CN103998458A

CN103998458A - 具有中央疏水域的细胞穿透肽

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Publication number: CN103998458A
Application number: CN201280042628.7A
Authority: CN
Inventors: 迈克尔·约翰·盖特; 安德烈·亚历山德罗维奇·阿尔祖马诺夫; 阿梅尔·F·萨利赫; 马修·J·A·伍德; 科琳娜·贝蒂; 具泰映
Original assignee: NAT INST FOR MEDICAL RES
Current assignee: British Research and Innovation Agency
Priority date: 2011-08-30
Filing date: 2012-08-29
Publication date: 2014-08-20
Anticipated expiration: 2032-08-29
Also published as: AU2012300633B2; WO2013030569A3; AU2012300633A8; IN2014MN00357A; BR112014004902A2; AU2012300633A1; CA2846218C; JP6077543B2; CA2846218A1; WO2013030569A2; EP2751128B1; EP2751128A2; US9302014B2; US20140342992A1; JP2014526238A; CN103998458B; BR112014004902B1; ES2876939T3

Abstract

本发明公开了细胞穿膜肽（CPP或膜转位肽）或它们与货物分子的结合。该肽作为药物输送系统、尤其作为输送载体对于基于核苷酸的治疗（如聚核苷酸、寡核苷酸和肽核酸）是有用的。本发明的CPP提供了良好的细胞进入效率和低毒性之间的平衡，包括三个连接域：中央部分是疏水性的，侧翼部分包含精氨酸和氨基己酸或β-丙氨酸残基。疏水性域包含选自YQFLI、YRFLI、IQFLI和IRFLI的序列。

Description

具有中央疏水域的细胞穿透肽

本发明的领域

本发明涉及肽，具体的、但不排除的涉及细胞穿透肽和细胞穿透肽和货物分子的结合物。

本发明的背景

靶向必需RNA序列的寡核苷酸（ON）已在近期众多的细胞中基因表达的调制应用中被发现，并作为潜在治疗剂^1,2。空间位阻ON比RNase H-诱导的反义ON和RISC-诱导的siRNA试剂强的机理优势在于具有更大的特异性，因为ON与不匹配的RNA结合不太可能引起不期望的脱靶生物效应。其次，可以使用更宽范围的合成的ON类似物，因为并不需要通过宿主RNA裂解酶的分子识别。

在作为空间阻断剂的ON类似物中最有用的是具有不带电荷的骨架的那些，如肽核酸（PNA）³和磷酰二胺吗啉代寡核苷酸（PMO）⁴。PNA和PMO ON均已在体内用于RNA靶向应用，有助于治疗的研发⁵。在细胞培养中，仅观察到相当少的PNA和PMO进入细胞，因此已花费了许多努力来研发加强细胞输送的方法。尤其有用的是细胞穿膜肽（CPP）（如穿透素、Tat（48-60）、转运素（Transportan）和（R-AHX-R） ₄（Ahx=氨基己酸））的连接物，希望在与PNA或PMO结合时，可以利用它们的被观察到的作为肽的细胞转位能力^6-9。

用于评价空间位阻ON活性的有价值的检测是由科莱和同事建立的，其涉及在人宫颈癌细胞（HeLa）pLuc705细胞的细胞核内由18-mer合成的（705位点）异常的地中海贫血β-球蛋白内含子的剪接校正和随后的虫荧光素酶报告的上调¹⁰。该检测具有非常高的动态范围，这样即使是非常低的活性水平也可作为正的发光读数被测量。已在该检测中测试了靶向于705剪接位点的CPP-PNA结合物，并且还报道了当在未添加转染试剂的情况下CPP-PNA结合物与HeLa pLuc705细胞培育时，几种不同的CPP的适宜活性水平，尽管单独的PNA无活性^11-13。在我们的实验室中，我们发现，尽管为了在检测中看到显著地活性，Tat-PNA或(Lys)₈-PNA结合物需要与100μΜ氯喹、核内体溶解剂共同培育^14,15，对于(R-Ahx-R)₄-PNA和(R-Ahx-R)₄-PMO构建体在μΜ范围中的活性可在没有氯喹的里面被得到^7,16。

我们还报道了一种CPP，其中6个精氨酸残基被加入到已知的CPP穿透素的N-末端^17,18。R₆-穿透素（R6Pen）二硫键结合至PNA补充的HIV-1的反式激活响应组分RNA，在Tat-依赖的反式激活抑制的HeLa细胞荧光素酶报告基因检测中表现出了显著活性，即为了抑制荧光素酶表达，需要核输送和结合TAR RNA¹⁸。

杜氏肌营养不良症（DMD）主要是由抗肌萎缩蛋白基因中的无意义或框移突变引起的X-连锁肌紊乱，在3500个新生男婴中的发生频率约为1个，并且急需潜在的治疗²⁹。DMD患者患有严重的、渐进的肌肉萎缩，而温和的Becker型肌营养不良是由框内缺失引起的，框内缺失导致蛋白质的表达缩短但具有部分功能。序列特异的反义寡核苷酸（ON）已显示出诱导靶向外显子跳跃以纠正突变的抗肌萎缩蛋白mRNA的读框，以使产生的较短的抗肌萎缩蛋白形式具有类似于Becker型肌营养不良的活性^30,31。已在如下模型进行了研究：在细胞模型中，在包含外显子23中的无意义突变的mdx肌营养不良小鼠模型中^31-33，和在已对外显子跳跃过程显示出了显著希望的小狗模型中。由于肌细胞核中ON与抗肌萎缩蛋白mRNA前体的结合通过“空间位阻”机理引起了剪接模式的改变实现了生物活性。

伴有DMD的患者往往患有心肌退化，这导致了诸如心肌病和X-隐性扩张型心肌病的心脏疾病形式。因此，CPP允许提高心肌中需要的功能性或部分功能性抗肌萎缩蛋白的表达。

反义寡核苷酸是目前用于杜氏肌营养不良症最有前景的治疗性干预。反义寡核苷酸调节抗肌萎缩蛋白mRNA前体的剪接，从而明确地修复抗肌萎缩蛋白读框，并生成了缩短了的但半功能性的抗肌萎缩蛋白。该方法开发中的挑战是较差的全身性反义寡核苷酸输送和在包括心脏在内的受影响非骨骼肌组织中低效的抗肌萎缩蛋白校正。

确定外显子跳跃效率的最重要因素之一是ON的化学反应。最广泛使用的是2'-O-甲基硫代磷酸酯（2'OMePS）。该骨架最初在I期临床检测中被测试，靶向在进行肌肉注射的DMD患者中的抗肌萎缩蛋白前体mRNA的外显子51³⁴。使用磷酰二胺吗啉代寡核苷酸（PMO）进行了类似的I期临床检测³⁵。涉及在DMD患者中全身输送的Ⅱ期临床检测已于近期完成了2'OMePS（Goermans N.M.等,(2011)新英格兰医学(New England J.Med.),364,1513-1522）和PMO化学反应（Cirak,S. 等,(2011)柳叶刀(The Lancet),doi:10.1016/S0140-6736(11)60756-3）。在小鼠中的研究已表明，与2'OMePS相比，使用PMO具有较高水平的外显子跳跃和抗肌萎缩蛋白表达的修复³⁵。PMO是非离子型分子，并被认为与靶细胞的细胞内分子不太可能形成多余的相互作用。

尹（Yin）和伍德（Wood）通过肌内注射mdx小鼠还验证了称为肽核酸（PNA）的另一非离子型类似物，并发现了显著诱导的外显子跳跃和抗肌萎缩蛋白生产²³。PMO和PNA被认为是具有序列特异性的无毒的ON类似物，其对于药物开发有着显著地潜力。外显子跳跃PMO已显示出在小鼠中的良好耐受性剂量为960mg/kg（Sazani,P.等(2011)国际毒理学杂志（Int,J.Toxocol），30，322-333），在猴子中为320mg/kg（Sazani,P.等(2011)Int,J.Toxocol，30,313-321）。

几个研究小组致力于CPP的设计（有时称为膜转位肽），当与非离子型ON（如PNA或PMO）结合时，有助于将它们输送到细胞中（而不是离子型），从而提高ON的生物活性。至于PMO，已公开的肽包含天然的和非天然的氨基酸（R-Ahx-R）₄-Ahx-B，当与PMO结合时会在许多细胞和体内模型中产生较高水平的空间位阻活性³⁶。这已在小鼠mdxDMD研究中被证实了³⁷。

为了用于体内应用，优选地，CPP证明了细胞和核膜的有效穿透，尤其是在与货物如PNA或PMO连接时，以便能够进行有效的剪接校正，如由科莱等人的剪接校正荧光素酶试验检测的EC₅₀为约0.90μΜ或更少。此外，为了抵抗在细胞穿透前的降解，CPP应具有良好的血清稳定性。用于治疗应用的CPP还应具有低毒性。

我们之前创建了一系列用于与具有20-mer的碱基序列GGCCAAACCTCGGCTTACCT[SEQ ID NO:309]的PNA货物(称为PNADMD)或具有25-mer的碱基序列GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT[SEQ ID NO:310]的PMO货物（称为PMODMD）结合的CPP。PNADMD和PMODMD在mdx肌细胞（体外）和mdx小鼠（体内）中通常用作适于外显子跳跃的寡核苷酸类似物。Pip5e-PMODMD在分化的小鼠H2K肌细胞和DMD的mdx小鼠模型中表现出外显子跳跃和抗肌萎缩蛋白表达的修复，包括在心肌中诱导抗肌萎缩蛋白生产。Pip5e具有序列：RXRRBRRXRILFQYRXRBRXRBC[SEQ ID NO:1]，并在WO2009/147368和尹（Yin）等（分子治疗（Molecular Therapy）19卷， 7期1295-1303，2011年7月）中公开。Pip5e肽的序列可分解为三个域，两个富含精氨酸域（RXRRBRRXR和RXRBRXRB）和中央疏水性核心（ILFQY）。发现PIP-5e在输送PMODMD到心肌中具有良好的活性。

吴（Wu）等人（核酸研究（Nucleic Acids Research），2007，35卷，15期5182-5191）报道了CPP-PMOF（F代表3'-羧基荧光素标记）结合物，在该结合物中X或B残基被插入到低聚R序列中，增强了剪接校正活性和细胞摄取并辅助血清结合，但该结合物并不如R8-和R9-结合物一样有效地进入细胞。他们还报道了X残基的数量影响了核反义活性和结合物的毒性，具有多于5X残基的肽在细胞株60μΜ时呈现出时间、浓度与毒性的相关性。他们建议保持X残基的数量小于5以减少毒性。他们还报道说，在（RX）n或（RB）n中减少RX或RB的重复数量降低了细胞摄取，并降低了剪接校正能力（在HeLa细胞检测中）。

阿贝斯（Abes）等人（核酸研究（Nucleic Acids Research），2008，36，6353-6354）讨论了具有（RXR）n-PMO结构的CPP分子，并报道了几个被测试的间隔（X）分子，直链C₄（Abu）、C₆（Ahx）、或C₈（Acy）间隔是最有效的。

萨利赫（Saleh）等人（生物结合物化学（Bioconjugate Chem.），21卷，10期1902-1911（2010））报道了增加直链（RXR）n排列中的精氨酸残基的数目到12和16用于结合PNA，在HeLa细胞试验中不仅增强了剪接校正能力，还提高了细胞毒性。支链化（2或4个分支）没有导致提高活性。2-分支和某些4-分支可用于12和16精氨酸构建体，但并不用于8精氨酸构建体。

因此，与低聚R肽相比，增加间隔残基（如X）的数量似乎增加了毒性，并减少了细胞进入的效率，但也可以增强剪接校正活性。另一方面，大量的R残基似乎导致进入细胞效率的增加，但也增强了毒性，这是不希望的。因此，需要CPP提供良好的细胞进入效率和低毒性的平衡。此外，对于CPP理想的是在体内显示出有利的特性，如在小鼠模型中、在mdx中、在包括心脏的所有肌肉类型中，指导高效的外显子跳跃和抗肌萎缩蛋白生产。

本发明的概要

本发明人现已创建了一系列新的CPP，并评价了它们促进结合的货物分子进入细胞的能力、以及CPP的细胞毒性。

意外的是，本发明人已确定，疏水性核心域的直链N-到C-末端序列（一级序列）对细胞穿透活性并不是必要的，并且核心氨基酸的存在、而不是它们的一级序列才是重要因素。同样地，他们还意识到，结构-活性的关系并不依赖于由疏水性核心中的氨基酸的特定直链序列顺序提供的结构，而是依赖于疏水性核心中的某些氨基酸的存在。这使得发明人设计了一系列新的本文中描述的细胞穿透肽。

因此，发明人已确定了一系列新的具有前景的细胞穿透肽。肽可以作为载体部分以促进货物跨细胞和核膜的运动，并可选的输送货物至特定器官类型（如心脏）。还提供了肽-货物的结合物。

已制备了四种新型的肽序列，并且他们作为肽-PMO货物结合物被测试。肽和连接的货物示于图18和41中，并被总结如下：

Pip-6a、Pip-6b、Pip-6c、Pip-6d、Pip-6e、Pip-6f、Pip-6g、Pip-6h、Pip-6i[SEQ ID NOs:2-10]；

Pip-7a、Pip-7b、Pip-7c、Pip-7d、Pip-7b2、Pip-7c2[SEQ ID NOs:11-16]；

Pip-8a、Pip-8b,Pip-8c、Pip-8c2、Pip-8d、Pip-8d2、Pip-8d3[SEQ ID NOs:17-20和317-319]；或

Pip-9b、Pip-9b2、Pip-9c、Pip-9c2、Pip-9c3、Pip-9d、Pip-9d2、Pip-9d3、Pip-9d4[SEQ ID NOs:320-328]。

与PMODMD结合的Pip-6a[SEQ ID NO:2]、Pip-6b[SEQ ID NO:3]、Pip-6c[SEQ ID NO:4]、Pip-6d[SEQ ID NO:5]、Pip-6e[SEQ ID NO:6]、Pip-6f[SEQ ID NO:7]、Pip-6g[SEQ ID NO:8]、Pip-6h[SEQ ID NO:9]和Pip-6i[SEQ ID NO:10]在体外的mdx小鼠细胞中均显示出高水平的外显子跳跃。与Pip-5e相比，Pip-6a、Pip-6b和Pip-6f在mdx小鼠的心肌中（即体内）维持了外显子跳跃和抗肌萎缩蛋白生产。Pip-8b,Pip-8c、Pip-9b、Pip-9b2和Pip-9c在胫骨前肌（TA）、膈肌、四头肌和心脏中也显示出有效的抗肌萎缩蛋白的修复，没有明显的毒性。

因此，测试的CPP-PMO结合物和具有大致类似的序列一致性和结构的肽的细胞穿透肽组分被期望有助于促进货物诸如反义寡核苷酸（包括PNA、PMO、siRNA、肽和蛋白质、以及小分子）穿透细胞和核。

因此，本发明提供的肽有助于促进此类货物跨细胞膜（如哺乳动物细胞的细胞膜和/或哺乳动物细胞的核膜）的摄取。该类肽可被称为“细胞穿透肽”，并可以与货物结合以利于货物跨细胞膜的运输。

根据本发明的肽具有的序列是化学连接的单分子。该肽序列可包括氨基酸和可选的非氨基酸，如氨基己酸间隔残基。例如，在肽的某些部分中，氨基己酸间隔可化学的键合到第一氨基酸的C-末端和第二氨基酸的N-末端，从而化学的连接两个氨基酸。在本说明书中，氨基酸被看作是一个“残基”，间隔分子或非天然的氨基酸也被看作是一个“残基”。

该肽可包括修饰的和非天然存在的氨基酸。优选地，任意的间隔残基和修饰的或非氨基酸通过共价肽（酰胺）键[-C(=O)NH-]被连接到相邻的残基上。

每种肽包含以下面的直链排列的3个域，或由其组成：

N-末端[域1]-[域2]-[域3]C-末端

每个域具有共同的序列特征，但每个域的确切序列能够变化和修改。因此，对于每个域，序列的范围是可能的。每个可能的域序列的结合产生了的肽序列的范围，这形成了本发明的部分。

核心的肽序列通过域1-3的连续的氨基酸（和任选的间隔）序列表示。可存在排列成允许键接到货物的任选的连接体序列，通常在域3的C-末端。

在下面的描述中使用标准的单字母氨基酸代码。涉及到的非天然氨基酸和间隔分子使用以下单字母代码：

X=氨基己酸、氨基丁酸、氨基辛酸、β-丙氨酰、p-氨基苯甲酰、异哌啶甲酰基（isonipecotyl）、或4-氨基丁酰中的任一个

B=β-丙氨酸

R=精氨酸

域1是精氨酸富含序列，在长度中可以有4、5、6、7、8、9、10、11、12或多个氨基酸。优选地，域1具有5、6、7、8或9个残基（例如X、B或R）。

优选地，域1具有两个或多个阳离子氨基酸，其中疏水性氨基酸或间隔基团分隔某些阳离子氨基酸。在优选地实施例中，阳离子氨基酸为精氨酸（R）。优选地，域1具有至少2个精氨酸残基，优选为2、3、4、5或6个精氨酸残基中的一种情况。在某些实施例中，域1包含 3、4、5、6或更多个精氨酸残基。

域1优选地具有小于15个残基的最大长度，更优选地小于13个残基的最大长度和4个残基的最小长度（例如X、B或R）。

优选地域1序列选自：

RXRRBRRXR[SEQ ID NO:782]

RXRRBRRX[SEQ ID NO:783]

RXRRBRX[SEQ ID NO:784]

RXRBRX[SEQ ID NO:785]

RXRBX[SEQ ID NO:790]

RXRRBRXR[SEQ ID NO:786]

RXRRBR[SEQ ID NO:787]

RXRRB[SEQ ID NO:788]，或

RXRRBRR[SEQ ID NO:789]的组。

域2包含核心氨基酸序列。该序列包括包含至少3个氨基酸Z₁Z₂FLI的序列，其中Z₁为Y或I，Z₂为Q或R。该氨基酸Z₁Z₂FLI可以为任意顺序。本发明人发现，域2的一级序列（即从N-到C-末端的顺序）对于细胞穿透活性不是必要的。在某些特别优选地实施例中，域2不包含ILFQY、ILFQ或ILIQ的N-到C-末端相连的一级序列，尽管它可以在不同的N-到C-末端相连的一级序列顺序中包含这些氨基酸。

