada tratamiento. Se cargaron diez microgramos de proteína total (TA, cuádriceps, gastrocnemio, diafragma, músculos del corazón y del abdomen) en relación con controles C57BL10 al 50 % (5 pg de proteína) y al 10 % (1 jg), y se normalizaron al control de carga de a-actinina (para cuantificación, véase la figura 38a).
Figura 36. Corte y empalme de distrofina y restauración de proteínas en el control C57BL10, mdx sin tratar y los derivados de Pip6e-PMO, Pip6g y Pip6h, después de una sola inyección i.v. de 12,5 mg/kg. Se realizó tinción inmunohistoquímica para distrofina en ratones de control C57BL10, mdx sin tratar y tratados con Pip6g y Pip6h-PMO en grupos de músculos del TA, cuádriceps, gastrocnemio, diafragma, corazón y abdomen para ratones C57BL10, mdx sin tratar y mdx tratados. (a) Cuantificación de la tinción inmunohistoquímica de distrofina en relación con la contratinción de laminina en cuádriceps, diafragma y músculos del corazón de ratones C57BL10, mdx sin tratar y mdx tratados. Se representan gráficamente los valores de intensidad relativa para cada región de interés (120 regiones) y se calculan los promedios de la estimación del modelo (presentado en b) a partir de un modelo estadístico multinivel de medidas repetidas. Para las tablas de significación estadística, véase la figura 39a, b. La puntuación de recuperación porcentual se representa a continuación. (c) Porcentaje de omisión del exón A23 según lo determinado por PCR cuantitativa en tiempo real (q-RT) en cuádriceps, diafragma y músculos del corazón. (d) Imágenes representativas de PCR en tiempo real (RT) que demuestran la omisión de exón (omitido) en TA, cuádriceps, gastrocnemio, diafragma, músculos del corazón y del abdomen. La banda superior indica la transcripción de longitud completa (LC) o sin omitir. (e) Imágenes de transferencia Western representativas para cada tratamiento. Se cargaron diez microgramos de proteína total (TA, cuádriceps, gastrocnemio, diafragma, músculos del corazón y del abdomen) en relación con controles C57BL10 al 50 % (5 pg de proteína) y al 10 % (1 jg), y se normalizaron a la proteína de carga de a-actinina (para cuantificación, véase la figura 39c).
Figura 37. Cromatograma de HPLC y datos de MALDI-TOF para Pip6e-PMO. (a) Cromatograma de HPLC de fase inversa analítica del conjugado Pip6e-PMO purificado en una columna C18 de 4,6 * 250 mm (eluyente A: TFA al 0,1 %, eluyente B: acetonitrilo al 90 %, eluyente A al 10 %) utilizando un gradiente del 10 al 50 % B en 27 minutos (b) Espectro de masas MALDI-TOF del conjugado Pip6e-PMO. (c) Tabla de masas moleculares calculadas y encontradas de Pip6-PMO.
Figura 38. Tabla de valores medios de qRT-PCR y cuantificación de transferencias Western para ratones de control C57BL10, mdx sin tratar y mdx tratados con Pip6-PMO, después de una sola inyección i.v. de 12,5 mg/kg. (a) Valores medios porcentuales de q-RT-PCR para los ratones mdx tratados con Pip6-PMO. (b) Se calculó la cuantificación de transferencias Western para TA, cuádriceps, diafragma y tejidos cardíacos de los tratamientos con Pip6a-f. Se realizó una transferencia Western para cada ratón para todos los tratamientos (n = 3) y se cuantificó frente a un control C57BL10 al 50 % y al 10 % que se promedió.
Figura 39. Tablas estadísticas para tinción inmunohistoquímica cuantitativa, tabla de valores medios de qRT-PCR y cuantificación de transferencias Western para ratones de control C57BL10, mdx sin tratar y mdx tratados con derivado de Pip6e-PMO (Pip6g y Pip6h), después de una sola inyección i.v. de 12,5 mg/kg. Tablas de significación estadística para la tinción inmunohistoquímica de cuádriceps, diafragma y músculos del corazón para ratones mdx tratados con Pip6g y Pip6h en relación a ratones mdx no tratados (a) o ratones tratados con Pip6e (b). La significación estadística se determinó utilizando un modelo estadístico multinivel de medidas repetidas (**** = p <0,0001, *** = p <0,001, ** = p <0,01, * = p <0,05, N/S = no significativo). (c) Valores medios porcentuales de q-RT-PCR para ratones mdx tratados con Pip6g y Pip6h-PMO. (d) Se calculó la cuantificación de transferencias Western para Ta, cuádriceps, diafragma y tejidos cardíacos de Pip6g y Pip6h. Se realizó una transferencia Western para cada ratón para todos los tratamientos (n = 3) y se cuantificó frente a un control C57BL10 al 50 % y al 10 % que se promedió.
Figura 40. Ensayos de toxicidad evaluados en muestras de sangre de ratones de control C57BL10, mdx sin tratar, y mdx tratados con Pip6-PMO y Pip5e-PMO, después de una sola inyección i.v. de 12,5 mg/kg. (a) Medición de los niveles de alanina aminotransferasa, aspartato aminotransferasa y creatina cinasa en plasma en ratones de control C57BL10 en comparación con ratones mdx sin tratar y tratados. (b) Medición de los niveles de nitrógeno ureico en sangre (BUN, del inglés 'blood urea nitrogen') y creatitina en suero en ratones de control C57BL10 en comparación con ratones mdx sin tratar y tratados.
Figura 41. Tabla que muestra la secuencia de aminoácidos de Pip-8d, Pip-8d2, Pip-8d3, Pip-9b, Pip-9b2, Pip-9c, Pip-9c2, Pip-9c3, Pip-9d, Pip-9d2, Pip-9d3, Pip-9d4. También se indican el número total de restos en los dominios 1, 2 y 3 y el número de restos Arg, X y B.
Figura 42. Gráfico que muestra la viabilidad celular en miotubos mdx tratados con Pip7, Pip8 y Pip9-PMO.
Figura 43. Selección de conjugados Pip7-PMO tras la administración intravenosa en ratones mdx. Expresión de distrofina tras una única inyección intravenosa a dosis de 12,5 mg/kg de Pip6e, Pip7a, Pip7b y Pip7b2 en ratones mdx de 8 semanas de edad. (a) (RT)-PCR de transcriptasa inversa para detectar la eficacia de omisión de exón a nivel de ARN, que se muestra mediante bandas más cortas con omisión de exón, (b) Análisis de transferencia Western de TA, cuádriceps, diafragma y músculos del corazón de ratones mdx tratados con conjugados Pip7-PMO. La proteína total se extrajo de cuatro músculos diferentes de ratones mdx tratados 2 semanas después de la inyección. Se cargaron diez microgramos de proteína total de muestras de músculo tratadas. Se utilizó a-actinina como control de carga.
Figura 44. Selección de conjugados Pip8-PMO tras la administración intravenosa en ratones mdx. Expresión de distrofina tras una única inyección intravenosa a dosis de 12,5 mg/kg de Pip8b, Pip8c y Pip8c2 en ratones mdx de 8 semanas de edad. (a) (RT)-PCR de transcriptasa inversa para detectar la eficacia de omisión de exón a nivel de ARN, que se muestra mediante bandas más cortas con omisión de exón, (b) Análisis de transferencia Western de TA, cuádriceps, diafragma y músculos del corazón de ratones mdx tratados con conjugados Pip8-PMO. La proteína total se extrajo de cuatro músculos diferentes de ratones mdx tratados 2 semanas después de la inyección. Se cargaron diez microgramos de proteína total de muestras de músculo tratadas. Se utilizó a-actinina como control de carga.
Figura 45. Selección de conjugados Pip9-PMO tras la administración intravenosa en ratones mdx. Expresión de distrofina tras una única inyección intravenosa a dosis de 12,5 mg/kg de Pip9b, Pip9b2, Pip9c, Pip9d y Pip9d2 en ratones mdx de 8 semanas de edad. (a) (RT)-PCR de transcriptasa inversa para detectar la eficacia de omisión de exón a nivel de ARN, que se muestra mediante bandas más cortas con omisión de exón, (b) Análisis de transferencia Western de TA, cuádriceps, diafragma y músculos del corazón de ratones mdx tratados con conjugados Pip9-PMO. La proteína total se extrajo de cuatro músculos diferentes de ratones mdx tratados 2 semanas después de la inyección. Se cargaron diez microgramos de proteína total de muestras de músculo tratadas. Se utilizó a-actinina como control de carga.
Figura 46. Análisis semicuantitativo de la restauración de la distrofina tras la inyección intravenosa de Pip7-9-PMO. Se inmunoteñieron y analizaron músculos del TA, cuádriceps, diafragma y corazón utilizando ImagePro para mostrar y cuantificar la expresión de distrofina. (a) La intensidad de las fibras teñidas inmunológicamente con distrofina utilizando anticuerpos contra la distrofina se analizó mediante el programa informático Image Pro como se informó anteriormente (Arechavala-Gomeza y col., 2010) utilizando un antilaminina de rata para la normalización y expresado como un porcentaje del nivel de intensidad de los músculos C57BL/10. Se representan gráficamente los valores de intensidad relativa para cada región de interés (120 regiones) y se calcula la intensidad media (representada por la barra roja) (b) La intensidad de la tinción de distrofina se normalizó a un promedio de músculos C57BL/10 (100 %) y mdx (0 %). Se representa gráficamente la puntuación de recuperación para cada animal (n = 3) y se calcula la puntuación de recuperación media (representada por la barra roja). (media - EEM; n = 3; Prueba ANOVA unidireccional: ns, no significativo, * p <0,05, **<0,001, ***<0,0001 en comparación con mdx y controles C57).
Figura 47. Bioquímica clínica de los marcadores séricos de la función hepática y renal en ratones mdx tratados con conjugados Pip7-9-PMO a la dosis de 12,5 mg/kg. Se extrajo suero de la vena yugular del ratón inmediatamente después del sacrificio a las 2 semanas de la inyección con inhalación de CO2. Se llevó a cabo el análisis de los niveles de creatina cinasa sérica, creatinina, urea, fosfatasa alcalina (ALP), alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), bilirrubina total y lactato deshidrogenasa (LDH). (media - EEM; n = 3; Prueba t bilateral: ns, no significativo, * p <0,05, **<0,001, ***<0,0001 en comparación con cualquiera de mdx o C57BL/10).
Figura 48. Análisis semicuantitativo de la restauración de la distrofina después de la inyección intravenosa con candidatos a PPMO. La TA y los músculos del corazón se inmunoteñieron con anticuerpo de distrofina y se analizaron con ImagePro para mostrar y cuantificar la expresión de distrofina. (a) Gráficos que muestran la intensidad de las fibras teñidas inmunológicamente de distrofina utilizando anticuerpos de distrofina analizados mediante el programa informático Image Pro como se informó anteriormente (Arechavala-Gomeza y col., 2010) utilizando un antilaminina de rata para la normalización y expresado como un porcentaje del nivel de intensidad de los músculos C57BL/10. Se representan gráficamente los valores de intensidad relativa para cada región de interés (120 regiones) y se calcula la intensidad media (representada por la barra roja) (b) Gráficos que muestran la intensidad de tinción de distrofina normalizada a un promedio de músculos de C57BL/10 (100 %) y mdx (0 %). Se representa gráficamente la puntuación de recuperación para cada animal (n = 3) y se calcula la puntuación de recuperación media (representada por las barras horizontales).
Figura 49. Comparación de candidatos de PPMO tras la administración intravenosa en ratones mdx. Se evaluaron los niveles de ARN de distrofina omitido en el exón después de una única inyección intravenosa a una dosis de 12,5 mg/kg de Pip8b, 9b, 9b2, 8c, 9c y 9d2 en ratones mdx de 8 semanas de edad. La (RT)-PCR de transcriptasa inversa para detectar la eficacia de omisión de exón a nivel de ARN se muestra mediante bandas más cortas de omisión de exón.
Figura 50. Cuantificación del nivel de proteína distrofina tras la administración intravenosa de candidatos de PPMO en ratones mdx. Análisis de transferencia Western de TA, cuádriceps, diafragma y músculos del corazón de ratones mdx tratados con candidatos de PPMO. La proteína total se extrajo de cuatro músculos diferentes de los tratados. mdx ratones 2 semanas después de la inyección a dosis de 12,5 mg/kg de Pip8b, 9b, 9b2, 8c, 9c y 9d2. Se cargaron quince microgramos de proteína total de muestras de músculo tratadas. Se utilizó vinculina como control de carga. (a) Imágenes representativas de transferencia Western de TA, cuádriceps, diafragma y músculos del corazón de ratones mdx tratados con candidatos de PPMO (b) Gráficos que muestran el análisis semicuantitativo de la proteína distrofina utilizando el programa informático Licor y la vinculina utilizada como control de carga. La densidad de la banda se normalizó mediante su respectiva banda de vinculina y esto se expresó como un porcentaje del nivel de expresión de distrofina de los músculos C57BL/10.
Figura 51. Gráficos que muestran la expresión de distromir en suero mdx tratado con PPMO. A las 2 semanas después de la inyección intravenosa de 12,5 mg/kg de candidatos de PPMO (Pip8b, 9b, 9b2, 8c y 9c) a las 8 semanas de edad, se extrajo suero de la vena yugular del ratón inmediatamente después de la muerte por inhalación de CO2. Los niveles de miR-133a y miR-206 se examinaron mediante Q-PCR en sueros tratados con PPMO de ratones mdx y se normalizaron con respecto a miR-223. Los niveles de miR-133a y miR-206 se regularon significativamente a la baja en sueros tratados con PPMO de ratones mdx en comparación con controles mdx no tratados.
