BR112020004072A2 - métodos para tratar distrofia muscular - Google Patents

Abstract

A presente revelação fornece, dentre outras coisas, composições e métodos melhorados para tratar distrofia muscular. Por exemplo, a revelação fornece métodos para tratar pacientes com distrofia muscular de Duchenne que têm uma mutação no gene de DMD que é suscetível ao salto de éxon 53 administrando-se uma quantidade eficaz de golodirsen.

Description

“MÉTODOS PARA TRATAR DISTROFIA MUSCULAR” PEDIDOS RELACIONADOS

[001]Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório n° U.S. 62/553.094, depositado em 31 de agosto de 2017, do Pedido Provisório n° U.S. 62/565.824, depositado em 29 de setembro de 2017 e do Pedido Provisório n° U.S. 62/725.129, depositado em 30 de agosto de 2018. Os ensinamentos dos pedidos acima mencionados estão incorporados a título de referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002]A presente invenção refere-se aos métodos melhorados para tratar distrofia muscular em um paciente. A mesma também fornece composições adequadas para facilitar o salto de éxon 53 no gene de distrofina humano.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003]Em uma variedade de doenças genéticas, os efeitos de mutações sobre a eventual expressão de um gene podem ser modulados através de um processo de salto de éxon alvejado durante o processo de splicing. Em casos em que uma proteína normalmente funcional é prematuramente finalizada devido às mutações na mesma, um meio para restaurar alguma produção de proteína funcional através de tecnologia antissenso se mostrou possível através da intervenção durante os processos de splicing, e se os éxons associados às mutações causadoras de doença podem ser especificamente deletados de alguns genes, um produto de proteína encurtada pode ser, por vezes, produzido com propriedades biológicas similares à proteína nativa ou com atividade biológica suficiente para amenizar a doença causada por mutações associadas ao éxon (consultar, por exemplo, Sierakowska, Sambade et al., 1996; Wilton, Lloyd et al., 1999; van Deutekom, Bremmer-Bout et al., 2001; Lu, Mann et al., 2003; Aartsma-Rus, Janson et al. 2004).

[004]Distrofia muscular de Duchenne (DMD) é causada por um defeito na expressão da proteína distrofina. Distrofina é uma proteína citoplasmática em formato de bastão, e uma parte vital de um complexo de proteína que conecta o citoesqueleto de uma fibra muscular à matriz extracelular circundante através da membrana celular. Distrofina tem um papel estrutural importante na fibra muscular, que é conectar a matriz extracelular e o citoesqueleto. A região de terminal N se liga à actina, enquanto a extremidade de terminal C é parte do complexo de glicoproteína distrofina (DGC), que abrange o sarcolema. Demonstrou-se que fibras musculares deficientes de distrofina do camundongo mdx exibiram uma suscetibilidade aumentada à ruptura de sarcolema induzida por contração (consultar Petrof et al., 1993; Cirak et al., 2012).

[005]O gene que codifica a proteína contém 79 éxons espalhados sobre mais de 2 milhões de nucleotídeos de DNA. Qualquer mutação exônica que altera o quadro de leitura do éxon, ou introduz um códon de parada, ou é caracterizada pela remoção de um éxon ou éxons inteiros fora de um quadro, ou duplicações de um ou mais éxons, tem o potencial para romper a produção de distrofina funcional, que resulta em DMD.

[006]O início da doença pode ser documentado no nascimento com níveis de quinase de creatina elevados, e défices motores significativos podem estar presentes no primeiro ano de vida. Aos sete ou oito anos de idade, a maioria dos pacientes com DMD têm um andar cada vez mais dificultado e perdem a habilidade de se levantar do chão e subir as escadas; dos 10 aos 14 anos de idade, a maioria é dependente da cadeira de rodas. DMD é uniformemente fatal; indivíduos afetados morrem, tipicamente, de insuficiência respiratória e/ou cardíaca no fim da sua juventude ou no começo dos 20 anos. A progressão contínua de DMD permite a intervenção terapêutica em todos os estágios da doença; no entanto, o tratamento é atualmente limitado aos glicocorticoides, que estão associados aos diversos efeitos colaterais que incluem ganho de peso, alterações comportamentais, alterações pubertárias, osteoporose, fácies cushingoide, inibição de crescimento e catarata. Consequentemente, desenvolver terapias melhores para tratar a causa fundamental dessa doença é imperativo.

[007]Uma forma menos grave de distrofia muscular, distrofia muscular de Becker (BMD) parece surgir quando uma mutação, tipicamente uma deleção de um ou mais éxons, resulta em um quadro de leitura correto ao longo da transcrição de distrofina inteira, de modo que a tradução de mRNA em proteína não seja prematuramente interrompida. Se a união dos éxons a montante e a jusante no processamento de um pré-mRNA de distrofina mutado mantém o quadro de leitura correto do gene, o resultado é um mRNA que codifica uma proteína com uma deleção interna curta que retém alguma atividade, o que resulta em um fenótipo de Becker.

[008]Por muitos anos sabe-se que deleções de um éxon ou éxons que não alteram o quadro de leitura de uma proteína distrofina daria origem a um fenótipo de BMD, enquanto uma deleção de éxon que causa uma comutação de quadro daria origem à DMD (Monaco, Bertelson et al., 1988). Em geral, mutações de distrofina que incluem mutações pontuais e deleções de éxon que alteram o quadro de leitura e, assim, interrompem a tradução de proteína apropriada resultam em DMD. Também deve-se verificar que alguns pacientes com BMD e DMD têm deleções de éxon que cobrem múltiplos éxons.

[009]Ensaios clínicos recentes que testam a segurança e eficácia de oligonucleotídeos de comutação de splice (SSOs) para o tratamento de DMD são com base na tecnologia de SSO para induzir splicing alternativo de pré-mRNAs através de bloqueio estérico do spliceossoma (Cirak et al., 2011; Goemans et al., 2011; Kinali et al., 2009; van Deutekom et al., 2007). No entanto, apesar desses sucessos, as opções farmacológicas disponíveis para tratar DMD são limitadas.

[010]Assim, permanece uma necessidade por composições e métodos melhorados para produzir distrofina e tratar distrofia muscular, tal como DMD e BMD em pacientes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[011]A presente revelação é com base, pelo menos em parte, na evidência clínica que mostra que o tratamento com um oligonucleotídeo antissenso de salto de éxon 53, golodirsen, aumentou significativamente a proteína distrofina em pacientes sobre a linha de referência. Adicionalmente, uma correlação positiva entre salto de éxon e proteína distrofina de novo foi observada.

