JP6077543B2 - ペプチド - Google Patents
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Description
意外にも、本発明者らは、疎水性コアドメインの線状N〜C末端配列(すなわち一次配列)は細胞透過活性に本質的ではないこと、および(それらの一次配列ではなく)コアのアミノ酸の存在が重要な要因であることを確認した。従って、彼らは、構造−活性関係は疎水性コア中の特定の線状のアミノ酸の配列順序により提供される構造に依存するのではなく、疎水性コア中の特定のアミノ酸の存在に依存することを理解している。これは、本発明者らが本明細書で記述される細胞透過性ペプチドの新規の系列を設計することを可能にした。
Pip−6a、Pip−6b、Pip−6c、Pip−6d、Pip−6e、Pip−6f、Pip−6g、Pip−6h、Pip−6i[SEQ ID NO:2〜10];
Pip−7a、Pip−7b、Pip−7c、Pip−7d、Pip−7b2、Pip−7c2[SEQ ID NO:11〜16];
Pip−8a、Pip−8b、Pip−8c、Pip−8c2、Pip−8d、Pip−8d2、Pip−8d3[SEQ ID NO:17〜20および317〜319];または
Pip−9b、Pip−9b2、Pip−9c、Pip−9c2、Pip−9c3、Pip−9d、Pip−9d2、Pip−9d3、Pip−9d4[SEQ ID No 320〜328]。
N末端 [ドメイン1]−[ドメイン2]−[ドメイン3] C末端
それぞれのドメインは共通の配列特徴を有するが、それぞれのドメインの正確な配列は変更および修正することができる。従って、ある範囲の配列がそれぞれのドメインに関して可能である。それぞれの可能なドメイン配列の組み合わせがある範囲のペプチド配列をもたらし、それが本発明の一部を形成する。
X=アミノヘキサン酸、アミノ酪酸、アミノカプリル酸、β−アラニル、p−アミノベンゾイル、イソニペコチル(isonipecotyl)、または4−アミノブチリルのいずれか、
B=ベータアラニン
R=アルギニン
ドメイン1はアルギニンに富む配列であり、4、5、6、7、8、9、10、11、12、またはより多くのアミノ酸長であってよい。好ましくは、ドメイン1は5、6、7、8、または9残基(例えばX、BまたはR)を有する。
好ましいドメイン1の配列は次の群から選択される:
RXRRBRRXR [SEQ ID NO:782]
RXRRBRRX [SEQ ID NO:783]
RXRRBRX [SEQ ID NO:784]
RXRBRX [SEQ ID NO:785]
RXRBX [SEQ ID NO:790]
RXRRBRXR [SEQ ID NO:786]
RXRRBR [SEQ ID NO:787]
RXRRB [SEQ ID NO:788]、または
RXRRBRR [SEQ ID NO:789]。
RXRBRXRB [SEQ ID NO:772]
XRBRXRB [SEQ ID NO:773]
RXRRBRB [SEQ ID NO:774]
BRXRB [SEQ ID NO:775]
XRRBRB [SEQ ID NO:776]
RRBRB [SEQ ID NO:777]
XRBRB [SEQ ID NO:778]
RBRXRB [SEQ ID NO:779]
RXRBRB [SEQ ID NO:780]、または
BRBRB [SEQ ID NO:781]。
Z4YQFLIZ5 [SEQ ID NO:791]
Z4IQFLI,Z5 [SEQ ID NO:792]
Z4YRFLIZ5 [SEQ ID NO:793]
Z4YRFRLIZ5 [SEQ ID NO:794]
Z4FQILYZ5 [SEQ ID NO:795]
Z4QFLIZ5 [SEQ ID NO:796]
Z4QFLZ5 [SEQ ID NO:797]
ここで、Z4は以下の1つから選択され:
RXRRBRRXR [SEQ ID NO:782]
RXRRBRRX [SEQ ID NO:783]
RXRRBRX [SEQ ID NO:784]
RXRBRX [SEQ ID NO:785]
RXRRBRXR [SEQ ID NO:786]
RXRRBR [SEQ ID NO:787]
RXRRB [SEQ ID NO:788]、または
RXRRBRR [SEQ ID NO:789]
かつZ5は以下の1つから選択され:
RXRBRXRB [SEQ ID NO:772]
XRBRXRB [SEQ ID NO:773]
RXRRBRB [SEQ ID NO:774]
BRXRB [SEQ ID NO:775]
XRRBRB [SEQ ID NO:776]
RRBRB [SEQ ID NO:777]
XRBRB [SEQ ID NO:778]
RBRXRB [SEQ ID NO:779]
RXRBRB [SEQ ID NO:780]、または
BRBRB [SEQ ID NO:781]
ここでZ5は場合によりそのC末端においてリンカーを含んでいてよく、それはBCys、XCys、Cys、GGCys、BBCys、BXCysまたはXBCys、X、XX、B、BB、BXまたはXBの1つであってよい。
カーゴ分子を除いて、本発明のペプチドは40残基、より好ましくは30残基、そしてさらにもっと好ましくは15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30残基の1つの最大長、および10残基、より好ましくは10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20残基の1つの最小長を有していてよい(その最大および最小長には、あらゆるスペーサー分子、例えばX、および非天然アミノ酸または修飾されたアミノ酸が含まれる)。
そのペプチドの誘導体も本発明の一部を形成する。ペプチド誘導体には、完全長ペプチドに対して実質的なアミノ酸配列同一性(例えば90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%)を有し、好ましくは同じまたはより優れたエキソンスキッピング活性または細胞生存度を有する、所与のペプチド配列(例えばSEQ ID NO:2〜308の1つ)の変異体が含まれる。ペプチド誘導体は、SEQ ID NO:2〜308の1つより1、2または3個多い、または少ないアミノ酸またはスペーサー分子を有していてよい。
タンパク質ギャップオープンペナルティー=10.0、タンパク質ギャップ伸張ペナルティー=0.2、タンパク質マトリックス=Gonnet、タンパク質/DNA ENDGAP=−1、タンパク質/DNA GAPDIST=4。
(i)グリシン、アラニン、セリン、スレオニン;
(ii)グルタミン酸およびアスパラギン酸;
(iii)アルギニン、ヒスチジンおよびリシン;
(iv)アスパラギンおよびグルタミン;
(v)イソロイシン、ロイシンおよびバリン;
(vi)フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。
本発明のペプチドおよびペプチド−カーゴコンジュゲートは、医学的処置の方法における使用のために提供されてよい。その医学的処置は、好ましくはそのカーゴ分子の細胞および場合によりその細胞の核中への送達を必要とし得る。
本発明のペプチドをコードする核酸も提供される。本発明のペプチドをコードする核酸に作動可能に(operably)連結された制御配列、例えばプロモーターを有する核酸ベクター、例えばプラスミドも提供される。そのベクターは好ましくは適切な細胞、例えば哺乳類、細菌または真菌細胞中に形質移入された際にそのペプチドを発現することができる。その核酸は単離または精製された形態で提供されてよい。
本発明の1観点において、次の配列を有する少なくとも3個のドメインからなる一次配列構造を有するペプチドが提供され:
N末端 [ドメイン1]−[ドメイン2]−[ドメイン3] C末端
ここで
ドメイン1および3中のR(アルギニン)残基を合わせた数は少なくとも5であり、
ドメイン1および3中のX残基を合わせた数は少なくとも1であり、
ドメイン1および3中のB残基を合わせた数は少なくとも2であり、
ここでX=アミノヘキサン酸およびB=ベータアラニンであり、
かつここで
ドメイン2はアミノ酸Z1Z2FLIの少なくとも3個を含有する配列を含み、ここでZ1はYまたはIであり、かつZ2はQまたはRであり、かつ
ドメイン2はILFQY、ILFQまたはILIQのN〜C末端の連続した一次配列を含有しない。
本発明の別の観点において、次の配列を有する少なくとも3個のドメインからなる一次配列構造を有するペプチドが提供され:
N末端 [ドメイン1]−[ドメイン2]−[ドメイン3] C末端
ここで:
(i)ドメイン1は以下の配列から選択される配列を含み:
RXRZ3 [SEQ ID NO:762]
ここでZ3は以下の配列の1つから選択され:
RBRRXR [SEQ ID NO:763]
RBRRX [SEQ ID NO:764]
RBRX [SEQ ID NO:765]
