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Description

本発明は、ペプチドに、特に、排他的にではないが、細胞透過性ペプチドに、ならびに細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子(cargo molecule)のコンジュゲートに関する。
必須のRNA配列を標的とするオリゴヌクレオチド(ON)は、細胞中の遺伝子発現の調節において、および可能性のある療法として、数多くの最近の適用を見出してきた1,2。RNアーゼHに誘導されるアンチセンスONおよびRISCに誘導されるsiRNA試薬を超える立体的遮断性(steric blocking)ONの機構的利点はより優れた特異性であり、これはONの不正確なRNAに対する結合は望まれない標的以外への(off−target)生物学的作用を誘発する可能性がより低いためである。第2に、宿主のRNA切断酵素による分子認識の必要がないため、はるかに広い範囲の合成ON類似体を用いることができる。
立体的遮断薬として有用なON類似体の中で主要なものは、ペプチド核酸(PNA)およびホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド(PMO)のような非荷電主鎖を有するON類似体である。PNAおよびPMO ONは両方とも療法の開発に向けたRNA標的化適用のためにインビボで用いられてきた。細胞培養において、PNAおよびPMOは両方ともかなり不十分にしか細胞に入らないことが観察されており、従って細胞送達を増進する方法を開発するために多くの努力が費やされてきた。特に有用なのは、PNAまたはPMOにコンジュゲートした際にそれらの観察されたペプチドとしての細胞移行(translocating)力を利用することができるという期待において、細胞透過性ペプチド(CPP)、例えばPenetratin、Tat(48−60)、Transportan、および(R−Ahx−R)(Ahx=アミノヘキサン酸)の結合であった6−9
立体的遮断性ONの活性を評価するための価値のあるアッセイは、HeLa pLuc705細胞の核における18マーの合成ON(705部位)による異常なサラセミアβグロブリンイントロンのスプライス修正およびそれに続くレポーターであるホタルルシフェラーゼの上方制御を含む、Koleおよび同僚らにより確立されたアッセイである10。このアッセイは、非常に低い活性レベルでさえも陽性発光の表示値(read−out)として測定され得るような、非常に高いダイナミックレンジを有する。705スプライス部位を標的としたCPP−PNAコンジュゲートがこのアッセイで試験され、いくつかの異なるCPPに関して、CPP−PNAコンジュゲートを添加される形質移入試薬の非存在下でHeLa pLuc705細胞と共にインキュベーションした際に中程度の活性レベルが報告されており、一方でPNA単独は不活性である11−13。我々の研究室において、我々は、Tat−PNAまたは(Lys)−PNAコンジュゲートはそのアッセイにおいて有意な活性を見るためにエンドソーム溶解剤である100μMクロロキンとの同時インキュベーションを必要とするが14,15、(R−Ahx−R)−PNAおよび(R−Ahx−R)−PMOコンストラクトに関するμM範囲での活性がクロロキンの非存在下で得られることを見出した7,16
我々は、6個のArg残基が既知のCPP PenetratinのN末端に付加されたCPPも報告している17,18。HIV−1のトランス活性化応答配列RNAに相補的なPNAにジスルフィドでコンジュゲートされたR−Penetratin(R6Pen)は、ルシフェラーゼ発現を阻害するために核送達およびTAR RNAへの結合を必要とするTat依存性トランス活性化の阻害のHeLa細胞ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて有意な活性を示した18
デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)は、主にジストロフィン遺伝子中のナンセンス変異またはフレームシフト変異により引き起こされるX連鎖性筋障害であり、約3500人の男性の出生中1人の頻度で起こり、可能性のある療法が大いに必要とされている29。DMDの患者は重篤な進行性の筋消耗を患い、一方でより軽度のベッカー型筋ジストロフィーは結果として短縮されているが部分的に機能するタンパク質の発現をもたらすインフレーム欠失により引き起こされる。配列特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド(ON)は、より短いジストロフィンの形態がベッカー型筋ジストロフィーの活性に類似した活性を有して産生されるように、標的化されたエキソンスキッピングを誘導して変異したジストロフィンのmRNAの読み枠を修正することが示されている30,31。細胞モデルにおいて、エキソン23においてナンセンス変異を含有するmdxジストロフィーマウスモデルにおいて31−33、そしてエキソンスキッピングのアプローチに顕著な有望性を示してきたイヌモデルにおいて、研究が実施されてきた。生物学的活性は、ONが筋細胞核中のジストロフィンのプレmRNAに結合して“立体的遮断”機序によりスプライシングパターンの変更を引き起こす結果として達成される。
DMDを有する患者はしばしば心筋の変性を患い、それは心筋症およびX連鎖性拡張型心筋症のような心疾患の形態をもたらす。従って、心筋において機能する、または部分的に機能するジストロフィンの向上した発現を可能にするCPPが必要とされている。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは現在デュシェンヌ型筋ジストロフィーに関する最も有望な療法的介入である。アンチセンスオリゴヌクレオチドはジストロフィンのプレmRNAのスプライシングを調節し、それによりジストロフィンの読み枠を特異的に修復し、切り詰められているが部分的に機能する(semi−functional)ジストロフィンタンパク質を生成する。このアプローチの開発における難題は、比較的乏しい全身へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達および心臓を含む冒された非骨格筋組織における非効率的なジストロフィンの修正である。
エキソンスキッピングの効率を決定する最も重要な要因の1つは、ONの化学的性質である。最も広く用いられてきたのは2’−O−メチルホスホロチオエート(2’OMePS)である。この主鎖は最初に筋肉内注射を含むDMD患者におけるジストロフィンプレmRNAのエキソン51を標的とする第I相臨床試験において試験された34。ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド(PMO)を用いて類似の第I相試験が実施された35。DMD患者における全身送達を含む第II相臨床試験が、2’OMePS(Goermans N.M. et al (2011) New England J. Med., 364, 1513-1522)およびPMO化学(Cirak, S. et al (2011) The Lancet, doi:10.1016/S0140-6736(11)60756-3)の両方に関して最近完了している。マウスにおける研究は、2’OMePSと比較してPMOを用いたエキソンスキッピングおよびジストロフィン発現の修復のより高いレベルを示唆してきた35。PMOは非イオン性分子であり、標的細胞の細胞内分子と望まれない相互作用を形成する可能性がより低いと考えられている。
YinおよびWoodは、ペプチド核酸(PNA)と呼ばれる別の非イオン性類似体をmdxマウス中への筋肉内注射により調べ、エキソンスキッピングおよびジストロフィン産生の有意な誘導を見出している23。PMOおよびPNAは両方とも、医薬開発に関する重要な可能性を有する、高い配列特異性を有する非毒性のON類似体であると考えられている。エキソンスキッピングPMOは、マウスにおいて960mg/kgの投与量まで(Sazani, P. et al (2011) Int, J. Toxocol, 30, 322-333)、そしてサルにおいて320mg/kgの投与量まで(Sazani, P. et al (2011) Int. J. Toxicol, 30, 313-321)十分に耐容されることが示されている。
いくつかの研究グループが、非イオン性ON(例えばPNAまたはPMO)にコンジュゲートした際にそれらの細胞中への送達を助け(るがイオン性のタイプは助けず)、従ってそのONの生物学的活性を高めるCPP(時々膜移行ペプチドとも呼ばれる)の設計に取り組んできた。PMOの場合、PMOにコンジュゲートした際に結果としていくつかの細胞およびインビボモデルにおいてより高いレベルの立体的遮断活性をもたらす、天然および非天然アミノ酸の両方を含有するペプチド(R−Ahx−R)−Ahx−Bが開示されている36。これはマウスmdxDMDの研究において調べられている37
インビボでの適用に有用であるために、CPPは、例えばKoleらのスプライス修正ルシフェラーゼアッセイにより測定した際にEC50が約0.90μM以下である有効なスプライス修正を可能にするために、特にPNAまたはPMOのようなカーゴに結合させた際に、細胞および核膜の有効な透過を示すことが好ましい。さらに、そのCPPは細胞透過の前の分解に耐えるために優れた血清中安定性を有するべきである。また、療法的適用のために、CPPは低い毒性を有するべきである。
我々は以前に、20マーの塩基配列GGCCAAACCTCGGCTTACCT[SEQ ID NO:309]を有するPNAカーゴ(PNADMDと呼ばれる)または25マーの塩基配列GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT[SEQ ID NO:310]を有するPMOカーゴ(PMODMDと呼ばれる)のどちらかへのコンジュゲーションのための一連のCPPを作成した。PNADMDおよびPMODMDは両方とも、mdx筋細胞(インビトロ)における、およびmdxマウス(インビボ)におけるエキソンスキッピングに適したオリゴヌクレオチド類似体として一般的に用いられている。Pip 5e−PMODMDは、心筋におけるジストロフィン産生の誘導を含め、分化したマウスH2K筋細胞における、およびDMDのmdxマウスモデルにおけるエキソンスキッピングおよびジストロフィン発現の修復を示した。Pip 5eは配列:RXRRBRRXRILFQYRXRBRXRBC[SEQ ID NO:1]を有し、国際公開第2009/147368号において、およびYin et al (Molecular Therapy Vol.19, No.7 1295-1303, July 2011)において開示されている。Pip 5eペプチドの配列は、3個のドメイン:2個のアルギニンに富むドメイン(RXRRBRRXRおよびRXRBRXRB)および中央の疎水性コア(ILFQY)に分解することができる。Pip−5eはPMODMDの心筋中への送達において優れた活性を有することが分かった。
Wu et al (Nucleic Acids Research, 2007, Vol. 35, No.15 5182-5191)は、オリゴR配列中にXまたはB残基が挿入されているCPP−PMOF(Fは3’カルボキシフルオレセインタグを表す)コンジュゲートはスプライス修正活性および細胞取り込みを増大させ、血清結合を助けるが、そのコンジュゲートはRおよびRコンジュゲートほど効率的に細胞に入らないことを報告した。彼らは、X残基の数が核のアンチセンス活性およびコンジュゲートの毒性の両方に影響を及ぼし、5より大きい個数のX残基のペプチドは細胞株において60μMで時間および濃度依存性の毒性を示すことも報告した。彼らは、毒性を低減するためにX残基の数を5未満に保つことを提案している。彼らは、(RX)または(RB)中のRXまたはRBリピートの数を低減することは細胞取り込みを低減し、かつ(HeLa細胞アッセイにおける)スプライス修正能力を低減することも報告した。
Abes et al (Nucleic Acids Research, 2008, 36, 6353-6354)は、(RXR)−PMO構造を有するCPP分子を論じ、試験したいくつかのスペーサー(X)分子の内で線状のC(Abu)、C(Ahx)、またはC(Acy)スペーサーが最も有効であることを報告している。
Saleh et al (Bioconjugate Chem. Vol. 21 , No.10 1902-1911 (2010))は、PNAを有するコンジュゲートに関する線状(RXR)配列中のアルギニン残基の数を12および16まで増やすことはHeLa細胞アッセイにおけるスプライス修正能力を増大させるが、細胞毒性も増大させることを報告した。鎖の分枝(2または4分枝)は結果として向上した活性をもたらさなかった。2鎖分枝および一部の4鎖分枝は12および16アルギニンコンストラクトに関して許容されたが、8アルギニンコンストラクトに関しては許容されなかった。
従って、スペーサー残基、例えばXの数を増やすことは、オリゴRペプチドと比較して毒性を増大させ、細胞侵入の効率を低減するようであるが、スプライス修正活性を増大させる可能性もある。一方で、大きい数のR残基は増大した細胞侵入効率をもたらすようであるが、望ましくない増大した毒性ももたらすようである。従って、優れた細胞侵入効率および低い毒性の釣り合いを提供するCPPが必要とされている。加えて、CPPに関して、インビボで好都合な特性、例えばマウスモデル、mdxにおける、心筋を含む全ての筋タイプにおける高いエキソンスキッピングおよびジストロフィン産生の方向付けを示すことが望ましい。
国際公開第2009/147368号
Goermans N.M. et al (2011) New England J. Med., 364, 1513-1522 Cirak, S. et al (2011) The Lancet, doi:10.1016/S0140-6736(11)60756-3 Sazani, P. et al (2011) Int, J. Toxocol, 30, 322-333 Sazani, P. et al (2011) Int. J. Toxicol, 30, 313-321 Yin et al (Molecular Therapy Vol.19, No.7 1295-1303, July 2011) Wu et al (Nucleic Acids Research, 2007, Vol. 35, No.15 5182-5191) Abes et al (Nucleic Acids Research, 2008, 36, 6353-6354) Saleh et al (Bioconjugate Chem. Vol. 21 , No.10 1902-1911 (2010))
本発明者らは、ここでCPPの新規の系列を作成し、コンジュゲートしたカーゴ分子の細胞侵入を促進するそれらの能力およびそのCPPの細胞毒性を評価した。
意外にも、本発明者らは、疎水性コアドメインの線状N〜C末端配列(すなわち一次配列)は細胞透過活性に本質的ではないこと、および(それらの一次配列ではなく)コアのアミノ酸の存在が重要な要因であることを確認した。従って、彼らは、構造−活性関係は疎水性コア中の特定の線状のアミノ酸の配列順序により提供される構造に依存するのではなく、疎水性コア中の特定のアミノ酸の存在に依存することを理解している。これは、本発明者らが本明細書で記述される細胞透過性ペプチドの新規の系列を設計することを可能にした。
従って、本発明者らは有望な細胞透過性ペプチドの新規の系列を同定した。そのペプチドは、細胞および核膜を越えるカーゴの移動を促進するための、そして場合によりカーゴを特定の器官のタイプ(例えば心臓)に送達するためのキャリヤー部分として作用することができる。ペプチド−カーゴコンジュゲートも提供される。
4つの新規のペプチド系列が調製され、ペプチド−PMOカーゴコンジュゲートとして試験された。そのペプチドおよび結合したカーゴを図18および41において示し、下記で要約する:
Pip−6a、Pip−6b、Pip−6c、Pip−6d、Pip−6e、Pip−6f、Pip−6g、Pip−6h、Pip−6i[SEQ ID NO:2〜10];
Pip−7a、Pip−7b、Pip−7c、Pip−7d、Pip−7b2、Pip−7c2[SEQ ID NO:11〜16];
Pip−8a、Pip−8b、Pip−8c、Pip−8c2、Pip−8d、Pip−8d2、Pip−8d3[SEQ ID NO:17〜20および317〜319];または
Pip−9b、Pip−9b2、Pip−9c、Pip−9c2、Pip−9c3、Pip−9d、Pip−9d2、Pip−9d3、Pip−9d4[SEQ ID No 320〜328]。
PMODMDにコンジュゲートされたPip−6a[SEQ ID NO:2]、Pip−6b[SEQ ID NO:3]、Pip−6c[SEQ ID NO:4]、Pip−6d[SEQ ID NO:5]、Pip−6e[SEQ ID NO:6]、Pip−6f[SEQ ID NO:7]、Pip−6g[SEQ ID NO:8]、Pip−6h[SEQ ID NO:9]およびPip−6i[SEQ ID NO:10]は全てインビトロでmdxマウス細胞において高レベルのエキソンスキッピングを示す。Pip−6a、Pip−6bおよびPip−6fはmdxマウス(すなわちインビボ)で心筋においてPip−5eに匹敵するエキソンスキッピングおよびジストロフィン(dystophin)産生を維持していた。Pip−8b、Pip−8c、Pip−9b、Pip−9b2、およびPip−9cはまた、前脛骨筋(TA)、横隔膜、四頭筋および心臓において、明らかな毒性を伴わずに効率的なジストロフィン産生を示している。
従って、試験したCPP−PMOコンジュゲートの細胞透過性ペプチド構成要素ならびに実質的に類似の配列同一性および構造を有するペプチドは、PNA、PMOを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、ペプチドおよびタンパク質、ならびに小分子のようなカーゴの細胞および核への透過の促進において有用であることが予想される。
従って、本発明は、そのようなカーゴの細胞膜、例えば哺乳類細胞の形質膜および/または哺乳類細胞の核膜を越える取り込みの促進において有用であるペプチドを提供する。そのペプチドは“細胞透過性ペプチド”と呼ぶことができ、膜を越えるカーゴの輸送を促進するためにカーゴにコンジュゲートすることができる。
本発明のペプチドは、化学的に連続した単一の分子である配列を有する。そのペプチド配列は、アミノ酸および任意の非アミノ酸、例えばアミノヘキサン酸スペーサー残基で構成されていてよい。例えば、そのペプチドの一部の部分において、アミノヘキサン酸スペーサーが第1アミノ酸のC末端に、および第2アミノ酸のN末端に化学結合し、それによりその2個のアミノ酸を化学的に連結していてよい。この明細書において、アミノ酸は1個の“残基”として数えられ、スペーサー分子または非天然アミノ酸も1個の“残基”として数えられる。
そのペプチドには、修飾されたアミノ酸および非天然存在アミノ酸が含まれてよい。好ましくは、あらゆるスペーサー残基および修飾されたアミノ酸または非アミノ酸は、共有結合性ペプチド(アミド)結合[−C(=O)NH−]により隣接する残基に連結されている。
それぞれのペプチドは、以下の線状配列中の3個のドメインを含む、またはそれで構成される。
N末端 [ドメイン1]−[ドメイン2]−[ドメイン3] C末端
それぞれのドメインは共通の配列特徴を有するが、それぞれのドメインの正確な配列は変更および修正することができる。従って、ある範囲の配列がそれぞれのドメインに関して可能である。それぞれの可能なドメイン配列の組み合わせがある範囲のペプチド配列をもたらし、それが本発明の一部を形成する。
コアペプチド配列は、ドメイン1〜3の連続したアミノ酸(および任意のスペーサー)配列により表される。カーゴへの連結を可能にするために配置される任意のリンカー配列が、典型的にはドメイン3のC末端に存在することができる。
以下の記述において、標準的な一文字アミノ酸コードが用いられる。非天然アミノ酸およびスペーサー分子は以下の1文字コードを用いて言及される:
X=アミノヘキサン酸、アミノ酪酸、アミノカプリル酸、β−アラニル、p−アミノベンゾイル、イソニペコチル(isonipecotyl)、または4−アミノブチリルのいずれか、
B=ベータアラニン
R=アルギニン
ドメイン1はアルギニンに富む配列であり、4、5、6、7、8、9、10、11、12、またはより多くのアミノ酸長であってよい。好ましくは、ドメイン1は5、6、7、8、または9残基(例えばX、BまたはR)を有する。
好ましくは、ドメイン1は2個以上の陽イオン性アミノ酸を有し、疎水性アミノ酸またはスペーサー基がその陽イオン性アミノ酸の一部を隔てている。好ましい態様において、その陽イオン性アミノ酸はアルギニン(R)である。好ましくは、ドメイン1は少なくとも2個のアルギニン残基を有し、好ましくは2、3、4、5、または6個のアルギニン残基の1つを有する。一部の態様において、ドメイン1は3、4、5、6個、またはより多くのアルギニン残基を含有する。
ドメイン1は好ましくは15残基未満、より好ましくは13残基未満の最大長および4残基の最小長(例えばX、BまたはR)を有する。
好ましいドメイン1の配列は次の群から選択される:
RXRRBRRXR [SEQ ID NO:782]
RXRRBRRX [SEQ ID NO:783]
RXRRBRX [SEQ ID NO:784]
RXRBRX [SEQ ID NO:785]
RXRBX [SEQ ID NO:790]
RXRRBRXR [SEQ ID NO:786]
RXRRBR [SEQ ID NO:787]
RXRRB [SEQ ID NO:788]、または
RXRRBRR [SEQ ID NO:789]。
ドメイン2はコアアミノ酸配列を含有する。これはアミノ酸ZFLIの少なくとも3個を含有する配列を含み、ここでZはYまたはIであり、ZはQまたはRである。アミノ酸ZFLIはあらゆる順序であってよい。ドメイン2の一次配列(すなわちN末端からC末端までの順序)は細胞透過活性に本質的ではないことは、本発明者らの発見である。一部の特に好ましい態様において、ドメイン2はILFQY、ILFQまたはILIQのN〜C末端の連続した一次配列を含有しないが、それはこれらのアミノ酸を異なるN〜C末端の連続した一次配列順序で含有してよい。
ドメイン2は、1、2、3、4または5個の追加のアミノ酸をその配列のNまたはC末端の一方または両方において含有してよい。好ましくは、N末端に0、1または2個のアミノ酸が存在し、C末端に0、1または2個のアミノ酸が存在する。従って、ドメイン2は3、4、5、6、7、8、9または10アミノ酸長であってよい。ドメイン2は好ましくは疎水性ドメインである。
ドメイン2は好ましくは10残基未満、より好ましくは7残基未満の最大長および3残基、より好ましくは4または5残基の最小長を有する(それぞれの長さにはスペーサー基、例えばX、および非天然アミノ酸が含まれる)。好ましい態様において、ドメイン2は(スペーサー基、例えばX、および非天然アミノ酸を含めて)3、4、5、または6残基を有する。その追加のアミノ酸はあらゆるタイプのアミノ酸であってよい。
ドメイン3は陽イオン性ドメインであり、好ましくは以下の配列から選択される配列を有する:
RXRBRXRB [SEQ ID NO:772]
XRBRXRB [SEQ ID NO:773]
RXRRBRB [SEQ ID NO:774]
BRXRB [SEQ ID NO:775]
XRRBRB [SEQ ID NO:776]
RRBRB [SEQ ID NO:777]
XRBRB [SEQ ID NO:778]
RBRXRB [SEQ ID NO:779]
RXRBRB [SEQ ID NO:780]、または
BRBRB [SEQ ID NO:781]。
好ましくは、ドメイン3は2個以上の陽イオン性アミノ酸を有し、疎水性アミノ酸またはスペーサー基がその陽イオン性アミノ酸の一部を隔てている。好ましい態様において、その陽イオン性アミノ酸はアルギニン(R)である。好ましくは、ドメイン3は少なくとも2、3、または4個のアルギニン残基を有する。一部の態様において、ドメイン3は1、2、3、4、5、6個、またはより多くのアルギニン残基を含有する。
一部の態様において、ドメイン3は(スペーサー基、例えばX、および非天然アミノ酸を含めて)3アミノ酸の最小長および15残基の最大長を有する。一部の態様において、そのスペーサー基を含む最小長は4以上であり、そのスペーサー基を含む最大長は12以下である。一部の態様において、ドメイン3は3、4、5、6、7、8、9、10、11または12残基の1つの長さを有する。
ドメイン1、2および3を合わせた中のアルギニン残基の総数は残基の総数の30〜60%であってよく、30%、35%、40%、45%、50%、55%または60%の1つであってよい。一部の態様において、ドメイン1、2および3を合わせた中のアルギニン残基の総数は残基の総数の30〜50%の範囲であってよく、または30%〜45%、もしくは30%〜40%、もしくは35%〜45%の範囲であってよい。
ドメイン1および3におけるアミノヘキサン酸およびベータアラニンの使用は、それがそのペプチドの免疫原性を最小限にし、タンパク質分解に対する耐性を増大させる点で好都合である。
そのペプチドのカーゴに対する化学結合を可能にするためにリンカーが配置されてよい。そのリンカーは、そのペプチドのドメイン1〜3部分をカーゴから隔てるためのスペーサーの役目も果たすことができる。ジスルフィド、チオエーテルまたはチオール−マレイミド結合の形成を可能にするC末端システイン残基を有する配列を含め、ある範囲のリンカー配列が可能である。そのペプチドをカーゴに連結する他の方法には、オキシムを形成するためのC末端アルデヒドの使用、クリック反応の使用、またはその後にXもしくはBもしくはXBもしくはBXを含むドメイン3の前のスペーサー配列が続くことができるそのペプチド上の塩基性アミノ酸とのモルホリノ結合の形成が含まれる。
そのリンカー配列は(スペーサー基を含めて)1、2、3、4、5またはより多くのアミノ酸および/または残基長であってよい。そのリンカー配列は以下の基から選択されてよい:BCys、XCys、Cys、GGCys、BBCys、BXCys、XBCys、X、XX、B、BB、BXまたはXB。あらゆるBまたはXは別のスペーサーにより置き換えられてよく、それは例えば4−アミノブチリル(Aib)およびイソニコペコチル(isonicopecotyl)から選択されてよい。
そのリンカー配列は、そのペプチドを結合させる予定のカーゴの一部を形成していてよい。一部の態様において、そのカーゴの結合は直接ドメイン3配列のC末端に対してである。従って、一部の態様において、リンカー配列は必要ではなく、またはそれはカーゴおよびドメイン3配列の連結により提供される。
上記のことに従って、本発明のペプチドは以下のように表すことができ:
YQFLIZ [SEQ ID NO:791]
IQFLI,Z [SEQ ID NO:792]
YRFLIZ [SEQ ID NO:793]
YRFRLIZ [SEQ ID NO:794]
FQILYZ [SEQ ID NO:795]
QFLIZ [SEQ ID NO:796]
QFLZ [SEQ ID NO:797]
ここで、Zは以下の1つから選択され:
RXRRBRRXR [SEQ ID NO:782]
RXRRBRRX [SEQ ID NO:783]
RXRRBRX [SEQ ID NO:784]
RXRBRX [SEQ ID NO:785]
RXRRBRXR [SEQ ID NO:786]
RXRRBR [SEQ ID NO:787]
RXRRB [SEQ ID NO:788]、または
RXRRBRR [SEQ ID NO:789]
かつZは以下の1つから選択され:
RXRBRXRB [SEQ ID NO:772]
XRBRXRB [SEQ ID NO:773]
RXRRBRB [SEQ ID NO:774]
BRXRB [SEQ ID NO:775]
XRRBRB [SEQ ID NO:776]
RRBRB [SEQ ID NO:777]
XRBRB [SEQ ID NO:778]
RBRXRB [SEQ ID NO:779]
RXRBRB [SEQ ID NO:780]、または
BRBRB [SEQ ID NO:781]
ここでZは場合によりそのC末端においてリンカーを含んでいてよく、それはBCys、XCys、Cys、GGCys、BBCys、BXCysまたはXBCys、X、XX、B、BB、BXまたはXBの1つであってよい。
好ましいペプチドはSEQ ID NO 2〜308または317〜761(図18、図23〜30および図41)の1つから選択される配列を含んでいてよく、またはそれで構成されていてよい。
本発明のペプチドは、SEQ ID NO:2、3、6、または7のいずれか1つから選択されてよい。
カーゴ分子を除いて、本発明のペプチドは40残基、より好ましくは30残基、そしてさらにもっと好ましくは15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30残基の1つの最大長、および10残基、より好ましくは10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20残基の1つの最小長を有していてよい(その最大および最小長には、あらゆるスペーサー分子、例えばX、および非天然アミノ酸または修飾されたアミノ酸が含まれる)。
本発明のペプチドはペプチド−カーゴコンジュゲートとして提供されてよく、ここでそのペプチドはさらにそのペプチドにそのペプチドのN末端またはC末端のどちらかにおいて、好ましくはC末端において化学結合した(好ましくは共有結合した)カーゴ分子を含む。化学結合はジスルフィド結合、チオエーテルもしくはチオール−マレイミド結合によるものであってよく、またはC末端カルボン酸を通したアミド結合によるものであってよい。