[012]Consequentemente, em alguns aspectos, a revelação fornece um método para tratar distrofia muscular de Duchenne (DMD) em um paciente que necessita do mesmo que tem uma mutação do gene de DMD que é suscetível ao salto de éxon 53, que compreende administrar ao paciente uma dose de golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[013]Em alguns aspectos, a revelação fornece um método para restaurar um quadro de leitura de mRNA para induzir salto de éxon em um paciente com distrofia muscular de Duchenne (DMD) que necessita do mesmo que tem uma mutação do gene de DMD que é suscetível ao salto de éxon 53, que compreende administrar ao paciente uma dose de golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[014]Em alguns aspectos, a revelação fornece um método para aumentar produção de distrofina em um paciente com distrofia muscular de Duchenne (DMD) que necessita do mesmo que tem uma mutação do gene de DMD que é suscetível ao salto de éxon 53, que compreende administrar ao paciente uma dose de golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[015]Em alguns aspectos, a dose é administrada em uma dosagem de 4 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg ou 50 mg/kg de peso corporal do paciente.

[016]Em alguns aspectos, a dose é administrada como uma dose única. Em alguns aspectos, a dose é administrada uma vez por semana. Em alguns aspectos, a dose é administrada por via intravenosa. Em alguns aspectos, a dose é administrada por via intravenosa através de infusão. Em alguns aspectos, a dose é administrada por via intravenosa através de infusão durante um período de 35 a 60 minutos. Em alguns aspectos, a dose é administrada por via intravenosa através de injeção subcutânea.

[017]Em alguns aspectos, o paciente tem até 40 anos de idade, até 30 anos de idade ou até 21 anos de idade. Em alguns aspectos, o paciente tem de 1 a 21 anos de idade. Em alguns aspectos, o paciente tem de 5 a 21 anos de idade. Em alguns aspectos, o paciente tem de 6 a 15 anos de idade.

[018]Em alguns aspectos, a revelação fornece um método de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados, em que o paciente tem uma mutação do gene de DMD que é selecionado a partir do grupo que inclui éxons 3 a 52, 4 a 52, 5 a 52, 6 a 52, 9 a 52, 10 a 52, 11 a 52, 13 a 52, 14 a 52, 15 a 52, 16 a 52, 17 a 52, 19 a 52, 21 a 52, 23 a 52, 24 a 52, 25 a 52, 26 a 52, 27 a 52, 28 a 52, 29 a 52, 30 a 52, 31 a 52, 32 a 52, 33 a 52, 34 a 52, 35 a 52, 36 a 52, 37 a 52, 38 a 52, 39 a 52, 40 a 52, 41 a 52, 43 a 52, 42 a 52, 45 a 52, 47 a 52, 48 a 52, 49 a 52, 50 a 52, 54 a 58, 54 a 61, 54 a 63, 54 a 64, 54 a 66, 54 a 76, 54 a 77, e éxon 52.

[019]Em alguns aspectos, a revelação fornece um método, de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados, sendo que o paciente é recebe cronicamente golodirsen. Em alguns aspectos, o paciente recebe golodirsen por pelo menos 48 semanas. Em alguns aspectos, o paciente recebe golodirsen por mais de um ano, mais de dois anos, mais de três anos, mais de quatro anos, mais de cinco anos, mais de dez anos, mais de vinte anos ou mais de trinta anos.

[020]Em alguns aspectos, a revelação fornece métodos de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados, em que o paciente recebe uma dose estável de corticosteroides por pelo menos 6 meses antes da administração de golodirsen. Em alguns aspectos, o paciente recebe uma dose estável de corticosteroides durante pelo menos 6 meses antes da administração de golodirsen e permanece sob corticosteroides durante a administração de golodirsen.

[021]Em alguns aspectos, a revelação fornece métodos de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados, em que golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é formulado como uma composição farmacêutica. Em alguns aspectos, golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é formulado como uma composição farmacêutica que tem uma força de 50 mg/ml. Em alguns aspectos, golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é formulado como uma composição farmacêutica que tem uma força de 50 mg/ml e apresentado em uma forma de dosagem de 100 mg/2 ml. Em alguns aspectos, golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é formulado como uma composição farmacêutica que tem uma força de 50 mg/ml e apresentado em uma forma de dosagem de 500 mg/2 ml. Em alguns aspectos, a forma de dosagem está contida em um frasco de uso único.

[022]Em alguns aspectos, golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é formulado como uma composição farmacêutica que compreende golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em alguns aspectos, o carreador farmaceuticamente aceitável é uma solução tamponada de fosfato.

[023]Em alguns aspectos, a revelação fornece um método de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados, em que o salto de éxon é medido através da reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa (RT-PCR).

[024]Em alguns aspectos, a revelação fornece um método de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados, em que o método aumenta a produção de distrofina no paciente. Em alguns aspectos, a produção de distrofina é medida através de análise de western blot. Em alguns aspectos, a produção de distrofina é medida através de imuno-histoquímica (IHC).

[025]Em alguns aspectos, a revelação fornece um método de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados, que compreende adicionalmente confirmar que o paciente tem uma mutação no gene de DMD que é suscetível ao salto de éxon 53 antes de administrar golodirsen.

[026]Em alguns aspectos, a revelação fornece golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo para uso no tratamento de distrofia muscular de Duchenne (DMD) em um paciente que necessita do mesmo, sendo que o paciente tem uma mutação do gene de DMD que é suscetível ao salto de éxon 53, em que o tratamento compreende administrar ao paciente uma dose intravenosa única de eteplirsen de 30 mg/kg uma vez por semana.

[027]Em alguns aspectos, a revelação fornece golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo para uso na restauração de um quadro de leitura de mRNA para induzir salto de éxon em um paciente com distrofia muscular de Duchenne (DMD) que necessita do mesmo, sendo que o paciente tem uma mutação do gene de DMD que é suscetível ao salto de éxon 53, em que o tratamento compreende administrar ao paciente uma dose intravenosa única de eteplirsen de 30 mg/kg uma vez por semana.

[028]Em alguns aspectos, a revelação fornece golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo para uso no aumento de produção de distrofina em um paciente com distrofia muscular de Duchenne (DMD) que necessita do mesmo, sendo que o paciente tem uma mutação do gene de DMD que é suscetível ao salto de éxon 53, em que o tratamento compreende administrar ao paciente uma dose intravenosa única de eteplirsen de 30 mg/kg uma vez por semana.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[029]A Figura 1 é um resumo de fluxograma do Estudo de Fase I/II de SRP- 4053 no projeto de estudo de pacientes com DMD.

[030]A Figura 2 representa dados de RT-PCR (Linha de Referência e em 48 semanas após tratamento com SRP-4053) para cada um dos 25 pacientes no estudo acima.