RBRXR [SEQ ID NO:766]
BRX [SEQ ID NO:767]
BX [SEQ ID NO:768]
RBR [SEQ ID NO:769]
RB [SEQ ID NO:770]、または
RBRR [SEQ ID NO:771]
(ii)ドメイン2はアミノ酸Z1Z2FLIの少なくとも3個を含有する配列を含み、ここでZ1はYまたはIであり、かつZ2はQまたはRであり、かつここでドメイン2はILFQY、ILFQまたはILIQのN〜C末端の連続した一次配列を含有せず、
(iii)ドメイン3は以下の配列から選択される配列を含み:
RXRBRXRB [SEQ ID NO:772]
XRBRXRB [SEQ ID NO:773]
RXRRBRB [SEQ ID NO:774]
BRXRB [SEQ ID NO:775]
XRRBRB [SEQ ID NO:776]
RRBRB [SEQ ID NO:777]
XRBRB [SEQ ID NO:778]
RBRXRB [SEQ ID NO:779]
RXRBRB [SEQ ID NO:780]、または
BRBRB [SEQ ID NO:781]
ここでX=アミノヘキサン酸、B=ベータアラニンである。
RXRRBRRXR [SEQ ID NO:782]
RXRRBRRX [SEQ ID NO:783]
RXRRBRX [SEQ ID NO:784]
RXRBRX [SEQ ID NO:785]
RXRRBRXR [SEQ ID NO:786]
RXRRBR [SEQ ID NO:787]
RXRRB [SEQ ID NO:788]、または
RXRRBRR [SEQ ID NO:789]。
RXRBRXRB [SEQ ID NO:772]
XRBRXRB [SEQ ID NO:773]
RXRRBRB [SEQ ID NO:774]
BRXRB [SEQ ID NO:775]
XRRBRB [SEQ ID NO:776]
RRBRB [SEQ ID NO:777]
XRBRB [SEQ ID NO:778]
RBRXRB [SEQ ID NO:779]
RXRBRB [SEQ ID NO:780]、または
BRBRB [SEQ ID NO:781]。
従って、ドメイン1は(i)2〜6個のR残基、(ii)1〜3個のX残基、および(iii)1〜2個のB残基のあらゆる組み合わせを有することができ、かつ好ましくは長さが10残基より多くなく、かつ0、1または2個のR、XまたはBではない残基を有する。ドメイン3は(a)2〜5個のR残基、(b)1〜3個のX残基、および(c)1〜3個のB残基のあらゆる組み合わせを有することができ、かつ好ましくは長さが9残基より多くなく、かつ0、1または2個のR、XまたはBではない残基を有する。
そのカーゴ分子は、核酸、ペプチド核酸(PNA)、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド(PMO)、ロックド核酸(locked nucleic acid)(LNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉RNA(siRNA)、ペプチド、環状ペプチド、タンパク質、または薬物から選択されてよい。そのカーゴ分子は5,000Da未満の分子量を有することができる。一部の態様において、そのカーゴ分子はPNADMD[SEQ ID NO:309]もしくはPMODMD[SEQ ID NO:310]またはPNADMD[SEQ ID NO:309]もしくはPMODMD[SEQ ID NO:310]の1つに少なくとも90%の配列同一性を有する分子である。
本発明のさらなる観点において、単離された核酸が提供され、その単離された核酸は本発明のあらゆる観点または態様に従うペプチドまたはペプチド−カーゴコンジュゲートをコードしている。そのような核酸に作動可能に連結された制御配列を有する核酸ベクターも提供される。
既知の薬学的または生物学的に有効な化合物に対する模倣体の設計は、“リード”化合物に基づく医薬および療法薬の開発のための既知のアプローチである。これは、その有効化合物を合成するのが困難もしくは費用がかかる場合、またはそれが特定の投与法に適さない場合に望ましい可能性があり、例えば一部のペプチドは、それらが消化管中のプロテアーゼにより急速に分解される傾向があるため、経口組成物に関して不適切な有効薬剤である可能性がある。模倣体の設計、合成および試験は、一般に標的特性に関して多数の分子をランダムにスクリーニングするのを避けるために用いられる。
本明細書で用いられる節の見出しは組織化の目的のためだけのものであり、記述される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
本発明は、非限定的に、好ましくは以下の態様を含む。
[態様1] 配列:
N末端 [ドメイン1]−[ドメイン2]−[ドメイン3] C末端
を有する少なくとも3個のドメインからなる一次配列構造を有するペプチドであって、ここで:
ドメイン1〜3中の残基を合わせた総数は40より多くなく、
ドメイン1および3中のR(アルギニン)残基を合わせた数は少なくとも5であり、
ドメイン1および3中のX残基を合わせた数は少なくとも1であり、
ドメイン1および3中のB残基を合わせた数は少なくとも2であり、ここで
X=アミノヘキサン酸およびB=ベータアラニンであり、
ドメイン2はアミノ酸Z1Z2FLI[SEQ ID NO:798]の少なくとも3個を含有する配列を含み、ここでZ1はYまたはIであり、かつZ2はQまたはRであり、かつ
ドメイン2はILFQY[SEQ ID NO:799]、ILFQ[SEQ ID NO:800]またはILIQ[SEQ ID NO:801]のN〜C末端の連続した一次配列を含有しない、前記ペプチド。
[態様2] 配列:
N末端 [ドメイン1]−[ドメイン2]−[ドメイン3] C末端
を有する少なくとも3個のドメインからなる一次配列構造を有するペプチドであって、ここで:
(i)ドメイン1は以下の配列から選択される配列を含み:
RXRZ3 [SEQ ID NO:762]
ここでZ3は以下の配列の1つから選択され:
RBRRXR [SEQ ID NO:763]
RBRRX [SEQ ID NO:764]
RBRX [SEQ ID NO:765]
RBRXR [SEQ ID NO:766]
BRX [SEQ ID NO:767]
BX [SEQ ID NO:768]
RBR [SEQ ID NO:769]
RB [SEQ ID NO:770]、または
RBRR [SEQ ID NO:771]
(ii)ドメイン2はアミノ酸Z1Z2FLI[SEQ ID NO:798]の少なくとも3個を含有する配列を含み、ここでZ1はYまたはIであり、かつZ2はQまたはRであり、かつここでドメイン2はILFQY[SEQ ID NO:799]、ILFQ[SEQ ID NO:800]またはILIQ[SEQ ID NO:801]のN〜C末端の連続した一次配列を含有せず、
(iii)ドメイン3は以下の配列から選択される配列を含み:
RXRBRXRB [SEQ ID NO:772]
XRBRXRB [SEQ ID NO:773]
RXRRBRB [SEQ ID NO:774]
BRXRB [SEQ ID NO:775]
XRRBRB [SEQ ID NO:776]
RRBRB [SEQ ID NO:777]
XRBRB [SEQ ID NO:778]
RBRXRB [SEQ ID NO:779]
RXRBRB [SEQ ID NO:780]、または
BRBRB [SEQ ID NO:781]
ここでX=アミノヘキサン酸、B=ベータアラニンである、前記ペプチド。
[態様3] ドメイン2がYQFLI[SEQ ID NO:802]、IQFLI[SEQ ID NO:803]、YRFLI[SEQ ID NO:804]、YRFRLI[SEQ ID NO:805]、FQILY[SEQ ID NO:806]、QFLI[SEQ ID NO:807]、QFL[SEQ ID NO:808]、またはILFRY[SEQ ID NO:811]から選択されるN〜C末端の連続した一次配列を含む、態様1または2に記載のペプチド。
[態様4] ドメイン1が以下の配列:
RXRRBRRXR [SEQ ID NO:782]
RXRRBRRX [SEQ ID NO:783]
RXRRBRX [SEQ ID NO:784]
RXRBRX [SEQ ID NO:785]
RXRRBRXR [SEQ ID NO:786]
RXRRBR [SEQ ID NO:787]
RXRRB [SEQ ID NO:788]、または
RXRRBRR [SEQ ID NO:789]
RXRBX [SEQ ID NO:790]
から選択される配列を含む、またはそれで構成される、態様1〜3のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様5] ドメイン3が以下の配列:
RXRBRXRB [SEQ ID NO:772]