Figura 52. Comparación de la eficacia de omisión de exón después de la administración intravenosa de PMO conjugado con Pip9b2 desalinizado por HPLC y filtración en ratones mdx. Expresión de distrofina después de una única inyección intravenosa a una dosis de 12,5 mg/kg de Pip9b-PMO desalinizado por HPLC y filtración en ratones mdx de 8 semanas de edad. Los gráficos muestran un análisis semicuantitativo de la restauración de la distrofina. Se analizó la intensidad de las fibras teñidas inmunológicamente con distrofina utilizando anticuerpos de distrofina mediante el programa informático Image Pro como se informó anteriormente (Arechavala-Gomeza y col., 2010) utilizando un antilaminina de rata para la normalización y expresado como un porcentaje del nivel de intensidad de los músculos C57BL/10. Se representan gráficamente los valores de intensidad relativa para cada región de interés (120 regiones) y se calcula la intensidad media (panel de la izquierda; representado por la barra). La intensidad de la tinción de distrofina se normalizó a un promedio de músculos de C57BL/10 (100 %) y mdx (0 %). Se representa gráficamente la puntuación de recuperación para cada animal (n = 4) y se calcula la puntuación de recuperación media (panel de la derecha; representado por la barra).
Figura 53. Comparación del ARN de la distrofina y el nivel de proteína después de la administración intravenosa de PMO conjugado con Pip9b2 en ratones mdx. Análisis de transferencia Western de TA, cuádriceps, diafragma y músculos del corazón de ratones mdx tratados con Pip9b2. La proteína total se extrajo de cuatro músculos diferentes de los ratones mdx tratados 2 semanas después de la inyección a una dosis de 12,5 mg/kg de Pip9b2-PMO. Se cargaron quince microgramos de proteína total de muestras de músculo tratadas. Se utilizó vinculina como control de carga. (a) Imágenes representativas de transferencia Western de TA, cuádriceps, diafragma y músculos del corazón de ratones mdx tratados con candidatos de PPMO (b) Gráfico que muestra el análisis semicuantitativo de la proteína distrofina utilizando el programa informático Licor y la vinculina utilizada como control de carga. La densidad de la banda se normalizó por su respectiva banda de vinculina y esto se expresó como un porcentaje del nivel de expresión de distrofina de los músculos de C57BL/10 (c) Se muestra una (RT)-PCR de transcriptasa inversa para detectar la eficacia de omisión de exón a nivel de ARN mediante bandas con omisión de exón.
Figura 54. Gráfico que muestra la viabilidad celular en miotubos de mdx tratados con Pip9b2-PMO.
Figura 55. Estructura del ácido aminohexanoico (ácido aminocaproico).
Figura 56. Estructura de p-alanina (ácido 3-aminopropanoico).
Figura 57. Gráfico que muestra la viabilidad celular (células hepáticas Huh-7 cultivadas) de Pip7a-PMO, Pip7b-PMO, Pip7b2-PMO, Pip7c-PMO, Pip7c2-PMO, Pip7d-PNO en función de la concentración de Pip-PMO añadida.
Figura 58. Gráfico que muestra la viabilidad celular (células hepáticas Huh-7 cultivadas) de Pip8a-PMO, Pip8b-PMO, Pip8c-PMO en función de la concentración de Pip-PMO añadida.
Figura 59. Gráfico que muestra la actividad de omisión de exón de PMO-péptidos (Pip7a, Pip7b, Pip7b2, Pip7c, Pip7c2, Pip7d) en miotubos musculares H2K de ratón mdx diferenciados. Los miotubos H2K mdx se incubaron con conjugados de péptido-PMO a concentraciones que variaban entre 0,125 pM y 2 pM sin el uso de reactivo de transfección. Los productos de la RT-PCR con cebadores internos se examinaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2 %. La actividad de omisión de exón se presenta como el porcentaje de omisión de A23 calculado mediante densitometría.
Figura 60. Gráfico que muestra la actividad de omisión de exón de PMO-péptidos (Pip8a, Pip8b, Pip8c, Pip8c2, Pip8d) en miotubos musculares H2K de ratón mdx diferenciados. Los miotubos H2K mdx se incubaron con conjugados de péptido-PMO a concentraciones que variaban entre 0,125 |jM y 2 |jM sin el uso de reactivo de transfección. Los productos de la RT-PCR con cebadores internos se examinaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2 %. La actividad de omisión de exón se presenta como el porcentaje de omisión de A23 calculado mediante densitometría.
Figura 61. Gráfico que muestra la actividad de omisión de exón de PMO-péptidos (Pip9b, Pip9b2, Pip9c, Pip9c2, Pip9c3, Pip9d, Pip9d2) en miotubos musculares H2K de ratón mdx diferenciados. Los miotubos H2K mdx se incubaron con conjugados de péptido-PMO a concentraciones que variaban entre 0,125 j M y 2 j M sin el uso de reactivo de transfección. Los productos de la RT-PCR con cebadores internos se examinaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2 %. La actividad de omisión de exón se presenta como el porcentaje de omisión de A23 calculado mediante densitometría.
Descripción detallada de la invención
Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en la descripción adjunta a continuación, incluyendo detalles específicos del mejor modo contemplado por los inventores para llevar a cabo la invención, a modo de ejemplo. Será evidente para un experto en la materia que la presente invención se puede poner en práctica sin limitación a estos detalles específicos.
Los inventores han diseñado una serie adicional de péptidos penetradores de células diseñados para la conjugación con PMO para investigar el papel de la secuencia del núcleo hidrófobo central en la obtención de una elevada omisión de exón y producción de distrofina en los músculos del corazón en un modelo de ratón mdx con distrofia muscular de Duchenne (DMD). mientras se mantiene la elevada actividad en todos los tipos de músculos en comparación con Pip5e-PMO ya divulgado. En particular, los inventores han buscado diseñar un CPP que a) presente una administración mejorada de carga de PMO en el músculo cardíaco y b) tenga una baja toxicidad.
En vista de esto, los inventores han diseñado una serie de péptidos que se diferencian en dos aspectos principales de las series Pip-2 a Pip-5 desveladas anteriormente.
1) La secuencia de los aminoácidos del núcleo hidrófobo del dominio 2 se ha invertido o desordenado.
2) El número de restos de arginina se ha variado sistemáticamente para determinar el efecto sobre la administración de carga y la toxicidad celular.
Se describe una serie de péptidos diseñados para la conjugación con PMO para investigar el papel del núcleo hidrófobo central en la obtención de una elevada omisión de exón y producción de distrofina en los músculos del corazón en un modelo de ratón mdx con distrofia muscular de Duchenne (DMD) mientras se mantiene la elevada actividad en todos los tipos de músculos en comparación con el Pip5e-PMO ya divulgado.
Ejemplo 1
Anteriormente se ha informado de una actividad cardíaca impresionante que incluye una elevada eficacia de corte y empalme y restauración de distrofina después de una sola administración de un péptido penetrador de células rico en arginina conjugado con un oligonucleótido fosforodiamidato morfolino: Pip5e-pMO. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a esta actividad son poco conocidos.
En este caso, se comunican los resultados de estudios que implican la administración de una dosis única (12,5 mg/kg) de una serie de derivados de Pip5e-PMO, asignados consecutivamente como Pip6-PMO, que contienen mutaciones en la región central hidrófoba del péptido Pip5e, en el que esta secuencia de aminoácidos de la región del núcleo central se invierte, desordena o elimina parcialmente. Estos cambios afectan los niveles de omisión de exón y restauración de distrofina en múltiples grupos de músculos, incluyendo el corazón, tras una única inyección intravenosa de dosis baja de los correspondientes conjugados Pip6-PMO. Los resultados muestran que una longitud central de 5 aminoácidos (5-aa) parece ser esencial para la producción de distrofina cardíaca, ya que las reducciones en la longitud del núcleo reducen la actividad cardíaca. Inesperadamente, se toleró (parcialmente) un resto de arginina en una posición del núcleo hidrófobo, pero no se toleraron dos restos de arginina, ni una arginina en una posición diferente. Sorprendentemente, la producción de distrofina esquelética también se redujo en estos dos últimos casos. Los presentes datos indican que el núcleo hidrófobo de las secuencias de Pip es fundamental para la administración de PMO al corazón y que las modificaciones específicas de esta región pueden mejorar aún más la actividad. Los resultados tienen implicaciones para el desarrollo de PMO terapéutico para la DMD.
Resultados
Desarrollo de la serie de CPP Pip6
El presente Pip de partida anterior de la serie de CPP, Pip5e [Yin, H., y col., Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(7): págs. 1295-303], contiene dos regiones flanqueantes ricas en arginina y un núcleo hidrófobo central. Para seguir investigando los requisitos de composición del núcleo hidrófobo para el mantenimiento de una buena producción de distrofina cardíaca, se sintetizó una gama de péptidos derivados de Pip5e (Pip6 a-f) en la que las mutaciones se realizaron solo en la región del núcleo hidrófobo, por ejemplo, péptidos de la región central desordenados y parcialmente eliminados.
Todos los péptidos contenían el mismo número de restos de arginina (10) en las secuencias flanqueantes que en Pip5e, con la excepción de Pip6e. Estos péptidos se conjugaron con un PMO de 25 mer complementario al exón 23 de la distrofina [Yin, H., y col., Cell-penetrating peptide-conjugated antisense oligonucleotides restore systemic muscle and cardiac dystrophin expression and function. Hum Mol Genet, 2008. 17(24): págs. 3909-18; Yin, H., y col., A fusion peptide directs enhanced systemic dystrophin exon skipping and functional restoration in dystrophin-deficient mdx mice. Hum Mol Genet, 2009. 18(22): págs. 4405-14.], previamente validado para la omisión de exón en ratones mdx. En contraste con el procedimiento de conjugación al extremo 5' de PMO que se utilizó previamente [Yin y col. mencionado anteriormente], se prepararon conjugados de Pip6-PMO mediante conjugación del extremo 3' del PMO a la fracción de ácido carboxílico carboxiterminal del péptido Pip. Se informó que no hubo diferencias significativas entre la producción de distrofina o la actividad de omisión de exón in vivo para Pip5e-PMO conjugado al extremo 3' del PMO o al extremo 5' y, por lo tanto, se eligió utilizar la conjugación al extremo 3' para estos experimentos [Saleh A. F., A. A. A., Yin H., Betts C., Hammond S., Wood M. J. A. y Gait M. J., Enhancement of exon skipping and dystrophin production by 3'-peptide conjugates of morpholino (PMO) oligonucleotides in a mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy in Collection Symposium Series, Chemistry of Nucleic Acid Components. 2011, Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic: Praga. pags. 292-296].
Síntesis de conjugados Pip de oligonucleótido PMO de carga alternativo
El PMO de 25 mer M23D (+7-18) (5'-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3' [SEQ ID NO: 310]) (PMODMD) se utiliza comúnmente como un análogo de oligonucleótido adecuado para la omisión de exón en ratones mdx 37424344. En muchos de estos ejemplos, el péptido B (secuencia RXRRBRRXRRBRXB [SEQ ID NO: 311]) se conjugó con PMODMD y se demostró que mejora significativamente la omisión de exón y la producción de distrofina mediante administración intramuscular o intravenosa en ratones mdx en comparación con PMODMD solo. El péptido B (que se diferencia de (RXR)4XB por solo dos reemplazos de X por unidades B) es un péptido candidato de partida para el desarrollo de ensayos clínicos en conjugación con un p Mo para el tratamiento de la DMD43.
Los péptidos se sintetizaron mediante síntesis en fase sólida basada en Fmoc estándar en un sintetizador de péptidos de microondas Liberty (CEM). Los péptidos se escindieron de la resina mediante tratamiento con ácido trifluoroacético (TFA, 94 %) en presencia de triisopropilsilano (1 %), 1,2-etanoditiol (2,5 %) y agua (2,5 %), purificados mediante HPLC de fase reversa y analizados mediante espectrometría de masas MALDI-TOF en un Voyager DE-PRO de Applied Biosystems utilizando una matriz de ácido p-ciano-4-hidroxicinámico (10 mg/ml) disuelto en acetonitrilo/TFA acuoso al 3 % (1:1, v/v).
Las secuencias de aminoácidos de los péptidos Pip-6a a Pip-6i, Pip-7a a Pip-7c2 y Pip8a a Pip-8c2 se muestran en la figura 18.
Se sintetizaron Pip-6a a Pip-6i, Pip-7a a Pip-7c2 y Pip8a a Pip-8c2 y el péptido B de control como conjugados de PMODMD. Los péptidos se conjugaron mediante una reacción de acoplamiento de amida de un ácido carboxílico carboxiterminal al extremo 3' de un PMO de 25 mer (véase Yin y col. Molecular Therapy Vol. 19, N.° 71295-1303, julio de 2011). En resumen, el enlace 3'-amida se llevó a cabo de la siguiente manera: se acopló PMO (100 nmoles) en DMSO con un exceso de péptido de 2 veces utilizando TBTU:HOAt:DIEA (exceso molar 2,5:1,8:1,7 sobre el péptido) en NMP a 37 °C durante 2 h. El conjugado se purificó mediante HPLC de intercambio catiónico (Source 15S, GE Healthcare) y se desaló en una columna HLB (Waters).