[031]A Figura 3 representa os dados de Western Blot (Linha de Referência e em 48 semanas após tratamento com SRP-4053) para cada um dos 25 pacientes no estudo acima.

[032]A Figura 4A representa tingimento com imunofluorescência de biopsias musculares de um único paciente (Exemplo 1) na linha de referência e a receber tratamento manchado para laminina para mostrar fibras musculares totais.

[033]A Figura 4B representa tingimento com imunofluorescência de seções (1 a 3) das biopsias musculares da Figura 4A manchadas para distrofina.

[034]A Figura 5A representa tingimento com imunofluorescência de biopsias musculares de um único paciente (Exemplo 2) na linha de referência e a receber tratamento manchado para laminina para mostrar fibras musculares totais.

[035]A Figura 5B representa tingimento com imunofluorescência de seções (1 a 3) das biopsias musculares da Figura 5A manchadas para distrofina.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[036]Modalidades da presente revelação se referem a métodos para tratar distrofia muscular, tal como DMD, administrando-se um oligonucleotídeo antissenso especificamente projetado para induzir salto de éxon 53 no gene de distrofina humano, golodirsen. Distrofina tem um papel vital na função do músculo, e várias doenças relacionadas ao músculo são caracterizadas por formas mutadas desse gene. Portanto, em determinadas modalidades, os métodos descritos no presente documento podem ser usados para induzir salto de éxon 53 em formas mutadas do gene de distrofina humano, tais como os genes de distrofina mutados encontrados em DMD.

[037]Assim, a revelação se refere a métodos para tratar distrofia muscular, tal como DMD, induzindo-se salto de éxon 53 em um paciente. Adicionalmente, a revelação se refere a métodos para restaurar um quadro de leitura de mRNA para induzir salto de éxon em um paciente com DMD. A revelação também se refere a métodos para aumentar produção de distrofina em um paciente com DMD.

[038]A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por aqueles com habilidade comum na técnica à qual a invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos no presente documento possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais preferenciais são descritos. Para os fins da presente invenção, os seguintes termos são definidos abaixo. I.Definições

[039]O termo "cerca de" significa uma quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, montante, peso ou comprimento que varia tanto quanto 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1% em uma quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento de referência.

[040]“Suscetível ao salto de éxon 53”, conforme usado no presente documento, com relação a um indivíduo ou paciente, é destinado a incluir indivíduos e pacientes que têm uma ou mais mutações no gene de distrofina que, ausente do salto de éxon 53 do gene de distrofina, faz com que o quadro de leitura esteja fora de quadro, desse modo, se interrompe a tradução do pré-mRNA que resulta em uma incapacidade do indivíduo ou paciente em produzir distrofina. Exemplos sem limitação de mutações nos seguintes éxons do gene de distrofina que são suscetíveis ao salto de éxon 53 incluem, por exemplo, deleção de: éxons 3 a 52, 4 a 52, 5 a 52, 6 a 52, 9 a 52, 10 a 52, 11 a 52, 13 a 52, 14 a 52, 15 a 52, 16 a 52, 17 a 52, 19 a 52, 21 a 52, 23 a 52, 24 a 52, 25 a 52, 26 a 52, 27 a 52, 28 a 52, 29 a 52, 30 a 52, 31 a 52, 32 a 52, 33 a 52, 34 a 52, 35 a 52, 36 a 52, 37 a 52, 38 a 52, 39 a 52, 40 a 52, 41 a 52, 43 a 52, 42 a 52, 45 a 52, 47 a 52, 48 a 52, 49 a 52, 50 a 52, 54 a 58, 54 a 61, 54 a 63, 54 a 64, 54 a 66, 54 a 76, 54 a 77 ou éxon 52. Determinar se um paciente tem uma mutação no gene de distrofina que é suscetível ao salto de éxon está muito dentro da competência de uma pessoa versada na técnica (consultar, por exemplo, Aartsma- Rus et al. (2009) Hum Mutat. 30:293 a 299, Gurvich et al., Hum Mutat. 2009; 30(4) 633 a 640 e Fletcher et al. (2010) Molecular Therapy 18(6) 1.218 a 1.223).

[041]Os termos "oligômero antissenso" e "composto antissenso" e "oligonucleotídeo antissenso" e "oligômero" e "oligonucleotídeo" são usados intercambiavelmente nesta revelação e se referem a uma sequência de subunidades cíclicas conectadas por ligações entre subunidades, em que cada subunidade cíclica consiste em: (i) um açúcar de ribose ou um derivado do mesmo; e (ii) uma porção química de pareamento de base ligada ao mesmo, de modo que a ordem das porções químicas de pareamento de base forme uma sequência de base que é complementar a uma sequência-alvo em um ácido nucleico (tipicamente um RNA) através de pareamento de base de Watson-Crick, para formar um heteroduplex de ácido nucleico:oligômero dentro da sequência-alvo. Em determinadas modalidades, o oligômero é um PMO. Em outras modalidades, o oligonucleotídeo antissenso é um fosforotioato de 2'-O-metila. Em outras modalidades, o oligonucleotídeo antissenso da revelação é um ácido nucleico peptídico (PNA), um ácido nucleico bloqueado (LNA) ou um ácido nucleico ligado (BNA), tal como ácido nucleico ligado a 2'-O,4'-C-etileno (ENA).

[042]Os termos "complementar" e "complementaridade" se referem a dois ou mais oligômeros (isto é, cada um compreende uma sequência de nucleobases) que estão relacionados entre si através das regras de pareamento de base de Watson- Crick. Por exemplo, a sequência de nucleobases "T-G-A (5'3')" é complementar à sequência de nucleobases "A-C-T (3' 5')". Complementaridade pode ser "parcial", em que menos do que todas as nucleobases de uma dada sequência de nucleobases são correspondidas à outra sequência de nucleobases de acordo com as regras de pareamento de base. Por exemplo, em algumas modalidades, complementaridade entre uma dada sequência de nucleobases e a outra sequência de nucleobases pode ser de cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90% ou cerca de 95%. Ou, pode haver complementaridade "completa" ou "perfeita" (100%) entre uma dada sequência de nucleobases e a outra sequência de nucleobases para continuar o exemplo. O grau de complementaridade entre sequências de nucleobases tem efeitos significativos sobre a eficiência e força de hibridização entre as sequências.

