BR112014004902B1 - Peptídeo, composição farmacêutica ou medicamento compreendendo o dito peptídeo e uso do mesmo para tratar distrofia muscular de duchenne - Google Patents

Abstract

peptídeos. a presente invenção revela peptídeos penetrantes de células, conjugados de um peptídeo penetrante de célula e uma molécula de carga.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção se refere aos peptídeos, em particular, embora não exclusivamente, aos peptídeos penetrantes de células e aos conjugados de peptídeo penetrante de células e a uma molécula de carga.

Antecedentes da Invenção

[002] Oligonucleotídeos (ONs) que têm como alvo sequências de RNA essenciais têm encontrado inúmeras aplicações recentes na modulação da expressão gênica nas células e como terapêutica em potencial 1, 2. A vantagem mecânica dos ONs de bloqueio estérico em relação aos ONs de antissentido que induzem RNase H e reagentes sIRNA que induzem RISC é a maior especificidade, uma vez que a ligação de um ON a um RNA incorreto é menos susceptível de provocar um efeito biológico indesejado fora do alvo. Em segundo lugar, uma gama muito mais vasta de análogos sintéticos de ON pode ser utilizada, uma vez que não existe nenhum requisito para o reconhecimento molecular por uma enzima de clivagem de RNA do hospedeiro.

[003] O mais importante entre os ON análogos úteis como agentes bloqueadores estéricos são aqueles com estruturas não carregadas, tais como os ácidos nucleicos peptídicos (PNA) 3 e oligonucleotídeos fosforodiamidato morfolino (PMO)4. Ambos ONs PNA e PMO têm sido utilizados in vivo para aplicações de alvejamento de RNA direcionadas ao desenvolvimento de terapêuticos5. Na cultura de células, tanto PNA quanto PMO são observados como entrando nas células muito fracamente e, portanto, muito esforço tem sido dispendido para desenvolver métodos de modo a melhorar a distribuição celular. Particularmente útil tem sido a anexação de peptídeos penetrantes de células (CPP), tais como de Penetratin, Tat (48-60), Transportan, e (R-Ahx-R) 4 (Ahx = ácido aminohexanóico), na esperança de que a sua força de translocação celular observada, como peptídeos, possa ser utilizada quando conjugada ao PNA ou PMO6-9.

[004] Um ensaio útil para a avaliação da atividade dos ONs de bloqueio estérico é aquele estabelecido por Kole e outros, que envolve a correção da emenda de um intron da β-globina na talassemia aberrante por um ON sintético 18-mer (sítio 705) no núcleo de células HeLa e pLuc705 e subsequente suprarregulação do repórter luciferase de vaga-lume10. Este ensaio tem uma gama dinâmica muito elevada, de tal modo que mesmo níveis muito baixos de atividade podem ser medidos como uma leitura de luminescência positiva. Conjugados de CPP-PNA alvejados para o sítio de junção 705 foram testados neste ensaio, e os níveis de atividade moderada foram relatados para vários CPPs diferentes quando o conjugado de CPP-ANP é incubado com células HeLa pLuc 705 na ausência de um agente de transfecção adicionado, considerando-se que o PNA sozinho é inativo11-13. Nos nossos laboratórios, verificou-se que enquanto os conjugados de Tat-PNA ou (Lys)8-PNA necessitam de coincubação com cloroquina 100 μM, um agente endossomolítico, a fim de obter uma atividade significativa no ensaio14,15, a atividade na faixa de μM para as construções (R-Ahx-R) 4-PNA e (R-Ahx-R) 4 -PMO pode ser obtida na ausência de cloroquina7, 16.

[005] Também relatamos um CPP em que seis resíduos Arg foram adicionados ao N-terminal de Penetratin CPP17,18. O dissulfeto de R6-Penetratin (R6Pen) conjugado a um PNA complementar ao RNA do elemento de resposta de ativação trans de HIV-1 mostrou uma atividade significativa em um ensaio de inibição do repórter de luciferase de células HeLa da ativação trans dependente de Tat que requereu distribuição nuclear e ligação ao RNA TAR a fim de inibir a expressão de luciferase18.

[006] Distrofia muscular de Duchenne (DMD) é um transtorno muscular ligado ao X causado principalmente por mutações sem sentido ou do tipo "frameshift" no gene da distrofina, que ocorre com uma frequência de cerca de 1 em 3.500 nascimentos vivos do sexo masculino e terapias em potencial são extremamente necessárias29. Os pacientes com DMD sofrem de perda de massa muscular grave, progressiva, enquanto que a distrofia muscular de Becker mais suave é causada por deleções na estrutura, resultando na expressão de uma proteína mais curta, porém, parcialmente funcional. Oligonucleotídeos antissentido específicos para sequência (ON) têm mostrado induzir salto de éxon alvejado para corrigir o quadro de leitura do RNAm da distrofina mutada, de modo a que as formas de distrofina mais curtas são produzidas com uma atividade semelhante à da distrofia muscular de Becker30,31. Estudos têm sido realizados em modelos de células, em um modelo de camundongo distrófico mdx contendo uma mutação sem sentido no éxon 2331-33, e em um modelo de cão que se mostrou muito promissor para a abordagem do salto do éxon. A atividade biológica é obtida como resultado da ligação do NO ao pré-RNAm da distrofina nos núcleos das células musculares para causar alteração do padrão de emenda por um mecanismo de "bloqueio estérico".

[007] Os pacientes com DMD muitas vezes sofrem de degeneração do músculo cardíaco, levando a formas de doença cardíaca, como a cardiomiopatia e cardiomiopatia dilatada ligada ao X. Assim, são necessários CPPs que permitem uma melhor expressão da distrofina funcional ou parcialmente funcional no músculo cardíaco.

[008] Oligonucleotídeos antissentido são atualmente a intervenção terapêutica mais promissora para a distrofia muscular de Duchenne. Oligonucleotídeos antissentido modulam a emenda de pré-RNAm da distrofina, restaurando desse modo, especificamente, o quadro de leitura da distrofina e gerando uma proteína de distrofina truncada, porém semifuncional. Desafios no desenvolvimento desta abordagem são a distribuição do oligonucleotídeo de antissentido sistêmica, relativamente fraca e correção ineficiente da distrofina nos tecidos musculares não esqueletais afetados, incluindo o coração.

[009] Um dos fatores mais importantes que determinam a eficiência da emenda do éxon é a química de ON. Um dos mais amplamente usados tem sido o fosforotioato 2'-O-metila (2'OMePS). Essa estrutura foi inicialmente testada em um ensaio clínico de Fase I visando éxon 51 de pré-RNAm da distrofina em pacientes com DMD envolvendo injeção intramuscular34. Um ensaio de Fase I semelhante foi realizado utilizando um oligonucleotídeo de fosforodiamidato morfolino (PMO)35. Ensaios clínicos de Fase II, envolvendo a distribuição sistêmica em pacientes com DMD, foram recentemente concluídos para ambos os 2'OMePS (Goermans NM e outros (2011) New England J. Med., 364, 1513-1522) e químicas de PMO (Cirak, S. e outros (2011) The Lancet, doi: 10.1016/S0140-6736 (11) 60756-3). Estudos em ratos sugerem níveis mais altos de salto de éxon e restauração da expressão da distrofina utilizando PMO comparado com 2'OMePS35. PMOs são moléculas não iônicas e são considerados menos propensos a formar interações indesejáveis com as moléculas intracelulares das células alvo.

[010] Yin e Wood examinaram outros ácidos nucleicos de peptídeo denominados análogos e não iônicos (PNA) por injeção intramuscular em camundongos mdx e encontraram indução significativa de salto de éxon e produção de distrofina23. Ambos PMO e PNA são considerados análogos não tóxicos com alta especificidade de sequência que têm potencial significativo para desenvolvimento farmacêutico. PMO com salto de éxon mostrou ser bem tolerado em camundongos a uma dosagem de 960 mg/kg (Sazani, P. e outros (2011) Int. J. Toxocol, 30, 322-333) e 320 mg/kg em macacos (Sazani, P. e outros (2011) Int. J. Toxicol, 30, 313-321).

[011] Vários grupos de pesquisa têm trabalhado no projeto dos CPPs (às vezes denominados peptídeos de translocação de membrana) os quais, quando conjugados aos ONs não iônicos (tais como, PNA ou PMO) ajudam na sua distribuição no interior das células (porém não dos tipos iônicos) e consequentemente, a atividade biológica de reforço do ON. No caso do PMO, um peptídeo foi divulgado contendo aminoácidos naturais e não naturais (R-Ahx-R)4- Ahx-B que, quando conjugado ao PMO resulta em níveis mais altos de atividade de bloqueio estérico em um número de células e em modelos in vivo 36. Isto tem sido investigado em estudos de DMD em camundongos mdx.

[012] De modo a ser útil para aplicações in vivo, é preferível que os CPPs demonstrem penetração eficaz das células e nucleares, particularmente quando anexados a uma carga, tal como PNA ou PMO, a fim de permitir a correção eficaz da emenda, por exemplo, EC50 a cerca de 90 μM ou menos conforme medido pelo ensaio de luciferase de correção de emenda de Kole e outros. Além disso, o CPP deve ter uma boa estabilidade no soro, a fim de resistir à degradação antes da penetração celular. Para aplicações terapêuticas CPPs também devem ter baixa toxicidade.

[013] Nós criamos previamente uma série de CPPs para conjugação com uma carga PNA possuindo a sequência de base de 20-mer GGCCAAACCTCGGCTTACCT [SEQ ID NO: 309] (denominada PNADMD) ou uma carga PMO com a sequência de bases de 25-mer GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT [SEQ ID NO: 310] (denominada PMODMD). Ambos PNADMD e PMODMD são geralmente usados como um análogo de oligonucleotídeo adequado para salto de éxon nas células musculares de camundongos mdx (in vitro) e em camundongos mdx (in vivo). Pip 5e-PMODMD exibiu salto de éxon e restauração da expressão de distrofina em células musculares H2K diferenciadas de camundongos e em modelo de camundongo mdx de DMD, incluindo a indução da produção de distrofina no músculo cardíaco. Pip 5e apresenta a sequência: RXRRBRRXRILFQYRXRBRXRBC [SEQ ID NO: 1] e é revelado no WO2009/147368 e em Yin e outros (Molecular Therapy Vol.19, N° 7 1295-1303, julho de 2011). A sequência do peptídeo Pip 5e pode ser dividida em três Domínios, dois Domínios ricos em arginina (RXRRBRRXR e RXRBRXRB) e um núcleo hidrofóbico central (ILFQY). Pip-5e mostrou ter uma boa atividade na distribuição de PMODMD ao músculo do coração.

[014] Wu e outros (Nucleic Acids Research, 2007, vol. 35, n°155182-5191) relataram que os conjugados CPP-PMOF (F representa um marcador 3'- carboxifluoresceína) nos quais os resíduos X ou B foram inseridos em uma sequência de oligo-R a atividade de correção de emenda aumentou e a absorção celular e ligação ao soro foram auxiliadas, porém que os conjugados não entraram nas células com a eficiência dos conjugados R8 e R9. Eles relataram também que o número de resíduos X afeta tanto a atividade antissentido nuclear e toxicidade de conjugados, com peptídeos apresentando mais de 5 X resíduos exibindo toxicidade dependendo do tempo e concentração em 60 μM nas linhagens de células. Eles sugerem manter o número de resíduos X em menos que 5 para reduzir a toxicidade. Eles também relataram que a redução do número de repetições RX ou RB em (RX)n ou (RB)n reduz a absorção celular e reduz a capacidade de correção da emenda (no ensaio de células HeLa).

[015] Abes e outros (Nucleic Acids Research, 2008, 36, 6353-6354) discutem as moléculas de CPP que têm uma estrutura (RXR)n-PMO e relatam que das várias moléculas de (X) testadas, um espaçador linear C4 (Abu), C6 (Ahx), ou C8 (Acy) é mais eficaz.

[016] Saleh e outros (Bioconjugate Chem. Vol. 21, No. 10 1902-1911 (2010)) relataram que o aumento do número de resíduos de arginina em uma disposição linear (RXR)n para 12 e 16 para os conjugados com PNA aumenta a capacidade de correção da emenda em um ensaio de células HeLa, mas também aumenta a toxicidade celular. Ramificação de cadeia (2 ou 4 ramificações) não resultou em atividade melhorada. Ramificações de duas cadeias e algumas ramificações de 4 cadeias foram toleradas para 12 e 16 construções de arginina, mas não para 8 construções de arginina.

[017] Assim, aumentando-se o número de resíduos do espaçador, tal como X, parece aumentar a toxicidade e reduzir a eficiência da entrada na célula em comparação com peptídeos oligoR, mas também pode aumentar a atividade de correção da emenda. Por outro lado, um elevado número de resíduos R parece levar a um aumento da eficiência de entrada celular, mas também um aumento da toxicidade, o que é indesejável. Assim, são necessários CPPs que proporcionem um equilíbrio de boa eficiência de entrada nas células e baixa toxicidade. Além disso, é desejável que o CPP mostre propriedades favoráveis in vivo, tais como direcionamento de salto significativo de éxons e produção da distrofina no modelo de camundongo, mdx, em todos os tipos de músculos, incluindo o coração.

Sumário da Invenção

[018] Os inventores criaram agora uma nova série de CPPs e avaliaram a sua capacidade de facilitar a entrada na célula das moléculas de carga conjugadas e toxicidade celular dos CPPs.

[019] Inesperadamente, os inventores identificaram que a sequência de N a C terminal linear (isto é, a sequência primária) do Domínio de núcleo hidrofóbico não é essencial para atividade de penetração da célula e que a presença de aminoácidos de núcleo, ao invés de sua sequência primária, é o fator importante. Como tal, eles perceberam que a relação estrutura-atividade não depende de uma estrutura provida por uma ordem determinada de sequência linear de aminoácidos no núcleo hidrofóbico, mas depende da presença de determinados aminoácidos no núcleo hidrofóbico. Isso permitiu que os inventores projetassem uma nova série de peptídeos penetrantes de células, descritos no presente documento.

[020] Assim, os inventores identificaram uma nova série de peptídeos penetrantes de células promissores. Os peptídeos podem atuar como porções de transportadores para facilitar o movimento de uma carga através de membranas celulares e nucleares e, opcionalmente, para distribuir cargas para tipos específicos de órgãos (tais como coração). Conjugados de peptídeo-carga também são fornecidos.Quatro novas séries de peptídeos foram preparadas e foram testadas como conjugados de peptídeo-PMO carga. Os peptídeos e as cargas associadas são mostrados nas figuras 18 e 41 e encontram-se resumidos abaixo:Pip-6a, Pip-6b, Pip-6c, Pip-6d, Pip-6e, Pip-6f, Pip-6g, Pip-6h, Pip-6i [SEQ ID NOs:2-10];Pip-7a, Pip-7b, Pip-7c, Pip-7d, Pip-7b2, Pip-7c2 [SEQ ID NOs:11-16];Pip-8a, Pip-8b, Pip-8c, Pip-8c2, Pip-8d, Pip-8d2, Pip-8d3 [SEQ ID NOs:17-20 e 317-319]; ouPip-9b, Pip-9b2, Pip-9c, Pip-9c2, Pip-9c3, Pip-9d, Pip-9d2, Pip-9d3, Pip-9d4 [SEQ ID Nos: 320-328].Pip-6a [SEQ ID NO:2], Pip-6b [SEQ ID NO:3], Pip-6c [SEQ ID NO:4], Pip-6d [SEQ ID NO: 5] Pip-6e [SEQ ID NO:6], Pip-6f [SEQ ID NO:7], Pip-6g [SEQ ID NO:8], Pip-6h [SEQ ID NO:9] e Pip-6i [SEQ ID NO:10] conjugados com PMODMD todos mostram altos níveis de salto de éxon em células de camundongo mdx in vitro. Pip- 6a, pip-6b e Pip-6f mantiveram o salto de éxon e produção de distrofina no músculo cardíaco em camundongos mdx (ou seja, in vivo), comparável ao Pip-5. Pip-8b, Pip- 8c, Pip-9b, Pip-9b2, e Pip-9c também mostraram restauração de distrofina eficiente no músculo tibial anterior (TA), diafragma, quadríceps e coração, sem toxicidade aparente.

[021] Por conseguinte, espera-se que o componente de peptídeo penetrante de célula dos conjugados CPP-PMO testados e os peptídeos possuindo identidade de sequência substancialmente semelhante e estrutura facilitem a penetração celular e nuclear da carga, tais como, oligonucleotídeos de antissentido incluindo PNA, PMO, siRNA, peptídeos e proteínas, bem como pequenas moléculas.

[022] Por conseguinte, a presente invenção fornece peptídeos que são úteis para facilitar a absorção de tais cargas através das membranas celulares, tais como a membrana plasmática de uma célula de mamífero e/ou a membrana nuclear de uma célula de mamífero. Os peptídeos podem ser referidos como "peptídeos penetrantes de células" e podem ser conjugados a uma carga para facilitar o transporte da carga através da membrana.

[023] Os peptídeos de acordo com a invenção têm uma sequência que é uma molécula única quimicamente contínua. A sequência do peptídeo pode ser constituída de aminoácidos e não aminoácidos opcionais, por exemplo, resíduos de espaçador aminoexanoico. Por exemplo, em algumas partes do peptídeo, um espaçador de ácido aminoexanoico pode ser quimicamente ligado à extremidade de C-terminal de um primeiro aminoácido e à extremidade de N-terminal de um segundo aminoácido, assim, ligando quimicamente os dois aminoácidos. Nesse relatório descritivo um aminoácido é contado como um "resíduo" e uma molécula espaçadora ou aminoácido não natural também é contado como um "resíduo".

[024] Os peptídeos podem incluir aminoácidos modificados e que não ocorrem naturalmente. De preferência, quaisquer resíduos espaçadores e aminoácidos, modificados ou não, são ligados aos resíduos adjacentes por um peptídeo de ligação de peptídeo covalente (amida) [-C(=O)NH-].Cada peptídeo compreende ou é constituído por três Domínios na seguinte disposição linear:N-terminal [Domínio 1] - [2 Domínio] - [Domínio 3] C-terminal

[025] Cada Domínio apresenta características de sequência comuns, porém a sequência exata de cada Domínio é capaz de variação e modificação. Assim, uma série de sequências é possível para cada Domínio. A combinação de cada sequência de Domínio possível produz uma variedade de sequências de peptídeos que formam parte da presente invenção.

[026] A sequência do peptídeo de núcleo é representada pela sequência de aminoácido contínuo (e espaçador opcional) de Domínios 1-3. Uma sequência ligante opcional disposta para permitir a ligação à carga pode estar presente, normalmente na extremidade do C-terminal do Domínio 3.

[027] Na descrição seguinte é empregado o código de aminoácidos de uma letra padrão. Os aminoácidos não naturais e moléculas espaçadoras são referidos usando o seguinte código de uma letra:X = qualquer um dentre ácido aminoexanoico, ácido aminobutírico, ácido aminocaprílico, β-alanilo, p-aminobenzoíla, isonipecotila ou 4-aminobutirila,B = betaAlaninaR = Arginina

[028] Domínio 1 é uma sequência rica em arginina e pode ter 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais aminoácidos de comprimento. De preferência o Domínio 1 tem 5, 6, 7, 8, 9 ou resíduos (por exemplo, X, B ou R).

[029] De preferência, o Domínio 1 tem dois ou mais aminoácidos catiônicos com aminoácidos hidrofóbicos ou grupos espaçadores que separam alguns dos aminoácidos catiônicos. Nas modalidades preferidas, o aminoácido catiônico é arginina (R). De preferência o Domínio 1 tem pelo menos dois resíduos de arginina, e de preferência um de 2, 3, 4, 5, ou 6 resíduos de arginina. Em algumas modalidades o Domínio 1 contém 3, 4, 5, 6 ou mais resíduos de arginina.

[030] O Domínio 1 de preferência, tem um comprimento máximo de menos de 15 resíduos, mais preferencialmente inferior a 13 resíduos e um comprimento mínimo de quatro resíduos (por exemplo, X, B ou R).Sequências preferidas do Domínio 1 são escolhidas do grupo de:RXRRBRRXR [SEQ ID NO :782]RXRRBRRX [SEQ ID NO :783] RXRRBRX [SEQ ID NO :784]RXRBRX [SEQ ID NO :785]RXRRBRXR [SEQ ID NO :786]RXRRBR [SEQ ID NO :787]RXRRB [SEQ ID NO :788], ouRXRRBRR [SEQ ID NO :789]RXRBX [SEQ ID NO :790]

[031] O Domínio 2 contém a sequência de aminoácidos do núcleo. Este compreende uma sequência que contém, pelo menos, três dos aminoácidos Z1Z2FLI, onde Z1 representa Y ou I e Z2 representa Q ou R. Os aminoácidos Z1Z2FLI podem estar em qualquer ordem. Os inventores verificaram que a sequência primária do Domínio 2 (isto é, a ordem dos N a C terminal) não é essencial para a atividade de penetração celular. Em algumas modalidades particularmente preferidas, o Domínio 2 não contém uma sequência primária contínua de N-terminal para C-terminal de ILFQY, ILFQ ou ILIQ, embora possa conter estes aminoácidos de uma ordem de sequência primária contínua de N-terminal para C.

[032] A sequência do Domínio 2 pode conter 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos adicionais a uma ou ambas as extremidades de N- ou C- terminal da sequência. De preferência, não há nenhum, ou existe um ou dois aminoácidos na extremidade de N-termnal e nenhum, um ou dois aminoácidos na extremidade de C-terminal. Comotal, o Domínio 2 pode ter 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos de comprimento. Domínio 2 é preferencialmente um Domínio hidrofóbico.