Ensayos de omisión de exón en cultivo celular en miotubos musculares H2K diferenciados de mdx
Se evaluó el potencial de omisión de exón de los conjugados Pip6-PMO en miotubos H2K diferenciados de ratón mdx en ausencia de cualquier agente de transfección (Figura 1) a concentraciones que varían entre 0,125 pM y 1 pM. Esto mostró que la actividad de omisión de exón en células musculares cultivadas fue muy similar para todas estas construcciones, incluyendo Pip5e-PMO. Estos resultados difieren de la serie Pip5 anterior [Yin y col. mencionado anteriormente], en la que las secuencias flanqueantes ricas en arginina contenían principalmente un número fijo de restos de arginina (10) pero en la que los espaciamientos se variaban mediante la colocación alternativa de unidades aminohexanoílo (ácido aminohexanoico) y p-alanina. Esto dio como resultado pequeñas variaciones en la actividad de omisión de exón que se correlacionó bien con la actividad in vivo. En el caso de secuencias Pip6, las secuencias flanqueantes ricas en arginina son idénticas (con la excepción de Pip6e, que es idéntica excepto por una arginina que precede inmediatamente al núcleo que se desplaza a la segunda posición del núcleo). Los resultados demuestran que la actividad de omisión de exón celular no depende de la secuencia o longitud del núcleo hidrófobo. Hay que tener en cuenta que anteriormente se ha demostrado que los cambios importantes en las actividades de omisión de exón in vitro se correlacionan en cambio con el número total de restos de arginina [Saleh, A. F., y col., Synthesis and spliceredirecting activity of branched, arginine-rich peptide dendrimer conjugates of peptide nucleic acid oligonucleotides.
Bioconjug Chem, 2010. 21 (10): págs. 1902-11.].
Los miotubos H2K de mdx proceden de mioblastos H2K de mdx obtenidos del músculo EDL de un ratón f2 H2K mdx macho. Las células son deficientes en distrofina y condicionalmente inmortales debido a la expresión del antígeno de tumor grande termolábil del virus 40 de simio (tsA58). Los mioblastos proliferan a 33 °C (CO2 al 10 %) en cultivo rico y se diferencian en miotubos a 37 °C en medio con suero de caballo.
Los miotubos H2K de mdx se prepararon e incubaron con conjugados péptido-PNA y péptido-PMO en ausencia de cualquier agente de transfección mediante los procedimientos descritos anteriormente (Wang, Q., Yin, H., y col., (2010) In vitro evaluation of novel antisense oligonucleotides is predictive of in vivo exon skipping activity for Duchenne muscular dystrophy) pero con pequeñas variaciones.
Los miotubos se obtuvieron a partir de células H2K confluentes de mdx sembradas en placas de 24 pocillos recubiertas de gelatina después de 2 días de privación de suero (DMEM con suero de caballo al 5 %). Los conjugados se incubaron con miotubos durante 4 h en 0,5 ml de OptiMEM y luego se reemplazó por 1 ml de medio DMEM/suero de caballo al 5 % para una incubación adicional. Después de 20 h, los miotubos se lavaron dos veces con PBS y el ARN total se extrajo con 0,5 ml de reactivo TRI (Sigma, Reino Unido). Las preparaciones de ARN se trataron con ADNasa libre de ARNasa (2 U) y Proteinasa K (20 mg) antes del análisis mediante RT-PCR. La RT-PCR se llevó a cabo en 25 pl con 1 pg de plantilla de ARN utilizando el sistema RTPCR de una sola etapa SuperScript III con ADN polimerasa Platinum Taq (Invitrogen) cebado por el cebador directo 5'CAG AAT TCT GCC AaT tGc TgAg3' [SEQ ID NO: 312] y el cebador inverso 5'TTC TTC AGC TTG TGT CAT CC3' [SEQ ID NO: 313]. La síntesis de ADNc inicial se realizó a 55 °C durante 30 min seguido de 30 ciclos de 95 °C durante 30 s, 55 °C durante 1 min y 68 °C durante 80 s. A continuación, el producto de RT PCR (1 ml) se utilizó como plantilla para la PCR secundaria realizada en 25 pl con 0,5 U de polimerasa Super TAQ (HT Biotechnologies) y se cebó con el cebador directo 5'CCC AGT CTA CCA cCc TAT CAG AGC3' [SEQ ID NO: 314] y el cebador inverso 5'CCT GCC TTT AAG GCT TCC TT3' [SEQ ID NO: 315]. Las condiciones de ciclo fueron 95 °C durante 1 min, 57 °C durante 1 min y 72 °C durante 80 s durante 25 ciclos. Los productos se examinaron mediante gel de agarosa al 2 % y después de escanear utilizando el programa informático Gene Tools Analysis (SynGene), la cantidad relativa de omisión del exón 23 se expresó como un porcentaje a una concentración dada de conjugados promediados sobre duplicados de tres experimentos.
Los resultados (Figura 1) mostraron que todos los conjugados Pip-6a-PMO, Pip-6b-PMO, Pip-6c-PMO, Pip-6d-PMO, Pip-6e-PMO y Pip-6f-PMO dieron una elevada actividad de omisión de exón en células musculares de mdx.
Los conjugados Pip-6g-PMO, Pip-6h-PMO, Pip-6i-PMO, Pip-7a-PMO, Pip-7b-PMO, Pip-7b2-PMO, Pip-7c2, Pip-8a-PMO, Pip-8b y Pip-8c también dieron una elevada actividad de omisión de exón en células musculares de mdx y Pip 7c y Pip7d dieron una omisión de exón moderada (Figuras 2 a 5).
Ensayos in vivo de conjugados Pip6-PMO en el ratón mdx
Dada la potencia de Pip5e-PMO en el tejido cardíaco, el objetivo de alterar la secuencia del núcleo hidrófobo (manteniendo la longitud de 5 aa) era identificar péptidos que podrían ser más eficaces en dosis más bajas. Estas modificaciones incluyeron inversión de la región hidrófoba (Pip6a), sustitución de tirosina por isoleucina (Pip6b), sustitución de glutamina en la secuencia de Pip6a por desplazamiento de la arginina que flanquea inmediatamente el núcleo en la primera región flanqueante rica en arginina (Pip6e), y una secuencia central hidrófoba desordenada (Pip6f). Todos los conjugados de péptido Pip6-PMO se administraron a ratones mdx como inyecciones intravenosas únicas de 12,5 mg/kg a través de la vena de la cola y los tejidos se recogieron 2 semanas más tarde y se evaluó la actividad tanto a niveles de ARN como de proteínas.
La tinción inmunohistoquímica de la expresión de distrofina para todos los Pip6-PMO con núcleo de 5 aa reveló elevados niveles de producción de distrofina en los músculos esqueléticos, incluyendo el TA, diafragma y el corazón. La cuantificación de la tinción inmunohistoquímica (Figuras 34a y b) se realizó como se describió previamente [Malerba, A., y col., La terapia sistémica crónica con oligómeros de morfolino en dosis bajas mejora la patología y normaliza el comportamiento locomotor en ratones mdx. Mol Ther, 2011. 19(2): págs. 345-54; Arechavala-Gomeza, V., y col., Immunohistological intensity measurements as a tool to assess sarcolemma-associated protein expression. Neuropathol Appl Neurobiol, 2010. 36(4): pags. 265-74.] y se logró tomando 4 marcos representativos de la tinción de distrofina y correlacionando esto con la tinción de laminina para cada sección (n = 3) del cuádriceps, diafragma y corazón para cada tratamiento con péptido-PMO. Los ratones mdx sin tratar y mdx tratados se normalizaron a ratones C57BL10. Este procedimiento permite comparar la intensidad de tinción de la distrofina en el sarcolema en relación con la laminina para cada grupo de tratamiento. Las relaciones de intensidad se normalizan a muestras de C57BL10 y cada región de interés en el sarcolema (120 regiones para cada grupo de tratamiento) se representa en un gráfico de dispersión. Los valores de intensidad relativa obtenidos para los cuatro conjugados Pip6-PMO con núcleo de 5 aa fueron significativamente diferentes a los de los ratones mdx sin tratar para el cuádriceps y el diafragma (Figura 34b y figura 31). Hubo niveles de restauración de distrofina muy similares en los cuádriceps (porcentaje de puntuación de recuperación- % de PR-intervalo entre 21,10 y 33,44 %; Figura 34b) y en el diafragma para todos los tratamientos, con la excepción de Pip6b que tuvo una puntuación de recuperación más elevada en el diafragma (intervalo de % de PR entre 38,87 y 48,43 %, Pip6b 56,72 %; Figura 34b). Todos los ratones tratados con Pip6-PMO con núcleo de 5 aa presentaron valores elevados de intensidad de distrofina en el corazón con la excepción de Pip6e (otros Pip6-PMO fueron estadísticamente significativos en comparación con mdx = p <0,0001; Figura 31). Los conjugados Pip6a- y Pip6b-PMO mostraron las puntuaciones de recuperación más elevadas, como se observa en la Figura 34b, (% de p R 37,66 % y 34,22 % respectivamente) seguido de cerca por Pip6f-PMO (% de PR 26,24 %) y después Pip5e-PMO (% de PR 17,32 %). Cuando se compara directamente con el tratamiento con Pip5e-PMO, solo Pip6a-PMO fue significativamente mejor en el corazón (Figura 32). También se demostró que estos Pip6-PMO con núcleo de 5 aa restauran otras proteínas del complejo de distrofina, a saber, nNOS, a-sarcoglicano y p-sarcoglicano, como se ilustra mediante tinción inmunohistoquímica en el músculo TA.
Los análisis de PCR y transferencia Western mostraron resultados similares a los de la inmunotinción. Las imágenes representativas de RT-PCR (Figura 34d) ilustran una elevada eficacia de omisión de exón en todos los tejidos analizados. Esto se muestra mejor con los resultados de PCR en tiempo real (qRT-PCR) para los cuádriceps, diafragma y corazón (Figura 34c). El transcrito A23 se normaliza frente a la "distrofina total" para cada grupo de músculos (n = 3). La cuantificación de estos datos reveló niveles similares de omisión de A23 en los cuádriceps de todos los ratones tratados con Pip6-PMO con 5 aa. Las tendencias de los datos sugieren que Pip6f- y Pip5e-PMO muestran la mayor omisión de exón en el diafragma y Pip6f-PMO la mayor en el corazón (para valores medios de corte y empalme véase la figura 38a). Se realizaron transferencias Western (Figura 34e) en los tejidos de cada ratón y se cuantificaron frente a un control C57BL10 al 50 % y al 10 %. Estos resultados se promediaron y se presentan en la figura 38b. Los conjugados Pip6a-, Pip6b-, Pip6e- y Pip6f-PMO presentaron la mayor restauración de proteína distrofina en los músculos TA y cuádriceps. Los niveles de restauración de distrofina en el diafragma fueron uniformes en todos estos tratamientos, mientras que en el caso del corazón, los conjugados Pip6b- y Pip6f-PMO mostraron la mayor restauración de distrofina.
La restauración de proteínas medida mediante tinción inmunohistoquímica es consistentemente más elevada que la restauración de proteínas calculada mediante análisis de transferencia Western. Estas diferencias pueden atribuirse a las diferentes 'proteínas de carcasa' utilizadas, es decir, la restauración de distrofina cuantificada mediante tinción inmunohistoquímica se normaliza frente a laminina, mientras que el análisis de transferencia Western utiliza a-actinina para la normalización. La cuantificación de las transferencias Western solo se ha informado recientemente para la distrofina y actualmente utiliza procedimientos de quimioluminiscencia. Por lo tanto, puede ser juicioso dar mayor peso a las tendencias en los niveles de proteína distrofina reveladas mediante transferencia Western en lugar de a los valores absolutos. Por lo tanto, considerando los resultados en general, los ratones mdx tratados con cada uno de los cuatro Pip6-PMO con núcleo de 5 aa (Pip6a-, Pip6b-, Pip6e- y Pip6f-PMO) parecen mostrar una mejora en la producción de distrofina y en la omisión de exones en músculos de tA, cuádriceps y corazón en comparación con el candidato de partida anterior, Pip5e-PMO.
Además, estos Pip6-PMO con núcleo de 5 aa no presentan evidencia de toxicidad, según la evaluación de los niveles plasmáticos de biomarcadores de toxicidad relevantes, alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST) y creatina cinasa (Véase la figura 40a). Los niveles de nitrógeno ureico en sangre y creatinina fueron similares a los niveles de mdx sin tratar (véase la figura 40b). Todos los grupos de tratamiento con Pip6-PMO presentan niveles de biomarcadores similares a los controles C57BL10 no tratados.
Como se ha descrito anteriormente, Pip5e-PMO se comparó con conjugados de Pip6-PMO para la omisión de exones y la producción de distrofina en ratones mdx adultos (4,5 meses de edad) tratados con una única inyección intravenosa de 12,5 mg/kg y los tejidos de todo el cuerpo se recogieron 2 semanas más tarde.
Se utilizó tinción inmunohistoquímica (datos no mostrados) para visualizar la producción de la proteína distrofina (y su correcta reubicación en el sarcolema) y se utilizó RT-PCR para detectar productos con omisión de exón en grupos musculares de mdx tratados. La qPCR permite la cuantificación del producto cortado y empalmado y se utilizaron transferencias Western para cuantificar la cantidad de la proteína distrofina producida en los músculos de los ratones mdx tratados en comparación con controles C57BL10 y mdx sin tratar.
Los resultados (Figuras 6 a 17) mostraron que Pip-6a (que contiene una secuencia central invertida (Dominio 2) de Pip-5e), Pip-6b (Y cambió a I en la secuencia central), Pip-6e (R se movió a la secuencia central) y Pip-6f (que contiene una secuencia central desordenada) mantuvieron la omisión de exón y la producción de distrofina en el músculo cardíaco de manera similar a Pip-5e, mientras que los péptidos que contienen una secuencia central truncada (Pip-6c y Pip-6d) perdieron actividad en el músculo cardíaco. La actividad en todos los demás tipos de músculos fue ampliamente similar para las seis construcciones de Pip-6 (a, b, c, d, e, f) y PMO.