[043]“Distrofina” é uma proteína citoplasmática em formato de bastão, e uma parte vital do complexo de proteína que conecta o citoesqueleto de uma fibra muscular à matriz extracelular circundante através da membrana celular. Distrofina contém múltiplos domínios funcionais. Por exemplo, distrofina contém um domínio de ligação à actina aproximadamente nos aminoácidos 14 a 240 e um domínio de haste central aproximadamente nos aminoácidos 253 a 3.040. Esse grande domínio central é formado por 24 elementos helicoidais triplos tipo espectrina de cerca de 109 aminoácidos, que têm homologia com alfa-actinina e espectrina. As repetições são tipicamente interrompidas por quatro segmentos sem repetição ricos em prolina, também denominadas regiões de articulação. Repetições 15 e 16 são separadas por um trecho de 18 aminoácidos que aparece para fornecer um sítio principal para clivagem proteolítica de distrofina. A identidade de sequência entre a maioria das repetições está na faixa de 10 a 25%. Uma repetição contém três alfa-hélices: 1, 2 e

3. Alfa-hélices 1 e 3 são, cada uma, formadas por 7 voltas de hélice, que provavelmente interagem como uma bobina enrolada através de uma interface hidrofóbica. Alfa-hélice 2 tem uma estrutura mais complexa e é formada por segmentos de quatro e três voltas de hélice, separadas por um resíduo de Glicina ou Prolina. Cada repetição é codificada por dois éxons, tipicamente interrompidos por um íntron entre os aminoácidos 47 e 48 na primeira parte da alfa-hélice 2. O outro íntron se encontra em diferentes posições na repetição, normalmente espalhado sobre a hélice-3. Distrofina também contém um domínio rico em cisteína aproximadamente nos aminoácidos 3.080 a 3.360, que inclui um segmento rico em cisteína (isto é, 15 cisteínas em 280 aminoácidos) que mostra homologia com o domínio de terminal C da alfa-actinina de bolor limoso (Dictyostelium discoideum). O domínio de terminal carbóxi está aproximadamente nos aminoácidos 3.361 a 3.685.

[044]A terminação amino da distrofina se liga à F-actina e a terminação carbóxi se liga ao complexo de proteína associado à distrofina (DAPC) no sarcolema. O DAPC inclui os distroglicanos, sarcoglicanos, integrinas e caveolina, e mutações em qualquer um desses componentes causam distrofias musculares autossomaticamente herdadas. O DAPC é desestabilizado quando a distrofina está ausente, o que resulta em níveis diminuídos das proteínas-membro e, por sua vez, resulta em dano progressivo na fibra e vazamento de membrana. Em várias formas de distrofia muscular, tais como distrofia muscular de Duchenne (DMD) e distrofia muscular de Becker (BMD), as células musculares produzem uma forma alterada e funcionalmente defeituosa de distrofina, ou nenhuma distrofina, principalmente devido às mutações na sequência de genes que resultam em splicing incorreto. A expressão predominante da proteína distrofina defeituosa, ou a ausência total de distrofina ou uma proteína semelhante à distrofina, resulta em rápida progressão de geração muscular, conforme observado acima. Com relação a isso, uma proteína distrofina "defeituosa" pode ser caracterizada pelas formas de distrofina que são produzidas em determinados indivíduos com DMD ou BMD, conforme conhecido na técnica, ou pela ausência de distrofina detectável.

[045]Um "éxon" se refere a uma seção definida de ácido nucleico que codifica uma proteína, ou uma sequência de ácidos nucleicos que é representada na forma madura de uma molécula de RNA após quaisquer porções de um RNA pré- processado (ou precursor) terem sido removidas através de splicing. A molécula de RNA madura pode ser um RNA mensageiro (mRNA) ou uma forma funcional de um RNA não codificador, tal como rRNA ou tRNA. O gene de distrofina humano tem cerca de 79 éxons.

[046]Um "íntron" se refere a uma região de ácido nucleico (dentro de um gene) que não é traduzida em uma proteína. Um íntron é uma seção não codificadora que é transcrita em um mRNA precursor (pré-mRNA), e subsequentemente removida através de splicing durante a formação do RNA maduro.

[047]Uma "quantidade eficaz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade de composto terapêutico, tal como um oligômero antissenso que inclui, por exemplo, golodirsen, administrado a um indivíduo mamífero, seja como uma dose única ou como parte de uma série de doses, que é eficaz para produzir um efeito terapêutico desejado. Para um oligômero antissenso, esse efeito pode ser provocado inibindo-se a tradução ou processamento de splice natural de uma sequência-alvo selecionada, ou salto de éxon para aumentar a produção de distrofina.

[048]Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz é pelo menos cerca de 4 mg/kg, pelo menos 10 mg/kg ou pelo menos 20 mg/kg de um oligômero antissenso, ou uma composição que inclui um oligômero antissenso, durante um período de tempo para tratar o indivíduo. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz é pelo menos cerca de 4 mg/kg, pelo menos 10 mg/kg ou pelo menos 20 mg/kg de um oligômero antissenso, ou uma composição que inclui um oligômero antissenso, para aumentar o número de fibras de distrofina positiva em um indivíduo. Em várias modalidades, uma quantidade eficaz é de pelo menos cerca de 4 mg/kg, pelo menos 10 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, 20 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, cerca de 25 mg/kg a cerca de 30 mg/kg ou cerca de 30 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz é de cerca de 30 mg/kg ou cerca de 50 mg/kg.

[049]Em várias modalidades, uma quantidade eficaz é pelo menos cerca de 4 mg/kg, pelo menos 10 mg/kg ou pelo menos 20 mg/kg de um oligômero antissenso, ou uma composição que inclui um oligômero antissenso, para aumentar a produção de distrofina em um indivíduo. Em várias modalidades, uma quantidade eficaz é de pelo menos cerca de 4 mg/kg, pelo menos 10 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, 20 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, cerca de 25 mg/kg a cerca de 30 mg/kg ou cerca de 30 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz é de cerca de 30 mg/kg ou cerca de 50 mg/kg.

[050]Em determinadas modalidades, uma quantidade eficaz é pelo menos cerca de 4 mg/kg, pelo menos 10 mg/kg ou pelo menos 20 mg/kg de um oligômero antissenso, ou uma composição que inclui um oligômero antissenso, para estabilizar, manter, ou melhorar distância de caminhada de um défice de 20%, por exemplo em um 6 MWT, em um paciente, com relação a um par saudável. Em várias modalidades, uma quantidade eficaz é de pelo menos cerca de 4 mg/kg, pelo menos 10 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, 20 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, cerca de 25 mg/kg a cerca de 30 mg/kg ou cerca de 30 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz é de cerca de 30 mg/kg ou cerca de 50 mg/kg.