[033] O Domínio 2 de preferência tem um comprimento máximo de menos que 10 resíduos, mais preferencialmente menos de 7 resíduos e um comprimento mínimo de 3 resíduos, mais preferivelmente 4 ou 5 resíduos (os respectivos comprimentos incluem grupos espaçadores, por exemplo, X, e os aminoácidos não naturais). Nas modalidades preferidas o Domínio 2 tem 3, 4, 5, ou 6 resíduos (incluindo os grupos de espaçador, por exemplo, X, e os aminoácidos não naturais). Os aminoácidos adicionais podem ser de qualquer tipo.O Domínio 3 é um Domínio catiônico e de preferência tem uma sequência escolhida a partir de:RXRBRXRB [SEQ ID NO:772]XRBRXRB [SEQ ID NO:773]RXRRBRB [SEQ ID NO:774]BRXRB [SEQ ID NO:775]XRRBRB [SEQ ID NO:776]RRBRB [SEQ ID NO:777]XRBRB [SEQ ID NO:778]RBRXRB [SEQ ID NO:779]RXRBRB [SEQ ID NO:780], ouBRBRB [SEQ ID NO:781]

[034] De preferência, o Domínio 3 tem dois ou mais aminoácidos catiônicos com aminoácidos hidrofóbicos ou grupos espaçadores que separam alguns dos aminoácidos catiônicos. Nas modalidades preferidas, o aminoácido catiônico é arginina (R). De preferência, o Domínio 3 tem, pelo menos, 2, 3 ou 4 resíduos de arginina. Em algumas modalidades o Domínio 3 contém 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais resíduos de arginina.

[035] Em algumas modalidades o Domínio 3 tem um comprimento mínimo de 3 aminoácidos e um comprimento máximo de 15 resíduos (incluindo os grupos espaçadores, por exemplo, X, e os aminoácidos não naturais). Em algumas modalidades, o comprimento mínimo, incluindo grupos espaçadores, é de 4 ou mais e o comprimento máximo, incluindo grupos espaçadores, é de 12 ou menos. Em algumas modalidades, o Domínio 3 tem um comprimento de um dos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 resíduos.

[036] O número total de resíduos de arginina nos Domínios 1, 2 e 3 juntos pode ser 30-60% do número total de resíduos e pode ser um dentre 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% ou 60%. Em algumas modalidades, o número total de resíduos de arginina nos Domínios 1, 2 e 3 pode ser combinado no intervalo de 3050% do número total de resíduos, ou na faixa de 30-45%, ou 30-40%, ou 35-45%.

[037] O uso de ácido aminohexanoico e betaAlanina nos Domínios 1 e 3 é vantajoso na medida em que ajuda a minimizar a imunogenicidade do peptídeo e aumentar a resistência à proteólise.

[038]Um ligante pode ser arranjado para permitir ligação química do peptídeo à carga. O ligante também pode agir como um espaçador, para separar parte dos Domínios 1-3 do peptídeo da carga. Uma variedade de sequências de ligação são possíveis, incluindo sequências possuindo um resíduo de cisteína no C-terminal que permite a formação de um dissulfeto, tioéter ou a ligação tiol-maleimida. Outras formas de ligar o peptídeo a carga incluem o uso de um aldeído de C-terminal para formar uma oxima, a utilização de uma reação de clique ou formação de uma ligação morfolino com um aminoácido básico em que o peptídeo pode ser seguido por uma sequência espaçadora antes do Domínio 3 compreendendo: X ou B ou XB ou BX.

[039] A sequência ligante pode ter 1, 2, 3, 4, 5 ou mais aminoácidos e/ou os resíduos de comprimento (incluindo grupos espaçadores). A sequência ligante pode ser escolhida dentre o grupo de: BCys, XCys, Cys, GGCys, BBCys, BXCys, XBCys, X, XX, B, BB, BX ou XB. Qualquer B ou X pode ser substituído por outro espaçador, o qual, por exemplo, pode ser escolhido a partir de 4-aminobutiril (Aib) e isonicopecotila.

[040] A sequência de ligação pode formar uma parte da carga a qual o peptídeo será anexado. Em algumas modalidades a fixação da carga é diretamente ao C-terminal da sequência do Domínio 3. Como tal, em algumas modalidades não é necessária uma sequência de ligação, ou é fornecida pelo acoplamento da carga e sequência do Domínio 3.Em conformidade com o acima exposto, os peptídeos de acordo com a invenção podem ser representados como se segue:Z4YQFLIZ5 [SEQ ID NO: 791]Z4IQFLIZ5 [SEQ ID NO: 792]Z4YRFLIZ5 [SEQ ID NO: 793]Z4YRFRLIZ5 [SEQ ID NO: 794]Z4FQILYZ5 [SEQ ID NO: 795]Z4QFLIZ5 [SEQ ID NO: 796]Z4QFLZ5 [SEQ ID NO: 797]onde Z4 é escolhido a partir de um de:RXRRBRRXR [SEQ ID NO:782]RXRRBRRX [SEQ ID NO:783]RXRRBRX [SEQ ID NO:784]RXRBRX [SEQ ID NO:785]RXRRBRXR [SEQ ID NO:786]RXRRBR [SEQ ID NO:787]RXRRB [SEQ ID NO:788], ouRXRRBRR [SEQ ID NO:789]e Z5 é escolhido a partir de um de:RXRBRXRB [SEQ ID NO:772]XRBRXRB [SEQ ID NO:773]RXRRBRB [SEQ ID NO:774]BRXRB [SEQ ID NO:775]XRRBRB [SEQ ID NO:776]RRBRB [SEQ ID NO:777]XRBRB [SEQ ID NO:778] RBRXRB [SEQ ID NO:779]RXRBRB [SEQ ID NO:780], ouBRBRB [SEQ ID NO:781]onde Z5 pode compreender, opcionalmente, um agente de ligação na extremidade do C-terminal, o qual pode ser um dentre BCys, XCys, Cys, GGCys, BBCys, BXCys ou XBCys, X, XX, B, BB, BX ou XB.

[041] Os peptídeos preferidos podem compreender ou consistir em uma sequência escolhida a partir de uma das SEQ ID NOs 2-308 ou 317-761 (figura 18, figuras 23 a 30 e figura 41).

[042] Os peptídeos de acordo com a presente invenção podem ser escolhidos a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 6, ou 7.

[043] Excluindo a molécula de carga, os peptídeos de acordo com a presente invenção pode ter um comprimento máximo de 40 resíduos, mais preferencialmente de 30 resíduos, e ainda mais de preferência, um dentre 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 , 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 resíduos e um comprimento mínimo de 10 resíduos, mais preferivelmente um dentre os resíduos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 (o comprimento máximo e mínimo inclui qualquer molécula espaçadora, por exemplo, X, e os aminoácidos não naturais ou modificados).

[044] Os peptídeos de acordo com a presente invenção podem ser fornecidos como conjugados de peptídeo-carga, onde o peptídeo compreende ainda uma molécula de carga ligadada quimicamente (de preferência ligada covalentemente) ao peptídeo em qualquer extremidade do N-terminal ou C-terminal do peptídeo, de preferência, no extremidade de C-terminal. A ligação química pode ser obtida através de uma ligação de dissulfeto, tioéter ou a ligação tiol-maleimida, ou através de ligação amida através do ácido carboxílico do C-terminal.

[045] A molécula de carga pode ser qualquer molécula pequena, por exemplo, fármaco de molécula pequena, peptídeo, peptídeo cíclico, proteína, substância farmacêutica ou terapêutica (por exemplo, peso molecular inferior a 10.000 Da, preferivelmente inferior a 5.000 Da ou inferior a 3.000Da, e, em alguns casos inferior a 1.000Da). A molécula de carga pode ser um ácido nucleico, oligonucleotídeo antissentido (tal como PNA, PMO, LNA), ou siRNA. Moléculas de carga preferidas são os análogos de oligonucleotídeos eletricamente neutros, tais como PNA ou PMO.

[046] Em uma modalidade a carga é PNA705 (CCTCTTACCTCAGTTACA [SEQ ID NO: 316]). Em outra modalidade a carga é PNADMD (SEQ ID NO: 309). Em outra modalidade a carga é PMODMD (SEQ ID NO: 310). A molécula de carga pode ter pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, de identidade de sequência com um dos PNADMD (SEQ ID NO: 309) ou PMODMD (SEQ ID NO: 310). Os resíduos de lisina podem ser adicionados a uma ou a ambas as extremidades destes PNA ou as moléculas de PMO para melhorar a solubilidade em água. A cisteína pode ser adicionada ao C-terminal ou N-terminal para permitir a formação de uma ligação dissulfeto ou bromoacetilação para conjugação de tioéter ou para conjugação de tiol-maleimida.

[047] Os peptídeos de acordo com a presente invenção podem ser fornecidos na forma isolada ou purificada, com ou sem uma molécula de carga.

[048] Os derivados dos peptídeos também fazem parte da presente invenção. Derivados de peptídeos incluem variantes de uma determinada sequência peptídica (por exemplo, uma dentre SEQ ID NOs: 2-308) que apresentam identidade substancial de sequência de aminoácidos (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) com relação ao peptídeo de comprimento total e de preferência apresentam a mesma atividade de salto de éxon ou viabilidade de célula ou melhor. Derivados peptídicos podem ter 1, 2 ou 3 aminoácidos ou moléculas espaçadoras mais ou menos de uma das SEQ ID NOs: 2-308.

[049] A porcentagem (%) de identidade de sequência é definida como a porcentagem de resíduos (incluindo grupos espaçadores) em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos na dada sequência listada (referida pela SEQ ID NO.), após alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para obter a identidade máxima da sequência, e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade de sequência. A identidade de sequência é de preferência calculada com relação a todo o comprimento das respectivas sequências.

[050] O alinhamento para fins de determinação da porcentagem de identidade da sequência de aminoácido pode ser obtido de várias maneiras conhecidas por um versado na técnica, por exemplo, utilizando programas de computador disponíveis ao público, tais como ClustalW 1,82. T-coffee ou Megalign (DNASTAR). Ao usar esse software, os parâmetros padrão, por exemplo, para penalidade para abrir uma lacuna no alinhamento e penalidade para estender uma lacuna, são utilizados preferencialmente. Os parâmetros padrão de ClustalW 1.82 são:

[051] Penalidade para abrir uma lacuna no alinhamento da proteína = 10,0. Penalidade para estender uma lacuna no alinhamento da proteína = 0,2. Matriz da Proteína = Gonnet, Proteína/DNA ENDGAP = -1, Proteína/DNA GAPDIST = 4.Derivados de peptídeos podem também compreender substituições de aminoácidos conservadores que, por exemplo, podem estar compreendidas entre os aminoácidos, dentro dos seguintes grupos:(i) glicina, alanina, serina, treonina;(ii) ácido glutâmico e ácido aspártico;(iii) arginina, histidina e histidina;(iv) asparagina e glutamina;(v) isoleucina, leucina e valina;(vi)fenilalanina, tirosina e triptofano

[052] Os peptídeos de acordo com a presente invenção apresentam, preferencialmente, uma elevada atividade quando conjugados com PMODMD no salto do éxon em células musculares de camundongos H2K diferenciadas (Yin e outros (Molecular Therapy Vol.19, No.7 1295-1303, julho de 2011). Preferencialmente a EC50 estabelecida neste ensaio é inferior a 2 μM. Em algumas modalidades, a EC50 estabelecida neste ensaio é inferior a 1 μM, menos que 0,9 μM, menos que 0,8 μM, menos que 0,7 μM, ou menos que 0,6 μM. Peptídeos de acordo com a presente invenção exibem de preferência a mesma ou atividade superior (ou seja, eles têm uma EC50 menor igual), no ensaio de células de salto do éxon como um dos Pip-5e ou (RXRRBR) 2XB [SEQ ID NO: 311].

[053] Os peptídeos de acordo com a presente invenção exibem de preferência uma maior estabilidade no soro depois de duas horas no soro (por exemplo, soro de camundongo ou humano) em comparação com R6Pen e estabilidade do soro preferivelmente equivalente (ou, opcionalmente, melhor) em comparação com Pip-5e ou (RXRRBR) 2XB [SEQ ID NO: 311]. Estabilidade de soro pode ser medida através da adição de uma alíquota de PMO-Pip (10 nmol) de 100% de soro de camundongo (100 μL) e incubando a 37°C durante 120 ou 240 min. Cada reação é diluída com solução IM de guanidina-HCl (300 μL) e acetonitrila gelada (600 μL). As amostras são misturadas e mantidas à temperatura de -20°C, e as proteínas do soro precipitadas separadas por centrifugação (13.000 rpm, 5 min.). Após centrifugação, o sobrenadante é recolhido, liofilizado e o resíduo dissolvido em água para a análise de degradação de peptídeos por espectrometria de massa MALDI-TOF e por HPLC de fase reversa. Condições de HPLC são as seguintes: Coluna de fase reversa C18 (250 x 4,6 mm); Solvente A, 0,1% TFA, Solvente B, 90% de acetonitrila, 10% de solvente; gradiente, 10% -50% de solvente B em 25 minutos.

[054] Nos peptídeos e os conjugados peptídicos da presente invenção os aminoácidos, os espaçadores de aminoácidos e moléculas de carga são todos de preferência quimicamente ligados por ligações covalentes.

[055] Os peptídeos e os conjugados de peptídeo-carga de acordo com a presente invenção podem ser providos para utilização em um método de tratamento médico. O tratamento médico pode requerer preferivelmente, a liberação da molécula de carga em uma célula e opcionalmente no núcleo da célula.

[056] Os peptídeos e/ou conjugados de peptídeo-carga são providos, por conseguinte para uso no tratamento de doença. O uso de um peptídeo e/ou um conjugado de peptídeo-carga na fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças, também é fornecido. Um método de tratamento de um paciente ou indivíduo que necessite de tratamento para uma condição de doença também é fornecido, compreendendo a etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo e/ou um conjugado de peptídeo-carga ao paciente ou indivíduo. De preferência, o componente de carga de um conjugado de peptídeo- carga compreende um agente ativo (por exemplo, agentes farmacêuticos), capaz de tratar, prevenir ou melhorar a doença.

[057] Doenças a serem tratadas podem incluir qualquer doença onde a melhora da penetração das células e/ou membrana nuclear por uma substância farmacêutica ou molécula terapêutica pode conduzir a um efeito terapêutico melhorado. Doenças a serem tratadas podem incluir condições de doenças causadas por (no todo ou em parte) as deficiências de emenda, por exemplo, distrofia muscular de Duchenne (DMD), Distrofia Muscular de Becker, e outras doenças musculares, como distrofia muscular membro-cintura (LGMD), distrofia muscular facioscapuloumeral, distrofia muscular congênita, distrofia muscular oculfaríngea (OMD), distrofia muscular distal e distrofia muscular Emery-Dreifuss, (EDMD), bem como de doença de Menkes38 , β-talassemia39, correção de emenda de proteína tau para aliviar a demência frontotemporal, parkinsonismo e atrofia muscular espinhal39, Síndrome de Hutchinson-Gilford Progeria40, Ataxiatelangiectasia mutante (ATM)41, atrofia muscular espinhal, distrofia miotônica1, ou câncer. Genes envolvidos na patogênese de algumas dessas doenças incluem distrofina (distrofia muscular de Duchenne e distrofia muscular de Becker), DMPK (MD tipo DM1), ZNF9 (MD tipo DM2), PABPN1 (OMD), emerina, lamina A ou lamina C (EDMD), miotilina (LGMD-1A), lamina A/C (LGMD-1 B), caveolina-3 (LGMD-1 C), a calpaína-3 (LGMD-2A), disferlina (LGMD-2B e miopatia de Miyoshi), gama- sarcoglicano LGMD-2C), alfa-sarcoglicano (LGMD-2D), beta-sarcoglicano (LGMD- 2E), a delta-sarcoglicano (LGMD-2F e CMD1 L), teletonina (LGMD-2G), TRIM32 (LGMD-2H) , proteína relacionada com fuqutina (LGMD-2I), titina (DMC-2J), e O- manosil-1 (LGMD-2K).

[058] Em tal caso de doenças que envolvem defeitos de emendas, a carga pode compreender um oligonucleotídeo PNA, PMO ou outros tipos de oligonucleotídeo incluindo LNA capazes de prevenir ou corrigir o defeito da emenda e/ou aumentar a produção (por exemplo, número de) moléculas de RNAm emendadas corretamente. A presente invenção não está, naturalmente, limitada às moléculas de carga capazes de corrigir um defeito de emenda. Moléculas de carga podem incluir outro oligonucleotídeo, PNA, PMO ou LNA, tais como as moléculas de oligonucleotídeos capazes de atingir RNAm ou microRNA, por exemplo, siRNA ou shRNA para nocautear a expressão gênica, bem como moléculas não oligonucleotídeo.

[059] Os peptídeos, de acordo com a presente invenção, conjugados ao PMODMD demonstraram excelente eficácia no salto do éxon no músculo cardíaco levando à produção de fibras contendo distrofina. A falência cardíaca é uma das principais causas de morte em pacientes que sofrem de DMD, os peptídeos de acordo com a presente invenção são particularmente úteis no tratamento da DMD por conjugação a um oligonucleotídeo (por exemplo, PNA ou PMO) capaz de induzir salto éxon levando à produção normal da distrofina no tecido cardíaco, do músculo cardíaco em particular. Isto é particularmente importante tendo em conta o sucesso dos ensaios clínicos de Fase II (2'OMe e PMO) que só restaura distrofina no tecido esquelético. Existe uma preocupação de que isto possa aumentar a carga de trabalho do coração, assim progredindo/acelerando a progressão da doença cardíaca. Os conjugados peptídeo-PMODMD são considerados especialmente úteis para o tratamento de DMD.

[060] Como tal, os peptídeos de acordo com a presente invenção são particularmente úteis para a distribuição de moléculas de cargas ao tecido do coração, especificamente ao músculo cardíaco. Consequentemente, os conjugados de peptídeo-carga de acordo com a presente invenção são fornecidos para uso no tratamento de doenças ou condições do coração ou do músculo cardíaco, ou que se apresentam no coração ou músculo cardíaco, tais como doença cardíaca, e cardiomiopatia.

[061] Doenças do músculo cardíaco a serem tratadas podem ser doença cardíaca coronária, doença cardíaca congênita, miocardiopatia isquêmica, hipertensiva, inflamatória ou intrínseca. Miocardiopatia intrínseca inclui os seguintes transtornos (com genes associados): miocardiopatia dilatada (distrofina, G4.5, actina, desmina, delta-sarcoglicano, troponina T, cadeia pesada da beta-miosina, alfa-tropomiosina, cadeia respiratória mitocondrial), miocardiopatia dilatada com doença de condução (lamina A/C), miocardiopatia hipertrófica (cadeia pesada da beta-miosina, troponina T, troponina I, alfa-tropomiosina, proteína C de ligação à miosina, cadeia leve essencial da miosina, cadeia leve reguladora da miosina, titina), cardiomiopatia hipertrófica com síndrome de Wolff-Parkinson-White (AMPK, cadeia respiratória mitocondrial) e não compactação do ventrículo esquerdo (G4.5, alfa- distrobrevina).

[062] O paciente ou indivíduo a ser tratado pode ser qualquer animal ou ser humano. O paciente ou o indivíduo pode ser um mamífero não humano, mas é mais preferencialmente um paciente humano. O paciente ou indivíduo pode ser masculino ou feminino.

[063] Os medicamentos e composições farmacêuticas de acordo com aspectos da presente invenção podem ser formulados para administração por uma série de vias, incluindo, mas não se limitando a parentérica, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intratumoral, intraperitoneal, subcutânea, oral e nasal. Os medicamentos e composições podem ser formulados na forma de líquidos ou sólidos. As formulações de fluidos podem ser formuladas para administração por injeção a uma região selecionada do corpo humano ou animal.

[064] A administração é preferivelmente em uma "quantidade terapeuticamente eficaz", sendo esta suficiente para mostrar o benefício ao indivíduo. A quantidade real administrada, e a taxa e tempo de administração, dependerão da natureza e da gravidade da doença a ser tratada. A prescrição do tratamento, por exemplo, decisões sobre a dosagem etc. é da responsabilidade dos clínicos gerais e outros médicos, e tipicamente levam em conta o transtorno a ser tratado, a condição do paciente individual, o sítio de distribuição, o método de administração e outros fatores conhecidos dos praticantes. Exemplos das técnicas e protocolos mencionados acima podem ser encontrados em Remington 's Pharmaceutical Sciences, 20a Edição, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins.

[065] Os peptídeos e os conjugados de peptídeo-carga são também fornecidos para o uso em métodos in vitro. Por exemplo, é provida a utilização de um peptídeo e/ou conjugado de peptídeo-carga em um salto de éxon ou ensaio de viabilidade celular. Além disso, os peptídeos e os conjugados de peptídeo-carga são fornecidos para o uso em um modelo de camundongo com DMD, o camundongo mdx, para salto de éxon e produção de distrofina.

[066] O termo "in vitro" se destina a englobar as experiências com células em cultura enquanto que o termo "in vivo" pretende abranger as experiências com organismos multi-celulares intactos.

[067] Um ácido nucleico que codifica um peptídeo de acordo com a presente invenção, também é fornecido. Um vetor de ácido nucleico, por exemplo, plasmídeo, tendo uma sequência reguladora, por exemplo, promotora, operacionalmente ligado a um ácido nucleico que codifica um peptídeo de acordo com a presente invenção é também fornecido. O vetor de preferência é capaz de expressar o peptídeo quando transfectado em uma célula adequada, por exemplo, de mamífero, células de bactérias ou fungos. Os ácidos nucleicos podem ser proporcionados na forma isolada ou purificada.

[068] Neste relatório descritivo, o termo "operativamente ligado" pode incluir uma situação em que uma sequência de nucleotídeos selecionada e a sequência de nucleotídeos de regulação são covalentemente ligadas de tal maneira, de modo a colocar a expressão de uma sequência de codificação de nucleotídeos, sob a influência ou controle da sequência reguladora. Assim, uma sequência reguladora está operativamente ligada a uma sequência de nucleotídeos selecionada, se a sequência reguladora for capaz de efetuar a transcrição de uma sequência de codificação de nucleotídeos, que faz parte ou é a totalidade da sequência de nucleotídeos selecionada. Onde apropriado a transcrição resultante pode então ser traduzida em um peptídeo desejado.