そのカーゴ分子は、あらゆる小分子、例えば小分子薬物、ペプチド、環状ペプチド、タンパク質、医薬または療法薬(例えば分子量10,000Da未満、好ましくは5,000Da未満または3000Da未満、そして一部の場合において1000Da未満)であってよい。そのカーゴ分子は、核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド(例えばPNA、PMO、LNA)、またはsiRNAであってよい。好ましいカーゴ分子は電気的に中性のオリゴヌクレオチド類似体、例えばPNAまたはPMOである。
1態様において、そのカーゴはPNA705(CCTCTTACCTCAGTTACA[SEQ ID NO:316])である。別の態様において、そのカーゴはPNADMD(SEQ ID NO:309)である。別の態様において、そのカーゴはPMODMD(SEQ ID NO:310)である。そのカーゴ分子はPNADMD(SEQ ID NO:309)またはPMODMD(SEQ ID NO:310)の一方に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有していてよい。水溶性を向上させるために、リシン残基がこれらのPNAまたはPMO分子の一方または両方の末端に付加されてよい。ジスルフィド結合の形成またはチオエーテルコンジュゲーションもしくはチオール−マレイミドコンジュゲーションのためのブロモアセチル化を可能にするために、システインがC末端またはN末端に付加されてよい。
本発明のペプチドは、カーゴ分子を有する、または有しない、単離または精製された形態で提供されてよい。
そのペプチドの誘導体も本発明の一部を形成する。ペプチド誘導体には、完全長ペプチドに対して実質的なアミノ酸配列同一性(例えば90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%)を有し、好ましくは同じまたはより優れたエキソンスキッピング活性または細胞生存度を有する、所与のペプチド配列(例えばSEQ ID NO:2〜308の1つ)の変異体が含まれる。ペプチド誘導体は、SEQ ID NO:2〜308の1つより1、2または3個多い、または少ないアミノ酸またはスペーサー分子を有していてよい。
配列同一性百分率(%)は、配列を整列させて必要であればギャップを導入して最大配列同一性を達成した後の、(SEQ ID NOにより言及される)所与の列挙された配列中の残基と同一である候補配列中の残基(スペーサー基を含む)の百分率として定義され、保存的置換は配列同一性の一部としては一切考えない。配列同一性は好ましくはそれぞれの配列の全長にわたって計算される。
アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当業者に既知の様々な方法で、例えばClustalW 1.82. T−coffeeまたはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアのような公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを用いて達成することができる。そのようなソフトウェアを用いる際、好ましくは、例えばギャップペナルティーおよび伸張ペナルティーに関して初期設定のパラメーターが用いられる。ClustalW 1.82の初期設定のパラメーターは以下の通りである:
タンパク質ギャップオープンペナルティー=10.0、タンパク質ギャップ伸張ペナルティー=0.2、タンパク質マトリックス=Gonnet、タンパク質/DNA ENDGAP=−1、タンパク質/DNA GAPDIST=4。
ペプチド誘導体は、例えば以下の群内のアミノ酸の間であることができる保存的アミノ酸置換も含んでいてよい:
(i)グリシン、アラニン、セリン、スレオニン;
(ii)グルタミン酸およびアスパラギン酸;
(iii)アルギニン、ヒスチジンおよびリシン;
(iv)アスパラギンおよびグルタミン;
(v)イソロイシン、ロイシンおよびバリン;
(vi)フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。
本発明のペプチドは、好ましくはPMODMDにコンジュゲートした場合に分化したマウスH2K筋細胞におけるエキソンスキッピング(Yin et al (Molecular Therapy Vol.19, No.7 1295-1303, July 2011)において高い活性を示す。好ましくは、このアッセイにおいて確立されるEC50は2μM未満である。一部の態様において、このアッセイにおいて確立されるEC50は1μM未満、0.9μM未満、0.8μM未満、0.7μM未満、または0.6μM未満である。本発明のペプチドは、好ましくはエキソンスキッピング細胞アッセイにおいてPip−5eまたは(RXRRBR)XB[SEQ ID NO:311]の一方より高い、または同じ活性を示す(すなわち、それらはより低い、または同じEC50を有する)。
本発明のペプチドは好ましくは、血清(例えばマウスまたはヒト血清)中で2時間後にR6Penと比較して増大した血清安定性および好ましくはPip−5eまたは(RXRRBR)XB[SEQ ID NO:311]と比較して同等の(または場合によりより優れた)血清安定性を示す。血清安定性は、Pip−PMOの分割量(aliquot)(10ナノモル)を100%マウス血清(100μL)に添加し、37℃で120または240分間インキュベーションすることにより測定することができる。それぞれの反応物を1Mグアニジニウム−HCl溶液(300μL)および氷冷したアセトニトリル(600μL)で希釈する。試料を混合し、−20℃に保ち、沈殿した血清タンパク質を遠心分離(13000rpm、5分間)により分離する。遠心分離後、上清を集め、凍結乾燥し、残留物を、MALDI−TOF質量分析による、および逆相HPLCによるペプチド分解に関する分析のために水中で溶解させる。HPLC条件は以下の通りである:カラム、C18逆相(250×4.6mm);溶媒A、0.1%TFA、溶媒B、90%アセトニトリル、10%溶媒A;勾配、25分間における10%〜50%溶媒B。
本発明のペプチドおよびペプチドコンジュゲートにおいて、アミノ酸、アミノ酸スペーサーおよびカーゴ分子は全て好ましくは共有結合により化学的に連結されている。
本発明のペプチドおよびペプチド−カーゴコンジュゲートは、医学的処置の方法における使用のために提供されてよい。その医学的処置は、好ましくはそのカーゴ分子の細胞および場合によりその細胞の核中への送達を必要とし得る。
従って、疾患の処置における使用のためのペプチドおよび/またはペプチド−カーゴコンジュゲートが提供される。疾患の処置のための薬剤の製造におけるペプチドおよび/またはペプチド−カーゴコンジュゲートの使用も提供される。療法上有効量のペプチドおよび/またはペプチド−カーゴコンジュゲートを患者または対象に投与する工程を含む、疾患状態に関する処置を必要とする患者または対象の処置の方法も提供される。好ましくは、ペプチド−カーゴコンジュゲートのカーゴ構成要素はその疾患を処置、予防または改善することができる有効薬剤(例えば医薬品)を含む。
処置されるべき疾患には、医薬的または療法的分子による細胞および/または核膜の向上した透過が向上した療法的作用をもたらし得るあらゆる疾患が含まれ得る。処置されるべき疾患には、(完全にまたは部分的に)スプライシングの欠陥により引き起こされる疾患状態、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、ベッカー型筋ジストロフィー、ならびに他の筋疾患、例えば肢帯型筋ジストロフィー症(LGMD)、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー(oculpharyngeal muscular dystrophy)(OMD)、遠位型筋ジストロフィーおよびエメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー(EDMD)、ならびにメンケス病38、β−サラセミア39、前頭側頭型認知症を軽減するためのタウタンパク質のスプライス修正、パーキンソン症候群および脊髄性筋萎縮症39、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群40、血管拡張性失調症変異(ATM)41、脊髄性筋萎縮症、筋緊張性ジストロフィー1型、または癌が含まれ得る。これらの疾患の一部の病理発生に関わっていることが示された遺伝子には、ジストロフィン(デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよびベッカー型筋ジストロフィー)、DMPK(DM1型MD)、ZNF9(DM2型MD)、PABPN1(OMD)、エメリン、ラミンAまたはラミンC(EDMD)、ミオチリン(myotilin)(LGMD−1A)、ラミンA/C(LGMD−1B)、カベオリン−3(LGMD−1C)、カルパイン−3(LGMD−2A)、ジスフェリン(LGMD−2Bおよび三好ミオパシー)、ガンマ−サルコグリカン(LGMD−2C)、アルファ−サルコグリカン(LGMD−2D)、ベータ−サルコグリカン(LGMD−2E)、デルタ−サルコグリカン(LGMD−2FおよびCMD1L)、テレソニン(telethonin)(LGMD−2G)、TRIM32(LGMD−2H)、フクチン関連タンパク質(LGMD−2I)、タイチン(LGMD−2J)、およびO−マンノシルトランスフェラーゼ−1(LGMD−2K)が含まれる。
そのようなスプライシング欠陥が関わっている疾患の場合、そのカーゴはそのスプライシング欠陥を防ぐ、もしくは修正する、および/または正しくスプライシングされたmRNA分子の産生(例えば数)を増大させることができるオリゴヌクレオチド、PNA、PMOまたはLNAが含まれる他のオリゴヌクレオチドタイプを含んでいてよい。本発明は、当然、スプライシング欠陥を修正することができるカーゴ分子に限定されない。カーゴ分子には、他のオリゴヌクレオチド、PNA、PMOまたはLNA分子、例えば遺伝子発現のノックダウンのためのmRNAまたはマイクロRNAを標的とすることができるオリゴヌクレオチド分子、例えばsiRNAまたはshRNA、ならびに非オリゴヌクレオチド分子も含まれてよい。
PMODMDにコンジュゲートされた本発明のペプチドは、心筋におけるジストロフィンを含有する線維の産生をもたらすエキソンスキッピングにおける素晴らしい有効性を示してきた。心不全はDMDを患う患者における主な死因であるため、本発明のペプチドは、心組織、特に心筋における正常なジストロフィンの産生をもたらすエキソンスキッピングを誘導することができるオリゴヌクレオチド(例えばPNAまたはPMO)へのコンジュゲーションにより、DMDの処置において特に有用である。これは、骨格筋においてのみジストロフィンを修復する第II相臨床試験(2’OMeおよびPMO)の成功を考慮すれば、特に重要である。これは心臓への作業負荷を増大させ、それにより心疾患を進行させる/心疾患の進行を加速する可能性がある懸念がある。ペプチド−PMODMDコンジュゲートはDMDの処置において特に有用であると考えられている。
従って、本発明のペプチドは、カーゴ分子の心組織、特に心筋への送達に特に有用である。従って、本発明のペプチド−カーゴコンジュゲートは、心臓もしくは心筋の疾患もしくは病気、または心臓もしくは心筋において徴候を示す(manifest)疾患もしくは病気、例えば心疾患および心筋症の処置における使用のために提供される。
処置されるべき心筋疾患は、冠動脈心疾患、先天性心疾患、虚血性、高血圧性、炎症性または内因性心筋症であってよい。内因性心筋症には以下の障害(関係する遺伝子と共に)が含まれる:拡張型心筋症(ジストロフィン、G4.5、アクチン、デスミン、デルタ−サルコグリカン、トロポニンT、ベータ−ミオシン重鎖、アルファー−トロポミオシン、ミトコンドリア呼吸鎖)、伝導系疾患を伴う拡張型心筋症(ラミンA/C)、肥大型心筋症(ベータ−ミオシン重鎖、トロポニンT、トロポニンI、アルファー−トロポミオシン、ミオシン結合タンパク質C、ミオシン必須軽鎖、ミオシン制御軽鎖、タイチン)、ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群を伴う肥大型心筋症(AMPK、ミトコンドリア呼吸鎖)、および左心室非圧縮(G4.5、アルファ−ジストロブレビン)。
処置されるべき患者または対象はあらゆる動物またはヒトであってよい。その患者または対象は非ヒト哺乳類であってよいが、より好ましくはヒトの患者である。その患者または対象は男性または女性であってよい。
本発明の観点に従う薬剤および医薬組成物は、非経口、静脈内、動脈内、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、皮下、経口および経鼻が含まれるがそれらに限定されないいくつかの経路による投与のために配合することができる。その薬剤および組成物は、流体または個体の形態で配合することができる。流体配合物は、ヒトまたは動物の体の選択された領域への注射による投与のために配合することができる。
投与は好ましくは“療法上有効量”であり、これはその個体に利益を示すのに十分である。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、処置される疾患の性質および重症度に依存するであろう。処置の処方、例えば投与量等に関する決定は、一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、典型的には処置されるべき障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与の方法および開業医に既知の他の要因を考慮する。上記で言及された技法およびプロトコルの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第20版, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkinsにおいて見つけることができる。
そのペプチドおよびペプチド−カーゴコンジュゲートは、インビトロの方法における使用のためにも提供される。例えば、エキソンスキッピングアッセイまたは細胞生存度アッセイにおけるペプチドおよび/またはペプチド−カーゴコンジュゲートの使用が提供される。加えて、そのペプチドおよびペプチド−カーゴコンジュゲートは、DMDのマウスモデルであるmdxマウスにおけるエキソンスキッピングおよびジストロフィン産生に関する使用のために提供される。
用語“インビトロ”は培養状態の細胞を用いた実験を含むことを意図しており、一方で用語“インビボ”は完全な多細胞生物を用いた実験を含むことを意図している。
本発明のペプチドをコードする核酸も提供される。本発明のペプチドをコードする核酸に作動可能に(operably)連結された制御配列、例えばプロモーターを有する核酸ベクター、例えばプラスミドも提供される。そのベクターは好ましくは適切な細胞、例えば哺乳類、細菌または真菌細胞中に形質移入された際にそのペプチドを発現することができる。その核酸は単離または精製された形態で提供されてよい。
この明細書において、用語“作動可能に連結された”には、選択されたヌクレオチド配列および制御ヌクレオチド配列がヌクレオチドコード配列の発現をその制御配列の影響または制御下に置くような方法で共有結合的に連結されている状況が含まれてよい。従って、制御配列は、その制御配列が選択されたヌクレオチド配列の一部または全部を形成するヌクレオチドコード配列の転写をもたらすことができる場合、選択されたヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。適切である場合、結果として生じる転写産物が次いで所望のペプチドに翻訳されることができる。
上記のことに従って、本発明の以下の観点および態様が提供される。
本発明の1観点において、次の配列を有する少なくとも3個のドメインからなる一次配列構造を有するペプチドが提供され:
N末端 [ドメイン1]−[ドメイン2]−[ドメイン3] C末端
ここで
ドメイン1および3中のR(アルギニン)残基を合わせた数は少なくとも5であり、
ドメイン1および3中のX残基を合わせた数は少なくとも1であり、
ドメイン1および3中のB残基を合わせた数は少なくとも2であり、
ここでX=アミノヘキサン酸およびB=ベータアラニンであり、
かつここで
ドメイン2はアミノ酸ZFLIの少なくとも3個を含有する配列を含み、ここでZはYまたはIであり、かつZはQまたはRであり、かつ
ドメイン2はILFQY、ILFQまたはILIQのN〜C末端の連続した一次配列を含有しない。
ドメイン1〜3中の残基を合わせた総数は、好ましくは50より多くなく、より好ましくは40より多くなく、そして最も好ましくは20〜30である。
本発明の別の観点において、次の配列を有する少なくとも3個のドメインからなる一次配列構造を有するペプチドが提供され:
N末端 [ドメイン1]−[ドメイン2]−[ドメイン3] C末端
ここで:
(i)ドメイン1は以下の配列から選択される配列を含み:
RXRZ [SEQ ID NO:762]
ここでZは以下の配列の1つから選択され:
RBRRXR [SEQ ID NO:763]
RBRRX [SEQ ID NO:764]
RBRX [SEQ ID NO:765]
RBRXR [SEQ ID NO:766]
BRX [SEQ ID NO:767]
BX [SEQ ID NO:768]
RBR [SEQ ID NO:769]
RB [SEQ ID NO:770]、または
RBRR [SEQ ID NO:771]
(ii)ドメイン2はアミノ酸ZFLIの少なくとも3個を含有する配列を含み、ここでZはYまたはIであり、かつZはQまたはRであり、かつここでドメイン2はILFQY、ILFQまたはILIQのN〜C末端の連続した一次配列を含有せず、
(iii)ドメイン3は以下の配列から選択される配列を含み:
RXRBRXRB [SEQ ID NO:772]
XRBRXRB [SEQ ID NO:773]
RXRRBRB [SEQ ID NO:774]
BRXRB [SEQ ID NO:775]
XRRBRB [SEQ ID NO:776]
RRBRB [SEQ ID NO:777]
XRBRB [SEQ ID NO:778]
RBRXRB [SEQ ID NO:779]
RXRBRB [SEQ ID NO:780]、または
BRBRB [SEQ ID NO:781]
ここでX=アミノヘキサン酸、B=ベータアラニンである。
一部の態様において、ドメイン2はYQFLI、IQFLI、YRFLI、YRFRLI、FQILY、QFLI、またはQFLから選択されるN〜C末端の連続した一次配列を含む。一部の態様において、ドメイン2は4または5アミノ酸を有する。一部の態様において、ドメイン2は0、1、2または3個のR残基を有する。
一部の態様において、ドメイン1は以下の配列から選択される配列を含む、またはそれで構成される:
RXRRBRRXR [SEQ ID NO:782]
RXRRBRRX [SEQ ID NO:783]
RXRRBRX [SEQ ID NO:784]
RXRBRX [SEQ ID NO:785]
RXRRBRXR [SEQ ID NO:786]
RXRRBR [SEQ ID NO:787]
RXRRB [SEQ ID NO:788]、または
RXRRBRR [SEQ ID NO:789]。
一部の態様において、ドメイン3は以下の配列から選択される配列を含む、またはそれで構成される:
RXRBRXRB [SEQ ID NO:772]
XRBRXRB [SEQ ID NO:773]
RXRRBRB [SEQ ID NO:774]
BRXRB [SEQ ID NO:775]
XRRBRB [SEQ ID NO:776]
RRBRB [SEQ ID NO:777]
XRBRB [SEQ ID NO:778]
RBRXRB [SEQ ID NO:779]
RXRBRB [SEQ ID NO:780]、または
BRBRB [SEQ ID NO:781]。
一部の態様において、そのペプチドは6〜12個のR残基、好ましくは6、7、8、9、10、11または12個のR残基の1つを有する。ドメイン2は1、2または3個のR残基を有することができる。ドメイン1は6個以下のR残基、例えば0、1、2、3、4、5、または6個のR残基を有することができる。ドメイン3は4個以下のR残基、例えば0、1、2、3、または4個のR残基を有することができる。そのR残基はD−アルギニンもしくはL−アルギニン、または両方の混合物であることができる。
一部の好ましい態様において、ドメイン1および3はR、XおよびB残基のみを含有し、またはXもしくはBではない1、もしくは2個の残基のみを有する。
従って、ドメイン1は(i)2〜6個のR残基、(ii)1〜3個のX残基、および(iii)1〜2個のB残基のあらゆる組み合わせを有することができ、かつ好ましくは長さが10残基より多くなく、かつ0、1または2個のR、XまたはBではない残基を有する。ドメイン3は(a)2〜5個のR残基、(b)1〜3個のX残基、および(c)1〜3個のB残基のあらゆる組み合わせを有することができ、かつ好ましくは長さが9残基より多くなく、かつ0、1または2個のR、XまたはBではない残基を有する。
一部の態様において、そのペプチドは天然アミノ酸、XおよびB残基を含めて30残基の最大長を有する。従って、一部の態様において、ドメイン1は4から12残基までの長さを有することができ、ドメイン2は3から9残基までの長さを有することができ、かつドメイン3は4から12残基までの長さを有することができ、ここでその長さには天然アミノ酸、XおよびB残基が含まれる。
一部の態様において、そのペプチドはSEQ ID NO:2〜308または317〜661(図18、23〜30および41)の1つから選択される配列を含む、またはそれで構成される。一部の態様において、そのペプチドはSEQ ID NO:2〜308または317〜761(図18、23〜30および41)の1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、またはそれで構成される。
一部の態様において、そのペプチドは、Pip−6a、Pip−6b、Pip−6c、Pip−6d、Pip−6e、Pip−6f、Pip−6g、Pip−6h、Pip−6i[SEQ ID NO:2〜10];Pip−7a、Pip−7b、Pip−7c、Pip−7d、Pip−7b2、Pip−7c2[SEQ ID NO:11〜16];もしくはPip−8a、Pip−8b、Pip−8c、Pip−8c2、Pip−8d、Pip−8d2、Pip−8d3[SEQ ID NO:17〜20および317〜319];もしくはPip−9b、Pip−9b2、Pip−9c、Pip−9c2、Pip−9c3、Pip−9d、Pip−9d2、Pip−9d3、Pip−9d4[SEQ ID NO 320〜328]の1つのドメイン1〜3の配列、またはPip−6a、Pip−6b、Pip−6c、Pip−6d、Pip−6e、Pip−6f、Pip−6g、Pip−6h、Pip−6i[SEQ ID NO:2〜10];Pip−7a、Pip−7b、Pip−7c、Pip−7d、Pip−7b2、Pip−7c2[SEQ ID NO:11〜16];もしくはPip−8a、Pip−8b、Pip−8c、Pip−8c2、Pip−8d、Pip−8d2、Pip−8d3[SEQ ID NO:17〜20および317〜319];もしくはPip−9b、Pip−9b2、Pip−9c、Pip−9c2、Pip−9c3、Pip−9d、Pip−9d2、Pip−9d3、Pip−9d4[SEQ ID NO 320〜328]の1つのドメイン1〜3の配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、またはそれで構成される。
一部の態様において、そのペプチドはさらにそのC末端においてリンカー配列を含む。そのリンカー配列は、BCys、XCys、Cys、GGCys、BBCys、BXCys、XBCys、BX、またはXBから選択されてよい。
一部の態様において、そのペプチドはカーゴ分子に化学的にコンジュゲートされている。そのコンジュゲーションはそのペプチドのC末端においてであってよい。
そのカーゴ分子は、核酸、ペプチド核酸(PNA)、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド(PMO)、ロックド核酸(locked nucleic acid)(LNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉RNA(siRNA)、ペプチド、環状ペプチド、タンパク質、または薬物から選択されてよい。そのカーゴ分子は5,000Da未満の分子量を有することができる。一部の態様において、そのカーゴ分子はPNADMD[SEQ ID NO:309]もしくはPMODMD[SEQ ID NO:310]またはPNADMD[SEQ ID NO:309]もしくはPMODMD[SEQ ID NO:310]の1つに少なくとも90%の配列同一性を有する分子である。
本発明のさらなる観点において、本発明のペプチドを含む医薬組成物または薬剤が提供される。その医薬組成物または薬剤はさらに薬学的に許容可能な希釈剤、アジュバントまたはキャリヤーを含むことができる。
本発明の別の観点において、本発明のペプチドは疾患の処置の方法における使用のために提供される。本発明の別の観点において、疾患の処置における使用のための薬剤の製造における本発明のペプチドの使用が提供される。
本発明のさらなる観点において、処置を必要とする患者における疾患の処置の方法が提供され、その方法は本発明のペプチドをその患者に投与することを含む。
本発明のさらなる観点において、単離された核酸が提供され、その単離された核酸は本発明のあらゆる観点または態様に従うペプチドまたはペプチド−カーゴコンジュゲートをコードしている。そのような核酸に作動可能に連結された制御配列を有する核酸ベクターも提供される。
ペプチド模倣体
既知の薬学的または生物学的に有効な化合物に対する模倣体の設計は、“リード”化合物に基づく医薬および療法薬の開発のための既知のアプローチである。これは、その有効化合物を合成するのが困難もしくは費用がかかる場合、またはそれが特定の投与法に適さない場合に望ましい可能性があり、例えば一部のペプチドは、それらが消化管中のプロテアーゼにより急速に分解される傾向があるため、経口組成物に関して不適切な有効薬剤である可能性がある。模倣体の設計、合成および試験は、一般に標的特性に関して多数の分子をランダムにスクリーニングするのを避けるために用いられる。
所与の標的特性を有する化合物からの模倣体の設計において一般的に用いられるいくつかの工程がある。第1に、その標的特性の決定において決定的および/または重要であるその化合物の特定の部分を決定する。ペプチドの場合、これはそのペプチド中のアミノ酸残基を例えばそれぞれの残基を順番に置換することにより系統的に変更することにより行うことができる。その化合物の活性な領域を構成しているこれらの部分または残基は、その“ファルマコフォア”として知られている。
一度そのファルマコフォアが見付かったら、その構造を、ある範囲の源、例えば分光分析技法、X線回折データおよびNMRからのデータを用いて、その物理特性、例えば立体化学、結合、大きさおよび/または電荷に従ってモデルする(modelled)。コンピューター分析、類似性マッピング(それは原子間の結合よりもむしろファルマコフォアの電荷および/または体積をモデルする)および他の技法をこのモデリングプロセスにおいて用いることができる。
このアプローチの変形において、リガンドおよびその結合パートナーの3次元構造をモデルする。これはリガンドおよび/または結合パートナーが結合の際に立体構造を変化させる場合に特に有用である可能性があり、その模倣体の設計においてそのモデルがこれを考慮することを可能にする。
次いでその上にそのファルマコフォアを模倣する化学基を移植することができる鋳型分子を選択する。その鋳型分子およびその上に移植された化学基は好都合には、その模倣体を合成し易い、それが薬学的に許容可能でありそうである、そしてインビボで分解せず、一方でそのリード化合物の生物学的活性を保持しているように選択することができる。次いでこのアプローチにより見付かった模倣体(単数または複数)を、それらがその標的特性を有するかどうか、またはどの程度までそれらがそれを示すかを調べるためにスクリーニングすることができる。次いで、インビボまたは臨床試験のための1種類以上の最終的な模倣体に到達するため、さらなる最適化または修飾を実施することができる。
本発明に関して、そのペプチド構造を修飾し、場合により続いてその修飾されたペプチドをスプライス修正アッセイもしくはエキソンスキッピングアッセイにおいて、および/または細胞生存度アッセイにおいて試験する工程を含む方法が提供される。このペプチドまたはペプチド模倣体の修飾のプロセスを、所望であるように、望まれるスプライス修正もしくはエキソンスキッピング活性および/または細胞生存度を有するペプチドが同定されるまで何回も繰り返してよい。
用いられる修飾工程は、そのペプチドまたはペプチド模倣体の長さを切り詰めること(これはより短い長さのペプチドまたはペプチド模倣体を合成することを含んでよい)、1個以上のアミノ酸残基もしくは化学基の置換、および/またはそのペプチドもしくはペプチド模倣体を化学的に修飾して細胞生存度、分解に対する耐性、細胞膜を越える輸送、および/または体からの排除に対する耐性を増大させること、および/または心筋中を含めてDMDのmdxマウスモデルにおいてエキソンスキッピングおよびジストロフィン産生における活性を提供することを含んでよい。