域2序列可在序列N-或C-的一个或两个末端包含1、2、3、4或5个附加的氨基酸。优选地在N-末端有0、1或2个氨基酸，在C-末端有0、1或2个氨基酸。同样的，域2在长度上可以有3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。优选地，域2为疏水性域。

优选地，域2具有小于10个残基的最大长度，更优选地小于7个残基的最大长度和3个残基的最小长度，更优选地4或5个残基（相应长度包括间隔基团，例如X和非天然氨基酸）的最小长度。在优选地实施例中，域2具有3、4、5或6个残基（包括间隔基团，例如X和非天然氨基酸）。附加的氨基酸可以是任何类型的。

域3为阳离子域，并且优选地具有选自以下的序列：

RXRBRXRB[SEQ ID NO:772]

XRBRXRB[SEQ ID NO:773]

RXRRBRB[SEQ ID NO:774]

BRXRB[SEQ ID NO:775]

XRRBRB[SEQ ID NO:776]

RRBRB[SEQ ID NO:777]

XRBRB[SEQ ID NO:778]

RBRXRB[SEQ ID NO:779]

RXRBRB[SEQ ID NO:780]，或

BRBRB[SEQ ID NO:781]

优选地，域3具有两个或多个阳离子氨基酸，其中疏水性氨基酸或间隔基团分隔某些阳离子氨基酸。在优选的实施例中，阳离子氨基酸为精氨酸（R）。优选地，域3具有至少2、3或4个精氨酸残基。在某些实施例中，域3包含1、2、3、4、5、6或更多个精氨酸残基。

在某些实施例中，域3具有3个氨基酸的最小长度和15个残基（包括间隔基团，例如X和非天然氨基酸）的最大长度。在某些实施例中，包括间隔基团的最小长度为4个或多于4个，包括间隔基团的最大长度为12个或少于12个。在某些实施例中，域3具有3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个残基之一的长度。

精氨酸残基在域1、2和3中合起来的总数可以是残基总数的30-60％，并且可以是30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％中的一个。在某些实施例中，精氨酸残基在域1，2和3中合起来的总数可在残基总数的30-50％范围内，或者在30％-45％、或30-40％或35-45％范围内。

在域1和3中使用氨基己酸和β-丙氨酸是有利的，因为它有助于减少所述肽的免疫原性，并增强对蛋白质水解的抗性。

连接体可被排列为允许所述肽化学连接到货物。该连接体也可作为间隔把所述肽的域1-3部分从货物分隔开。连接体序列的范围可能包括具有C-末端半胱氨酸残基的序列，所述C-末端半胱氨酸残基允许形成二硫化物、硫醚或硫醇-马来酰亚胺的键。连接该肽到货物上的其他方法包括利用C-末端醛形成肟，利用链接反应或与肽上的碱性氨基酸形成吗啉代键，所述肽在域3前可跟随有包括：X或B或XB或BX的间隔序列。

连接体序列在长度中可以有1、2、3、4、5或多个氨基酸和/或残基（包括间隔基团）。连接体序列可选自：BCys、XCys、Cys、GGCys、BBCys、BXCys、XBCys、X、XX、B、BB、BX或XB的组。任意的 B或X可由另一间隔取代，其所述另一间隔物例如可选自4-氨基丁酰（Aib）和异哌啶甲酰基（isonicopecotyl）。

连接体序列可构成连接有肽的货物的一部分。在某些实施例中，该货物的连接体是直接连在域3序列的C-末端。同样的，在某些实施例中，不需要连接体序列，或连接体序列由该货物和域3序列的连接提供。

根据以上所述，根据本发明的肽可表示为如下：

Z₄YQFLIZ₅[SEQ ID NO:791]

Z₄IQFLI,Z₅[SEQ ID NO:792]

Z₄YRFLIZ₅[SEQ ID NO:793]

Z₄YRFRLIZ₅[SEQ ID NO:794]

Z₄FQILYZ₅[SEQ ID NO:795]

Z₄QFLIZ₅[SEQ ID NO:796]

Z₄QFLZ₅[SEQ ID NO:797]

其中，Z₄选自

RXRRBRRXR[SEQ ID NO:782]

RXRRBRRX[SEQ ID NO:783]

RXRRBRX[SEQ ID NO:784]

RXRBRX[SEQ ID NO:785]

RXRRBRXR[SEQ ID NO:786]

RXRRBR[SEQ ID NO:787]

RXRRB[SEQ ID NO:788]，或

RXRRBRR[SEQ ID NO:789]中的一个，

Z₅选自

RXRBRXRB[SEQ ID NO:772]

XRBRXRB[SEQ ID NO:773]

RXRRBRB[SEQ ID NO:774]

BRXRB[SEQ ID NO:775]

XRRBRB[SEQ ID NO:776]

RRBRB[SEQ ID NO:777]

XRBRB[SEQ ID NO:778]

RBRXRB[SEQ ID NO:779]

RXRBRB[SEQ ID NO:780]，或

BRBRB[SEQ ID NO:781]中的一个，

其中，Z₅可任选地包括在C-末端处的连接体，该连接体可以是BCys、XCys、Cys、GGCys、BBCys、BXCys或XBCys、X、XX、B、BB、BX或XB中的一个。

优选地，肽可以包括选自SEQ ID NO2-308或317-761之一的序列，或由其组成（图18、图23-30和图41）。

根据本发明的肽可选自SEQ ID NO：2、3、6或7之任一个。

除去货物分子外，根据本发明的肽可具有40个残基的最大长度，更优选为30个残基的最大长度，并且还更优选为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个残基之一的最大长度，以及10个残基的最小长度，更优选为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个残基之一的最小长度（最大和最小长度包括任意间隔分子，例如X和非天然的或修饰的氨基酸）。

根据本发明的肽可被提供作为肽-货物结合物，其中，所述肽进一步包括在所述肽的N-末端或C-末端、优选为在C-末端化学连接（优选为共价连接）到所述肽上的货物分子。化学连接可通过二硫键、硫醚或硫醇-马来酰亚胺的键，或通过C-末端羧酸经由酰胺连接。

所述货物分子可以是任意的小分子，例如小分子药物、肽、环肽、蛋白质、药物或治疗剂（例如，分子量小于10,000Da，优选小于5000Da或小于3000Da，并在某些情况下小于1000Da）。所述货物分子可以是核酸，反义寡核苷酸（如PNA、PMO、LNA）或siRNA。优选地，货物分子是电中性的寡核苷酸类似物，如PNA或PMO。

在一个实施例中，所述货物是PNA705（CCTCTTACCTCAGTTACA[SEQ ID NO:316]）。在另一个实施例中，所述货物是PNADMD（SEQ ID NO:309）。在另一个实施例中，所述货物是PMODMD（SEQ ID NO:310）。所述货物分子可与PNADMD（SEQ ID NO:309）或PMODMD（SEQ ID NO:310）之一具有至少80％、优选至少90％的序列一致性。赖氨酸残基可被添加到这些PNA或PMO分子的一端或两端以改善水溶性。半胱氨酸可被添加在C-末端或N-末端以允许二硫键的形成或硫醚结合物或硫醇-马来酰亚胺结合物的溴乙酰化。

根据本发明的肽可以以分离的或纯化的形式被提供，带有或不带有货物分子。

肽的衍生物也是本发明的一部分。肽衍生物包括给定的肽序列的变型体（例如SEQ ID NO:2-308中的一个），这些给定的肽序列的变型体与标准长度的肽具有大体上的氨基酸序列一致性（例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％），并优选地具有相同或更好的外显子跳跃活性或细胞活性。肽衍生物可具有1、2或3个氨基酸或多于或少于SEQ ID NO:2-308之一的间隔分子。

在校正序列及引入空位（如果必要的话）以达到最大程度的序列一致性，而且不考虑作为序列一致性一部分的任意保守替换之后，百分比（％）序列一致性定义为候选序列中残基（包括间隔基团）的百分比，这与已给出的列举的序列中的残基一致（通过SEQ ID NO提到）。优选地，计算出的序列一致性超过相应序列的整体长度。

以本领域技术人员已知的多种方式，例如，使用公众可利用的计算机软件如ClustaIW1.82.T-coffee或Megalign(DNASTAR)软件来实现确定氨基酸序列一致性百分比目的的校正。当使用此类软件时，优选的使用默认参数，如用于空位罚分和延伸罚分。ClustaIW1.82的默认参数是：蛋白质空位开放罚分=10.0，蛋白质空位延伸罚分=0.2，蛋白质矩阵=Gonnet，蛋白质/DNA ENDGAP=-1，蛋白质/DNA GAPDIST=4。

肽衍生物也可包括保守氨基酸替换物，所述保守氨基酸替换物例如可以位于下列基团中的氨基酸之间：

（i）甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸;

（ii）谷氨酸和天冬氨酸;

（iii）精氨酸、组氨酸和赖氨酸;

（iv）天冬酰胺和谷氨酰胺;

（v）异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸;

（vi）苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

优选地，根据本发明的肽与PMODMD结合时在分化的小鼠H2K肌细胞的外显子跳跃中显示出了高活性（尹等（分子治疗，19卷，7期1295-1303，2011年7月）。优选地，在该检测中确定的EC₅₀小于2μΜ。在某些实施例中，在该检测中确定的EC₅₀小于1μΜ、小于0.9μΜ、小于0.8μΜ、小于0.7μΜ或小于0.6μΜ。优选地，根据本发明的肽在外显子跳跃细胞检测中作为Pip-5e或(RXRRBR)₂XB[SEQ ID NO:311]之一显示出较高或相同的活性（即它们具有较低的或相同的EC₅₀）。

根据本发明优选的肽与R6Pen相比，在血清（如小鼠或人血清）中2小时后表现出增强的血清稳定性，与Pip-5e或(RXRRBR)₂XB[SEQ ID NO:311]相比，优选具有相同（或可选更好的）血清稳定性。血清稳定性可通过添加小份的Pip-PMO(10nmol)到100％小鼠血清（100μL）中，并在37℃培育120或240分钟被测量。使用IM胍-HCL溶液（300μL）和冰乙腈（600μL）稀释每个反应。混合样品并保持在-20℃，通过离心法（13000rpm，5分钟）分离出沉淀的血清蛋白。离心后，收集上清液，冻干，将滤渣溶于水中通过MALDI-TOF质谱法、并通过反相HPLC来分析肽的降解。HPLC条件为：柱，C18反相（250×4.6mm）；溶剂A，0.1％三氟乙酸（TFA），溶剂B，90％乙腈，10％溶剂A；梯度，在25分钟内10％-50％溶剂B。

在本发明的肽和肽结合物中，氨基酸、氨基酸间隔物和货物分子优选地是通过共价键化学的连接。

可提供根据本发明的肽和肽-货物结合物用于医学治疗的方法中。医学治疗可优选地需要输送货物分子进入细胞和任选的细胞核中。

相应地提供肽和/或肽-货物结合物用于疾病的治疗中。还提供了肽和/或肽-货物结合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。还提供了治疗需要对疾病进行治疗的患者或受试者的方法，包括在治疗上给予有效量的肽和/或肽-货物结合物给患者或受试者的步骤。优选地，肽-货物结合物的货物组分包括能够治疗、预防或改善疾病的活性剂（例如药剂）。

治疗的疾病可包括通过药物或治疗性分子改善细胞和/或核膜的穿透可引起治疗效果改善的任意疾病。治疗的疾病可包括（全部或部分的）由剪接缺陷产生的疾病状况，如杜氏肌营养不良症（DMD）、贝克肌营养不良症、以及其它肌肉疾病如肢带型肌营养不良症（LGMD）、面肩肱型肌营养不良症、先天性肌营养不良症、眼肌营养不良症（OMD）、远端型肌营养不良症和埃-德型肌营养不良症（EDMD）、以及门克斯病³⁸、β-地中海贫血³⁹、以减轻额颞叶痴呆、帕金森和脊髓性肌萎缩³⁹、早年衰老综合症（Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome） ⁴⁰、突变的（ATM）共济失调-毛细血管扩张症⁴¹、脊肌萎缩症、肌强直性营养不良症1或癌症的tau蛋白的剪接校正。在这些疾病的某些发病机理中牵连的基因包括抗肌萎缩蛋白（杜氏肌营养不良症和贝克肌营养不良症），DMPK（DM1型MD），ZNF9（DM2型MD），PABPN1 （OMD），伊莫菌素（emerin），核纤层蛋白（lamin）A或核纤层蛋白C（EDMD），肌收缩蛋白（myotilin）（LGMD-1A），核纤层蛋白A/C（LGMD-1B），小窝蛋白（caveolin）-3（LGMD-1C），钙蛋白酶（calpain）-3（LGMD-2A），迪赛福林（dysferlin）（LGMD-2B和三好氏远端肌肉病变），γ-肌聚糖（sarcoglycan）（LGMD-2C），α-肌聚糖（LGMD-2D），β-肌聚糖（LGMD-2E），δ-肌聚糖（LGMD-2F和CMD1L），视松蛋白（telethonin）（LGMD-2G），TRIM32（LGMD-2H），福库汀（fukutin）相关蛋白（LGMD-2I），肌联蛋白（LGMD-2J）和O-甘露糖转移酶-1（LGMD-2K）。

在涉及剪接缺陷疾病的情况下，货物可包括寡核苷酸、PNA、PMO或包括LNA的其他寡核苷酸类型，能够防止或校正剪接缺陷和/或增加（例如许多）正确的剪接mRNA分子产生。本发明当然不会限定能够校正剪接缺陷的货物分子。货物分子可包括其他的寡核苷酸、PNA、PMO或LNA分子，这样寡核苷酸分子能够靶向mRNA或微RNA，例如siRNA和shRNA，以对基因表达以及非寡核苷酸分子进行抑制。

根据本发明的结合到PMODMD的肽在心肌（引起包含抗肌萎缩蛋白的纤维的产生）的外显子跳跃中已显示出极好的疗效。心力衰竭是患有DMD患者死亡的主要原因，根据本发明的肽通过结合能够诱导外显子跳跃引起心脏组织、特别是心肌中正常的抗肌萎缩蛋白生产的寡核苷酸（例如，PNA或PMO），特别地有助于DMD的治疗。这对于仅在骨骼组织中修复抗肌萎缩蛋白的II期临床检测（2'OMe和PMO）的成功是特别重要的。大家很关的是，这有可能会增加心脏的工作负荷，从而推动/加速心脏疾病进展。肽-PMODMD结合物在DMD的治疗中被认为是特别有用的。

因此，根据本发明的肽对于输送货物分子至心脏组织、尤其是心肌是特别有用的。于是，提供根据本发明的肽-货物结合物用于治疗过心脏或心肌疾病或病症，或者用于治疗在心脏或心肌中表现出的疾病或病症，如心脏疾病和心肌病。

治疗的心肌病可以是冠状动脉心脏疾病，先天性心脏疾病，局部缺血的、高血压的、炎症性的或内在的心肌病。内在的心肌病包括下列疾病（伴有相应的基因）：扩张型心肌病（抗肌萎缩蛋白、G4.5、肌动蛋白、结蛋白、δ-肌聚糖、肌钙蛋白T、β-肌球蛋白重链、α-原肌球蛋白、线粒体呼吸链），伴有传导疾病的扩张型心肌病（核纤层蛋白A/C），肥厚型心肌病（β-肌球蛋白重链、肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、α-肌球蛋白、肌球蛋白结合蛋白C、肌球蛋白必需轻链、肌球蛋白调节轻链、肌联蛋白），伴有预激综合征的肥厚型心肌病（AMPK、线粒体呼吸链），以及左室致密化不全（G4.5、α-小机营养蛋白）。

治疗的患者或受试者可以是任意动物或人。患者或受试者可以是人以外的哺乳动物，但更优选的是人类患者。患者或受试者可以是男性或女性。

根据本发明各方面的药物和药物组合物可通过包括但不限于肠胃外、静脉内、动脉内、肌内、肿瘤内、腹腔内、皮下、口腔和鼻腔的多种途径被配制用于给药。药物和组合物可以配制成液体或固体形式。液体制剂可被配制用于通过注射给药到人体或动物体的选定区域。

优选以“治疗有效量”给药，这对于个体充分显示了益处。给药的实际用量、给药的速率和时间过程将取决于所治疗疾病的性质和严重程度。治疗的处方，例如在剂量上的决定等，是在全科医师和其它医生的责任范围内，并通常需要考虑治疗的病症、每个患者的病情、输送的位点、给药方法以及执业医师已知的其它因素。上述提到的技术和原则的实施例可在利平科特、廉姆斯和威尔金斯（Lippincott,Williams&Wilkins）2000年出版的第20版次的雷明顿药物科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）中找到。

还提供了在体外方法中使用的肽和肽-货物结合物。例如，提供了在外显子跳跃检测或细胞存存活率检测中肽和/或肽-货物结合物的用途。此外，提供了在DMD、mdx小鼠的小鼠模型中使用的用于外显子跳跃和抗肌萎缩蛋白生产的肽和/或肽-货物结合物。

术语“体外”意图涵盖细胞培养的实验，而术语“体内”意图涵盖完整多细胞生物体的实验。

还提供了编码根据本发明的肽的核酸。还提供了具有调控序列（如启动子）的核酸载体（如质粒），其可操作地连接到编码根据本发明的肽的核酸。该载体优选地在转染入适当的细胞，如哺乳动物、细菌或真菌细胞中时能够表达肽。该核酸可以分离的或纯化的形式被提供。

在本说明书中，术语“可操作地连接”可包括这种情况，其中将选定的核苷酸序列与调控的核苷酸序列以共价连接的方式连接，使得在调控序列的影响或控制下放置核苷酸编码序列的表达。如果调控序列能够影响核苷酸编码序列（形成部分或全部的选定核苷酸序列）的转录，则调控序列是可操作地连接到选定的核苷酸序列。在适当的情况下，得到的转录物之后可被翻译成所需的肽。