[069] De acordo com o exposto, os seguintes aspectos e modalidades da presente invenção, são fornecidos.Em um aspecto da presente invenção é proporcionado um peptídeo que tem uma estrutura de sequência primária constituída por pelo menos três Domínios, apresentando a disposição:N-terminal [Domínio 1] - [Domínio 2] - [Domínio 3] C-terminalonde: o número de resíduos R (arginina) nos Domínios 1 e 3 combinado é de pelo menos 5,o número de resíduos de X nos Domínios 1 e 3 combinado é de pelo menos1,o número de resíduos B, nos Domínios 1 e 3 combinado é pelo menos 2, onde X = ácido aminohexanoico e B = betaAlanina, e ondeO Domínio 2 compreende uma sequência que contém, pelo menos, três dos aminoácidos Z1Z2FLI, onde Z1 é Y ou I e Z2é Q ou R, eDomínio 2 não contém uma sequência primária contínua de N a C terminal de ILFQY, ILFQ ou lLIQ.

[070] O número total de resíduos nos Domínios 1-3 combinado é, de preferência não superior a 50, mais preferivelmente não superior a 40, e mais preferivelmente situa-se entre 20 e 30.Em outro aspecto da presente invenção é proporcionado um peptídeo que tem uma estrutura de sequência primária constituída por pelo menos três Domínios, apresentando a disposição:N-terminal [Domínio 1] - [Domínio 2] - [Domínio 3] C-terminalonde:Domínio 1 compreende uma sequência escolhida a partir de:RXRZ3 [SEQ ID NO:762]onde Z3 é selecionado a partir de um dentre:RBRRXR [SEQ ID NO: 763]RBRRX [SEQ ID NO: 764]RBRX [SEQ ID NO: 765]RBRXR [SEQ ID NO: 766]BRX [SEQ ID NO: 767] BX [SEQ ID NO: 768]RBR [SEQ ID NO: 769]RB [SEQ ID NO: 770], ouRBRR [SEQ ID NO: 771](ii) O Domínio 2 compreende uma sequência que contém, pelo menos, três dos aminoácidos Z1Z2FLI, onde Z1 é Y ou I e Z2 é Q ou R, e onde Domínio 2 não contém uma sequência primária contínua de N a C terminal de ILFQY, ILFQ ou lLIQ.(iii) O Domínio 3 compreende uma sequência escolhida de:RXRBRXRB [SEQ ID NO:772]XRBRXRB [SEQ ID NO:773]RXRRBRB [SEQ ID NO:774]BRXRB [SEQ ID NO:775]XRRBRB [SEQ ID NO:776]RRBRB [SEQ ID NO:777]XRBRB [SEQ ID NO:778]RBRXRB [SEQ ID NO:779]RXRBRB [SEQ ID NO:780], ouBRBRB [SEQ ID NO:781]onde X = ácido aminohexanóico, B = betaAlanina.

[071] Em algumas modalidades o Domínio 2 compreende uma sequência primária contínua de N a C terminal escolhida de YQFLI, IQFLI, YRFLI, YRFRLI, FQILY, QFLI, ou QFL. Em algumas modalidades o Domínio 2 apresenta quatro ou cinco aminoácidos. 7. Em algumas modalidades o Domínio 2 apresenta 0, 1, 2 ou 3 resíduos de R.Em algumas modalidades o Domínio 1 compreende, ou consiste em uma sequência escolhida a partir de:RXRRBRRXR [SEQ ID NO:782] RXRRBRRX [SEQ ID NO:783]RXRRBRX [SEQ ID NO:784]RXRBRX [SEQ ID NO:785]RXRRBRXR [SEQ ID NO:786]RXRRBR [SEQ ID NO:787]RXRRB [SEQ ID NO:788], ouRXRRBRR [SEQ ID NO:789].Em algumas modalidades o Domínio 3 compreende ou consiste em uma sequência escolhida a partir de:RXRBRXRB [SEQ ID NO:772]XRBRXRB [SEQ ID NO:773]RXRRBRB [SEQ ID NO:774]BRXRB [SEQ ID NO:775]XRRBRB [SEQ ID NO:776]RRBRB [SEQ ID NO:777]XRBRB [SEQ ID NO:778]RBRXRB [SEQ ID NO:779]RXRBRB [SEQ ID NO:780], ouBRBRB [SEQ ID NO:781].

[072] Em algumas modalidades o peptídeo tem entre 6 e 12 resíduos de R, de preferência um de 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 resíduos de R. O Domínio 2 pode ter 1, 2 ou 3 resíduos R. O Domínio 1 pode ter 6 resíduos R ou menos, por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 resíduos de R. O Domínio 3 pode ter quatro resíduos de R ou menos, por exemplo, 0, 1, 2, 3 ou 4 resíduos de R. Os resíduos R podem ser D-arginina ou L-arginina, ou uma mistura de ambos.

[073] Em algumas modalidades preferidas os Domínios 1 e 3 contêm apenas os resíduos de R, X e B, ou contêm apenas um, ou dois resíduos que não são X ou B.

[074] Como tal, o Domínio 1 pode ter qualquer combinação de (i) 2 a 6 resíduos R, (ii) 1 a 3 resíduos de X, e (iii) de 1 a 2 resíduos de B, e apresenta preferencialmente não mais de 10 resíduos de comprimento e possui 0, 1 ou 2 resíduos diferentes de R, X ou B. O Domínio 3 pode ter qualquer combinação de (a) 2 a 5 resíduos de R, (b) 1 a 3 resíduos de X e (c) 1 a 3 e resíduos de B e apresenta, de preferência, não mais de 9 resíduos de comprimento e contêm 0, 1 ou 2 resíduos diferentes de R, X ou B.

[075] Em algumas modalidades, o peptídeo tem um comprimento máximo de 30 resíduos, incluindo os aminoácidos naturais, resíduos X e B. Como tal, em algumas modalidades o Domínio 1 pode ter um comprimento de 4 a 12 resíduos, o Domínio 2 pode ter um comprimento de 3 a 9 resíduos e o Domínio 3 pode ter um comprimento de 4 a 12 resíduos, em que os comprimentos incluem aminoácidos naturais, resíduos X e B.

[076] Em algumas modalidades, o peptídeo compreende, ou consiste em uma sequência escolhida a partir de uma das SEQ ID NOS: 2-308 ou 317-661 (figuras 18, 23 a 30 e 41). Em algumas modalidades o peptídeo compreende ou é constituído por uma sequência possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência de uma das SEQ ID Nos: 2-308 ou 317-761 (figuras 18, 23 a 30 e 41).

[077] Em algumas modalidades, o peptídeo compreende, ou consiste na sequência dos Domínios 1 a 3 de um dentre Pip-6a, Pip-6b, Pip-6c, Pip-6d, Pip-6e, Pip-6f, Pip-6g, Pip-6h, Pip-6i [SEQ ID NO: 2-10]; Pip-7a, Pip-7b, Pip-7c, Pip-7d, Pip- 7b2, Pip-7c2 [SEQ ID NO: 01-16]; ou Pip-8a, Pip-8b, Pip-8c, Pip-8C2, Pip-8d, Pip- 8d2, Pip-8d3 [SEQ ID NO :17-20 e 317-319], ou Pip-9b, Pip-9b2 , Pip-9c, Pip-9c2, Pip-9c3, Pip-9d, Pip-9d2, Pip-9d3, Pip-9d4 [SEQ ID Nos: 320-328] ou uma sequência tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de Domínios 1 a 3 de um dentre Pip-6a, Pip-6b, Pip-6c, Pip-6d, Pip-6e, Pip-6f, Pip-6g, Pip-6h, Pip-6i [SEQ ID NO: 2-10]; Pip-7a, Pip-7b, Pip-7c, Pip-7d, Pip-7b2, Pip-7c2 [SEQ ID NOs: 11-16], ou Pip-8a, Pip-8b, Pip-8c, Pip-8C2, Pip-8d, Pip-8d2, Pip-8d3 [SEQ ID NO: 17-20 e 317-319]; ou Pip-9b, Pip-9b2, Pip-9c, Pip-9c2, Pip-9c3, Pip-9d, Pip-9d2, Pip-9d3, Pip-9d4 [SEQ ID Nos: 320-328].

[078] Em algumas modalidades, o peptídeo compreende ainda uma sequência de ligação no C-terminal. A sequência ligante pode ser escolhida a partir de BCys, XCys, Cys, GGCys, BBCys, BXCys, XBCys, BX ou XB.

[079] Em algumas modalidades, o peptídeo é quimicamente conjugado a uma molécula de carga. A conjugação pode ser na extremidade do C-terminal do peptídeo.

[080] A molécula de carga pode ser escolhida a partir de um ácido nucleico, ácido nucleico peptídico (PNA), fosforodiamidato morfolino oligonucleotídeo (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA), oligonucleotídeo antissentido, pequeno RNA de interferência (siRNA), peptídeo, peptídeo cíclico, proteína ou fármacos. A molécula de carga pode ter um peso molecular inferior a 5.000 Da. Em algumas modalidades, a molécula de carga é PNADMD [SEQ ID NO: 309] ou PMODMD [SEQ ID NO: 310] ou uma molécula possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com um dos PNADMD [SEQ ID NO: 309] ou PMODMD [SEQ ID NO: 310].

[081] Em outro aspecto da presente invenção é fornecida uma composição farmacêutica ou medicamento que compreende um peptídeo de acordo com a presente invenção. A composição farmacêutica ou medicamento pode ainda compreender um diluente, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável.

[082] Em outro aspecto da presente invenção, um peptídeo de acordo com a presente invenção é fornecido para utilização em um método de tratamento de doença. Em outro aspecto da presente invenção é provida a utilização de um peptídeo de acordo com a presente invenção na fabricação de um medicamento para uso no tratamento de uma doença.

[083] Em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de tratamento de uma doença em um paciente que necessidade de tratamento, o método compreendendo a administração de um peptídeo ao paciente de acordo com a presente invenção.

[084] Em um aspecto adicional da presente invenção é provido um ácido nucleico isolado, o ácido nucleico isolado codificando um peptídeo ou conjugado de peptídeo-carga de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da presente invenção. Um vetor de ácido nucleico com uma sequência reguladora ligada operativamente a tal ácido nucleico também é fornecido.

Miméticos de Peptídeo

[085] A concepção de miméticos de um composto farmacêutica ou biologicamente ativo é uma abordagem conhecida para o desenvolvimento dos farmacêuticos e terapêuticos com base em um composto "líder". Isso pode ser desejável quando o composto ativo é difícil ou dispendioso de ser sintetizado ou quando é inadequado para um método particular de administração, por exemplo, alguns peptídeos podem ser agentes ativos inadequados para composições orais, pois tendem a ser rapidamente degradados por proteases no canal alimentar. O projeto mimético, síntese e teste são geralmente utilizados para evitar a classificação aleatória de um grande número de moléculas de uma propriedade alvo.

[086] Existem várias etapas normalmente seguidas no projeto de um mimético de um composto apresentando uma dada propriedade alvo. Em primeiro lugar, são determinadas as partes específicas do composto que são críticas e/ou importantes na determinação da propriedade alvo. No caso de um peptídeo, isto pode ser feito variando sistematicamente os resíduos de aminoácido no peptídeo, por exemplo, substituindo cada resíduo por sua vez. Estas partes ou resíduos que constituem a região ativa do composto são conhecidas como o seu "farmacóforo".

[087] Uma vez que o farmacóforo tiver sido encontrado, a sua estrutura é modelada de acordo com as suas propriedades físicas, por exemplo, estereoquímica, ligação, tamanho e/ou carga, utilizando dados de uma gama de fontes, por exemplo, técnicas espectroscópicas, dados de difração de raios-X e NMR. A análise computacional, mapeamento de semelhanças (que modela a carga e/ou volume de um farmacóforo, em vez da ligação entre átomos) e outras técnicas podem ser utilizadas neste processo de modelagem.

[088] Em uma variante desta abordagem, as estruturas tridimensionais do ligante e do seu parceiro de ligação são modeladas. Isto pode ser especialmente útil quando o ligannte e/ou parceiro de ligação alteram a conformação na ligação, permitindo que o modelo leve isso em conta no projeto do mimético.

[089] A molécula molde é então selecionada, na qual os grupos químicos que imitam o farmacóforo podem ser enxertados. A molécula molde e os grupos químicos enxertados sobre a mesma podem ser convenientemente selecionados de modo que o mimético seja fácil de sintetizar, seja provavelmente farmacologicamente aceitável, e não se degrade in vivo, retendo ao mesmo tempo a atividade biológica do composto líder. O mimético ou miméticos encontrados por essa abordagem podem então ser examinados para ver se eles têm a propriedade alvo, ou até que ponto eles exibem isso. Otimização ou modificação adicionais podem então ser efetuadas para chegar a um ou mais miméticos finais para testes in vivo ou clínicos.

[090] No que diz respeito à presente invenção, é proporcionado um método que compreende a etapa de modificar a estrutura do peptídeo, seguido opcionalmente por teste do peptídeo modificado em um ensaio de correção de emenda ou um ensaio de salto de éxon e/ou em um ensaio de viabilidade celular. Este processo de modificação do peptídeo ou peptídeo mimético pode ser repetido inúmeras vezes, se for o caso, até que um peptídeo possuindo a correção da emenda desejada ou atividade de salto de éxons e/ou viabilidade da célula seja identificado.

[091] As etapas de modificação utilizadas podem compreender truncagem do peptídeo ou comprimento do peptídeo mimético (isto pode envolver a síntese de um peptídeo ou peptídeo mimético de comprimento mais curto), a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos ou grupos químicos, e/ou modificação química do peptídeo ou peptídeo mimético para aumentar a viabilidade das células, resistência à degradação, transporte através das membranas das células e/ou resistência de células de depuração a partir do corpo e/ou prover uma atividade de salto de éxon e produção de distrofina em um modelo de camundongo mdx de DMD, incluindo no músculo cardíaco.

[092] A invenção inclui a combinação das características e aspectos preferidos descritos, exceto quando tal combinação é claramente inaceitável ou expressamente evitada.

[093] Os títulos das seções usados aqui são apenas para fins de organização e não devem ser interpretados como limitando a matéria descrita.

[094] Aspectos e modalidades da presente invenção serão agora ilustrados, a título de exemplo, com referência às figuras anexas. Outros aspectos e modalidades serão evidentes aos versados na técnica. Todos os documentos mencionados neste texto são aqui incorporados por referência.

Breve Descrição das Figuras

[095] As modalidades e experimentos que ilustram os princípios da invenção, serão agora discutidos com referência às figuras anexas, nas quais:

[096] Figura 1. Gráfico mostrando atividade de salto de éxon de PMO- peptídeos (Pip-5e, Pip-6a, Pip-6b, Pip-6c, Pip-6d, Pip-6e, Pip-6f) em diferenciados miotubos musculares de camundongo H2K mdx. Miotubos H2K de mdx foram incubados com os conjugados de peptídeo-PMO, em concentrações que variam entre 0,125 μM a 1 μM sem o uso de reagentes de transfecção. Os produtos de RT- PCR aninhados foram analisados por eletroforese em um gel de agarose a 2%. A atividade de salto de éxon é apresentada como a porcentagem de salto de Δ23 calculado por densitometria.

[097] Figura 2. Gráfico mostrando atividade de salto de éxon de PMO- peptídeos (Pip-6g, Pip-6h, Pip-7a, Pip-7b, Pip-7c, Pip-7d) em miotubos musculares de H2K mdx.

[098] Figura 3. Gráfico mostrando atividade de salto de éxon de PMO- peptídeos (Pip-6i, Pip-7b2, Pip-7C2, Pip-8a, Pip-8b, Pip-8c) em miotubos musculares H2K de mdx.

[099] Figura 4. Gráfico mostrando atividade de salto de éxon de PMO- peptídeos (Pip-7b, Pip-7b2, Pip-8b (cada um com 8 Arg), peptídeo B (RXRRBR)2XB)) em miotubos musculares H2K de mdx.

[0100]Figura 5. Gráfico mostrando atividade éxon de PMO-peptídeos (Pip- 7c, Pip-7c2, Pip-8c (cada um com 7 Arg), peptídeo B (RXRRBR)2XB)) em miotubos musculares H2K de mdx.

[0101] Figura 6. Gráfico mostrando resultados de quantificação de proteínas de Western blot de PMO-peptídeos (Pip-6a, Pip-6b, Pip-6c, Pip-6d, Pip-6e, Pip-6f, Pip-5e) no tecido muscular do camundongo diferente em camundongos mdx (TA = músculo tibial anterior, Quad = quadríceps, Gas = gastrocnêmio, diaph = diafragma, coração = músculo cardíaco).

[0102] Figura 7. Os gráficos que mostram os resultados de qPCR da atividade de salto de éxon nos quadríceps (A), (B) diafragma e (C) do tecido cardíaco a partir dos camundongos mdx para Pip-6a, Pip-6b, Pip-6c, Pip-6d, Pip-6e, Pip-6f e Pip-5e.

[0103] Figura 8. Os gráficos que mostram os resultados quantitativos do Western blot da atividade de salto de éxon no (A) tibial anterior, (B) quadríceps, (C) diafragma e (D) tecido cardíaco de camundongos mdx para Pip-6a, Pip-6b, Pip-6c, Pip-6d, Pip-6e, Pip-6f e Pip-5e.

[0104] Figura 9. Os resultados representativos de RT-PCR, mostrando atividade de salto de éxon em diferentes tecidos musculares de camundongos mdx para PMO-Peptídeos Pip-6a, Pip-6b, Pip-6c, Pip-6d, Pip-6e, Pip-6f e Pip-5e.

[0105]Figura 10. Western blot representativos mostrando atividade de salto de éxon em diferentes tecidos musculares de camundongos mdx para PMO- Peptídeos Pip-6a, Pip-6b, Pip-6c, Pip-6d, Pip-6e, Pip-6f e Pip-5e.

[0106]Figura 11. Conjunto de dados individuais mostrando atividade de salto de éxon no tecido muscular de camundongos mdx para Pip-5e-PMO. (A) resultados de RT-PCR, (B) Western Blot, (C) gráfico dos dados quantificados do Western blot.

[0107]Figura 12. Conjunto de dados individuais mostrando atividade de salto de éxon no tecido muscular de camundongos mdx para Pip-6a-PMO. (A) resultados de RT-PCR, (B) Western Blot, (C) gráfico de dados de Western blot quantificados.

[0108]Figura 13. Conjunto de dados individuais mostrando atividade de salto de éxon no tecido muscular de camundongos mdx para Pip-6b-PMO. (A) resultados de RT-PCR, (B) Western Blot, (C) gráfico de dados de Western blot quantificados.

[0109]Figura 14. Conjunto de dados individuais mostrando atividade de salto de éxon no tecido muscular de camundongos mdx para Pip-6c-PMO. (A) resultados de RT-PCR, (B) Western Blot, (C) gráfico de dados de Western blot quantificados.

[0110] Figura 15. Conjunto de dados individuais que mostram atividade de salto de éxon no tecido muscular de camundongos mdx para Pip-6d-PMO. (A) resultados de RT-PCR, (B) Western Blot, (C) gráfico de dados de Western blot quantificados.

[0111]Figura 16. Conjunto de dados individual mostrando atividade de salto de éxon no tecido muscular de camundongos mdx para Pip-6e-PMO pular. (A) resultados de RT-PCR, (B) Western Blot, (C) gráfico de dados de Western blot quantificados.

[0112]Figura 17. Conjunto de dados individuais mostrando atividade de salto de éxon no tecido muscular de camundongos mdx para Pip-6f-PMO (A) resultados de RT-PCR, (B) Western Blot, (C) gráfico de dados de Western blot quantificados.

[0113]Figura 18. Tabela mostrando a sequência de aminoácidos de Pip-5e, Pip-6a, Pip-6b, Pip-6c, Pip-6d, Pip-6e, Pip-6f, Pip-6g, Pip-6h, Pip-6i, Pip-7a, Pip-7b, Pip-7c, Pip-7d, Pip-7b2, Pip7c2, Pip-8a, Pip-8b, Pip8c, Pip-8c2. O número total de resíduos nos Domínios 1, 2 e 3 e número de resíduos Arg, X e B também é indicado.

[0114] Figura 19. Gráfico mostrando a viabilidade celular do peptídeo B- PMO, Pip-5e-PMO, Pip-6a-PMO, Pip-6c-PMO, Pip-6f-PMO, Pip-6h-PMO como uma função da concentração de Pip-PMO adicionado. Pip-5e, Pip-6a, Pip-6b, Pip-6c,

[0115] Figura 19. Gráfico mostrando a viabilidade celular do peptídeo B- PMO, Pip-5e-PMO, Pip-6a-PMO, Pip-6c-PMO, Pip-6f-PMO, Pip-6h-PMO como uma função da concentração de Pip-PMO adicionado.

[0116] Figura 20. Gráfico mostrando a viabilidade celular do peptídeo B- PMO, Pip-7a-PMO, Pip-8a-PMO (contendo 9 resíduos Arg) como uma função da concentração de Pip-PMO adicionado.

[0117] Figura 21. Gráfico mostrando a viabilidade celular do peptídeo B- PMO, Pip-7b-PMO, Pip-7b2- PMO, Pip-8b-PMO (contendo 8 resíduos Arg) e B-MSP- PMO (RXRRBRRXRRBRASSLNIAX [SEQ ID NO: 910], Yin, H. e outros, (2010) Mol. Ther. 18, 1822-1827) como uma função da concentração de adição de Pip-PMO.

[0118] Figura 22. Gráfico mostrando a viabilidade celular do peptídeo B- PMO, Pip-7c-PMO, Pip-7c2-PMO, Pip-8c-PMO (contendo 7 resíduos Arg) como uma função da concentração de Pip-PMO adicionado.