本発明には、記述された観点および好ましい特徴の組み合わせが、そのような組み合わせが明確に許容できない、または特に避けられる場合を除いて含まれる。
本明細書で用いられる節の見出しは組織化の目的のためだけのものであり、記述される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
本発明は、非限定的に、好ましくは以下の態様を含む。
[態様1] 配列:
N末端 [ドメイン1]−[ドメイン2]−[ドメイン3] C末端
を有する少なくとも3個のドメインからなる一次配列構造を有するペプチドであって、ここで:
ドメイン1〜3中の残基を合わせた総数は40より多くなく、
ドメイン1および3中のR(アルギニン)残基を合わせた数は少なくとも5であり、
ドメイン1および3中のX残基を合わせた数は少なくとも1であり、
ドメイン1および3中のB残基を合わせた数は少なくとも2であり、ここで
X=アミノヘキサン酸およびB=ベータアラニンであり、
ドメイン2はアミノ酸ZFLI[SEQ ID NO:798]の少なくとも3個を含有する配列を含み、ここでZはYまたはIであり、かつZはQまたはRであり、かつ
ドメイン2はILFQY[SEQ ID NO:799]、ILFQ[SEQ ID NO:800]またはILIQ[SEQ ID NO:801]のN〜C末端の連続した一次配列を含有しない、前記ペプチド。
[態様2] 配列:
N末端 [ドメイン1]−[ドメイン2]−[ドメイン3] C末端
を有する少なくとも3個のドメインからなる一次配列構造を有するペプチドであって、ここで:
(i)ドメイン1は以下の配列から選択される配列を含み:
RXRZ [SEQ ID NO:762]
ここでZは以下の配列の1つから選択され:
RBRRXR [SEQ ID NO:763]
RBRRX [SEQ ID NO:764]
RBRX [SEQ ID NO:765]
RBRXR [SEQ ID NO:766]
BRX [SEQ ID NO:767]
BX [SEQ ID NO:768]
RBR [SEQ ID NO:769]
RB [SEQ ID NO:770]、または
RBRR [SEQ ID NO:771]
(ii)ドメイン2はアミノ酸ZFLI[SEQ ID NO:798]の少なくとも3個を含有する配列を含み、ここでZはYまたはIであり、かつZはQまたはRであり、かつここでドメイン2はILFQY[SEQ ID NO:799]、ILFQ[SEQ ID NO:800]またはILIQ[SEQ ID NO:801]のN〜C末端の連続した一次配列を含有せず、
(iii)ドメイン3は以下の配列から選択される配列を含み:
RXRBRXRB [SEQ ID NO:772]
XRBRXRB [SEQ ID NO:773]
RXRRBRB [SEQ ID NO:774]
BRXRB [SEQ ID NO:775]
XRRBRB [SEQ ID NO:776]
RRBRB [SEQ ID NO:777]
XRBRB [SEQ ID NO:778]
RBRXRB [SEQ ID NO:779]
RXRBRB [SEQ ID NO:780]、または
BRBRB [SEQ ID NO:781]
ここでX=アミノヘキサン酸、B=ベータアラニンである、前記ペプチド。
[態様3] ドメイン2がYQFLI[SEQ ID NO:802]、IQFLI[SEQ ID NO:803]、YRFLI[SEQ ID NO:804]、YRFRLI[SEQ ID NO:805]、FQILY[SEQ ID NO:806]、QFLI[SEQ ID NO:807]、QFL[SEQ ID NO:808]、またはILFRY[SEQ ID NO:811]から選択されるN〜C末端の連続した一次配列を含む、態様1または2に記載のペプチド。
[態様4] ドメイン1が以下の配列:
RXRRBRRXR [SEQ ID NO:782]
RXRRBRRX [SEQ ID NO:783]
RXRRBRX [SEQ ID NO:784]
RXRBRX [SEQ ID NO:785]
RXRRBRXR [SEQ ID NO:786]
RXRRBR [SEQ ID NO:787]
RXRRB [SEQ ID NO:788]、または
RXRRBRR [SEQ ID NO:789]
RXRBX [SEQ ID NO:790]
から選択される配列を含む、またはそれで構成される、態様1〜3のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様5] ドメイン3が以下の配列:
RXRBRXRB [SEQ ID NO:772]
XRBRXRB [SEQ ID NO:773]
RXRRBRB [SEQ ID NO:774]
BRXRB [SEQ ID NO:775]
XRRBRB [SEQ ID NO:776]
RRBRB [SEQ ID NO:777]
XRBRB [SEQ ID NO:778]
RBRXRB [SEQ ID NO:779]
RXRBRB [SEQ ID NO:780]、または
BRBRB [SEQ ID NO:781]
から選択される配列を含む、またはそれで構成される、態様1〜4のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様6] ドメイン2が4または5個のアミノ酸を有する、態様1〜5のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様7] ドメイン2が0、1、2または3個のR残基を含有する、態様1〜6のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様8] ドメイン2が少なくとも1または2個のR残基を有し、ドメイン1が5個以下のR残基を有し、ドメイン3が4個以下のR残基を有する、態様1〜7のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様9] 1個以上のR残基がD−アルギニンである、態様1〜8のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様10] 1個以上のR残基がL−アルギニンである、態様1〜9のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様11] ドメイン1および3がR、XおよびB残基のみを含有する、態様1〜10のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様12] ドメイン1が2〜6個のR残基、1〜3個のX残基および1〜2個のB残基のあらゆる組み合わせを有し、かつ長さが10残基より多くなく、かつ0、1または2個のR、XまたはBではない残基を有する、態様1〜11のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様13] ドメイン3が2〜5個のR残基、1〜3個のX残基、および1〜3個のB残基のあらゆる組み合わせを有し、かつ長さが9残基より多くなく、かつ0、1または2個のR、XまたはBではない残基を有する、態様1〜12のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様14] ペプチドが天然アミノ酸、XおよびB残基を含めて30残基の最大長を有する、態様1〜13のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様15] ドメイン1が4から12残基までの長さを有し、ドメイン2が3から9残基までの長さを有し、かつドメイン3が4から12残基までの長さを有し、ここで該長さに天然アミノ酸、XおよびB残基が含まれる、態様1〜14のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様16] SEQ ID NO:2〜308または317〜761(図18、23〜30、および41)の1つから選択される配列を含む、またはそれで構成される、態様1〜15のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様17] SEQ ID NO:2〜308または317〜761(図18、23〜30、および41)の1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、またはそれで構成される、態様1〜16のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様18] Pip−6a、Pip−6b、Pip−6e、Pip−6f(SEQ ID NO:2、3、6、または7)の1つのドメイン1〜3の配列またはPip−6a、Pip−6b、Pip−6e、Pip−6f(SEQ ID NO:2、3、6、または7)の1つのドメイン1〜3の配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、またはそれで構成される、態様1〜17のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様19] ペプチドがさらにC末端においてリンカーを含む、態様1〜18のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様20] リンカーがBCys、XCys、Cys、GGCys、BBCys、BXCys、XBCys、BX、またはXBから選択される、態様19に記載のペプチド。
[態様21] ペプチドがカーゴ分子に化学的にコンジュゲートされている、態様1〜20のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様22] コンジュゲーションがペプチドのC末端においてである、態様21に記載のペプチド。
[態様23] カーゴ分子が核酸、ペプチド核酸(PNA)、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド(PMO)、ロックド核酸(LNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉RNA(siRNA)、ペプチド、環状ペプチド、タンパク質、または薬物から選択される、態様21または22に記載のペプチド。
[態様24] カーゴ分子が5,000Da未満の分子量を有する、態様23に記載のペプチド。
[態様25] カーゴ分子がPNADMD[SEQ ID NO:309]もしくはPMODMD[SEQ ID NO:310]またはPNADMD[SEQ ID NO:309]もしくはPMODMD[SEQ ID NO:310]の1つに少なくとも90%の配列同一性を有する分子である、態様23または24に記載のペプチド。
[態様26] 態様1〜25のいずれか1項に記載のペプチドを含む、医薬組成物または薬剤。
[態様27] さらに薬学的に許容可能な希釈剤、アジュバントまたはキャリヤーを含む、態様26に記載の医薬組成物または薬剤。
[態様28] 疾患の処置の方法における使用のための、態様1〜25のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様29] 疾患の処置における使用のための薬剤の製造における、態様1〜25のいずれか1項に記載のペプチドの使用。
[態様30] 態様1〜25のいずれか1項に記載のペプチドを患者に投与することを含む、処置を必要とする患者における疾患の処置の方法。
[態様31] 疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、メンケス病、β−サラセミア、前頭側頭型認知症、パーキンソン症候群、脊髄性筋萎縮症、筋緊張性ジストロフィー、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群、血管拡張性失調症変異(ATM)、または癌から選択される、態様28〜30のいずれか1項に記載のペプチド、使用または方法。
[態様32] 疾患が心臓の病気である、または心臓において明白である、態様28〜30のいずれか1項に記載のペプチド、使用または方法。
[態様33] 態様1〜25のいずれか1項に記載のペプチドまたはペプチド−カーゴコンジュゲートをコードしている、単離された核酸。
[態様34] 態様1〜25のいずれか1項に記載のペプチドまたはペプチド−カーゴコンジュゲートをコードしている核酸に作動可能に連結された制御配列を有する核酸ベクター。
本発明の観点および態様は、ここで例として添付の図を参照して説明されるであろう。さらなる観点および態様は当業者には明らかであろう。本書において言及される全ての文書は参照により本明細書に援用される。
本発明の原理を説明する態様および実験は、ここで添付の図を参照して論じられ、ここで:
分化したマウスH2K mdx筋肉筋管におけるPMO−ペプチド(Pip−5e、Pip−6a、Pip−6b、Pip−6c、Pip−6d、Pip−6e、Pip−6f)のエキソンスキッピング活性を示すグラフ。H2K mdx筋管を、0.125μM〜1μMの範囲の濃度のペプチド−PMOコンジュゲートと共に、形質移入試薬を使用せずにインキュベーションした。ネステッドRT−PCRの産物を2%アガロースゲル上での電気泳動により調べた。エキソンスキッピング活性はデンシトメトリーにより計算されるΔ23スキッピングの百分率として示される。 H2K mdx筋肉筋管におけるPMO−ペプチド(Pip−6g、Pip−6h、Pip−7a、Pip−7b、Pip−7c、Pip−7d)のエキソンスキッピング活性を示すグラフ。 H2K mdx筋肉筋管におけるPMO−ペプチド(Pip−6i、Pip−7b2、Pip−7c2、Pip−8a、Pip−8b、Pip−8c)のエキソンスキッピング活性を示すグラフ。 H2K mdx筋肉筋管におけるPMO−ペプチド(Pip−7b、Pip−7b2、Pip−8b(それぞれ8個のArgを有する)、Bペプチド(RXRRBR)XB))のエキソンスキッピング活性を示すグラフ。 H2K mdx筋肉筋管におけるPMO−ペプチド(Pip−7c、Pip−7c2、Pip−8c(それぞれ7個のArgを有する)、Bペプチド(RXRRBR)XB))のエキソンスキッピング活性を示すグラフ。 mdxマウス中の異なるマウス筋組織におけるPMO−ペプチド(Pip−6a、Pip−6b、Pip−6c、Pip−6d、Pip−6e、Pip−6f、Pip−5e)のウェスタンブロットでのタンパク質定量化の結果を示すグラフ(TA=前脛骨筋、Quad=四頭筋、Gas=腓腹筋、diaph=横隔膜筋、heart=心筋)。 Pip−6a、Pip−6b、Pip−6c、Pip−6d、Pip−6e、Pip−6fおよびPip−5eに関するmdxマウスからの(A)四頭筋、(B)横隔膜および(C)心組織におけるエキソンスキッピング活性のqPCRの結果を示すグラフ。 Pip−6a、Pip−6b、Pip−6c、Pip−6d、Pip−6e、Pip−6fおよびPip−5eに関するmdxマウスからの(A)四頭筋、(B)横隔膜および(C)心組織におけるエキソンスキッピング活性のqPCRの結果を示すグラフ。 Pip−6a、Pip−6b、Pip−6c、Pip−6d、Pip−6e、Pip−6fおよびPip−5eに関するmdxマウスからの(A)四頭筋、(B)横隔膜および(C)心組織におけるエキソンスキッピング活性のqPCRの結果を示すグラフ。 Pip−6a、Pip−6b、Pip−6c、Pip−6d、Pip−6e、Pip−6fおよびPip−5eに関するmdxマウスからの(A)前脛骨筋、(B)四頭筋、(C)横隔膜および(D)心組織におけるエキソンスキッピング活性の定量的ウェスタンブロットの結果を示すグラフ。 Pip−6a、Pip−6b、Pip−6c、Pip−6d、Pip−6e、Pip−6fおよびPip−5eに関するmdxマウスからの(A)前脛骨筋、(B)四頭筋、(C)横隔膜および(D)心組織におけるエキソンスキッピング活性の定量的ウェスタンブロットの結果を示すグラフ。 Pip−6a、Pip−6b、Pip−6c、Pip−6d、Pip−6e、Pip−6fおよびPip−5eに関するmdxマウスからの(A)前脛骨筋、(B)四頭筋、(C)横隔膜および(D)心組織におけるエキソンスキッピング活性の定量的ウェスタンブロットの結果を示すグラフ。 Pip−6a、Pip−6b、Pip−6c、Pip−6d、Pip−6e、Pip−6fおよびPip−5eに関するmdxマウスからの(A)前脛骨筋、(B)四頭筋、(C)横隔膜および(D)心組織におけるエキソンスキッピング活性の定量的ウェスタンブロットの結果を示すグラフ。 PMO−ペプチドPip−6a、Pip−6b、Pip−6c、Pip−6d、Pip−6e、Pip−6fおよびPip−5eに関するmdxマウスの異なる筋組織におけるエキソンスキッピング活性を示すRT−PCRの代表的な結果。 PMO−ペプチドPip−6a、Pip−6b、Pip−6c、Pip−6d、Pip−6e、Pip−6fおよびPip−5eに関するmdxマウスの異なる筋組織におけるエキソンスキッピング活性を示す代表的なウェスタンブロット。 Pip−5e−PMOに関するmdxマウスの筋組織におけるエキソンスキッピング活性を示す個々のデータセット。(A)RT−PCRの結果、(B)ウェスタンブロット、(C)定量化されたウェスタンブロットデータのプロット。 Pip−6a−PMOに関するmdxマウスの筋組織におけるエキソンスキッピング活性を示す個々のデータセット。(A)RT−PCRの結果、(B)ウェスタンブロット、(C)定量化されたウェスタンブロットデータのプロット。 Pip−6b−PMOに関するmdxマウスの筋組織におけるエキソンスキッピング活性を示す個々のデータセット。(A)RT−PCRの結果、(B)ウェスタンブロット、(C)定量化されたウェスタンブロットデータのプロット。 Pip−6c−PMOに関するmdxマウスの筋組織におけるエキソンスキッピング活性を示す個々のデータセット。(A)RT−PCRの結果、(B)ウェスタンブロット、(C)定量化されたウェスタンブロットデータのプロット。 Pip−6d−PMOに関するmdxマウスの筋組織におけるエキソンスキッピング活性を示す個々のデータセット。(A)RT−PCRの結果、(B)ウェスタンブロット、(C)定量化されたウェスタンブロットデータのプロット。 Pip−6e−PMOに関するmdxマウスの筋組織におけるエキソンスキッピング活性を示す個々のデータセット。(A)RT−PCRの結果、(B)ウェスタンブロット、(C)定量化されたウェスタンブロットデータのプロット。 Pip−6f−PMOに関するmdxマウスの筋組織におけるエキソンスキッピング活性を示す個々のデータセット。(A)RT−PCRの結果、(B)ウェスタンブロット、(C)定量化されたウェスタンブロットデータのプロット。 Pip−5e、Pip−6a、Pip−6b、Pip−6c、Pip−6d、Pip−6e、Pip−6f、Pip−6g、Pip−6h、Pip−6i、Pip−7a、Pip−7b、Pip−7c、Pip−7d、Pip−7b2、Pip7c2、Pip−8a、Pip−8b、Pip8c、Pip−8c2のアミノ酸配列を示す表。ドメイン1、2および3中の残基の総数およびArg、XおよびB残基の数も示す。 B−ペプチド−PMO、Pip−5e−PMO、Pip−6a−PMO、Pip−6c−PMO、Pip−6f−PMO、Pip−6h−PMOの細胞生存度を添加されたPip−PMOの濃度の関数として示すグラフ。 B−ペプチド−PMO、Pip−7a−PMO、Pip−8a−PMO(9個のArg残基を含有する)の細胞生存度を添加されたPip−PMOの濃度の関数として示すグラフ。 B−ペプチド−PMO、Pip−7b−PMO、Pip−7b2−PMO、Pip−8b−PMO(8個のArg残基を含有する)およびB−MSP−PMO(RXRRBRRXRRBRASSLNIAX[SEQ ID NO:910], Yin, H. et al, (2010) Mol. Ther. 18, 1822-1827)の細胞生存度を添加されたPip−PMOの濃度の関数として示すグラフ。 B−ペプチド−PMO、Pip−7c−PMO、Pip−7c2−PMO、Pip−8c−PMO(7個のArg残基を含有する)の細胞生存度を添加されたPip−PMOの濃度の関数として示すグラフ。 本発明のドメイン1〜3のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン2の配列YQFLI[SEQ ID NO:802]を、RXRRBRRXR[SEQ ID NO:782]、RXRRBRRX[SEQ ID NO:783]、RXRRBRX[SEQ ID NO:784]、RXRRBRXR[SEQ ID NO:786]、RXRBRX[SEQ ID NO:785]、RXRBX[SEQ ID NO:790]、RXRRBR[SEQ ID NO:787]、RXRRB[SEQ ID NO:788]、RXRRBRR[SEQ ID NO:789]から選択されるドメイン1の配列およびRXRBRXRB[SEQ ID NO:722]、XRBRXRB[SEQ ID NO:773]、RXRRBRB[SEQ ID NO:774]、BRXRB[SEQ ID NO:775]、XRRBRB[SEQ ID NO:776]、RRBRB[SEQ ID NO:777]、XRBRB[SEQ ID NO:778]、RBRXRB[SEQ ID NO:779]、RXRBRB[SEQ ID NO:780]、BRBRB[SEQ ID NO:781]から選択されるドメイン3の配列と共に含有する。 本発明のドメイン1〜3のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン2の配列YQFLI[SEQ ID NO:802]を、RXRRBRRXR[SEQ ID NO:782]、RXRRBRRX[SEQ ID NO:783]、RXRRBRX[SEQ ID NO:784]、RXRRBRXR[SEQ ID NO:786]、RXRBRX[SEQ ID NO:785]、RXRBX[SEQ ID NO:790]、RXRRBR[SEQ ID NO:787]、RXRRB[SEQ ID NO:788]、RXRRBRR[SEQ ID NO:789]から選択されるドメイン1の配列およびRXRBRXRB[SEQ ID NO:722]、XRBRXRB[SEQ ID NO:773]、RXRRBRB[SEQ ID NO:774]、BRXRB[SEQ ID NO:775]、XRRBRB[SEQ ID NO:776]、RRBRB[SEQ ID NO:777]、XRBRB[SEQ ID NO:778]、RBRXRB[SEQ ID NO:779]、RXRBRB[SEQ ID NO:780]、BRBRB[SEQ ID NO:781]から選択されるドメイン3の配列と共に含有する。 本発明のドメイン1〜3のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン2の配列IQFLI[SEQ ID NO:803]を、RXRRBRRXR、RXRRBRRX、RXRRBRX、RXRRBRXR、RXRBRX、RXRBX、RXRRBR、RXRRB、RXRRBRRから選択されるドメイン1の配列およびRXRBRXRB、XRBRXRB、RXRRBRB、BRXRB、XRRBRB、RRBRB、XRBRB、RBRXRB、RXRBRB、BRBRBから選択されるドメイン3の配列と共に含有する。 本発明のドメイン1〜3のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン2の配列IQFLI[SEQ ID NO:803]を、RXRRBRRXR、RXRRBRRX、RXRRBRX、RXRRBRXR、RXRBRX、RXRBX、RXRRBR、RXRRB、RXRRBRRから選択されるドメイン1の配列およびRXRBRXRB、XRBRXRB、RXRRBRB、BRXRB、XRRBRB、RRBRB、XRBRB、RBRXRB、RXRBRB、BRBRBから選択されるドメイン3の配列と共に含有する。 本発明のドメイン1〜3のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン2の配列QFLI[SEQ ID NO:807]を、RXRRBRRXR、RXRRBRRX、RXRRBRX、RXRRBRXR、RXRBRX、RXRBX、RXRRBR、RXRRB、RXRRBRRから選択されるドメイン1の配列およびRXRBRXRB、XRBRXRB、RXRRBRB、BRXRB、XRRBRB、RRBRB、XRBRB、RBRXRB、RXRBRB、BRBRBから選択されるドメイン3の配列と共に含有する。 本発明のドメイン1〜3のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン2の配列QFLI[SEQ ID NO:807]を、RXRRBRRXR、RXRRBRRX、RXRRBRX、RXRRBRXR、RXRBRX、RXRBX、RXRRBR、RXRRB、RXRRBRRから選択されるドメイン1の配列およびRXRBRXRB、XRBRXRB、RXRRBRB、BRXRB、XRRBRB、RRBRB、XRBRB、RBRXRB、RXRBRB、BRBRBから選択されるドメイン3の配列と共に含有する。 本発明のドメイン1〜3のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン2の配列QFL[SEQ ID NO:808]を、RXRRBRRXR、RXRRBRRX、RXRRBRX、RXRRBRXR、RXRBRX、RXRBX、RXRRBR、RXRRB、RXRRBRRから選択されるドメイン1の配列およびRXRBRXRB、XRBRXRB、RXRRBRB、BRXRB、XRRBRB、RRBRB、XRBRB、RBRXRB、RXRBRB、BRBRBから選択されるドメイン3の配列と共に含有する。 本発明のドメイン1〜3のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン2の配列QFL[SEQ ID NO:808]を、RXRRBRRXR、RXRRBRRX、RXRRBRX、RXRRBRXR、RXRBRX、RXRBX、RXRRBR、RXRRB、RXRRBRRから選択されるドメイン1の配列およびRXRBRXRB、XRBRXRB、RXRRBRB、BRXRB、XRRBRB、RRBRB、XRBRB、RBRXRB、RXRBRB、BRBRBから選択されるドメイン3の配列と共に含有する。 本発明のドメイン1〜3のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン2の配列YRFLI[SEQ ID NO:804]を、RXRRBRRXR、RXRRBRRX、RXRRBRX、RXRRBRXR、RXRBRX、RXRBX、RXRRBR、RXRRB、RXRRBRRから選択されるドメイン1の配列およびRXRBRXRB、XRBRXRB、RXRRBRB、BRXRB、XRRBRB、RRBRB、XRBRB、RBRXRB、RXRBRB、BRBRBから選択されるドメイン3の配列と共に含有する。 本発明のドメイン1〜3のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン2の配列YRFLI[SEQ ID NO:804]を、RXRRBRRXR、RXRRBRRX、RXRRBRX、RXRRBRXR、RXRBRX、RXRBX、RXRRBR、RXRRB、RXRRBRRから選択されるドメイン1の配列およびRXRBRXRB、XRBRXRB、RXRRBRB、BRXRB、XRRBRB、RRBRB、XRBRB、RBRXRB、RXRBRB、BRBRBから選択されるドメイン3の配列と共に含有する。 本発明のドメイン1〜3のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン2の配列FQILY[SEQ ID NO:806]を、RXRRBRRXR、RXRRBRRX、RXRRBRX、RXRRBRXR、RXRBRX、RXRBX、RXRRBR、RXRRB、RXRRBRRから選択されるドメイン1の配列およびRXRBRXRB、XRBRXRB、RXRRBRB、BRXRB、XRRBRB、RRBRB、XRBRB、RBRXRB、RXRBRB、BRBRBから選択されるドメイン3の配列と共に含有する。 本発明のドメイン1〜3のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン2の配列FQILY[SEQ ID NO:806]を、RXRRBRRXR、RXRRBRRX、RXRRBRX、RXRRBRXR、RXRBRX、RXRBX、RXRRBR、RXRRB、RXRRBRRから選択されるドメイン1の配列およびRXRBRXRB、XRBRXRB、RXRRBRB、BRXRB、XRRBRB、RRBRB、XRBRB、RBRXRB、RXRBRB、BRBRBから選択されるドメイン3の配列と共に含有する。 本発明のドメイン1〜3のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン2の配列YRFRLI[SEQ ID NO:805]を、RXRRBRRXR、RXRRBRRX、RXRRBRX、RXRRBRXR、RXRBRX、RXRBX、RXRRBR、RXRRB、RXRRBRRから選択されるドメイン1の配列およびRXRBRXRB、XRBRXRB、RXRRBRB、BRXRB、XRRBRB、RRBRB、XRBRB、RBRXRB、RXRBRB、BRBRBから選択されるドメイン3の配列と共に含有する。 本発明のドメイン1〜3のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン2の配列YRFRLI[SEQ ID NO:805]を、RXRRBRRXR、RXRRBRRX、RXRRBRX、RXRRBRXR、RXRBRX、RXRBX、RXRRBR、RXRRB、RXRRBRRから選択されるドメイン1の配列およびRXRBRXRB、XRBRXRB、RXRRBRB、BRXRB、XRRBRB、RRBRB、XRBRB、RBRXRB、RXRBRB、BRBRBから選択されるドメイン3の配列と共に含有する。 