Estos resultados indican que para la administración eficaz de PMODMD al músculo cardíaco, la secuencia de péptidos no es importante, lo que sugiere que no hay una señal de entrada a la célula específica (por ejemplo, núcleo desordenado: Pip-6f presenta una buena administración de PMODMD al músculo cardíaco). Por tanto, mientras que la conservación de una secuencia central hidrófoba de 5 aminoácidos es importante, el orden N- a C- (secuencia primaria) de esa secuencia central hidrófoba no es importante, como lo demuestra la inversión y el desorden de la secuencia central sin pérdida de actividad en el músculo cardíaco en comparación con Pip-5e. Sin embargo, para la administración a otros tipos de músculos, por ejemplo, músculo esquelético y liso, el requisito de tener una secuencia central hidrófoba de 5 aminoácidos es menos importante, como lo demuestra la buena actividad en el músculo no cardíaco por Pip-6c y Pip-6d.
Ensayo de viabilidad celular
Se cultivaron células Huh-7 a 37 °C bajo CO2 al 5 %/atmósfera de aire al 95 % en DMEM complementado con suero bovino fetal al 10 % y antibióticos de penicilina/estreptomicina. Las células se trataron con tripsina y se colocaron en placas a 1,5 * 104 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Después de la incubación durante la noche, las células se lavaron con PBS y se añadieron conjugados PMO-péptido en 50 pl de OptiMEM a los pocillos por triplicado. Después de 4 horas de incubación, los conjugados se eliminaron mediante el reemplazo del medio con 100 pl de DMEM/FBS al 10 % durante 20 h más de incubación. Se añadieron 20 pl de solución de ensayo de viabilidad celular MTS (Promega) a los pocillos que contenían 100 pl de DMEM y las placas se incubaron durante 1 a 2 horas antes de tomar las medidas de UV a 490 nm. El porcentaje de viabilidad celular se determinó normalizando la absorbencia media de las muestras por triplicado a la media de las muestras sin tratar.
Los resultados presentados (Figuras 19 a 22) son el promedio de dos experimentos independientes y son coherentes con una mayor viabilidad celular (es decir, menor toxicidad celular) de péptidos que contienen menos restos de arginina. Por ejemplo, los péptidos que tenían un total de 7 restos de arginina en los dominios 1 a 3 combinados presentaron una mayor viabilidad celular (menor toxicidad celular) que los péptidos que tenían 8 o 9 restos de arginina.
Estabilidad sérica de los conjugados Pip-PMO
Se midió la estabilidad en suero mediante la adición de una alícuota de Pip-PMO (10 nmoles) a suero de ratón al 100 % (100 pl) y mediante la incubación a 37 °C durante 120 o 240 min. Cada reacción se diluyó con solución i.m. de guanidinio-HCl (300 pl) y acetonitrilo enfriado en hielo (600 pl). Las muestras se mezclaron y se mantuvieron a -20 °C, y las proteínas séricas precipitadas se separaron mediante centrifugación (13000 rpm, 5 min). Después de la centrifugación, se recogió el sobrenadante, se liofilizó y el resto se disolvió en agua para análisis de degradación de péptidos mediante espectrometría de masas MALDI-TOF y mediante HPLC de fase inversa. Las condiciones de HPLC fueron: Columna, C18 fase inversa (250 x 4,6 mm); Disolvente A, TFA al 0,1 %, disolvente B, acetonitrilo al 90 %, disolvente A al 10 %; Gradiente, disolvente B del 10 % al 50 % en 25 minutos. Los resultados mostraron que para Pip5e-PMO, Pip6a-PMO, Pip6e-PMO y Pip6f-PMO a los 120 minutos, el componente principal restante podría identificarse como el conjugado Pip-PMO sin cambios y que los niveles de PMO conjugado con fragmentos de péptido eran muy similares a los de (RXRRBR)2XB-PMO.
Las eliminaciones parciales del núcleo hidrófobo de los conjugados Pip6-PMO anulan la producción de distrofina cardíaca
Además de la necesidad de identificar Pip-PMO con elevada eficacia y administración cardíaca, otro objetivo era definir mejor los elementos del núcleo hidrófobo de los péptidos Pip que son importantes para la administración al corazón. Para este fin, los péptidos Pip que contienen eliminaciones parciales del núcleo hidrófobo por 1 aminoácido (eliminación de tirosina; Pip6c) y por 2 aminoácidos (eliminación de isoleucina y tirosina; Pip6d) se sintetizaron como conjugados de PMO.
Después del tratamiento de ratones mdx, se realizó una tinción inmunohistoquímica que reveló cierta expresión de distrofina en los músculos esqueléticos, tales como el TA y el diafragma, para ambas eliminaciones en Pip6-PMO. La cuantificación de la tinción inmunohistoquímica reveló la menor restauración de distrofina en el cuádriceps con el tratamiento con Pip6d, seguido de cerca por Pip6c-PMO en comparación con los otros Pip6-PMO (Figura 35a, b y figura 31). De manera similar, Pip6d-PMO mostró la restauración de distrofina más baja en el diafragma. Las puntuaciones de recuperación para los conjugados Pip6c- y Pip6d-PMO en el corazón fueron muy bajas, indicando su baja eficacia (% de PR de Pip6c -1,06 % y de Pip6d 2,50 %; figura 35b).
Estos resultados se corroboraron mediante los análisis de PCR y transferencia Western. Las imágenes representativas de RT-PCR (Figura 35d) y los resultados de omisión de exón de qRT-PCR (Figura 35c) indican una reducción de la omisión de exón en ratones mdx tratados con conjugados Pip6c- y Pip6d-PMO en cuádriceps y diafragma y omisión de exón insignificante en el corazón. El análisis de transferencia Western reveló una producción ineficaz de la proteína distrofina en los músculos TA y cuádriceps y una restauración insignificante de distrofina en el corazón (Figura 35e y figura 38b).
Estos resultados muestran que la longitud del núcleo hidrófobo es crucial no solo para una buena producción de distrofina cardíaca, sino también para la actividad en algunos otros grupos musculares. Por lo tanto, el contenido de arginina del CPP por sí solo no es el único factor pronóstico de la producción de distrofina y la eficacia de omisión de exón para esta clase de péptidos.
La alteración de la posición de la arginina en el núcleo hidrófobo o la adición de una segunda arginina es perjudicial para la producción de distrofina
El reposicionamiento de una arginina desde una región flanqueante hacia el núcleo fue inesperadamente tolerado (Pip6e-PMO). Por tanto, se sintetizaron otros dos conjugados de Pip6-PMO como derivados de Pip6e-PMO. Pip6g-PMO contenía un segundo resto de arginina, que se movió de la segunda región flanqueante al núcleo central hidrófobo, y Pip6h-PMO contiene una inversión de la región hidrófoba de Pip6e, de manera que la ubicación única de la arginina se altera dentro del núcleo.
Sorprendentemente, estos cambios en el núcleo hidrófobo dieron como resultado reducciones adicionales en la expresión de distrofina no solo en el corazón sino también en todos los demás tejidos, como se observa en la tinción inmunohistoquímica y en las cuantificaciones de la misma (Figura 36a y b). Las imágenes representativas de tinción inmunohistoquímica revelaron muy pocas fibras positivas para distrofina en todos los tejidos con la excepción del TA y cuádriceps. Con referencia a las cuantificaciones, Pip6g-PMO no fue significativamente diferente al mdx sin tratar en el cuádriceps o diafragma (Figura 39a). Ambos derivados de Pip6e-PMO no fueron significativamente diferentes a los mdx sin tratar en los músculos del corazón, lo que ilustra la ineficacia general de estos dos péptidos. De manera similar, estos derivados de Pip6e-PMO mostraron una eficacia reducida en la omisión de exón, como se ilustra en imágenes representativas de RT-PCR (Figura 39d) y en análisis de qRT-PCR (Figura 36c y figura 39c) en todos los tejidos. Las transferencias Western revelaron una restauración insignificante de la proteína distrofina (Figura 36e y figura 39d) en todos los tejidos con la excepción del músculo TA. Estos datos muestran que un aumento en el número de argininas o una alteración en la ubicación de la arginina única en la región hidrófoba de Pip6e son perjudiciales para la producción de distrofina tanto en el corazón como en el músculo esquelético.
Materiales y procedimientos
Síntesis de conjugados péptido-PMO
Los péptidos se sintetizaron mediante la química estándar de Fmoc y se purificaron mediante HPLC. La secuencia de PMO (5'-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3' [SEQ ID NO: 310]) se adquirió de Gene Tools LLC. Los péptidos se conjugaron con PMO a través de un enlace amida en el extremo 3' de PMO, seguido de purificación mediante HPLC y se analizaron mediante MALDI-TOF MS como se describió anteriormente en la comunicación preliminar [Saleh AF, A. A. A., Yin H., Betts C., Hammond S., Wood M. J. A. y Gait M. J., Enhancement of exon skipping and dystrophin production by 3'-peptide conjugates of morpholino (PMO) oligonucleotides in a mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy in Collection Symposium Series, Chemistry of Nucleic Acid Components. 2011, Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic: Praga. pags. 292-296]. Los conjugados péptido-PMO se disolvieron en agua estéril y se filtraron a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,22 pm antes de su uso.
Se encontró que los conjugados de PMO de Pip6a, Pip6b, Pip6e y Pip6f eran predominantemente estables y de estabilidad similar a Pip5e-PMO en suero al 100 % durante 2 h a 37 °C, como se observa mediante análisis espectral de masas y MALDI-TOF y HPLC. Todos los conjugados mostraron patrones de degradación similares, y aún se observaron conjugados inalterados hasta 4 h, (datos no mostrados).
Ensayos in vitro: omisión de exón en miotubos de ratón mdx
Se prepararon e incubaron miotubos H2K de mdx con conjugados de péptido-PMO en ausencia de cualquier agente de transfección a concentraciones de 0,125, 0,25, 0,5 y 1,0 pM mediante el procedimiento descrito previamente [Yin, H., y col., Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(7): págs. 1295-303.]. Los productos de la RT-PCR con cebadores internos del ARN total aislado se examinaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2 %. La cuantificación de los niveles del transcrito A23 se calculó utilizando densitometría. La prueba de viabilidad celular MTS (Promega) mostró el 100 % de supervivencia a las concentraciones más elevadas de conjugados péptido-PMO utilizadas en el estudio (datos no mostrados).
Animales e inyecciones intravenosas
Se utilizaron ratones mdx de cuatro meses y medio a 5 meses y medio de edad en estos experimentos (n = 3). Los experimentos se realizaron en la Biomedical Sciences Unit, Universidad de Oxford de acuerdo con los procedimientos autorizados por el UK Home Office. Se prepararon conjugados de Pip6-PMO en solución salina al 0,9 % a una dosis final de 12,5 mg/kg. Se administró el volumen total de 160 pl a través de la vena de la cola de ratones anestesiados. Dos semanas después, los ratones se sacrificaron mediante inhalación de CO2, y músculos y otros tejidos se recogieron y se congelaron rápidamente en isopentano enfriado antes del almacenamiento a -80 °C.
Inmunohistoquímica y cuantificación de la expresión de la distrofina
Se cortaron secciones transversales de muestras de tejido (8 pm de espesor) para examinar la expresión de la distrofina. Para la visualización y cuantificación de la distrofina, las secciones se tiñeron de manera conjunta con antidistrofina de conejo (Abcam) y antilaminina de rata (Sigma), y se detectaron mediante anticuerpos secundarios de cabra anti-IgG de conejo Alexa 594 y de cabra anti-IgG de rata 488 respectivamente (Invitrogen). Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio Leica DM IRB y el programa informático Axiovision (Carl Zeiss). La inmunohistoquímica cuantitativa se realizó como se describió anteriormente [Malerba, A., y col., La terapia sistémica crónica con oligómeros de morfolino en dosis bajas mejora la patología y normaliza el comportamiento locomotor en ratones mdx. Mol Ther, 2011. 19(2): págs. 345-54; Arechavala-Gomeza, V., y col., Immunohistological intensity measurements as a tool to assess sarcolemma-associated protein expression. Neuropathol Appl Neurobiol, 2010.
36(4): págs. 265-74.]. Se tomó una imagen representativa de cada tratamiento. Para la cuantificación, se tomaron 4 marcos representativos de la distrofina y la laminina correlacionada para cada sección (n = 3) del cuádriceps, diafragma y corazón para cada tratamiento. Utilizando el programa informático ImagePro, se colocaron aleatoriamente 10 regiones de interés en la imagen de laminina que se superpuso a la imagen de distrofina correspondiente. La intensidad de fluorescencia mínima y máxima para 120 regiones se registró para cada tratamiento. La diferencia de intensidad se calculó para cada región para corregir la fluorescencia de fondo y mdx sin tratar y mdx tratados se normalizaron a C57BL10. Estos valores se representaron en un gráfico de dispersión. Las 'medias de intensidad relativa' se calcularon utilizando un modelo estadístico multinivel. Utilizando estos valores, el porcentaje de puntuación de recuperación se calculó implementando la siguiente ecuación, como se describe en la dirección de Internet de TREATNMD
(http://www.treatnmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/DMD_M.1.1_001.pdf): (recuperación de distrofina de ratones mdx tratados - recuperación de distrofina de ratones mdx no tratados)/(recuperación de distrofina de ratones C57BL10 - recuperación de distrofina de ratones mdx sin tratar). La tinción de las proteínas asociadas a la distrofina se realizó como se describió anteriormente [Yin, H., y col., Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011.
19(7): pags. 1295-303] utilizando un kit de bloqueo MOM (Vector Labs) y anticuerpos a-sarcoglicano y a-distroglucano (Novocastra) (dilución 1:100). La tinción con nNOS se realizó utilizando un anticuerpo de cabra anticonejo (Abcam).
Omisión de exón en tejidos de ratón mdx
Se extrajo el ARN total de los tejidos de ratón de control y tratados utilizando reactivo TRIzol (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante.