XRBRXRB [SEQ ID NO:773]
RXRRBRB [SEQ ID NO:774]
BRXRB [SEQ ID NO:775]
XRRBRB [SEQ ID NO:776]
RRBRB [SEQ ID NO:777]
XRBRB [SEQ ID NO:778]
RBRXRB [SEQ ID NO:779]
RXRBRB [SEQ ID NO:780]、または
BRBRB [SEQ ID NO:781]
から選択される配列を含む、またはそれで構成される、態様1〜4のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様6] ドメイン2が4または5個のアミノ酸を有する、態様1〜5のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様7] ドメイン2が0、1、2または3個のR残基を含有する、態様1〜6のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様8] ドメイン2が少なくとも1または2個のR残基を有し、ドメイン1が5個以下のR残基を有し、ドメイン3が4個以下のR残基を有する、態様1〜7のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様9] 1個以上のR残基がD−アルギニンである、態様1〜8のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様10] 1個以上のR残基がL−アルギニンである、態様1〜9のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様11] ドメイン1および3がR、XおよびB残基のみを含有する、態様1〜10のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様12] ドメイン1が2〜6個のR残基、1〜3個のX残基および1〜2個のB残基のあらゆる組み合わせを有し、かつ長さが10残基より多くなく、かつ0、1または2個のR、XまたはBではない残基を有する、態様1〜11のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様13] ドメイン3が2〜5個のR残基、1〜3個のX残基、および1〜3個のB残基のあらゆる組み合わせを有し、かつ長さが9残基より多くなく、かつ0、1または2個のR、XまたはBではない残基を有する、態様1〜12のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様14] ペプチドが天然アミノ酸、XおよびB残基を含めて30残基の最大長を有する、態様1〜13のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様15] ドメイン1が4から12残基までの長さを有し、ドメイン2が3から9残基までの長さを有し、かつドメイン3が4から12残基までの長さを有し、ここで該長さに天然アミノ酸、XおよびB残基が含まれる、態様1〜14のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様16] SEQ ID NO:2〜308または317〜761(図18、23〜30、および41)の1つから選択される配列を含む、またはそれで構成される、態様1〜15のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様17] SEQ ID NO:2〜308または317〜761(図18、23〜30、および41)の1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、またはそれで構成される、態様1〜16のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様18] Pip−6a、Pip−6b、Pip−6e、Pip−6f(SEQ ID NO:2、3、6、または7)の1つのドメイン1〜3の配列またはPip−6a、Pip−6b、Pip−6e、Pip−6f(SEQ ID NO:2、3、6、または7)の1つのドメイン1〜3の配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、またはそれで構成される、態様1〜17のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様19] ペプチドがさらにC末端においてリンカーを含む、態様1〜18のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様20] リンカーがBCys、XCys、Cys、GGCys、BBCys、BXCys、XBCys、BX、またはXBから選択される、態様19に記載のペプチド。
[態様21] ペプチドがカーゴ分子に化学的にコンジュゲートされている、態様1〜20のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様22] コンジュゲーションがペプチドのC末端においてである、態様21に記載のペプチド。
[態様23] カーゴ分子が核酸、ペプチド核酸(PNA)、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド(PMO)、ロックド核酸(LNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉RNA(siRNA)、ペプチド、環状ペプチド、タンパク質、または薬物から選択される、態様21または22に記載のペプチド。
[態様24] カーゴ分子が5,000Da未満の分子量を有する、態様23に記載のペプチド。
[態様25] カーゴ分子がPNADMD[SEQ ID NO:309]もしくはPMODMD[SEQ ID NO:310]またはPNADMD[SEQ ID NO:309]もしくはPMODMD[SEQ ID NO:310]の1つに少なくとも90%の配列同一性を有する分子である、態様23または24に記載のペプチド。
[態様26] 態様1〜25のいずれか1項に記載のペプチドを含む、医薬組成物または薬剤。
[態様27] さらに薬学的に許容可能な希釈剤、アジュバントまたはキャリヤーを含む、態様26に記載の医薬組成物または薬剤。
[態様28] 疾患の処置の方法における使用のための、態様1〜25のいずれか1項に記載のペプチド。
[態様29] 疾患の処置における使用のための薬剤の製造における、態様1〜25のいずれか1項に記載のペプチドの使用。
[態様30] 態様1〜25のいずれか1項に記載のペプチドを患者に投与することを含む、処置を必要とする患者における疾患の処置の方法。
[態様31] 疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、メンケス病、β−サラセミア、前頭側頭型認知症、パーキンソン症候群、脊髄性筋萎縮症、筋緊張性ジストロフィー、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群、血管拡張性失調症変異(ATM)、または癌から選択される、態様28〜30のいずれか1項に記載のペプチド、使用または方法。
[態様32] 疾患が心臓の病気である、または心臓において明白である、態様28〜30のいずれか1項に記載のペプチド、使用または方法。
[態様33] 態様1〜25のいずれか1項に記載のペプチドまたはペプチド−カーゴコンジュゲートをコードしている、単離された核酸。
[態様34] 態様1〜25のいずれか1項に記載のペプチドまたはペプチド−カーゴコンジュゲートをコードしている核酸に作動可能に連結された制御配列を有する核酸ベクター。
1)ドメイン2の疎水性コアのアミノ酸の配列が逆になっている、または混ぜられている。
我々は、既に開示されたPip5e−PMOと比較してデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)のmdxマウスモデルにおける心筋中の高いエキソンスキッピングおよびジストロフィン産生を得る一方で全ての筋タイプにわたる高い活性を維持する上での中央の疎水性コアの役割を調べるためのPMOへのコンジュゲーションのために設計した一連のペプチドを記述する。
我々は以前に、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたアルギニンに富む細胞透過性ペプチド:Pip5e−PMOの1回投与後の高いスプライシング効率およびジストロフィン修復を含む印象的な心臓活性を報告してきた。しかし、この活性の基礎をなす機序は不十分にしか理解されていない。
Pip6 CPP系列の開発