[0119] Figura 23. Tabela mostrando sequências peptídicas dos Domínios 1-3 de acordo com a presente invenção. Todas as sequências contém a sequência do Domínio 2 YQFLI [SEQ ID NO: 802], com as sequências do Domínio 1 selecionadas de RXRRBRRXR [SEQ ID NO: 782], RXRRBRRX [SEQ ID NO: 783], RXRRBRX [SEQ ID NO: 784], RXRRBRXR [SEQ ID NO: 786], RXRBRX [SEQ ID NO: 785], RXRBX [SEQ ID NO:790], RXRRBR [SEQ ID NO:787], RXRRB [SEQ ID NO:788], RXRRBRR [SEQ ID NO:789], com as sequências do Domínio 3 selecionadas de RXRBRXRB [SEQ ID NO:722], XRBRXRB [SEQ ID NO:773], RXRRBRB [SEQ ID NO:774], BRXRB [SEQ ID NO:775], XRRBRB [SEQ ID NO:776], RRBRB [SEQ ID NO:777], XRBRB [SEQ ID NO:778], RBRXRB [SEQ ID NO:779], RXRBRB [SEQ ID NO:780], BRBRB [SEQ ID NO:781].

[0120] Figura 24. Tabela mostrando sequências peptídicas dos Domínios 1-3 de acordo com a presente invenção. Todas as sequências contêm a sequência do Domínio 2 IQFLI [SEQ ID NO:803], com as sequências do Domínio 1 selecionadas de RXRRBRRXR, RXRRBRRX, RXRRBRX, RXRRBRXR, RXRBRX, RXRBX, RXRRBR, RXRRB, RXRRBRR, com as sequências do Domínio 3 selecionadas de RXRBRXRB, XRBRXRB, RXRRBRB, BRXRB, XRRBRB, RRBRB, XRBRB, RBRXRB, RXRBRB, BRBRB.

[0121] Figura 25. Tabela mostrando sequências peptídicas dos Domínios 1-3 de acordo com a presente invenção. Todas as sequências contêm a sequência do Domínio 2 QFLI [SEQ ID NO:807], com as sequências do Domínio 1 selecionadas de RXRRBRRXR, RXRRBRRX, RXRRBRX, RXRRBRXR, RXRBRX, RXRBX, RXRRBR, RXRRB, RXRRBRR, com as sequências do Domínio 3 selecionadas de RXRBRXRB, XRBRXRB, RXRRBRB, BRXRB, XRRBRB, RRBRB, XRBRB, RBRXRB, RXRBRB, BRBRB.

[0122] Figura 26. Tabela mostrando sequências peptídicas dos Domínios 1-3 de acordo com a presente invenção. Todas as sequências contêm a sequência do Domínio 2 QFL [SEQ ID NO: 808], com as sequências do Domínio 1 selecionadas de RXRRBRRXR, RXRRBRRX, RXRRBRX, RXRRBRXR, RXRBRX, RXRBX, RXRRBR, RXRRB, RXRRBRR, com as sequências do Domínio 3 selecionadas de RXRBRXRB, XRBRXRB, RXRRBRB, BRXRB, XRRBRB, RRBRB, XRBRB, RBRXRB, RXRBRB, BRBRB.

[0123] Figura 27. Tabela mostrando sequências peptídicas dos Domínios 1-3 de acordo com a presente invenção. Todas as sequências contêm a sequência do Domínio 2 YRFLI [SEQ ID NO: 804], com as sequências do Domínio 1 selecionadas de RXRRBRRXR, RXRRBRRX, RXRRBRX, RXRRBRXR, RXRBRX, RXRBX, RXRRBR, RXRRB, RXRRBRR, com as sequências do Domínio 3 selecionadas de RXRBRXRB, XRBRXRB, RXRRBRB, BRXRB, XRRBRB, RRBRB, XRBRB, RBRXRB, RXRBRB, BRBRB.

[0124] Figura 28. Tabela mostrando sequências peptídicas dos Domínios 1-3 de acordo com a presente invenção. Todas as sequências contêm a sequência do Domínio 2 FQILY [SEQ ID NO:806], com as sequências do Domínio 1 selecionadas de RXRRBRRXR, RXRRBRRX, RXRRBRX, RXRRBRXR, RXRBRX, RXRBX, RXRRBR, RXRRB, RXRRBRR, com as sequências do Domínio 3 selecionadas de RXRBRXRB, XRBRXRB, RXRRBRB, BRXRB, XRRBRB, RRBRB, XRBRB, RBRXRB, RXRBRB, BRBRB.

[0125] Figura 29. Tabela mostrando sequências peptídicas dos Domínios 1-3 de acordo com a presente invenção. Todas as sequências contêm a sequência do Domínio 2 YRFRLI [SEQ ID NO: 805], com as sequências do Domínio 1 selecionadas de RXRRBRRXR, RXRRBRRX, RXRRBRX, RXRRBRXR, RXRBRX, RXRBX, RXRRBR, RXRRB, RXRRBRR, com as sequências do Domínio 3 selecionadas de RXRBRXRB, XRBRXRB, RXRRBRB, BRXRB, XRRBRB, RRBRB, XRBRB, RBRXRB, RXRBRB, BRBRB.

[0126] Figura 30. Tabela mostrando sequências peptídicas dos Domínios 1-3 de acordo com a presente invenção. Todas as sequências contêm a sequência do Domínio 2 ILFRY [SEQ ID NO: 811], com as sequências do Domínio 1 selecionadas de RXRRBRRXR, RXRRBRRX, RXRRBRX, RXRRBRXR, RXRBRX, RXRBX, RXRRBR, RXRRB, RXRRBRR, com as sequências do Domínio 3 selecionadas de RXRBRXRB, XRBRXRB, RXRRBRB, BRXRB, XRRBRB, RRBRB, XRBRB, RBRXRB, RXRBRB, BRBRB.

[0127] Figura 31. Tabelas estatísticas para valores médios quantitativos de coloração imuno-histoquímica para controle C57BL10, camundongos mdx não tratados e tratados com Pip6-PMO, após uma única injeção I.V. de 12,5 mg/kg. Tabelas estatísticas significativas para coloração imuno-histoquímica do quadríceps, diafragma e músculos do coração para camundongos mdx tratados com Pip6a-f em relação aos camundongos mdx não tratados. O significado estatístico foi determinado utilizando uma série de medidas repetidas, modelo estatístico multinível (**** = p <0,0001, *** = p <0,001, ** = p <0,01 * = p <0,05, N/S = não significativo).

[0128] Figura 32. Tabelas estatísticas para valores médios quantitativos de coloração imuno-histoquímica para controle C57BL10, camundongos mdx não tratados e tratados com Pip6-PMO, após uma única injeção I.V. de 12,5 mg/kg. Tabelas estatísticas significativas para coloração imuno-histoquímica do quadríceps, diafragma e músculos do coração para camundongos mdx tratados com Pip6a-f em relação aos camundongos mdx não tratados. O significado estatístico foi determinado utilizando uma série de medidas repetidas, modelo estatístico multinível (**** = p <0,0001, *** = p <0,001, ** = p <0,01 * = p <0,05, N/S = não significativo).

[0129] Figura 33. Método de conjugação química de derivados Pip5e-PMO. Método de conjugação do peptídeo ao PMO AO. Os peptídeos foram conjugados com PMO através de uma ligação amida na extremidade 3' de PMO, seguido por purificação através de HPLC e analisados por MALDI-TOF MS. HBTU: hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il) -1,1, 3,3 - tetrametilurônio, HOBt monoidrato de 1-hidroxibenzotriazol, DIEA: diisopropiletilamina.

[0130] Figura 34. Emenda da distrofina e recuperação da proteína no controle C57BL10, camundongo mdx não tratado, camundongo tratado com o núcleo hidrofóbico 5-α Pip6-PMO ePip5e-PMO seguindo-se uma única injeção IV de 12,5 mg/kg. (a) quantificação da coloração imuno-histoquímica de distrofina em relação à contra-coloração de laminina de controle no quadríceps, diafragma e músculos cardíacos de C57BL10, camundongos mdx não tratados e mdx tratados. Valores de intensidade relativa para cada região de interesse (120 regiões) são colocados em gráfico e a média estimada do modelo calculada (apresentada em b) das medidas repetidas, modelo estatístico multinível. Para tabelas de significância estatística vide figuras 31 e 32. A classificação de porcentagem de recuperação é representada a seguir, (c) Porcentagem salto do éxon Δ23 como determinado pelo tempo real quantitativo (Q-RT)-PCR em quadríceps, diafragma e os músculos cardíacos, (d) Imagens em tempo real representativas (RT)-PCR demonstrando salto de éxon (saltado) em TA, quadríceps, gastrocnêmio, diafragma, coração e músculos do abdômen. A banda superior indica comprimento total (FL) ou transcrição não saltada. (e) Imagens western blot representativas para cada tratamento. Dez microgramas de proteína total foram carregados (TA, quadríceps, gastrocnêmio, diafragma, coração e músculos do abdômen) em relação a 50% (5 μg de proteína) e 10% (1 μg) controles C57BL10, e normalizada para o controle de carga de α-actinina (para quantificação vide figura 38a).

[0131] Figura 35. Emenda da distrofina e restauração da proteína no controle C57BL10, camundongos mdx não tratados e tratados com o núcleo hidrofóbico Pip6- PMO encurtado (Pip6c e Pip6d) em comparação com Pip5e PMO seguindo uma única injeção I.V. de 12,5 mg/kg. (a) Quantificação da coloração imuno-histoquímica de distrofina em relação a contracoloração de laminina de controle no quadríceps, diafragma e músculos cardíacos de C57BL10, camundongos mdx não tratados e mdx tratados. Valores de intensidade relativa para cada região de interesse (120 regiões) são colocados em gráfico e o modelo de média estimada calculado (apresentado em b) das medidas repetidas, modelo estatístico multi-nível. Para tabelas de significância estatística vide figuras 31 e 32. Classificação de porcentagem de recuperação é representada a seguir, (c) Porcentagem do salto do éxon Δ23 como determinado pelo tempo real quantitativo (Q-RT)-PCR no quadríceps, diafragma e os músculos cardíacos, (d) Imagens de tempo real representativo (RT)-PCR, demonstrando o salto do éxon (saltado) em TA, quadríceps, gastrocnêmio, diafragma, coração e músculos do abdômen. A banda superior indica comprimento total (FL) ou transcrição não saltada. (e) Imagens western blot representativas de cada tratamento. Dez microgramas de proteína total foram carregados (TA, quadríceps, gastocnêmio, diafragma, coração e músculos do abdômen) em relação a 50% (5 μg de proteína) e 10% (1 μg) de controles C57BL10, e normalizada para o controle de carga da α-actinina (para quantificação vide figura 38a).

[0132] Figura 36. Emenda da distrofina e recuperação de proteína no controle C57BL10, camundongos mdx não tratados e os derivados Pip6e-PMO, Pip6g e Pip6h, seguindo uma injeção única I.V. de 12,5 mg/kg. Coloração imuno- histoquímica para distrofina no controle C57BL10, camundongos mdx não tratados camundongos mdx tratados com Pip6g e Pip6h-PMO foi realizada em TA, quadríceps, gastrocnêmio, diafragma, coração e músculos do abdômen para C57BL10, camundongos mdx não tratados e camundongos mdx tratados. (a) Quantificação da coloração imuno-histoquímica de distrofina em relação à contracoloração de laminina de controle no quadríceps, diafragma e músculos cardíacos de C57BL10, camundongos mdx não tratados e mdx tratados. Valores de intensidade relativa para cada região de interesse (120 regiões) são colocados em gráfico e o modelo de média estimada calculado (apresentado em b) das medidas repetidas, modelo estatístico multi-nível. Para tabelas de significância estatística vide figuras 31 e 32. Classificação de porcentagem de recuperação é representada a seguir, (c) Porcentagem do salto do éxon Δ23 como determinado pelo tempo real quantitativo (Q-RT)-PCR no quadríceps, diafragma e os músculos cardíacos, (d) Imagens de tempo real representativo (RT)-PCR, demonstrando o salto do éxon (saltado) em TA, quadríceps, gastrocnêmio, diafragma, coração e músculos do abdômen. A banda superior indica comprimento total (FL) ou transcrição não saltada. (e) Imagens western blot representativas de cada tratamento. Dez microgramas de proteína total foram carregados (TA, quadríceps, gastocnêmio, diafragma, coração e músculos do abdômen) em relação a 50% (5 μg de proteína) e 10% (1 μg) de controles C57BL10, e normalizada para o controle de carga da α- actinina (para quantificação vide figura 39c).

[0133]Figura 37. Cromatograma HPLC e dados de MALDI-TOF para Pip6e- PMO. (a) Cromatograma HPLC de fase inversa analítica de conjugado purificado Pip6e-PMO em coluna C18 de 4,6 x 250 mm (eluente A: 0,1% de TFA, eluente B: 90% de acetonitrila, 10% de eluente A) utilizando um gradiente de 10-50% de B em 27 minutos (b), espectro de massa MALDI-TOF do conjugado Pip6e-PMO. (c) Tabela de massas moleculares calculadas e encontradas de Pip6-PMOs.

[0134] Figura 38. Tabela de valores médios de qRT-PCR e quantificação de western blots para controle C57BL10, camundongos mdx não tratados e mdx tratados com Pip6-PMO, seguindo uma injeção única I.V. de 12,5 mg/kg. (a) Valores percentuais médios de q-RT-PCR para camundongos mdx tratados com Pip6-PMO, (b) Quantificação de Western blot para tratamentos de TA, quadríceps, diafragma e tecidos do coração com Pip6a-f foi calculada. Um western blot foi realizado para cada camundongo para todos os tratamentos (n = 3) e quantificado contra um controle de C57BL10 a 50% e 10% que foi ponderado.

[0135] Figura 39. Tabelas estatísticas para coloração imuno-histoquímica quantitativa, tabela de valores médios de qRT-PCR e quantificação de Western blot para controle C57BL10, camundongos mdx não tratados e camundongos mdx tratados com Pip6e-PMO (Pip6g e Pip6h), seguindo uma única injeção I.V. de 12,5 mg/kg. Tabelas de significância estatística para coloração imuno-histoquímica do quadríceps, diafragma e músculos do coração para camundongos mdx tratados com Pip6g e Pip6h em relação aos camundongos mdx não tratados (a) ou camundongos tratados com Pip6e (B). A significância estatística foi determinada utilizando uma série de medidas repetidas, modelo estatístico multi-level (**** = p <0,0001, *** = p <0,001, ** = p <0,01 * = p <0,05, N/S = não significativo). (c) Valores de porcentagem média de q-RT-PCR para camundongos mdx tratados com Pip6g e Pip6h-PMO. (d) Quantificação de Western blot para a TA, quadríceps, diafragma e tecidos do coração tratados com Pip6g e Pip6h foi calculada. Um western blot para cada camundongo para todos os tratamentos (n = 3) foi realizado e quantificado contra um controle de C57BL10 a 50% e 10% que foi ponderado.

[0136]Figura 40. Ensaios de toxicidade avaliados em amostras de sangue de controle C57BL10, camundongos mdx não tratados e tratados com Pip6-PMO e Pip5e-PMO após uma única injeção I.V. de 12,5 mg/kg. (a) Medição de alanina aminotransferase no plasma, aspartato aminotransferase e níveis de creatina cinase em camundongos de controle C57BL10 em comparação com camundongos mdx não tratados e tratados, (b) determinação dos níveis séricos de ureia no sangue (BUN) e níveis de creatinina em camundongos de controle C57BL10 comparado com os camundongos mdx não tratados e tratados.

[0137]Figura 41. Tabela mostrando a sequência de aminoácidos de Pip-8d, Pip-8d2, Pip-8d3, Pip-9b, Pip-9b2, Pip-9c, Pip-9c2, Pip-9c3, Pip-9d, Pip-9d2, Pip- 9d3, Pip-9d4. Também é indicado o número total de resíduos nos Domínios 1, 2 e 3 e número de resíduos Arg, X e B.

[0138]Figura 42. Gráfico que mostra a viabilidade celular nos miotubos de camundongos mdx tratados com Pip7, Pip8 e Pip9-PMO.

[0139] Figura 43. Classificação de conjugados Pip7-PMO após a administração intravenosa em camundongos mdx. Expressão de distrofina após injeção intravenosa única em doses de 12,5 mg de Pip6e, Pip7a, Pip7b e Pip7b2 nos camundongos mdx de 8 semanas de idade. (a) Transcriptase reversa (RT)-PCR para detectar eficiência de salto de éxon ao nível do RNA, que é mostrado por bandas mais curtas de salto de éxon. (b) Análise Western blot de TA, quadríceps, diafragma e os músculos cardíacos de camundongos mdx tratados com conjugados Pip7-PMO. A proteína total foi extraída a partir de quatro diferentes músculos de camundongos mdx tratados 2 semanas após a injeção. Dez microgramas de proteína total das amostras de músculo tratado foram carregados. A-actinina foi utilizada como controle de carga.

[0140] Figura 44. Classificação de conjugados Pip8-PMO após a administração intravenosa em camundongos mdx. Distrofina expressão após injeção intravenosa única em doses de 12,5 mg de Pip8b, Pip8c e Pip8c2 em camundongos mdx de 8 semanas de idade. (a) Transcriptase reversa (RT)-PCR para detectar a eficiência do salto de éxon saltando ao nível do RNA, o que é mostrado por bandas de salto de éxon mais curtas. (b) Análise de Western blot de TA, quadríceps, diafragma e os músculos cardíacos de camundongos mdx tratados com conjugados Pip8-PMO. A proteína total foi extraída a partir de quatro diferentes músculos de camundongos mdx tratados 2 semanas após a injeção. Dez microgramas de proteína total a partir de amostras de músculo tratados foram carregados, α-actinina foi utilizada como controle de carga.

[0141] Figura 45. Classificação de conjugados Pip9-PMO após a administração intravenosa em camundongos mdx. Expressão de distrofina após injeção intravenosa única em doses de 12,5 mg de Pip9b, Pip9b2, Pip9c, Pip9d e Pip9d2 em camundongos mdx de 8 semanas de idade. (a) Transcriptase reversa (RT)-PCR para detectar a eficiência do salto de éxon saltando ao nível do RNA, o que é mostrado por bandas de salto de éxon mais curtas. (b) Análise de Western blot de TA, quadríceps, diafragma e os músculos cardíacos de camundongos mdx tratados com conjugados Pip8-PMO. A proteína total foi extraída a partir de quatro diferentes músculos de camundongos mdx tratados 2 semanas após a injeção. Dez microgramas de proteína total a partir de amostras de músculo tratados foram carregados, α-actinina foi utilizada como controle de carga.

[0142]Figura 46. Análise semiquantitativa de restauração da distrofina após a injeção intravenosa com Pip7-9-PMO. Músculos de TA, quadríceps, diafragma e coração foram imunocorados e analisados utilizando ImagePro para mostrar e quantificar a expressão de distrofina. (a) A intensidade das fibras imunocoradas de distrofina usando anticorpo distrofina foi analisada pelo software Image Pro conforme relatado anteriormente (Arechavala-Gomeza e outros, 2010) usando anti- laminina de camundongo para normalização e expressa como uma porcentagem do nível de intensidade de músculos C57BL/10. Valores de intensidade relativa para cada região de interesse (120 regiões) são colocados em gráfico e a intensidade média calculada (representada pela barra vermelha). (b) A intensidade da coloração da distrofina foi normalizada a uma média de músculos de C57BL/10 (100%) e mdx (0 %). A classificação de recuperação para cada animal (n = 3) é colocada em gráfico e a classificação de recuperação média calculada (representada pela barra vermelha), (média-SEM, n = 3; teste One way-ANOVA: ns, não significativo, * p < 0,05, ** <0,001, *** <0,0001 em comparação aos controles de mdx e C57).

[0143] Figura 47. Bioquímica clínica de marcadores séricos da função hepática e renal em camundongos mdx tratados com conjugados Pip7-9-PMO em dose de 12,5 mg/kg. O soro foi coletado a partir da veia jugular do camundongo imediatamente depois do sacrifício a 2 semanas após a injeção por inalação de CO2. Foi realizada análise de soro de creatina cinase, creatinina, ureia, fosfatase alcalina (ALP), alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), bilirrubina total, os níveis de lactato desidrogenase (LDH). (Média-SEM, n = 3; teste-t bicaudal; ns, não significativo, * p <0,05, ** <0,001, *** <0,0001 em comparação com qualquer mdx ou C57BL/10).

[0144]Figura 48. Análise semiquantitativa de restauração da distrofina após a injeção intravenosa com os PPMO candidatos. Músculos de TA e coração foram imunocorados utilizando anticorpo distrofina e analisados utilizando ImagePro para mostrar e quantificar a expressão da distrofina. (a) Gráficos mostram a intensidade das fibras imunocoradas de distrofina usando anticorpo distrofina analisada pelo software Image Pro conforme relatado anteriormente (Arechavala-Gomeza e outros, 2010) usando um anticorpo de camundongo anti-laminina para normalização e expressa como uma porcentagem do nível de intensidade de músculos C57BL/10. Valores de intensidade relativa para cada região de interesse (120 regiões) são colocados em gráfico e a intensidade média calculada (representada pela barra vermelha). (b) Gráficos mostram a intensidade da coloração da distrofina normalizada para uma média de músculos C57BL/10 (100%) e mdx (0%). A classificação de recuperação para cada animal (n = 3) é colocada em gráfico e a classificação média de recuperação calculada (representada pelas barras horizontais).

[0145] Figura 49. Comparação de PPMO candidatos após a administração intravenosa em camundongos mdx. Níveis de RNA de distrofina de salto de éxon foram avaliados após a injeção intravenosa única em dose de 12,5 mg de Pip8b, 9b, 9B2, 8c, 9c e 9d2 em camundongos mdx de 8 semanas de idade. A transcriptase reversa (RT)-PCR para detectar a eficiência do salto de éxon ao nível do RNA é mostrada por bandas mais curtas de salto de éxon.