RT-PCR: Se utilizaron cuatrocientos nanogramos de plantilla de ARN en una reacción de transcripción inversa de 50 pl utilizando el kit One Step RT-PCR (QIAGEN) y cebadores específicos de genes (Ex 20 a 26, directo: 5'-CAG AAT TCT GCC AAT TGC TGA G-3' [SEQ ID NO: 312], inverso: 5'-TTC TTC AGC TTG TGT CAT CC-3' [SEQ ID NO: 313]). Condiciones de ciclo: 50 °C durante 30 minutos, seguido de 30 ciclos de 30 s a 94 °C, 1 min a 58 °C y 2 min a 72 °C. Se amplificaron adicionalmente dos microlitros de ADNc en una PCR con cebadores internos de 50 pl (kit QIAGEN PCR) utilizando las siguientes condiciones de ciclo: 94 °C durante 30 segundos, 58 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 1 min durante 24 ciclos (Ex 20 a 26: directo: CCC AGT CTA CCA CCC TAT CAG AGC [SEQ ID NO: 314], inverso: CCT GCC TTT AAG g Ct TCC TT [SEQ ID NO: 315]). Los productos de la PCR se examinaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2 %.
PCR cuantitativa en tiempo real: Se sometieron a transcripción inversa dos microgramos de ARN utilizando un kit de High Capacity cDNA Synthesis (Applied Biosystems). La qPCR de omisión de exón se realizó utilizando Syber green Kits (Applied Biosystems), conjuntos de cebadores (IDT) y el sistema de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems). Los conjuntos de cebadores utilizados fueron los siguientes: transcritos totales de distrofina, ex 19 a 20: directo: GCCATAGCACGAGAAAAAGC [SEQ ID NO: 812], inverso: GCATTAACACCCTCATTTGC [SEQ ID NO: 813]; transcrito de A23 dmd, directo: GCG CTA TCA GGA GAC AAT GAG [SEQ ID NO: 814], inverso: GTT TTT ATG TGA TTC TGT AAT TTC CC [SEQ ID NO: 815]. Se utilizaron plásmidos (distrofina total y A23 omitidos) para la curva estándar.
Extracción de proteínas y transferencia Western
Las muestras de músculo de control y tratadas se homogeneizaron en tampón de lisis que comprendía Tris-HCl 75 mM (pH 6,5) y dodecilsulfato de sodio al 10 % complementado con 2-mercaptoetanol al 5 %. Las muestras se calentaron a 100 °C durante 3 minutos antes de la centrifugación y la eliminación del sobrenadante. Los niveles de proteína se midieron mediante el ensayo de Bradford (Sigma) y se cuantificaron utilizando estándares BSA. Diez a 15 pg de proteína de muestra de mdx sin tratar y tratada, y el 50 % y el 10 % de estas concentraciones de proteína C57BL10 (control positivo) se cargaron en geles de Tris-acetato al 3-8 %. Las proteínas se transfirieron a la membrana de PVDF y se sondaron para detectar distrofina utilizando DYS1 (Novocastra) y anticuerpo de control de carga, a-actinina (Sigma). El anticuerpo primario se detectó mediante la unión de IgG anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante con lumigen. Se obtuvieron imágenes de transferencias Western (LícOr Biosciences) y se analizaron utilizando el sistema de imágenes Odyssey.
Bioquímica clínica
Se tomaron muestras de plasma de la vena yugular de ratones mdx inmediatamente después del sacrificio mediante inhalación de CO2. El análisis de biomarcadores de toxicidad se realizó por un laboratorio de patología clínica, Mary Lyon Centre, MRC, Harwell, RU.
Análisis estadístico
Todos los datos informaron valores medios ± EEM. Se aplicó el modelo multinivel de medidas repetidas para este estudio. El enfoque estadístico multinivel se basa en procedimientos estadísticos tradicionales y se está aplicando cada vez más en las ciencias sociales, ciencias médicas y biológicas [Butterfield, A., y col., PyEvolve: a toolkit for statistical modelling of molecular evolution. BMC Bioinformatics, 2004. 5: p. 1; Brooks, G., y col., Referral Source and Outcomes of Physical Therapy Care in Patients With Low Back Pain. J Orthop Sports Phys Ther, 2012; Bernier, J., Y. Feng y K. Asakawa, Strategies for handling normality assumptions in multilevel modeling: a case study estimating trajectories of Health Utilities Index Mark 3 scores. Health Rep, 2011. 22(4): págs. 45-51; Winter, E.M., R.G. Eston y K.L. Lamb, Statistical analyses in the physiology of exercise and kinanthropometry. J Sports Sci, 2001. 19(10): págs.
761-75.]. El modelo utilizado para este estudio tiene en cuenta las múltiples "unidades de intensidad relativa" (nivel 1) para cada ratón (nivel 2) para cada tratamiento (nivel 3) como se realizó en la cuantificación de tinción inmunohistoquímica. En el presente ejemplo, se aplicaron ratones mdx no tratados y ratones tratados con Pip5e-PMO como el parámetro constante/fijo, con el que se compararon los otros tratamientos y el control de tipo silvestre. Esto sucedió después de una transformación de potencia de Box-Cox que se realizó para garantizar una distribución normal. El análisis estadístico se realizó utilizando MLwIN versión 2.25.
Síntesis de péptidos y conjugados péptido-PMO
La secuencia de PMO (5'-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3' [SEQ ID NO: 310]) se adquirió de Gene Tools LLC. Los péptidos se sintetizaron mediante la química estándar de 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), utilizando un sintetizador de péptidos Liberty (CEM) en una escala de 100 pmoles, se purificaron hasta >90 % de pureza mediante HPLC de fase inversa estándar, y se caracterizaron mediante MALDI-TOF MS. Se prepararon conjugados péptido-PMO en una escala de PMO de 200 nmoles a través de un enlace amida mediante la unión del grupo carboxilo en el extremo C del péptido a la amina secundaria en el extremo 3' del PMO (Figura 1c). El ácido carboxílico carboxiterminal del péptido (exceso molar de 2,5 veces sobre PMO) se activó utilizando hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU) y 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) en 1 -metil-2-pirrolidinona (NMP) y diisopropiletilamina (DIEA) utilizando un exceso molar de HBTU:HOBt:DIEA (2,3:2,0:2,3) sobre el péptido. La mezcla se añadió a una solución de PMO (10 mM) disuelta en DMSO y se incubó a 37 °C durante 2 h. A continuación, la mezcla se diluyó con un exceso de agua 4 veces mayor y se purificó en una columna de cromatografía de intercambio catiónico (columna Resource S de 6 ml, GE Healthcare) utilizando tampón de fosfato de sodio (tampón A: Na2HPO425 mM, acetonitrilo al 25 %, pH 7,0), tampón B: NaCl 1 M, Na2HPO425 mM, acetonitrilo al 25 %, pH 7,0), un caudal de 4 ml/min y un gradiente de tampón B del 0 al 75 % en 25 min para eliminar el PMO no conjugado y el exceso de péptido. A continuación, los conjugados se cargaron en una columna Oasis HLB (4,6 mm * 20 mm, Waters, Milford, MA), se lavaron con agua para eliminar las sales y se eluyeron con acetonitrilo al 60 % (v/v). El conjugado se liofilizó y analizó mediante MALDI-TOF MS y mediante HPLC (Figura 37). Los conjugados péptido-PMO se disolvieron en agua estéril y se filtraron a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,22 pm antes de su uso. Los rendimientos generales fueron del 20 al 25 % basados en PMO.
Aumento a escala de la síntesis de péptido-PMO
Las conjugaciones se mejoraron en una escala de 1000 nanomol de PMO inicial, manteniendo la misma proporción para HBTU:HOBt:DIEA como se describe anteriormente. Las reacciones de conjugación se llevaron a cabo utilizando un horno de microondas (CEM Discover) y la temperatura de reacción se aumentó a 65 °C, conduciendo a una disminución del tiempo de reacción a 15 min. Las etapas cruciales de purificación también se mejoraron en este procedimiento. La mezcla de reacción bruta se purificó mediante HPLC utilizando una columna de intercambio iónico más grande (Source 15S, GE Healthcare, HR16/10, 18 ml de volumen del lecho) para eliminar el exceso de péptido y PMO no conjugado, eluyendo con una solución de cloruro de sodio (NaCl, 1,0 M) en tampón fosfato de sodio (pH 7,0) para obtener la sal cloruro del péptido-PMO. Se utilizó una etapa de desalación para eliminar el exceso de NaCl en una columna de desalación Oasis HLB hecha a medida (Waters, 19 * 30 mm). Después de lavar la columna durante 10 min con agua de calidad Millipore (en lugar de agua de calidad HPLC), el PPMO se eluyó con acetonitrilo al 60 % (v/v) en agua. Se utilizaron 500 nanomoles en una sola inyección y los rendimientos fueron mayores que con inyecciones múltiples (por ejemplo, 2 * 250 nmol). Esto dio como resultado un aumento en el rendimiento de esta reacción de conjugación en un recipiente hasta aproximadamente el 40 %.
Análisis
La terapia más prometedora hasta la fecha para el trastorno neuromuscular gravemente debilitante DMD es el tratamiento con Ao, que restaura el marco de lectura del pre-ARNm de la distrofina mediante omisión de exón. Dos AO, un PMO [Cirak, S., y col., Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an openlabel, phase 2, dose-escalation study. Lancet, 2011. 378(9791): págs. 595-605; Miller, F., C.F. Moseley y J. Koreska, Spinal fusion in Duchenne muscular dystrophy. Dev Med Child Neurol, 1992. 34(9): pags. 775-86.] y un oligonucleótido 2'OMe [van Deutekom, J.C., y col., Local dystrophin restoration with antisense oligonucleotide PRO051. N Engl J Med, 2007. 357(26): págs. 2677-86; Goemans, N.M., y col., Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med, 2011.
364(16): págs. 1513-22.], se encuentran actualmente en ensayos clínicos y los primeros resultados prometedores han aumentado la esperanza para los pacientes con DMD. Sin embargo, estudios que implican la administración de dosis muy elevadas de PMO inalterado en ratones mdx han mostrado sólo una restauración parcial de la distrofina en los músculos esqueléticos de todo el cuerpo y una corrección insignificante en el corazón [Malerba, A., y col., La terapia sistémica crónica con oligómeros de morfolino en dosis bajas mejora la patología y normaliza el comportamiento locomotor en ratones mdx. Mol Ther, 2011,19(2): págs. 345-54; Malerba, A., y col., Dosing regimen has a significant impact on the efficiency of morpholino oligomer-induced exon skipping in mdx mice. Hum Gene Ther, 2009. 20(9): págs. 955-65.]. La necesidad de corregir la distrofina en el corazón es cada vez más evidente después de estudios en los que la corrección del fenotipo esquelético dio como resultado un aumento en la carga de trabajo cardíaco y, por tanto, una progresión adicional de la miocardiopatía [Malerba, A., L. Boldrin y G. Dickson, Long-term systemic administration of unconjugated morpholino oligomers for therapeutic expression of dystrophin by exon skipping in skeletal muscle: implications for cardiac muscle integrity. Nucleic Acid Ther, 2011. 21(4): págs. 293-8; Townsend, D., y col., Emergent dilated cardiomyopathy caused by targeted repair of dystrophic skeletal muscle. Mol Ther, 2008. 16(5): págs. 832-5.]. El descubrimiento de que los PMO conjugados con CPP pueden lograr una corrección de distrofina mucho más eficaz en ratones mdx que los PMO inalterados ha traído una promesa renovada para una eficacia mejorada de AO al mejorar la administración celular e in vivo.
Anteriormente se informó sobre un prometedor candidato a péptido-PMO, Pip5e-PMO, capaz de restaurar la proteína distrofina a niveles elevados en todos los tipos de músculos, incluyendo el corazón, después de una administración única de 25 mg/kg [Yin, H., y col., Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(7): págs. 1295-303.]. Además de las secuencias ricas en arginina, los péptidos Pip contienen una sección hidrófoba de 5 aa que no está presente en el péptido B de partida anterior [Perez, F., y col., Antennapedia homeobox as a signal for the cellular internalization and nuclear addressing of a small exogenous peptide. J Cell Sci, 1992. 102 (Pt 4): págs. 717-22.], que parecía ser responsable de la mejora de la actividad cardíaca. La serie Pip6 se desarrolló como derivados de Pip5e-PMO en un intento de arrojar luz sobre los aspectos del núcleo hidrófobo necesarios para la producción de distrofina cardíaca y también para identificar conjugados de Pip-PMO aún más activos. El presente estudio que utilizó un régimen de administración de dosis única y moderada ha producido algunos resultados sorprendentes.
Un hallazgo clave es que el mantenimiento de la longitud de cinco aminoácidos de la región central hidrófoba es imperativo para una buena producción de distrofina cardíaca. Se podría imaginar que la eficacia disminuida de la restauración de la distrofina en el corazón para Pip6c-PMO y Pip6d-PMO, con eliminaciones secuenciales de aminoácidos en el núcleo, podría estar correlacionada con la menor hidrofobicidad resultante y, por lo tanto, una capacidad reducida para entrar en la célula [Gupta, A., y col., Hydrophobicity drives the cellular uptake of short cationic peptide ligands. Eur Biophys J, 2011. 40(6): págs. 727-36.]. Sin embargo, los resultados in vitro sugerirían que todas estas construcciones son capaces de entrar en las células, ya que todas son totalmente capaces de omitir exones en las células musculares. Por tanto, la longitud del núcleo hidrófobo de 5 aa debe afectar un parámetro diferente esencial para ad in vivo al corazón. La captación mejorada de Pip5e-PMO marcado con fluorescencia en cortes de corazón completo, en comparación con B-PMO, sugirió en cambio que se mejora el cruce de otra barrera (por ejemplo, el revestimiento endotelial del corazón) [Yin, H., y col., Cell-penetrating peptide-conjugated antisense oligonucleotides restore systemic muscle and cardiac dystrophin expression and function. Hum Mol Genet, 2008. 17(24): págs. 3909­ 18.]. Continúan los estudios cardíacos adicionales con un Pip6-PMO que puede ayudar a abordar este problema. Quizás más sorprendente es que para Pip6c-PMO y Pip6d-PMO también hubo cierta pérdida de producción de distrofina en otros tipos de músculos. Esto sugiere que el equilibrio hidrófobo/catiónico y/o los espaciamientos precisos de restos hidrófobos y catiónicos en el CPP imponen efectos más sutiles sobre parámetros de administración in vivo. Otra conclusión clara que surge de los análogos de Pip6-PMO es que un orden específico de restos hidrófobos dentro del núcleo hidrófobo es menos importante para mantener la producción de distrofina cardíaca, ya que una secuencia invertida (Pip6a), una sola sustitución de un resto igualmente hidrófobo (Pip6b) y una secuencia desordenada (Pip6f) eran al menos tan activas como Pip5e-PMO, y más eficaces en el corazón y algunos grupos musculares (Figura 38).