我々の以前のリードPip系列のCPPであるPip5e[Yin, H., et al., Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(7): p. 1295-303]は、2個のアルギニンに富む側方の(flanking)領域および中央の疎水性コアを含有する。優れた心臓ジストロフィン産生の維持に関するその疎水性コアの構成の必要条件をさらに調べるため、我々は、その疎水性コア領域にのみ変異がなされている(例えばコア領域が混ぜられている、および部分的に削除されているペプチド)ある範囲のPip5e誘導体ペプチド(Pip6a〜f)を合成した。
PMO 25マーM23D(+7−18)(5’−GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT−3’[SEQ ID NO:310])(PMODMD)は、mdxマウスにおけるエキソンスキッピングに適したオリゴヌクレオチド類似体として一般的に用いられている37,42,43,44。これらの例の多くで、Bペプチド(配列RXRRBRRXRRBRXB[SEQ ID NO:311])をPMODMDにコンジュゲートし、そのままの(naked)PMODMDと比較してmdxマウスにおける筋内または静脈内送達によるエキソンスキッピングおよびジストロフィン産生を有意に増進することが示された。Bペプチド((RXR)4XBとXのB単位による2個のみの置換により異なる)は、DMD処置のためのPMOとのコンジュゲーションにおける臨床試験開発のためのリード候補ペプチドである43。
Pip−6a〜Pip−6i、Pip−7a〜Pip−7c2およびPip8a〜Pip−8c2ならびに対照のBペプチドを、PMODMDのコンジュゲートとして合成した。ペプチドをC末端カルボン酸の25マーPMOの3’末端へのアミドカップリング反応によりコンジュゲートした(Yin et al. Molecular Therapy Vol.19, No.7 1295-1303, July 2011を参照)。簡潔には、3’−アミド結合を以下のように実施した:DMSO中のPMO(100nmole)を、2倍過剰量のペプチドと、NMP中でTBTU:HOAt:DIEA(ペプチドに対して2.5:1.8:1.7モル過剰)を用いて37℃において2時間カップリングさせた。そのコンジュゲートを陽イオン交換HPLC(Source 15S,GE Healthcare)により精製し、HLBカラム(Waters)上で脱塩した。
Pip6−PMOコンジュゲートのエキソンスキッピングの可能性を、分化したマウスH2K mdx筋管において、一切の形質移入試薬の非存在下で(図1)、0.125μMから1μMまでの範囲の濃度で評価した。これは、培養された筋細胞におけるエキソンスキッピング活性は、Pip5e−PMOを含め、これらのコンストラクト全てに関して非常に類似していることを示した。これらの結果は、側方のアルギニンに富む配列は大部分が一定数のアルギニン残基(10)を含有していたが間隔をアミノヘキサノイル(アミノヘキサン酸)およびβアラニン単位を代替で配置することにより変動させていた以前のPip5系列[Yin et al、上記]とは異なっている。これは結果として、インビボでの活性とよく相関するエキソンスキッピング活性における小さな変動をもたらした。Pip6配列の場合、側方のアルギニンに富む配列は同一である(Pip6eを除く、それはコアの2番目の位置中に置換されているコアの直前の1個のアルギニンを除いて同一である)。その結果は、細胞のエキソンスキッピング活性はその疎水性コアの配列または長さに依存しないことを実証している。我々は以前にインビトロでのエキソンスキッピング活性における主な変化はむしろアルギニン残基の総数と相関していることを示していることを特筆する[Saleh, A.F., et al., Synthesis and splice-redirecting activity of branched, arginine-rich peptide dendrimer conjugates of peptide nucleic acid oligonucleotides. Bioconjug Chem, 2010. 21(10): p. 1902-11.]。
心組織におけるPip5e−PMOの効力を考えると、疎水性コアの配列を(5−aaの長さを維持しながら)変更する目的は、より低い用量でより効率的であり得るペプチドを同定することであった。これらの修飾には、その疎水性領域の反転(Pip6a)、チロシンのイソロイシンによる置換(Pip6b)、第1のアルギニンに富む側方領域中のそのコアに直接隣接するアルギニンの置換によるPip6a配列中のグルタミンの置換(Pip6e)、および混ぜられた疎水性コアの配列(Pip6f)が含まれていた。全てのPip6ペプチド−PMOコンジュゲートをmdxマウスに1回の12.5mg/kgの尾静脈経由の静脈内注射として投与し、2週間後に組織を採取し、RNAおよびタンパク質レベル両方で活性に関して評価した。
Huh−7細胞を、37℃で5%CO2/95%空気雰囲気下において10%ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質を補ったDMEM中で増殖させた。細胞をトリプシンで処理し、96ウェルプレート中にウェルあたり1.5×104細胞で蒔いた。一夜培養後、細胞をPBSで洗浄し、50μlのOptiMEM中のPMO−ペプチドコンジュゲートをそのウェルに3通りで(in triplicate)添加した。4時間のインキュベーション後、培地を100μlのDMEM/10%FBSで置き換えることによりコンジュゲートを除去し、さらに20時間培養した。20μlのMTS細胞生存度アッセイ(Promega)溶液を100μlのDMEMを含有するウェルに添加し、プレートを1〜2時間インキュベーションした後、490nmでのUV測定を行った。細胞生存度の百分率を、3通りの試料の平均吸光度を未処置の試料の平均値に対して正規化することにより決定した。
血清安定性を、Pip−PMOの分割量(10ナノモル)を100%マウス血清(100μL)に添加し、37℃で120または240分間インキュベーションすることにより測定した。それぞれの反応物を1Mグアニジニウム−HCl溶液(300μL)および氷冷したアセトニトリル(600μL)で希釈した。試料を混合し、−20℃に保ち、沈殿した血清タンパク質を遠心分離(13000rpm、5分間)により分離した。遠心分離後、上清を集め、凍結乾燥し、残留物を、MALDI−TOF質量分析による、および逆相HPLCによるペプチド分解に関する分析のために水中で溶解させた。HPLC条件は以下の通りであった:カラム、C18逆相(250×4.6mm);溶媒A、0.1%TFA、溶媒B、90%アセトニトリル、10%溶媒A;勾配、25分間における10%〜50%溶媒B。その結果は、Pip5e−PMO、Pip6a−PMO、Pip6e−PMOおよびPip6f−PMOに関して120分において残っている主成分を未変化のPip−PMOコンジュゲートとして同定することができること、ならびにペプチドの断片にコンジュゲートしたPMOのレベルは(RXRRBR)2XB−PMOに関するレベルと非常に類似していることを示した。
高い効率および心臓への送達を有するPip−PMOを同定する必要性に加えて、心臓への送達に重要であるPipペプチドの疎水性コアの要素をよりよく定めることはさらなる目的であった。この目的のため、疎水性コアの1アミノ酸(チロシンの除去;Pip6c)および2アミノ酸(イソロイシンおよびチロシンの除去;Pip6d)の部分的な欠失を含有するPipペプチドをPMOコンジュゲートとして合成した。
側方領域からコア中へのアルギニンの位置変更は、意外にも許容された(Pip6e−PMO)。従って、2種類のさらなるPip6−PMOコンジュゲートをPip6e−PMOの誘導体として合成した。Pip6g−PMOは第2のアルギニン残基を含有し、それは第2の側方領域から中央の疎水性コア中に移動しており、Pip6h−PMOは1個のアルギニンの位置がコア内で変更されるようにPip6eの疎水性領域の反転を含有する。
ペプチド−PMOコンジュゲートの合成
ペプチドは標準的なFmoc化学により合成され、HPLCにより精製された。PMO配列(5’−GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT−3’[SEQ ID NO:310])はGene Tools LLCから購入した。ペプチドを、以前に予備報告[Saleh AF, A.A.A., Yin H, Betts C, Hammond S, Wood MJA and Gait MJ, Enhancement of exon skipping and dystrophin production by 3 '-peptide conjugates of morpholino (PMO) oligonucleotides in a mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy in Collection Symposium Series, Chemistry of Nucleic Acid Components. 2011, Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciencesof the Czech Republic: Prague, p. 292-296]において記述したように、PMOの3’末端におけるアミド結合によりPMOにコンジュゲートし、続いてHPLCにより精製し、MALDI−TOF MSにより分析した。ペプチド−PMOコンジュゲートを使用前に滅菌水中で溶解させ、0.22μmセルロースアセテート膜を通して濾過した。