根据上述情况，提供了本发明的以下几方面和实施例。

在本发明的一方面中，提供了具有由至少3个域组成的一级序列结构的肽，具有的排列为：

N-末端[域1]-[域2]-[域3]C-末端

其中

在域1和3中合起来的R（精氨酸）残基的数量至少为5，

在域1和3中合起来的X残基的数量至少1，

在域1和3中合起来的B残基的数量至少2，

其中X=氨基己酸，B=β-丙氨酸，

其中

域2包括包含至少3个氨基酸Z₁Z₂FLI的序列，其中Z₁为Y或I，Z₂为Q或R，和

域2不包含ILFQY，ILFQ或lLIQ的N-到C-末端连续的一级序列。

在域1-3中合起来的残基的总数优选不超过50，更优选不超过40，最优选在20和30之间。

在本发明的另一方面中，提供了具有由至少3个域组成的一级序列结构的肽，具有的排列为：

N-末端[域1]-[域2]-[域3]C-末端

其中

(i)域1包括选自：

RXRZ₃[SEQ ID NO:762]的序列

其中Z₃选自：

RBRRXR[SEQ ID NO:763]

RBRRX[SEQ ID NO:764]

RBRX[SEQ ID NO:765]

RBRXR[SEQ ID NO:766]

BRX[SEQ ID NO:767]

BX[SEQ ID NO:768]

RBR[SEQ ID NO:769]

RB[SEQ ID NO:770]，或

RBRR[SEQ ID NO:771]中的一个。

(ii)域2包括包含至少3个氨基酸Z₁Z₂FLI的序列，其中Z₁为Y或I，Z₂为Q或R，其中域2不包含ILFQY，ILFQ或lLIQ的N-到C-末端连续的一级序列。

(iii)域3包括的序列选自：

RXRBRXRB[SEQ ID NO:772]

XRBRXRB[SEQ ID NO:773]

RXRRBRB[SEQ ID NO:774]

BRXRB[SEQ ID NO:775]

XRRBRB[SEQ ID NO:776]

RRBRB[SEQ ID NO:777]

XRBRB[SEQ ID NO:778]

RBRXRB[SEQ ID NO:779]

RXRBRB[SEQ ID NO:780]，或

BRBRB[SEQ ID NO:781]

其中X=氨基己酸，B=β-丙氨酸。

在某些实施例中，域2包括选自YQFLI、IQFLI、YRFLI、YRFRLI、FQILY、QFLI、或QFL的N-到C-末端连续的一级序列。在某些实施例中，域2具有4或5个氨基酸。7.在某些实施例中，域2具有0、1、2或3个R残基。

在某些实施例中，域1包括选自以下的序列或由选自以下的序列组成：

RXRRBRRXR[SEQ ID NO:782]

RXRRBRRX[SEQ ID NO:783]

RXRRBRX[SEQ ID NO:784]

RXRBRX[SEQ ID NO:785]

RXRRBRXR[SEQ ID NO:786]

RXRRBR[SEQ ID NO:787]

RXRRB[SEQ ID NO:788]，或

RXRRBRR[SEQ ID NO:789]的序列。

在某些实施例中，域3包括选自以下的序列或由选自以下的序列组成：

RXRBRXRB[SEQ ID NO:772]

XRBRXRB[SEQ ID NO:773]

RXRRBRB[SEQ ID NO:774]

BRXRB[SEQ ID NO:775]

XRRBRB[SEQ ID NO:776]

RRBRB[SEQ ID NO:777]

XRBRB[SEQ ID NO:778]

RBRXRB[SEQ ID NO:779]

RXRBRB[SEQ ID NO:780]，或

BRBRB[SEQ ID NO:781]。

在某些实施例中，肽有6-12个R残基，优选为6、7、8、9、10、11或12个R残基中的一个。域2可有1、2或3个R残基。域1可有6个R残基或更少的，例如0、1、2、3、4、5或6个R残基。域3可有4个R残基或更少的，例如0、1、2、3或4个R残基。该R残基可以是D-精氨酸或L-精氨酸，或两者的混合物。

在某些优选的实施例中，域1和3仅包含R、X和B残基，或仅有1或2个不是X或B的残基。

同样的，域1可具有(i)2-6个R残基，(ii)1-3个X残基，和(iii)1-2个B残基，的任意组合，优选地在长度中不超过10个残基，并具有0、1或2个不是R、X或B的残基。域3可具有(a)2-5个R残基，(b)1-3个X残基，和(c)1-3个B残基，的任意组合，优选地在长度中不超过9个残基，并具有0、1或2个不是R、X或B的残基。

在某些实施例中，该肽具有30个残基的最大长度，其中包括天然氨基酸、X和B的残基。同样的，在某些实施例中，域1可具有4-12个残基的长度，域2可具有从3-9个残基的长度，域3可具有4-12个残基的长度，其中所述长度包括天然氨基酸、X和B残基。

在某些实施例中，肽包含选自SEQ ID NO:2-308或317-661之一的序列，或由该序列组成（图18、23-30和41）。在某些实施例中，肽包含与SEQ ID NO:2-308或317-761之一具有至少90％序列一致性的序列，或由该序列组成（图18、23-30和41）。

在某些实施例中，肽包含Pip-6a、Pip-6b、Pip-6c、Pip-6d、Pip-6e、Pip-6f、Pip-6g、Pip-6h、Pip-6i[SEQ ID NO:2-10]；Pip-7a、Pip-7b、Pip-7c、Pip-7d、Pip-7b2、Pip-7c2[SEQ ID NO:11-16]；或Pip-8a、Pip-8b、Pip-8c、Pip-8c2、Pip-8d、Pip-8d2、Pip-8d3[SEQ ID NO:17-20和317-319]；或Pip-9b、Pip-9b2、Pip-9c、Pip-9c2、Pip-9c3、Pip-9d、Pip-9d2、Pip-9d3、 Pip-9d4[SEQ ID NO:320-328]之一的序列的域1-3的序列、或由该序列组成；或包含与Pip-6a、Pip-6b、Pip-6c、Pip-6d、Pip-6e、Pip-6f、Pip-6g、Pip-6h、Pip-6i[SEQ ID NO:2-10]；Pip-7a、Pip-7b、Pip-7c、Pip-7d、Pip-7b2、Pip-7c2[SEQ ID NO:11-16]；或Pip-8a、Pip-8b、Pip-8c、Pip-8c2、Pip-8d、Pip-8d2、Pip-8d3[SEQ ID NO:17-20和317-319]；或Pip-9b、Pip-9b2、Pip-9c、Pip-9c2、Pip-9c3、Pip-9d、Pip-9d2、Pip-9d3、Pip-9d4[SEQ IDNO:320-328]之一的域1-3的序列具有至少90％序列一致性的序列、或由该序列组成。

在某些实施例中，肽进一步包括在C-末端的连接体序列。该连接体序列可选自BCys、XCys、Cys、GGCys、BBCys、BXCys、XBCys、BX或XB。

在某些实施例中，该肽化学连接到货物分子。该连接可位于该肽的C-末端处。

货物分子可选自核酸、肽核酸（PNA）、磷酰二胺吗啉代寡核苷酸（PMO）、锁核酸（LNA）、反义寡核苷酸、短干扰RNA（siRNA）、肽、环肽、蛋白质或药物。该货物分子可具有小于5000Da的分子量。在某些实施例中，该货物分子是PNADMD[SEQ ID NO:309]或PMODMD[SEQ ID NO:310]或与PNADMD[SEQ ID NO:309]或PMODMD[SEQ ID NO:310]之一具有至少90％序列一致性的分子。

在本发明的又一方面中，药物组合物或药物包括根据本发明提供的肽。该药物组合物或药物可进一步包括药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体。

在本发明的另一方面中，提供了用于在治疗疾病的方法中使用的根据本发明的肽。在本发明的又一方面中，提供了根据本发明的肽在制备用于治疗疾病的药物中的用途。

在本发明的另一方面中，提供了在需要治疗的患者中治疗疾病的方法，该方法包括给予根据本发明的肽给患者。

在本发明的另一方面中，提供了分离的核酸，所述分离的核酸编码了根据本发明的任意方面或实施例的肽或肽-货物结合物。还提供了核酸载体，其具有可操作地连接到该核酸的调控序列。

肽模拟物

已知的药学或生物学活性化合物的模拟物的设计是基于先导化合物的药物和治疗学发展的已知方法。对于合成困难的或昂贵的或用于特殊的给药方法并不适用的活性化合物这可能是可取的，例如，某些肽用于口服组合物并不是适合的活性剂，因为它们在消化道中易于迅速被蛋白酶降解。模拟物的设计、合成和测试通常用于避免为目标属性而随机筛选大量的分子。

在具有给定目标属性的化合物的模拟物的设计中，通常采取几个步骤。首先，确定该化合物的特定部位，该特定部位在决定目标属性中是关键和/或重要的。在肽的情况下，可以通过系统地改变肽中的氨基酸残基，例如，通过依次取代每个残基来完成。这些部位或残基组成的该化合物的活性区域被称为它的“药效团”。

一旦发现药效团，根据它的物理性质（如立体化学、结合、大小和/或电荷）使用来自多种来源的数据（如光谱技术、X-射线衍射数据和NMR）模拟它的结构。在这个建模过程中可以使用计算分析、相似性作图（其模拟了药效团的电荷和/或量，而不是原子之间的结合）和其他技术。

在这种方法的变型体中，模拟了配体和其结合的配偶体的三维结构。配体和/或结合配偶体改变结合构象，允许该模型在模拟物的设计中考虑到这点，这是特别有用的。

然后选定模板分子，模仿药效团的化学基团可以被接枝到该选定的模板分子上。模板分子和接枝到其上的化学基团可被方便地选择以使模拟物易于合成、可能在药学上是可接受的、并在体内不会降解，同时保持生物活性的先导化合物。通过这种方法发现类似物或模拟物之后可再进行筛选，以观察它们是否具有目标属性，或在何种程度上表现出它。之后可进行进一步的优化或修饰，以得到用于在体内或临床测试中的一个或多个最终模拟物。

对于本发明，提供了一种方法，该方法包括修饰肽结构，随后可任选地在剪接校正检测或外显子跳跃检测和/或细胞存活试验中测试修饰肽的步骤。肽或肽模拟物修饰的这个过程如需要可重复多次，直至确定具有所需的剪接校正或外显子跳跃活性和/或细胞存活率的肽。

所用的修饰步骤可包括缩短肽或肽模拟物的长度（这可以包括合成较短长度的肽或肽模拟物），取代一个或多个氨基酸残基或化学基团，和/或化学的修饰肽或肽模拟物以在DMD的mdx小鼠模型（包括心肌）中的外显子跳跃和抗肌萎缩蛋白生产中增强细胞存活率、抗降解、跨细胞膜运输和/或抗排除体外和/或提供活性。

本发明包括描述的多个方面和优选特征的组合，除了该组合是明显不允许的或明确避免的。

本文中使用的段落标题仅用于组织目的，而不应当被解释为限制所描述的主题。

本发明的多个方面和实施例将通过带有参考附图的实施例的方式被示出。进一步的多个方面和实施例对本领域的技术人员将是显而易见的。在该文本中提及的所有文件通过引用的方式并入在此。

附图的简要说明

现在将参照附图讨论说明本发明原理的实施例和实验，其中：

图1图表显示了在分化的小鼠H2K mdx肌肉肌管中，PMO-肽（Pip-5e、Pip-6a、Pip-6b、Pip-6c、Pip-6d、Pip-6e、Pip-6f）的外显子跳跃活性。在不使用转染试剂的情况下，用浓度范围在0.125μΜ-1μΜ之间的肽-PMO结合物培育H2K mdx肌管。嵌入式RT-PCR的产物在2％琼脂糖凝胶上通过电泳被检测。外显子跳跃活性表现为通过光密度法计算的Δ23跳跃的百分比。

图2图表显示了在H2K mdx肌肉肌管中PMO-肽（Pip-6g、Pip-6h、Pip-7a、Pip-7b、Pip-7c、Pip-7d）的外显子跳跃活性。

图3图表显示了在H2K mdx肌肉肌管中PMO-肽（Pip-6i、Pip-7b2、Pip-7c2、Pip-8a、Pip-8b、Pip-8c）的外显子跳跃活性。

图4图表显示了在H2K mdx肌肉肌管中PMO-肽（Pip-7b、Pip-7b2、Pip-8b（每个具有8个精氨酸）、B肽(RXRRBR)₂XB）的外显子跳跃活性。

图5图表显示了在H2K mdx肌肉肌管中PMO-肽（Pip-7c、Pip-7c2、Pip-8c（每个具有7个精氨酸），B肽(RXRRBR)₂XB）的外显子跳跃活性。

图6图表显示了在mdx小鼠的不同小鼠肌组织（TA=胫骨前肌，Quad=四头肌，Gas=腓肠肌，diaph=膈肌，心脏=心肌）中，PMO-肽（Pip-6a、Pip-6b、Pip-6c、Pip-6d、Pip-6e、Pip-6f、Pip-5e）的蛋白质印迹（Western blot）的蛋白量结果。

图7图表显示了mdx小鼠的（A）四头肌、（B）膈肌和（C）心脏的组织中Pip-6a、Pip-6b、Pip-6c、Pip-6d、Pip-6e、Pip-6f和Pip-5e的外显子跳跃活性的qPCR结果。

图8图表显示了mdx小鼠的（A）胫骨前肌、（B）四头肌、（C）膈肌和（D）心脏的组织中Pip-6a、Pip-6b、Pip-6c、Pip-6d、Pip-6e、Pip-6f和Pip-5e的外显子跳跃活性的定量蛋白质印迹结果。

图9RT-PCR的代表性结果显示了在mdx小鼠的不同肌肉组织中PMO-肽Pip-6a、Pip-6b、Pip-6c、Pip-6d、Pip-6e、Pip-6f和Pip-5e的外显子跳跃活性。

图10代表性蛋白质印迹显示了在mdx小鼠的不同肌肉组织中PMO-肽Pip-6a、Pip-6b、Pip-6c、Pip-6d、Pip-6e、Pip-6f和Pip-5e的外显子跳跃活性。

图11单个的数据集显示了在mdx小鼠的肌肉组织中的Pip-5e-PMO的外显子跳跃活性。（A）RT-PCR结果，（B）蛋白质印迹，（C）定量的蛋白质印迹数据图。

图12单个的数据集显示了在mdx小鼠的肌肉组织中的Pip-6a-PMO的外显子跳跃活性。（A）RT-PCR结果，（B）蛋白质印迹，（C）定量的蛋白质印迹数据图。

图13单个的数据集显示了在mdx小鼠的肌肉组织中的Pip-6b-PMO的外显子跳跃活性。（A）RT-PCR结果，（B）蛋白质印迹，（C）定量的蛋白质印迹数据图。

图14单个的数据集显示了在mdx小鼠的肌肉组织中的Pip-6c-PMO的外显子跳跃活性。（A）RT-PCR结果，（B）蛋白质印迹，（C）定量的蛋白质印迹数据图。

图15单个的数据集显示了在mdx小鼠的肌肉组织中的Pip-6d-PMO的外显子跳跃活性。（A）RT-PCR结果，（B）蛋白质印迹，（C）定量的蛋白质印迹数据图。

图16单个的数据集显示了在mdx小鼠的肌肉组织中的Pip-6e-PMO的外显子跳跃活性。（A）RT-PCR结果，（B）蛋白质印迹，（C）定量的蛋白质印迹数据图。

图17单个的数据集显示了在mdx小鼠的肌肉组织中的Pip-6f-PMO的外显子跳跃活性。（A）RT-PCR结果，（B）蛋白质印迹，（C）定量的蛋白质印迹数据图。

图18表格显示了Pip-5e、Pip-6a、Pip-6b、Pip-6c、Pip-6d、Pip-6e、Pip-6f、Pip-6g、Pip-6h、Pip-6i、Pip-7a、Pip-7b、Pip-7c、Pip-7d、Pip-7b2、Pip-7c2、Pip-8a、Pip-8b、Pip-8c、Pip-8c2的氨基酸序列。还表明了在域1、2和3中的残基总数以及精氨酸、X和B的残基的数目。

图19图表显示了作为添加的Pip-PMO浓度的函数的B-肽-PMO、Pip-5e-PMO、Pip-6a-PMO、Pip-6c-PMO、Pip-6f-PMO、Pip-6h-PMO的细胞存活率。

图20图表显示了作为添加的Pip-PMO浓度的函数的B-肽-PMO、Pip-7a-PMO、Pip-8a-PMO（包含9个精氨酸残基）的细胞存活率。

图21图表显示了作为添加的Pip-PMO浓度的函数的B-肽-PMO、Pip-7b-PMO、Pip-7b2-PMO、Pip-8b-PMO（包含8个精氨酸残基）和B-MSP-PMO（RXRRBRRXRRBRASSLNIAX[SEQ ID NO:910]，Yin,H.等，（2010）分子癌症治疗学（Mol.Ther.），1822-1827）的细胞存活率。

图22图表显示了作为添加的Pip-PMO浓度的函数的B-肽-PMO、Pip-7c-PMO、Pip-7c2-PMO、Pip-8c-PMO（包含7个精氨酸残基）的细胞存活率。

图23表格显示了根据本发明的域1-3肽序列。该序列均包含域2序列YQFLI[SEQ ID NO:802]，且域1序列选自RXRRBRRXR[SEQ ID NO:782]、RXRRBRRX[SEQ ID NO:783]、RXRRBRX[SEQ ID NO:784]、RXRRBRXR[SEQ ID NO:786]、RXRBRX[SEQ ID NO:785]、RXRBX[SEQ ID NO:790]、RXRRBR[SEQ ID NO:787]、RXRRB[SEQ ID NO:788]、RXRRBRR[SEQ ID NO:789]，域3序列选自RXRBRXRB[SEQ ID NO:722]、XRBRXRB[SEQ ID NO:773]、RXRRBRB[SEQ ID NO:774]、BRXRB[SEQ ID NO:775]、XRRBRB[SEQ ID NO:776]、RRBRB[SEQ ID NO:777]、XRBRB[SEQ ID NO:778]、RBRXRB[SEQ ID NO:779]、RXRBRB[SEQ ID NO:780]、BRBRB[SEQ ID NO:781]。

图24表格显示了根据本发明的域1-3肽序列。该序列均包含域2序列IQFLI[SEQ ID NO:803]，且域1序列选自RXRRBRRXR、RXRRBRRX、RXRRBRX、RXRRBRXR、RXRBRX、RXRBX、RXRRBR、RXRRB、RXRRBRR，域3序列选自RXRBRXRB、XRBRXRB、RXRRBRB、BRXRB、XRRBRB、RRBRB、XRBRB、RBRXRB、RXRBRB、BRBRB。