[051]Em determinadas modalidades, uma quantidade eficaz é de pelo menos cerca de 4 mg/kg, 10 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg ou cerca de 30 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, por pelo menos 24 semanas, pelo menos 36 semanas ou pelo menos 48 semanas, para, desse modo, aumentar o número de fibras de distrofina positiva em um indivíduo. Em determinadas modalidades, o aumento em fibras de distrofina positiva no indivíduo é de pelo menos 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95% do normal. Em algumas modalidades, o tratamento aumenta o número de fibras de distrofina positiva até 20 a 60%, ou 30 a 50% do normal no paciente.

[052]Em determinadas modalidades, uma quantidade eficaz é de pelo menos cerca de 4 mg/kg, pelo menos cerca de 10 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg ou cerca de 30 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, por pelo menos 24 semanas, pelo menos 36 semanas ou pelo menos 48 semanas, para estabilizar ou melhorar a distância de caminhada de um défice de 20%, por exemplo em um 6 MWT, no paciente com relação a um par saudável.

[053]Em várias modalidades, uma quantidade eficaz é de pelo menos cerca de 4 mg/kg, pelo menos cerca de 10 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg ou cerca de 30 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, por pelo menos 24 semanas, pelo menos 36 semanas ou pelo menos 48 semanas para, desse modo, aumentar a produção de distrofina no paciente. Em algumas modalidades, a produção de distrofina aumentada é de cerca de 0,1%, 0,2% 0,3% 0,5%, 0,7%, 0,9%, 1%, 1,01%, 1,5%, 2%, 2,01%, 2,5%, 3%, 3,01%, 3,5%, 4%, 4,01%, 4,5%, 5%, 5,01%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5%, 15%, 15,5%, 16%, 16,5%, 17%, 17,5%, 18%, 18,5%, 19%, 19,5%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, ou 60% com relação a um par saudável. Em determinadas modalidades, o aumento em produção de distrofina pode ser de cerca de 0,1% a 0,5%, 0,5% a 0,9%, 0,8% a 1%, 0,9% a 1,2%, 0,9% a 1,0%, 0,9% a 1,01%, 1% a 1,01%, 1% a 1,5%, 1,5% a 2%, 1,9% a 2,0%, 1,9% a 2,01%, 2% a 2,01%, 2% a 2,5%, 2,5% a 3%, 2,9% a 3,0%, 2,9% a 3,01%, 2% a 3,01%, 3% a 3,5%, 3,5% a 4%, 4% a 4,5%, 4,5% a 5%, 5% a 6%, 6% a 7%, 7% a 8%, 8% a 9%, 9% a 10%, 1% a 2%, 1% a 3%, 1% a 5%, 2% a 4%, 2% a 5%, 4% a 6%, 5% a 8%, 8% a 10%, 1% a 5%, 2% a 6%, 3% a 7%, 4% a 8%, 5% a 10%, 10% a 12%, 12% a 15%, 15% a 20%, 17% a 20%, 20% a 22%, 20% a 25%, 25% a 30% ou 30% a 35% com relação a um par saudável.

[054]O termo "aprimorar" ou "aprimoramento", ou "aumentar" ou "aumento", ou "estimular" ou “estimulação”, se refere, de modo geral, à habilidade de um ou mais oligonucleotídeos antissenso que incluem, por exemplo, golodirsen ou composições farmacêuticas do mesmo, em produzir ou causar uma resposta fisiológica maior (isto é, efeitos a jusante) em uma célula ou um indivíduo, em comparação com a resposta causada seja por oligonucleotídeo não antissenso ou um composto de controle.

Uma resposta fisiológica mensurável pode incluir expressão aumentada de (ou produção de) uma forma funcional de uma proteína distrofina, ou atividade biológica relacionada à distrofina aumentada em tecido muscular, dentre outras respostas aparentes a partir do entendimento na técnica e da descrição no presente documento.

Função do músculo aumentada também pode ser medida, que inclui aumentos ou melhoramentos na função do músculo em cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100%. A porcentagem de fibras musculares que expressa uma distrofina funcional também pode ser medida, que inclui expressão de distrofina aumentada em cerca de 1%, 2%, 5%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% das fibras musculares.

Por exemplo, demonstrou-se que cerca de 40% do melhoramento de função do músculo pode ocorrer se 25 a 30% das fibras expressarem distrofina (consultar, por exemplo, DelloRusso et al., Proc Natl Acad Sci USA 99: 12.979 a 12.984, 2002). Em algumas modalidades, a produção de distrofina aumentada é de cerca de 0,1%, 0,2% 0,3% 0,5%, 0,7%, 0,9%, 1%, 1,01%, 1,5%, 2%, 2,01%, 2,5%, 3%, 3,01%, 3,5%, 4%, 4,01%, 4,5%, 5%, 5,01%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5%, 15%, 15,5%, 16%, 16,5%, 17%, 17,5%, 18%, 18,5%, 19%, 19,5%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, ou 60% com relação a um par saudável.

Em determinadas modalidades, o aumento em produção de distrofina pode ser de cerca de 0,1% a 0,5%, 0,5% a 0,9%, 0,8% a 1%, 0,9% a 1,2%, 0,9% a 1,0%, 0,9% a 1,01%, 1% a 1,01%, 1% a 1,5%, 1,5% a 2%, 1,9% a 2,0%, 1,9% a 2,01%, 2% a 2,01%, 2% a 2,5%, 2,5% a 3%, 2,9% a 3,0%, 2,9% a 3,01%, 2% a 3,01%, 3% a 3,5%, 3,5% a 4%, 4% a 4,5%, 4,5% a 5%, 5% a 6%, 6% a 7%, 7% a 8%,

8% a 9%, 9% a 10%, 1% a 2%, 1% a 3%, 1% a 5%, 2% a 4%, 2% a 5%, 4% a 6%, 5% a 8%, 8% a 10%, 1% a 5%, 2% a 6%, 3% a 7%, 4% a 8%, 5% a 10%, 10% a 12%, 12% a 15%, 15% a 20%, 17% a 20%, 20% a 22%, 20% a 25%, 25% a 30% ou 30% a 35% com relação a um par saudável. Conforme usado no presente documento, os termos "produção de distrofina aumentada", "um aumento na produção de distrofina" ou semelhantes se referem a um aumento na produção de pelo menos uma dentre distrofina, uma proteína semelhante à distrofina ou uma proteína distrofina funcional no indivíduo.

[055]Uma quantidade "aumentada" ou "aprimorada" é tipicamente uma quantidade "estatisticamente significativa", e pode incluir um aumento que é de 1,1, 1,2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 ou mais vezes (por exemplo, 500, 1.000 vezes) (que inclui todos os números inteiros e pontos decimais entre e acima de 1, por exemplo, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) a quantidade produzida por oligonucleotídeo não antissenso (pela ausência de um agente) ou um composto de controle.