H2K mdx筋管を調製し、以前に記述した方法により[Yin, H., et al., Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(7): p. 1295-303.]、一切の形質移入剤の非存在下で、0.125、0.25、0.5および1.0μMの濃度のペプチド−PMOコンジュゲートと共にインキュベーションした。単離されたRNA全体からのネステッドRT−PCRの産物を2%アガロースゲル上での電気泳動により調べた。Δ23転写産物レベルの定量化をデンシトメトリーを用いて計算した。MTS細胞生存度試験(Promega)は、その研究において用いられたペプチド−PMOコンジュゲートの最も高い濃度における100%の生存を示した(データは示していない)。
4.5月齢〜5 1/2月齢のmdxマウスをこれらの実験において用いた(n=3)。その実験は、オックスフォード大学生物医学ユニットにおいて英国内務省により認可された手順に従って実施された。Pip6−PMOコンジュゲートは0.9%生理食塩水溶液中で12.5mg/kgの最終的な用量で調製された。160μlの総量を麻酔したマウスの尾静脈経由で投与した。2週間後、マウスをCO2吸入により屠殺し、筋肉および他の組織を採取し、冷却したイソペンタン中で瞬時に凍結させた(snap−frozen)後、−80℃で保管した。
ジストロフィン発現の実験のために組織試料の横断切片を切った(8μm厚)。ジストロフィンの可視化および定量化のため、切片をウサギ抗ジストロフィン(Abcam)およびラット抗ラミニン(Sigma)を用いて共染色し、それぞれヤギ抗ウサギIgG Alexa594およびヤギ抗ラットIgG488二次抗体(Invitrogen)により検出した。画像をLeica DM IRB顕微鏡およびAxiovisionソフトウェア(Carl Zeiss)を用いて捕捉した。定量的免疫組織化学を以前に記述されたように実施した[Malerba, A., et al., Chronic systemic therapy with low-dose morpholino oligomers ameliorates the pathology and normalizes locomotor behavior in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(2): p. 345-54; Arechavala-Gomeza, V., et al., Immunohistological intensity measurements as a tool to assess sarcolemma-associated protein expression. Neuropathol Appl Neurobiol, 2010. 36(4):p. 265-74.]。それぞれの処置に関する代表的な画像を選んだ。定量化のため、ジストロフィンおよび相関するラミニンの4つの代表的なフレームをそれぞれの処置に関する四頭筋、横隔膜および心臓のそれぞれの切片(n=3)に関して選んだ。ImageProソフトウェアを用いて、対象の10個の領域をランダムにラミニン画像上に配置し、それを対応するジストロフィン画像の上に重ねた。120個の領域に関する最小および最大蛍光強度をそれぞれの処置に関して記録した。バックグラウンド蛍光に関して補正するためにそれぞれの領域に関して強度の差を計算し、未処置のmdxおよび処置されたmdxをC57BL10に対して正規化した。これらの値を散布図上にプロットした。その‘相対強度平均値’をマルチレベル統計モデルを用いて計算した。これらの値を用いて、回復スコアの百分率をTREATNMDのウェブサイト(http://www.treatnmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/DMD_M.1.1_001.pdf)上に記載されているような次の方程式:(処置されたmdxマウスのジストロフィン回復−未処置のmdxマウスのジストロフィン回復)/(C57BL10マウスのジストロフィン回復−未処置のmdxマウスのジストロフィン回復)を実行することにより計算した。ジストロフィン関連タンパク質の染色は、以前に記述されたように[Yin, H., et al., Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(7): p. 1295-303]、MOMブロッキングキット(Vector Labs)およびα−サルコグリカンおよびα−ジストログリカン(Novocastra)抗体(1:100希釈)を用いて実施した。nNOS染色は、ヤギ抗ウサギ抗体(Abcam)を用いて実施した。
総RNAを、対照マウスおよび処置されたマウスの組織からTRIzol試薬(Invitrogen)を製造業者の説明書に従って用いて抽出した。
対照および処置された筋試料を、5%2−メルカプトエタノールを補った75mMトリス−HCl(pH6.5)および10%ドデシル硫酸ナトリウムを含む溶解緩衝液中でホモジナイズした。試料を100℃で3分間加熱した後、遠心分離して上清を除去した。タンパク質レベルをブラッドフォードアッセイ(Sigma)により測定し、BSA標準を用いて定量化した。10〜15μgの未処置および処置されたmdx試料のタンパク質、ならびにこれらの濃度の50%および10%のC57BL10タンパク質(陽性対照)を、3〜8%トリス−酢酸ゲル上にロードした。タンパク質をPVDF膜上にブロットし、ジストロフィンに関してDYS1抗体(Novocastra)を用いて、およびロード対照に関してα−アクチニン抗体(Sigma)を用いて調べた。一次抗体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(peroxidise)コンジュゲート抗マウスIgGの結合により、lumigenを用いて検出した。ウェスタンブロットを画像化し(LiCOR Biosciences)、Odyssey画像化システムを用いて分析した。
血漿試料をmdxマウスの頚静脈からCO2吸入による屠殺の直後に採取した。毒性バイオマーカーの分析は、MRC、Mary Lyonセンター臨床病理学実験室(英国ハーウェル)により実施された。
全てのデータは平均値±SEMを報告した。マルチレベル、繰り返し測定モデルをこの試験に関して実行した。そのマルチレベル統計アプローチは伝統的な統計法に基づいており、社会科学、医学および生物科学においてますます実施されている[Butterfield, A., et al., PyEvolve: a toolkit for statistical modelling of molecular evolution. BMC Bioinformatics, 2004. 5: p. 1; Brooks, G., et al., Referral Source and Outcomes of Physical Therapy Care in Patients With Low Back Pain. J Orthop Sports Phys Ther, 2012; Bernier, J., Y. Feng, and K. Asakawa, Strategies for handling normality assumptions in multilevel modeling: a case study estimating trajectories of Health Utilities Index Mark 3 scores. Health Rep, 2011. 22(4): p. 45-51; Winter, E.M., R.G. Eston, and K.L. Lamb, Statistical analyses in the physiology of exercise and kinanthropometry. J Sports Sci, 2001. 19(10): p. 761-75.]。この研究のために用いられたモデルは、免疫組織化学染色の定量化において実施される際、多数の‘相対強度単位’(レベル1)を、それぞれのマウスに関して(レベル2)、それぞれの処置に関して(レベル3)考慮する。この実施例では、mdx未処置マウスおよびPip5e−PMOで処置されたマウスを定数/固定されたパラメーターとして適用し、それに対して他の処置および野生型対照を比較した。これは正規分布を確実にするために実施されたBox−Coxべき乗変換に従っていた。統計分析はMLwINバージョン2.25を用いて実施された。