图25表格显示了根据本发明的域1-3肽序列。该序列均包含域2序列QFLI[SEQ ID NO:807]，且域1序列选自RXRRBRRXR、RXRRBRRX、RXRRBRX、RXRRBRXR、RXRBRX、RXRBX、RXRRBR、 RXRRB、RXRRBRR，域3序列选自RXRBRXRB、XRBRXRB、RXRRBRB、BRXRB、XRRBRB、RRBRB、XRBRB、RBRXRB、RXRBRB、BRBRB选定3个域序列。

图26表格显示了根据本发明的域1-3肽序列。该序列均包含域2序列QFL[SEQ ID NO:808]，且域1序列选自RXRRBRRXR，RXRRBRRX，RXRRBRX、RXRRBRXR，RXRBRX，RXRBX，RXRRBR，RXRRB，RXRRBRR，域3序列选自RXRBRXRB，XRBRXRB，RXRRBRB，BRXRB，XRRBRB，RRBRB，XRBRB，RBRXRB，RXRBRB，BRBRB。

图27表格显示了根据本发明的域1-3肽序列。该序列均包含域2序列YRFLI[SEQ ID NO:804]，且域1序列选自RXRRBRRXR、RXRRBRRX、RXRRBRX、RXRRBRXR、RXRBRX、RXRBX、RXRRBR、RXRRB、RXRRBRR，域3序列选自RXRBRXRB，XRBRXRB、RXRRBRB、BRXRB、XRRBRB、RRBRB、XRBRB、RBRXRB、RXRBRB、BRBRB。

图28表格显示了根据本发明的域1-3肽序列。该序列均包含域2序列FQILY[SEQ ID NO:806]，且域1序列选自RXRRBRRXR、RXRRBRRX、RXRRBRX、RXRRBRXR、RXRBRX、RXRBX、RXRRBR、RXRRB、RXRRBRR，域3序列选自RXRBRXRB、XRBRXRB、RXRRBRB、BRXRB、XRRBRB、RRBRB、XRBRB、RBRXRB、RXRBRB、BRBRB。

图29表格显示了根据本发明的域1-3肽序列。该序列均包含域2序列YRFRLI[SEQ ID NO:805]，且域1序列选自RXRRBRRXR、RXRRBRRX、RXRRBRX、RXRRBRXR、RXRBRX、RXRBX、RXRRBR、RXRRB、RXRRBRR，域3序列选自RXRBRXRB、XRBRXRB、RXRRBRB、BRXRB、XRRBRB、RRBRB、XRBRB、RBRXRB、RXRBRB、BRBRB。

图30表格显示了根据本发明的域1-3肽序列。该序列均包含域2序列ILFRY[SEQ ID NO:811]，且域1序列选自RXRRBRRXR、RXRRBRRX、RXRRBRX、RXRRBRXR、RXRBRX、RXRBX、RXRRBR、RXRRB、RXRRBRR，域3序列选自RXRBRXRB、XRBRXRB、RXRRBRB、BRXRB、XRRBRB、RRBRB、XRBRB、RBRXRB、RXRBRB、BRBRB。

图31在单次12.5mg/kg静脉注射后，C57BL10对照、未处理的mdx和Pip6-PMO处理的mdx小鼠的定量免疫组化染色平均值统计表。相对于未处理的mdx小鼠，用Pip6a-f处理的mdx小鼠的四头肌、膈肌和心肌免疫组化染色的统计显著性表。使用重复测量、多层统计模型确定统计显著性（****=P<0.0001，***=P<0.001，**=P<0.01，*=P<0.05，N/S=不显著）。

图32在单次12.5mg/kg静脉注射后，C57BL10对照、未处理的mdx和Pip6-PMO处理的mdx小鼠的定量免疫组化染色平均值统计表。相对于Pip5e处理的小鼠，用Pip6a-f处理的mdx小鼠的四头肌、膈肌和心肌免疫组化染色的统计显著性表。使用重复测量、多层统计模型确定统计显著性（****=P<0.0001，***=P<0.001，**=P<0.01，*=P<0.05，N/S=不显著）。

图33用于Pip5e-PMO衍生物的化学结合法。肽至PMO AO的结合方法。肽通过在PMO的3'端的氨基连接体结合至PMO，随后经HPLC纯化，并通过MALDI-TOF质谱分析。HBTU：2-（1H-苯并三唑-1-基）-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐，HOBt，1-羟基苯并三唑一水合物，DIEA：二异丙基乙胺。

图34在单次12.5mg/kg静脉注射后，C57BL10对照、未处理的mdx、5-aa疏水性核心Pip6-PMO处理的和Pip5e-PMO处理的小鼠的抗肌萎缩蛋白剪接和蛋白质修复。（a）在C57BL10、未处理的mdx和处理的mdx小鼠的四头肌、膈肌和心肌中，相对对照的层粘连蛋白复染剂的抗肌萎缩蛋白免疫组化的定量。绘制了每个兴趣区（120个区）的相对强度值，并由重复测量、多层统计模型计算了模型评估平均值（体现在b中）。关于统计显著表格参见图31和32。百分比修复得分表示如下。（c）百分比Δ23外显子跳跃通过在四头肌、膈肌和心肌中的定量实时(RT)-PCR确定。（d）代表性的实时(RT)-PCR图像显示了在胫骨前肌、四头肌、腓肠肌、膈肌、心脏和腹部肌中的外显子跳跃（跳跃的）。顶部条带表明了全长（FL）或非跳跃转录。（e）每种处理的代表性蛋白质印迹图像。相对于50％（5μg蛋白质）和10％（1μg）的C57BL10对照，加载了10μg的总蛋白（胫骨前肌、四头肌、腓肠肌、膈肌、心脏和腹部肌），并关于加载的α-辅肌动蛋白对照进行归一化（normalise）（有关定量参见图38a）。

图35在经单次12.5mg/kg静脉注射后，与Pip5e-PMO相比， C57BL10对照、未处理的mdx、缩短的疏水性核心Pip6-PMO处理的小鼠（Pip6c和Pip6d）的抗肌萎缩蛋白剪接和蛋白质修复。（a）在C57BL10对照、未处理的mdx和处理的mdx小鼠的四头肌、膈肌和心肌中，相对对照的层粘连蛋白复染剂的抗肌萎缩蛋白免疫组化的定量。绘制了每个兴趣区（120个区）的相对强度值，并由重复测量、多层统计模型计算了模型评估平均值（体现在b中）。关于统计显著表格参见图31和32。百分比修复得分表示如下。（c）百分比Δ23外显子跳跃通过在四头肌、膈肌和心肌中的定量实时(RT)-PCR确定。（d）代表性的实时(RT)-PCR图像显示了在胫骨前肌、四头肌、腓肠肌、膈肌、心脏和腹部肌中的外显子跳跃（跳跃的）。顶部条带表明了全长（FL）或非跳跃转录。（e）每种处理的代表性蛋白质印迹图像。相对于50％（5μg蛋白质）和10％（1μg）的C57BL10对照，加载了10μg的总蛋白（胫骨前肌、四头肌、腓肠肌、膈肌、心脏和腹部肌），并关于加载的α-辅肌动蛋白对照进行归一化（有关定量参见图38a）。

图36在经单次12.5mg/kg静脉注射后，C57BL10对照、未处理的mdx和Pip6-PMO衍生物（Pip6g和Pip6h）的抗肌萎缩蛋白剪接和蛋白质修复。在C57BL10、未处理的mdx和处理的mdx小鼠的胫骨前肌、四头肌、腓肠肌、膈肌、心脏和腹部肌群中进行C57BL10对照、未处理的mdx和Pip6g和Pip6h-PMO处理的小鼠中的抗肌萎缩蛋白免疫组化。（a）在C57BL10、未处理的mdx和处理的mdx小鼠的四头肌、膈肌和心肌中，相对对照的层粘连蛋白复染剂的抗肌萎缩蛋白免疫组化的定量。绘制了每个兴趣区（120个区）的相对强度值，并由重复测量、多层统计模型计算了模型评估平均值（体现在b中）。关于统计显著表格参见图39a，b。百分比修复得分表示如下。（c）百分比Δ23外显子跳跃通过在四头肌、膈肌和心肌中的定量实时(RT)-PCR确定。（d）代表性的实时(RT)-PCR图像显示了在胫骨前肌、四头肌、腓肠肌、膈肌、心脏和腹部肌中的外显子跳跃（跳跃的）。顶部条带表明了全长（FL）或非跳跃转录。（e）每种处理的代表性蛋白质印迹图像。相对于50％（5μg蛋白质）和10％（1μg）的C57BL10对照，加载了10μg的总蛋白（胫骨前肌、四头肌、腓肠肌、膈肌、心脏和腹部肌），并关于加载的α-辅肌动蛋白对照进行归一化（有关定量参见图38a）。

图37Pip6e-PMO的HPLC色谱和MALDI-TOF数据。（a）纯化的Pip6e-PMO结合物在27分钟内使用梯度10-50％B在4.6×250mm C18柱（洗脱剂A：0.1％三氟乙酸（TFA），洗脱剂B：90％乙腈，10％洗脱液A）上的反相HPLC色谱分析。（b）Pip6e-PMO结合物的MALDI-TOF质谱图（c）计算的和发现的Pip6-PMO衍生物的分子量表格。

图38在经单次12.5mg/kg静脉注射后，C57BL10对照、未处理的mdx和Pip6-PMO处理的小鼠的qRT-PCR平均值表和定量的蛋白质印迹。（a）Pip6-PMO处理的mdx小鼠的平均q-RT-PCR百分比值。（b）计算了胫骨前肌、四头肌、膈肌和心脏组织的Pip6a-f治疗的定量蛋白质印迹。对每个小鼠的所有治疗（n=3）进行了蛋白质印迹，并相对于50％和10％的C57BL10对照（平均值）来进行量化。

图39在经单次12.5mg/kg静脉注射后，C57BL10对照、未处理的mdx和Pip6e-PMO衍生物（Pip6g和Pip6h）处理的mdx小鼠的定量免疫组化染色统计表、qRT-PCR平均值表和定量的蛋白质印迹。相对于未处理的mdx小鼠（a）或Pip6e处理的小鼠（b），Pip6g和Pip6h处理的mdx小鼠的四头肌、膈肌心肌的免疫组化染色的统计学显著表。使用重复测量、多层统计模型来确定统计学显著性（****=P<0.0001，***=P<0.001，**=P<0.01*=P<0.05，N/S=不显著）。(c）用Pip6g和Pip6h-PMO处理的mdx小鼠的平均q-RT-PCR百分比值。（d）计算了Pip6g和Pip6h的胫骨前肌、四头肌、膈肌和心脏组织的定量蛋白质印迹。对每个小鼠的所有治疗（n=3）进行了蛋白质印迹，并相对于50％和10％的C57BL10对照（平均值）进行了量化。

图40在单次12.5mg/kg静脉注射后，对C57BL10对照、未处理的mdx和Pip6-PMO和Pip5e-PMO处理的mdx小鼠的血液样本进行了毒性检测评估。（a）相对未处理mdx和处理的小鼠，在C57BL10对照小鼠中血浆丙氨酸氨基转氨酶、天冬氨酸转氨酶和肌酸激酶水平的测量值，（b）相对未处理的mdx和处理的小鼠，在C57BL10对照小鼠中血清尿素氮（BUN）和肌酐水平的测量值。

图41表格显示了Pip-8d、Pip-8d2、Pip-8d3、Pip-9b、Pip-9b2、Pip-9c、Pip-9c2、Pip-9c3、Pip-9d、Pip-9d2、Pip-9d3、PIP-9d4的氨基酸序列。还指出了在域1、2和3中的残基总数和精氨酸、X和B残基的数目。

图42图表显示了在Pip7、Pip8和Pip9-PMO处理的mdx肌管中的细胞存活率。

图43在mdx小鼠中，Pip7-PMO结合物在静脉给药后的拍摄图片。在对8周龄mdx小鼠单次静脉注射12.5mg/kg剂量的Pip6e、Pip7a、Pip7b和Pip7b2后的抗肌萎缩蛋白表达。（a）在RNA水平检测外显子跳跃效率的逆转录酶（RT）-PCR，其由较短的外显子-跳跃条带示出，（b）用Pip7-PMO结合物处理的mdx小鼠的胫骨前肌、四头肌、膈肌和心肌的蛋白质印迹分析。在注射2周后，从处理的mdx小鼠的四种不同的肌肉中提取总蛋白。加载10μg的取自处理的肌肉样本的总蛋白。使用α-辅肌动蛋白作为加载对照。

图44在mdx小鼠中，Pip8-PMO结合物在静脉给药后的拍摄图片。在对8周龄mdx小鼠单次静脉注射12.5mg/kg剂量的Pip8b、Pip8c和Pip8c2后的抗肌萎缩蛋白表达。（a）在RNA水平检测外显子跳跃效率的逆转录酶（RT）-PCR，其由较短的外显子-跳跃条带示出，（b）用Pip8-PMO结合物处理的mdx小鼠的胫骨前肌、四头肌、膈肌和心肌的蛋白质印迹分析。在注射2周后，从处理的mdx小鼠的四种不同的肌肉中提取总蛋白。加载10μg的取自处理的肌肉样本的总蛋白。使用α-辅肌动蛋白作为加载对照。

图45在mdx小鼠中，Pip9-PMO结合物在静脉给药后的拍摄图片。在对8周龄mdx小鼠中单次静脉注射12.5mg/kg剂量的Pip9b、Pip9b2、Pip9c、Pip9d和Pip9d2后的抗肌萎缩蛋白表达。（a）在RNA水平检测外显子跳跃效率的逆转录酶（RT）-PCR，其由较短的外显子-跳跃条带示出，（b）用Pip9-PMO结合物处理的mdx小鼠的胫骨前肌、四头肌、膈肌和心肌的蛋白质印迹分析。在注射2周后，从处理的mdx小鼠的四种不同的肌肉中提取总蛋白。加载10μg的取自处理的肌肉样本的总蛋白。使用α-辅肌动蛋白作为加载对照。

图46在用Pip7-9-PMO静脉注射后的抗肌萎缩蛋白修复的半定量分析。胫骨前肌、四头肌、膈肌和心肌被免疫染色，并使用ImagePro分析以显示并定量抗肌萎缩蛋白的表达，（a）通过ImagePro软件按照先前的报道（阿瑞恰瓦拉-葛马扎（Arechavala-Gomeza）等，2010）使用小鼠抗层粘连蛋白进行归一化，来分析应用抗肌萎缩蛋白抗体的抗肌萎缩蛋白免疫染色纤维的强度，并表示为C57BL/10肌肉强度水平的百分比。绘制了每个兴趣区（120个区）的相对强度值，并计算了平均强度值（由红色条表示）（b）该抗肌萎缩蛋白的染色强度被归一化为C57BL/10（100％）和mdx（强度0％）肌肉的平均值。绘制了每种动物（n=3）的修复得分，并计算了平均修复得分（由红色条表示）（平均值-SEM；n=3；单因素方差分析检验：ns，不显著，*P<0.05，**<0.001，***<0.0001，与mdx和C57对照相比）。

图47在用Pip7-9-PMO结合物以12.5mg/kg剂量处理的mdx小鼠中肝和肾功能的血清标志物的临床生化学。在通过CO₂吸入注射的第2周，立即从处死的小鼠的颈静脉取血清。进行了血清肌酸磷酸激酶、肌酐、尿素、碱性磷酸酶（ALP）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、总胆红素、乳酸脱氢酶（LDH）水平的分析。（平均值-SEM；n=3；双尾t-检验：ns，不显著，*P<0.05，**<0.001，***<0.0001，与mdx或C57BL/10相比）。

图48在用PPMO候选物静脉注射后的抗肌萎缩蛋白修复的半定量分析。胫骨前肌和心肌使用抗肌萎缩蛋白抗体被免疫染色，并使用ImagePro分析以显示并定量抗肌萎缩蛋白的表达。（a）图表显示了通过ImagePro软件按照先前的报道（阿瑞恰瓦拉-葛马扎（Arechavala-Gomeza）等，2010）使用小鼠抗层粘连蛋白进行归一化，来分析应用抗肌萎缩蛋白抗体的抗肌萎缩蛋白免疫染色纤维的强度，并表示为C57BL/10肌肉强度水平的百分比。绘制了每个兴趣区（120个区）的相对强度值，并计算了平均强度值（由红色条表示）（b）图表显示了归一化为C57BL/10（100％）和mdx（0％）肌肉平均值的抗肌萎缩蛋白的染色强度。绘制了每种动物（n=3）的修复得分，并计算了平均修复得分（由水平条表示）。

图49在mdx小鼠中经静脉给药的PPMO候选物的比较。在对8周龄mdx小鼠中单次静脉注射12.5mg/kg剂量的Pip8b、9b、9b2、8c、9c和9d2后评估了外显子跳跃的抗肌萎缩蛋白RNA的水平。在RNA水平检测外显子跳跃效率的逆转录酶（RT）-PCR由较短的外显子-跳跃的条带示出。

图50在mdx小鼠中经静脉给药PPMO候选物后的抗肌萎缩蛋白水平的量化。用PPMO候选物处理的mdx小鼠的胫骨前肌、四头肌、膈肌和心肌的蛋白质印迹分析。在注射12.5mg/kg剂量的Pip8b、9b、9b2、8c、9c和9d2两周后，从处理的mdx小鼠的四种不同的肌肉中提取总蛋白。加载15μg的取自处理的肌肉样本的总蛋白。使用黏着斑蛋白作为加载的对照。（a）用PPMO候选物处理的mdx小鼠的胫骨前肌、四头肌、膈肌和心肌的代表性蛋白质印迹图像（b）图表显示了使用Licor软件的抗肌萎缩蛋白蛋白的半定量分析，并使用黏着斑蛋白作为加载的对照。该条带的密度通过其相应的黏着斑蛋白带进行归一化，这被表示为C57BL/10肌肉的抗肌萎缩蛋白表达水平的百分比。

图51图表显示了在PPMO处理的mdx血清中的抗肌萎缩蛋白（dystromir）表达。在8周龄时，在静脉注射12.5mg/kg PPMO候选物（Pip8b、9b、9b2、8c和9c）后的第2周，在通过CO₂吸入处死后，立即从小鼠的颈静脉取血清。在PPMO处理的mdx小鼠的血清中通过Q-PCR检测了miR-133a和miR-206的水平，归一化为miR-223。与未处理的mdx对照相比，在PPMO处理的mdx小鼠的血清中，miR-133a和miR-206的水平显著下调。