[056]O termo "reduz" ou "inibe" pode se referir, de modo geral, à habilidade de um ou mais compostos antissenso da invenção em "diminuir" uma resposta fisiológica ou celular relevante, tal como um sintoma de uma doença ou afecção descrito no presente documento, conforme medido de acordo com técnicas de rotina na técnica de diagnóstico. Respostas fisiológicas ou celulares relevantes (in vivo ou in vitro) estarão aparentes às pessoas versadas na técnica, e podem incluir reduções nos sintomas ou patologia da distrofia muscular, ou reduções na expressão de formas defeituosas de distrofina, tal como as formas alteradas de distrofina que são expressas em indivíduos com DMD ou BMD. Uma "diminuição" em uma resposta pode ser estatisticamente significativa em comparação com a resposta produzida por composto não antissenso ou uma composição de controle, e pode incluir uma diminuição de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%,

70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100%, que inclui todos os números inteiros entre as mesmas.

[057]Conforme usado no presente documento, os termos "função" e "funcional" e semelhantes se referem a uma função biológica, enzimática ou terapêutica.

[058]Uma proteína distrofina "funcional" se refere, de modo geral, a uma proteína distrofina que tem atividade biológica suficiente para reduzir a degradação progressiva de tecido muscular que é, de outra forma, característica da distrofia muscular, tipicamente, em comparação com a forma alterada ou "defeituosa" de proteína distrofina que está presente em determinados indivíduos com DMD ou BMD. Em determinadas modalidades, uma proteína distrofina funcional pode ter cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100% (que inclui todos os números inteiros entre as mesmas) da atividade biológica in vitro ou in vivo da distrofina de tipo selvagem, conforme medido de acordo com técnicas de rotina na técnica. Como um exemplo, a atividade relacionada à distrofina nas culturas de músculo in vitro pode ser medida de acordo com tamanho de miotubo, organização de miofibrila (ou desorganização), atividade contrátil e agrupamento espontâneo de receptores de acetilcolina (consultar, por exemplo, Brown et al., Journal of Cell Science. 112:209 a 216, 1999). Modelos animais também são recursos valiosos para estudar a patogênese da doença, e fornecer um meio para testar atividade relacionada à distrofina. Dois dos modelos animais mais amplamente usados para pesquisa de DMD são o camundongo mdx e o cão golden retriever com distrofia muscular (GRMD), em que ambos têm distrofina negativa (consultar, por exemplo, Collins & Morgan, Int J Exp Pathol 84: 165 a 172, 2003). Esses e outros modelos animais podem ser usados para medir a atividade funcional de várias proteínas distrofina. São incluídas formas truncadas de distrofina, tal como aquelas formas que são produzidas por determinados oligonucleotídeos antissenso de salto de éxon da presente revelação.

[059]Os termos "morfolino", "oligômero de morfolino" ou "PMO" se referem a um oligômero de morfolino de fosforodiamidato da seguinte estrutura geral: e conforme descrito na Figura 2 de Summerton, J., et al., Antisense & Nucleic Acid Drug Development, 7: 187 a 195 (1997). Morfolinos, conforme descrito no presente documento, são destinados a cobrir todos os estereoisômeros (e misturas dos mesmos) e configurações da estrutura geral anterior. A síntese, as estruturas e as características de ligação de oligômeros de morfolino são detalhadas nos documentos de Patente nº U.S. 5.698.685, 5.217.866, 5.142.047, 5.034.506,

5.166.315, 5.521.063, 5.506.337, 8.076.476 e 8.299.206, em que todos estão incorporados no presente documento a título de referência. Em determinadas modalidades, um morfolino é conjugado na extremidade 5’ ou 3’ do oligômero com uma porção química de “cauda” para aumentar sua estabilidade e/ou solubilidade. Caudas exemplificativas incluem: (1)

(2) (3)

[060]“Golodirsen", também conhecido por seu nome em código "SRP-4053" é um PMO que tem a sequência de base 5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3' (SEQ ID NO:1). Golodirsen está registrado sob Número de Registro CAS 1422959- 91-8. Nomes químicos incluem: all-P-ambo-[P,2',3'-trideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'- imino-2',3'-seco](2'a5')(G-T-T-G-C-C-T-C-C-G-G-T-T-C-T-G-A-A-G-G-T-G-T-T-C) 5'-[4-({2-[2-(2-hidroxietoxi)etoxi]etoxi}carbonil)-N,N-dimetilpiperazina-1- fosfonamidato]

Golodirsen tem a seguinte estrutura:

(SEQ ID NO:1)

E também é representado pela seguinte estrutura química:

A sequência de bases da extremidade 5' até a extremidade 3'

GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC (SEQ ID NO:1)

[061]Para fins de clareza, as estruturas da revelação que incluem, por exemplo, a estrutura acima de golodirsen, são contínuas de 5' a 3', e, pela conveniência de representar a estrutura inteira de uma forma compacta, várias quebras de ilustrações marcadas "QUEBRA A" e "QUEBRA B" foram incluídas. Conforme seria entendido pelo especialista, por exemplo, cada indicação de "QUEBRA A" mostra uma continuação da ilustração da estrutura desses pontos. O especialista entende que o mesmo é verdadeiro para cada exemplo de "QUEBRA B" nas estruturas acima. Nenhuma das quebras de ilustração, no entanto, deve indicar, nem o especialista entenderia as mesmas como uma descontinuação real da estrutura acima.

[062]Conforme usado no presente documento, um conjunto de colchetes usados dentro de uma fórmula estrutural indicam que o recurso estrutural entre os colchetes é repetido. Em algumas modalidades, os colchetes usados podem ser "[" e "]" e em determinadas modalidades, os colchetes usados para indicar recursos estruturais repetidos podem ser "(" e ")". Em algumas modalidades, o número de iterações de repetição do recurso estrutural entre os colchetes é o número indicado fora dos colchetes, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7 e assim por diante. Em várias modalidades, o número de iterações de repetição do recurso estrutural entre os colchetes é indicado por uma variável indicada fora dos colchetes, tal como "Z".

[063]Conforme usado no presente documento, uma atração de ligação para carbono quiral ou átomo de fósforo dentro de uma ligação linear ou uma fórmula estrutural de ligação embaralhada indica que a estereoquímica do carbono quiral ou fósforo é indefinida e deve incluir todas as formas do centro quiral. Exemplos de tais ilustrações estão representados abaixo: .

[064]As frases "administração parenteral" e "administrado por via parenteral" conforme usadas no presente documento significam os modos de administração diferentes da administração entérica e tópica, normalmente através de injeção, e incluem, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal e intraesternal.