[0146] Figura 50. Quantificação do nível da proteína distrofina, após administração intravenosa dos PPMO candidatos em camundongos mdx. Análise de Western blot dos músculos TA, quadríceps, diafragma e cardíacos de camundongos mdx tratados com PPMO candidatos. A proteína total foi extraída a partir de quatro diferentes músculos de camundongos mdx tratados 2 semanas após a injeção, com as doses de 12,5 mg de Pip8b, 9b, 9B2, 8c, 9c e 9d2. Foram carregados quinze microgramas de proteína total a partir de amostras de músculo tratados. Vinculina foi usada como controle de carga. (a) Imagens representativas de western blot dos músculos TA, quadríceps, o diafragma e cardíacos de camundongos mdx tratados com PPMO candidatos. (b) Gráficos mostrando análise semiquantitativa de proteína distrofina usando software Licor e vinculina usada como controle de carga. A densidade da banda foi normalizada pela sua respectiva banda de vinculina e esta foi expressa como uma porcentagem do nível de expressão de distrofina dos músculos C57BL/10.

[0147] Figura 51. Gráficos mostram expressão de distromir no soro de mdx tratado com PPMO. Duas semanas após a injeção intravenosa de 12,5 mg/kg PPMO candidatos (Pip8b, 9b, 9B2, 8c e 9c) com 8 semanas de idade, o soro foi retirado da veia jugular do camundongo, imediatamente após o sacrifício por inalação de CO2. Os níveis de miR-133a e miR-206 foram examinados por soros tratados com Q-PCR em PPMO de camundongos mdx e normalizados para miR-223. Os níveis de miR- 133a e miR-206 foram significativamente infrarregulados em soros tratados com PPMO de camundongos mdx em comparação ao controle mdx não tratado.

[0148] Figura 52. Comparação da eficiência do salto de éxon seguindo-se administração intravenosa de HPLC e PMO conjugado Pip9b2 dessalinizado-filtro em camundongos mdx.

[0149] Expressão de distrofina após injeção intravenosa única em doses de 12,5 mg de HPLC e PMO-dessalinizado-filtro em cada camundongo mdx de 8 semanas de idade. Os gráficos mostram a análise semiquantitativa de restauração da distrofina. A intensidade das fibras imunocoradas de distrofina utilizando anticorpo distrofina foi analisada pelo software Image Pro, como previamente relatado (Arechavala-Gomeza e outros, 2010) usando uma antilaminina de camundongo para normalização e expressa como uma porcentagem do nível de intensidade dos músculos de C57BL/10. Valores de intensidade relativa para cada região de interesse (120 regiões) são colocados em gráfico e a intensidade média calculada (painel do lado esquerdo; representado pela barra). A intensidade da coloração da distrofina foi normalizada para uma média de músculos C57BL/10 (100%) e mdx (0%). A classificação de recuperação para cada animal (n = 4) foi colocada em gráfico e a classificação média de recuperação calculada (painel do lado direito, representado pela barra).

[0150]Figura 53. Comparação de RNA da distrofina e nível de proteína após a administração intravenosa de Pip9b2 conjugado PMO em camundongos mdx. Análise Western blot dos músculos TA, quadríceps, diafragma e cardíacos de camundongos mdx tratados com Pip9b2. A proteína total foi extraída a partir de quatro diferentes músculos dos camundongos mdx tratados 2 semanas após a injeção, com as doses de 12,5 mg de Pip9b2-PMO. Quinze microgramas de proteína total a partir de amostras de músculo tratado foram carregados. Vinculina foi utilizada como controle de carga. (a) Imagens western blot representativas de músculos TA, quadríceps, diafragma e cardíacos de camundongos mdx tratados com PPMO candidatos. (b) Gráfico que mostra a análise semiquantitativa da proteína distrofina utilizando software Licor e vinculina usado como controle de carga. A densidade da banda foi normalizada pela respectiva banda de vinculina e esta foi expressa como uma porcentagem do nível de expressão de distrofina nos músculos de C57BL/10. (c) Transcriptase reversa (RT)-PCR para detectar a eficiência do salto de éxon eficiência ao nível do RNA é mostrada pelas bandas menores de salto de éxon.

[0151]Figura 54. Gráfico que mostra a viabilidade celular nos miotubos de camundongos mdx tratados com Pip9b2-PMO.

[0152] Figura 55. Estrutura do ácido aminohexanóico (ácido aminocapróico).

[0153] Figura 56. Estrutura de betaAlanina (ácido 3-aminopropanóico).

[0154]Figura 57. Gráfico mostrando a viabilidade celular (células Huh-7 do fígado cultivadas) de Pip7a-PMO, Pip7b-PMO, Pip7b2-PMO, Pip7c-PMO, Pip7c2- PMO, Pip7d-PNO em função da concentração de Pip-PMO adicionado.

[0155]Figura 58. Gráfico mostrando a viabilidade celular (células Huh-7 do fígado cultivadas) de Pip8a-PMO, Pip8b-PMO, Pip8c-PMO como uma função da concentração de Pip-PMO adicionado.

[0156] Figura 59. Gráfico mostrando atividade de salto de éxon de PMO- peptídeos (Pip7a, Pip7b, Pip7b2, Pip7c, Pip7c2, Pip7d) em miotubos H2K diferenciados musculares de camundongo mdx. Miotubos H2K de mdx foram incubados com os conjugados de peptídeo-PMO, em concentrações que variam entre 0,125 μM a 2 μM sem o uso de reagentes de transfecção. Os produtos de RT- PCR aninhada foram analisados por eletroforese em um gel de agarose a 2%. A atividade de salto de éxon é apresentada como a porcentagem de salto de Δ23 calculada por densitometria.

[0157] Figura 60. Gráfico mostrando atividade salto de éxon de PMO- peptídeos (Pip8a, Pip8b, Pip8c, Pip8c2, Pip8d) em miotubos H2K diferenciados musculares de camundongo mdx. Miotubos H2K de mdx foram incubados com os conjugados de peptídeo-PMO, em concentrações que variam entre 0,125 μM a 2 μM sem o uso de reagentes de transfecção. Os produtos de RT-PCR aninhada foram analisados por eletroforese em um gel de agarose a 2%. A atividade de salto de éxon é apresentada como a porcentagem de salto de Δ23 calculada por densitometria.

[0158] Figura 61. Gráfico mostrando atividade salto de éxon de PMO- peptídeos (Pip9b, Pip9b2, Pip9c, Pip9c2, Pip9c3, Pip9d, Pip9d2) em miotubos H2K diferenciados musculares de camundongo mdx. Miotubos H2K de mdx foram incubados com conjugados de peptídeo-PMO, em concentrações que variam entre 0,125 μM a 2 μM sem o uso de reagentes de transfecção. Os produtos de RT-PCR aninhada foram analisados por eletroforese em um gel de agarose a 2%. Atividade de salto de éxon é apresentada como a porcentagem de salto de Δ23 calculada por densitometria.

Descrição Detalhada da Invenção

[0159] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são apresentados na descrição que se segue, incluindo os detalhes específicos do melhor modo contemplado pelos inventores para a realização da invenção, a título de exemplo. Será evidente para um versado na técnica que a presente invenção pode ser praticada sem limitação a estes detalhes específicos.

[0160] Os inventores criaram uma nova série de peptídeos penetrantes de células projetados para a conjugação ao PMO de modo a investigar o papel da sequência núcleo hidrofóbico central na obtenção de alto salto de éxon e produção de distrofina nos músculos cardíacos em um modelo de camundongo mdx com distrofia muscular de Duchenne (DMD) mantendo a alta atividade em todos os tipos de músculos em relação ao Pip5e-PMO já divulgado. Em particular, os inventores tentaram conceber um CPP que: a) apresenta a administração melhorada de PMO carga no músculo do coração, e b) tem uma baixa toxicidade.

[0161] Em vista disso, os inventores projetaram uma série de peptídeos que diferem em dois aspectos principais da série Pip-2 a Pip-5 anteriormente divulgada.1)A sequência dos aminoácidos de núcleo hidrofóbicos do Domínio 2 foi invertida, ou embaralhada.2) O número de resíduos de arginina foi sistematicamente variado para determinar o efeito sobre a distribuição de carga e de toxicidade celular.

[0162] Nós descrevemos uma série de peptídeos projetados para a conjugação ao PMO de modo a investigar o papel do núcleo hidrofóbico central na obtenção do alto salto de éxon e produção de distrofina nos músculos cardíacos em um modelo de camundongo mdx com distrofia muscular de Duchenne (DMD), mantendo a alta atividade através todos os tipos de músculos em comparação com o Pip5e-PMO já divulgado.

Exemplo 1

[0163] Em estudo prévio relatamos atividade cardíaca impressionante, incluindo alta eficiência de salto e restauração da distrofina após uma administração única de um peptídeo penetrante de célula rica em arginina conjugado a um oligonucleotídeo fosforodiamidato morfolino: Pip5e-PMO. No entanto, os mecanismos subjacentes a esta atividade são mal compreendidos.

[0164] No presente documento relatamos os resultados de estudos que envolvem a administração de uma dose única (12,5 mg/kg) de uma série de derivados de Pip5e-PMO, consecutivamente designados como Pip6-PMOs, contendo as mutações na região do núcleo hidrofóbico do peptídeo Pip5e, onde esta sequência de aminoácidos da região de núcleo central é invertida, embaralhada ou parcialmente suprimida. Estas mudanças afetam os níveis de salto de éxon e restauração da distrofina em vários grupos musculares, incluindo o coração, após uma injeção intravenosa em dose única dos correspondentes conjugados Pip6- PMO. Os resultados mostram que um comprimento do núcleo de 5 aminoácidos (5- aa) parece ser essencial para a produção da distrofina cardíaca, uma vez que a redução no comprimento do núcleo diminui a atividade cardíaca. Inesperadamente, um resíduo de arginina foi (parcialmente) tolerado em uma posição do núcleo hidrofóbico, porém dois resíduos de arginina não foram tolerados, nem uma arginina em uma posição diferente. Surpreendentemente, a produção de distrofina esquelética também foi reduzida nestes dois últimos casos. Os nossos dados indicam que o núcleo hidrofóbico das sequências Pip é importante para a distribuição de PMO ao coração e que as modificações específicas para esta região podem melhorar ainda mais a atividade. Os resultados têm implicações no desenvolvimento terapêutico de PMO para DMD.

Resultados Desenvolvimento da série Pip6 CPP

[0165] Nossa CPP série Pip líder anterior, Pip5e [Yin, H., e outros., Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19 (7): p. 1295-303], contém duas regiões de flanqueando ricas em arginina e um núcleo hidrofóbico central. Para sondar ainda mais os requisitos de composição do núcleo hidrofóbico para a manutenção da boa produção de distrofina cardíaca, sintetizamos uma série de peptídeos derivados de Pip5e (Pip6 af) onde as mutações foram feitas apenas para a região de núcleo hidrofóbico, por exemplo, embaralhada e peptídeos de região de núcleo parcialmente excluídos.

[0166] Todos os peptídeos continham o mesmo número de resíduos de arginina (10) nas sequências de flanqueamento, como em Pip5e, com a exceção de Pip6e. Estes peptídeos foram conjugados a um 25-mer PMO complementar ao éxon 23 da distrofina [Yin, H., e outros., Cell-penetrating peptide-conjugated antisense oligonucleotides restore systemic muscle and cardiac dystrophin expression and function. Hum Genet Mol, 2008. 17 (24): p. 3909-18; Yin, H., e outros, A fusion peptide directs enhanced systemic dystrophin exon skipping and functional restoration in dystrophin-deficient mdx mice. Hum Genet Mol, 2009. 18 (22): p. 440514.], previamente validado para salto de éxon em camundongos mdx. Em contraste com o método de conjugação para a extremidade 5' de PMO que foi utilizado anteriormente [Yin e outros, supra], os conjugados Pip6-PMO foram preparados por conjugação da extremidade 3' de PMO à porção de ácido carboxílico de C-terminal do peptídeo Pip. Nós relatamos que não houve diferença significativa entre a produção in vivo de distrofina ou a atividade de salto de éxon para Pip5e-PMO conjugado à extremidade 3' de PMO ou a extremidade 5' e, portanto, optamos por utilizar a conjugação da extremidade 3' para esses experimentos [ Saleh AF, AAA, Yin H, Betts C, Hammond S, Madeira MJA e Gait MJ, Enhancement of exon skipping and dystrophin production by 3'- peptíde conjugates of morpholino (PMO) oligonucleotides im a mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy in Collection Symposium Series, Chemistry of Nucleic Acid Components, 2011, Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic: Prague, p. 292-296].Síntese de conjugados de Pip de oligonucleotídeos PMO de carga alternativa

[0167] PMO 25-mer M23D (+7-18) (5'-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3' [SEQ ID NO: 310]) (PMODMD) é comumente utilizado como um oligonucleotídeo análogo adequado para salto de éxon em camundongos mdx 27,42,43,44. Em muitos destes exemplos, peptídeo B (sequência RXRRBRRXRRBRXB [SEQ ID NO: 311]) foi conjugado ao PMODMD e mostrou melhorar significativamente o saldo do éxon e produção da distrofina por distribuição por via intramuscular ou intravenosa em camundongos mdx em comparação ao PMODMD nu. O B-peptídeo (que difere de (RXR)4XB apenas pelas duas substituições de X por unidades B) é um peptídeo principal candidato ao desenvolvimento de ensaios clínicos em conjugação com um PMO para o tratamento de DMD43.

[0168] Os peptídeos foram sintetizados por síntese de fase sólida padrão com base em um sintetizador de peptídeos de micro-ondas Liberty (CEM). Os peptídeos foram clivados a partir da resina por tratamento com ácido trifluoroacético (TFA, 94%) na presença de tri-isopropilsilano (1%), 1,2-etanoditiol (2,5%) e água (2,5%), purificados por HPLC de fase reversa e analisados por espectrometria de massa MALDI-TOF em Voyager DE-PRO da Applied Biosystems utilizando uma matriz de ácido e-ciano-4-hidroxicinâmico (10 mg/ml) dissolvido em acetonitrila/TFA aquoso a 3% (1:1, v/v).

[0169] As sequências de aminoácidos dos peptídeos Pip-6a a Pip-6i, Pip-7a a Pip-7c2 e Pip8a a Pip-8c2 são mostradas na figura 18.

[0170] Pip-6a a Pip-6i, Pip-7a a Pip-7C2 e Pip8a a Pip-8c2 e B-peptídeo de controle B foram sintetizados como conjugados de PMODMD. Os peptídeos foram conjugados através de uma reação de acoplamento de amida de um ácido carboxílico de C-terminal com a extremidade 3' de um 25 mer PMO (vide Yin e outros, Molecular Therapy Vol.19, N° 7, 1295-1303, julho de 2011). Resumidamente, a ligação 3'-amida foi realizada como se segue: PMO (100 nmol) em DMSO foi acoplado a um excesso de 2 vezes o peptídeo usando TBTU: HOAt: DIEA (2,5:1,8:1,7 excesso molar em relação ao peptídeo) em NMP a 37°C durante 2 horas. O conjugado foi purificado por HPLC de troca catiônica (Source 15S, GE Healthcare) e dessalinizado em coluna de HLB (Waters).Ensaios de salto de éxon em cultura celular em miotubos H2K diferenciados musculares de mdx

[0171] O salto do éxon em potencial dos conjugados Pip6-PMO foi avaliado em miotubos H2K diferenciados de camundongo mdx na ausência de qualquer agente de transfecção (figura 1), em concentrações que variam de 0,125 μM a 1 μM. Isso mostrou que a atividade de salto do éxon nas células musculares em cultura era muito semelhante para todas essas construções, incluindo Pip5e-PMO. Estes resultados diferem da série anterior Pip5 [Yin e outros, supra], em que as sequências de flanqueamento ricas em arginina continham, em sua maior parte, um determinado número de resíduos de arginina (10), porém onde os espaçamentos variaram, através da colocação alternativa de unidades aminoexanoila (ácido aminohexanóico) e unidades β-alanina. Isto resultou em pequenas variações na atividade de salto dos éxons que se correlacionaram bem com a atividade in vivo. No caso de sequências de Pip6, as sequências de flanqueamento ricas em arginina são idênticas (com a exceção de Pip6e, que é idêntica, exceto para uma arginina que precede imediatamente o núcleo, que é deslocada para a segunda posição do núcleo). Os resultados demonstram que a atividade de salto de éxon celular não depende da sequência ou do comprimento do núcleo hidrofóbico. Observe que já havíamos demonstrado que as principais mudanças nas atividades de salto de éxon in vitro ao invés disso estão relacionadas com o número total de resíduos de arginina [Saleh, A.F., e outros, Synthesis and splice-redirecting activity of branched, arginine-rich peptide dendrimer conjugates of peptide nucleic acid oligonucleotides. Bioconjug Chem, 2010. 21 (10): p. 1902-11].

[0172] Miotubos H2K de mdx são derivados de mioblastos H2K de mdx obtidos a partir do músculo EDL de um camundongo H2K f2 mdx. As células são deficientes de distrofina e condicionalmente imortais devido a expressão de antígeno de tumor grande (stA58) de vírus símio 40 termolábil. Os mioblastos proliferam a 33°C (10% de CO2) em cultura rica e diferenciam-se em miotubos a 37°C em meios com soro de cavalo.

[0173] Miotubos H2K de mdx foram preparados e incubados com peptídeo- PNA e os conjugados de peptídeo-PMO, na ausência de qualquer agente de transfecção pelos métodos descritos anteriormente (Wang, Q, Yin, H, e outros. (2010) In vitro evaluation of novel antisense oligonucleotides is predictive of in vivo exon skipping activity for Duchenne muscular dystrophy), porém com pequenas variações.

[0174] Miotubos foram obtidos a partir de células confluentes H2K mdx semeadas em placas revestidas com gelatina de 24 poços, seguindo 2 dias de privação de soro (DMEM com 5% de soro de cavalo). Os conjugados foram incubados com miotubos durante 4 h em 0,5 mL de OptiMEM e em seguida substituídos por 1 mL de DMEM/5% de meio de soro de cavalo para posterior incubação. Após 20 h os miotubos foram lavados duas vezes com PBS e o RNA total foi extraído com 0,5 mL de Reagente TRI (Sigma, Reino Unido). Preparações de RNA foram tratadas com DNAse livre de RNAse (2U) e Proteinase K (20 mg) antes da análise por RT-PCR. RT-PCR foi realizada em 25 μL com um molde de RNA usando Sistema Superscript III One-Step RTPCR com Platinum Taq DNA polimerase (Invitrogen) preparada pelo iniciador direto 5'CAG GCC AAT TCT AAT TGC TGAG3' [SEQ ID NO: 312 ] e iniciador reverso 5'TTC TTC AGC TTG TGT CAT CC3 ' [SEQ ID NO: 313]. A síntese de DNAc inicial foi realizada a 55°C durante 30 min. seguido por 30 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 55°C durante 1 min. e 68°C durante 80 seg. Produto de RT PCR (1 mL) foi então utilizado como molde para a PCR secundária realizada em 25 μL com 0,5 L de Super TAQ polimerase (HT Biotechnologies) e preparado por iniciador direto 5'CCC AGT CTA CCA CCC TAT CAG AGC3' [SEQ ID NO: 314] e iniciador reverso 5'CCT GCC TTT AAG GCT TCC TT3 '[SEQ ID NO: 315]. As condições dos ciclos foram de 95°C durante 1 min., 57°C durante 1 min. e 72°C durante 80 segundos durante 25 ciclos. Os produtos foram analisados por 2% em gel de agarose e após a digitalização usando Software Gene Tools Analysis (SynGene) a quantidade relativa de salto do éxon 23 foi expressa como uma porcentagem de uma dada concentração de conjugados ponderada em relação às duplicatas de três experimentos.

[0175] Os resultados (figura 1) mostraram que todos os Pip-6a-PMO, Pip-6b- PMO, Pip-6c-PMO, Pip-6d-PMO, Pip-6e-PMO e conjugados Pip-6f-PMO forneceram alta atividade de salto em células musculares de mdx.

[0176] Pip-6g-PMO, Pip-6h-PMO, Pip-6i-PMO, Pip-7a-PMO, Pip-7b-PMO, Pip-7b2-PMO, Pip- 7c2, Pip-8a-PMO, Pip-8b, e conjugados Pip-8c forneceram alta atividade de salto em células musculares de mdx e Pip7c e Pip7d forneceram salto de éxon moderado (figuras 2-5).Ensaios in vivo de conjugados Pip6-PMO no camundongo mdx

[0177] Dada a potência de Pip5e-PMO no tecido do coração, o objetivo de alterar a sequência do núcleo hidrofóbico (mantendo ao mesmo tempo o comprimento de 5-aa), foi o de identificar peptídeos que podem ser mais eficazes em doses mais baixas. Estas modificações incluíram inversão da região hidrofóbica (Pip6a), substituição de tirosina por isoleucina (Pip6b), substituição de glutamina na sequência de Pip6a por deslocamento da arginina imediatamente flanqueando o núcleo na primeira região de flanqueamento rica em arginina (Pip6e), e uma sequência de núcleo hidrofóbico embaralhada (Pip6f). Todos os conjugados de peptídeo PMO-Pip6 foram administrados aos camundongos mdx como injeção intravenosa única de 12,5 mg/kg na veia da cauda e os tecidos foram colhidos duas semanas mais tarde e avaliados quanto à atividade em ambos os níveis de RNA e proteína.