图52在mdx小鼠中经静脉给药的HPLC和过滤-脱盐的Pip9b2结合的PMO的外显子跳跃效率的比较。在8周龄mdx小鼠中，经单次静脉注射12.5mg/kg剂量的HPLC和过滤-脱盐的Pip9b-PMO的抗肌萎缩蛋白表达。图表显示了抗肌萎缩蛋白修复的半定量分析。通过ImagePro软件按照先前的报道（阿瑞恰瓦拉-葛马扎（Arechavala-Gomeza）等，2010）使用小鼠抗层粘连蛋白进行归一化，来分析应用抗肌萎缩蛋白抗体的抗肌萎缩蛋白免疫染色纤维的强度，并表示为C57BL/10肌肉强度水平的百分比。绘制了每个兴趣区（120个区）的相对强度值，并计算了平均强度值（左侧面板，由红色条表示）（b）抗肌萎缩蛋白的染色强度被归一化为C57BL/10（100％）和mdx（强度0％）肌肉的平均值。绘制了对于每种动物（n=4）的修复得分，并计算了平均修复得分（右手侧面板，由条表示）。

图53在mdx小鼠中经静脉给药Pip9b2结合的PMO后的抗肌萎缩蛋白RNA和蛋白质水平的比较。用Pip9b2处理的mdx小鼠的胫骨前肌、四头肌、膈肌和心肌的蛋白质印迹分析。在注射12.5mg/kg剂量的Pip9b2-PMO两周后，从处理的mdx小鼠的四种不同的肌肉中提取总蛋白。加载15μg的取自处理的肌肉样本的总蛋白。使用黏着斑蛋白作为加载的对照。（a）用PPMO候选物处理的mdx小鼠的胫骨前肌、四头肌、膈肌和心肌的代表性蛋白质印迹图像（b）图表显示了使用Licor软件的抗肌萎缩蛋白蛋白的半定量分析，并使用黏着斑蛋白作为加载的对照。该条带的密度通过其相应的黏着斑蛋白带进行归一化，这被表示为C57BL/10肌肉抗肌萎缩蛋白表达水平的百分比。（c）在RNA水平检测外显子跳跃效率的逆转录酶（RT）-PCR，其由较短的外显子 -跳跃条带示出。

图54图表显示了在Pip9b2-PMO处理的mdx肌管中的细胞存活率。

图55氨基己酸（氨基己酸）的结构。

图56β-丙氨酸（3-氨基丙酸）的结构。

图57图表显示了作为加入的Pip-PMO的浓度的函数的Pip7a-PMO、Pip7b-PMO、Pip7b2-PMO、Pip7c-PMO、Pip7c2-PMO、Pip7d-PNO的细胞存活率（培养的Huh-7肝癌细胞）。

图58图表显示了作为加入的Pip-PMO的浓度的函数的Pip8a-PMO、Pip8b-PMO、Pip8c-PMO的细胞存活率（培养的Huh-7肝癌细胞）。

图59图表显示了在分化的小鼠H2K mdx肌管中PMO-肽（Pip7a、Pip7b、Pip7b2、Pip7c、Pip7c2、Pip7d）的外显子跳跃活性。在不使用转染试剂的情况下，用浓度范围在0.125μΜ-1μΜ之间的肽-PMO结合物培育H2K mdx肌管。嵌入式RT-PCR的产物在2％琼脂糖凝胶上通过电泳被检测。外显子跳跃活性表现为通过光密度法计算的Δ23跳跃的百分比。

图60图表显示了在分化的小鼠H2K mdx肌管中PMO-肽（Pip8a、Pip8b、Pip8c、Pip8c2、Pip8d）的外显子跳跃活性。在不使用转染试剂的情况下，用浓度范围在0.125μΜ-1μΜ之间的肽-PMO结合物培育H2Kmdx肌管。嵌入式RT-PCR的产物在2％琼脂糖凝胶上通过电泳被检测。外显子跳跃活性表现为通过光密度法计算的Δ23跳跃的百分比。

图61图表显示了在分化的小鼠H2K mdx肌管中PMO-肽（Pip9b、Pip9b2、Pip9c、Pip9c2、Pip9c3、Pip9d、Pip9d2）的外显子跳跃活性。在不使用转染试剂的情况下，用浓度范围在0.125μΜ-1μΜ之间的肽-PMO结合物培育H2K mdx肌管。嵌入式RT-PCR的产物在2％琼脂糖凝胶上通过电泳被检测。外显子跳跃活性表现为通过光密度法计算的Δ23跳跃的百分比。

本发明的详细说明

本发明的一个或多个实施例的细节通过实施例的方式在下面随附的说明中进行阐述，包括本发明人用于实施本发明所考虑的最佳方式的具体细节。对于本领域技术人员将显而易见的是，本发明可不限于这些具体细节被实施。

与已公开的Pip5e-PMO相比，本发明人还设计了又一系列的设计用于结合至PMO的细胞穿透肽，以探究在杜氏肌营养不良（DMD）的mdx小鼠模型的心肌中，在保持跨过所有肌肉类型的高活性的同时获得高度的外显子跳跃和抗肌萎缩蛋白生产中，中央疏水性核心序列的作用。特别地，本发明人还试图设计了CPP：a）在心肌中表现出了增强的PMO货物输送，和b）具有低毒性。

鉴于此，本发明人还设计了一系列的在两个主要方面中不同于先前公开的Pip-2至Pip-5系列的肽。

1）域2疏水性核心氨基酸序列被反转，或打乱。

2）精氨酸残基的数目被系统地改变以确定对货物输送和细胞毒性的作用。

与已公开的Pip5e-PMO相比，我们描述了一系列的设计用于结合至PMO的细胞穿透肽，以探究在杜氏肌营养不良（DMD）的mdx小鼠模型的心肌中，在保持跨过所有肌肉类型的高活性的同时获得高度的外显子跳跃和抗肌萎缩蛋白生产中，中央疏水性核心序列的作用。

实施例1

我们之前已报道了令人印象深刻的心脏活性，所述活性包括在单次给药结合至磷酰二胺吗啉代寡核苷酸的富含精氨酸的细胞穿透肽：Pip5e-PMO后的高剪接效率和抗肌萎缩蛋白修复。然而，对该活性的根本机理则知之甚少。

在此，我们报道了涉及单剂量给药（12.5mg/kg）一系列Pip5e-PMO的衍生物的研究结果，相继指定为包含突变的Pip5e肽的疏水性核心区的Pip6-PMO，其中该中央核心区的氨基酸序列是相反的、打乱的或部分缺失的。这些变化影响了包括心脏的多个肌肉群在经单一、低剂量静脉注射相应的Pip6-PMO结合物后的外显子跳跃和抗肌萎缩蛋白修复水平。结果表明：5个氨基酸（5-aa）的核心长度似乎对心脏抗肌萎缩蛋白生产是重要的，因为核心长度的减少降低了心脏活性。意外的是，在疏水性核心的一个位置上（部分地）接受精氨酸残基，但不能接受两个精氨酸残基，也不能在其它位置上接受精氨酸。出人意料的是，在这后两种情况中，骨骼抗肌萎缩蛋白生产也减少了。我们的数据表明，Pip序列的疏水性核心对于PMO输送至心脏是至关重要的，对于该区域的特定修饰可进一步提高活性。该结果对DMD的治疗PMO 开发具有启示。

结果

Pip6CPP系列的开发

我们之前的先导Pip系列CPP，Pip5e[Yin,H.,等，Pip5转导肽在心脏和表型校正的mdx小鼠中引导高效率的寡核苷酸介导的抗肌萎缩蛋白外显子跳跃.Mol Ther（分子治疗学）2011,19(7):p.1295-303]，包含两个富含精氨酸的侧翼区和中央疏水性核心。为了进一步探讨用于维持良好的心脏抗肌萎缩蛋白生产的疏水性核心的构成需要，我们合成了一系列其中只在疏水性核心区域制造突变（例如打乱和部分缺失的核心区域肽）的Pip5e衍生肽（Pip6a-f）。

除了Pip6e以外，在Pip5e的侧翼序列中所有的肽包含相同数量的精氨酸残基（10）。这些肽结合至辅助抗肌萎缩蛋白外显子23的25-merPMO[Yin,H.,等,细胞穿透肽结合的反义寡核苷酸修复全身肌肉和心脏的抗肌萎缩蛋白的表达和功能，Hum Mol Genet（赫姆分子遗传学）,2008,17（24）:p.3909-18；Yin,H.,等，融合肽在抗肌萎缩蛋白缺陷的mdx小鼠中引导全身抗肌萎缩蛋白外显子跳跃和功能修复的增强，（赫姆分子遗传学）,2009,18（22）:p.4405-14]，之前确认了mdx小鼠中的外显子跳跃。与我们之前使用的[Yin等同上]结合至PMO5'端的方法相反，Pip6-PMO结合物是通过结合PMO3'端至Pip肽的C-末端羧酸基团制备。我们报道了在体内将Pip5e-PMO结合至PMO的3'端或至5'端的抗肌萎缩蛋白生产或外显子跳跃没有显著差异，因此选择使用3'端结合用于这些实验[Saleh AF,A.A.A.,Yin H,Betts C,Hammond S,Wood MJA和Gait MJ,在系列研讨会系列的杜氏肌营养不良症的mdx小鼠模型中通过吗啉代（PMO）寡核苷酸的3'-肽结合物增强外显子跳跃和抗肌萎缩蛋白生产,核酸组分化学,2011,有机化学和生物化学研究所,捷克共和国科学研究院:布拉格,292-296页]。

可替代的货物PMO寡核苷酸的Pip结合物的合成

PMO25-merM23D(+7-18)(5'-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3'[SEQ IDNO:310])(PMODMD)通常被用作适于mdx小鼠中外显子跳跃的寡核苷酸类似物^37,42,43,44。在很多这样的实施例中，与裸露的PMODMD相比，B肽（序列RXRRBRRXRRBRXB[SEQ ID NO:311]）被结合至PMODMD，并在mdx小鼠中通过肌肉或静脉输送表现出显著增强的外显子跳跃和抗肌萎缩蛋白生产。该B-肽（不同于仅由两个X乘B单元取代的（RXR）₄XB）是与PMO结合用于DMD治疗的临床检测开发的主要候选肽⁴³。

该肽在自由微波多肽合成仪（CEM）上由标准的基于Fmoc（氨基酸王树脂）的固相合成被合成。在三异丙基硅烷（1％）、1,2-乙二硫醇（2.5％）和水（2.5％）存在情况下，肽通过三氟乙酸（TFA，94％）处理从树脂上脱落，通过反相HPLC纯化，并使用在乙腈/3％水溶液TFA(1:1,v/v)中溶解的β-氰基-4-羟基肉桂酸（10mg/ml）基体在AppliedBiosystems Voyager DE-PRO（应用生物系统公司基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪）上通过MALDI-TOF质谱分析。

肽Pip-6a至Pip-6i、Pip-7a至Pip-7c2和Pip8a至Pip-8c2的氨基酸序列示于图18中。

作为PMODMD的结合物，合成了Pip-6a至Pip-6i、Pip-7a至Pip-7c2和Pip8a至Pip-8c2和对照B肽。肽通过C-末端羧酸与25-mer PMO的3'-端的酰胺偶合反应被结合(参见Yin等，分子治疗学，19卷，7期1295-1303，2011)。简单地说，3'-酰胺键按如下进行：DMSO中的PMO（100nmol）与2倍过量的肽在NMP（甲基吡咯烷酮）中使用TBTU（四氟硼酸盐）:HOAt（苯并三唑）:DIEA（二异丙基乙胺）（2.5:1.8:1.7）在37℃反应2小时。通过阳离子交换HPLC纯化该结合物（源15S，GE Healthcare），并在HLB柱（Waters）上进行脱盐。

在分化的H2K mdx肌肉肌管中的细胞培养外显子跳跃分析

在没有任何转染剂的情况下，在浓度范围为0.125μΜ到1μΜ的分化的小鼠H2K mdx肌管中评价了Pip6-PMO结合物的外显子跳跃潜力（图1）。它表明在培养的肌细胞中，外显子跳跃活性对于包括Pip5e-PMO的所有这些结构是非常相似的。这些结果不同于以前的Pip5系列[Yin等同上]，其中侧翼富含精氨酸的序列大多包含固定数目的精氨酸残基（10），但其中的间隔是通过取代氨基己酰（氨基己酸）和β-丙氨酸单元的位置而改变。这导致了与体内活性良好相关的外显子跳跃活性的微小变化。在Pip6序列的情况下，侧翼富含精氨酸的序列是相同的（除了Pip6e，Pip6e除一个精氨酸外都是一致的，该精氨酸刚好位于被取代进入核心第二位置的核心之前）。结果表明，细胞外显子跳跃活性不取决于疏水性核心的序列或长度。请注意，我们之前已表明，体外外显子跳跃活性的主要变化而是与精氨酸残基的总数相关[Saleh,A.F.等，肽核酸寡核苷酸的分支的、富含精氨酸的肽聚合物结合物的合成和剪接变向活性，Bioconjug Chem（生物结合化学）,2010，21(10):p.1902-11]。

来源于H2K mdx成肌细胞的H2K mdx肌管从雄性的H2K mdx f2小鼠的EDL（趾长伸肌）肌肉中获得。由于不耐热的猿猴病毒40的多数肿瘤抗原（tsA58）的表达，这些细胞是抗肌萎缩蛋白缺乏的并受条件限制存活的。成肌细胞在33℃（10％CO₂）的丰富的培养液中增殖，并在37℃具有马血清的培养基中分化成肌管。

制备H2K mdx肌管，并按照以前描述的（Wang,Q,Yin,H,等（2010），新型反义寡核苷酸的体外评价预测用于杜氏肌营养不良症的体内外显子跳跃活性）但有少许变化的方法，在没有任何转染剂的情况下，将肽-PNA和肽-PMO结合物进行培养Wang,Q,Yin,H,等（2010），新型反义寡核苷酸的体外评价预测用于杜氏肌营养不良症的体内外显子跳跃活性。

在2天的血清去除后（具有5％马血清的DMEM），肌管从接种于明胶包覆的24孔板中的融合性H2K mdx细胞中获得。该结合物与肌管在0.5ml的OptiMEM中培养4小时，然后换用1ml的DMEM/5％马血清培养基用于继续培养。20小时后，肌管用PBS洗涤两次，并用0.5ml的TRI试剂（西格玛（Sigma），英国）提取总RNA。在RT-PCR分析前，RNA制备物用RNAse free DNAse（无核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶）（2U）和蛋白酶K(20mg)处理。RT-PCR在具有1μg RNA的25μL模板中使用上标III一步法RTPCR系统（Superscript III One-Step RTPCR System）和由正向引物引5'CAG AAT TCT GCC AAT TGCTGAG3'[SEQ ID NO：312]和反向引物5'TTC TTC AGC TTG TGT CATCC3'[SEQ ID NO：313]引导的超Taq DNA聚合酶（Platinum Taq DNApolymerase）(英杰公司（Invitrogen）)进行。最初在55℃下持续30分钟进行cDNA合成，然后是95℃持续30秒、55℃持续1分钟、68℃持续80秒的30个循环。RT-PCR产物（1ml）之后被用作模板用于在具有0.5U超级Taq聚合酶（HT生物技术）的25μL中进行二次PCR，并通过正向引物5'CCC AGT CTA CCA CCC TAT CAG AGC3'[SEQ ID NO：314]和反向引物5'CCT GCC TTT AAG GCT TCC TT3'[SEQ ID NO：315]引导。循环条件为95℃持续1分钟、57℃持续1分钟和72℃持续80秒的25个循环。产物通过2％琼脂糖凝胶进行了检测，并在使用基因工具分析软件（SynGene）扫描后，外显子23的相对量被表示为结合物在给定浓度的百分比，该百分比为三次检测的多次记录的平均值。

结果（图1）表明，Pip-6a-PMO、Pip-6b-PMO、Pip-6c-PMO、Pip-6d-PMO、Pip-6e-PMO和Pip-6f-PMO结合物在mdx肌细胞中均给出了高度的外显子跳跃活性。

Pip-6g-PMO、Pip-6h-PMO、Pip-6i-PMO、Pip-7a-PMO、Pip-7b-PMO、Pip-7b2-PMO、Pip-7c2、Pip-8a-PMO、Pip-8b-和Pip-8c结合物在mdx肌细胞中也给出了高度的外显子跳跃活性，Pip7c和Pip7d给出了中等的外显子跳跃（图2-5）。

在mdx小鼠中Pip6-PMO结合物的体内检测

鉴于在心脏组织的Pip5e-PMO的潜力，改变疏水性核心序列（同时保持5个氨基酸的长度）的目的是要确定肽在低剂量时可能是更有效的。这些修饰包括疏水性区的反转（Pip6a），由异亮氨酸替代酪氨酸（Pip6b），在第一富含精氨酸的侧翼区，刚好位于核心侧翼的精氨酸替代Pip6a序列中的谷氨酰胺（Pip6e），打乱的疏水性核心序列（Pip6f）。所有的Pip6肽-PMO结合物用单次12.5mg/kg经尾静脉静脉注射给药于mdx小鼠，并在2周后获得组织，并在RNA和蛋白水平评价活性。