[065]A frase "farmaceuticamente aceitável" significa que a substância ou composição deve ser compatível, química e/ou toxicologicamente, com os outros ingredientes que compreendem uma formulação, e/ou o indivíduo que é tratado com a mesma.

[066]A frase "carreador farmaceuticamente aceitável" conforme usada no presente documento significa um sólido inerte não tóxico, carga semissólida ou líquida, diluente, material de encapsulação ou auxiliar de formulação de qualquer tipo. Alguns exemplos de materiais que podem servir como carreadores farmaceuticamente aceitáveis são açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; amidos, tais como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados, tais como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; adragante em pó; malte; gelatina; talco; excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras de supositório; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de colza, óleo de sésamo, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de soja; glicóis; tais como propilenoglicol; ésteres, tais como oleato de etila e laurato de etila; ágar; agentes tamponantes, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água livre de pirogênio; solução salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico e soluções de tampão de fosfato, assim como outros lubrificantes compatíveis não tóxicos, tais como sulfato de laurila de sódio e estearato de magnésio, assim como agentes corantes, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes edulcorantes, saborizantes e perfumantes, conservantes e antioxidantes também podem estar presentes na composição, de acordo com o julgamento do formulador.

[067]O termo "restauração" de síntese ou produção de distrofina se refere, de modo geral, à produção de uma proteína distrofina que inclui formas truncadas de distrofina em um paciente com distrofia muscular pós-tratamento com um oligômero antissenso, conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, o tratamento resulta em um aumento na produção de distrofina em um paciente em 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% (que inclui todos os números inteiros entre as mesmas). Em algumas modalidades, o tratamento aumenta o número de fibras de distrofina positiva em pelo menos 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90 % ou cerca de 95% a 100% do normal no indivíduo. Em outras modalidades, o tratamento aumenta o número de fibras de distrofina positiva em cerca de 20% a cerca de 60%

ou cerca de 30% a cerca de 50% do normal no indivíduo. O percentual de fibras de distrofina positiva em um paciente pós-tratamento pode ser determinado por uma biopsia muscular que usa técnicas conhecidas. Por exemplo, uma biopsia muscular pode ser tirada de um músculo adequado, tal como o músculo do bíceps braquial em um paciente.

[068]Análise da porcentagem de fibras de distrofina positiva pode ser realizada pré-tratamento e/ou pós-tratamento ou em pontos no tempo ao longo do curso do tratamento. Em algumas modalidades, uma biopsia pós-tratamento é tirada a partir do músculo contralateral da biopsia pré-tratamento. Estudos de expressão de distrofina pré e pós-tratamento podem ser realizados com o uso de qualquer ensaio adequado para distrofina. Em algumas modalidades, a detecção imuno-histoquímica é realizada nas seções de tecido a partir da biopsia muscular com o uso de um anticorpo que é um marcador para distrofina, tal como um anticorpo monoclonal ou policlonal. Por exemplo, o anticorpo MANDYS106 pode ser usado, o qual é um marcador altamente sensível para distrofina. Qualquer anticorpo secundário adequado pode ser usado.

[069]Em algumas modalidades, o percentual de fibras de distrofina positiva é calculado dividindo-se o número de fibras positivas pelo total de fibras contadas. Amostras de músculo normal têm 100% de fibras de distrofina positiva. Portanto, o percentual de fibras de distrofina positiva pode ser expresso como uma porcentagem do normal. Para controlar a presença de níveis vestigiais de distrofina no músculo pré- tratamento, assim como fibras revertentes, uma linha de referência pode ser definida com o uso de seções de músculos pré-tratamento a partir de cada paciente ao contar fibras de distrofina positiva nos músculos pós-tratamento. Isso pode ser usado como um limite para contar fibras de distrofina positiva em seções de músculo pós- tratamento nesse paciente. Em outras modalidades, seções de tecido marcadas com anticorpo também podem ser usadas para quantificação de distrofina com o uso do software de análise de imagem Bioquant (Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, TN). A intensidade de sinal de fluorescência de distrofina total pode ser relatada como uma porcentagem do normal. Adicionalmente, análise de Western blot com anticorpos anti-distrofina monoclonais ou policlonais pode ser usada para determinar a porcentagem de fibras de distrofina positiva. Por exemplo, o anticorpo anti-distrofina NCL-Dys1 da Novacastra pode ser usado. A porcentagem de fibras de distrofina positiva também pode ser analisada determinando-se a expressão dos componentes do complexo de sarcoglicano (βγ) e/ou NOS neuronal.

[070]Em algumas modalidades, o tratamento com um oligômero antissenso da revelação, tal como golodirsen, retarda ou reduz a disfunção e/ou falha de músculo respiratório progressiva em pacientes com DMD que seria esperada sem tratamento. Em algumas modalidades, o tratamento com um oligômero antissenso da revelação pode reduzir ou eliminar a necessidade por auxílio de ventilação que seria esperada sem tratamento. Em algumas modalidades, medições de função respiratória para rastrear o curso da doença, assim como a avaliação de potenciais intervenções terapêuticas incluem pressão inspiratória máxima (MIP), pressão expiratória máxima (MEP) e capacidade vital forçada (FVC). MIP e MEP medem o nível de pressão que uma pessoa pode gerar durante inalação e exalação, respectivamente, e são medidas sensíveis de força do músculo respiratório. MIP é uma medida de fraqueza do músculo diafragma.

[071]Em algumas modalidades, MEP pode diminuir antes das alterações em outros testes de função pulmonar, que incluem MIP e FVC. Em determinadas modalidades, MEP pode ser um indicador precoce de disfunção respiratória. Em determinadas modalidades, FVC pode ser usada para medir o volume total de ar expelido durante a exalação forçada após inspiração máxima. Em pacientes com DMD, FVC aumenta concomitantemente com o crescimento físico até o início da juventude. No entanto, conforme o crescimento diminui ou é prejudicado pela progressão da doença, e a fraqueza muscular avança, a capacidade vital entra em uma fase descendente e diminui em uma taxa média de cerca de 8 a 8,5 por cento por ano após 10 a 12 anos de idade. Em determinadas modalidades, a porcentagem de MIP prevista (MIP ajustada por peso), a porcentagem de MEP prevista (MEP ajustada por idade) e a porcentagem de FVC prevista (FVC ajustada por idade e altura) são análises de apoio.