本発明のドメイン1〜3のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン2の配列ILFRY[SEQ ID NO:811]を、RXRRBRRXR、RXRRBRRX、RXRRBRX、RXRRBRXR、RXRBRX、RXRBX、RXRRBR、RXRRB、RXRRBRRから選択されるドメイン1の配列およびRXRBRXRB、XRBRXRB、RXRRBRB、BRXRB、XRRBRB、RRBRB、XRBRB、RBRXRB、RXRBRB、BRBRBから選択されるドメイン3の配列と共に含有する。 本発明のドメイン1〜3のペプチド配列を示す表。その配列は全て、ドメイン2の配列ILFRY[SEQ ID NO:811]を、RXRRBRRXR、RXRRBRRX、RXRRBRX、RXRRBRXR、RXRBRX、RXRBX、RXRRBR、RXRRB、RXRRBRRから選択されるドメイン1の配列およびRXRBRXRB、XRBRXRB、RXRRBRB、BRXRB、XRRBRB、RRBRB、XRBRB、RBRXRB、RXRBRB、BRBRBから選択されるドメイン3の配列と共に含有する。 C57BL10対照マウス、mdx未処置マウス、および1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従ってPip6−PMOで処置されたmdxマウスに関する定量的免疫組織化学染色の平均値に関する統計表。未処置のmdxマウスと比較したPip6a〜fで処置されたmdxマウスに関する四頭筋、横隔膜、および心筋の免疫組織化学染色に関する統計的有意性の表。統計的有意性は、繰り返し測定、マルチレベル統計モデルを用いて決定された(****=p<0.0001、***=p<0.001、**=p<0.01、*=p<0.05、N/S=有意ではない)。 C57BL10対照マウス、mdx未処置マウス、および1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従ってPip6−PMOで処置されたmdxマウスに関する定量的免疫組織化学染色の平均値に関する統計表。Pip5eで処置されたマウスと比較したPip6a〜fで処置されたmdxマウスに関する四頭筋、横隔膜、および心筋の免疫組織化学染色に関する統計的有意性の表。統計的有意性は、繰り返し測定、マルチレベル統計モデルを用いて決定された(****=p<0.0001、***=p<0.001、**=p<0.01、*=p<0.05、N/S=有意ではない)。 Pip5e−PMO誘導体に関する化学的コンジュゲーション法。PMO AOに対するペプチドのコンジュゲーションの方法。ペプチドをPMOに、そのPMOの3’末端におけるアミド結合を通してコンジュゲートし、続いてHPLCにより精製し、MALDI−TOF MSにより分析した。HBTU:2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート、HOBt、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物、DIEA:ジイソプロピルエチルアミン。 C57BL10対照マウス、mdx未処置マウス、1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従って5−aa疎水性コアPip6−PMOで処置されたマウスおよびPip5e−PMOで処置されたマウスにおけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。(a)C57BL10、mdx未処置およびmdx処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋における対照ラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域(120個の領域)に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された(bにおいて示される)平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図31および32を参照。回復スコアの百分率を下に示す。(c)四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム(q−RT)−PCRにより決定されたΔ23エキソンスキッピングの百分率。(d)TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング(skipped)を示す代表的なリアルタイム(RT)−PCR画像。上部のバンドは完全長(FL)またはスキップされなかった転写産物を示す。(e)それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。50%(5μgタンパク質)および10%(1μg)のC57BL10対照と比較して、10マイクログラムの総タンパク質をロードし(TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋)、α−アクチニンロード対照に対して正規化した(定量化に関して図38a参照)。 C57BL10対照マウス、mdx未処置マウス、1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従って5−aa疎水性コアPip6−PMOで処置されたマウスおよびPip5e−PMOで処置されたマウスにおけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。(a)C57BL10、mdx未処置およびmdx処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋における対照ラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域(120個の領域)に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された(bにおいて示される)平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図31および32を参照。回復スコアの百分率を下に示す。(c)四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム(q−RT)−PCRにより決定されたΔ23エキソンスキッピングの百分率。(d)TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング(skipped)を示す代表的なリアルタイム(RT)−PCR画像。上部のバンドは完全長(FL)またはスキップされなかった転写産物を示す。(e)それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。50%(5μgタンパク質)および10%(1μg)のC57BL10対照と比較して、10マイクログラムの総タンパク質をロードし(TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋)、α−アクチニンロード対照に対して正規化した(定量化に関して図38a参照)。 C57BL10対照マウス、mdx未処置マウス、1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従って5−aa疎水性コアPip6−PMOで処置されたマウスおよびPip5e−PMOで処置されたマウスにおけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。(a)C57BL10、mdx未処置およびmdx処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋における対照ラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域(120個の領域)に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された(bにおいて示される)平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図31および32を参照。回復スコアの百分率を下に示す。(c)四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム(q−RT)−PCRにより決定されたΔ23エキソンスキッピングの百分率。(d)TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング(skipped)を示す代表的なリアルタイム(RT)−PCR画像。上部のバンドは完全長(FL)またはスキップされなかった転写産物を示す。(e)それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。50%(5μgタンパク質)および10%(1μg)のC57BL10対照と比較して、10マイクログラムの総タンパク質をロードし(TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋)、α−アクチニンロード対照に対して正規化した(定量化に関して図38a参照)。 C57BL10対照マウス、mdx未処置マウス、1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従って5−aa疎水性コアPip6−PMOで処置されたマウスおよびPip5e−PMOで処置されたマウスにおけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。(a)C57BL10、mdx未処置およびmdx処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋における対照ラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域(120個の領域)に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された(bにおいて示される)平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図31および32を参照。回復スコアの百分率を下に示す。(c)四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム(q−RT)−PCRにより決定されたΔ23エキソンスキッピングの百分率。(d)TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング(skipped)を示す代表的なリアルタイム(RT)−PCR画像。上部のバンドは完全長(FL)またはスキップされなかった転写産物を示す。(e)それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。50%(5μgタンパク質)および10%(1μg)のC57BL10対照と比較して、10マイクログラムの総タンパク質をロードし(TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋)、α−アクチニンロード対照に対して正規化した(定量化に関して図38a参照)。 C57BL10対照マウス、mdx未処置マウス、1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従って5−aa疎水性コアPip6−PMOで処置されたマウスおよびPip5e−PMOで処置されたマウスにおけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。(a)C57BL10、mdx未処置およびmdx処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋における対照ラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域(120個の領域)に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された(bにおいて示される)平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図31および32を参照。回復スコアの百分率を下に示す。(c)四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム(q−RT)−PCRにより決定されたΔ23エキソンスキッピングの百分率。(d)TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング(skipped)を示す代表的なリアルタイム(RT)−PCR画像。上部のバンドは完全長(FL)またはスキップされなかった転写産物を示す。(e)それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。50%(5μgタンパク質)および10%(1μg)のC57BL10対照と比較して、10マイクログラムの総タンパク質をロードし(TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋)、α−アクチニンロード対照に対して正規化した(定量化に関して図38a参照)。 C57BL10対照マウス、mdx未処置マウス、およびPip5e−PMOと比較した1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従って短縮された疎水性コアのPip6−PMOで処置されたマウス(Pip6cおよびPip6d)におけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。(a)C57BL10、mdx未処置およびmdx処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋における対照ラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域(120個の領域)に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された(bにおいて示される)平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図31および32を参照。回復スコアの百分率を下に示す。(c)四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム(q−RT)−PCRにより決定されたΔ23エキソンスキッピングの百分率。(d)TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング(skipped)を示す代表的なリアルタイム(RT)−PCR画像。上部のバンドは完全長(FL)またはスキップされなかった転写産物を示す。(e)それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。50%(5μgタンパク質)および10%(1μg)のC57BL10対照と比較して、10マイクログラムの総タンパク質をロードし(TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋)、α−アクチニンロード対照に対して正規化した(定量化に関して図38a参照)。 C57BL10対照マウス、mdx未処置マウス、およびPip5e−PMOと比較した1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従って短縮された疎水性コアのPip6−PMOで処置されたマウス(Pip6cおよびPip6d)におけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。(a)C57BL10、mdx未処置およびmdx処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋における対照ラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域(120個の領域)に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された(bにおいて示される)平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図31および32を参照。回復スコアの百分率を下に示す。(c)四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム(q−RT)−PCRにより決定されたΔ23エキソンスキッピングの百分率。(d)TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング(skipped)を示す代表的なリアルタイム(RT)−PCR画像。上部のバンドは完全長(FL)またはスキップされなかった転写産物を示す。(e)それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。50%(5μgタンパク質)および10%(1μg)のC57BL10対照と比較して、10マイクログラムの総タンパク質をロードし(TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋)、α−アクチニンロード対照に対して正規化した(定量化に関して図38a参照)。 C57BL10対照マウス、mdx未処置マウス、およびPip5e−PMOと比較した1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従って短縮された疎水性コアのPip6−PMOで処置されたマウス(Pip6cおよびPip6d)におけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。(a)C57BL10、mdx未処置およびmdx処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋における対照ラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域(120個の領域)に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された(bにおいて示される)平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図31および32を参照。回復スコアの百分率を下に示す。(c)四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム(q−RT)−PCRにより決定されたΔ23エキソンスキッピングの百分率。(d)TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング(skipped)を示す代表的なリアルタイム(RT)−PCR画像。上部のバンドは完全長(FL)またはスキップされなかった転写産物を示す。(e)それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。50%(5μgタンパク質)および10%(1μg)のC57BL10対照と比較して、10マイクログラムの総タンパク質をロードし(TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋)、α−アクチニンロード対照に対して正規化した(定量化に関して図38a参照)。 C57BL10対照マウス、mdx未処置マウス、およびPip5e−PMOと比較した1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従って短縮された疎水性コアのPip6−PMOで処置されたマウス(Pip6cおよびPip6d)におけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。(a)C57BL10、mdx未処置およびmdx処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋における対照ラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域(120個の領域)に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された(bにおいて示される)平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図31および32を参照。回復スコアの百分率を下に示す。(c)四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム(q−RT)−PCRにより決定されたΔ23エキソンスキッピングの百分率。(d)TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング(skipped)を示す代表的なリアルタイム(RT)−PCR画像。上部のバンドは完全長(FL)またはスキップされなかった転写産物を示す。(e)それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。50%(5μgタンパク質)および10%(1μg)のC57BL10対照と比較して、10マイクログラムの総タンパク質をロードし(TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋)、α−アクチニンロード対照に対して正規化した(定量化に関して図38a参照)。 C57BL10対照マウス、mdx未処置マウス、およびPip5e−PMOと比較した1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従って短縮された疎水性コアのPip6−PMOで処置されたマウス(Pip6cおよびPip6d)におけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。(a)C57BL10、mdx未処置およびmdx処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋における対照ラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域(120個の領域)に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された(bにおいて示される)平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図31および32を参照。回復スコアの百分率を下に示す。(c)四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム(q−RT)−PCRにより決定されたΔ23エキソンスキッピングの百分率。(d)TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング(skipped)を示す代表的なリアルタイム(RT)−PCR画像。上部のバンドは完全長(FL)またはスキップされなかった転写産物を示す。(e)それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。50%(5μgタンパク質)および10%(1μg)のC57BL10対照と比較して、10マイクログラムの総タンパク質をロードし(TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋)、α−アクチニンロード対照に対して正規化した(定量化に関して図38a参照)。 C57BL10対照、mdx未処置、ならびに1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従うPip6e−PMO誘導体、Pip6gおよびPip6hにおけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。C57BL10対照マウス、mdx未処置マウスならびにPip6gおよびPip6h−PMOで処置されたマウスにおけるジストロフィンに関する免疫組織化学染色を、C57BL10、mdx未処置およびmdx処置マウスに関してTA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋群において実施した。(a)C57BL10、mdx未処置およびmdx処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋におけるラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域(120個の領域)に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された(bにおいて示される)平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図39a,bを参照。b.回復スコアの百分率を下に示す。(c)四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム(q−RT)−PCRにより決定されたΔ23エキソンスキッピングの百分率。(d)TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング(skipped)を示す代表的なリアルタイム(RT)−PCR画像。上部のバンドは完全長(FL)またはスキップされなかった転写産物を示す。(e)それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。50%(5μgタンパク質)および10%(1μg)のC57BL10対照と比較して、10マイクログラムの総タンパク質をロードし(TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋)、α−アクチニンロードタンパク質に対して正規化した(定量化に関して図39c参照)。 C57BL10対照、mdx未処置、ならびに1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従うPip6e−PMO誘導体、Pip6gおよびPip6hにおけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。C57BL10対照マウス、mdx未処置マウスならびにPip6gおよびPip6h−PMOで処置されたマウスにおけるジストロフィンに関する免疫組織化学染色を、C57BL10、mdx未処置およびmdx処置マウスに関してTA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋群において実施した。(a)C57BL10、mdx未処置およびmdx処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋におけるラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域(120個の領域)に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された(bにおいて示される)平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図39a,bを参照。b.回復スコアの百分率を下に示す。(c)四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム(q−RT)−PCRにより決定されたΔ23エキソンスキッピングの百分率。(d)TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング(skipped)を示す代表的なリアルタイム(RT)−PCR画像。上部のバンドは完全長(FL)またはスキップされなかった転写産物を示す。(e)それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。50%(5μgタンパク質)および10%(1μg)のC57BL10対照と比較して、10マイクログラムの総タンパク質をロードし(TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋)、α−アクチニンロードタンパク質に対して正規化した(定量化に関して図39c参照)。 C57BL10対照、mdx未処置、ならびに1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従うPip6e−PMO誘導体、Pip6gおよびPip6hにおけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。C57BL10対照マウス、mdx未処置マウスならびにPip6gおよびPip6h−PMOで処置されたマウスにおけるジストロフィンに関する免疫組織化学染色を、C57BL10、mdx未処置およびmdx処置マウスに関してTA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋群において実施した。