所有的5-aa（氨基酸）核心Pip6-PMO的抗肌萎缩蛋白表达的免疫组化染色显示了在包括胫骨前肌、四头肌、膈肌和心脏的骨骼肌中高水平的抗肌萎缩蛋白生产。按先前描述的进行定量免疫组化染色（图34a，b）[Malerba,A.等，使用低剂量吗啉代低聚物的慢性全身性治疗可改善mdx小鼠的病理学和正常化的运动行为，Mol Ther（分子治疗学）.,2011,19(2):p.345-54;Arechavala-Gomeza等，免疫组化强度测量作为一种工具以评价肌膜相关蛋白的表达，神经病理学和应用生物学（Neuropathol Appl Neurobiol,2010,36(4):p.265-74]，并且通过拍摄抗肌萎缩蛋白染色的4个代表性的帧和将它与每一肽-PMO治疗的四头肌、膈肌和心脏的每个部分（n=3）的层粘连蛋白染色进行关联而实现。未处理的mdx和处理的mdx小鼠被归一化为C57BL10小鼠。该方法允许每个治疗组的在肌膜处的抗肌萎缩蛋白的染色强度相对于层粘连蛋白的比较。强度比被归一化为C57BL10样本，并在散点图上绘制了肌膜上的每个兴趣区（每个治疗组的120个区）。所有4个5-aa核心Pip6-PMO结合物获得的相对强度值明显不同于未处理的mdx小鼠的四头肌和膈肌的相对强度值（图34b和图31）。对于所有的治疗，在四头肌（修复得分百分比-％RS-范围在21.10-33.44％之间，图34b）和膈肌中的抗肌萎缩蛋白修复水平非常相似，除了Pip6b在膈肌中有着更高的修复得分（％RS范围在38.87-48.43％之间，Pip6b56.72％；图34b）。除了Pip6（与mdx=P<0.0001相比，其他的Pip6-PMOs有统计显著性，图31），所有的5-aa核心Pip6-PMO治疗的小鼠在心脏中表现出了高抗肌萎缩蛋白强度值。Pip6a-和Pip6b-PMO结合物显示了最高的修复得分，如图34b中看到的（％RS分别为37.66％和34.22％），紧随其后的是Pip6f-PMO（％RS26.24％），然后是Pip5e-PMO（％RS17.32％）。当与Pip5e-PMO治疗的直接比较时，仅Pip6a-PMO在心脏中是显著地更好（图32）。如通过胫骨前肌的免疫组化染色所阐明的，这些5-aa核心Pip6-PMO还显示了修复其它的抗肌萎缩蛋白复杂蛋白质，即nNOS、α-肌糖和β-肌糖。

PCR和蛋白质印迹分析显示了相似的免疫染色结果。代表性的RT-PCR图像（图34d）说明在所有分析的组织中高度的外显子跳跃效率。这通过四头肌、膈肌和心脏的实时PCR（qRT-PCR）结果更好的示出了这一点（图34c）。Δ23转录不利于用每个肌肉组（n=3）的“总抗肌萎缩蛋白”进行归一化。该数据的定量在所有5-aa Pip6-PMO治疗的小鼠的四头肌中显示有相似的Δ23跳跃水平。该数据趋势表明，Pip6f-和Pip5e-PMO在膈肌中显示有最高度的外显子跳跃，Pip6f-PMO在心脏中最高（有关剪接平均值参见Fig38a）。蛋白质印迹（图34e）在每个小鼠的组织中进行，并相对50％和10％的C57BL10对照定量。这些结果被平均化，体现在图38b中。Pip6a-、Pip6b-、Pip6e-和Pip6f-PMO结合物在胫骨前肌和四头肌中表现了最高度的抗肌萎缩蛋白修复。膈肌中的抗肌萎缩蛋白修复水平对于所有这些治疗进行了统一，而在心脏的情况中，Pip6b-和Pip6f-PMO结合物显示出了最高度的抗肌萎缩蛋白修复。

通过免疫组化染色测定的蛋白质修复始终高于由蛋白质印迹分析计算的蛋白质修复。这些差异可能归因于使用的不同的“住宅蛋白”，即通过免疫组化染色定量的抗肌萎缩蛋白修复相对于层粘连蛋白被归一化，而蛋白质印迹分析使用α-辅肌动蛋白进行归一化。蛋白质印迹的定量最近仅被报道用于抗肌萎缩蛋白，并且目前使用化学发光的方法。因此，它可以明确判断，以给与由蛋白质印迹表现的抗肌萎缩蛋白水平的更重要的趋势而不是绝对值。因此，考虑到全部的结果，与之前先导的候选物Pip5e-PMO相比，采用四个5-aa核心Pip6-PMO（Pip6a-、Pip6b-、Pip6e和Pip6f-PMO）中的每一个治疗的mdx小鼠似乎说明了在胫骨前肌、四头肌和心肌中，抗肌萎缩蛋白生产和外显子跳跃的改善。

另外，如通过相关的毒性生物标志物、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、肌酸激酶的血浆水平所评估的，这些5-aa核心Pip6-PMO未表现出毒性的证据（参见图40a）。血尿素氮和肌酸酐水平类似于未处理的mdx的水平（参见图40b）。所有的Pip6-PMO治疗组对于未处理的C57BL10对照均表现出了相似的生物标志物水平。

如上所述，经单次静脉注射12.5mg/kg处理成年mdx小鼠（4.5月龄），并在两周后获得体内广泛的组织，对于该小鼠中的外显子跳跃和抗肌萎缩蛋白生产，将Pip5e-PMO与Pip6e-PMO进行了比较。

免疫组化染色（数据未示出）被用于可视化抗肌萎缩蛋白生产（以及它在肌膜正确的重新定位），RT-PCR被用于检测处理的mdx肌肉群中的外显子跳跃。qPCR允许用于剪接产物的定量，蛋白质印迹被用于定量来自处理的mdx小鼠的肌肉中产生的抗肌萎缩蛋白的量，其与C57BL10和未处理的mdx对照相比较。

结果（图6-17）显示了Pip-6a（包含来自Pip-5e的反转的核心（域2）序列）、Pip-6b（Y变为核心序列中的I）、Pip-6e（R移入核心序列）和Pip-6f（包含打乱的核心序列）都在心肌中保持了外显子跳跃和抗肌萎缩蛋白生产，类似于Pip-5e，而包含缩短的核心序列的肽（Pip-6c和Pip-6d）在心肌中丧失活性。在所有其他的肌肉类型中的活性大致相同于所有的6个Pip-6（a、b、c、d、e、f）PMO结构。

这些结果表明，对于有效地输送PMODMD到心肌，肽序列并不重要，这表明没有特定的细胞进入信号（如打乱的核心：Pip-6f展现了良好的输送PMODMD至心肌）。因此，与Pip-5e相比，尽管保留5个氨基酸的疏水性核心序列是重要的，但如在心肌中通过反转和打乱核心序列没有丧失活性所证实的，疏水性核心序列的N-到C-顺序（一级序列）并不是重要的。然而，对于输送到其他肌肉类型，例如骨骼肌和平滑肌，拥有5个氨基酸的疏水性核心序列的需求是较不重要的，如由Pip-6c和Pip-6d在非心肌中的良好活性所阐明的。

细胞存活试验

Huh-7细胞在37℃的5％CO₂/95％空气下的补充有10％胎牛血清和青霉素/链霉素抗生素的DMEM中生长。细胞用胰蛋白酶处理并在96孔板的每个孔中覆盖1.5×10⁴个细胞。在过夜培养后，细胞用PBS洗涤，并将50μL OptiMEM中的PMO-肽结合物分三次加入到孔中。经4小时培养后，通过更换具有100μL DMEM/10％FBS的培养基的方式移除结合物用于下一个20小时的培养。20μL的MTS细胞存活试验（Promega）溶液被加入到包含100μL DMEM的孔中，在UV490nm进行测量在之前，将板培养1-2小时。通过将三份样本的平均吸光度归一化为未处理样本的平均值来确定细胞存活率百分比。

呈现的结果（图19-22）是两个独立实验的平均值，与包含较少的精氨酸残基的肽的增强的细胞存活率（即较低的细胞毒性）一致。例如，在域1-3中具有合起来共7个精氨酸残基的肽比具有8或9个精氨酸残基的肽表现出了较高的细胞存活率（较低的细胞毒性）。

Pip-PMO结合物的血清稳定性

血清稳定性通过添加小份的Pip-PMO(10nmol)到100％小鼠血清（100μL）中，并在37℃培育120或240分钟被测量。使用IM胍-HCL溶液（300μL）和冰乙腈（600μL）稀释每个反应。混合样品并保持在-20℃，通过离心法（13000rpm，5分钟）分离出沉淀的血清蛋白。离心后，收集上清液，冻干，将滤渣溶于水中通过MALDI-TOF质谱法、并通过反相HPLC来分析肽的降解。HPLC条件为：柱，C18反相（250×4.6mm）；溶剂A，0.1％三氟乙酸（TFA），溶剂B，90％乙腈，10％溶剂A；梯度，在25分钟内10％-50％溶剂B。结果表明，在120分钟，对于Pip5e-PMO、Pip6a-PMO、Pip6e-PMO和Pip6f-PMO而言，剩余的主要组分可被确定为未改变的Pip-PMO结合物，且肽的PMO结合碎片的水平非常类似于(RXRRBR)₂XB-PMO的。

Pip6-PMO结合物的疏水性核心的部分缺失破坏了心脏抗肌萎缩蛋白生产

除了需要确定Pip-PMO具有高效率和心脏输送，它进一步的目的是更好地确定Pip肽疏水性核心对于心脏输送更为重要的那些要素。为此，合成了包含疏水性核心通过1个氨基酸（除去酪氨酸;Pip6c）和通过2个氨基酸（除去异亮氨酸和酪氨酸；Pip6d）部分缺失的Pip肽作为PMO结合物。

mdx小鼠在治疗后，进行了免疫组化染色，这显示了这两个缺失的Pip6-PMO在诸如胫骨前肌和膈肌的骨骼肌中的某些抗肌萎缩蛋白表达。免疫组化染色的定量显示了当与其他Pip6-PMO相比时，用Pip6d治疗的四头肌中的抗肌萎缩蛋白修复最低，紧随其后的是Pip6c-PMO（图35a，b和图31）。类似的，Pip6d-PMO在膈肌中显示了最低的抗肌萎缩蛋白修复。在心脏中Pip6c-和Pip6d-PMO结合物的修复得分非常低，说明其效率不佳（Pip6c％RS-1.06％和Pip6d2.50％；图35b）。

这些结果通过PCR和蛋白质印迹分析被证实。代表性的RT-PCR图像（图35d）和qRT-PCR外显子跳跃结果（图35c）均表明在mdx小鼠中，在用Pip6c-和Pip6d-PMO结合物治疗的四头肌和膈肌中外显子跳跃降低，在心脏中外显子跳跃可忽略不计。蛋白质印迹分析显示在胫骨前肌和四头肌肌肉中抗肌萎缩蛋白生产低效，在心脏中抗肌萎缩蛋白修复可忽略不计（图35e和图38b）。

这些结果表明，疏水性核心的长度不仅对于良好的心脏抗肌萎缩蛋白生产而且对于某些其它的肌群的活性都是至关重要的。因此，单独的CPP的精氨酸含量不再是用于该类肽的抗肌萎缩蛋白生产和外显子跳跃效率的唯一指标。

在疏水性核心中改变精氨酸的位置或增加第二精氨酸不利于抗肌萎缩蛋白生产

精氨酸从侧翼区进入核心的重新定位意外地被接受（Pip6e-PMO）。因此，合成了另外两个Pip6-PMO结合物作为Pip6e-PMO的衍生物。Pip6g-PMO包含从第二侧翼区移入中央疏水性核心的第二精氨酸残基，Pip6h-PMO包含反转的Pip6e疏水性区，这样核心中单一的精氨酸位置被改变。

惊人的是，疏水性核心的这些变化不仅在心脏中而且在所有其它组织中导致了抗肌萎缩蛋白表达的进一步减少，如在免疫组化染色和其量化中观察到的（图36a，b）。代表性的免疫组化染色图像显示了在除了胫骨前肌和四头肌外的所有组织中具有非常少的抗肌萎缩蛋白阳性纤维。参照量化，Pip6g-PMO没有显著不同于四头肌或膈肌中未处理的mdx（图39a）。这两个Pip6e-PMO的衍生物没有显著不同于心肌中未处理的mdx，说明这两种肽总体效率低下。类似的，这些Pip6e-PMO衍生物在所有组织的外显子跳跃中表现出效率降低，如在代表性的RT-PCR图像（图39d）和qRT-PCR分析（图36c和图39c）中说明的。蛋白质印迹显示在除了胫骨前肌外的所有组织中抗肌萎缩蛋白修复可忽略不计（图36e，图39d）。这些数据表明，在Pip6e的疏水性区域中增加精氨酸的数目或改变单一精氨酸的位置不利于心脏和骨骼肌抗肌萎缩蛋白生产。

材料和方法

肽-PMO结合物的合成

通过标准Fmoc化学合成了肽，并通过HPLC进行纯化。PMO序列（5'-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3'[SEQ ID NO:310]）购于基因工具有限责任公司（Gene Tools LLC）。肽通过PMO3'端的酰胺键结合至PMO，随后经HPLC纯化，并通过如之前初步说明中描述的MALDI-TOF质谱分析[Saleh AF,A.A.A.,Yin H,Betts C,Hammond S,Wood MJA和Gait MJ，在系列研讨会系列的杜氏肌营养不良症的mdx小鼠模型中通过吗啉代（PMO）寡核苷酸的3'-肽结合物增强外显子跳跃和抗肌萎缩蛋白生产,核酸组分化学,2011,有机化学和生物化学研究所,捷克共和国科学研究院:布拉格,292-296页。肽-PMO结合物溶解无菌水中，并在使用前通过0.22μm乙酸纤维膜过滤。

Pip6a、Pip6b、Pip6e和Pip6f的PMO结合物被发现具有显著的稳定性，并置于37℃的100％血清中2小时，如通过HPLC和MALDI-TOF质谱分析看到的，相对Pip5e-PMO具有相似的稳定性。结合物均显示出了相似的降解模式，直到4小时仍可观察到完整的结合物（数据未显示）。

体外实验：在mdx小鼠肌管中的外显子跳跃

制备H2K mdx肌管，并按照先前描述的方法：在没有任何转染剂的情况下，与浓度为0.125、0.25、0.5和1.0μΜ的肽-PMO结合物培养[Yin,H.,等Pip5转导肽在心脏和表型校正的mdx小鼠中引导高效率的寡核苷酸介导的抗肌萎缩蛋白外显子跳跃，分子治疗学（.Mol Ther）2011,19(7):p.1295-303]。来自分离的总RNA的嵌入式RT-PCR产物在2％琼脂糖凝胶上通过电泳被检测。使用光密度法计算定量的Δ23转录水平。MTS细胞存活试验（Promega）显示在本研究中使用的肽-PMO结合物在浓度最高时的100％存活率（数据未显示）。

动物和静脉注射

在这些实验中使用的是四个半月到5个半月大的mdx小鼠（n=3）。该实验在牛津大学的生物医学科学部根据英国内政部授权的程序执行。在最终剂量为12.5mg/kg的0.9％生理盐水溶液中制备Pip6-PMO结合物。160μL总体积经麻醉小鼠的尾静脉给药。两个星期后，小鼠通过CO₂吸入被处死，获得肌肉和其他组织，在冷却的异戊烷中快速冷冻，然后储存于-80℃。

抗肌萎缩蛋白表达的免疫组化和定量

切下组织样本的横切面（8μm厚）用于抗肌萎缩蛋白表达的检测。对于抗肌萎缩蛋白的可视化和定量，将切面用兔抗肌萎缩蛋白（Abcam）和鼠抗层粘连蛋白（Sigma）共染色，并用山羊抗兔IgG Alexa594和山羊抗鼠IgG488第二抗体分别检测（英杰公司）。图像使用Leica DMIRB显微镜和AxioVision软件（卡尔蔡司（Carl Zeiss））被捕捉。按先前描述的进行定量免疫组化[Malerba,A.等，使用低剂量吗啉代低聚物的慢性全身性治疗可改善mdx小鼠的病理学和正常化的运动行为，分子治疗学（.Mol Ther）,2011,19(2):p.345-54;Arechavala-Gomeza等，免疫组化强度测量作为一种工具以评价肌膜相关蛋白的表达，神经病理学和应用生物学（Neuropathol Appl Neurobiol）,2010,36(4):p.265-74]。拍摄每一治疗的代表性图像。关于定量，为用于每个治疗的四头肌、膈肌和心脏的每个部分（n=3）拍摄抗肌萎缩蛋白和层粘连蛋白相关的4个代表性的帧。使用ImagePro软件，10个兴趣区被随机地放置在层粘连蛋白图像，该层粘连蛋白图像被覆盖在相应的抗肌萎缩蛋白图像上。为每一治疗记录120个区的最小和最大荧光强度。计算每个区域的强度差以校正背景荧光，未处理的mdx和处理的mdx被归一化为C57BL10。在散点图上绘制这些值。使用多层统计模型计算“相对强度平均值”。使用这些值，通过执行下面的公式，如在TREATNMD网站中(http://www.treatnmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/DMD_M.1.1_001.pdf):(处理的mdx小鼠的抗肌萎缩蛋白修复-未处理的mdx小鼠的抗肌萎缩蛋白修复)/(C57BL10小鼠的抗肌萎缩蛋白修复-未处理的mdx小鼠的抗肌萎缩蛋白修复)所描述的计算修复得分百分比。按先前描述的[Yin,H.,等Pip5转导肽在心脏和表型校正的mdx小鼠中引导高效率的寡核苷酸介导的抗肌萎缩蛋白外显子跳跃，分子治疗学,2011,19(7):p.1295-303]使用MOM阻断试剂盒（载体实验室（Vector Labs））和α-肌糖和α-蛋白聚糖（克隆抗体（Novocastra））抗体（1：100稀释）进行抗肌萎缩蛋白相关蛋白的染色。使用山羊抗兔抗体（Abcam）进行nNOS的染色。

mdx小鼠组织中的外显子跳跃

使用TRIzol试剂（英杰公司）依照制造商的说明从对照和处理的小鼠组织中提取总RNA。

RT-PCR：400毫微克RNA模板被用于50μL反转录反应中，该反应使用一步RT-PCR试剂盒（QIAGEN）和基因特异性引物（Ex20-26，正向:5'-CAG AAT TCT GCC AAT TGC TGA G-3'[SEQ ID NO:312]，反向:5'-TTC TTC AGC TTG CAT TGT CC-3'[SEQ ID NO:313]）。循环条件：50℃持续30分钟，接着是94℃持续30秒、58℃持续1分钟、72℃持续2分钟的30个循环。2μL的cDNA在50μL的嵌入式PCR（QIAGEN PCR试剂盒）中使用下述循环条件被进一步扩大：94℃持续30秒、58℃持续1分钟和72℃持续1分钟的24个循环（Ex20-26：正向：CCC AGT CTA CCA CCC TAT CAG AGC[SEQ ID NO:314]，反向：CCT GCC TTT AAG GCT TCC TT[SEQ ID NO:315]）。PCR产物在2％琼脂糖凝胶上通过电泳被检测。