Estos resultados proporcionan evidencia de que es poco probable que el núcleo hidrófobo de los péptidos Pip contenga una secuencia de aminoácidos particular que reconozca un receptor específico en una barrera de membrana requerida para penetrar el tejido cardíaco, pero en cambio el núcleo actúa como un espaciador hidrófobo de algún tipo.
Sin embargo, lo más sorprendente es que Pip6e-PMO indujo cierto corte y empalme de distrofina y restauración de proteínas en el músculo cardíaco como lo indican los resultados de Western y qRT-PCR (nota: no significativamente diferente en la cuantificación de la tinción inmunohistoquímica). En el péptido Pip-6e, un resto de arginina se mueve al núcleo hidrófobo, que también da como resultado la alineación de un resto X hidrófobo adyacente al núcleo (X-YRFLI [SEQ ID NO: 816]). Se podría haber esperado que la producción de distrofina cardíaca se hubiera perdido por completo en este conjugado, ya que ahora se incluye un aminoácido catiónico (arginina) en el núcleo. Por el contrario, dicha actividad cardíaca se perdió para Pip6h-PMO (núcleo X-ILFRY [SEQ ID NO: 817]) y el conjugado con núcleo de doble arginina Pip6g-PMO (núcleo XYr Fr LI-X [s Eq ID NO: 818]). Inesperadamente, la producción de distrofina también se perdió en el cuádriceps y el diafragma tanto para Pip6g- como para Pip6h-PMO. Las inconsistencias inesperadas dentro de los resultados de actividad para Pip6e, Pip6g y Pip6h, y las pérdidas de actividades para Pip6cy Pip6d-PMO, tal vez se expliquen mejor por la constatación de que los espaciamientos precisos del resto de arginina dentro de los péptidos Pip con respecto tanto a los espaciadores de aminoácidos hidrófobos externos (X y B) como a los restos centrales hidrófobos internos pueden alterar drásticamente las propiedades farmacológicas de cada conjugado. Esto podría ocurrir no solo a través de la alteración en el equilibrio catiónico/hidrófobo sino, de manera alternativa, debido a cambios en la estructura secundaria o terciaria de los Pip-PMO, lo que a su vez podría afectar la unión a proteínas séricas u otro parámetro que altere la semivida circulatoria, o que podría afectar la capacidad de atravesar las barreras necesarias para penetrar los tejidos musculares.
Varios conjugados (Pip6a, Pip6b y Pip6f-PMO) han mostrado actividades de producción de distrofina prometedoras incluso más allá de las del candidato anterior, Pip5e-PMO. De forma interesante, análisis de muestras de suero de uno de los tratamientos de Pip6-PMO con 5 aa, Pip6e-PMO, mostró normalización parcial de 3 miARN (miR-1, miR-133a y miR-206) a niveles cercanos a los de tipo silvestre después de una única administración de 12,5 mg/kg [Thomas C. Roberts, K.E.M.B., Graham McClorey, Samir EL Andaloussi, Caroline Godfrey, Corinne Betts, Thibault Coursindel, Michael J. Gait y C.I.E.S.a.M.J.A. Wood, Expression analysis in multiple muscle groups and serum reveals complexity in the microRNA transcriptome of the mdx mouse with implications for therapy. Nucleic Acid Ther, 2012]). Esto es muy prometedor para Pip6-PMO, ya que no se consideraría el péptido óptimo, pero aún así se demostró el efecto terapéutico significativo de este grupo de péptidos. Estas nuevas moléculas de partida proporcionan una buena base para la identificación de un candidato Pip-PMO adecuado para estudios fisiológicos detallados de la función muscular y cardíaca, así como un perfil de toxicidad exhaustivo, incluyendo estudios de aumento de dosis, en previsión de que uno de esos Pip-PMO procederá al ensayo clínico.
Ejemplo 2 - Síntesis de conjugados péptido-PMO
La secuencia de PMO (5'-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3') [SEQ ID NO: 310] se adquirió de Gene Tools, LLC. Los péptidos se sintetizaron internamente mediante la química estándar de 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), purificado hasta >90 % de pureza y caracterizado mediante mA l DI-TOF MS. Se prepararon conjugados péptido-PMO a través de un enlace amida mediante la unión del grupo carboxilo en el extremo C del péptido a la amina secundaria en el extremo 3' del PMO (Figura 33). Sin embargo, se hicieron varias modificaciones para la conjugación y purificación final de péptido-PMO, incluyendo a) reacción de conjugación a gran escala (hasta 15 pmol de PMO), b) uso de una columna de intercambio iónico a mayor escala para la purificación de péptido-PMO a partir de componentes individuales (Tabla 1) y c) el uso del dispositivo de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 para desalar en lugar de la columna de HPLC de fase inversa utilizada anteriormente. Como resultado, los rendimientos fueron más del doble y fueron de manera rutinaria del 40 al 55 % basado en la secuencia de PMO.
T l 1. l mn in r m i i ni R r r m r rifi i n
Figure imgf000028_0002
El ácido carboxílico carboxiterminal del péptido (exceso molar de 2,5 veces sobre PMO) se activó utilizando hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU) y 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt) en 1 -metil-2-pirrolidinona (NMP) y diisopropiletilamina (DIEA) utilizando un exceso molar de HBTU:HOBt:DIEA (2.3:2.0:2.3) sobre el péptido (Tabla 2). La concentración del péptido fue 100 mM. Después de mezclar, la mezcla se añadió a una solución en DMSO de PMO (10 mM) en una relación molar de 2,5:1 y se incubó a 37 °C durante 2 horas. A continuación, la mezcla se purificó mediante una gran columna de cromatografía de intercambio catiónico (columna Resource S de 200 ml, GE Healthcare) utilizando tampones de fosfato de sodio (tampón A: Na2HPO4 25 mM, acetonitrilo al 25 %, pH 7,0), tampón B: NaCl 1 M, Na2HPO4 25 mM, acetonitrilo al 25 %, pH 7,0), un caudal de 14 ml/min y un gradiente del tampón B del 0 al 100 % en 60 min, para eliminar el PMO no conjugado y el exceso de péptido.
T l 2. n i v l m n r iv r l n i n Pi -PM l 1 m l PM
Figure imgf000028_0001
A continuación, los conjugados se desalaron utilizando un dispositivo de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 MWCO de 3 kDa (Millipore) mediante la concentración de la muestra (centrifugado de 1 hora a 25 °C, a 3220 rcf), después mediante la dilución del concentrado a 12 ml con H2O. El procedimiento se repitió dos veces. El conjugado se liofilizó y analizó mediante MALDI-TOF MS y HPLC. Los conjugados péptido-PMO se disolvieron en agua estéril (sin endotoxinas) y se filtraron a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,22 pm antes de su uso. La concentración se midió mediante UV a 265 nm en HCl 0,1 N utilizando el coeficiente de extinción del PMO como se proporciona en la hoja de datos de Gene Tools.
Ejemplo 3 - Péptidos pip7-9
Evaluación de la toxicidad de Pip7-9-PMO in vitro
Se realizaron estudios de toxicidad de Pip7-9-PMO utilizando ensayos de viabilidad celular. Estos mostraron que 10 conjugados de arginina-PMO (Pip6e) tenían un elevado nivel de toxicidad celular (Figura 42). Por lo tanto, empleando Pip 6a (serie Pip8), Pip6e (serie Pip7) y Pip6f (serie Pip9) como péptidos precursores, la serie Pip7-9-PMO se sintetizó mediante la reducción del número de restos de arginina y aminohexanoílo (ácido aminohexanoico) para minimizar la posible toxicidad celular. La viabilidad celular aumentó sustancialmente en los miotubos mdx tratados con Pip7-9-PMO en comparación con las células tratadas con Pip6e (Figura 42), lo que sugiere una promesa para los siguientes estudios in vivo.
Una única inyección intravenosa de Pip7-9-PMO da como resultado una expresión generalizada de distrofina en los músculos esqueléticos/periféricos de mdx
Para evaluar la eficacia de omisión de exón de los compuestos Pip7-9-PMO, a los ratones mdx de 8 semanas de edad se les inyectó por vía intravenosa 12,5 mg/kg de Pip7-9-PMO. A las 2 semanas después de la inyección, se analizó la expresión de la distrofina en los músculos del tibial anterior (TA), diafragma, cuádriceps y corazón. Se evaluaron las fibras positivas para distrofina teñidas inmunológicamente, el ARNm con omisión de exón y los niveles de proteína distrofina (Figuras 2 a 4). La intensidad de las fibras teñidas inmunológicamente con distrofina se analizó utilizando un anticuerpo antilaminina de rata para la normalización y esto se expresó como una proporción del nivel de intensidad de los músculos C57BL/10 (Figura 5). Se observó una expresión notable de miofibras positivas para distrofina con omisión de exón en todos los músculos esqueléticos inyectados con Pip7-9-PMO, tales como los músculos del TA, cuádriceps y diafragma 2 semanas después de la inyección (Figuras 43 a 46). Sin embargo, solo Pip8b, Pip8c, Pip9b, Pip9b2 y Pip9c mostraron una expresión significativa de distrofina en el corazón (Figura 46). Pip7a, Pip7b, Pip7b2, Pip8c2, Pip9d y Pip9d2 dieron como resultado una producción insignificante de distrofina en el corazón (Figura 46). Teniendo en cuenta las estructuras de los péptidos, es evidente que el orden de los aminoácidos en la región central hidrófoba es menos importante, ya que incluso el núcleo hidrófobo desordenado de la serie Pip9 produjo una expresión de distrofina similar a la de la serie Pip8 en el corazón.
Evaluación toxicológica tras la administración sistémica del Pip7-9-PMO
Para evaluar las respuestas de toxicidad en ratones mdx tratados con Pip7-9-PMO, se realizaron evaluaciones preliminares de la función hepática y renal 2 semanas después de la administración sistémica de los compuestos Pip7-9-PMO mediante extracción y análisis de suero de ratones tratados y controles. Se llevó a cabo el análisis de los niveles de creatina cinasa sérica (CK), creatinina, urea, fosfatasa alcalina (ALP), alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), bilirrubina total y lactato deshidrogenasa (LDH). No hubo elevación en el nivel de urea y creatinina, un marcador de toxicidad renal y TBIL, un marcador de toxicidad hepática en suero mdx tratado con PPMO en comparación con el control mdx no tratado (Figura 47). Los niveles de ALT, AST, ALP y LDH estaban elevados en ratones mdx. No hubo elevación en los niveles de estos marcadores en suero mdx tratados con PPMO comparado con control mdx no tratado. Los niveles de CK fueron variables entre ratones.
Identificación adicional de PPMO de partida (exón 23 de ratón) en ratones mdx
Se identificaron PPMO para proporcionar un elevado nivel de restauración de la distrofina tanto en el músculo esquelético como en el cardíaco en ratones mdx. Pip8b, 9b, 9b2, 8c y 9c se han mostrado muy prometedores con una restauración de la distrofina muy eficaz en el tibial anterior (TA), diafragma, cuádriceps y corazón, sin toxicidad aparente.
Para comparar la eficacia de omisión de exón del PPMO de partida, a los ratones mdx de 8 semanas de edad se les inyectó por vía intravenosa 12,5 mg/kg de PPMO. A las 2 semanas después de la inyección, se analizó la expresión de la distrofina en los músculos del TA, cuádriceps, diafragma y corazón. Se evaluaron las fibras positivas para distrofina teñidas inmunológicamente, el ARNm con omisión de exón y los niveles de proteína distrofina (Figuras 48 a 50). La intensidad de las fibras teñidas inmunológicamente con distrofina en el TA y el corazón se analizó utilizando un anticuerpo antilaminina de rata para la normalización y esto se expresó como una proporción del nivel de intensidad de los músculos C57BL/10 (Figura 48). Los niveles de a Rn y proteína de distrofina con omisión de exón se expresaron notablemente en músculos esqueléticos inyectados con Pip8b, 9b y Pip9b2-PMO tales como los músculos del TA, cuádriceps, diafragma y corazón 2 semanas después de la inyección (Figuras 49 a 50). Sin embargo, Pip8c y 9c-PMO redujeron la expresión de distrofina en comparación con Pip8b, 9b y 9b2-PMO. Además, Pip9d2-PMO dio como resultado una producción insignificante de distrofina en músculos del TA, cuádriceps, diafragma y corazón (Figura 48 a 50), lo que ilustra la importancia de mantener la longitud de la región hidrófoba del péptido para inducir una omisión de exón eficaz.