[0178] Coloração imuno-histoquímica da expressão de distrofina para todos Pip6-PMOs de núcleo 5-aa revelou altos níveis de produção de distrofina nos músculos esqueletais, incluindo o TA, diafragma e coração. Quantificação da coloração imuno-histoquímica (figuras 34a, b), foi executada como previamente descrito [Malerba, A., e outros. Chronic systemic therapy with low-dose morpholino oligomers ameliorates the pathology and normalizes locomotor behavior in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(2): p. 345-54; Arechavala-Gomeza, V., e outros, Immunohistological intensity measurements as a tool to assess sarcolemma- associated protein expression. Neuropathol Appl Neurobiol, 2010. 36(4): p. 265-74] foi atingido por tomar 4 quadros representativos da coloração de distrofina e correlacionar isso com coloração de laminina para cada seção (n = 3) do quadríceps, diafragma e coração para cada tratamento peptídeo-PMO. Camundongos mdx não tratados e tratados foram normalizados para camundongos C57BL10. Este método permite a comparação da intensidade da coloração da distrofina no sarcolema relativo à laminina, para cada grupo de tratamento. As razões de intensidade são normalizadas para amostras C57BL10 e cada região de interesse no sarcolema (120 regiões para cada grupo de tratamento) são reunidas em um gráfico de dispersão. Os valores de intensidade relativa obtidos para os todos os quatro conjugados Pip6- PMO de núcleo 5-aa foram significativamente diferentes daqueles dos camundongos mdx não tratados para os quadríceps e diafragma (figura 34b e figura 31). Havia níveis de restauração de distrofina muito semelhantes nos quadríceps (classificação de recuperação percentual entre 21,10-33,44%; figura 34b) e no diafragma para todos os tratamentos, com exceção de Pip6b que teve uma classificação de recuperação maior no diafragma (% de RS varia entre 38,87-48,43%, Pip6b 56,72%; figura 34b). Todos os camundongos tratados com Pip6-PMO núcleo 5-aa exibiram valores de intensidade alta de distrofina no coração com a exceção de Pip6e (outros Pip6-PMOs foram estatisticamente significativos em relação ao mdx = p <0,0001; figura 31). Os conjugados Pip6a e Pip6b-PMO exibiram as classificações mais altas de recuperação, como observado na figura 34b, (% RS 37,66% e 34,22%, respectivamente) seguido de perto por Pip6f-PMO (% RS 26,24%) e, em seguida, Pip5e-PMO (% RS 17,32%). Quando comparado diretamente com o tratamento Pip5e-PMO, só Pip6a-PMO foi significativamente melhor no coração (figura 32). Esses Pip6-PMOs de núcleo 5-aa também mostraram restauração de outras proteínas complexas de distrofina, ou seja, nNOS, α-sarcoglicano e β-sarcoglicano conforme ilustrado pela coloração imuno-histoquímica no músculo TA.

[0179] As análises de PCR e western blot exibiram resultados semelhantes para a imunocoloração. As imagens representativas RTPCR (figura 34d) ilustram alta eficiência de salto de éxon em todos os tecidos analisados. Isto é melhor demonstrado pelos resultados do PCR em Tempo Real (qRT-PCR) para o quadríceps, diafragma e coração (figura 34c). A transcrição do delta 23 é normalizada contra "distrofina total" para cada grupo muscular (n = 3). Quantificação dos dados revelou níveis semelhantes de pulo de Δ23 no quadríceps de todos os camundongos tratados com 5-aa Pip6-PMO. As tendências dos dados sugerem que Pip6f e Pip5e-PMO mostram o mais alto salto de éxon no diafragma, e Pip6f-PMO o maior no coração (para valores médios de emenda vide figura 38a). Western blots (figura 34e) foram realizados em tecidos de cada camundongo e foram quantificados contra um controle de C57BL10 a 50% e 10%. Estes resultados foram calculados e são apresentados na figura 38b. Os conjugados de Pip6a-, Pip6b-, Pip6e e Pip6f- PMO exibiram a maior restauração da proteína distrofina nos músculos TA e quadríceps. Os níveis de restauração da distrofina na membrana foram uniformes em todos estes tratamentos, enquanto que no caso do coração, os conjugados Pip6b- e Pip6f-PMO apresentaram a maior recuperação da distrofina.

[0180] A restauração da proteína medida pela coloração imuno-histoquímica é consistentemente maior que a restauração de proteínas calculada por western blot. Estas diferenças podem ser atribuídas às "proteínas domésticas" diferentes utilizadas, ou seja, restauração da distrofina quantificada por coloração imuno- histoquímica é normalizada contra laminina, enquanto que a análise Western blot utiliza alfa-actinina para normalização. Quantificação de western blots só recentemente foi relatada para distrofina e, atualmente, usa métodos de quimiluminescência. Por conseguinte, pode ser criteriosa para dar maior peso às tendências em níveis da proteína distrofina reveladas por western blot em vez de valores absolutos. Portanto, considerando os resultados globais, camundongos mdx tratados com cada um dos quatro Pip6-PMOs de núcleo 5-aa (Pip6a-, Pip6b-, Pip6e e Pip6f-PMO) parecem demonstrar uma melhor produção de distrofina e salto de éxon no TA, quadríceps e músculos do coração em comparação com o principal candidato anterior, Pip5e-PMO.

[0181] Além disso, esses Pip6-PMOs de núcleo 5-aa não apresentam evidência de toxicidade, avaliada pelos níveis plasmáticos de biomarcadores de toxicidade, alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST) e creatina cinase (vide figura 40a). Níveis de uréia e creatinina foram semelhantes aos níveis de mdx não tratados (vide figura 40b). Todos os grupos de tratamento Pip6- PMO exibem níveis de biomarcadores semelhantes aos controles C57BL10 não tratados.

[0182] Como descrito acima, Pip5e-PMO foi comparado com os conjugados Pip6-PMO para salto de éxons e produção de distrofina em camundongos mdx adultos (4,5 meses de idade) tratados com uma única injeção intravenosa de 12,5 mg e tecidos largos do corpo foram recolhidos duas semanas mais tarde.

[0183] A coloração imuno-histoquímica (dados não mostrados) foi utilizada para visualizar a produção da proteína de distrofina (e a sua relocalização correta no sarcolema) e RT-PCR foi utilizada para detectar os produtos de salto de éxon em grupos musculares de mdx tratados. qPCR permite a quantificação do produto emendado e Western blots foram usados para quantificar a proteína distrofina produzida nos músculos dos camundongos mdx tratados, em comparação com os controles C57BL10 e mdx não tratados.

[0184] Os resultados (figuras 6-17) mostraram que Pip-6a (contendo uma sequência de núcleo invertido (Domínio 2) Pip-5e), Pip-6b (Y mudou para I na sequência de núcleo), Pip-6e (R mudou-se para a sequência de núcleo) e Pip-6f (contendo uma sequência de núcleo embaralhada) todos mantiveram o salto de éxon e a produção de distrofina no músculo cardíaco semelhante ao Pip-5e, enquanto peptídeos contendo uma atividade de sequência de núcleo truncado (Pip- 6c e Pip-6d) perderam a atividade no músculo cardíaco. Atividade em todos os outros tipos musculares era muito semelhante para todas as seis construções de Pip-6 (a, b, c, d, e, f) construções PMO.

[0185] Estes resultados indicam que, para a distribuição eficiente de PMODMD ao músculo cardíaco, a sequência peptídica não é importante, o que sugere que não existe um sinal de entrada de célula específico (por exemplo, núcleo embaralhado: Pip-6f exibe boa liberação de PMODMD ao músculo do coração). Assim, enquanto que a retenção de uma sequência de núcleos hidrofóbicos de 5 aminoácidos é importante, a ordem N para C (sequência primária) daquela sequência do núcleo hidrofóbico não é importante como foi demonstrado por inversão e embaralhamento da sequência de núcleo, sem perda de atividade no músculo cardíaco em comparação com Pip-5e. No entanto, para a liberação de outros tipos de músculo, por exemplo, músculo esquelético, músculo liso, o requisito de ter uma sequência de núcleo hidrofóbico de 5 aminoácidos é menos importante, como demonstrado por uma boa atividade no músculo não cardíaco de Pip-6c e Pip- 6d.Ensaio de viabilidade celularCélulas Huh-7 foram cultivadas a 37°C sob 5% de CO2/95% de ar em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e antibióticos penicilina/estreptomicina. As células foram tratadas com tripsina e colocadas em placas a 10,5 x104 células por poço em placas de 96 poços. Após incubação durante a noite células foram lavadas com PBS e conjugados de PMO-Peptídeo em 50 μL de OptiMEM foram adicionados aos poços em triplicata. Após 4 horas de incubação, os conjugados foram removidos por substituição do meio com 100 μL DMEM/10% FBS durante um adicional de 20 horas de incubação. 20 μL de solução MTS - Cell Viability Assay (Promega) foram adicionados aos poços contendo 100 μL de DMEM e as placas foram incubadas durante 1-2 horas antes das medições de UV a 490 nm serem realizadas. A porcentagem de viabilidade celular foi determinada através da normalização da absorvância média de amostras em triplicata para a média das amostras não tratadas.

[0186] Os resultados apresentados (figuras 19-22) são a média de dois experimentos independentes e são consistentes com a viabilidade da célula aumentada (isto é, menor toxicidade celular) de peptídeos que contêm poucos resíduos de arginina. Por exemplo, peptídeos possuindo um total de 7 resíduos de arginina nos Domínios 1-3 combinados exibiu maior viabilidade das células (toxicidade celular baixa) que os peptídeos possuindo 8 ou 9 resíduos de arginina. Estabilidade sérica de conjugados Pip-PMO

[0187] A estabilidade sérica foi medida através da adição de uma alíquota de Pip-PMO (10 nmol) de 100% de soro de camundongo (100 μL) e incubando a 37°C durante 120 ou 240 min. Cada reação foi diluída com uma solução IM de guanidina- HCl (300 μL) e acetonitrila gelada (600 μL). As amostras foram misturadas e mantidas à temperatura de -20°C, e as proteínas séricas precipitadas e separadas por centrifugação (13.000 rpm, 5 min.). Após centrifugação, o sobrenadante foi recolhido, liofilizado e o resíduo dissolvido em água para a análise de degradação de peptídeos por espectrometria de massa MALDI-TOF e por HPLC de fase reversa. Condições de HPLC foram: coluna C18 de fase inversa (250 x 4,6 mm); Solvente A, 0,1% TFA, Solvente B, 90% acetonitrila, 10% de solvente A; gradiente, 10% -50% de solvente B em 25 minutos. Os resultados mostraram que para Pip5e-PMO, Pip6a- PMO, Pip6e-PMO e Pip6f-PMO em 120 minutos, o principal componente restante pode ser identificado como o conjugado inalterado Pip-PMO e que os níveis de PMO conjugados com fragmentos de peptídeo foram muito semelhantes ao (RXRRBR) 2XB-PMO.Supressões parciais do núcleo hidrofóbico de conjugados Pip6-PMO eliminam a produção de distrofina no coração

[0188] Além da necessidade de identificar Pip-PMOs com alta eficiência e distribuição ao coração, era outro objetivo definir melhor os elementos do núcleo hidrofóbico de peptídeos Pip, que são importantes para a distribuição ao coração. Para este fim, os peptídeos Pip contendo deleções parciais do núcleo hidrofóbico de um aminoácido (remoção de tirosina; Pip6c) e de dois aminoácidos (remoção de isoleucina e tirosina; Pip6d) foram sintetizados como conjugados PMO.

[0189]Seguindo-se o tratamento dos camundongos mdx, coloração imuno- histoquímica foi realizada e esta revelou alguma expressão de distrofina nos músculos esqueletais, como o TA e diafragma para ambos Pip6-PMOs de eliminação. A quantificação da coloração imuno-histoquímica revelou a menor restauração da distrofina nos quadríceps no tratamento com Pip6d, seguido de perto por Pip6c-PMO quando comparado com os outros Pip6-OGP (figura 35a, b e figura 31). Da mesma forma, Pip6d-PMO exibiu a menor restauração da distrofina no diafragma. As classificações de recuperação para Pip6c e conjugados de Pip6d- PMO no coração eram muito baixas, indicando a sua baixa eficiência (Pip6c %RS - 1,06% e 2,50% Pip6d; Figura 35b).

[0190] Estes resultados são confirmados por PCR e análises Western blot. Os resultados das imagens de RT-PCR representativas (figura 35d) e o salto do éxon qRT-PCR (figura 35c), ambos indicam salto de éxon reduzido em camundongos mdx tratados com Pip6c e conjugados Pip6d-PMO nos quadríceps e diafragma e salto de éxon insignificante no coração. Análise Western blot revelou a produção da proteína distrofina ineficiente nos músculos TA e quadríceps e restauração da distrofina insignificante no coração (figura 35e e figura 38b).

[0191] Estes resultados mostram que o comprimento do núcleo hidrofóbico é importante não apenas para uma boa produção de distrofina no coração, mas também para a atividade de alguns outros grupos musculares. Por conseguinte, o teor de arginina de CPP sozinha não é o único indicador de produção da distrofina eficiência do salto de éxon para esta classe de peptídeos.Alteração da posição de arginina no núcleo hidrofóbico ou adição de uma segunda arginina é prejudicial para a produção da distrofina

[0192]O reposicionamento de uma arginina a partir de uma região de flanqueamento para o interior do núcleo foi inesperadamente tolerada (Pip6e-PMO). Dois outros conjugados Pip6-PMO foram, portanto, sintetizados como derivados de Pip6e-PMO. Pip6g-PMO continha um segundo resíduo de arginina, a qual foi transferido a partir da segunda região de flanqueamento para o núcleo hidrofóbico central, e Pip6h-PMO contém uma inversão da região hidrofóbica do Pip6e, de tal modo que a localização da arginina única é alterada no interior do núcleo.

[0193]Surpreendentemente, essas alterações no núcleo hidrofóbico resultaram em reduções adicionais na expressão da distrofina, não só no coração, mas também em todos os outros tecidos, como observado na coloração imuno- histoquímica e nas quantificações da mesma (figura 36a, b). As imagens representativas de coloração imuno-histoquímica revelaram muito poucas fibras positivas de distrofina em todos os tecidos com exceção do TA e quadríceps. Com referência às quantificações, Pip6g-PMO não foi significativamente diferente para mdx não tratados no quadríceps ou diafragma (figura 39a). Ambos os derivados de Pip6e-PMO não eram significativamente diferentes para mdx tratados nos músculos do coração, o que ilustra a ineficiência geral destes dois peptídeos. Do mesmo modo, estes derivados de PMO-Pip6e mostraram eficiência reduzida no salto do éxon, como ilustrado nas imagens representativas de RT-PCR (figura 39d) e nas análises qRT-PCR, (figura 36c e figura 39c) em todos os tecidos. Western blot revelou pouca restauração da proteína distrofina (figura 36e e figura. 39d) em todos os tecidos, com exceção do músculo TA. Estes dados mostram que um aumento no número de argininas ou alteração na localização da única arginina na região hidrofóbica de Pip6e é prejudicial tanto para o coração, quanto para a produção de distrofina no músculo esquelético.

Materiais e MétodosSíntese dos conjugados de peptídeo-PMO

[0194] Os peptídeos foram sintetizados por química de Fmoc padrão e purificados por HPLC. A sequência de PMO (5'- GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3' [SEQ ID NO: 310]) foi adquirida na Gene Tools LLC. Os peptídeos foram conjugados com PMO através de uma ligação amida na extremidade 3' de PMO, seguido por purificação através de HPLC e analisados por MALDI-TOF MS, como descrito anteriormente na comunicação preliminar [Saleh AF, AAA, Yin H, Betts C, Hammond S, Wood MJA and Gait MJ, Enhancement of exon skipping and dystrophin production by 3'-peptide conjugates of morpholino (PMO) oligonucleotides in a mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy in Collection Symposium Series, Chemistry of Nucleic Acid Components. 2011, Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic: Prague, p. 292-296]. Os conjugados peptídeo-PMO foram dissolvidos em água esterilizada e filtrados através de uma membrana de acetato de celulose de 0,22 μm antes da utilização.

[0195] Os conjugados de PMO de Pip6a, Pip6b, Pip6e e Pip6f foram considerados predominantemente estáveis e de estabilidade similar ao Pip5e-PMO no soro a 100% durante 2 horas a 37°C, como pode ser visto por meio de HPLC e análise espectral de massa MALDI-TOF. Todos os conjugados apresentaram padrão de degradação semelhante, e conjugados intactos ainda foram observados até 4 horas (dados não mostrados).Ensaios in vitro: salto do éxon em miotubos de camundongo mdx

[0196] Miotubos H2K de mdx foram preparados e incubados com os conjugados de peptídeo-PMO, na ausência de qualquer agente de transfecção em concentrações de 0,125, 0,25, 0,5 e 10,0 μM pelo método descrito anteriormente [Yin, H., e outros, Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide- mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(7): p. 1295-303]. Os produtos de RT-PCR aninhada a partir de RNA total isolado foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 2%. Quantificação dos níveis de transcrição Δ23 foi calculada utilizando densitometria. O teste de viabilidade celular MTS (Promega) mostrou 100% de sobrevivência nas concentrações mais elevadas de conjugados peptídeo-PMO utilizados no estudo (dados não mostrados).Animais e injeções intravenosas

[0197]Camundongos mdx de quatro e meio meses de idade a 5 e meio meses de idade foram utilizados nesses experimentos (n = 3). Os experimentos foram realizados na Biomedical Sciences Unit, University of Oxford de acordo com os procedimentos autorizados pelo UK Home Office. Conjugados de Pip6-PMO foram preparados em solução salina 0,9% a uma dose final de 12,5 mg/kg. O volume total de 160 μL foi administrado através da veia da cauda de camundongos anestesiados. Duas semanas mais tarde os camundongos foram sacrificados por inalação de CO2 e os músculos e outros tecidos colhidos e congelados em isopentano resfriado antes da armazenagem a -80°C.Imuno-histoquímica e quantificação da expressão de distrofina

[0198] Seções transversais das amostras de tecidos foram cortadas (8 μm de espessura) para o exame da expressão de distrofina. Para a visualização e quantificação da distrofina, as seções foram cocoradas com antidistrofina de coelho (Abeam) e antilaminina de camundongo (Sigma), e detectadas por anticorpos secundários IgG Alexa 594 cabra-anticoelho e IgG 488 cabra-anticamundongo respectivamente (Invitrogen). As imagens foram capturadas usando um microscópio Leica DM IRB e software Axiovision (Carl Zeiss). Imuno-histoquímica quantitativa foi realizada como previamente descrito [Malerba, A., e outros, Chronic systemic therapy with low-dose morpholino oligomers ameliorates the pathology and normalizes locomotor behavior in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(2): p. 345-54; Arechavala-Gomeza, V., e outros, Immunohistological intensity measurements as a tool to assess sarcolemma-associated protein expression. Neuropathol. AppI. Neurobiol, 2010. 36(4):p. 265-74.]. A imagem representativa para cada tratamento foi realizada. Para a quantificação, 4 estruturas representativas da distrofina e correlacionando laminina foram tomadas para cada seção (n = 3) do quadríceps, diafragma e coração para cada tratamento. Usando o software ImagePro, 10 regiões de interesse foram colocadas aleatoriamente sobre a imagem da laminina, que foi sobreposta à imagem da distrofina correspondente. As intensidades de fluorescência mínima e máxima para 120 regiões foram registradas para cada tratamento. A diferença de intensidade foi calculada para cada região de modo a corrigir a fluorescência de fundo e camundongos mdx tratados e não tratados foram normalizados para C57BL10. Estes valores foram colocados em um gráfico de dispersão. As "intensidades relativas médias" foram calculadas usando um modelo de estatísticas multi-nível. Usando esses valores, a classificação de recuperação percentual foi calculada mediante a aplicação da seguinte equação, conforme descrito no site da TREATNMD (http://www.treatnmd.eu/downloads/file/sops/dmd/mdx/DMD_M.1.1_ 0001.pdf):(recuperação da distrofina de camundongos mdx tratados-recuperação da distrofina de camundongos mdx não tratados) / (recuperação de distrofina de camundongos C57BL10-recuperação da distrofina de camundongos mdx não tratados). A coloração das proteínas associadas à distrofina foi realizada como previamente descrito [Yin, H., e outros, Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011.19(7): p. 1295-303] usando um kit de bloqueio de MOM (Vector Labs) e anticorpos α-sarcoglicano e α-distroglicana (Novocastra) (1:100 de diluição). Coloração nNOS foi realizada utilizando um anticorpo de cabra anti-coelho (Abeam).Salto do éxon em tecidos de camundongo mdx

[0199] O RNA total foi extraído a partir de tecidos de controle e de camundongos tratados usando o reagente TRIzol (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante.

[0200]RT-PCR: Quatrocentos nanogramas de molde de RNA foram utilizados em 50 μL de uma reação de transcrição reversa utilizando um kit de RT- PCR de uma etapa (QIAGEN) e iniciadores específicos do gene (Ex 20-26, Direto: 5'-AAT TCT CAG GCC AAT TGC TGA G-3' [SEQ ID NO: 312], Reverso: 5'-TTC TTC AGC TTG TGT CAT CC-3' [SEQ ID NO: 313]). As condições de ciclo: 50°C durante 30 minutos, seguido por 30 ciclos de 30 segundos a 94°C, 1 minuto a 58°C, e 2 minutos a 72°C. Dois microlitros de DNAc foram amplificados em 50 μL de PCR aninhado (kit QIAGEN de PCR), utilizando as seguintes condições de ciclos: 94°C durante 30 segundos, 58°C durante 1 minuto, e 72°C durante 1 minuto durante 24 ciclos (Ex 20-26: Direto: CCC AGT CTA CCA CCC TAT CAG AGC [SEQ ID NO: 314], Reverso: CCT GCC TTT AAG GCT TCC TT [SEQ ID NO: 315]). Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em um gel de agarose a 2%.

[0201] PCR quantitativa em tempo real: Dois microgramas de RNA foram transcritos de forma inversa utilizando um kit High Capacity cDNA Synthesis (Applied Biosystems). O salto do éxon qPCR foi realizado utilizando kits Syber green (Applied Biosystems), conjuntos de primers (IDT) e o sistema StepOne Plus Real-Time PCR (Applied Biosystems). Os conjuntos de iniciadores utilizados foram os seguintes: transcritos de distrofina no total, ex19-20: Direto: GCCATAGCACGAGAAAAAGC [SEQ ID NO: 812], Reverso: GCATTAACACCCTCATTTGC [SEQ ID NO: 813]; Transcrito Delta23 dmd, Direto: ATT GCG GAC CTA GGA GAG AAT [SEQ ID NO: 814], Reverso: GTT TTT ATG AAT TGA TTC TGT TTC CC [ SEQ ID NO: 815]. Os plasmídeos (distrofina total e delta 23 saltado) foram utilizados para a curva padrão.Extração de proteínas e western blot

[0202]Amostras de controle e musculares tratadas foram homogeneizadas em tampão de lise contendo 75 mM de Tris-HCl (pH 6,5) e 10% de dodecil sulfato de sódio complementado com 5% de 2-mercaptoetanol. As amostras foram aquecidas a 100°C durante 3 minutos antes da centrifugação e remoção do sobrenadante. Os níveis de proteína foram medidos pelo ensaio de Bradford (Sigma) e quantificados utilizando-se padrão de BSA. Dez a 15 μg de proteína da amostra de mdx não tratada e tratada, e 50% e 10% destas concentrações de proteína C57BL10 (controle positivo) foram carregados em géis de 3-8% de Tris-Acetato. As proteínas foram manchadas na membrana de PVDF e sondadas quanto à distrofina usando anticorpos DYS1 (Novocastra) e de controle de carga, oactinina (Sigma). O anticorpo primário foi detectado por ligação de peroxidase de rábano silvestre- conjugado IgG anticamundongo com lumigen. Western blots foram fotografados (Licor Biosciences) e analisados utilizando-se o sistema de imagem Odyssey.