定量实时PCR：2μg RNA使用高容量cDNA合成试剂盒（应用生物系统（Applied Biosystems））进行反转录。外显子跳跃qPCR使用赛博绿（Syber green）试剂盒（Applied Biosystems）、引物集（IDT）和一步加（StepOne Plus）实时PCR系统（Applied Biosystems）进行。使用的引物集如下：总抗肌萎缩蛋白转录，ex19-20：正向：GCCATAGCACGAGAAAAAGC[SEQ ID NO:812]，反向：GCATTAACACCCTCATTTGC[SEQ ID NO:813];Δ23dmd转录，正向：ATT GCG CTA GAC GGA AAT GAG[SEQ ID NO:814]，反向：GTTTTT ATG AAT TGA TTC TGT TTC CC[SEQ ID NO:815]。质粒（总抗肌萎缩蛋白和Δ23跳跃）被用于标准曲线。

蛋白提取和蛋白质印迹

对照和处理的肌肉样本在包括75mM Tris-HCl（pH6.5）和补充有5％2-巯基乙醇的10％十二烷基硫酸钠的裂解缓冲液中被均质化。在离心分离并除去上清液之前，样本在100℃被加热3分钟。通过Bradford试验（Sigma）测定蛋白质水平，使用BSA标准定量。未处理的和处理的mdx样本的10-15μg蛋白、和C57BL10蛋白的这些浓度的50％和10％（阳性对照）被加载到3-8％Tris-乙酸盐凝胶中。蛋白质被印迹在PVDF膜上，并使用DYS1（克隆抗体）和加载对照、α-辅肌动蛋白（Sigma）、抗体来探测抗肌萎缩蛋白。通过绑定辣根过氧化物结合的抗小鼠IgG与鲁米根（Lumigen）检测初级抗体。蛋白质印迹被成像（LICOR（莱卡）生物科学），并使用奥德赛（Odyssey）成像系统分析。

临床生化

再通过CO₂吸入处死的mdx小鼠后，立即从其颈静脉提取样本。由英国哈威尔医学研究理事会玛丽里昂中心临床病理实验室进行毒性生物标记物的分析。

统计分析

报告的所有数据为平均值±SEM。多层次、重复测量模型被应用于该研究中。多层次统计方法建立在传统统计方法之上，并在人文、医疗和生物科学中被越来越多的应用[Butterfield,A.等，Py进化:用于分子进化的统计建模工具包,BMC生物信息学（BMC Bioinformatics）2004，5：p.1；Brooks,G.等，在腰痛患者中物理治疗护理的转介来源和结果，骨科和运动物理治疗杂志（J Orthop Sports Phys Ther）,2012；Bernier,J.,Y.Feng和K.Asakawa等，在多层次建模中处理正态假设的策略:一项评估卫生公用事业指数马克3分数的轨迹研究，健康报道（Health Rep）,2011,22(4):p.45-51；Winter,E.M.,R.G.Eston和K.L.Lamb，生理学中运动和测量（kinanthropometry）的统计分析，运动科学杂志(J Sports Sci),2001,19(10):p.761-75]。本研究使用的模型考虑到每一治疗（3级）的每个小鼠（2级）的多个“相对强度单元”（1级），如在免疫组化染色定量中进行的。在该实施例中，与其它处理的和野生型对照进行比较，未处理的mdx小鼠和Pip5e-PMO处理的小鼠被用作常数/固定系数。这是继Box-Cox变换后被执行的，以确保正态分布。使用MLwIN版本2.25进行统计学分析。

肽和肽-PMO结合物的合成

PMO序列（5'-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3'[SEQ IDNO:310]）购于基因工具有限责任公司。通过标准的9-芴羰基（Fmoc）化学使用自由多肽合成仪（CEM）以100μmol的规模合成肽，通过标准反相HPLC纯化至>90％纯度，并通过MALDI-TOF MS进行表征。肽-PMO结合物以200nmol的规模通过将肽的C-末端羧基基团连接到PMO在3’-端的仲胺经由酰胺键被制备（图1c）。利用1-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）中的2-（1H-苯并三唑-1-基）-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）和1-羟基苯并三唑一水合物（HOBt）以及二异丙基乙胺（DIEA）来激活肽的C-末端羧酸（2.5倍摩尔过量于PMO），使用的HBTU：HOBt：DIEA（2.3:2.0:2.3）过量于肽。该混合物被加入到溶有PMO的DMSO溶液（10mM）中，并在37℃下培养2小时。然后将该混合物用4倍过量的水稀释，并通过阳离子交换层析柱（源S6-ml柱，通用医疗集团）使用磷酸盐缓冲液（缓冲液A：25mM Na₂HPO₄，25％乙腈，pH7.0，缓冲液B：1M NaCl，25mM Na₂HPO₄，25％乙腈，pH7.0）进行纯化，流速为4ml/min，25分钟内0-75％缓冲液B的梯度洗脱以除去未结合的PMO和过量的肽。之后该结合物被加载到Oasis HLB柱上(4.6mm x20mm,沃特斯,米尔福德,马萨诸塞州),用水洗涤以除去盐，并用60％（v/v）乙腈洗脱。该结合物被冻干，并通过MALDI-TOF质谱和通过HPLC分析（图37）。在使用前，将肽-PMO结合物溶于无菌水中，并通过0.22μm乙酸纤维膜过滤。基于PMO总产率为20-25％。

规模扩大的肽-PMO合成

改进了结合物的初始PMO1000nm的规模，保持如上所述的HBTU：DIEA：HOBt的相同比率。使用微波炉（CEM发现（CEMDiscover））进行结合反应，反应温度升高至65℃，导致反应时间减少到15分钟。在该过程中关键的纯化步骤也被改进了。粗反应混合物使用较大的离子交换柱（源15S，通用医疗集团，HR16/10，18ml床体积）通过HPLC以除去过量的肽和未结合的PMO，在磷酸钠缓冲液（pH7.0）中用氯化钠溶液（NaCl,1.0M）洗脱以获得肽-PMO的氯化物被纯化。脱盐步骤被用于在定制的Oasis HLB脱盐柱（Waters，19×30mm）上去除过量的NaCl。在用超纯级水（代替HPLC级水）洗涤柱子10分钟后，用60％（v/v）乙腈水溶液洗脱PPMO。单次注射使用500nm，产率比使用多次注射的要高（例如2×250nm）。这导致一步法结合反应的产率增加约40％。

讨论

到目前为止，对于严重衰弱的神经肌肉紊乱DMD的最有前景的治疗是用AO通过外显子跳跃修复抗肌萎缩蛋白前体mRNA的读码框架的治疗。两个AO，PMO[Cirak,S.等，在全身性的磷酰二胺吗啉代低聚物治疗后的杜氏肌营养不良症的患者中的外显子跳跃和抗肌萎缩蛋白修复:开放标签,2期,剂量递增研究,柳叶刀（Lancet,2011,378（9791）: p.595-605；Miller,F.,C.F.Moseley和J.Koreska，杜氏肌营养不良症中的脊柱融合术，开发医学儿童神经学(Dev Med Child Neurol,1992，34(9):p.775-86]和2'OMe核苷酸[van Deutekom,J.C.等，用反义寡核苷酸PRO051的局部抗肌萎缩蛋白修复.新英格兰医学杂志（N Engl JMed）,2007,357(26):p.2677-86；Goemans,N.M.等，PRO051在杜氏肌营养不良症中PRO051的全身给药.新英格兰医学杂志（N Engl JMed）,2011,364(16):p.1513-22]，目前处于临床试验中，并且早期的有希望的结果增加了DMD患者的希望。然而，涉及给药非常高剂量的裸露的PMO给mdx小鼠的研究表明在全身性的骨骼肌肉中只部分修复抗肌萎缩蛋白，在心脏中的校正可忽略不计[Malerba,A.等,使用低剂量吗啉代低聚物的慢性全身性治疗可改善mdx小鼠的病理学和正常化的运动行为.分子治疗学(Mol Ther),2011,19(2):p.345-54；Malerba,A.等,在mdx小鼠中剂量方案对吗啉代寡聚体诱导的外显子跳跃的效率有显著影响，赫姆基因治疗学(Hum Gene Ther),2009,20(9):p.955-65]。在随后的研究中在心脏中校正抗肌萎缩蛋白的必要性是更加明显的，因为骨骼表型的校正导致了心脏工作负荷的增加，从而进一步加剧了心肌病[Malerba,A.,L.Boldrin和G.Dickson,在骨骼肌中用于治疗的长期全身给药未结合吗啉寡聚物通过外显子跳跃的抗肌萎缩蛋的表达:对于心肌完整性的影响,核酸治疗学(Nucleic Acid Ther),2011,21(4):p.293-8;Townsend,D.等，由营养不良的骨骼肌的靶向修复引起的应急扩张型心肌病,分子治疗学(Mol Ther),2008,16(5):p.832-5]。CPP结合的PMO比赤裸的PMO在mdx小鼠中可实现更有效的抗肌萎缩蛋白校正，这一发现给通过改善细胞和体内输送增强AO疗效带来了新的希望。

我们之前报道了一个有前景的肽-PMO候选物，Pip5e-PMO，能够在经单次25mg/kg给药后在包括心脏的所有肌肉类型中修复高水平的抗肌萎缩蛋白[Yin,H.,等Pip5转导肽在心脏和表型校正的mdx小鼠中引导高效率的寡核苷酸介导的抗肌萎缩蛋白外显子跳跃,分子治疗学（Mol Ther）,2011,19(7):p.1295-303]。除了富含精氨酸序列，包含5-aa疏水性部分的Pip肽不存在于先前的B-肽先导中[Perez,F.等，触角同源作为信号用于小外源肽的细胞内化和核粘附素.细胞科学杂志（J Cell Sci）,1992,102(Pt4)：p.717-22]，这似乎可能对改善心脏活性负有责任。Pip6系列作为Pip5e-PMO的衍生物被开发，试图使心脏抗肌萎缩蛋白生产所需的疏水性核心的各方面真相大白，还试图确定更多活跃 Pip-PMO结合物。我们使用适中、单剂量给药方案的研究产生了一些令人吃惊的结果。

一个重要的发现是，保持疏水性核心的五个氨基酸的长度对于良好的心脏抗肌萎缩蛋白生产是重要的。一个可能的想象是，在核心中具有连续氨基酸缺失的Pip6c-PMO和Pip6d-PMO在心脏中抗肌萎缩蛋白修复效率的减弱可能与生成物较低的疏水性有关，从而降低了进入细胞的能力[Gupta,A.等,疏水性性驱动短阳离子肽配体的细胞摄取，欧洲生物物理学杂志(Eur Biophys J),2011,40(6):p.727-36]。然而，体外结果会表明由于它们完全有能力在肌细胞中进行外显子跳跃，因此所有的这些构建体都能够进入细胞。因此，5-aa疏水性核心的长度肯定会影响对体内心脏输送至关重要的不同参数。与B-PMO相比，在荧光标记Pip5e-PMO的整个心脏切片中摄取力增强反而表明跨越的另一种屏障（例如心脏的内皮层）被改善了[Yin,H.，等,2008,17(24):p.3909-18]。继续对Pip6-PMO做进一步的心脏研究，这可能有助于解决该问题。更令人惊讶的或许是，对于Pip6c-PMO和Pip6d-PMO而言在其他肌肉类型中也有一些抗肌萎缩蛋白生产的损失。这表明，在CPP中疏水性/阳离子的平衡和/或疏水性和阳离子残基的精确间距施加了更加微妙的影响给体内输送参数。另一由Pip6-PMO类似物产生的明确结论是，疏水性核心中的疏水性残基的特定顺序在维持心脏抗肌萎缩蛋白产生时不太重要，因为反转的序列（Pip6a）、同样的疏水性残基的单取代（Pip6b）和打乱的序列（Pip6f）的活性至少和Pip5e-PMO一样，并在心脏和一些肌肉群中更加有效（图38）。

这些结果提供证据证明Pip肽的疏水性核心不可能包含在穿透心脏组织所需的膜屏障中识别特定受体的特定氨基酸序列，而是核心充当某些疏水性间隔。

然而最令人惊讶的是，Pip6e-PMO在心肌中诱发了部分的抗肌萎缩蛋白剪接和蛋白质修复，如由蛋白质印迹和qRT-PCR结果所示的（注：在免疫组化染色和定量中没有显著不同）。在Pip-6e肽中，一个精氨酸残基被移入疏水性核心，还引起了相邻核心（X-YRFLI[SEQ ID NO:816]）的疏水性X残基的校准。人们可能会认为心脏肌萎缩蛋白生产在该结合物中已完全失去，因为阳离子氨基酸（精氨酸）现被包含在核心中。与此相反，Pip6h-PMO（X-ILFRY核心[SEQ ID NO:817]）和双精氨酸核心结合物Pip6g-PMO（XYRFRLI-X核心[SEQ ID NO:818]）失去心脏活性。没想到的是，对于Pip6g-和Pip6h-PMO而言，在四头肌和膈肌中还失去了抗肌萎缩蛋白生产。在Pip6e、Pip6g和Pip6h的活性结果和Pip6c-和Pip6d-PMO的活性损失中意想不到的矛盾可能最好这样来解释：实现了关于外部疏水性氨基酸间隔（X和B）和内部疏水性核心残基这二者，Pip肽中精氨酸残基的精确间距可能会彻底改变各结合物的药理性质。这不仅可能通过改变阳离子/疏水性平衡而发生，而且可替代的可能由于Pip-PMO的二级或三级结构的改变会发生，这可能又影响血清蛋白的结合或另一改变循环半衰期的参数，或可能影响穿透肌肉组织所需地跨越屏障的能力。

几个结合物（Pip6a、Pip6b和Pip6f-PMO）已显示出有前景的抗肌萎缩蛋白生产活性，甚至超出了之前的候选物Pip5e-PMO。有趣的是，从5-aa Pip6-PMO的治疗之一(Pip6e-PMO)的血清样品的分析显示局部正常化的3miRNA（miR-1、miR-133a和miR-206）在经单次12.5mg/kg给药后接近野生型水平[Thomas C.Roberts,K.E.M.B.,Graham McClorey,Samir EL Andaloussi,Caroline Godfrey,Corinne Betts,Thibault Coursindel,Michael J.Gait,和C.I.E.S.a.M.J.A.Wood，在多个肌肉群和血清中的表达分析显露的mdx小鼠microRNA转录的复杂性对治疗具有影响，核酸治疗学（Nucleic Acid Ther），2012]。这对于Pip6-PMO是大有希望的，因为它虽然不被认为是最优的肽但还是在该类肽中表现出了显著的治疗效果。这些新的先导为识别适用于详细的肌肉和心脏功能的生理研究、以及包括剂量递增研究的深入的毒性分析的Pip-PMO候选物提供了良好的基础，预计如这样一个Pip-PMO将继续进入临床试验。

实施例2-肽-PMO结合物的合成

PMO序列（5'-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3'）[SEQ IDNO:310]购于基因工具有限责任公司。在反应室中通过标准的9-芴羰基（Fmoc）化学合成肽，纯化至>90％纯度，并通过MALDI-TOF MS进行表征。肽-PMO结合物通过将肽的羧基基团的C-末端连接到PMO的仲胺的3’-端经由酰胺键被制备（图33）。然而，我们对于肽-PMO的结合和最终纯化做了一些修改，包括a）大规模结合反应（PMO高达15μmol），b）使用较大规格的离子交换层析柱用于肽-PMO纯化出单体组分（表1）和c），使用Amicon Ultra-15离心过滤装置用于脱盐代替先前使用的反相HPLC柱。结果，产量超过两倍，基于PMO序列通常为40-55％。

表1源S离子交换柱和纯化参数

加载量	柱（床体积）	流速（ml/min）	梯度
				50-200μmol	6ml	4ml/min	25分钟0-75%溶剂B
2-10μmol	200ml	14ml/min	60分钟0-100%溶剂B

利用1-甲基-2-吡咯烷酮中的2-（1H-苯并三唑-1-基）-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）和1-羟基苯并三唑一水合物（HOBt）以及二异丙基乙胺（DIEA）来激活肽的C-末端羧酸（2.5倍摩尔过量于PMO），使用的HBTU：HOBt：DIEA（2.3:2.0:2.3）过量于肽（表2）。肽的浓度为100mM。混合后，该混合物被加入到PMO（摩尔比2.5:1）的DMSO溶液（10mM）中，并在37℃下培养2小时。然后将该混合物通过较大的阳离子交换层析柱（源S200-ml柱，通用医疗集团）使用磷酸盐缓冲液（缓冲液A：25mM Na₂HPO₄，25％乙腈，pH7.0，缓冲液B：1M NaCl，25mM Na₂HPO₄，25％乙腈，pH7.0）进行纯化，流速为14ml/min，60分钟内0-100％缓冲液B的梯度洗脱以除去未结合的PMO和过量的肽。

表2用于Pip9b-PMO结合物试剂的用量和体积（10μmol规模的PMO）

然后将该结合物使用3kDa MWCO AmiconUltra-15离心过滤装置（微孔）通过浓缩样品（在25℃下，1小时旋转3220rcf），之后用水稀释浓缩液至12ml脱盐。该过程重复两次。冻干该结合物，并通过MALDI-TOF质谱和HPLC分析。将肽-PMO结合物溶于无菌水（不含内毒素）中，并在使用前通过0.22μm乙酸纤维膜过滤。通过使用基因工具数据表中提供的PMO的消光系数在0.1N盐酸中通过紫外265nm测量浓度。

实施例3—Pip7-9肽

Pip7-9-PMO的体外毒性评价

利用细胞存活率试验开展了Pip7-9-PMO的毒性研究。这些表明10精氨酸-PMO结合物（Pip6e）具有较高水平的细胞毒性（图42）。因此，利用Pip6a（Pip8系列）、Pip6e（Pip7系列）和Pip6f（Pip9系列）作为肽源，通过减少精氨酸和氨基己酰基（氨基己酸）残基的数目合成Pip7-9-PMO系列以减少可能的细胞毒性。与Pip6e处理的细胞相比，在Pip7-9-PMO处理的mdx肌管中细胞存活率显著增加（图42），这表明有望用于后续体内研究中。