PMO配列(5’−GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT−3’[SEQ ID NO:310])はGene Tools LLCから購入した。ペプチドは標準的な9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)化学によりLibertyペプチド合成装置(CEM)を用いて100μmoleスケールで合成され、標準的な逆相HPLCにより90%より大きい純度まで精製され、MALDI−TOF MSにより特性付けられた。ペプチド−PMOコンジュゲートは、200nmole PMOスケールで、ペプチドのC末端のカルボキシル基をPMOの3’末端の第二級アミンに結合させることによるアミド結合により調製された(図1c)。ペプチド(PMOに対して2.5倍モル過剰量)のC末端カルボン酸を、1−メチル−2−ピロリジノン(NMP)およびジイソプロピルエチルアミン(DIEA)中で2−(1H−ベンゾトリアゾール−1イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート(HBTU)および1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)を用いて、ペプチドに対してHBTU:HOBt:DIEA(2.3:2.0:2.3)モル過剰量を用いて活性化した。その混合物をDMSO中で溶解させたPMO(10mM)の溶液に添加し、37℃で2時間インキュベーションした。次いでその混合物を4倍過剰量の水で希釈し、陽イオン交換クロマトグラフィーカラム(Resource S 6−mlカラム、GE Healthcare)上でリン酸ナトリウム緩衝液(緩衝液A:25mM Na2HPO4、25%アセトニトリル、pH7.0)、緩衝液B:1M NaCl、25mM Na2HPO4、25%アセトニトリル、pH7.0)、4ml/分の流速および25分間で0〜75%緩衝液Bの勾配を用いて精製してコンジュゲートしなかったPMOおよび過剰なペプチドを除去した。次いでそのコンジュゲートをOasis HLBカラム(4.6mm×20mm、Waters、マサチューセッツ州ミルフォード)上にロードし、水で洗浄して塩類を除去し、60%(v/v)アセトニトリルで溶離した。そのコンジュゲートを凍結乾燥し、MALDI−TOF MSにより、およびHPLCにより分析した(図37)。ペプチド−PMOコンジュゲートを使用前に滅菌水中で溶解させ、0.22μmセルロースアセテート膜を通して濾過した。全体の収率は、PMOに基づいて20〜25%であった。
コンジュゲーションは、HBTU:HOBt:DIEAに関して上記で記述した比率と同じ比率を保って、出発するPMOの1000ナノモルスケールにおいて向上した。コンジュゲーション反応をマイクロ波オーブン(CEM Discover)を用いて実施し、反応の温度を65℃に上げ、これは反応時間の15分への減少をもたらした。重要な精製工程もこのプロセスで向上した。粗反応混合物をHPLCにより、より大きいイオン交換カラム(Source 15S、GE Healthcare、HR16/10、ベッド体積18ml)を用いて精製し、過剰なペプチドおよびコンジュゲートしなかったPMOを除去し、リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)中塩化ナトリウム(NaCl、1.0M)の溶液を用いて溶離して、ペプチド−PMOの塩化物塩を得た。脱塩工程を用いて、特別注文のOasis HLB脱塩カラム(Waters、19×30mm)上で過剰なNaClを除去した。そのカラムを(HPLCグレードの水の代わりに)Milliporeグレードの水を用いて10分間洗浄した後、PPMOを水中60%(v/v)アセトニトリルで溶離した。500ナノモルを1回の注入で用いて、収率は多数回の注入(例えば2×250nmol)を用いるよりも高かった。これは結果としてこのワンポットコンジュゲーション反応の収率におけるおおよそ40%までの増大をもたらした。
重篤に衰弱させる神経筋障害であるDMDに関する今までで最も有望な療法はAOを用いた処置であり、それはジストロフィンのプレmRNAの読み枠をエキソンスキッピングにより修復する。2種類のAO、PMO[Cirak, S., et al., Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an openlabel, phase 2, dose-escalation study. Lancet, 2011. 378(9791): p. 595-605; Miller, F., C.F. Moseley, and J. Koreska, Spinal fusion in Duchenne muscular dystrophy. Dev Med Child Neurol, 1992. 34(9): p. 775-86.]および2’OMeオリゴヌクレオチド[van Deutekom, J.C., et al., Local dystrophin restoration with antisense oligonucleotide PRO051. N Engl J Med, 2007. 357(26): p. 2677-86; Goemans, N.M., et al., Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med, 2011. 364(16): p. 1513-22.]は現在臨床試験中であり、早期の有望な結果がDMD患者に関する希望を増大させてきた。しかし、非常に高い用量のそのままのPMOのmdxマウス中への投与を含む研究は、体の広い範囲の骨格筋におけるごく部分的なジストロフィンの修復および心臓における無視できるほどの修正を示してきた[Malerba, A., et al., Chronic systemic therapy with low-dose morpholino oligomers ameliorates the pathology and normalizes locomotor behavior in mdx mice. Mol Ther, 2011.19(2): p. 345-54; Malerba, A., et al., Dosing regimen has a significant impact on the efficiency of morpholino oligomer-induced exon skipping in mdx mice. Hum Gene Ther, 2009. 20(9): p. 955-65.]。心臓においてジストロフィンを修正する必要性は、骨格の表現型の修正が結果として心臓の作業負荷における増大をもたらし、そうして心筋症のさらなる進行をもたらした研究[Malerba, A., L. Boldrin, and G. Dickson, Long-term systemic administration of unconjugated morpholino oligomers for therapeutic expression of dystrophin by exon skipping in skeletal muscle: implications for cardiac muscle integrity. Nucleic Acid Ther, 2011.21(4): p. 293-8; Townsend, D., et al., Emergent dilated cardiomyopathy caused by targeted repair of dystrophic skeletal muscle. Mol Ther, 2008. 16(5): p. 832-5.]を受けて、今まで以上に明らかである。CPPとコンジュゲートしたPMOはmdxマウスにおいてそのままのPMOよりもはるかにもっと有効なジストロフィン修正を達成することができるという発見は、細胞およびインビボ送達を向上することによる高められたAOの有効性に関する新たな有望性をもたらしてきた。
そのPMO配列(5’−GGGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT−3’)[SEQ ID NO:310]はGene Tools,LLCから購入した。ペプチドは標準的な9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)化学により社内で合成され、90%より大きい純度まで精製され、MALDI−TOF MSにより特性付けられた。ペプチド−PMOコンジュゲートは、ペプチドのC末端のカルボキシル基をPMOの3’末端の第二級アミンに結合させることによるアミド結合により調製された(図33)。しかし、我々はペプチド−PMOのコンジュゲーションおよび最後の精製に関して以下のことを含むいくつかの改変を行った:a)(15μmolのPMOに至るまでの)大規模コンジュゲーション反応、b)ペプチド−PMOの個々の構成要素からの精製のためのより大規模なイオン交換カラムの使用(表1)、およびc)脱塩に関する、以前に用いられた逆相HPLCカラムの代わりのAmicon Ultra−15遠心フィルター装置の使用。結果として、収率は二倍より大きくなり、PMO配列に基づいてルーチン的に40〜55%であった。