El nivel de proteína distrofina en músculos mdx tratados con PPMO se cuantificó mediante análisis de transferencia Western. La densidad de la banda de distrofina se cuantificó utilizando el programa informático Licor y se utilizó vinculina como control de carga. La densidad de la banda se normalizó mediante su respectiva banda de vinculina y esto se expresó como un porcentaje del nivel de expresión de distrofina de los músculos C57BL/10. El nivel de proteína distrofina con omisión de exón fue similar en músculos esqueléticos inyectados con Pip8b, 9b y 9b2-PMO tales como los músculos del TA, cuádriceps y diafragma 2 semanas después de la inyección (Figura 50). Sin embargo, Pip8c y 9c redujeron la expresión de distrofina en comparación con 8b, 9b y 9b2-PMO. Además, 9d2-PMO dio como resultado una producción insignificante de distrofina en músculos del TA, cuádriceps, diafragma y corazón (Figura 50).
Restauración de niveles de microARN desregulados en ratones mdx tratados con PPMO de partida (exón 23 de ratón)
Se probó la capacidad de la distrofina con omisión de exón inducida por candidatos a PPMO para corregir los niveles de microARN mejorando la patología muscular en los ratones mdx. Se evaluaron los niveles de distromir (microARN desregulados en la deficiencia de distrofina), miR-1 y miR-133a, que se incrementaron en suero mdx y disminuyeron o no cambiaron en tejidos mdx y estos pueden, por tanto, constituir marcadores séricos útiles. A las 2 semanas después de la inyección intravenosa de 12,5 mg/kg de PPMO (Pip8b, 9b, 9b2, 8c y 9c) en ratones mdx de 8 semanas de edad, se examinaron los niveles de miR-133a y miR-206 mediante PCR cuantitativa (Q) en suero tratado con PPMO y se normalizaron a miR-223 como microARN de referencia. Los niveles de miR-133a y miR-206 se regularon significativamente a la baja en el suero tratado con PPMO de ratones mdx en comparación con controles mdx no tratados, lo que implica que el PPMO mejoró la patología muscular (Figura 51).
Mejora de la síntesis de PPMO
Para comparar la eficacia de omisión de exón de 9b2-PMO desalado por HPLC y filtro, a los ratones mdx de 8 semanas de edad se les inyectó por vía intravenosa 12,5 mg/kg de PPMO. A las 2 semanas después de la inyección, se analizó la expresión de la distrofina en los músculos del TA, cuádriceps, diafragma y corazón. Se evaluaron las fibras positivas para distrofina teñidas inmunológicamente, el ARNm con omisión de exón y los niveles de proteína distrofina (Figuras 52 a 54). La intensidad de las fibras teñidas inmunológicamente con distrofina se analizó utilizando un anticuerpo antilaminina de rata para la normalización y esto se expresó como una proporción del nivel de intensidad de los músculos C57BL/10 (Figura 52). No hubo cambios en el nivel de intensidad de distrofina con omisión de exón en el sarcolema inducido por 9b2-PMO desalinizado con HPLC y filtro. Los niveles de ARN y proteína de distrofina con omisión de exón aumentaron ligeramente en los músculos esqueléticos inyectados con Pip9b2-PMO desalinizado con filtro en comparación con los músculos tratados con PMO filtrado por HPLC, tales como TA, cuádriceps y diafragma 2 semanas después de la inyección (Figura 53).
Evaluación de la toxicidad de Pip9b2-PMO en miotubos cultivados de ratón mdx
Se llevó a cabo un estudio de toxicidad de Pip9b2-PMO desalado por HPLC y filtración utilizando ensayos de viabilidad celular. La viabilidad celular aumentó ligeramente en los miotubos mdx tratados con Pip9b2-PMO desalinizados por filtración en comparación con las células tratadas con Pip9b2-PMO desaladas por HPLC, cuando se trataron con 60 pM de Pip9b2-PMO (Figura 54).
Sumario
Se han identificado candidatos a PPMO para proporcionar una restauración de distrofina de elevado nivel tanto en el músculo esquelético como en el cardíaco en ratones mdx. En particular, Pip8b y 9b y Pip9b2, 8c y 9c han mostrado una restauración eficaz de la distrofina en el tibial anterior (TA), diafragma, cuádriceps y corazón, sin toxicidad aparente.
Para la evaluación cuantitativa del tratamiento in vivo de la DMD, se evaluaron los niveles de distromir (miR-133a y miR-206) que aumentaron en suero mdx. Los niveles de miR-133a y miR-206 se regularon significativamente a la baja en sueros tratados con PPMO de ratones mdx en comparación con controles mdx no tratados.
Ejemplo 4 - Viabilidad celular (series Pip7 y Pip8)
Los péptidos de las series Pip7 y Pip8 se probaron en un ensayo de viabilidad celular, como sigue. Se cultivaron células hepáticas Huh-7 a 37 °C bajo CO2 al 5 %/atmósfera de aire al 95 % en DMEM complementado con suero bovino fetal al 10 % y antibióticos de penicilina/estreptomicina. Las células se trataron con tripsina y se colocaron en placas a 1,5 * 104 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Después de la incubación durante la noche, las células se lavaron con PBS y se añadieron conjugados PMO-péptido en 50 pl de OptiMEM a los pocillos por triplicado. Después de 4 horas de incubación, los conjugados se eliminaron mediante el reemplazo del medio con 100 pl de DMEM/FBS al 10 % durante 20 h más de incubación. Se añadieron 20 pl de solución de ensayo de viabilidad celular MTS (Promega) a los pocillos que contenían 100 pl de DMEM y las placas se incubaron durante 1 a 2 horas antes de tomar las medidas de UV a 490 nm. El porcentaje de viabilidad celular se determinó normalizando la absorbencia media de las muestras por triplicado a la media de las muestras sin tratar.
Los resultados presentados (Figuras 57 y 58) son coherentes con una mayor viabilidad celular (es decir, menor toxicidad celular) de péptidos que contienen menos restos de arginina. Por ejemplo, los péptidos que tenían un total de 7 restos de arginina en los dominios 1 a 3 combinados presentaron una mayor viabilidad celular (menor toxicidad celular) que los péptidos que tenían 8 o 9 restos de arginina.
Ejemplo 5 - Ensayos in vitro: omisión de exón en miotubos de ratón mdx; Series Pip7, Pip8 y Pip9
Se prepararon e incubaron miotubos H2K de mdx con conjugados de péptido-PMO en ausencia de cualquier agente de transfección a concentraciones de 0,125, 0,25, 0,5, 1,0 y 2,0 pM mediante el procedimiento descrito previamente [Yin, H., y col., Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(7): págs. 1295-303.]. Los productos de la RT-PCR con cebadores internos del ARN total aislado se examinaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2 %. La cuantificación de los niveles del transcrito A23 se calculó utilizando densitometría.
Los resultados (Figuras 59 a 61) muestran que los conjugados de Pip7a, Pip7b, Pip7b2, Pip7c, Pip7c2, Pip8a, Pip8b, Pip8c, Pip8c2, Pip8d, Pip9b, Pip9b2, Pip9c, pip9c2, Pip9c3, pip9d y Pip9d2 con PMO dieron una elevada actividad de omisión de exón en células musculares mdx.
Referencias
1. Kurreck J.: Eur. J. Biochem. 2003, 270, 1628.
2. Eckstein F.: Expert Opin. Biol. Ther. 2007, 7, 1021.
3. Egholm M., Buchardt O., Nielsen P. E., Berg R. H.: J. Amer. Chem. Soc. 1992, 114, 1895.
4. Summerton J., Weller D.: Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 1997, 7, 187.
5. Lebleu B., Moulton H. M., Abes R., Ivanova G. D., Abes S., Stein D. A., Iversen P. L., Arzumanov A., Gait M. J.: Adv. Drug Delivery Rev. 2008, 60, 517.
6. Zatsepin T. S., Turner J. J., Oretskaya T. S., Gait M. J.: Curr. Pharm. Design 2005, 11, 3639.
7. Abes R., Arzumanov A., Moulton H. M., Abes S., Ivanova G. D., Iversen P. L., Gait M. J., Lebleu B.: Biochem. Soc. Trans. 2007, 35, 775.
8. Turner J. J., Arzumanov A., Ivanova G., Fabani M., Gait M. J.: Cell-Penetrating Peptides, 2a edición. (U. Langel Ed.) 2006, CRC Press, Boca Raton. 313.
9. Turner J. J., Jones S., Fabani M., Ivanova G., Arzumanov A., Gait M. J.: Blood, Cells, Molecules and Diseases 2007, 38, 1.
10. Kang S.-H., Cho M.-J., Kole R.: Biochemistry 1998, 37, 6235.
11. Bendifallah N., Rasmussen F. W., Zachar V., Ebbesen P., Nielsen P. E., Koppelhus U.: Bioconjugate Chem.
2006, 17, 750.
12. EI-Andaloussi S., Johansson H. J., Lundberg P., Langel U.: J. Gene Medicine 2006, 8, 1262.
13. EI-Andaloussi S., Johansson H. J., Holm T., Langel U.: Mol. Ther. 2007, 15, 1820.
14. Abes S., Williams D., Prevot P., Thierry A. R., Gait M. J., Lebleu B.: J. Controlled Release 2006, 110, 595. 15. Abes S., Moulton H. M., Turner J. J., Clair P., Richard J.-P., Iversen P. L., Gait M. J., Lebleu B.: Biochem. Soc. Trans. 2007, 35, 53.
16. Abes S., Moulton H. M., Clair P., Prevot P., Youngblood D. S., Wu R. P., Iversen P. L., Lebleu B.: J. Controlled Release 2006, 116, 304.
17. Turner J. J., Arzumanov A. A., Gait M. J.: Nucl. Acids Res. 2005, 33, 27.
18. Turner J. J., Ivanova G. D., Verbeure B., Williams D., Arzumanov A., Abes S., Lebleu B., Gait M. J.: Nucl. Acids Res. 2005, 33, 6837.
19. Abes S., Turner J. J., Ivanova G. D., Owen D., Williams D., Arzumanov A., Clair P., Gait M. J., Lebleu B.: Nucl. Acids Res. 2007, 35, 4495.
20. Fabani M., Gait M. J.: RNA 2008, 14, 336.
21. Moulton H. M., Nelson M. H., Hatlevig S. A., Reddy M. T., Iversen P. L.: Bioconjugate Chem. 2004, 15, 290.
22. Kichler A., Leborgne C., J. M., Danos O., Bechinger B.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100, 1564.
23. Yin H., Lu Q., Wood M.: Mol. Ther. 2008, 16, 38.
24. Fletcher S., Honeyman K., Fall A. M., Harding P. L., Johnsen R. D., Wilton S. D.: J Gene Med. 2006, 8, 207.
25. Soifer H. S., Rossi J. J., Saetrom P.: Mol. Ther. 2007, 15, 2070.
26. Jopling C. L., Yi M., Lancaster A. M., Lemon S. M., Sarnow P.: Science 2005, 309, 1577.
27. Krutzfeldt J., Rajewsky N., Braich R., Rajeev K. G., Tuschl T., Manoharan M., Stoffel M.: Nature 2005, 438, 685.
28. Esau C., Davis S., Murray S. F., Yu X. X., Pandey S. K., Pear M., Watts L., Booten S. L., Graham M., Mckay R., Subramanian A., Propp S., Lollo B. A., Freier S. M., Bennett C. F., Bhanot S., Monia B. P.: Cell Metabolism 2006, 3, 87.
29. Cossu, G. y Sampaolesi, M. (2007) Trends Mol. Medicine, 13520-526.
30. Aartsma-Rus, A. y van Ommen, G.-J. B. (2007) RNA, 13, 1609-1624.
31. Lu, Q. y col., (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 198-203.
33. Alter, J. y col., (2006) Nature Medicine, 12, 175-177.
34. van Deutekom, J. y col., (2007) New England J. Med. 357, 2677-2686.
35. Arechavala-Gomeza, V. y col., (2007) Human Gene Therapy, 18, 798-810.
36. Lebleu, B. y col., (2008) Adv. Drug Delivery Rev. 60, 517-529.
37. Fletcher, S. y col., (2007) Mol. Ther. 15, 1587-1592.
38. Madsen, E.C., Morcos, P.A., Mendelsohn, B.A. y Gitlin, J.D. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 3909-3914 39. Kole, R. Vacek, M. y Williams T. (2004) Oligonucleotides, 14, 65-74).
40. Scaffidi, P. y Mistelli, T. (2006) Science, 312, 1059-1063
41. Du, L. y col., (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 6007-6012
42. Yin, H. y col., (2008) Human Mol. Gen. 17, 3909-3918;
43. Wu. B. y col., (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 14814-14819
44. Jearawiriyapaisarn, N. y col., (2008) Mol. Ther. 16, 1624-1629
45. Moulton y col., 2004) Bioconjugate Chem. 15, 290-299.
46. Seabra, L. y Warenius, H. (2007) Eur. J. Cancer 43, 1483-1492.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un péptido, que tiene una estructura de secuencia primaria compuesta por al menos tres dominios, teniendo la disposición: [Dominio 1] aminoterminal -[Dominio 2] -[Dominio 3] carboxiterminal en la que:
(i) El dominio 1 comprende una secuencia elegida entre:
RXRZa [SEQ ID NO: 762]
en la que Z3 se selecciona de uno de:
RBRRXR [SEQ ID NO: 763]
RBRRX [SEQ ID NO: 764]
RBRX [SEQ ID NO: 765]
RBRXR [SEQ ID NO: 766]
BRX [SEQ ID NO: 767]
BX [SEQ ID NO: 768]
RBR [SEQ ID NO: 769]
RB [SEQ ID NO: 770] o
RBRR [SEQ ID NO: 771]
(ii) El dominio 2 comprende una secuencia que contiene al menos 3 de los aminoácidos Z1 , Z2 , F, L, I [SEQ ID NO: 798], en la que Z1 es Y o I y Z2 es Q o R, y en la que el dominio 2 no contiene una secuencia primaria contigua aminoterminal a carboxiterminal de ILFQY [SEQ ID NO: 799], ILFQ [SEQ ID NO: 800] o ILIQ [SEQ ID NO: 801], (iii) El dominio 3 comprende una secuencia elegida entre:
RXRBRXRB [SEQ ID NO: 772]
XRBRXRB [SEQ ID NO 773]
RXRRBRB [SEQ ID NO: 774]
BRXRB [SEQ ID NO 775]
XRRBRB [SEQ ID NO: 776]
RRBRB [SEQ ID NO: 777]
XRBRB [SEQ ID NO 778]
RBRXRB [SEQ ID NO 779]
RXRBRB [SEQ ID NO 780] o
BRBRB [SEQ ID NO 781]
en la que X = ácido aminohexanoico, B = p-alanina.