Bioquímica Clínica

[0203] As amostras de plasma foram retiradas da veia jugular dos ratos mdx imediatamente após o sacrifício por inalação de CO2. Análise de biomarcadores de toxicidade foi realizada por um laboratório de patologia clínica, Mary Lyon Centre, MRC, Harwell, Reino Unido.Análise estatística

[0204] Todos os dados reportaram valores médios ± SEM. Um modelo de medidas repetido, multi-nível, foi criado para este estudo. A abordagem estatística multi-nível baseia-se em métodos estatísticos tradicionais e está sendo cada vez mais implementada nas ciências sociais, médicas e biológicas [Butterfield, A., e outros, PyEvolve: a toolkit for statistical modelling of molecular evolution. BMC Bioinformatics, 2004. 5: p. 1; Brooks, G., et al., Referral Source and Outcomes of Physical Therapy Care in Patients With Low Back Pain. J Orthop Sports Phys Ther, 2012; Bernier, J., Y. Feng, and K. Asakawa, Strategies for handling normality assumptions in multilevel modeling: a case study estimating trajectories of Health Utilities Index Mark 3 scores. Health Rep, 2011. 22(4): p. 45-51; Winter, E.M., R.G. Eston, and K.L. Lamb, Statistical analyses in the physiology of exercise and kinanthropometry. J Sports Sci, 2001. 19(10): p. 761-75]. O modelo utilizado para este estudo leva em conta os múltiplos das "unidades de intensidade relativa" (nível 1) para cada camundongo (nível 2) para cada tratamento (nível 3) como foi executado na quantificação de coloração imuno-histoquímica. Neste exemplo, os camundongos não tratados mdx e camundongos tratados com Pip5e-PMO foram aplicados como o parâmetro constante/fixo, para que os outros tratamentos de controle e de tipo selvagem fossem comparados. Isto foi após uma transformação de energia de Box-Cox, que foi realizada para assegurar uma distribuição normal. A análise estatística foi realizada utilizando MLwiN versão 2.25.Síntese de peptídeos e os conjugados de peptídeo-PMO

[0205]A sequência de PMO (5'-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3' [SEQ ID NO: 310]) foi adquirida na Gene Tools LLC. Os peptídeos foram sintetizados por química padrão 9-fluorenimetil-carbonato (Fmoc), empregando um Liberty Peptide Synthesizer (CEM) em escala de 100 μmol, purificados a > 90% de pureza por HPLC de fase reversa padrão, e caracterizados por MALDI-TOF MS. Os conjugados de peptídeo-PMO foram preparados em 200 nmol escala PMO através de uma ligação amida anexando o grupo carboxila no C-terminal do peptídeo à amina secundária na extremidade 3' de PMO (figura 1c). O ácido carboxílico de C- terminal do peptídeo (excesso molar de 2,5 vezes em relação ao PMO) foi ativado utilizando um hexafluorfosfato de 2-(1H-benzotriazol-1il)-1,1,3.3-tetrametilurônio (HBTU) e 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) em 1-metil-2-pirrolidinona (NMP) e diisopropiletilamina (DIEA), utilizando um excesso molar HBTU: HOBt: DIEA (2,3:2,0:2,3) em relação ao peptídeo. A mistura foi adicionada a uma solução de PMO (10 mM) dissolvida em DMSO e incubada a 37°C durante 2 horas. A mistura foi então diluída com um excesso quatro vezes superior de água e purificada em uma coluna de cromatografia de permuta de cátion (coluna Resource S, 6 mL, GE Healthcare) utilizando um tampão de fosfato de sódio (tampão A: 25 mM de Na2HPO4, 25% de acetonitrila, pH 7,0), tampão B: NaCl, 1 M, 25 mM de Na2HPO4, 25% de acetonitrila, pH 7,0), com uma vazão de 4 mL/min. e um gradiente de 0-75% de tampão B em 25 min. para remover PMO não conjugado e o excesso de peptídeo. Os conjugados foram então carregados em uma coluna Oasis HLB (4,6 mm x 20 mm, Waters, Milford, MA), lavados com água para remover sais e eluídos com 60% (v/v) de acetonitrila. O conjugado foi liofilizado e analisado por MALDI-TOF MS e por HPLC (figura 37). Os conjugados de peptídeo-PMO foram dissolvidos em água esterilizada e filtrados através de uma membrana de acetato de celulose de 0,22 μmm antes da utilização. Os rendimentos totais foram de 20-25% com base no PMO.Escalonamento da síntese de peptídeos-PMO

[0206] As conjugações foram melhoradas em uma escala de 1.000 nanomols do PMO de partida, mantendo a mesma proporção de HBTU: HOBt: DIEA como descrito acima. As reações de conjugação foram realizadas utilizando um forno de micro-ondas (CEM Discover) e a temperatura de reação foi aumentada para 65°C, conduzindo a uma diminuição do tempo de reação de 15 min. As etapas de purificação fundamentais também foram melhoradas neste processo. A mistura de reação em bruto foi purificada por HPLC utilizando uma coluna de permuta iônica maior (Source 15S, GE Healthcare, HR16/10, 18 mL de volume de leito) para remover o excesso de peptídeo e PMO não conjugado, eluindo com uma solução de cloreto de sódio (NaCl , 10,0 M) em tampão fosfato de sódio (pH 7,0) para se obter o sal de cloreto de peptídeo-PMO. A etapa de dessalinização foi usada para remover o excesso de NaCl em uma coluna de dessalinização Oasis HLB feito por encomenda (Waters, 19 x 30 mm). Depois de lavar a coluna durante 10 min. com água classificação Millipore (em vez de água classificação HPLC), o PPMO foi eluído com 60% (v/v) de acetonitrila em água. 500 nanomols foram utilizados em uma única injeção e os rendimentos foram mais elevados do que com injeções múltiplas (por exemplo, 2 x 250 nmol). Isto resultou em um aumento no rendimento da reação de conjugação de one pot de aproximadamente 40%.

Discussão

[0207] A terapia mais promissora até o momento para o transtorno neuromuscular altamente debilitante DMD é o tratamento com AOs, que restaura o quadro de leitura do pré-RNAm da distrofina por salto do éxon. Dois AOs, um PMO [Cirak, S., e outros, Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an openlabel, phase 2, dose- escalation study. Lancet, 2011. 378(9791): p. 595-605; Miller, F., C.F. Moseley, and J. Koreska, Spinal fusion in Duchenne muscular dystrophy. Dev Med Child Neurol, 1992. 34(9): p. 775-86] e a 2'OMe oligonucleotídeo [van Deutekom, J.C., e outros, Local dystrophin restoration with antisense oligonucleotide PRO051. N Engl J Med, 2007. 357(26): p. 2677-86; Goemans, N.M., e outros, Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med, 2011. 364(16): p. 1513-22], estão atualmente em ensaios clínicos e os primeiros resultados promissores aumentaram a esperança para pacientes com DMD. No entanto, estudos envolvendo a administração de doses muito elevadas de PMO nu em camundongos mdx mostraram recuperação parcial da distrofina nos músculos esqueletais de todo o corpo e correção insignificante no coração [Malerba, A., e outros, Chronic systemic therapy with low- dose morpholino oligomers ameliorates the patology and normalizes locomotor behavior in mdx mice. Mol Ther, 2011.19(2): p. 345-54; Malerba, A., e outros, Dosing regimen has a significant impact on the efficiency of morpholino oligomer-induced exon skipping in mdx mice. Hum Gene Ther, 2009. 20(9): p. 955-65.]. A necessidade de corrigir a distrofina no coração é cada vez mais evidente a partir de estudos em que a correção do fenótipo esquelético resultou em um aumento da carga de trabalho cardíaco e, portanto, a progressão da cardiomiopatia [Malerba, A., L. Boldrin, e G. Dickson, Long-term systemic administration of unconjugated morpholino oligomers for therapeutic expression of dystrophin by exon skipping in skeletal muscle: implications for cardiac muscle integrity. Nucleic Acid Ther, 2011. 21(4): p. 293-8; Townsend, D. e outros, Emergent dilated cardiomyopathy caused by targeted repair of dystrophic skeletal muscle. Mol Ther, 2008. 16(5): p. 832-5.]. A descoberta de que PMOs conjugados-CPP podem conseguir correção muito mais eficaz da distrofina em camundongos mdx que os PMOs nus, trouxe uma promessa renovada de uma maior eficácia AO por melhora da liberação celular e in vivo.

[0208] Nós relatamos anteriormente um peptídeo PMO candidato promissor, o Pip5e-PMO, capaz de restabelecer a proteína distrofina a níveis elevados em todos os tipos de músculos, incluindo o coração, após uma administração única de 25 mg/kg [Yin, H., e outros, Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19(7): p. 1295-303]. Além das sequências ricas em arginina, peptídeos Pip contêm uma seção 5-aa hidrofóbica não presente no B- peptídeo principal anterior [Perez, F., e outros, Antennapedia homeobox as a signal for the cellular internalization and nuclear addressing of a small exogenous peptide. J Cell Sci, 1992. 102 (Pt 4): p. 717-22], o que pareceu ser provavelmente responsável pela atividade aperfeiçoada do coração. A série Pip6 foi desenvolvida como derivados de Pip5e-PMO em uma tentativa de lançar luz sobre os aspectos do núcleo hidrofóbico necessário para a produção de distrofina no coração e também para identificar conjugados Pip-PMO ainda mais ativos. Nosso estudo usando um regime de administração de uma dose única moderada produziu alguns resultados surpreendentes.

[0209] A principal conclusão é que a manutenção do comprimento de cinco aminoácidos da região central hidrofóbica é imprescindível para uma boa produção de distrofina no coração. Poderíamos imaginar que a eficiência diminuída de restauração da distrofina no coração para Pip6c-PMO e Pip6d-PMO, com deleções de aminoácidos sequenciais no núcleo, pudesse estar relacionada à menor hidrofobicidade resultante e, portanto, uma capacidade reduzida para entrar na célula [Gupta, A., e outros, Hydrophobicity drives the cellular uptake of short cationic peptide ligands. Eur Biophys J, 2011. 40(6): p. 727-36]. No entanto, os resultados in vitro sugerem que todas essas construções são capazes de entrar nas células como eles são totalmente capazes de saltar o éxon em células musculares. Assim, o comprimento do núcleo hidrofóbico 5-aa deve afetar um parâmetro essencial diferente para a distribuição in vivo do coração. Absorção reforçada nas porções do coração inteiro marcadas por fluorescência Pip5e-PMO, em comparação com B- PMO, ao invés disso, sugeriu que o cruzamento de outra barreira (por exemplo, o revestimento endotelial para o coração) é melhorado [Yin, H., e outros I., Cellpenetrating peptide-conjugated antisense oligonucleotides restore systemic muscle and cardiac dystrophin expression and function. Hum Mol Genet, 2008. 17(24): p. 3909-18]. Estudos cardíacos adicionais continuam com um Pip6-PMO que pode ajudar a resolver este problema. Mais surpreendente, talvez, é que para Pip6c-PMO e Pip6d-PMO também houve alguma perda de produção de distrofina em outros tipos musculares. Isto sugere que o equilíbrio hidrofóbico/catiônico e/ou os espaçamentos precisos de resíduos hidrofóbicos e catiônicos em CPP impõem efeitos mais sutis nos parâmetros de distribuição in vivo. Outra conclusão clara resultante dos análogos de Pip6 PMO é que uma ordem específica de resíduos hidrofóbicos no interior do núcleo hidrofóbico é menos importante para a manutenção da produção da distrofina cardíaca, uma vez que uma sequência invertida (Pip6a), uma única substituição de um resíduo igualmente hidrofóbico (Pip6b), e uma sequência codificada (Pip6f) foram pelo menos tão ativas como Pip5e-PMO, e mais eficientes no coração e em alguns grupos musculares (figura 38).

[0210] Estes resultados fornecem evidências de que o núcleo hidrofóbico de peptídeos Pip provavelmente não contém uma sequência de aminoácidos particular que reconhece um receptor específico na membrana de uma barreira, o qual precisa penetrar o tecido do coração, mas em vez disso, o núcleo funciona como um espaçador hidrofóbico de algum tipo.

[0211] O mais surpreendente, porém, é que Pip6e-PMO induziu algumas emendas da distrofina e restauração de proteínas no músculo cardíaco, como indicado pelos resultados do western e qRT-PCR (observação: não significativamente diferentes na quantificação da coloração imuno-histoquímica). No peptídeo Pip-6e, um resíduo de arginina é movido para o núcleo hidrofóbico, o que também resulta em alinhamento de um resíduo hidrofóbico X adjacente ao núcleo (X-YRFLI [SEQ ID NO: 816]). Poderíamos esperar que a produção de distrofina no coração tivesse sido completamente perdida neste conjugado, uma vez que o aminoácido catiônico (arginina) agora está incluído no núcleo. Por outro lado, tal atividade cardíaca foi perdida no Pip6h-PMO (X-ILFRY núcleo [SEQ ID NO: 817]) e no duplo conjugado de núcleo de arginina Pip6g-PMO (XYRFRLI-X núcleo [SEQ ID NO: 818]). Inesperadamente, a produção de distrofina também se perdeu no quadríceps e diafragma para ambos Pip6g e Pip6h-PMO. As inconsistências não previstas dentro dos resultados da atividade de Pip6e, Pip6g e Pip6h, e as perdas de atividade para Pip6c e Pip6d-PMO, são talvez melhor explicadas pela constatação de que os espaçamentos precisos do resíduo arginina dentro dos peptídeos Pip com respeito a ambos os espaçadores de aminoácidos hidrofóbicos exteriores (X e B) e os resíduos de núcleo hidrofóbicos internos podem alterar drasticamente as propriedades farmacológicas de cada conjugado. Isto pode ocorrer não apenas por meio da alteração no equilíbrio catiônico/hidrofóbico, porém, alternativamente, devido a alterações da estrutura secundária ou terciária dos Pip-PMOs, o que poderia, por sua vez afetar a ligação da proteína sérica ou outro parâmetro que altere a meia-vida em circulação, ou o que poderia afetar a capacidade de atravessar barreiras necessárias para penetrar nos tecidos musculares.

[0212] Vários conjugados (Pip6a, Pip6b e Pip6f-PMOs) têm demonstrado atividades promissoras de produção de distrofina, mesmo além daquelas do candidato anterior, Pip5e-PMO. Curiosamente, a análise das amostras séricas de um dos tratamentos Pip6 PMO-5-aa, Pip6e-PMO, mostrou a normalização parcial de 3 miRNAs (miR-1, miR-133 e miR-206) a níveis próximos do tipo selvagem, após uma única administração de 12,5 mg. [Thomas C. Roberts, K.E.M.B., Graham McClorey, Samir EL Andaloussi, Caroline Godfrey, Corinne Betts, Thibault Coursindel, Michael J. Gait, and C.I.E.S.a.M.J.A. Wood, Expression analysis in multiple muscle groups and serum reveals complexity in the microRNA transcriptome of the mdx mouse with implications for therapy. Nucleic Acid Ther, 2012]). Isto é muito promissor para os Pip6-PMOs, como eles não seriam considerados ainda o peptídeo ótimo ainda que demonstrassem o efeito terapêutico significativo deste grupo de peptídeos. Esses novos líderes fornecem uma boa base para a identificação de um Pip-PMO candidato que é adequado para estudos fisiológicos detalhados da função muscular e cardíaca, bem como perfis de toxicidade completa, incluindo estudos de aumento da dose, na expectativa de que um tal Pip-PMO proceda os experimentos clínicos.Exemplo 2 - Síntese de conjugados de peptídeo-PMO

[0213]A sequência de PMO (5'-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3') [SEQ ID NO: 310] foi adquirida na Gene Tools, LLC. Os peptídeos foram sintetizados domesticamente por química padrão 9-fluorenimetil-carbonato (Fmoc), purificados a > 90% de pureza e caracterizados por MALDI-TOF MS. Os conjugados de peptídeo-PMO foram preparados através de uma ligação amida por anexação do grupo carboxila no C-terminal do peptídeo à amina secundária na extremidade 3' de PMO (figura 33). No entanto, fizemos várias modificações para conjugação e purificação final do peptídeo-PMO, incluindo a) reação de conjugação em grande escala (até 15 μmol de PMO), b) o uso de uma coluna de troca iônica em maior escala para purificação de peptídeo-PMO de componentes individuais (Tabela 1) e c) a utilização do dispositivo Amicon Ultra-15 filtro centrífugo para dessalgar, em vez da coluna de HPLC de fase reversa usada anteriormente. Como um resultado, o rendimento foi mais do dobro e foi rotineiramente de 40-55% com base na sequência de PMO.Tabela 1. Colunas de permuta de íon de Resource S e parâmetros de purificação

[0214] O ácido carboxílico de C-terminal do peptídeo (excesso molar de 2,5 vezes em relação ao PMO) foi ativado utilizando hexafluorfosfato de 2-(1H- benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio (HBTU) e 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt) em 1-metil-2-pirrolidinona (NMP) e diisopropiletilamina (DIEA), utilizando um HBTU: HOBt: DIEA (2.3:2.0:2.3) excesso molar em relação ao peptídeo (Tabela 2). A concentração do peptídeo foi de 100 mM. Após a mistura, a mesma foi adicionada a uma solução em DMSO de PMO (10 mM) em razão molar de 2.5:1 e incubada a 37°C durante 2 horas. A mistura foi, em seguida, purificada por meio de uma grande coluna de cromatografia de troca catiônica (coluna Resource S de 200 mL, GE Healthcare) utilizando tampões de fosfato de sódio (tampão A: 25 mM de Na2HPO4, 25% de acetonitrila, pH 7,0), tampão B: 1 M NaCl 25 mM Na2HPO4, 25% de acetonitrila, pH 7,0), uma vazão de 14 mL/min. e um gradiente de 0-100% de tampão B em 60 min., para remover o PMO não conjugado e peptídeo em excesso.Tabela 2.Quantidades e volumes de reagentes para conjugação de Pip9b-PMO (escala de 10 μmol de PMO)

[0215] Os conjugados foram então dessalinizados usando dispositivo de filtro centrífugo 3 kDa MWCO Amicon Ultra-15 (Millipore) por concentração da amostra (1 hora de rotação a 25°C, em 3.220 rcf), em seguida, diluindo o concentrado para 12 mL com H2O. O processo foi repetido duas vezes. O conjugado foi liofilizado e analisado por MALDI-TOF MS e HPLC. Os conjugados peptídeo-PMO foram dissolvidos em água estéril (isenta de endotoxinas) e filtrados através de membrana de acetato de celulose 0,22, antes da utilização. A concentração foi medida por UV em 265 nm em 0,1 N HCI usando o coeficiente de extinção do PMO, conforme previsto na ficha de dados da Gene Tools.Exemplo 3 - Peptídeos Pip7-9Avaliação da toxicidade de Pip7-9-PMO in vitro

[0216] Os estudos de toxicidade de Pip7-9-PMO foram realizados utilizando os ensaios de viabilidade celular. Esses mostraram que 10 conjugados de arginina- PMO (Pip6e) apresentaram um nível elevado de toxicidade celular (figura 42). Portanto, quando se emprega Pip6a (série Pip8), Pip6e (série Pip7) e Pip6f (série Pip9) como peptídeos de origem, séries as séries Pip7-9-PMO foram sintetizadas por redução do número de resíduos de arginina e aminohexanoil (ácido aminohexanóico), a fim de minimizar a possível toxicidade celular. A viabilidade celular foi substancialmente aumentada nos miotubos de mdx tratados com Pip7-9- PMO em comparação às células tratadas com Pip6e (figura 42), sugerindo promessa de estudos in vivo subsequentes.Injeção intravenosa única de Pip7-9-PMO resulta na expressão generalizada de distrofina nos músculos esqueletais/periféricos de mdx

[0217] De modo a avaliar a eficiência do salto de éxon dos compostos Pip7- 9-PMO, camundongos mdx de 8 semanas de idade receberam injeção de 12,5 mg de Pip7-9-PMO. Duas semanas após a injeção, a expressão de distrofina foi analisada nos músculos tibial anterior (TA), diafragma, quadríceps e cardíacos. Foram avaliadas as fibras positivas de distrofina imunocoradas, RNAm salto de éxon e os níveis da proteína distrofina (figuras 2-4). A intensidade das fibras de distrofina imunocoradas foi analisada utilizando um anticorpo de rato antilaminina para a normalização e isso foi expresso como uma razão do nível de intensidade de músculos C57BL/10 (figura 5). A notável expressão das miofibras positivas para distrofina de salto de éxon foi observada em todos músculos esqueletais injetados com Pip7-9-PMO, tais como, TA, quadríceps e músculos do diafragma em 2 semanas após a injeção (figuras 43-46). No entanto, apenas Pip8b, Pip8c, Pip9b, Pip9b2 e Pip9c renderam expressão significativa de distrofina no coração (figura 46). Pip7a, Pip7b, Pip7b2, Pip8c2, Pip9d e Pip9d2 resultaram na produção de distrofina insignificante no coração (figura 46). Tendo em conta as estruturas dos peptídeos, é aparente que a ordem dos aminoácidos na região de núcleo hidrofóbica é menos importante, como ainda o núcleo hidrofóbico embaralhado da série Pip9 que produziu expressão de distrofina semelhante à série Pip8 no coração.Avaliação toxicológica após a administração sistêmica de Pip7-9-PMO

[0218] Para avaliar as respostas de toxicidade em camundongos mdx tratados com Pip7-9-PMO, fizemos avaliações preliminares da função hepática e renal em 2 semanas após a administração sistêmica dos compostos Pip7-9-PMO através da extração e análise de soro dos camundongos tratados e controles. A análise dos níveis séricos de creatina cinase (CK), creatinina, ureia, fosfatase alcalina (ALP), alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), a bilirrubina total, lactato desidrogenase foi realizada. Não houve elevação do nível de ureia e creatinina, um marcador para a toxicidade renal e TBIL, um marcador de toxicidade hepática no soro de mdx tratado com PPMO em relação ao controle mdx não tratado (figura 47). Os níveis de ALT, AST, ALP e de LDH foram elevados em camundongos mdx não tratados. Não houve alteração nos níveis destes marcadores no soro de mdx tratado com PPMO em comparação com o controle mdx não tratado. Os níveis de CK foram variáveis entre camundongos.Identificação de PPMO líder (éxon 23 do camundongo) em camundongos mdx

[0219]Nós identificamos PPMO para fornecer alto nível de restauração da distrofina tanto no músculo esquelético quanto no cardíaco em camundongos mdx. Pip8b, 9b, 9b2, 8c e 9c mostraram uma promessa significativa com a restauração muito eficiente da distrofina no tibial anterior (TA), diafragma, quadríceps e coração, sem toxicidade aparente.