インビトロでのPip7〜9−PMOの毒性評価
Pip7〜9−PMOの毒性試験を細胞生存度アッセイを用いて行った。これらは、10アルギニン−PMOコンジュゲート(Pip6e)は高レベルの細胞毒性を有することを示した(図42)。従って、可能性のある細胞毒性を最小限にするために、アルギニンおよびアミノヘキシル(アミノヘキサン酸)残基の数を減らすことにより、Pip6a(Pip8系列)、Pip6e(Pip7系列)およびPip6f(Pip9系列)を親ペプチドとして用いて、Pip7〜9系列を合成した。細胞生存度はPip7〜9−PMOで処置されたmdx筋管においてPip6eで処置された細胞と比較して実質的に増大し(図42)、これはそれに続くインビボでの試験に関する有望性を示唆している。
Pip7〜9−PMO化合物のエキソンスキッピング効率を評価するため、8週齢のmdxマウスに12.5mg/kgのPip7〜9−PMOを静脈内注射した。注射の2週間後に、前脛骨筋(TA)、横隔膜、四頭筋および心筋においてジストロフィン発現を分析した。我々は、免疫染色されたジストロフィン陽性線維、エキソンスキッピングされたmRNAおよびジストロフィンタンパク質レベルを評価した(図2〜4)。ジストロフィンで免疫染色された線維の強度をラット抗ラミニン抗体を正規化のために用いて分析し、これをC57BL/10の筋肉の強度レベルの比率として表した(図5)。エキソンスキッピングされたジストロフィン陽性筋線維の顕著な発現が、Pip7〜9−PMOを注射された骨格筋、例えばTA、四頭筋および横隔膜筋の全てにおいて、注射の2週間後に観察された(図43〜46)。しかし、Pip8b、Pip8c、Pip9b、Pip9b2およびPip9cのみが心臓において有意なジストロフィン発現を与えた(図46)。Pip7a、Pip7b、Pip7b2、Pip8c2、Pip9dおよびPip9d2は結果として心臓において無視できる程度のジストロフィン産生をもたらした(図46)。そのペプチドの構造を考慮すると、Pip9系列の混ぜられた(scrambled)疎水性コアでさえも心臓においてPip8系列と類似したジストロフィン発現をもたらしたため、疎水性コア領域中のアミノ酸の順序は重要性がより低いことは明らかである。
Pip7〜9−PMOで処置されたmdxマウスにおける毒性応答を評価するため、我々は処置されたマウスおよび対照から血清を抽出して分析することによりPip7〜9−PMO化合物の全身投与の2週間後に肝および腎機能の予備的評価を行っている。血清クレアチンキナーゼ(CK)、クレアチニン、尿素、アルカリホスファターゼ(ALP)、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、総ビリルビン、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)レベルの分析を実施した。PPMOで処置されたmdxの血清において、未処置のmdxの対照と比較して、腎毒性に関するマーカーである尿素およびクレアチニンならびに肝毒性に関するマーカーであるTBILのレベルにおける上昇はなかった(図47)。ALT、AST、ALPおよびLDHのレベルは未処置のmdxマウスにおいて上昇した。PPMOで処置されたmdxの血清において、未処置のmdxの対照と比較して、これらのマーカーのレベルにおける上昇はなかった。CKレベルはマウス間で変動性があった。
我々はmdxマウスにおいて骨格筋および心筋の両方で高レベルのジストロフィン修復を与えるPPMOを同定してきた。Pip8b、9b、9b2、8cおよび9cは、前脛骨筋(TA)、横隔膜、四頭筋および心臓における明白な毒性を伴わない非常に効率的なジストロフィン修復により重要な有望性を示してきた。
我々は、PPMO候補により誘導されるエキソンスキッピングされたジストロフィンの、mdxマウスにおいて筋病理を改善することによりマイクロRNAレベルを修正する能力を試験した。我々はジストロmir(ジストロフィン欠損症において調節不全になっているマイクロRNA)、miR−1およびmiR−133aのレベルを評価し、それはmdxの血清中で増大しており、かつmdxの組織中で減少しているか変化していないかのどちらかであり、従ってこれらは有用な血清マーカーを構成し得る。8週齢のmdxマウスにおける12.5mg/kgのPPMO(Pip8b、9b、9b2、8cおよび9c)の静脈内注射の2週間後に、PPMOで処置された血清においてmiR−133aおよびmiR−206のレベルを定量的(Q)−PCRにより調べ、参照マイクロRNAとしてのmiR−223に対して正規化した。miR−133aおよびmiR−206のレベルはPPMOで処置されたmdxマウスの血清中で未処置のmdx対照と比較して有意に下方制御されており、これは筋病理がPPMOにより改善されたことを暗示している(図51)。
HPLCおよびフィルター脱塩した9b2−PMOのエキソンスキッピング効率を比較するため、8週齢のmdxマウスに12.5mg/kgのPPMOを静脈内注射した。注射の2週間後に、ジストロフィン発現をTA、四頭筋、横隔膜および心筋において分析した。我々は、免疫染色されたジストロフィン陽性線維、エキソンスキッピングされたmRNAおよびジストロフィンタンパク質レベルを評価した(図52〜54)。ジストロフィンで免疫染色された線維の強度をラット抗ラミニン抗体を正規化のために用いて分析し、これをC57BL/10の筋肉の強度レベルの比率として表した(図52)。HPLCおよびフィルター脱塩した9b2−PMOにより誘導された筋線維膜において、エキソンスキッピングされたジストロフィンの強度レベルには変化はなかった。エキソンスキッピングされたジストロフィンRNAおよびタンパク質のレベルは、フィルター脱塩したPip9b2−PMOを注射された骨格筋において、HPLC濾過されたPMOで処置された筋肉、例えばTA、四頭筋および横隔膜と比較して、注射の2週間後においてわずかに増大していた(図53)。
HPLCおよびフィルター脱塩したPip9b2−PMOの毒性試験を、細胞生存度アッセイを用いて行った。細胞生存度は、それらを60μMのPip9b2−PMOを用いて処理した際に、フィルター脱塩したPip9b2−PMOで処理したmdx筋管において、HPLC脱塩したPip9b2−PMOで処理した細胞と比較してわずかに増大していた(図54)。
mdxマウスにおいて骨格筋および心筋の両方において高レベルのジストロフィン修復を与えるPPMO候補を同定してきた。特に、Pip8bおよび9bならびにPip9b2、8cおよび9cは前脛骨筋(TA)、横隔膜、四頭筋および心臓における明白な毒性を伴わない効率的なジストロフィン修復を示している。
Pip7およびPip8系列のペプチドを、以下のように細胞生存度アッセイにおいて試験した。Huh−7肝細胞を、37℃で5%CO2/95%空気雰囲気下において10%ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質を補ったDMEM中で増殖させた。細胞をトリプシンで処理し、96ウェルプレート中にウェルあたり1.5×104細胞で蒔いた。一夜培養後、細胞をPBSで洗浄し、50μlのOptiMEM中のPMO−ペプチドコンジュゲートをそのウェルに3通りで添加した。4時間のインキュベーション後、培地を100μlのDMEM/10%FBSで置き換えることによりコンジュゲートを除去し、さらに20時間培養した。20μlのMTS細胞生存度アッセイ(Promega)溶液を100μlのDMEMを含有するウェルに添加し、プレートを1〜2時間インキュベーションした後、490nmでのUV測定を行った。細胞生存度の百分率を、3通りの試料の平均吸光度を未処置の試料の平均値に対して正規化することにより決定した。
以前に記述された方法[Yin, H., et al., Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(7): p. 1295-303.]により、H2K mdx筋管を調製し、0.125、0.25、0.5、1.0および2.0μMの濃度のペプチド−PMOコンジュゲートと共に一切の形質移入試薬の非存在下でインキュベーションした。単離されたRNA全体からのネステッドRT−PCRの産物を2%アガロースゲル上での電気泳動により調べた。Δ23転写産物レベルの定量化をデンシトメトリーを用いて計算した。
Claims (31)
- 配列:
N末端 [ドメイン1]−[ドメイン2]−[ドメイン3] C末端