(a)C57BL10、mdx未処置およびmdx処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋におけるラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域(120個の領域)に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された(bにおいて示される)平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図39a,bを参照。b.回復スコアの百分率を下に示す。(c)四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム(q−RT)−PCRにより決定されたΔ23エキソンスキッピングの百分率。(d)TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング(skipped)を示す代表的なリアルタイム(RT)−PCR画像。上部のバンドは完全長(FL)またはスキップされなかった転写産物を示す。(e)それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。50%(5μgタンパク質)および10%(1μg)のC57BL10対照と比較して、10マイクログラムの総タンパク質をロードし(TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋)、α−アクチニンロードタンパク質に対して正規化した(定量化に関して図39c参照)。 C57BL10対照、mdx未処置、ならびに1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従うPip6e−PMO誘導体、Pip6gおよびPip6hにおけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。C57BL10対照マウス、mdx未処置マウスならびにPip6gおよびPip6h−PMOで処置されたマウスにおけるジストロフィンに関する免疫組織化学染色を、C57BL10、mdx未処置およびmdx処置マウスに関してTA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋群において実施した。(a)C57BL10、mdx未処置およびmdx処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋におけるラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域(120個の領域)に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された(bにおいて示される)平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図39a,bを参照。b.回復スコアの百分率を下に示す。(c)四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム(q−RT)−PCRにより決定されたΔ23エキソンスキッピングの百分率。(d)TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング(skipped)を示す代表的なリアルタイム(RT)−PCR画像。上部のバンドは完全長(FL)またはスキップされなかった転写産物を示す。(e)それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。50%(5μgタンパク質)および10%(1μg)のC57BL10対照と比較して、10マイクログラムの総タンパク質をロードし(TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋)、α−アクチニンロードタンパク質に対して正規化した(定量化に関して図39c参照)。 C57BL10対照、mdx未処置、ならびに1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従うPip6e−PMO誘導体、Pip6gおよびPip6hにおけるジストロフィンのスプライシングおよびタンパク質修復。C57BL10対照マウス、mdx未処置マウスならびにPip6gおよびPip6h−PMOで処置されたマウスにおけるジストロフィンに関する免疫組織化学染色を、C57BL10、mdx未処置およびmdx処置マウスに関してTA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋群において実施した。(a)C57BL10、mdx未処置およびmdx処置マウスの四頭筋、横隔膜および心筋におけるラミニン対比染色と比較したジストロフィン免疫組織化学染色の定量化。対象のそれぞれの領域(120個の領域)に関する相対強度値をプロットし、そのモデルは繰り返し測定、マルチレベル統計モデルから計算された(bにおいて示される)平均値を概算する。統計的有意性の表に関しては図39a,bを参照。b.回復スコアの百分率を下に示す。(c)四頭筋、横隔膜および心筋において定量的リアルタイム(q−RT)−PCRにより決定されたΔ23エキソンスキッピングの百分率。(d)TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋におけるエキソンスキッピング(skipped)を示す代表的なリアルタイム(RT)−PCR画像。上部のバンドは完全長(FL)またはスキップされなかった転写産物を示す。(e)それぞれの処置に関する代表的なウェスタンブロット画像。50%(5μgタンパク質)および10%(1μg)のC57BL10対照と比較して、10マイクログラムの総タンパク質をロードし(TA、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、心筋および腹筋)、α−アクチニンロードタンパク質に対して正規化した(定量化に関して図39c参照)。 Pip6e−PMOに関するHPLCクロマトグラムおよびMALDI−TOFデータ。(a)精製されたPip6e−PMOコンジュゲートの4.6×250mm C18カラム(溶離液A:0.1%TFA、溶離液B:90%アセトニトリル、10%溶離液A)上での27分間で10〜50%Bの勾配を用いた分析的逆相HPLCクロマトグラム。(b)Pip6e−PMOコンジュゲートのMALDI−TOF質量スペクトル。(c)Pip6−PMOの計算された、および見出された分子量の表。 Pip6e−PMOに関するHPLCクロマトグラムおよびMALDI−TOFデータ。(a)精製されたPip6e−PMOコンジュゲートの4.6×250mm C18カラム(溶離液A:0.1%TFA、溶離液B:90%アセトニトリル、10%溶離液A)上での27分間で10〜50%Bの勾配を用いた分析的逆相HPLCクロマトグラム。(b)Pip6e−PMOコンジュゲートのMALDI−TOF質量スペクトル。(c)Pip6−PMOの計算された、および見出された分子量の表。 Pip6e−PMOに関するHPLCクロマトグラムおよびMALDI−TOFデータ。(a)精製されたPip6e−PMOコンジュゲートの4.6×250mm C18カラム(溶離液A:0.1%TFA、溶離液B:90%アセトニトリル、10%溶離液A)上での27分間で10〜50%Bの勾配を用いた分析的逆相HPLCクロマトグラム。(b)Pip6e−PMOコンジュゲートのMALDI−TOF質量スペクトル。(c)Pip6−PMOの計算された、および見出された分子量の表。 C57BL10対照マウス、mdx未処置マウス、および1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従ってPip6−PMOで処置されたmdxマウスに関するqRT−PCRの平均値の表およびウェスタンブロットの定量化。(a)Pip6−PMOで処置されたmdxマウスに関する平均q−RT−PCR百分率値。(b)Pip6a〜f処置のTA、四頭筋、横隔膜および心筋に関するウェスタンブロットの定量化を計算した。全ての処置(n=3)に関するそれぞれのマウスに関してウェスタンブロットを実施し、50%および10%C57BL10対照に対して定量化し、それを平均した。 C57BL10対照マウス、mdx未処置マウス、および1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従ってPip6e−PMO誘導体(Pip6gおよびPip6h)で処置されたmdxマウスに関する定量的免疫組織化学染色に関する統計表、qRT−PCRの平均値の表およびウェスタンブロットの定量化。未処置のmdxマウス(a)またはPip6eで処置されたマウス(b)と比較したPip6gおよびPip6hで処置されたmdxマウスに関する四頭筋、横隔膜、および心筋の免疫組織化学染色に関する統計的有意性の表。統計的有意性は、繰り返し測定、マルチレベル統計モデルを用いて決定された(****=p<0.0001、***=p<0.001、**=p<0.01、*=p<0.05、N/S=有意ではない)。(c)Pip6gおよびPip6h−PMOで処置されたmdxマウスに関する平均q−RT−PCR百分率値。(d)Pip6gおよびPip6hのTA、四頭筋、横隔膜および心組織に関するウェスタンブロットの定量化を計算した。全ての処置(n=3)に関するそれぞれのマウスに関してウェスタンブロットを実施し、50%および10%C57BL10対照に対して定量化し、それを平均した。 C57BL10対照マウス、mdx未処置マウス、および1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従ってPip6e−PMO誘導体(Pip6gおよびPip6h)で処置されたmdxマウスに関する定量的免疫組織化学染色に関する統計表、qRT−PCRの平均値の表およびウェスタンブロットの定量化。未処置のmdxマウス(a)またはPip6eで処置されたマウス(b)と比較したPip6gおよびPip6hで処置されたmdxマウスに関する四頭筋、横隔膜、および心筋の免疫組織化学染色に関する統計的有意性の表。統計的有意性は、繰り返し測定、マルチレベル統計モデルを用いて決定された(****=p<0.0001、***=p<0.001、**=p<0.01、*=p<0.05、N/S=有意ではない)。(c)Pip6gおよびPip6h−PMOで処置されたmdxマウスに関する平均q−RT−PCR百分率値。(d)Pip6gおよびPip6hのTA、四頭筋、横隔膜および心組織に関するウェスタンブロットの定量化を計算した。全ての処置(n=3)に関するそれぞれのマウスに関してウェスタンブロットを実施し、50%および10%C57BL10対照に対して定量化し、それを平均した。 C57BL10対照マウス、mdx未処置マウス、および1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従ってPip6e−PMO誘導体(Pip6gおよびPip6h)で処置されたmdxマウスに関する定量的免疫組織化学染色に関する統計表、qRT−PCRの平均値の表およびウェスタンブロットの定量化。未処置のmdxマウス(a)またはPip6eで処置されたマウス(b)と比較したPip6gおよびPip6hで処置されたmdxマウスに関する四頭筋、横隔膜、および心筋の免疫組織化学染色に関する統計的有意性の表。統計的有意性は、繰り返し測定、マルチレベル統計モデルを用いて決定された(****=p<0.0001、***=p<0.001、**=p<0.01、*=p<0.05、N/S=有意ではない)。(c)Pip6gおよびPip6h−PMOで処置されたmdxマウスに関する平均q−RT−PCR百分率値。(d)Pip6gおよびPip6hのTA、四頭筋、横隔膜および心組織に関するウェスタンブロットの定量化を計算した。全ての処置(n=3)に関するそれぞれのマウスに関してウェスタンブロットを実施し、50%および10%C57BL10対照に対して定量化し、それを平均した。 C57BL10対照マウス、mdx未処置マウス、および1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従ってPip6e−PMO誘導体(Pip6gおよびPip6h)で処置されたmdxマウスに関する定量的免疫組織化学染色に関する統計表、qRT−PCRの平均値の表およびウェスタンブロットの定量化。未処置のmdxマウス(a)またはPip6eで処置されたマウス(b)と比較したPip6gおよびPip6hで処置されたmdxマウスに関する四頭筋、横隔膜、および心筋の免疫組織化学染色に関する統計的有意性の表。統計的有意性は、繰り返し測定、マルチレベル統計モデルを用いて決定された(****=p<0.0001、***=p<0.001、**=p<0.01、*=p<0.05、N/S=有意ではない)。(c)Pip6gおよびPip6h−PMOで処置されたmdxマウスに関する平均q−RT−PCR百分率値。(d)Pip6gおよびPip6hのTA、四頭筋、横隔膜および心組織に関するウェスタンブロットの定量化を計算した。全ての処置(n=3)に関するそれぞれのマウスに関してウェスタンブロットを実施し、50%および10%C57BL10対照に対して定量化し、それを平均した。 C57BL10対照マウス、mdx未処置マウス、1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従ってPip6−PMOおよびPip5e−PMOで処置されたマウスの血液試料において評価された毒性アッセイ。(a)mdx未処置および処置マウスと比較したC57BL10対照マウスにおける血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびクレアチンキナーゼのレベルの測定。(b)mdx未処置および処置マウスと比較したC57BL10対照マウスにおける血清血液尿素窒素(BUN)およびクレアチチン(creatitine)レベルの測定。 C57BL10対照マウス、mdx未処置マウス、1回の12.5mg/kgの静脈内注射に従ってPip6−PMOおよびPip5e−PMOで処置されたマウスの血液試料において評価された毒性アッセイ。(a)mdx未処置および処置マウスと比較したC57BL10対照マウスにおける血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびクレアチンキナーゼのレベルの測定。(b)mdx未処置および処置マウスと比較したC57BL10対照マウスにおける血清血液尿素窒素(BUN)およびクレアチチン(creatitine)レベルの測定。 Pip−8d、Pip−8d2、Pip−8d3、Pip−9b、Pip−9b2、Pip−9c、Pip−9c2、Pip−9c3、Pip−9d、Pip−9d2、Pip−9d3、Pip−9d4のアミノ酸配列を示す表。ドメイン1、2および3中の残基の総数およびArg、XおよびB残基の数も示す。 Pip7、Pip8およびPip9−PMOで処置されたmdx筋管における細胞生存度を示すチャート。 mdxマウスにおける静脈内投与後のPip7−PMOコンジュゲートのスクリーニング(Screen)。8週齢のmdxマウスにおけるPip6e、Pip7a、Pip7bおよびPip7b2の12.5mg/kg用量での1回の静脈内注射後のジストロフィン発現。(a)より短いエキソンスキッピングされたバンドにより示されるRNAレベルでのエキソンスキッピング効率を検出するための逆転写酵素(RT)−PCR。(b)Pip7−PMOコンジュゲートで処置されたmdxマウスからのTA、四頭筋、横隔膜および心筋のウェスタンブロット分析。注射の2週間後に処置されたmdxマウスの4種類の異なる筋肉から総タンパク質を抽出した。処置された筋試料からの10マイクログラムの総タンパク質をロードした。α−アクチニンをロード対照として用いた。 mdxマウスにおける静脈内投与後のPip7−PMOコンジュゲートのスクリーニング(Screen)。8週齢のmdxマウスにおけるPip6e、Pip7a、Pip7bおよびPip7b2の12.5mg/kg用量での1回の静脈内注射後のジストロフィン発現。(a)より短いエキソンスキッピングされたバンドにより示されるRNAレベルでのエキソンスキッピング効率を検出するための逆転写酵素(RT)−PCR。(b)Pip7−PMOコンジュゲートで処置されたmdxマウスからのTA、四頭筋、横隔膜および心筋のウェスタンブロット分析。注射の2週間後に処置されたmdxマウスの4種類の異なる筋肉から総タンパク質を抽出した。処置された筋試料からの10マイクログラムの総タンパク質をロードした。α−アクチニンをロード対照として用いた。 mdxマウスにおける静脈内投与後のPip8−PMOコンジュゲートのスクリーニング。8週齢のmdxマウスにおけるPip8b、Pip8cおよびPip8c2の12.5mg/kg用量での1回の静脈内注射後のジストロフィン発現。(a)より短いエキソンスキッピングされたバンドにより示されるRNAレベルでのエキソンスキッピング効率を検出するための逆転写酵素(RT)−PCR。(b)Pip8−PMOコンジュゲートで処置されたmdxマウスからのTA、四頭筋、横隔膜および心筋のウェスタンブロット分析。注射の2週間後に処置されたmdxマウスの4種類の異なる筋肉から総タンパク質を抽出した。処置された筋試料からの10マイクログラムの総タンパク質をロードした。α−アクチニンをロード対照として用いた。 mdxマウスにおける静脈内投与後のPip8−PMOコンジュゲートのスクリーニング。8週齢のmdxマウスにおけるPip8b、Pip8cおよびPip8c2の12.5mg/kg用量での1回の静脈内注射後のジストロフィン発現。(a)より短いエキソンスキッピングされたバンドにより示されるRNAレベルでのエキソンスキッピング効率を検出するための逆転写酵素(RT)−PCR。(b)Pip8−PMOコンジュゲートで処置されたmdxマウスからのTA、四頭筋、横隔膜および心筋のウェスタンブロット分析。注射の2週間後に処置されたmdxマウスの4種類の異なる筋肉から総タンパク質を抽出した。処置された筋試料からの10マイクログラムの総タンパク質をロードした。α−アクチニンをロード対照として用いた。 mdxマウスにおける静脈内投与後のPip9−PMOコンジュゲートのスクリーニング。8週齢のmdxマウスにおけるPip9b、Pip9b2、Pip9c、Pip9dおよびPip9d2の12.5mg/kg用量での1回の静脈内注射後のジストロフィン発現。(a)より短いエキソンスキッピングされたバンドにより示されるRNAレベルでのエキソンスキッピング効率を検出するための逆転写酵素(RT)−PCR。(b)Pip9−PMOコンジュゲートで処置されたmdxマウスからのTA、四頭筋、横隔膜および心筋のウェスタンブロット分析。注射の2週間後に処置されたmdxマウスの4種類の異なる筋肉から総タンパク質を抽出した。処置された筋試料からの10マイクログラムの総タンパク質をロードした。α−アクチニンをロード対照として用いた。 mdxマウスにおける静脈内投与後のPip9−PMOコンジュゲートのスクリーニング。8週齢のmdxマウスにおけるPip9b、Pip9b2、Pip9c、Pip9dおよびPip9d2の12.5mg/kg用量での1回の静脈内注射後のジストロフィン発現。(a)より短いエキソンスキッピングされたバンドにより示されるRNAレベルでのエキソンスキッピング効率を検出するための逆転写酵素(RT)−PCR。(b)Pip9−PMOコンジュゲートで処置されたmdxマウスからのTA、四頭筋、横隔膜および心筋のウェスタンブロット分析。注射の2週間後に処置されたmdxマウスの4種類の異なる筋肉から総タンパク質を抽出した。処置された筋試料からの10マイクログラムの総タンパク質をロードした。α−アクチニンをロード対照として用いた。 Pip7〜9−PMOを用いた静脈内注射後のジストロフィン修復の半定量分析。TA、四頭筋、横隔膜および心筋を免疫染色し、ImageProを用いて分析してジストロフィン発現を示し、定量化した。(a)ジストロフィン抗体を用いてジストロフィン免疫染色された線維の強度を、ラット抗ラミニンを正規化のために用いて以前に報告されたように(Arechavala-Gomeza et al., 2010)Image Proソフトウェアにより分析し、C57BL/10の筋肉の強度レベルの百分率として表した。対象のそれぞれの領域(120個の領域)に関する相対強度値をプロットし、平均強度を計算した(赤い棒により表した)。(b)ジストロフィン染色強度をC57BL/10(100%)およびmdx(0%)の筋肉の平均値に対して正規化した。それぞれの動物(n=3)に関する回復スコアをプロットし、平均回復スコアを計算した(赤い棒により表した)。(平均−SEM;n=3;一元配置ANOVA検定:mdxおよびC57対照と比較して、ns、有意ではない、*p<0.05、**<0.001、***<0.0001)。 Pip7〜9−PMOを用いた静脈内注射後のジストロフィン修復の半定量分析。TA、四頭筋、横隔膜および心筋を免疫染色し、ImageProを用いて分析してジストロフィン発現を示し、定量化した。(a)ジストロフィン抗体を用いてジストロフィン免疫染色された線維の強度を、ラット抗ラミニンを正規化のために用いて以前に報告されたように(Arechavala-Gomeza et al., 2010)Image Proソフトウェアにより分析し、C57BL/10の筋肉の強度レベルの百分率として表した。対象のそれぞれの領域(120個の領域)に関する相対強度値をプロットし、平均強度を計算した(赤い棒により表した)。(b)ジストロフィン染色強度をC57BL/10(100%)およびmdx(0%)の筋肉の平均値に対して正規化した。それぞれの動物(n=3)に関する回復スコアをプロットし、平均回復スコアを計算した(赤い棒により表した)。(平均−SEM;n=3;一元配置ANOVA検定:mdxおよびC57対照と比較して、ns、有意ではない、*p<0.05、**<0.001、***<0.0001)。 12.5mg/kgの用量でのPip7〜9−PMOコンジュゲートにより処置されたmdxマウスにおける肝および腎機能の血清マーカーの臨床生化学。血清をマウスの頚静脈から注射の2週間後におけるCO吸入による屠殺の直後に採取した。血清クレアチンキナーゼ、クレアチニン、尿素、アルカリホスファターゼ(ALP)、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、総ビリルビン、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)レベルの分析を実施した。(平均−SEM;n=3;両側t検定:mdxまたはC57BL/10のどちらかと比較して、ns、有意ではない、*p<0.05、**<0.001、***<0.0001)。 12.5mg/kgの用量でのPip7〜9−PMOコンジュゲートにより処置されたmdxマウスにおける肝および腎機能の血清マーカーの臨床生化学。血清をマウスの頚静脈から注射の2週間後におけるCO吸入による屠殺の直後に採取した。血清クレアチンキナーゼ、クレアチニン、尿素、アルカリホスファターゼ(ALP)、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、総ビリルビン、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)レベルの分析を実施した。(平均−SEM;n=3;両側t検定:mdxまたはC57BL/10のどちらかと比較して、ns、有意ではない、*p<0.05、**<0.001、***<0.0001)。 PPMO候補を用いた静脈内注射後のジストロフィン修復の半定量分析。TAおよび心筋をジストロフィン抗体を用いて免疫染色し、ImageProを用いて分析してジストロフィン発現を示し、定量化した。(a)ラット抗ラミニンを正規化のために用いて以前に報告された(Arechavala-Gomeza et al., 2010)ようにImage Proソフトウェアにより分析し、C57BL/10の筋肉の強度レベルの百分率として表した、ジストロフィン抗体を用いてジストロフィン免疫染色された線維の強度を示すチャート。対象のそれぞれの領域(120個の領域)に関する相対強度値をプロットし、平均強度を計算した(赤い棒により表した)。(b)C57BL/10(100%)およびmdx(0%)の筋肉の平均値に対して正規化したジストロフィン染色強度を示すチャート。それぞれの動物(n=3)に関する回復スコアをプロットし、平均回復スコアを計算した(横棒により表した)。 mdxマウスにおける静脈内投与後のPPMO候補の比較。8週齢のmdxマウスにおけるPip8b、9b、9b2、8c、9cおよび9d2の12.5mg/kg用量での1回の静脈内注射後にエキソンスキッピングされたジストロフィンRNAのレベルを評価した。より短いエキソンスキッピングされたバンドにより示されるRNAレベルでのエキソンスキッピング効率を検出するための逆転写酵素(RT)−PCR。 mdxマウスにおけるPPMO候補の静脈内投与後のジストロフィンタンパク質レベルの定量化。PPMO候補を用いて処置されたmdxマウスからのTA、四頭筋、横隔膜および心筋のウェスタンブロット分析。Pip8b、9b、9b2、8c、9cおよび9d2の12.5mg/kg用量での注射の2週間後に、処置されたmdxマウスの4種類の異なる筋肉から総タンパク質を抽出した。処置された筋試料からの15マイクログラムの総タンパク質をロードした。ビンキュリンをロード対照として用いた。(a)PPMO候補を用いて処置されたmdxマウスからのTA、四頭筋、横隔膜および心筋の代表的なウェスタンブロット画像。(b)Licorソフトウェアを用いたジストロフィンタンパク質の半定量分析を示すチャート;ビンキュリンをロード対照として用いた。バンドの密度をそのそれぞれのビンキュリンのバンドにより正規化し、これをC57BL/10の筋肉のジストロフィン発現レベルの百分率として表した。 mdxマウスにおけるPPMO候補の静脈内投与後のジストロフィンタンパク質レベルの定量化。PPMO候補を用いて処置されたmdxマウスからのTA、四頭筋、横隔膜および心筋のウェスタンブロット分析。Pip8b、9b、9b2、8c、9cおよび9d2の12.5mg/kg用量での注射の2週間後に、処置されたmdxマウスの4種類の異なる筋肉から総タンパク質を抽出した。処置された筋試料からの15マイクログラムの総タンパク質をロードした。ビンキュリンをロード対照として用いた。(a)PPMO候補を用いて処置されたmdxマウスからのTA、四頭筋、横隔膜および心筋の代表的なウェスタンブロット画像。(b)Licorソフトウェアを用いたジストロフィンタンパク質の半定量分析を示すチャート;ビンキュリンをロード対照として用いた。バンドの密度をそのそれぞれのビンキュリンのバンドにより正規化し、これをC57BL/10の筋肉のジストロフィン発現レベルの百分率として表した。 PPMOで処置されたmdxの血清中のジストロmir(dystromir)の発現を示すチャート。8週齢における12.5mg/kgのPPMO候補(Pip8b、9b、9b2、8cおよび9c)の静脈内注射の2週間後に、血清をマウスの頚静脈からCO2吸入による屠殺の直後に採取した。miR−133aおよびmiR−206のレベルをPPMO処置したmdxマウスの血清においてQ−PCRにより調べ、miR−223に対して正規化した。miR−133aおよびmiR−206のレベルはPPMO処置したmdxマウスの血清において未処置のmdx対象と比較して有意に下方制御された。 mdxマウスにおけるHPLCおよびフィルター脱塩したPip9b2とコンジュゲートしたPMOの静脈内投与後のエキソンスキッピング効率の比較。8週齢のmdxマウスにおけるHPLCおよびフィルター脱塩したPip9b−PMOの12.5mg/kgの用量での1回の静脈内注射後のジストロフィン発現。そのチャートはジストロフィン修復の半定量分析を示す。ジストロフィン抗体を用いてジストロフィン免疫染色された線維の強度を、ラット抗ラミニンを正規化のために用いて以前に報告されたように(Arechavala-Gomeza et al., 2010)Image Proソフトウェアにより分析し、C57BL/10の筋肉の強度レベルの百分率として表した。対象のそれぞれの領域(120個の領域)に関する相対強度値をプロットし、平均強度を計算した(左側のパネル;棒により表した)。ジストロフィン染色強度をC57BL/10(100%)およびmdx(0%)の筋肉の平均値に対して正規化した。それぞれの動物(n=4)に関する回復スコアをプロットし、平均回復スコアを計算した(右側のパネル;棒により表した)。 mdxマウスにおけるPip9b2とコンジュゲートしたPMOの静脈内投与後のジストロフィンRNAおよびタンパク質レベルの比較。Pip9b2を用いて処置されたmdxマウスからのTA、四頭筋、横隔膜および心筋のウェスタンブロット分析。Pip9b2−PMOの12.5mg/kg用量での注射の2週間後に、処置されたmdxマウスの4種類の異なる筋肉から総タンパク質を抽出した。処置された筋試料からの15マイクログラムの総タンパク質をロードした。ビンキュリンをロード対照として用いた。(a)PPMO候補を用いて処置されたmdxマウスからのTA、四頭筋、横隔膜および心筋の代表的なウェスタンブロット画像。(b)Licorソフトウェアを用いたジストロフィンタンパク質の半定量分析を示すチャート;ビンキュリンをロード対照として用いた。バンドの密度をそのそれぞれのビンキュリンのバンドにより正規化し、これをC57BL/10の筋肉のジストロフィン発現レベルの百分率として表した。(c)より短いエキソンスキッピングされたバンドにより示されるRNAレベルでのエキソンスキッピング効率を検出するための逆転写酵素(RT)−PCR。 mdxマウスにおけるPip9b2とコンジュゲートしたPMOの静脈内投与後のジストロフィンRNAおよびタンパク質レベルの比較。Pip9b2を用いて処置されたmdxマウスからのTA、四頭筋、横隔膜および心筋のウェスタンブロット分析。Pip9b2−PMOの12.5mg/kg用量での注射の2週間後に、処置されたmdxマウスの4種類の異なる筋肉から総タンパク質を抽出した。処置された筋試料からの15マイクログラムの総タンパク質をロードした。ビンキュリンをロード対照として用いた。(a)PPMO候補を用いて処置されたmdxマウスからのTA、四頭筋、横隔膜および心筋の代表的なウェスタンブロット画像。(b)Licorソフトウェアを用いたジストロフィンタンパク質の半定量分析を示すチャート;ビンキュリンをロード対照として用いた。バンドの密度をそのそれぞれのビンキュリンのバンドにより正規化し、これをC57BL/10の筋肉のジストロフィン発現レベルの百分率として表した。(c)より短いエキソンスキッピングされたバンドにより示されるRNAレベルでのエキソンスキッピング効率を検出するための逆転写酵素(RT)−PCR。 Pip9b2−PMOで処置されたmdx筋管における細胞生存度を示すチャート。 アミノヘキサン酸(アミノカプロン酸)の構造。 ベータアラニン(3−アミノプロパン酸)の構造。 Pip7a−PMO、Pip7b−PMO、Pip7b2−PMO、Pip7c−PMO、Pip7c2−PMO、Pip7d−PNOの細胞生存度(培養されたHuh−7肝細胞)を添加されたPip−PMOの濃度の関数として示すグラフ。 Pip8a−PMO、Pip8b−PMO、Pip8c−PMOの細胞生存度(培養されたHuh−7肝細胞)を添加されたPip−PMOの濃度の関数として示すグラフ。 分化したマウスH2K mdx筋肉筋管におけるPMO−ペプチド(Pip7a、Pip7b、Pip7b2、Pip7c、Pip7c2、Pip7d)のエキソンスキッピング活性を示すグラフ。H2K mdx筋管を、0.125μM〜2μMの範囲の濃度のペプチド−PMOコンジュゲートと共に、形質移入試薬を使用せずにインキュベーションした。ネステッドRT−PCRの産物を2%アガロースゲル上での電気泳動により調べた。エキソンスキッピング活性はデンシトメトリーにより計算されるΔ23スキッピングの百分率として示される。 分化したマウスH2K mdx筋肉筋管におけるPMO−ペプチド(Pip8a、Pip8b、Pip8c、Pip8c2、Pip8d)のエキソンスキッピング活性を示すグラフ。H2K mdx筋管を、0.125μM〜2μMの範囲の濃度のペプチド−PMOコンジュゲートと共に、形質移入試薬を使用せずにインキュベーションした。ネステッドRT−PCRの産物を2%アガロースゲル上での電気泳動により調べた。エキソンスキッピング活性はデンシトメトリーにより計算されるΔ23スキッピングの百分率として示される。 分化したマウスH2K mdx筋肉筋管におけるPMO−ペプチド(Pip9b、Pip9b2、Pip9c、Pip9c2、Pip9c3、Pip9d、Pip9d2)のエキソンスキッピング活性を示すグラフ。H2K mdx筋管を、0.125μM〜2μMの範囲の濃度のペプチド−PMOコンジュゲートと共に、形質移入試薬を使用せずにインキュベーションした。ネステッドRT−PCRの産物を2%アガロースゲル上での電気泳動により調べた。エキソンスキッピング活性はデンシトメトリーにより計算されるΔ23スキッピングの百分率として示される。