2. El péptido de la reivindicación 1, en el que el dominio 2 comprende una secuencia primaria contigua aminoterminal a carboxiterminal elegida entre YQFLI [SEQ ID NO: 802], IQFLI [SEQ ID NO: 803], YRFLI [SEQ ID NO: 804], YRFRLI [SEQ ID NO: 805], FQILY [SEQ ID NO: 806], QFLI [SEQ ID NO: 807], QFL [SEQ ID NO: 808] o ILFRY [SEQ ID NO: 811].
3. El péptido de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el dominio 1 comprende o consiste en una secuencia elegida entre:
RXRRBRRXR [SEQ ID NO: 782]
RXRRBRRX [SEQ ID NO: 783]
RXRRBRX [SEQ ID NO: 784]
RXRBRX [SEQ ID NO: 785]
RXRRBRXR [SEQ ID NO: 786]
RXRRBR [SEQ ID NO: 787]
RXRRB [SEQ ID NO: 788] o
RXRRBRR [SEQ ID NO: 789].
RXRBX [SEQ ID NO: 790]
4. El péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que el dominio 3 comprende o consiste en una secuencia elegida entre:
RXRBRXRB [SEQ ID NO: 772]
(continuación)
XRBRXRB [SEQ ID NO: 773]
RXRRBRB [SEQ ID NO: 774]
BRXRB [SEQ ID NO: 775]
XRRBRB [SEQ ID NO: 776]
RRBRB [SEQ ID NO: 777]
XRBRB [SEQ ID NO: 778]
RBRXRB [SEQ ID NO: 779]
RXRBRB [SEQ ID NO: 780] o
BRBRB [SEQ ID NO: 781].
5. El péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que:
a) el dominio 2 tiene 4 o 5 aminoácidos;
b) el dominio 2 contiene 0, 1,2 o 3 restos R;
c) el dominio 2 tiene al menos uno o dos restos R, el dominio 1 tiene 5 restos R o menos y el dominio 3 tiene 4 restos R o menos; o
d) uno o más restos R son D-arginina; o
e) uno o más restos R son L-arginina; o
f) los dominios 1 y 3 solo contienen restos R, X y B; o
g) el dominio 1 tiene cualquier combinación de 2 a 6 restos R, 1 a 3 restos X y 1 a 2 restos B y no tiene más de 10 restos de longitud y tiene 0, 1 o 2 restos que no son R, X o B; o
h) el dominio 3 tiene cualquier combinación de 2 a 5 restos R, 1 a 3 restos X y 1 a 3 restos B y no tiene más de 9 restos de longitud y tiene 0, 1 o 2 restos que no son R, X o B; o
i) el péptido tiene una longitud máxima de 30 restos, incluyendo aminoácidos naturales, restos X y B; o j) el dominio 1 tiene una longitud de 4 a 12 restos, el dominio 2 tiene una longitud de 3 a 9 restos y el dominio 3 tiene una longitud de 4 a 12 restos, en los que las longitudes incluyen aminoácidos naturales, restos X y B.
6. Un péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende, o consiste en, una secuencia elegida de una de las SEQ ID NO: 2 a 308 o 317 a 761 o una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con una de las SEQ ID NO: 2 a 308 o 317 a 761
7. Un péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende, o consiste en, la secuencia de los dominios 1 a 3 de uno de Pip-6a, Pip-6b, Pip-6e, Pip-6f (SEQ ID NO: 2, 3, 6 o 7) o una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de los dominios 1 a 3 de uno de Pip-6a, Pip-6b, Pip-6e, Pip-6f (SEQ ID NO: 2, 3, 6 o 7).
8. El péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el péptido comprende además un enlazador en el extremo C, eligiéndose el enlazador opcionalmente de BCys, XCys, Cys, GGCys, BBCys, BXCys, XBCys, BX o XB.
9. El péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el péptido se conjuga químicamente con una molécula de carga, en el que la conjugación está opcionalmente en el extremo C del péptido.
10. El péptido de la reivindicación 9, en el que la molécula de carga se elige entre un ácido nucleico, ácido nucleico peptídico (PNA), oligonucleótido de fosforodiamidato morfolino (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA), oligonucleótido antisentido, ARN de interferencia pequeño (ARNip), péptido, péptido cíclico, proteína o fármaco, en el que, opcionalmente, la molécula de carga tiene un peso molecular inferior a 5.000 Da.
11. El péptido de la reivindicación 10, en el que la molécula de carga es PNADMD [SEQ ID NO: 309] o PMODMD [SEQ ID NO: 310] o una molécula que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con uno de PNADMD [SEQ ID NO: 309] o PMODMD [SEQ ID NO: 310].
12. Una composición farmacéutica o medicamento que comprende un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y que opcionalmente comprende además un diluyente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. Un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad.
14. El péptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la enfermedad se elige entre distrofia muscular de Duchenne (DMD), enfermedad de Menkes, p-talasemia, demencia frontotemporal, parkinsonismo, atrofia muscular en la columna, distrofia miotónica, síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford, ataxia-telangiectasia mutada (ATM), cáncer, una afección cardíaca o una afección que se manifiesta en el corazón.
ES12756546T 2011-08-30 2012-08-29 Péptidos penetradores de células que tienen un dominio hidrófobo central Active ES2876939T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161528804P 2011-08-30 2011-08-30
GBGB1115014.1A GB201115014D0 (en) 2011-08-30 2011-08-30 Peptides
GBGB1211740.4A GB201211740D0 (en) 2012-07-03 2012-07-03 Peptides
PCT/GB2012/052116 WO2013030569A2 (en) 2011-08-30 2012-08-29 Peptides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2876939T3 true ES2876939T3 (es) 2021-11-15

Family

ID=47756980

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES12756546T Active ES2876939T3 (es) 2011-08-30 2012-08-29 Péptidos penetradores de células que tienen un dominio hidrófobo central

Country Status (10)

Country Link
US (1) US9302014B2 (es)
EP (1) EP2751128B1 (es)
JP (1) JP6077543B2 (es)
CN (1) CN103998458B (es)
AU (1) AU2012300633B2 (es)
BR (1) BR112014004902B1 (es)
CA (1) CA2846218C (es)
ES (1) ES2876939T3 (es)
IN (1) IN2014MN00357A (es)
WO (1) WO2013030569A2 (es)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201605698XA (en) 2014-01-13 2016-08-30 Berg Llc Enolase 1 (eno1) compositions and uses thereof
US20170197011A1 (en) * 2014-06-06 2017-07-13 Vivoscript, Inc. Methods for repairing cartilage damage
CN106397606B (zh) * 2015-01-28 2020-11-10 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种多肽复合物作为sst药物载体的应用、方法及其融合蛋白复合物
GB2545898B (en) * 2015-12-21 2019-10-09 Sutura Therapeutics Ltd Improved drug delivery by conjugating oligonucleotides to stitched/stapled peptides
EP3895722A1 (en) * 2016-01-06 2021-10-20 D. Travis Wilson Methods for the treatment of duchenne muscular dystrophy
BR112018072279A2 (pt) 2016-04-29 2019-02-12 Sarepta Therapeutics, Inc. análogos de oligonucleotídeo tendo como alvo lmna humana
PL3464336T3 (pl) 2016-06-01 2022-05-16 Athira Pharma, Inc. Związki
CN109757108A (zh) 2016-07-05 2019-05-14 比奥马林技术公司 具有治疗遗传疾病的改善特征的包含双环支架部分的前体mRNA剪接转换或调节寡核苷酸
US20200131231A1 (en) * 2017-02-17 2020-04-30 Oxford University Innovation Limited Cell penetrating peptides
GB201711809D0 (en) 2017-07-21 2017-09-06 Governors Of The Univ Of Alberta Antisense oligonucleotide
TW201919682A (zh) 2017-08-08 2019-06-01 西班牙商阿爾米雷爾有限公司 活化Ｎｒｆ２路徑的新穎化合物
US11339192B2 (en) 2017-10-04 2022-05-24 Ohio State Innovation Foundation Bicyclic peptidyl inhibitors
CN108070025B (zh) * 2017-10-24 2019-11-19 中山大学附属口腔医院 一种细胞穿透肽和细胞穿透肽复合物及二者的应用
EP3784248A4 (en) * 2018-04-26 2022-08-10 Sarepta Therapeutics, Inc. EXON-SKIPPING OLIGOMERS AND OLIGOMER CONJUGATE FOR MUSCLE DYSTROPHY
WO2019226651A1 (en) * 2018-05-22 2019-11-28 Children's Medical Center Corporation Nanoparticles for treatment of choroidal neovascularization and other indications
GB201812972D0 (en) * 2018-08-09 2018-09-26 Univ Oxford Innovation Ltd Cell-penetrating peptides
GB201812980D0 (en) * 2018-08-09 2018-09-26 Univ Oxford Innovation Ltd Cell-penetrating peptides
WO2020115494A1 (en) 2018-12-07 2020-06-11 Oxford University Innovation Limited Linkers
GB201911403D0 (en) * 2019-08-09 2019-09-25 Univ Oxford Innovation Ltd Conjugate and uses thereof
EP4370677A1 (en) 2021-07-16 2024-05-22 Academisch Ziekenhuis Leiden h.o.d.n. LUMC Oligonucleotide for inhibiting quaking activity
WO2023026994A1 (ja) 2021-08-21 2023-03-02 武田薬品工業株式会社 ヒトトランスフェリンレセプター結合ペプチド－薬物コンジュゲート
WO2023214373A2 (en) 2022-05-06 2023-11-09 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Oligonucleotide
GB202216207D0 (en) * 2022-11-01 2022-12-14 Univ Oxford Innovation Ltd Shortened cell-penetrating peptides

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ20011671A3 (cs) 1998-11-13 2001-10-17 Cyclacel Limited Peptidová nosná skupina pro transport
SE0201863D0 (en) 2002-06-18 2002-06-18 Cepep Ab Cell penetrating peptides
AU2008271050B2 (en) 2007-06-29 2014-11-06 Sarepta Therapeutics, Inc. Tissue specific peptide conjugates and methods
WO2009144481A2 (en) 2008-05-30 2009-12-03 Isis Innovation Limited Conjugates for delivery of biologically active compounds
EP2283029A1 (en) * 2008-06-04 2011-02-16 Medical Research Council Peptides
WO2011064552A1 (en) * 2009-11-30 2011-06-03 Isis Innovation Limited Conjugates for delivery of biologically active compounds

Also Published As

Publication number Publication date
EP2751128A2 (en) 2014-07-09
AU2012300633A8 (en) 2014-05-29
US20140342992A1 (en) 2014-11-20
US9302014B2 (en) 2016-04-05
IN2014MN00357A (es) 2015-06-19
AU2012300633A1 (en) 2014-03-06
WO2013030569A2 (en) 2013-03-07
CN103998458A (zh) 2014-08-20
CN103998458B (zh) 2018-10-09
WO2013030569A3 (en) 2013-06-13
JP6077543B2 (ja) 2017-02-08
CA2846218A1 (en) 2013-03-07
BR112014004902A2 (pt) 2017-07-04
JP2014526238A (ja) 2014-10-06
AU2012300633B2 (en) 2017-04-27
EP2751128B1 (en) 2021-03-03
BR112014004902B1 (pt) 2022-02-08
CA2846218C (en) 2020-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2876939T3 (es) Péptidos penetradores de células que tienen un dominio hidrófobo central
US8575305B2 (en) Cell penetrating peptides
US9840531B2 (en) Tetragalnac and peptide containing conjugates and methods for delivery of oligonucleotides
Shabanpoor et al. Identification of a peptide for systemic brain delivery of a morpholino oligonucleotide in mouse models of spinal muscular atrophy
ES2936464T3 (es) Métodos y medios para el salto eficaz de al menos el exón 52 del gen de distrofia muscular de Duchenne humana
ES2532634T3 (es) Procedimientos y medios para el salto eficiente del exón 45 en el pre-ARNm de la distrofia muscular de Duchenne
ES2361621T3 (es) Péptidos de lactoferrina útiles como péptidos de penetración celular.
US9610362B2 (en) Antisense conjugates for decreasing expression of DMPK
JP4974890B2 (ja) ペプチドが結合された、イノシン置換アンチセンスオリゴマー化合物および方法
AU2019203887A1 (en) Compositions and methods for selective delivery of oligonucleotide molecules to specific neuron types
ES2562463T3 (es) Administración no covalente, mediada por péptidos, de agentes activos a través de la barrera hematoencefálica
JP5635512B2 (ja) 遺伝子調節化合物の改良された送達のための化学的に修飾された細胞透過性ペプチド
McErlean et al. Rational design and characterisation of a linear cell penetrating peptide for non-viral gene delivery
ES2850726T3 (es) Péptidos de penetración celular para suministro intracelular de moléculas
US20210299263A1 (en) Cell-penetrating peptides
JP2022543320A (ja) 複合体及びその使用
ES2639838T3 (es) Péptidos inhibidores de la interacción entre ASF1 y las histonas, y sus usos
JP2022502347A (ja) 細胞透過性ペプチド
Song Design, synthesis and characterization of lipidated PNA-peptide conjugates as potential therapeutic and diagnostic reagents