を有する少なくとも3個のドメインからなる一次配列構造を有するペプチドであって、ここで:
(i)ドメイン1は以下の配列から選択される配列を含み:
RXRZ3 [SEQ ID NO:762]
ここでZ3は以下の配列の1つから選択され:
RBRRXR [SEQ ID NO:763]
RBRRX [SEQ ID NO:764]
RBRX [SEQ ID NO:765]
RBRXR [SEQ ID NO:766]
BRX [SEQ ID NO:767]
BX [SEQ ID NO:768]
RBR [SEQ ID NO:769]
RB [SEQ ID NO:770]、または
RBRR [SEQ ID NO:771]
(ii)ドメイン2がYQFLI[SEQ ID NO:802]、IQFLI[SEQ ID NO:803]、YRFLI[SEQ ID NO:804]、YRFRLI[SEQ ID NO:805]、FQILY[SEQ ID NO:806]、QFLI[SEQ ID NO:807]、QFL[SEQ ID NO:808]、またはILFRY[SEQ ID NO:811]から選択されるN〜C末端の連続した一次配列を含む、
(iii)ドメイン3は以下の配列から選択される配列を含み:
RXRBRXRB [SEQ ID NO:772]
XRBRXRB [SEQ ID NO:773]
RXRRBRB [SEQ ID NO:774]
BRXRB [SEQ ID NO:775]
XRRBRB [SEQ ID NO:776]
RRBRB [SEQ ID NO:777]
XRBRB [SEQ ID NO:778]
RBRXRB [SEQ ID NO:779]
RXRBRB [SEQ ID NO:780]、または
BRBRB [SEQ ID NO:781]
ここでX=アミノヘキサン酸、B=ベータアラニンである、前記ペプチド。 - ドメイン1が以下の配列:
RXRRBRRXR [SEQ ID NO:782]
RXRRBRRX [SEQ ID NO:783]
RXRRBRX [SEQ ID NO:784]
RXRBRX [SEQ ID NO:785]
RXRRBRXR [SEQ ID NO:786]
RXRRBR [SEQ ID NO:787]
RXRRB [SEQ ID NO:788]、または
RXRRBRR [SEQ ID NO:789]
RXRBX [SEQ ID NO:790]
から選択される配列を含む、またはそれで構成される、請求項1に記載のペプチド。 - ドメイン3が以下の配列:
RXRBRXRB [SEQ ID NO:772]
XRBRXRB [SEQ ID NO:773]
RXRRBRB [SEQ ID NO:774]
BRXRB [SEQ ID NO:775]
XRRBRB [SEQ ID NO:776]
RRBRB [SEQ ID NO:777]
XRBRB [SEQ ID NO:778]
RBRXRB [SEQ ID NO:779]
RXRBRB [SEQ ID NO:780]、または
BRBRB [SEQ ID NO:781]
から選択される配列を含む、またはそれで構成される、請求項1または2に記載のペプチド。 - ドメイン2が4または5個のアミノ酸を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチド。
- ドメイン2が0、1、2または3個のR残基を含有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載のペプチド。
- ドメイン2が少なくとも1または2個のR残基を有し、ドメイン1が5個以下のR残基を有し、ドメイン3が4個以下のR残基を有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチド。
- 1個以上のR残基がD−アルギニンである、請求項1〜6のいずれか1項に記載のペプチド。
- 1個以上のR残基がL−アルギニンである、請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチド。
- ドメイン1および3がR、XおよびB残基のみを含有する、請求項1〜8のいずれか1項に記載のペプチド。
- ドメイン1が2〜6個のR残基、1〜3個のX残基および1〜2個のB残基のあらゆる組み合わせを有し、かつ長さが10残基より多くなく、かつ0、1または2個のR、XまたはBではない残基を有する、請求項1〜9のいずれか1項に記載のペプチド。
- ドメイン3が2〜5個のR残基、1〜3個のX残基、および1〜3個のB残基のあらゆる組み合わせを有し、かつ長さが9残基より多くなく、かつ0、1または2個のR、XまたはBではない残基を有する、請求項1〜10のいずれか1項に記載のペプチド。
- ペプチドが天然アミノ酸、XおよびB残基を含めて30残基の最大長を有する、請求項1〜11のいずれか1項に記載のペプチド。
- ドメイン1が4から12残基までの長さを有し、ドメイン2が3から9残基までの長さを有し、かつドメイン3が4から12残基までの長さを有し、ここで該長さに天然アミノ酸、XおよびB残基が含まれる、請求項1〜12のいずれか1項に記載のペプチド。
- SEQ ID NO:2〜308または317〜761(図18、23〜30、および41)の1つから選択される配列を含む、またはそれで構成される、請求項1〜13のいずれか1項に記載のペプチド。
- SEQ ID NO:2〜308または317〜761(図18、23〜30、および41)の1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、またはそれで構成される、請求項1〜14のいずれか1項に記載のペプチド。
- Pip−6a、Pip−6b、Pip−6e、Pip−6f(SEQ ID NO:2、3、6、または7)の1つのドメイン1〜3の配列またはPip−6a、Pip−6b、Pip−6e、Pip−6f(SEQ ID NO:2、3、6、または7)の1つのドメイン1〜3の配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、またはそれで構成される、請求項1〜15のいずれか1項に記載のペプチド。
- ペプチドがさらにC末端においてリンカーを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載のペプチド。
- リンカーがBCys、XCys、Cys、GGCys、BBCys、BXCys、XBCys、BX、またはXBから選択される、請求項17に記載のペプチド。
- ペプチドがカーゴ分子に化学的にコンジュゲートされている、請求項1〜18のいずれか1項に記載のペプチド。
- コンジュゲーションがペプチドのC末端においてである、請求項19に記載のペプチド。
- カーゴ分子が核酸、ペプチド核酸(PNA)、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド(PMO)、ロックド核酸(LNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉RNA(siRNA)、ペプチド、環状ペプチド、タンパク質、または薬物から選択される、請求項19または20に記載のペプチド。
- カーゴ分子が5,000Da未満の分子量を有する、請求項21に記載のペプチド。
- カーゴ分子がPNADMD[SEQ ID NO:309]もしくはPMODMD[SEQ ID NO:310]またはPNADMD[SEQ ID NO:309]もしくはPMODMD[SEQ ID NO:310]の1つに少なくとも90%の配列同一性を有する分子である、請求項21または22に記載のペプチド。
- 請求項1〜23のいずれか1項に記載のペプチドを含む、医薬組成物または薬剤。
- さらに薬学的に許容可能な希釈剤、アジュバントまたはキャリヤーを含む、請求項24に記載の医薬組成物または薬剤。
- 疾患の処置の方法における使用のための、請求項1〜23のいずれか1項に記載のペプチド。
- 疾患の処置における使用のための薬剤の製造における、請求項1〜23のいずれか1項に記載のペプチドの使用。
- 疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、メンケス病、β−サラセミア、前頭側頭型認知症、パーキンソン症候群、脊髄性筋萎縮症、筋緊張性ジストロフィー、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群、血管拡張性失調症変異(ATM)、または癌から選択される、請求項27に記載の使用のためのペプチド。
- 疾患が心臓の病気である、または心臓において明白である、請求項27に記載の使用のためのペプチド。
- 請求項1〜23のいずれか1項に記載のペプチドをコードしている、単離された核酸。
- 請求項1〜23のいずれか1項に記載のペプチドをコードしている核酸に作動可能に連結された制御配列を有する核酸ベクター。
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