本発明の1個以上の態様の詳細を、本発明を実施するために本発明者らが意図する最高の方式の具体的な詳細を含めて下記の添付の記述で例として述べる。当業者には、本発明はこれらの具体的な詳細に限定されることなく実施されてよいことは明らかであろう。
本発明者らは、既に開示されたPip5e−PMOと比較してデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)のmdxマウスモデルにおける心筋中の高いエキソンスキッピングおよびジストロフィン産生を得る一方で全ての筋タイプにわたる高い活性を維持する上での中央の疎水性コア配列の役割を調べるために、PMOへのコンジュゲーションのために設計された細胞透過性ペプチドのさらなる系列を設計した。特に、本発明者らは、a)心筋におけるPMOカーゴの高められた送達を示し、かつb)低い毒性を有するCPPを設計することを求めてきた。
これを考慮して、本発明者らは2つの主な観点において前に開示されたPip−2〜Pip−5系列と異なる一連のペプチドを設計している。
1)ドメイン2の疎水性コアのアミノ酸の配列が逆になっている、または混ぜられている。
2)カーゴ送達および細胞毒性への作用を決定するために、アルギニン残基の数が系統的に変更されている。
我々は、既に開示されたPip5e−PMOと比較してデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)のmdxマウスモデルにおける心筋中の高いエキソンスキッピングおよびジストロフィン産生を得る一方で全ての筋タイプにわたる高い活性を維持する上での中央の疎水性コアの役割を調べるためのPMOへのコンジュゲーションのために設計した一連のペプチドを記述する。
実施例1
我々は以前に、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたアルギニンに富む細胞透過性ペプチド:Pip5e−PMOの1回投与後の高いスプライシング効率およびジストロフィン修復を含む印象的な心臓活性を報告してきた。しかし、この活性の基礎をなす機序は不十分にしか理解されていない。
ここで、我々は、そのPip5eペプチドの疎水性コア領域に変異を含有するPip5e−PMOの一連の誘導体(連続的にPip6−PMOと割り当てる)の1回量投与(12.5mg/kg)を含む研究の結果を報告し、ここでこの中央のコア領域のアミノ酸配列は反転し、混ぜられ、または部分的に削除されている。これらの変化は、その対応するPip6−PMOコンジュゲートの1回の低用量の静脈内注射の後に、心臓を含む多数の筋群におけるエキソンスキッピングおよびジストロフィン修復のレベルに影響を及ぼす。その結果は、コアの長さにおける低減は心臓活性を低減するため、5アミノ酸(5−aa)のコアの長さが心臓のジストロフィン産生に必須であるようであることを示している。意外にも、1個のアルギニン残基はその疎水性コアの1つの位置において(部分的に)許容されたが、2個のアルギニン残基は許容されず、異なる位置における1個のアルギニンも許容されなかった。驚くべきことに、骨格のジストロフィン産生もこれらの2つの後者の場合において低減した。我々のデータは、Pip配列の疎水性コアは心臓へのPMOの送達に決定的に重要であり、この領域への特定の修飾は活性をさらに高め得ることを示している。その結果は、DMDに関する療法用PMOの開発に関する含意を有する。
結果
Pip6 CPP系列の開発
我々の以前のリードPip系列のCPPであるPip5e[Yin, H., et al., Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(7): p. 1295-303]は、2個のアルギニンに富む側方の(flanking)領域および中央の疎水性コアを含有する。優れた心臓ジストロフィン産生の維持に関するその疎水性コアの構成の必要条件をさらに調べるため、我々は、その疎水性コア領域にのみ変異がなされている(例えばコア領域が混ぜられている、および部分的に削除されているペプチド)ある範囲のPip5e誘導体ペプチド(Pip6a〜f)を合成した。
Pip6eを除いて、全てのペプチドはPip5eにおけるように側方の配列において同じ数のアルギニン残基(10)を含有していた。これらのペプチドを、以前にmdxマウスにおけるエキソンスキッピングに関して検証されたジストロフィンのエキソン23に相補的な25マーのPMO[Yin, H., et al., Cell-penetrating peptide-conjugated antisense oligonucleotides restore systemic muscle and cardiac dystrophin expression and function. Hum Mol Genet, 2008. 17(24): p. 3909-18; Yin, H., et al., A fusion peptide directs enhanced systemic dystrophin exon skipping and functional restoration in dystrophin-deficient mdx mice. Hum Mol Genet, 2009. 18(22): p. 4405-14.]にコンジュゲートした。我々が以前に利用したPMOの5’末端へのコンジュゲーションの方法[Yin et al、上記]とは対照的に、Pip6−PMOコンジュゲートはPMOの3’末端のPipペプチドのC末端カルボン酸部分へのコンジュゲーションにより調製された。我々は、PMOの3’末端に、または5’末端にコンジュゲートされたPip5e−PMOに関するインビボでのジストロフィン産生またはエキソンスキッピング活性の間に有意な差がないことを報告しており、従ってこれらの実験に関して3’末端コンジュゲーションを利用することを選択した[Saleh AF, A.A.A., Yin H, Betts C, Hammond S, Wood MJA and Gait MJ, Enhancement of exon skipping and dystrophin production by 3'-peptide conjugates of morpholino (PMO) oligonucleotides in a mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy in Collection Symposium Series, Chemistry of Nucleic Acid Components. 2011, Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academyof Sciences of the Czech Republic: Prague, p. 292-296]。
代替カーゴPMOオリゴヌクレオチドのPipコンジュゲートの合成
PMO 25マーM23D(+7−18)(5’−GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT−3’[SEQ ID NO:310])(PMODMD)は、mdxマウスにおけるエキソンスキッピングに適したオリゴヌクレオチド類似体として一般的に用いられている37,42,43,44。これらの例の多くで、Bペプチド(配列RXRRBRRXRRBRXB[SEQ ID NO:311])をPMODMDにコンジュゲートし、そのままの(naked)PMODMDと比較してmdxマウスにおける筋内または静脈内送達によるエキソンスキッピングおよびジストロフィン産生を有意に増進することが示された。Bペプチド((RXR)XBとXのB単位による2個のみの置換により異なる)は、DMD処置のためのPMOとのコンジュゲーションにおける臨床試験開発のためのリード候補ペプチドである43
そのペプチドは、Libertyマイクロ波ペプチド合成装置(CEM)上の標準的なFmocに基づく固相合成により合成された。ペプチドをトリイソプロピルシラン(1%)、1,2−エタンジチオール(2.5%)および水(2.5%)の存在下でのトリフルオロ酢酸(TFA、94%)を用いた処理により樹脂から切り離し、逆相HPLCにより精製し、Applied Biosystems Voyager DE−PRO上でのアセトニトリル/3%水性TFA(1:1、v/v)中で溶解させたβ−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸(10mg/ml)のマトリックスを用いたMALDI−TOF質量分析により分析した。
ペプチドPip−6a〜Pip−6i、Pip−7a〜Pip−7c2およびPip8a〜Pip−8c2のアミノ酸配列を図18において示す。
Pip−6a〜Pip−6i、Pip−7a〜Pip−7c2およびPip8a〜Pip−8c2ならびに対照のBペプチドを、PMODMDのコンジュゲートとして合成した。ペプチドをC末端カルボン酸の25マーPMOの3’末端へのアミドカップリング反応によりコンジュゲートした(Yin et al. Molecular Therapy Vol.19, No.7 1295-1303, July 2011を参照)。簡潔には、3’−アミド結合を以下のように実施した:DMSO中のPMO(100nmole)を、2倍過剰量のペプチドと、NMP中でTBTU:HOAt:DIEA(ペプチドに対して2.5:1.8:1.7モル過剰)を用いて37℃において2時間カップリングさせた。そのコンジュゲートを陽イオン交換HPLC(Source 15S,GE Healthcare)により精製し、HLBカラム(Waters)上で脱塩した。
分化したH2K mdx筋肉筋管における細胞培養エキソンスキッピングアッセイ
Pip6−PMOコンジュゲートのエキソンスキッピングの可能性を、分化したマウスH2K mdx筋管において、一切の形質移入試薬の非存在下で(図1)、0.125μMから1μMまでの範囲の濃度で評価した。これは、培養された筋細胞におけるエキソンスキッピング活性は、Pip5e−PMOを含め、これらのコンストラクト全てに関して非常に類似していることを示した。これらの結果は、側方のアルギニンに富む配列は大部分が一定数のアルギニン残基(10)を含有していたが間隔をアミノヘキサノイル(アミノヘキサン酸)およびβアラニン単位を代替で配置することにより変動させていた以前のPip5系列[Yin et al、上記]とは異なっている。これは結果として、インビボでの活性とよく相関するエキソンスキッピング活性における小さな変動をもたらした。Pip6配列の場合、側方のアルギニンに富む配列は同一である(Pip6eを除く、それはコアの2番目の位置中に置換されているコアの直前の1個のアルギニンを除いて同一である)。その結果は、細胞のエキソンスキッピング活性はその疎水性コアの配列または長さに依存しないことを実証している。我々は以前にインビトロでのエキソンスキッピング活性における主な変化はむしろアルギニン残基の総数と相関していることを示していることを特筆する[Saleh, A.F., et al., Synthesis and splice-redirecting activity of branched, arginine-rich peptide dendrimer conjugates of peptide nucleic acid oligonucleotides. Bioconjug Chem, 2010. 21(10): p. 1902-11.]。
H2K mdx筋管は、雄のH2K mdx f2マウスのEDL筋から得られたH2K mdx筋芽細胞に由来する。その細胞はジストロフィン欠損であり、熱不安定性シミアンウイルス40ラージ腫瘍抗原(tsA58)の発現により条件付き不死である。その筋芽細胞はリッチ培養(rich culture)において33℃(10%CO)で増殖し、ウマ血清を含む培地中で37℃で筋管に分化する。
H2K mdx筋管を調製し、わずかな変更があることを除いて以前に記述された方法(Wang, Q, Yin, H, et al. (2010) In vitro evaluation of novel antisense oligonucleotides is predictive of in vivo exon skipping activity for Duchenne muscular dystrophy)により、ペプチド−PNAおよびペプチド−PMOコンジュゲートと共に一切の形質移入剤の非存在下でインキュベーションした。
ゼラチンコートされた24ウェルプレート中に蒔いたコンフルエントなH2K mdx細胞から血清欠乏(5%ウマ血清を含むDMEM)の2日後に筋管を得た。コンジュゲートを0.5mlのOptiMEM中で筋管と共に4時間インキュベーションし、次いでさらなる培養のために1mlのDMEM/5%ウマ血清培地により置き換えた。20時間後、筋管をPBSで2回洗浄し、総RNAを0.5mlのTRI試薬(Sigma,英国)で抽出した。RNA調製物をRNアーゼを含まないDNアーゼ(2U)およびプロテイナーゼK(20mg)で処理した後、RT−PCR分析を行った。RT−PCRは、25μL中で1μgのRNA鋳型を用いて、Superscript III One−Step RTPCR System with Platinum Taq DNA polymerase(Invitrogen)を用いて、順方向プライマー5’CAG AAT TCT GCC AAT TGC TGAG3’[SEQ ID NO:312]および逆方向プライマー5’TTC TTC AGC TTG TGT CAT CC3’[SEQ ID NO:313]をプライマーとして(primed)実施された。最初のcDNA合成を55℃で30分間実施し、続いて30サイクルの95℃で30秒間、55℃で1分間、および68℃で80秒間を行った。次いでRT PCR産物(1mL)を、25μL中で0.5UのSuper TAQポリメラーゼ(HT Biotechnologies)を用いて順方向プライマー5’CCC AGT CTA CCA CCC TAT CAG AGC3’[SEQ ID NO:314]および逆方向プライマー5’CCT GCC TTT AAG GCT TCC TT3’[SEQ ID NO:315]をプライマーとして実施される二次PCRのための鋳型として用いた。サイクル条件は、95℃で1分間、57℃で1分間および72℃で80秒間を25サイクルであった。生成物を2%アガロースゲルにより調べ、Gene Tools分析ソフトウェア(SynGene)を用いた走査後、エキソン23スキッピングの相対量を3つの実験の複製にわたって平均されたコンジュゲートの所与の濃度における百分率として表した。
その結果(図1)は、Pip−6a−PMO、Pip−6b−PMO、Pip−6c−PMO、Pip−6d−PMO、Pip−6e−PMOおよびPip−6f−PMOコンジュゲートの全てがmdx筋細胞において高いエキソンスキッピング活性を与えることを示した。
Pip−6g−PMO、Pip−6h−PMO、Pip−6i−PMO、Pip−7a−PMO、Pip−7b−PMO、Pip−7b2−PMO、Pip−7c2、Pip−8a−PMO、Pip−8b、およびPip−8cコンジュゲートもmdx筋細胞において高いエキソンスキッピング活性を与え、Pip7cおよびPip7dは中程度のエキソンスキッピングを与えた(図2〜5)。
Pip6−PMOコンジュゲートのmdxマウスにおけるインビボアッセイ
心組織におけるPip5e−PMOの効力を考えると、疎水性コアの配列を(5−aaの長さを維持しながら)変更する目的は、より低い用量でより効率的であり得るペプチドを同定することであった。これらの修飾には、その疎水性領域の反転(Pip6a)、チロシンのイソロイシンによる置換(Pip6b)、第1のアルギニンに富む側方領域中のそのコアに直接隣接するアルギニンの置換によるPip6a配列中のグルタミンの置換(Pip6e)、および混ぜられた疎水性コアの配列(Pip6f)が含まれていた。全てのPip6ペプチド−PMOコンジュゲートをmdxマウスに1回の12.5mg/kgの尾静脈経由の静脈内注射として投与し、2週間後に組織を採取し、RNAおよびタンパク質レベル両方で活性に関して評価した。
全ての5−aaコアPip6−PMOに関するジストロフィン発現の免疫組織化学染色は、TA、横隔膜、および心臓を含め、骨格筋における高レベルのジストロフィン産生を明らかにした。免疫組織化学染色の定量化(図34a,b)は以前に記述されたように実施され[Malerba, A., et al., Chronic systemic therapy with low-dose morpholino oligomers ameliorates the pathology and normalizes locomotor behavior in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(2): p. 345-54; Arechavala-Gomeza, V., et al., Immunohistological intensity measurements as a tool to assess sarcolemma-associated protein expression. Neuropathol Appl Neurobiol, 2010. 36(4): p. 265-74.]、それぞれのペプチド−PMO処置に関する四頭筋、横隔膜および心臓のそれぞれの切片(n=3)に関してジストロフィン染色の4つの代表的なフレームを選んで、これをラミニン染色と相関させることにより達成された。未処置のmdxマウスおよび処置されたmdxマウスをC57BL10マウスに対して正規化した。この方法は、それぞれの処置群に関するラミニンと比較した筋線維膜におけるジストロフィンの染色強度の比較を可能にする。強度比はC57BL10試料に対して正規化され、筋線維膜における対象のそれぞれの領域(各処置群に関して120個の領域)を散布図上にプロットする。その5−aaコアPip6−PMOコンジュゲートの4つ全てに関して得られた相対強度値は、四頭筋および横隔膜に関して未処置のmdxマウスの相対強度値と有意に異なっていた(図34bおよび図31)。横隔膜においてより高い回復スコアを有していたPip6bを除いて(%RSは38.87〜48.43%の範囲であり、Pip6bは56.72%である;図34b)、全ての処置に関して、四頭筋において(回復スコアパーセント−%RS−は21.10〜33.44%の範囲である;図34b)、および横隔膜において、非常に類似したジストロフィン修復レベルが存在していた。全ての5−aaコアPip6−PMOで処置されたマウスは、Pip6eを除いて、心臓において高いジストロフィン強度値を示した(他のPip6−PMOはmdxと比較して統計的に有意であった=p<0.0001;図31)。Pip6a−およびPip6b−PMOコンジュゲートは、図34bにおいて観察されるように最も高い回復スコアを示し(それぞれ%RSは37.66%および34.22%)、接近してPip6f−PMO(%RSは26.24%)、次いでPip5e−PMO(%RSは17.32%)が続いた。Pip5e−PMO処置と直接比較した場合、Pip6a−PMOのみが心臓において有意に優れていた(図32)。これらの5−aaコアPip6−PMOは、TA筋における免疫組織化学染色により説明されるように、他のジストロフィン複合体タンパク質、すなわちnNOS、α−サルコグリカンおよびβ−サルコグリカンも修復することが示された。
PCRおよびウェスタンブロット分析は、免疫染色と類似した結果を示した。RTPCRの代表的な画像(図34d)は分析した全ての組織における高いエキソンスキッピング効率を説明している。これは、四頭筋、横隔膜および心臓に関するリアルタイムPCR(qRT−PCR)の結果により、よりよく示されている(図34c)。デルタ23転写産物はそれぞれの筋群(n=3)に関して‘総ジストロフィン’に対して正規化されている。このデータの定量化は、全ての5−aa Pip6−PMOで処置されたマウスの四頭筋における類似のΔ23スキッピングのレベルを明らかにした。そのデータの傾向は、Pip6f−およびPip5e−PMOは横隔膜において最も高いエキソンスキッピングを示し、Pip6f−PMOは心臓において最も高いエキソンスキッピングを示すことを示唆している(スプライシングの平均値に関して図38aを参照)。ウェスタンブロット(図34e)をそれぞれのマウスの組織に対して実施し、50%および10% C57BL10対照に対して定量化した。これらの結果を平均し、図38bにおいて示す。Pip6a−、Pip6b−、Pip6e−およびPip6f−PMOコンジュゲートは、TAおよび四頭筋において最も高いジストロフィンタンパク質修復を示した。横隔膜におけるジストロフィン修復のレベルはこれらの処置の全てにわたって一様であり、一方で心臓の場合はPip6b−およびPip6f−PMOコンジュゲートが最も高いジストロフィン修復を示した。
免疫組織化学染色により測定されるようなタンパク質修復は、ウェスタンブロット分析により計算されるタンパク質修復よりも一貫して高い。これらの違いは、用いられた異なる‘ハウジングタンパク質(housing proteins)’に帰することができ、すなわち、免疫組織化学染色により定量化されるジストロフィン修復はラミニンに対して正規化されており、一方でウェスタンブロット分析はアルファ−アクチニンを正規化のために用いている。ウェスタンブロットの定量化はごく最近ジストロフィンに関して報告されており、現在化学発光法を用いている。従って、絶対値をではなくウェスタンブロットにより明らかにされるジストロフィンタンパク質レベルにおける傾向をより重視することは賢明であり得る。従って、その結果全体を考えると、4種類の5−aaコアPip6−PMO(Pip6a−、Pip6b−、Pip6e−およびPip6f−PMO)のそれぞれで処置されたmdxマウスは、以前のリード候補であるPip5e−PMOと比較して、TA、四頭筋および心筋において向上したジストロフィン産生およびエキソンスキッピングを示すようである。
加えて、これらの5−aaコアPip6−PMOは、関連する毒性バイオマーカーであるアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)およびクレアチンキナーゼの血漿レベルにより評価した際に、毒性の証拠を示さない(図40a参照)。血液尿素窒素およびクレアチニンレベルは未処置のmdxのレベルに類似していた(図40b参照)。全てのPip6−PMO処置群は、未処置のC57BL10対照に類似したバイオマーカーのレベルを示している。
上記で記述したように、Pip5e−PMOを1回の12.5mg/kgの静脈内注射で処置された成体のmdxマウス(4.5月齢)におけるエキソンスキッピングおよびジストロフィン産生に関してPip6−PMOコンジュゲートと比較し、体の広い範囲の組織を2週間後に採取した。
処置されたmdxの筋群において免疫組織化学染色(データは示していない)を用いてジストロフィンタンパク質の産生(およびその筋線維膜における正しい再局在)を可視化し、RT−PCRを用いてエキソンスキッピングされた産物を検出した。qPCRはスプライシングされた産物の定量化を可能にし、ウェスタンブロットを用いてC57BL10および未処置のmdx対照マウスと比較した場合の処置されたmdxマウスからの筋肉中で産生されたジストロフィンタンパク質の量を定量化した。
その結果(図6〜17)は、Pip−6a(Pip−5eから反転したコア(ドメイン2)配列を含有する)、Pip−6b(コア配列においてYがIに変化している)、Pip−6e(Rがコア配列中に移動している)およびPip−6f(混ぜられたコア配列を含有する)は全て、Pip−5eと類似して心筋におけるエキソンスキッピングおよびジストロフィン産生を維持しており、一方で切り詰められたコア配列を含有するペプチド(Pip−6cおよびPip−6d)は心筋において活性を失っていることを示した。全ての他の筋タイプにおける活性は、6種類のPip−6(a、b、c、d、e、f)PMOコンストラクト全てに関して大まかに類似していた。
これらの結果はPMODMDの心筋への効率的な送達のためにそのペプチド配列は重要ではないことを示しており、それは特定の細胞侵入シグナルはないことを示唆している(例えば、混ぜられたコア:Pip−6fはPMODMDの心筋への優れた送達を示す)。従って、5アミノ酸の疎水性コア配列の保持は重要であるが、Pip−5eと比較して心筋における活性を失うことのないコア配列の反転およびかき混ぜ(scrambling)により実証されるように、その疎水性コア配列のN〜Cの順序(一次配列)は重要ではない。しかし、他の筋タイプ、例えば骨格筋および平滑筋への送達に関しては、5アミノ酸の疎水性コア配列を有する必要条件は、Pip−6cおよびPip−6dによる非心臓性の筋肉における優れた活性により実証されるように、重要性がより低い。
細胞生存度アッセイ
Huh−7細胞を、37℃で5%CO/95%空気雰囲気下において10%ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質を補ったDMEM中で増殖させた。細胞をトリプシンで処理し、96ウェルプレート中にウェルあたり1.5×10細胞で蒔いた。一夜培養後、細胞をPBSで洗浄し、50μlのOptiMEM中のPMO−ペプチドコンジュゲートをそのウェルに3通りで(in triplicate)添加した。4時間のインキュベーション後、培地を100μlのDMEM/10%FBSで置き換えることによりコンジュゲートを除去し、さらに20時間培養した。20μlのMTS細胞生存度アッセイ(Promega)溶液を100μlのDMEMを含有するウェルに添加し、プレートを1〜2時間インキュベーションした後、490nmでのUV測定を行った。細胞生存度の百分率を、3通りの試料の平均吸光度を未処置の試料の平均値に対して正規化することにより決定した。
示した結果(図19〜22)は2回の独立した実験の平均であり、より少ないアルギニン残基を含有するペプチドの増大した細胞生存度(すなわちより低い細胞毒性)と一致している。例えば、ドメイン1〜3を合わせた中に合計7個のアルギニン残基を有するペプチドは、8または9個のアルギニン残基を有するペプチドよりも高い細胞生存度(より低い細胞毒性)を示した。
Pip−PMOコンジュゲートの血清安定性