Pip7-9-PMO的单次静脉注射在mdx骨骼/周边肌肉中引起广泛的抗肌萎缩蛋白表达

为了评估Pip7-9-PMO化合物的外显子跳跃效率，给8周龄mdx小鼠静脉注射12.5mg/kg的Pip7-9-PMO。注射2周后，在胫骨前肌（TA）、膈肌、四头肌和心肌中分析了抗肌萎缩蛋白表达。我们评估了免疫染色的抗肌萎缩蛋白阳性纤维、外显子跳跃的mRNA和抗肌萎缩蛋白水平（图2-4）。通过使用鼠抗层粘连蛋白抗体进行归一化，分析了抗肌萎缩蛋白免疫染色的纤维的强度，并被表示为C57BL/10肌肉的强度水平的比率（图5）。在注射2周后，在所有Pip7-9-PMO注射的如胫骨前肌、四头肌和膈肌的骨骼肌中观察到外显子跳跃的抗肌萎缩蛋白阳性肌纤维的显著表达（图43-46）。但是，只有Pip8b、Pip8c、Pip9b、Pip9b2和Pip9c在心脏中呈现显著的抗肌萎缩蛋白表达（图46）。Pip7a、Pip7b、Pip7b2、Pip8c2、Pip9d和Pip9d2在心脏中产生的抗肌萎缩蛋白生产可不略不计（图46）。考虑到该肽的结构，在疏水性核心区中的氨基酸的顺序很明显不太重要，因为即使Pip9系列打乱的疏水性核心在心脏中也产生了类似于Pip8系列的抗肌萎缩蛋白表达。

经全身给药Pip7-9-PMO后的毒性评价

为了评价Pip7-9-PMO处理的mdx小鼠中的毒性反应，我们在全身给药Pip7-9-PMO化合物2周后，通过从处理的小鼠和对照中提取和分析血清的方式开展了初步的肝和肾功能的评价。进行了血清肌酸激酶（CK）、肌酐、尿素、碱性磷酸酶（ALP）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、总胆红素、乳酸脱氢酶（LDH）水平的分析。与未处理的mdx对照相比，在PPMO处理的mdx血清中没有升高尿素、肌酐、用于肾毒性和总胆红素的标记物、用于肝毒性的标记物的水平（图47）。在未处理的mdx小鼠中升高了ALT，AST，ALP和LDH水平。与未处理的mdx对照相比，在PPMO处理的mdx血清中没有升高这些标记物的水平。在小鼠之间CK水平可变。

在mdx小鼠中先导PPMO（外显子23小鼠）的进一步确认

我们已确定的PPMO在mdx小鼠的骨骼肌和心肌中给出了高水平的抗肌萎缩蛋白修复。Pip8b、9b、9b2、8c和9c在胫骨前肌、膈肌、四头肌和心脏中已显示给出非常有效的抗肌萎缩蛋白修复的前景，无明显毒性。

为了比较先导PPMO的外显子跳跃效率，给8周龄mdx小鼠静脉注射12.5mg/kg的PPMO。注射2周后，在胫骨前肌、膈肌、四头肌和心肌中分析了抗肌萎缩蛋白表达。我们评价了免疫染色的抗肌萎缩蛋白阳性纤维、外显子跳跃的mRNA和抗肌萎缩蛋白水平（图48-50）。通过使用鼠抗层粘连蛋白抗体进行归一化，分析了抗肌萎缩蛋白免疫染色的纤维的强度，并被表示为C57BL/10肌肉的强度水平的比率（图48）。在注射2周后，在Pip8b、9b和Pip9b2-PMO注射的如胫骨前肌、四头肌、膈肌和心肌的骨骼肌中显著表达了外显子跳跃的抗肌萎缩蛋白RNA和蛋白水平（图49-50）。但是，与Pip8b、9b和9b2-PMO相比，Pip8c和9c-PMO呈现降低的抗肌萎缩蛋白表达。此外，Pip9d2-PMO在胫骨前肌、四头肌、膈肌和心肌中产生的抗肌萎缩蛋白生产可忽略不计（图48-50），说明保持肽疏水性区域的长度以诱导有效的外显子跳跃的重要性。

通过蛋白质印迹定量PPMO处理的mdx肌肉中的抗肌萎缩蛋白水平。使用Licor软件定量抗肌萎缩蛋白带的密度，并使用黏着斑蛋白作为加载对照。条带密度由其相应的黏着斑蛋白进行归一化，并被表示为C57BL/10肌肉的抗肌萎缩蛋白表达水平的百分比。在注射2周后，外显子跳跃的抗肌萎缩蛋白水平类似于Pip8b、9b和9b2-PMO注射的如胫骨前肌、四头肌和膈肌的骨骼肌中的（图50）但是，与Pip8b、9b和9b2-PMO相比，Pip8c和9c呈现降低的抗肌萎缩蛋白表达。此外，9d2-PMO在胫骨前肌、四头肌、膈肌和心肌中产生的抗肌萎缩蛋白生产可忽略不计（图50）。

先导PPMO（外显子23小鼠）处理的mdx小鼠中异常的microRNA水平的修复

我们测试了由PPMO候选物诱导的外显子跳跃的抗肌萎缩蛋白在 mdx小鼠中通过改善肌肉病变来校正microRNA水平的能力。我们评估了异常的水平（在抗肌萎缩蛋白缺乏中的microRNA异常）中，miR-1和miR-133a在mdx血清中增多，在mdx组织中减少或不变，因此，这些可能构成有用的血清标记物。8周龄的mdx小鼠在静脉注射12.5mg/kg PPMO（Pip8b、9b、9b2、8c和9c）两星期后，在PPMO处理的血清中通过定量（Q）-PCR检测了miR-133a和miR-206的水平，并统一于miR-223作为参考的microRNA。与未处理的mdx对照相比，miR-133a和miR-206的水平在PPMO处理的mdx小鼠的血清中显著下调，这意味着肌肉病变通过PPMO改善（图51）。

PPMO合成的改进

为了比较HPLC和过滤脱盐的9b2-PMO的外显子跳跃效率，给8周龄mdx小鼠静脉内注射12.5mg/kg的PPMO。注射2周后，在胫骨前肌（TA）、膈肌、四头肌和心肌中分析了抗肌萎缩蛋白表达。我们评估了免疫染色的抗肌萎缩蛋白阳性纤维、外显子跳跃的mRNA和抗肌萎缩蛋白水平（图52-54）。通过使用鼠抗层粘连蛋白抗体进行归一化，分析抗肌萎缩蛋白免疫染色的纤维的强度，并被表示为C57BL/10肌肉的强度水平的比率（图52）。由HPLC和过滤脱盐的9b2-PMO诱导的在肌膜的外显子跳跃的抗肌萎缩蛋白的强度水平没有变化。在注射2周后，与HPLC过滤的PMO处理的肌肉（如胫骨前肌、四头肌和膈肌）相比，在过滤脱盐的Pip9b2-PMO注射的骨骼肌中，外显子跳跃的抗肌萎缩蛋白RNA和蛋白的水平略有增加（图53）。

在培养的mdx小鼠肌管中Pip9b2-PMO的毒性评价

采用细胞存活率试验开展了HPLC和过滤脱盐的Pip9b2-PMO的毒性研究。当它们用60μΜ的Pip9b2-PMO处理时，与HPLC-脱盐的Pip9b2-PMO处理的细胞相比，过滤脱盐的Pip9b2-PMO处理的mdx肌管中细胞存活率略有增加（图54）。

总结

PPMO候选物已被确定在mdx小鼠的骨骼和心肌中给出了高水平的抗肌萎缩蛋白修复。特别是，Pip8b和9b和9b2，8c和9c在胫骨前肌、膈肌、四头肌和心脏中已显示出有效的抗肌萎缩蛋白修复，无明显毒性。

对于体内DMD治疗的定量评价，异常的水平（MIR-133a和miR-206）已被评价为在mdx血清中是增加的。与未处理的mdx对照相比，miR-133a和miR-206的水平在PPMO处理的mdx小鼠的血清中显著下调。

实施例4—细胞存活率（Pip7和Pip8系列）

Pip7和Pip8系列肽在细胞存活率试验中被测试，如下所述。Huh-7肝癌细胞在37℃的5％CO₂/95％空气下的补充有10％胎牛血清和青霉素/链霉素抗生素的DMEM中生长。细胞用胰蛋白酶处理并在96孔板的每个孔中覆盖1.5×10⁴个细胞。在过夜培养后，细胞用PBS洗涤，并将50μL OptiMEM中的PMO-肽结合物分三次加入到孔中。经4小时培养后，通过更换具有100μL DMEM/10％FBS的培养基的方式移除结合物用于下一个20小时的培养。20μL的MTS细胞存活试验（Promega）溶液被加入到包含100μL DMEM的孔中，在UV（紫外线）490nm进行测量之前，将板培养1-2小时。通过统一三份样本的平均吸光度到未处理样本的平均值来确定细胞存活率百分比。

呈现的结果（图57和58）与包含较少的精氨酸残基的肽增强的细胞存活率（即较低的细胞毒性）一致。例如，在域1-3中具有合起来共7个精氨酸残基的肽比具有8或9个精氨酸残基的肽表现出了较高的细胞存活率（较低的细胞毒性）。

实施例5-体外试验：在mdx小鼠肌管中的外显子跳跃;Pip7、Pip8和Pip9系列

制备H2K mdx肌管，并按照先前描述的方法：与没有任何转染剂、浓度为0.125、0.25、0.5、1.0和2.0μΜ的肽-PMO结合物培养[Yin,H.,等,Pip5转导肽在心脏和表型校正的mdx小鼠中引导高效率的寡核苷酸介导的抗肌萎缩蛋白外显子跳跃）.Mol Ther（分子治疗学）,2011,19(7):p.1295-303]。来自分离的总RNA的嵌入式RT-PCR产物在2％琼脂糖凝胶上通过电泳被检测。使用光密度法计算定量的Δ23转录水平。

结果（图59-61）显示，在mdx肌细胞中，Pip7a、Pip7b、Pip7b2、Pip7c、Pip7c2、Pip8a、Pip8b、Pip8c、Pip8c2、Pip8d、Pip9b、Pip9b2、Pip9c、pip9c2、Pip9c3、pip9d和Pip9d2-PMO结合物给出了高度的外显子跳跃活性。

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Claims

1.一种肽，所述肽具有由至少3个域组成的一级序列结构，具有的排列为：

N-末端[域1]-[域2]-[域3]C-末端

其中

在域1-3中合起来的残基总数不超过40，

在域1和3中合起来的R（精氨酸）残基的数量至少为5，

在域1和3中合起来的X残基的数量至少为1，

在域1和3中合起来的B残基的数量至少为2，

其中X=氨基己酸，B=β-丙氨酸，

域2包括包含至少3个氨基酸Z₁Z₂FLI[SEQ ID NO:798]的序列，其中Z₁为Y或I，Z₂为Q或R，并且

域2不包含ILFQY[SEQ ID NO：799]、ILFQ[SEQ ID NO：800]或ILIQ[SEQ ID NO：801]的N-到C-末端连续的一级序列。

2.一种肽，所述肽具有由至少3个域组成的一级序列结构，具有的排列为：

N-末端[域1]-[域2]-[域3]C-末端

其中：

(i)域1包括选自：

RXRZ₃[SEQ ID NO:762]的序列，

其中Z₃选自：

RBRRXR[SEQ ID NO:763]

RBRRX[SEQ ID NO:764]

RBRX[SEQ ID NO:765]

RBRXR[SEQ ID NO:766]

BRX[SEQ ID NO:767]

BX[SEQ ID NO:768]

RBR[SEQ ID NO:769]

RB[SEQ ID NO:770]，或

RBRR[SEQ ID NO:771]中的一个，

(ii)域2包括包含至少3个氨基酸Z₁Z₂FLI[SEQ ID NO:798]的序列，其中Z₁为Y或I，Z₂为Q或R，其中域2不包含ILFQY[SEQ ID NO:799]、ILFQ[SEQ ID NO:800]或ILIQ[SEQ ID NO:801]的N-到C-末端连续的一级序列，

(iii)域3包括选自：

RXRBRXRB[SEQ ID NO:772]

XRBRXRB[SEQ ID NO:773]

RXRRBRB[SEQ ID NO:774]

BRXRB[SEQ ID NO:775]

XRRBRB[SEQ ID NO:776]

RRBRB[SEQ ID NO:777]

XRBRB[SEQ ID NO:778]

RBRXRB[SEQ ID NO:779]

RXRBRB[SEQ ID NO:780]，或

BRBRB[SEQ ID NO:781]的序列，

其中X=氨基己酸，B=β-丙氨酸。

3.根据权利要求1或2所述的肽，其中，域2包括选自YQFLI[SEQID NO:802]、IQFLI[SEQ ID NO:803]、YRFLI[SEQ ID NO:804]、YRFRLI[SEQ ID NO:805]、FQILY[SEQ ID NO:806]、QFLI[SEQ ID NO:807]、QFL[SEQ ID NO:808]或ILFRY[SEQ ID NO:811]的N-到C-末端连续的一级序列。

4.根据权利要求1-3任一项所述的肽，其中，域1包括选自以下的序列或由选自以下的序列组成：

RXRRBRRXR[SEQ ID NO:782]

RXRRBRRX[SEQ ID NO:783]

RXRRBRX[SEQ ID NO:784]

RXRBRX[SEQ ID NO:785]

RXRRBRXR[SEQ ID NO:786]

RXRRBR[SEQ ID NO:787]

RXRRB[SEQ ID NO:788]，或

RXRRBRR[SEQ ID NO:789]

RXRBX[SEQ ID NO：790]。

5.根据权利要求1-4任一项所述的肽，其中，域3包括选自以下的序列或由选自以下的序列组成：

RXRBRXRB[SEQ ID NO:772]

XRBRXRB[SEQ ID NO:773]

RXRRBRB[SEQ ID NO:774]

BRXRB[SEQ ID NO:775]

XRRBRB[SEQ ID NO:776]

RRBRB[SEQ ID NO:777]

XRBRB[SEQ ID NO:778]

RBRXRB[SEQ ID NO:779]

RXRBRB[SEQ ID NO:780]，或

BRBRB[SEQ ID NO:781]。

6.根据权利要求1-5任一项所述的肽，其中，域2具有4或5个氨基酸。

7.根据权利要求1-6任一项所述的肽，其中，域2包含0、1、2或3个R残基。

8.根据权利要求1-7任一项所述的肽，其中，域2具有至少1或2个R残基，域1具有5个R残基或更少，且域3具有4个R残基或更少。

9.根据权利要求1-8任一项所述的肽，其中，一个或多个R残基为D-精氨酸。

10.根据权利要求1-9任一项所述的肽，其中一个或多个R残基为L-精氨酸。

11.根据权利要求1-10任一项所述的肽，其中，域1和3中仅包含R、X和B残基。

12.根据权利要求1-11任一项所述的肽，其中，域1具有2-6个R残基、1-3个X残基和1-2个B残基的任意组合，并且在长度上不超过10个残基，并具有0、1或2个不是R、X或B的残基。

13.根据权利要求1-12任一项所述的肽，其中，域3具有2-5个R残基、1-3个X残基和1-3个B残基的任意组合，并且在长度上不超过9个残基，并具有0、1或2个不是R、X或B的残基。

14.根据权利要求1-13任一项所述的肽，其中，所述肽具有30个残基的最大长度，所述长度包括天然氨基酸、X和B残基。

15.根据权利要求1-14任一项所述的肽，其中，域1具有4-12个残基的长度，域2具有3-9个残基的长度，域3具有4-12个残基的长度，其中所述长度包括天然氨基酸、X和B残基。

16.根据权利要求1-15任一项所述的肽，包含SEQ ID NO:2-308或317-761之一的序列，或由该序列组成（图18、23-30和41）。

17.根据权利要求1-16任一项所述的肽，包括与SEQ ID NO:2-308或317-761之一具有至少90％序列一致性的序列，或由该序列组成（图18、23-30和41）。

18.根据权利要求1-17任一项所述的肽，

包括Pip-6a、Pip-6b、Pip-6e、Pip-6f（SEQ ID NO:2、3、6或7）之一的域1-3的序列或由该序列组成，或

包括与Pip-6a、Pip-6b、Pip-6e、Pip-6f（SEQ ID NO:2、3、6或7）之一的域1-3的序列具有至少90%序列一致性的序列或由该序列组成。

19.根据权利要求1-18任一项所述的肽，其中，所述肽进一步包括在C-末端处的连接体。

20.根据权利要求19所述的肽，其中，所述连接体选自BCys、XCys、Cys、GGCys、BBCys、BXCys、XBCys、BX或XB。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的肽，其中，所述肽化学结合至货物分子。

22.根据权利要求21所述的肽，其中，所述结合是在所述肽的所述C-末端。

23.根据权利要求21或22所述的肽，其中，所述货物分子选自核酸、肽核酸（PNA）、磷酰二胺吗啉代寡核苷酸（PMO）、锁核酸（LNA）、反义寡核苷酸、短干扰RNA（siRNA）、肽、环状肽、蛋白质或药物。

24.根据权利要求23所述的肽，其中，所述货物分子的分子量小于5000Da。

25.根据权利要求23或24所述的肽，其中，所述货物分子为PNADMD[SEQ ID NO:309]或PMODMD[SEQ ID NO:310]，或

与PNADMD[SEQ ID NO:309]或PMODMD[SEQ ID NO:310]之一具有至少90％序列一致性的分子。

26.一种药物组合物或药物，所述药物组合物或药物包括根据权利要求1-25任一项所述的肽。

27.根据权利要求26所述的药物组合物或药物，还包含药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体。

28.一种根据权利要求1-25任一项所述的肽在治疗疾病的方法中的用途。

29.一种根据权利要求1-25任一项所述的肽在制备用于治疗疾病的药物中的用途。

30.一种在需要治疗的患者中治疗疾病的方法，该方法包括给予根据权利要求1-25任一项所述的肽给患者。

31.根据权利要求28-30任一项所述的肽、用途或方法，其中，所述疾病选自杜氏肌营养不良症（DMD）、门克斯病、β-地中海贫血、额颞叶痴呆、帕金森综合征、脊髓性肌萎缩症、肌强直性营养不良、早年衰老综合征、共济失调-毛细血管扩张症突变（ATM）或癌症。

32.根据权利要求28-30任一项所述的肽、用途或方法，其中，所述疾病为心脏病，或是在心脏中明显的疾病。

33.一种分离的核酸，所述核酸编码根据权利要求1-25任一项所述的肽或肽-货物结合物。

34.一种具有调控序列的核酸载体，所述调控序列可操作地连接到编码根据权利要求1-25任一项所述的肽或肽-货物结合物的核酸。