[0220] Para comparar a eficiência do salto do éxon do PPMO líder, camundongos mdx de 8 semanas de idade receberam injeção com 12,5 mg de PPMO. Duas semanas após a injeção, a expressão de distrofina foi analisada nos músculos TA, quadríceps, diafragma e cardíaco. Foram avaliadas as fibras positivas de distrofina imunocoradas, RNAm de salto de éxon e os níveis de proteína distrofina (figuras 48-50). A intensidade de fibras de distrofina imunocoradas no TA e coração foi analisada utilizando um anticorpo de camundongo antilaminina para a normalização e essa foi expressa como uma razão do nível de intensidade dos músculos C57BL/10 (figura 48). Os níveis de RNA de salto de éxon da distrofina foram notavelmente expressos nos músculos esqueletais injetados com Pip8b, 9b e Pip9b2-PMO, tais como músculos TA, quadríceps, diafragma e cardíaco em 2 semanas após a injeção (figuras 49-50). No entanto, Pip8c e 9c-PMO resultaram em expressão fraca de distrofina em comparação com Pip8b, 9b e 9b2-PMO. Além disso, Pip9d2-PMO resultou na produção inexpressiva da distrofina nos músculos de TA, quadríceps, diafragma e os músculos do coração (figura 48-50), o que ilustra a importância de manter o comprimento da região hidrofóbica do peptídeo para induzir o salto de éxons eficiente.

[0221] O nível da proteína distrofina nos músculos de mdx tratados com PPMO foi quantificado por análise western blot. A densidade da banda da distrofina foi quantificada utilizando o software Licor e vinculina foi utilizada como controle de carga. A densidade da banda foi normalizada pela respectiva banda de vinculina e esta foi expressa como uma porcentagem do nível de expressão da distrofina dos músculos C57BL/10. O nível da proteína distrofina com salto de éxon foi semelhante nos músculos esqueléticos injetados com Pip8b, 9b e 9B2-PMO, tais como os músculos TA, quadríceps e diafragma em 2 semanas após a injeção (figuras 50). No entanto, Pip8c e 9c reduziram a expressão de distrofina em comparação com 8b, 9b e 9b2-PMO. Além disso, 9d2-PMO resultou na produção de distrofina insignificante nos músculos TA, quadríceps, diafragma e músculos do coração (figura 50).Restauração dos níveis de microRNA desregulados no PPMO líder (éxon 23 do camundongo) em camundongos mdx tratados com PPMO

[0222] Testamos a capacidade da distrofina de salto de éxon induzida pelos PPMO candidatos para corrigir os níveis de microRNA por amenizar a patologia muscular em camundongos mdx. Foram avaliados os níveis de distromirs (microRNAs desregulados na deficiência de distrofina), miR-1 e miR-133a, que foram aumentados no soro de mdx e tanto diminuíram ou permaneceram inalterados nos tecidos de mdx e esses podem, portanto, constituir marcadores séricos úteis. Duas semanas após a injeção intravenosa de 12,5 mg/kg de PPMO (Pip8b, 9b, 9b2, 8c e 9c) em ratos mdx de 8 semanas de idade, os níveis de miR-133a e miR-206 foram examinados por (Q)-PCR quantitativa em soro tratado com PPMO e normalizados para miR-223 como um microRNA referência. Os níveis de miR-133a e miR-206 foram significativamente infrarregulados no soro de camundongos mdx tratados com PPMO em comparação com os controles mdx não tratados, o que implica que a patologia muscular melhorou com PPMO (figura 51).Melhoria da síntese de PPMO

[0223] Para comparar a eficiência do salto de éxon de HPLC e 9b2-PMO dessalinizado em filtro, camundongos mdx de 8 semanas de idade receberam injeção com 12,5 mg de PPMO. Duas semanas após a injeção, a expressão de distrofina foi analisada nos músculos TA, quadríceps, diafragma e cardíaco. Foram avaliadas as fibras positivas de distrofina imunocoradas, RNAm em salto de éxon e os níveis da proteína distrofina (figuras 52-54). A intensidade de fibras imunocoradas da distrofina foi analisada utilizando um anticorpo antilaminina de camundongo para a normalização e esta foi expressa como uma razão do nível de intensidade dos músculos de C57BL/10 (figura 52). Não houve qualquer alteração no nível de intensidade da distrofina de salto de éxon no sarcolema induzido por HPLC e 9b2- PMO dessalinizado em filtro. Os níveis de RNA da distrofina com salto de éxon foram ligeiramente aumentados nos músculos esqueletais que receberam injeção de Pip9b2-PMO em comparação com músculos tratados com PMO filtrado em HPLC, tais como, TA, quadríceps e diafragma em 2 semanas após a injeção (figura 53).Avaliação da toxicidade de Pip9b2-PMO em miotubos de camundongo mdx cultivados

[0224] O estudo de toxicidade de Pip9b2-PMO dessalinizado em filtro-HPLC foi realizado utilizando-se ensaios de viabilidade celular. A viabilidade celular foi ligeiramente aumentada em miotubos de mdx tratados com Pip9b2-PMO dessalinizado em filtro-HPLC em comparação com células tratadas com Pip9b2- PMO dessalinizado-HPLC, quando foram tratados com 60 μM de Pip9b2-PMO (figura 54).

Sumário

[0225] PPMO candidatos foram identificados para fornecer restauração de alto nível a distrofina em ambos o músculo esqueletal e cardíaco em camundongos mdx. Em particular, Pip8b e 9b e Pip9b2, 8c e 9c mostraram restauração eficiente da distrofina no tibial anterior (TA), diafragma, quadríceps e coração, sem toxicidade aparente.

[0226] Para a avaliação quantitativa do tratamento in vivo de DMD, os níveis de distromirs (miR-133 e miR-206) foram avaliados, os quais foram aumentados no soro de mdx. Os níveis de miR-133a e miR-206 foi significativamente infrarregulados em soros tratados com PPMO de camundongos mdx em comparação ao controle mdx não tratado.Exemplo 4 - Viabilidade celular (séries Pip7 e Pip8)

[0227] Peptídeos das séries Pip7 e Pip8 foram testados em um ensaio de viabilidade de células, como se segue. Células Huh-7 do fígado foram cultivadas a 37°C sob 5% de CO2/95% de ar em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e antibióticos penicilina/estreptomicina. As células foram tratadas com tripsina e colocadas em placas a 1,5x104 células por poço em placas de 96 poços. Após incubação durante a noite as células foram lavadas com PBS e conjugados de Peptídeo-PMO em 50 μL OptiMEM foram adicionados aos poços em triplicata. Após 4 horas de incubação, os conjugados foram removidos por substituição do meio com 100 μL de DMEM/10% FBS durante um adicional de 20 horas de incubação. 20 μL de solução MTS Cell Viability Assay (Promega) foram adicionados às células contendo 100 μL de DMEM e as placas foram incubadas por 1-2 horas antes das medições de UV a 490 nm serem realizadas. A porcentagem de viabilidade celular foi determinada por normalização da absorvância média de amostras em triplicata para a média das amostras não tratadas.

[0228] Os resultados apresentados (figuras 57 e 58) são consistentes com o aumento da viabilidade celular (isto é, menor toxicidade celular) de peptídeos que contêm menos resíduos de arginina. Por exemplo, peptídeos possuindo um total de 7 resíduos de arginina, nos Domínios 1-3 combinados exibiram maior viabilidade das células (toxicidade celular baixa) que os peptídeos possuindo 8 ou 9 resíduos de arginina.Exemplo 5 - Em ensaios in vitro: o salto de éxon em miotubos de camundongo mdx; séries Pip7, Pip8 e Pip9

[0229] Miotubos H2K de mdx foram preparados e incubados com os conjugados de peptídeo-PMO, na ausência de qualquer agente de transfecção em concentrações de 0,125, 0,25, 0,5, 1,0 e 2,0 μM pelo método descrito anteriormente [Yin, H., e outros, Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide- mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol Ther, 2011. 19 (7): p. 1295-303.]. Os produtos de RT-PCR aninhada partir de RNA total isolado foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 2%. Quantificação dos níveis do transcrito Δ23 foi calculada utilizando densitometria.

[0230] Os resultados (figuras 59 a 61) mostram que Pip7a, Pip7b, Pip7b2, Pip7c, Pip7c2, Pip8a, Pip8b, Pip8c, Pip8c2, Pip8d, Pip9b, Pip9b2, Pip9c, pip9c2, Pip9c3, pip9d e conjugados de Pip9d2-PMO forneceram alta atividade de salto de éxon nas células musculares de mdx.Referências1. . Kurreck J.: Eur. J. Biochem. 2003, 270, 1628.2. Eckstein F.: Expert Opin. Biol. Ther. 2007, 7, 1021.3. Egholm M., Buchardt O., Nielsen P. E., Berg R. H.: J. Amer. Chem. Soc. 1992, 774, 1895.4. Summerton J., Weller D.: Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 1997, 7, 187.5. Lebleu B., Moulton H. M., Abes R., Ivanova G. D., Abes S., Stein D. A., Iversen P. L., Arzumanov A., Gait M. J.: Adv. Drug Delivery Rev. 2008, 60, 517.6. Zatsepin T. S., Turner J. J., Oretskaya T. S., Gait M. J.: Curr. Pharm. Design 2005, 77, 3639.7. Abes R., Arzumanov A., Moulton H. M., Abes S., Ivanova G. D., Iversen P. L, Gait M. J., Lebleu B.: Biochem. Soc. Trans. 2007, 35, 775.8. Turner J. J., Arzumanov A., Ivanova G., Fabani M., Gait M. J.: CellPenetrating Peptides, 2a Edição. (U. Langel Ed.) 2006, CRC Press, Boca Raton. 313.9. Turner J. J., Jones S., Fabani M., Ivanova G., Arzumanov A., Gait M. J.: Blood, Cells, Molecules and Diseases 2007, 38, 1.10. Kang S.-H., Cho M.-J., Kole R.: Biochemistry 1998, 37, 6235.11. Bendifallah N., Rasmussen F. W., Zachar V., Ebbesen P., Nielsen P. E., Koppelhus U.: Bioconjugate Chem. 2006, 77, 750.12. El-Andaloussi S., Johansson H. J., Lundberg P., Langel U.: J. Gene Medicine 2006, 8, 1262.13. El-Andaloussi S., Johansson H. J., Holm T., Langel U.: Mol. Ther. 2007, 15, 1820.14. Abes S., Williams D., Prevot P., Thierry A. R., Gait M. J., Lebleu B.: J. Controlled Release 2006, 770, 595.15. Abes S., Moulton H. M., Turner J. J., Clair P., Richard J.-P., Iversen P. L., Gait M. J., Lebleu B.: Biochem. Soc. Trans. 2007, 35, 53.16. Abes S., Moulton H. M., Clair P., Prevot P., Youngblood D. S., Wu R. P., Iversen P. L., Lebleu B.: J. Controlled Release 2006, 776, 304.17. Turner J. J., Arzumanov A. A., Gait M. J.: Nucl. Acids Res. 2005, 33, 27.18. Turner J. J., Ivanova G. D., Verbeure B., Williams D., Arzumanov A., Abes S., Lebleu B., Gait M. J.: Nucl. Acids Res. 2005, 33, 6837.19. Abes S., Turner J. J., Ivanova G. D., Owen D., Williams D., Arzumanov A., Clair P., Gait M. J., Lebleu B.: Nucl. Acids Res. 2007, 35, 4495.20. Fabani M., Gait M. J.: RNA 2008, 14, 336.21. Moulton H. M., Nelson M. H., Hatlevig S. A., Reddy M. T., Iversen P. L: Bioconjugate Chem. 2004, 15, 290.22. Kichler A., Leborgne C, J. M., Danos O., Bechinger B.: Proc. Natl. Acad. Sci.23. Yin H., Lu Q., Wood M.: Mol. Ther. 2008, 16, 38.24. Fletcher S., Honeyman K., Fall A. M., Harding P. L., Johnsen R. D., Wilton S. D.: J Gene Med. 2006, 8, 207. 25. Soifer H. S., Rossi J. J., Saetrom P.: Mol. Ther. 2007, 15, 2070.26. Jopling C. L., Yi M., Lancaster A. M., Lemon S. M., Sarnow P.: Science 2005, 309, 1577.27. Krijtzfeldt J., Rajewsky N., Braich R., Rajeev K. G., Tuschl T., Manoharan M., Stoffel M.: Nature 2005, 438, 685.28. Esau C, Davis S., Murray S. F., Yu X. X., Pandey S. K., Pear M., Watts L., Booten S. L., Graham M., Mckay R., Subramanian A., Propp S., Lollo B. A., Freier S. M., Bennett C. F., Bhanot S., Monia B. P.: Cell Metabolism 2006, 3, 87.29. Cossu, G. and Sampaolesi, M. (2007) Trends Mol. Medicine, 13 520-526.30. Aartsma-Rus, A. and van Ommen, G.-J. B. (2007) RNA, 13, 1609-1624.31. Lu, Q. e outros, (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 198-203.33. Alter, J. e outros, (2006) Nature Medicine, 12, 175-177.34. van Deutekom, J. e outros, (2007) New England J. Med. 357, 2677-2686.35. Arechavala-Gomeza, V. e outros, (2007) Human Gene Therapy, 18, 798810.36. Lebleu, B. e outros (2008) Adv. Drug Delivery Rev. 60, 517-529.37. Fletcher, S. e outros, (2007) Mol. Ther. 15, 1587-1592.38. Madsen, E.C., Morcos, P.A., Mendelsohn, B.A., and Gitlin, J.D. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 3909-391439. Kole, R. Vacek, M., and Williams T. (2004) Oligonucleotides, 14, 65-74).40. Scaffidi, P. and Mistelli, T. (2006) Science, 312, 1059-106341. Du, L. e outros, (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 6007-601242. Yin, H. e outros, (2008) Human Mol. Gen. 17, 3909-3918;43. Wu. B. e outros, (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 14814-1481944. Jearawiriyapaisarn, N. e outros, (2008) Mol. Ther. 16, 1624-162945. Moulton e outros (2004) Bioconjugate Chem. 15, 290-299.46. Seabra, L. and Warenius, H. (2007) Eur. J. Cancer 43, 1483-1492.

Claims (26)

1. Peptídeo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma estrutura de sequência primária compreendida de pelo menos três domínios, apresentando a disposição:N-terminal [Domínio 1] - [Domínio 2] - [Domínio 3] C-terminal,no qual:(i) o Domínio 1 compreende uma sequência selecionada a partir de: RXRZ3 [SEQ ID NO: 762]em que Z3 é selecionado a partir de um de:RBRRXR [SEQ ID NO: 763],RBRRX [SEQ ID NO: 764],RBRX [SEQ ID NO: 765],RBRXR [SEQ ID NO: 766],BRX [SEQ ID NO: 767],BX [SEQ ID NO: 768],RBR [SEQ ID NO: 769],RB [SEQ ID NO: 770], ouRBRR [SEQ ID NO: 771],(ii) o Domínio 2 compreende uma sequência que contém pelo menos 3 dos aminoácidos Z1, Z2, F, L, I [SEQ ID NO: 798], em que Z1 é Y ou I e Z2é Q ou R, e em que o Domínio 2 não contém uma sequência primária contígua de N- a C- terminal de ILFQY [SEQ ID NO: 799], ILFQ [SEQ ID NO: 800] ou lLIQ [SEQ ID NO: 801],(iii) o Domínio 3 compreende uma sequência selecionada a partir de: RXRBRXRB [SEQ ID NO: 772],XRBRXRB [SEQ ID NO: 773],RXRRBRB [SEQ ID NO: 774],BRXRB [SEQ ID NO: 775], XRRBRB [SEQ ID NO: 776],RRBRB [SEQ ID NO: 777],XRBRB [SEQ ID NO: 778],RBRXRB [SEQ ID NO: 779],RXRBRB [SEQ ID NO: 780], ouBRBRB [SEQ ID NO: 781],em que X = ácido aminohexanóico, B = betaAlanina.

2. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o Domínio 2 compreende uma sequência primária contígua de N- a C- terminal selecionada dentre YQFLI [SEQ ID NO: 802], IQFLI [SEQ ID NO: 803], YRFLI [SEQ ID NO: 804], YRFRLI [SEQ ID NO: 805], FQILY [SEQ ID NO: 806], QFLI [SEQ ID NO: 807], QFL [SEQ ID NO: 808] ou ILFRY [SEQ ID NO: 811].

3. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o Domínio 1 consiste em uma sequência selecionada a partir de:RXRRBRRXR [SEQ ID NO: 782] ,RXRRBRRX [SEQ ID NO: 783] ,RXRRBRX [SEQ ID NO: 784] ,RXRBRX [SEQ ID NO: 785] ,RXRRBRXR [SEQ ID NO: 786] ,RXRRBR [SEQ ID NO: 787],RXRRB [SEQ ID NO: 788],RXRRBRR [SEQ ID NO: 789], ouRXRBX [SEQ ID NO: 790].

4. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o Domínio 3 consiste em uma sequência selecionada a partir de:RXRBRXRB [SEQ ID NO: 772], XRBRXRB [SEQ ID NO: 773] ,RXRRBRB [SEQ ID NO: 774],BRXRB [SEQ ID NO: 775],XRRBRB [SEQ ID NO: 776],RRBRB [SEQ ID NO: 777],XRBRB [SEQ ID NO: 778],RBRXRB [SEQ ID NO: 779],RXRBRB [SEQ ID NO: 780], ouBRBRB [SEQ ID NO: 781].

5. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o Domínio 2 tem 4 ou 5 aminoácidos.

6. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o Domínio 2 contém 0, 1, 2 ou 3 resíduos R.

7. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o Domínio 2 tem pelo menos um ou dois resíduos R, o Domínio 1 tem cinco resíduos R ou menos, e o Domínio 3 tem quatro resíduos R ou menos.

8. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais resíduos R são D-Arginina.

9. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais resíduos R são L-Arginina.

10. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que os Domínios 1 e 3 contêm apenas resíduos R, X e B.

11. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o Domínio 1 tem qualquer combinação de 2 a 6 resíduos R, 1 a 3 resíduos X e 1 a 2 resíduos B, e não apresenta mais que 10 resíduos de comprimento e possui 0, 1 ou 2 resíduos que não são R, X ou B.

12. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o Domínio 3 apresenta qualquer combinação de 2 a 5 resíduos R, 1 a 3 resíduos X e 1 a 3 resíduos B, e não apresenta mais que 9 resíduos de comprimento e possui 0, 1 ou 2 resíduos que não são R, X ou B.

13. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo tem um comprimento máximo de 30 resíduos, incluindo aminoácidos naturais e resíduos X e B.

14. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o Domínio 1 tem um comprimento de 4 a 12 resíduos, o Domínio 2 tem um comprimento de 3 a 9 resíduos e o Domínio 3 tem um comprimento de 4 a 12 resíduos, em que os comprimentos incluem aminoácidos naturais e resíduos X e B.

15. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que consiste em uma sequência escolhida a partir de uma das SEQ ID NOs: 2 a 308 ou 317 a 761.

16. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que consiste na sequência de Domínios 1 a 3 de um dentre Pip-6a, Pip-6b, Pip-6e, Pip-6f (SEQ ID NOs: 2, 3, 6 ou 7).

17. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo compreende ainda um ligante no C- terminal.

18. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o ligante é escolhido dentre BCys, XCys, Cys, GGCys, BBCys, BXCys, XBCys, BX ou XB.

19. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo é quimicamente conjugado a uma molécula de carga.

20. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a conjugação é no C-terminal do peptídeo.

21. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula de carga é escolhida a partir de um ácido nucleico, ácido nucleico peptídico (PNA), oligonucleotídeo de morfolino fosforodiamidato (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA), oligonucleotídeo antissenso, pequeno RNA de interferência (siRNA), peptídeo, peptídeo cíclico, proteína ou fármaco.

22. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula de carga tem um peso molecular inferior a 5.000 Da.

23. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula de carga é PNADMD [SEQ ID NO: 309] ou PMODMD [SEQ ID NO: 310].

24. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o Domínio 2 possui pelo menos dois resíduos R, o Domínio 1 possui cinco resíduos R ou menos, e o Domínio 3 possui quatro resíduos R ou menos.

25. Composição farmacêutica ou medicamento, CARACTERIZADA(O) pelo fato de que compreende um peptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, e opcionalmente compreende um diluente, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável.

26. Uso de um peptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para uso no tratamento de uma doença, em que a doença é Distrofia Muscular de Duchenne (DMD).

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