血清安定性を、Pip−PMOの分割量(10ナノモル)を100%マウス血清(100μL)に添加し、37℃で120または240分間インキュベーションすることにより測定した。それぞれの反応物を1Mグアニジニウム−HCl溶液(300μL)および氷冷したアセトニトリル(600μL)で希釈した。試料を混合し、−20℃に保ち、沈殿した血清タンパク質を遠心分離(13000rpm、5分間)により分離した。遠心分離後、上清を集め、凍結乾燥し、残留物を、MALDI−TOF質量分析による、および逆相HPLCによるペプチド分解に関する分析のために水中で溶解させた。HPLC条件は以下の通りであった:カラム、C18逆相(250×4.6mm);溶媒A、0.1%TFA、溶媒B、90%アセトニトリル、10%溶媒A;勾配、25分間における10%〜50%溶媒B。その結果は、Pip5e−PMO、Pip6a−PMO、Pip6e−PMOおよびPip6f−PMOに関して120分において残っている主成分を未変化のPip−PMOコンジュゲートとして同定することができること、ならびにペプチドの断片にコンジュゲートしたPMOのレベルは(RXRRBR)XB−PMOに関するレベルと非常に類似していることを示した。
Pip6−PMOコンジュゲートの疎水性コアの部分的削除は心臓のジストロフィン産生を消失させる
高い効率および心臓への送達を有するPip−PMOを同定する必要性に加えて、心臓への送達に重要であるPipペプチドの疎水性コアの要素をよりよく定めることはさらなる目的であった。この目的のため、疎水性コアの1アミノ酸(チロシンの除去;Pip6c)および2アミノ酸(イソロイシンおよびチロシンの除去;Pip6d)の部分的な欠失を含有するPipペプチドをPMOコンジュゲートとして合成した。
mdxマウスの処置後、免疫組織化学染色を実施し、これはこれらの欠失Pip6−PMOの両方に関して骨格筋、例えばTAおよび横隔膜における一部のジストロフィン発現を明らかにした。その免疫組織化学染色の定量化は、四頭筋における、他のPip6−PMOと比較した場合の、接近してPip6c−PMOが続く、Pip6d−PMO処理による最も低いジストロフィン修復を明らかにした(図35a、bおよび図31)。同様に、Pip6d−PMOは横隔膜において最も低いジストロフィン修復を示した。心臓におけるPip6c−およびPip6d−PMOコンジュゲートに関する回復スコアは非常に低く、これはそれらの乏しい効率を示している(Pip6c %RS −1.06%およびPip6d 2.50%;図35b)。
これらの結果は、PCRおよびウェスタンブロット分析により確証されている。RT−PCRの代表的な画像(図35d)およびqRT−PCRのエキソンスキッピングの結果(図35c)は両方とも、Pip6c−およびPip6d−PMOコンジュゲートを用いて処置されたmdxマウスにおける四頭筋および横隔膜における低減したエキソンスキッピングならびに心臓における無視できるほどのエキソンスキッピングを示している。ウェスタンブロット分析は、TAおよび四頭筋における非効率的なジストロフィンタンパク質産生ならびに心臓における無視できるほどのジストロフィン修復を明らかにした(図35eおよび図38b)。
これらの結果は、疎水性コアの長さは優れた心臓ジストロフィン産生に決定的に重要であるだけでなく、一部の他の筋群における活性にも決定的に重要であることを示している。従って、CPP単独のアルギニン含有量はこのクラスのペプチドに関するジストロフィン産生およびエキソンスキッピング効率の唯一の予測因子ではない。
疎水性コア中のアルギニンの位置の変更または第2のアルギニンの付加はジストロフィン産生に有害である
側方領域からコア中へのアルギニンの位置変更は、意外にも許容された(Pip6e−PMO)。従って、2種類のさらなるPip6−PMOコンジュゲートをPip6e−PMOの誘導体として合成した。Pip6g−PMOは第2のアルギニン残基を含有し、それは第2の側方領域から中央の疎水性コア中に移動しており、Pip6h−PMOは1個のアルギニンの位置がコア内で変更されるようにPip6eの疎水性領域の反転を含有する。
驚くべきことに、疎水性コアに対するこれらの変更は、免疫組織化学染色において、およびその定量化において観察されたように、結果として心臓においてだけでなく全ての他の組織においてもジストロフィン発現のさらなる低減をもたらした(図36a,b)。免疫組織化学染色の代表的な画像は、TAおよび四頭筋を除いて全ての組織における非常に少数しかないジストロフィン陽性線維を明らかにした。その定量化に関して、Pip6g−PMOは四頭筋または横隔膜において未処置のmdxと有意に異なっていなかった(図39a)。両方のPip6e−PMO誘導体は心筋において未処置のmdxと有意に異なっておらず、これはこれらの2種類のペプチドの一般的な非効率性を説明している。同様に、これらのPip6e−PMO誘導体は、全ての組織において、代表的なRT−PCR画像(図39d)において、およびqRT−PCR分析(図36cおよび図39c)において説明されるように、エキソンスキッピングにおける低減した効率を示した。ウェスタンブロットは、TA筋を除いて全ての組織における無視できるほどのジストロフィンタンパク質修復(図36eおよび図39d)を明らかにした。これらのデータは、Pip6eの疎水性領域におけるアルギニンの数の増大または1個のアルギニンの位置の変更は、心臓ならびに骨格筋のジストロフィン産生の両方に有害であることを示している。
材料および方法
ペプチド−PMOコンジュゲートの合成
ペプチドは標準的なFmoc化学により合成され、HPLCにより精製された。PMO配列(5’−GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT−3’[SEQ ID NO:310])はGene Tools LLCから購入した。ペプチドを、以前に予備報告[Saleh AF, A.A.A., Yin H, Betts C, Hammond S, Wood MJA and Gait MJ, Enhancement of exon skipping and dystrophin production by 3 '-peptide conjugates of morpholino (PMO) oligonucleotides in a mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy in Collection Symposium Series, Chemistry of Nucleic Acid Components. 2011, Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciencesof the Czech Republic: Prague, p. 292-296]において記述したように、PMOの3’末端におけるアミド結合によりPMOにコンジュゲートし、続いてHPLCにより精製し、MALDI−TOF MSにより分析した。ペプチド−PMOコンジュゲートを使用前に滅菌水中で溶解させ、0.22μmセルロースアセテート膜を通して濾過した。
HPLCおよびMALDI−TOF質量スペクトル分析により観察されたように、Pip6a、Pip6b、Pip6eおよびPip6fのPMOのコンジュゲートは100%血清中、37℃で2時間において主に安定であり、Pip5e−PMOと類似した安定性を有することが分かった。そのコンジュゲートは全て類似した分解パターンを示し、4時間に至るまで完全なコンジュゲートがまだ観察された(データは示していない)。
インビトロアッセイ:mdxマウス筋管におけるエキソンスキッピング
H2K mdx筋管を調製し、以前に記述した方法により[Yin, H., et al., Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(7): p. 1295-303.]、一切の形質移入剤の非存在下で、0.125、0.25、0.5および1.0μMの濃度のペプチド−PMOコンジュゲートと共にインキュベーションした。単離されたRNA全体からのネステッドRT−PCRの産物を2%アガロースゲル上での電気泳動により調べた。Δ23転写産物レベルの定量化をデンシトメトリーを用いて計算した。MTS細胞生存度試験(Promega)は、その研究において用いられたペプチド−PMOコンジュゲートの最も高い濃度における100%の生存を示した(データは示していない)。
動物および静脈内注射
4.5月齢〜5 1/2月齢のmdxマウスをこれらの実験において用いた(n=3)。その実験は、オックスフォード大学生物医学ユニットにおいて英国内務省により認可された手順に従って実施された。Pip6−PMOコンジュゲートは0.9%生理食塩水溶液中で12.5mg/kgの最終的な用量で調製された。160μlの総量を麻酔したマウスの尾静脈経由で投与した。2週間後、マウスをCO吸入により屠殺し、筋肉および他の組織を採取し、冷却したイソペンタン中で瞬時に凍結させた(snap−frozen)後、−80℃で保管した。
ジストロフィン発現の免疫組織化学および定量化
ジストロフィン発現の実験のために組織試料の横断切片を切った(8μm厚)。ジストロフィンの可視化および定量化のため、切片をウサギ抗ジストロフィン(Abcam)およびラット抗ラミニン(Sigma)を用いて共染色し、それぞれヤギ抗ウサギIgG Alexa594およびヤギ抗ラットIgG488二次抗体(Invitrogen)により検出した。画像をLeica DM IRB顕微鏡およびAxiovisionソフトウェア(Carl Zeiss)を用いて捕捉した。定量的免疫組織化学を以前に記述されたように実施した[Malerba, A., et al., Chronic systemic therapy with low-dose morpholino oligomers ameliorates the pathology and normalizes locomotor behavior in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(2): p. 345-54; Arechavala-Gomeza, V., et al., Immunohistological intensity measurements as a tool to assess sarcolemma-associated protein expression. Neuropathol Appl Neurobiol, 2010. 36(4):p. 265-74.]。それぞれの処置に関する代表的な画像を選んだ。定量化のため、ジストロフィンおよび相関するラミニンの4つの代表的なフレームをそれぞれの処置に関する四頭筋、横隔膜および心臓のそれぞれの切片(n=3)に関して選んだ。ImageProソフトウェアを用いて、対象の10個の領域をランダムにラミニン画像上に配置し、それを対応するジストロフィン画像の上に重ねた。120個の領域に関する最小および最大蛍光強度をそれぞれの処置に関して記録した。バックグラウンド蛍光に関して補正するためにそれぞれの領域に関して強度の差を計算し、未処置のmdxおよび処置されたmdxをC57BL10に対して正規化した。これらの値を散布図上にプロットした。その‘相対強度平均値’をマルチレベル統計モデルを用いて計算した。これらの値を用いて、回復スコアの百分率をTREATNMDのウェブサイト(http://www.treatnmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/DMD_M.1.1_001.pdf)上に記載されているような次の方程式:(処置されたmdxマウスのジストロフィン回復−未処置のmdxマウスのジストロフィン回復)/(C57BL10マウスのジストロフィン回復−未処置のmdxマウスのジストロフィン回復)を実行することにより計算した。ジストロフィン関連タンパク質の染色は、以前に記述されたように[Yin, H., et al., Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(7): p. 1295-303]、MOMブロッキングキット(Vector Labs)およびα−サルコグリカンおよびα−ジストログリカン(Novocastra)抗体(1:100希釈)を用いて実施した。nNOS染色は、ヤギ抗ウサギ抗体(Abcam)を用いて実施した。
mdxマウス組織におけるエキソンスキッピング
総RNAを、対照マウスおよび処置されたマウスの組織からTRIzol試薬(Invitrogen)を製造業者の説明書に従って用いて抽出した。
RT−PCR:400ナノグラムのRNA鋳型を、One Step RT−PCRキット(QIAGEN)および遺伝子特異的プライマー(実施例20〜26、順方向:5’−CAG AAT TCT GCC AAT TGC TGA G−3’[SEQ ID NO:312]、逆方向:5’−TTC TTC AGC TTG TGT CAT CC−3’[SEQ ID NO:313])を用いる50μlの逆転写反応において用いた。サイクル条件は以下の通りであった:50℃で30分間、続いて30サイクルの94℃で30秒間、58℃で1分間、および72℃で2分間。2マイクロリットルのcDNAを、以下のサイクル条件を用いる50μlのネステッドPCR(QIAGEN PCRキット)においてさらに増幅した:94℃で30秒間、58℃で1分間、および72℃で1分間を24サイクル(実施例20〜26:順方向:CCC AGT CTA CCA CCC TAT CAG AGC[SEQ ID NO:314]、逆方向:CCT GCC TTT AAG GCT TCC TT[SEQ ID NO:315])。PCR産物を2%アガロースゲル上での電気泳動により調べた。
定量的リアルタイムPCR:2マイクログラムのRNAを、High Capacity cDNA合成キット(Applied Biosystems)を用いて逆転写した。エキソンスキッピングqPCRを、Syber greenキット(Applied Biosystems)、プライマーセット(IDT)およびStepOne PlusリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)を用いて実施した。用いたプライマーセットは以下の通りであった:総ジストロフィン転写産物、実施例19〜20:順方向:GCCATAGCACGAGAAAAAGC[SEQ ID NO:812]、逆方向:GCATTAACACCCTCATTTGC[SEQ ID NO:813];デルタ23 dmd転写産物、順方向:GCG CTA TCA GGA GAC AAT GAG[SEQ ID NO:814]、逆方向:GTT TTT ATG TGA TTC TGT AAT TTC CC[SEQ ID NO:815]。プラスミド(総ジストロフィンおよびデルタ23スキップ)を標準曲線のために用いた。
タンパク質抽出およびウェスタンブロット
対照および処置された筋試料を、5%2−メルカプトエタノールを補った75mMトリス−HCl(pH6.5)および10%ドデシル硫酸ナトリウムを含む溶解緩衝液中でホモジナイズした。試料を100℃で3分間加熱した後、遠心分離して上清を除去した。タンパク質レベルをブラッドフォードアッセイ(Sigma)により測定し、BSA標準を用いて定量化した。10〜15μgの未処置および処置されたmdx試料のタンパク質、ならびにこれらの濃度の50%および10%のC57BL10タンパク質(陽性対照)を、3〜8%トリス−酢酸ゲル上にロードした。タンパク質をPVDF膜上にブロットし、ジストロフィンに関してDYS1抗体(Novocastra)を用いて、およびロード対照に関してα−アクチニン抗体(Sigma)を用いて調べた。一次抗体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(peroxidise)コンジュゲート抗マウスIgGの結合により、lumigenを用いて検出した。ウェスタンブロットを画像化し(LiCOR Biosciences)、Odyssey画像化システムを用いて分析した。
臨床生化学
血漿試料をmdxマウスの頚静脈からCO吸入による屠殺の直後に採取した。毒性バイオマーカーの分析は、MRC、Mary Lyonセンター臨床病理学実験室(英国ハーウェル)により実施された。
統計分析
全てのデータは平均値±SEMを報告した。マルチレベル、繰り返し測定モデルをこの試験に関して実行した。そのマルチレベル統計アプローチは伝統的な統計法に基づいており、社会科学、医学および生物科学においてますます実施されている[Butterfield, A., et al., PyEvolve: a toolkit for statistical modelling of molecular evolution. BMC Bioinformatics, 2004. 5: p. 1; Brooks, G., et al., Referral Source and Outcomes of Physical Therapy Care in Patients With Low Back Pain. J Orthop Sports Phys Ther, 2012; Bernier, J., Y. Feng, and K. Asakawa, Strategies for handling normality assumptions in multilevel modeling: a case study estimating trajectories of Health Utilities Index Mark 3 scores. Health Rep, 2011. 22(4): p. 45-51; Winter, E.M., R.G. Eston, and K.L. Lamb, Statistical analyses in the physiology of exercise and kinanthropometry. J Sports Sci, 2001. 19(10): p. 761-75.]。この研究のために用いられたモデルは、免疫組織化学染色の定量化において実施される際、多数の‘相対強度単位’(レベル1)を、それぞれのマウスに関して(レベル2)、それぞれの処置に関して(レベル3)考慮する。この実施例では、mdx未処置マウスおよびPip5e−PMOで処置されたマウスを定数/固定されたパラメーターとして適用し、それに対して他の処置および野生型対照を比較した。これは正規分布を確実にするために実施されたBox−Coxべき乗変換に従っていた。統計分析はMLwINバージョン2.25を用いて実施された。
ペプチドおよびペプチド−PMOコンジュゲートの合成
PMO配列(5’−GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT−3’[SEQ ID NO:310])はGene Tools LLCから購入した。ペプチドは標準的な9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)化学によりLibertyペプチド合成装置(CEM)を用いて100μmoleスケールで合成され、標準的な逆相HPLCにより90%より大きい純度まで精製され、MALDI−TOF MSにより特性付けられた。ペプチド−PMOコンジュゲートは、200nmole PMOスケールで、ペプチドのC末端のカルボキシル基をPMOの3’末端の第二級アミンに結合させることによるアミド結合により調製された(図1c)。ペプチド(PMOに対して2.5倍モル過剰量)のC末端カルボン酸を、1−メチル−2−ピロリジノン(NMP)およびジイソプロピルエチルアミン(DIEA)中で2−(1H−ベンゾトリアゾール−1イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート(HBTU)および1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)を用いて、ペプチドに対してHBTU:HOBt:DIEA(2.3:2.0:2.3)モル過剰量を用いて活性化した。その混合物をDMSO中で溶解させたPMO(10mM)の溶液に添加し、37℃で2時間インキュベーションした。次いでその混合物を4倍過剰量の水で希釈し、陽イオン交換クロマトグラフィーカラム(Resource S 6−mlカラム、GE Healthcare)上でリン酸ナトリウム緩衝液(緩衝液A:25mM NaHPO、25%アセトニトリル、pH7.0)、緩衝液B:1M NaCl、25mM NaHPO、25%アセトニトリル、pH7.0)、4ml/分の流速および25分間で0〜75%緩衝液Bの勾配を用いて精製してコンジュゲートしなかったPMOおよび過剰なペプチドを除去した。次いでそのコンジュゲートをOasis HLBカラム(4.6mm×20mm、Waters、マサチューセッツ州ミルフォード)上にロードし、水で洗浄して塩類を除去し、60%(v/v)アセトニトリルで溶離した。そのコンジュゲートを凍結乾燥し、MALDI−TOF MSにより、およびHPLCにより分析した(図37)。ペプチド−PMOコンジュゲートを使用前に滅菌水中で溶解させ、0.22μmセルロースアセテート膜を通して濾過した。全体の収率は、PMOに基づいて20〜25%であった。
ペプチド−PMO合成のスケールアップ
コンジュゲーションは、HBTU:HOBt:DIEAに関して上記で記述した比率と同じ比率を保って、出発するPMOの1000ナノモルスケールにおいて向上した。コンジュゲーション反応をマイクロ波オーブン(CEM Discover)を用いて実施し、反応の温度を65℃に上げ、これは反応時間の15分への減少をもたらした。重要な精製工程もこのプロセスで向上した。粗反応混合物をHPLCにより、より大きいイオン交換カラム(Source 15S、GE Healthcare、HR16/10、ベッド体積18ml)を用いて精製し、過剰なペプチドおよびコンジュゲートしなかったPMOを除去し、リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)中塩化ナトリウム(NaCl、1.0M)の溶液を用いて溶離して、ペプチド−PMOの塩化物塩を得た。脱塩工程を用いて、特別注文のOasis HLB脱塩カラム(Waters、19×30mm)上で過剰なNaClを除去した。そのカラムを(HPLCグレードの水の代わりに)Milliporeグレードの水を用いて10分間洗浄した後、PPMOを水中60%(v/v)アセトニトリルで溶離した。500ナノモルを1回の注入で用いて、収率は多数回の注入(例えば2×250nmol)を用いるよりも高かった。これは結果としてこのワンポットコンジュゲーション反応の収率におけるおおよそ40%までの増大をもたらした。
論考
重篤に衰弱させる神経筋障害であるDMDに関する今までで最も有望な療法はAOを用いた処置であり、それはジストロフィンのプレmRNAの読み枠をエキソンスキッピングにより修復する。2種類のAO、PMO[Cirak, S., et al., Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an openlabel, phase 2, dose-escalation study. Lancet, 2011. 378(9791): p. 595-605; Miller, F., C.F. Moseley, and J. Koreska, Spinal fusion in Duchenne muscular dystrophy. Dev Med Child Neurol, 1992. 34(9): p. 775-86.]および2’OMeオリゴヌクレオチド[van Deutekom, J.C., et al., Local dystrophin restoration with antisense oligonucleotide PRO051. N Engl J Med, 2007. 357(26): p. 2677-86; Goemans, N.M., et al., Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med, 2011. 364(16): p. 1513-22.]は現在臨床試験中であり、早期の有望な結果がDMD患者に関する希望を増大させてきた。しかし、非常に高い用量のそのままのPMOのmdxマウス中への投与を含む研究は、体の広い範囲の骨格筋におけるごく部分的なジストロフィンの修復および心臓における無視できるほどの修正を示してきた[Malerba, A., et al., Chronic systemic therapy with low-dose morpholino oligomers ameliorates the pathology and normalizes locomotor behavior in mdx mice. Mol Ther, 2011.19(2): p. 345-54; Malerba, A., et al., Dosing regimen has a significant impact on the efficiency of morpholino oligomer-induced exon skipping in mdx mice. Hum Gene Ther, 2009. 20(9): p. 955-65.]。心臓においてジストロフィンを修正する必要性は、骨格の表現型の修正が結果として心臓の作業負荷における増大をもたらし、そうして心筋症のさらなる進行をもたらした研究[Malerba, A., L. Boldrin, and G. Dickson, Long-term systemic administration of unconjugated morpholino oligomers for therapeutic expression of dystrophin by exon skipping in skeletal muscle: implications for cardiac muscle integrity. Nucleic Acid Ther, 2011.21(4): p. 293-8; Townsend, D., et al., Emergent dilated cardiomyopathy caused by targeted repair of dystrophic skeletal muscle. Mol Ther, 2008. 16(5): p. 832-5.]を受けて、今まで以上に明らかである。CPPとコンジュゲートしたPMOはmdxマウスにおいてそのままのPMOよりもはるかにもっと有効なジストロフィン修正を達成することができるという発見は、細胞およびインビボ送達を向上することによる高められたAOの有効性に関する新たな有望性をもたらしてきた。
我々は以前に、1回の25mg/kgの投与後に心臓を含む全ての筋タイプにおいてジストロフィンタンパク質を高いレベルまで修復することができる有望なペプチド−PMO候補Pip5e−PMOを報告した[Yin, H., et al., Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011.19(7): p. 1295-303.]。アルギニンに富む配列に加えて、Pipペプチドは以前のB−ペプチドリードには存在しない5−aaの疎水性区間を含有し[Perez, F., et al., Antennapedia homeobox as a signal for the cellular internalization and nuclear addressing of a small exogenous peptide. J Cell Sci, 1992. 102(Pt 4): p. 717-22.]、それがおそらく向上した心臓活性の原因であるように思われる。そのPip6系列は、心臓ジストロフィン産生に必要とされる疎水性コアの側面を明らかにする、およびまた、さらにもっと有効なPip−PMOコンジュゲートを同定する試みにおいて、Pip5e−PMOの誘導体として開発された。適度な1回量の投与計画を用いる我々の研究は、いくつかの驚くべき結果をもたらしてきた。
重要な発見は、疎水性コア領域の5アミノ酸長の維持は優れた心臓ジストロフィン産生に必須であることである。コア中に連続的なアミノ酸欠失を有するPip6c−PMOおよびPip6d−PMOに関する心臓における減少したジストロフィン修復の効率は、結果としてもたらされるより低い疎水性およびそれ故に低減した細胞に入る能力と相関している可能性があると想像するかもしれない[Gupta, A., et al., Hydrophobicity drives the cellular uptake of short cationic peptide ligands. Eur Biophys J, 2011. 40(6): p. 727-36.]。しかし、インビトロでの結果は、これらのコンストラクトの全てが、それらは全て筋細胞において完全にエキソンスキッピングすることができるため、細胞に入ることができることを示唆していると考えられる。従って、5−aaの疎水性コアの長さは、インビボでの心臓送達に不可欠な異なるパラメーターに影響を及ぼしているにちがいない。蛍光標識されたPip5e−PMOのB−PMOと比較して増進された全心臓薄片中への取り込みは、むしろ別の障壁(例えば心臓の内皮の裏層)の横断(crossing)が向上していることを示唆した[Yin, H., et al., Cell-penetrating peptide-conjugated antisense oligonucleotides restore systemic muscle and cardiac dystrophin expression and function. Hum Mol Genet, 2008. 17(24): p. 3909-18.]。さらなる心臓の研究が、この問題に取り組むのを助け得るPip6−PMOを用いて続けられている。より驚くべきことは、おそらく、Pip6c−PMOおよびPip6d−PMOに関して他の筋タイプにおけるジストロフィン産生のいくらかの喪失もあったことである。これは、CPP中の疎水性および陽イオン性残基の疎水性/陽イオン性バランスおよび/または正確な間隔はインビボでの送達のパラメーターにより微妙な作用を及ぼしていることを示唆している。Pip6−PMO類似体から生じた別の明確な結論は、疎水性コア内の疎水性残基の特定の順序は、反転した配列(Pip6a)、等しく疎水性の残基の単一の置換(Pip6b)、および混ぜられた配列(Pip6f)は少なくともPip5e−PMOと同じくらい有効であり、心臓および一部の筋群ではより効率的であった(図38)ため、心臓ジストロフィン産生の維持において重要性がより低いことである。
これらの結果は、Pipペプチドの疎水性コアが心組織を透過するのに必要な膜障壁中の特異的な受容体を認識する特定のアミノ酸配列を含有していることはなさそうであり、代わりにそのコアはある種の疎水性スペーサーの役目を果たしていることの証拠を提供する。
しかし、最も驚くべきことは、ウェスタンおよびqRT−PCRの結果により示されるように、Pip6e−PMOが心筋においていくらかのジストロフィンスプライシングおよびタンパク質修復を誘導したことである(注釈:免疫免疫組織化学染色の定量化では有意に異なっていない)。Pip−6eペプチドにおいて、1個のアルギニン残基が疎水性コア中に移動しており、それは結果としてそのコアに隣接する疎水性X残基の整列ももたらす(X−YRFLI[SEQ ID NO:816])。ここで陽イオン性アミノ酸(アルギニン)がコア中に含まれているため、このコンジュゲートでは心臓ジストロフィン産生が完全に失われていると予想したかもしれない。対照的に、そのような心臓活性はPip6h−PMO(X−ILFRYコア[SEQ ID NO:817])および二重アルギニンコアコンジュゲートPip6g−PMO(XYRFRLI−Xコア[SEQ ID NO:818])に関しては失われた。意外にも、ジストロフィン産生はPip6g−およびPip6h−PMOの両方に関して四頭筋および横隔膜においても失われた。Pip6e、Pip6gおよびPip6hに関する活性の結果内の予想外の不一致、ならびにPip6c−およびPip6d−PMOに関する活性の喪失は、おそらく、外側の疎水性アミノ酸スペーサー(XおよびB)および内側の疎水性コア残基両方に関するPipペプチド内のアルギニン残基の正確な間隔がそれぞれのコンジュゲートの薬理学的特性を劇的に変化させる可能性があるという認識により、最もよく説明される。これは、陽イオン性/疎水性バランスにおける変化によってだけでなく、代わりにそのPip6−PMOの二次または三次構造の変化によっても起こっている可能性があり、それが今度は血清タンパク質の結合もしくは循環での半減期を変化させる別のパラメーターに影響を及ぼす可能性があり、またはそれが筋組織を透過するために必要な障壁を越える能力に影響を及ぼす可能性がある。
いくつかのコンジュゲート(Pip6a、Pip6bおよびPip6f−PMO)は、前の候補であるPip5e−PMOのジストロフィン産生活性さえも超える有望なジストロフィン産生活性を示している。興味深いことに、5−aa Pip6−PMO処置の1つ(Pip6e−PMO)からの血清試料の分析は、1回の12.5mg/kgの投与後に、3種類のmiRNA(miR−1、miR−133aおよびmiR−206)の野生型レベル付近までの部分的な正常化を示した[Thomas C. Roberts, K.E.M.B., Graham McClorey, Samir EL Andaloussi, Caroline Godfrey, Corinne Betts, Thibault Coursindel, Michael J. Gait, and C.I.E.S.a.M.J.A. Wood, Expression analysis in multiple muscle groups and serum reveals complexity in the microRNA transcriptome of the mdx mouse with implications for therapy. Nucleic Acid Ther, 2012]。これは、Pip6−PMOに関して、それは最適なペプチドであるとは考えられないであろうが、なおこの群のペプチドの有意な療法的作用を実証しているため、大いに有望である。これらの新規のリードは、筋肉および心臓機能の詳細な生理学的研究に適したPip−PMO候補の同定ならびに1つのそのようなPip−PMOが臨床試験へと進むであろうことを予想した用量の段階的増大の研究を含む完全な毒性プロファイリングのための優れた基礎を提供する。
実施例2−ペプチド−PMOコンジュゲートの合成
そのPMO配列(5’−GGGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT−3’)[SEQ ID NO:310]はGene Tools,LLCから購入した。ペプチドは標準的な9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)化学により社内で合成され、90%より大きい純度まで精製され、MALDI−TOF MSにより特性付けられた。ペプチド−PMOコンジュゲートは、ペプチドのC末端のカルボキシル基をPMOの3’末端の第二級アミンに結合させることによるアミド結合により調製された(図33)。しかし、我々はペプチド−PMOのコンジュゲーションおよび最後の精製に関して以下のことを含むいくつかの改変を行った:a)(15μmolのPMOに至るまでの)大規模コンジュゲーション反応、b)ペプチド−PMOの個々の構成要素からの精製のためのより大規模なイオン交換カラムの使用(表1)、およびc)脱塩に関する、以前に用いられた逆相HPLCカラムの代わりのAmicon Ultra−15遠心フィルター装置の使用。結果として、収率は二倍より大きくなり、PMO配列に基づいてルーチン的に40〜55%であった。
ペプチド(PMOに対して2.5倍モル過剰量)のC末端カルボン酸を、1−メチル−2−ピロリジノン(NMP)およびジイソプロピルエチルアミン(DIEA)中で2−(1H−ベンゾトリアゾール−1イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート(HBTU)および1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール(HOAt)を用いて、ペプチドに対してHBTU:HOBt:DIEA(2.3:2.0:2.3)モル過剰量を用いて活性化した(表2)。ペプチドの濃度は100mMであった。混合した後、その混合物をPMOのDMSO溶液(10mM)に2.5:1のモル比で添加し、37℃で2時間インキュベーションした。次いでその混合物を、大きい陽イオン交換クロマトグラフィーカラム(Resource S 200−mlカラム、GE Healthcare)により、リン酸ナトリウム緩衝液(緩衝液A:25mM NaHPO、25%アセトニトリル、pH7.0)、緩衝液B:1M NaCl、25mM NaHPO、25%アセトニトリル、pH7.0)、14ml/分の流速および60分間で0〜100%緩衝液Bの勾配を用いて精製してコンジュゲートしなかったPMOおよび過剰なペプチドを除去した。
次いでそのコンジュゲートを3kDa MWCO Amicon Ultra−15遠心フィルター装置(Millipore)を用いてその試料を濃縮する(concentring)(25℃で3220rcfにおける1時間の遠心分離)ことにより脱塩し、次いでその濃縮物をHOで12mlに希釈した。そのプロセスを2回繰り返した。そのコンジュゲートを凍結乾燥し、MALDI−TOF MSおよびHPLCにより分析した。ペプチド−PMOコンジュゲートを使用前に(内毒素を含まない)滅菌水中で溶解させ、0.22μmセルロースアセテート膜を通して濾過した。濃度を、0.1N HCl中で265nmの紫外線により、Gene Toolsからのデータシートにおいて提供された通りのPMOの吸光係数を用いて測定した。
実施例3−Pip7〜9ペプチド
インビトロでのPip7〜9−PMOの毒性評価
Pip7〜9−PMOの毒性試験を細胞生存度アッセイを用いて行った。これらは、10アルギニン−PMOコンジュゲート(Pip6e)は高レベルの細胞毒性を有することを示した(図42)。従って、可能性のある細胞毒性を最小限にするために、アルギニンおよびアミノヘキシル(アミノヘキサン酸)残基の数を減らすことにより、Pip6a(Pip8系列)、Pip6e(Pip7系列)およびPip6f(Pip9系列)を親ペプチドとして用いて、Pip7〜9系列を合成した。細胞生存度はPip7〜9−PMOで処置されたmdx筋管においてPip6eで処置された細胞と比較して実質的に増大し(図42)、これはそれに続くインビボでの試験に関する有望性を示唆している。
Pip7〜9−PMOの1回の静脈内注射は結果としてmdxの骨格筋/周辺の筋肉における広範囲に及ぶジストロフィン発現をもたらす
Pip7〜9−PMO化合物のエキソンスキッピング効率を評価するため、8週齢のmdxマウスに12.5mg/kgのPip7〜9−PMOを静脈内注射した。注射の2週間後に、前脛骨筋(TA)、横隔膜、四頭筋および心筋においてジストロフィン発現を分析した。我々は、免疫染色されたジストロフィン陽性線維、エキソンスキッピングされたmRNAおよびジストロフィンタンパク質レベルを評価した(図2〜4)。ジストロフィンで免疫染色された線維の強度をラット抗ラミニン抗体を正規化のために用いて分析し、これをC57BL/10の筋肉の強度レベルの比率として表した(図5)。エキソンスキッピングされたジストロフィン陽性筋線維の顕著な発現が、Pip7〜9−PMOを注射された骨格筋、例えばTA、四頭筋および横隔膜筋の全てにおいて、注射の2週間後に観察された(図43〜46)。しかし、Pip8b、Pip8c、Pip9b、Pip9b2およびPip9cのみが心臓において有意なジストロフィン発現を与えた(図46)。Pip7a、Pip7b、Pip7b2、Pip8c2、Pip9dおよびPip9d2は結果として心臓において無視できる程度のジストロフィン産生をもたらした(図46)。そのペプチドの構造を考慮すると、Pip9系列の混ぜられた(scrambled)疎水性コアでさえも心臓においてPip8系列と類似したジストロフィン発現をもたらしたため、疎水性コア領域中のアミノ酸の順序は重要性がより低いことは明らかである。
Pip7〜9−PMOの全身投与後の毒性学的評価
Pip7〜9−PMOで処置されたmdxマウスにおける毒性応答を評価するため、我々は処置されたマウスおよび対照から血清を抽出して分析することによりPip7〜9−PMO化合物の全身投与の2週間後に肝および腎機能の予備的評価を行っている。血清クレアチンキナーゼ(CK)、クレアチニン、尿素、アルカリホスファターゼ(ALP)、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、総ビリルビン、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)レベルの分析を実施した。PPMOで処置されたmdxの血清において、未処置のmdxの対照と比較して、腎毒性に関するマーカーである尿素およびクレアチニンならびに肝毒性に関するマーカーであるTBILのレベルにおける上昇はなかった(図47)。ALT、AST、ALPおよびLDHのレベルは未処置のmdxマウスにおいて上昇した。PPMOで処置されたmdxの血清において、未処置のmdxの対照と比較して、これらのマーカーのレベルにおける上昇はなかった。CKレベルはマウス間で変動性があった。
mdxマウスにおけるリードPPMO(エキソン23マウス)のさらなる同定
我々はmdxマウスにおいて骨格筋および心筋の両方で高レベルのジストロフィン修復を与えるPPMOを同定してきた。Pip8b、9b、9b2、8cおよび9cは、前脛骨筋(TA)、横隔膜、四頭筋および心臓における明白な毒性を伴わない非常に効率的なジストロフィン修復により重要な有望性を示してきた。
リードPPMOのエキソンスキッピング効率を比較するため、8週齢のmdxマウスに12.5mg/kgのPPMOを静脈内注射した。注射の2週間後、ジストロフィン発現をTA、四頭筋、横隔膜および心筋において分析した。我々は、免疫染色されたジストロフィン陽性線維、エキソンスキッピングされたmRNAおよびジストロフィンタンパク質レベルを評価した(図48〜50)。ジストロフィンで免疫染色された線維の強度をラット抗ラミニン抗体を正規化のために用いて分析し、これをC57BL/10の筋肉の強度レベルの比率として表した(図48)。エキソンスキッピングされたジストロフィンRNAおよびタンパク質のレベルは、Pip8b、9bおよびPip9b2−PMOを注射された骨格筋、例えばTA、四頭筋、横隔膜および心筋において、注射の2週間後に顕著に発現していた(図49〜50)。しかし、Pip8cおよび9c−PMOはPip8b、9bおよびPip9b2−PMOと比較して低減したジストロフィン発現を与えた。さらに、Pip9d2−PMOは結果としてTA、四頭筋、横隔膜および心筋において無視できるほどのジストロフィン産生をもたらし(図48〜50)、これは効率的なエキソンスキッピングを誘導するためにそのペプチドの疎水性領域の長さを維持することの重要性を説明している。
PPMOで処置されたmdxの筋肉におけるジストロフィンタンパク質レベルをウェスタンブロット分析により定量化した。ジストロフィンのバンドの密度をLicorソフトウェアを用いて定量化し、ビンキュリンをロード対照として用いた。そのバンド密度をそのそれぞれのビンキュリンのバンドにより正規化し、これをC57BL/10の筋肉のジストロフィン発現レベルの百分率として表した。エキソンスキッピングされたジストロフィンタンパク質のレベルは、Pip8b、9bおよびPip9b2−PMOを注射された骨格筋、例えばTA、四頭筋および横隔膜筋において、注射の2週間後において類似していた(図50)。しかし、Pip8cおよび9cは8b、9bおよび9b2−PMOと比較して低減したジストロフィン発現を与えた。さらに、9d2−PMOは結果としてTA、四頭筋、横隔膜および心筋において無視できるほどのジストロフィン産生をもたらした(図50)。
リードPPMO(エキソン23マウス)で処置されたmdxマウスにおける調節不全のマイクロRNAレベルの修復
我々は、PPMO候補により誘導されるエキソンスキッピングされたジストロフィンの、mdxマウスにおいて筋病理を改善することによりマイクロRNAレベルを修正する能力を試験した。我々はジストロmir(ジストロフィン欠損症において調節不全になっているマイクロRNA)、miR−1およびmiR−133aのレベルを評価し、それはmdxの血清中で増大しており、かつmdxの組織中で減少しているか変化していないかのどちらかであり、従ってこれらは有用な血清マーカーを構成し得る。8週齢のmdxマウスにおける12.5mg/kgのPPMO(Pip8b、9b、9b2、8cおよび9c)の静脈内注射の2週間後に、PPMOで処置された血清においてmiR−133aおよびmiR−206のレベルを定量的(Q)−PCRにより調べ、参照マイクロRNAとしてのmiR−223に対して正規化した。miR−133aおよびmiR−206のレベルはPPMOで処置されたmdxマウスの血清中で未処置のmdx対照と比較して有意に下方制御されており、これは筋病理がPPMOにより改善されたことを暗示している(図51)。
PPMO合成の向上
HPLCおよびフィルター脱塩した9b2−PMOのエキソンスキッピング効率を比較するため、8週齢のmdxマウスに12.5mg/kgのPPMOを静脈内注射した。注射の2週間後に、ジストロフィン発現をTA、四頭筋、横隔膜および心筋において分析した。我々は、免疫染色されたジストロフィン陽性線維、エキソンスキッピングされたmRNAおよびジストロフィンタンパク質レベルを評価した(図52〜54)。ジストロフィンで免疫染色された線維の強度をラット抗ラミニン抗体を正規化のために用いて分析し、これをC57BL/10の筋肉の強度レベルの比率として表した(図52)。HPLCおよびフィルター脱塩した9b2−PMOにより誘導された筋線維膜において、エキソンスキッピングされたジストロフィンの強度レベルには変化はなかった。エキソンスキッピングされたジストロフィンRNAおよびタンパク質のレベルは、フィルター脱塩したPip9b2−PMOを注射された骨格筋において、HPLC濾過されたPMOで処置された筋肉、例えばTA、四頭筋および横隔膜と比較して、注射の2週間後においてわずかに増大していた(図53)。
Pip9b2−PMOの培養されたmdxマウス筋管における毒性評価
HPLCおよびフィルター脱塩したPip9b2−PMOの毒性試験を、細胞生存度アッセイを用いて行った。細胞生存度は、それらを60μMのPip9b2−PMOを用いて処理した際に、フィルター脱塩したPip9b2−PMOで処理したmdx筋管において、HPLC脱塩したPip9b2−PMOで処理した細胞と比較してわずかに増大していた(図54)。
要約
mdxマウスにおいて骨格筋および心筋の両方において高レベルのジストロフィン修復を与えるPPMO候補を同定してきた。特に、Pip8bおよび9bならびにPip9b2、8cおよび9cは前脛骨筋(TA)、横隔膜、四頭筋および心臓における明白な毒性を伴わない効率的なジストロフィン修復を示している。
インビボでのDMD処置の定量的評価に関して、mdxの血清中で増大しているジストロmir(miR−133aおよびmiR−206)のレベルを評価してきた。miR−133aおよびmiR−206のレベルは、PPMOで処置されたmdxマウスの血清において、未処置のmdx対照と比較して有意に下方制御されていた。
実施例4−細胞生存度(Pip7およびPip8系列)
Pip7およびPip8系列のペプチドを、以下のように細胞生存度アッセイにおいて試験した。Huh−7肝細胞を、37℃で5%CO/95%空気雰囲気下において10%ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質を補ったDMEM中で増殖させた。細胞をトリプシンで処理し、96ウェルプレート中にウェルあたり1.5×10細胞で蒔いた。一夜培養後、細胞をPBSで洗浄し、50μlのOptiMEM中のPMO−ペプチドコンジュゲートをそのウェルに3通りで添加した。4時間のインキュベーション後、培地を100μlのDMEM/10%FBSで置き換えることによりコンジュゲートを除去し、さらに20時間培養した。20μlのMTS細胞生存度アッセイ(Promega)溶液を100μlのDMEMを含有するウェルに添加し、プレートを1〜2時間インキュベーションした後、490nmでのUV測定を行った。細胞生存度の百分率を、3通りの試料の平均吸光度を未処置の試料の平均値に対して正規化することにより決定した。
示した結果(図57〜58)は、より少ないアルギニン残基を含有するペプチドの増大した細胞生存度(すなわちより低い細胞毒性)と一致している。例えば、ドメイン1〜3を合わせた中に合計7個のアルギニン残基を有するペプチドは、8または9個のアルギニン残基を有するペプチドよりも高い細胞生存度(より低い細胞毒性)を示した。
実施例5−インビトロアッセイ:mdxマウス筋管におけるエキソンスキッピング;Pip7、Pip8およびPip9系列
以前に記述された方法[Yin, H., et al., Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(7): p. 1295-303.]により、H2K mdx筋管を調製し、0.125、0.25、0.5、1.0および2.0μMの濃度のペプチド−PMOコンジュゲートと共に一切の形質移入試薬の非存在下でインキュベーションした。単離されたRNA全体からのネステッドRT−PCRの産物を2%アガロースゲル上での電気泳動により調べた。Δ23転写産物レベルの定量化をデンシトメトリーを用いて計算した。
その結果(図59〜61)は、Pip7a、Pip7b、Pip7b2、Pip7c、Pip7c2、Pip8a、Pip8b、Pip8c、Pip8c2、Pip8d、Pip9b、Pip9b2、Pip9c、pip9c2、Pip9c3、pip9dおよびPip9d2 PMOコンジュゲートはmdx筋細胞において高いエキソンスキッピング活性を与えたことを示している。
参考文献

Claims (31)

  1. 配列:
    N末端 [ドメイン1]−[ドメイン2]−[ドメイン3] C末端
    を有する少なくとも3個のドメインからなる一次配列構造を有するペプチドであって、ここで:
    (i)ドメイン1は以下の配列から選択される配列を含み:
    RXRZ [SEQ ID NO:762]
    ここでZは以下の配列の1つから選択され:
    RBRRXR [SEQ ID NO:763]
    RBRRX [SEQ ID NO:764]
    RBRX [SEQ ID NO:765]
    RBRXR [SEQ ID NO:766]
    BRX [SEQ ID NO:767]
    BX [SEQ ID NO:768]
    RBR [SEQ ID NO:769]
    RB [SEQ ID NO:770]、または
    RBRR [SEQ ID NO:771]
    (ii)ドメイン2がYQFLI[SEQ ID NO:802]、IQFLI[SEQ ID NO:803]、YRFLI[SEQ ID NO:804]、YRFRLI[SEQ ID NO:805]、FQILY[SEQ ID NO:806]、QFLI[SEQ ID NO:807]、QFL[SEQ ID NO:808]、またはILFRY[SEQ ID NO:811]から選択されるN〜C末端の連続した一次配列を含む、
    (iii)ドメイン3は以下の配列から選択される配列を含み:
    RXRBRXRB [SEQ ID NO:772]
    XRBRXRB [SEQ ID NO:773]
    RXRRBRB [SEQ ID NO:774]
    BRXRB [SEQ ID NO:775]
    XRRBRB [SEQ ID NO:776]
    RRBRB [SEQ ID NO:777]
    XRBRB [SEQ ID NO:778]
    RBRXRB [SEQ ID NO:779]
    RXRBRB [SEQ ID NO:780]、または
    BRBRB [SEQ ID NO:781]
    ここでX=アミノヘキサン酸、B=ベータアラニンである、前記ペプチド。
  2. ドメイン1が以下の配列:
    RXRRBRRXR [SEQ ID NO:782]
    RXRRBRRX [SEQ ID NO:783]
    RXRRBRX [SEQ ID NO:784]
    RXRBRX [SEQ ID NO:785]
    RXRRBRXR [SEQ ID NO:786]
    RXRRBR [SEQ ID NO:787]
    RXRRB [SEQ ID NO:788]、または
    RXRRBRR [SEQ ID NO:789]
    RXRBX [SEQ ID NO:790]
    から選択される配列を含む、またはそれで構成される、請求項1に記載のペプチド。
  3. ドメイン3が以下の配列:
    RXRBRXRB [SEQ ID NO:772]
    XRBRXRB [SEQ ID NO:773]
    RXRRBRB [SEQ ID NO:774]
    BRXRB [SEQ ID NO:775]
    XRRBRB [SEQ ID NO:776]
    RRBRB [SEQ ID NO:777]
    XRBRB [SEQ ID NO:778]
    RBRXRB [SEQ ID NO:779]
    RXRBRB [SEQ ID NO:780]、または
    BRBRB [SEQ ID NO:781]
    から選択される配列を含む、またはそれで構成される、請求項1または2に記載のペプチド。
  4. ドメイン2が4または5個のアミノ酸を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチド。
  5. ドメイン2が0、1、2または3個のR残基を含有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載のペプチド。
  6. ドメイン2が少なくとも1または2個のR残基を有し、ドメイン1が5個以下のR残基を有し、ドメイン3が4個以下のR残基を有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチド。
  7. 1個以上のR残基がD−アルギニンである、請求項1〜6のいずれか1項に記載のペプチド。
  8. 1個以上のR残基がL−アルギニンである、請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチド。
  9. ドメイン1および3がR、XおよびB残基のみを含有する、請求項1〜8のいずれか1項に記載のペプチド。
  10. ドメイン1が2〜6個のR残基、1〜3個のX残基および1〜2個のB残基のあらゆる組み合わせを有し、かつ長さが10残基より多くなく、かつ0、1または2個のR、XまたはBではない残基を有する、請求項1〜9のいずれか1項に記載のペプチド。
  11. ドメイン3が2〜5個のR残基、1〜3個のX残基、および1〜3個のB残基のあらゆる組み合わせを有し、かつ長さが9残基より多くなく、かつ0、1または2個のR、XまたはBではない残基を有する、請求項1〜10のいずれか1項に記載のペプチド。
  12. ペプチドが天然アミノ酸、XおよびB残基を含めて30残基の最大長を有する、請求項1〜11のいずれか1項に記載のペプチド。
  13. ドメイン1が4から12残基までの長さを有し、ドメイン2が3から9残基までの長さを有し、かつドメイン3が4から12残基までの長さを有し、ここで該長さに天然アミノ酸、XおよびB残基が含まれる、請求項1〜12のいずれか1項に記載のペプチド。
  14. SEQ ID NO:2〜308または317〜761(図18、23〜30、および41)の1つから選択される配列を含む、またはそれで構成される、請求項1〜13のいずれか1項に記載のペプチド。
  15. SEQ ID NO:2〜308または317〜761(図18、23〜30、および41)の1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、またはそれで構成される、請求項1〜14のいずれか1項に記載のペプチド。
  16. Pip−6a、Pip−6b、Pip−6e、Pip−6f(SEQ ID NO:2、3、6、または7)の1つのドメイン1〜3の配列またはPip−6a、Pip−6b、Pip−6e、Pip−6f(SEQ ID NO:2、3、6、または7)の1つのドメイン1〜3の配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、またはそれで構成される、請求項1〜15のいずれか1項に記載のペプチド。
  17. ペプチドがさらにC末端においてリンカーを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載のペプチド。
  18. リンカーがBCys、XCys、Cys、GGCys、BBCys、BXCys、XBCys、BX、またはXBから選択される、請求項17に記載のペプチド。
  19. ペプチドがカーゴ分子に化学的にコンジュゲートされている、請求項1〜18のいずれか1項に記載のペプチド。
  20. コンジュゲーションがペプチドのC末端においてである、請求項19に記載のペプチド。
  21. カーゴ分子が核酸、ペプチド核酸(PNA)、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド(PMO)、ロックド核酸(LNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉RNA(siRNA)、ペプチド、環状ペプチド、タンパク質、または薬物から選択される、請求項19または20に記載のペプチド。
  22. カーゴ分子が5,000Da未満の分子量を有する、請求項21に記載のペプチド。
  23. カーゴ分子がPNADMD[SEQ ID NO:309]もしくはPMODMD[SEQ ID NO:310]またはPNADMD[SEQ ID NO:309]もしくはPMODMD[SEQ ID NO:310]の1つに少なくとも90%の配列同一性を有する分子である、請求項21または22に記載のペプチド。
  24. 請求項1〜23のいずれか1項に記載のペプチドを含む、医薬組成物または薬剤。
  25. さらに薬学的に許容可能な希釈剤、アジュバントまたはキャリヤーを含む、請求項24に記載の医薬組成物または薬剤。
  26. 疾患の処置の方法における使用のための、請求項1〜23のいずれか1項に記載のペプチド。
  27. 疾患の処置における使用のための薬剤の製造における、請求項1〜23のいずれか1項に記載のペプチドの使用。
  28. 疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、メンケス病、β−サラセミア、前頭側頭型認知症、パーキンソン症候群、脊髄性筋萎縮症、筋緊張性ジストロフィー、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群、血管拡張性失調症変異(ATM)、または癌から選択される、請求項27に記載の使用のためのペプチド。
  29. 疾患が心臓の病気である、または心臓において明白である、請求項27に記載の使用のためのペプチド。
  30. 請求項1〜23のいずれか1項に記載のペプチドをコードしている、単離された核酸。
  31. 請求項1〜23のいずれか1項に記載のペプチドをコードしている核酸に作動可能に連結された制御配列を有する核酸ベクター。
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