[072]Um "indivíduo" ou "paciente", conforme usado no presente documento, inclui qualquer animal que exibe um sintoma, ou está em risco de exibir um sintoma, que pode ser tratado com um oligonucleotídeo antissenso da revelação, tal como um indivíduo que tem ou está em risco de ter DMD ou BMD, ou qualquer um dos sintomas associados a essas afecções (por exemplo, perda de fibra muscular). Indivíduos adequados (pacientes) incluem animais de laboratório (tais como camundongo, rato, coelho ou porquinho-da-índia), animais de fazenda e animais domésticos ou de estimação (tal como um gato ou cão). Primatas não humanos e, preferencialmente, pacientes humanos, são incluídos. Também estão incluídos métodos para produzir distrofina em um indivíduo que tem uma mutação do gene de distrofina que é suscetível ao salto de éxon 53.

[073]Um "paciente pediátrico", conforme usado no presente documento, é um paciente de 1 a 21 anos de idade, inclusive.

[074]As frases "administração sistêmica", "administrado sistematicamente", "administração periférica" e "administrado perifericamente", conforme usadas no presente documento, significam a administração de um composto, fármaco ou outro material diferente daquela diretamente no sistema nervoso central, de modo que a mesma entre no sistema do paciente e, assim, seja submetida ao metabolismo e outros processos semelhantes, por exemplo, administração subcutânea.

[075]“Administração crônica”, conforme usado no presente documento, se refere à administração terapêutica a longo prazo regular e contínua, isto é,

administração periódica sem interrupção substancial. Por exemplo, diariamente, durante um período de tempo de pelo menos diversas semanas ou meses ou anos, com o propósito de tratar distrofia muscular em um paciente. Por exemplo, semanalmente, durante um período de tempo de pelo menos alguns meses ou anos, com o propósito de tratar distrofia muscular em um paciente (por exemplo, semanalmente por pelo menos seis semanas, semanalmente por pelo menos 12 semanas, semanalmente por pelo menos 24 semanas, semanalmente por pelo menos 48 semanas, semanalmente por pelo menos 72 semanas, semanalmente por pelo menos 96 semanas, semanalmente por pelo menos 120 semanas, semanalmente por pelo menos 144 semanas, semanalmente por pelo menos 168 semanas, semanalmente por pelo menos 180 semanas, semanalmente por pelo menos 192 semanas, semanalmente por pelo menos 216 semanas ou semanalmente por pelo menos 240 semanas).

[076]"Administração periódica", conforme usado no presente documento, se refere à administração com um intervalo entre doses. Por exemplo, a administração periódica inclui a administração em intervalos fixos (por exemplo, semanalmente, mensalmente) que podem ser recorrentes.

[077]"Placebo", conforme usado no presente documento, se refere a uma substância que não tem efeito terapêutico e pode ser usada como um controle.

[078]“Controle de placebo", conforme usado no presente documento, se refere a um indivíduo ou paciente que recebe um placebo em vez da terapia de combinação, oligonucleotídeo antissenso, composto anti-inflamatório não esteroide e/ou outra composição farmacêutica. O controle de placebo pode ter a mesma situação de mutação, ser de idade similar, habilidade similar em se mover e/ou receber as mesmas medicações concomitante (que incluem esteroides, etc.), que o indivíduo ou paciente.

[079]A frase "sequência de alvejamento", "sequência de base" ou "sequência de nucleobases" se refere a uma sequência de nucleobases de um oligômero que é complementar a uma sequência de nucleotídeos em um pré-mRNA-alvo. Em algumas modalidades da revelação, a sequência de nucleotídeos no pré-mRNA-alvo é um sítio de anelamento de éxon 53 no pré-mRNA de distrofina designado como H53A(+36+60).

[080]“Tratamento” de um indivíduo (por exemplo, um mamífero, tal como um ser humano) ou uma célula é qualquer tipo de intervenção usada em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo ou célula. Tratamento inclui, porém, sem limitação, administração de um oligômero ou uma composição farmacêutica do mesmo, e pode ser realizada profilaticamente ou subsequente à iniciação de um evento patológico ou contato com um agente etiológico. Tratamento inclui qualquer efeito desejável sobre os sintomas ou patologia de uma doença ou afecção associada à proteína distrofina, como em determinadas formas de distrofia muscular, e pode incluir, por exemplo, alterações mínimas ou melhoramentos em um ou mais marcadores mensuráveis da doença ou afecção que é tratada. Também são incluídos tratamentos “profiláticos”, que podem ser direcionados à redução da taxa de progressão da doença ou afecção que é tratada, ao atraso do início dessa doença ou afecção ou à redução da gravidade de seu início. "Tratamento" ou "profilaxia" não indica necessariamente a erradicação completa, cura ou prevenção da doença ou afecção, ou sintomas associados da mesma.

[081]Em algumas modalidades, o tratamento com um oligômero antissenso da revelação aumenta a produção de distrofina, atrasa a progressão de doença, retarda ou reduz a perda de deambulação, reduz inflamação muscular, reduz dano muscular, melhora a função do músculo, reduz a perda de função pulmonar e/ou aprimora a regeneração muscular que seria esperada sem tratamento ou que seria esperada sem tratamento. Em algumas modalidades, o tratamento mantém, atrasa ou retarda a progressão de doença. Em algumas modalidades, o tratamento mantém deambulação ou reduz a perda de deambulação. Em algumas modalidades, o tratamento mantém a função pulmonar ou reduz a perda de função pulmonar. Em algumas modalidades, o tratamento mantém ou aumenta uma distância de caminhada estável em um paciente, conforme medido, por exemplo, pelo Teste de Caminhada de 6 Minutos (6MWT). Em algumas modalidades, o tratamento mantém ou reduz o tempo para andar/correr 10 metros (isto é, o teste de andar/correr 10 metros). Em algumas modalidades, o tratamento mantém ou reduz o tempo para se levantar da posição supina (isto é, teste de tempo para se levantar). Em algumas modalidades, o tratamento mantém ou reduz o tempo para subir quatro escadas normais (isto é, o teste de escalar quatro escadas). Em algumas modalidades, o tratamento mantém ou reduz inflamação muscular no paciente, conforme medido, por exemplo, por ressonância magnética (por exemplo, ressonância magnética dos músculos das pernas). Em algumas modalidades, a ressonância magnética mede T2 e/ou fração de gordura para identificar degeneração muscular. A ressonância magnética pode identificar alterações na estrutura e composição muscular causadas por inflamação, edema, dano muscular e infiltração de gordura.

[082]Em algumas modalidades, o tratamento com um oligômero antissenso da revelação aumenta a produção de distrofina. Em algumas modalidades, a produção de distrofina aumentada é de cerca de 0,1%, 0,2% 0,3% 0,5%, 0,7%, 0,9%, 1%, 1,01%, 1,5%, 2%, 2,01%, 2,5%, 3%, 3,01%, 3,5%, 4%, 4,01%, 4,5%, 5%, 5,01%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5%, 15%, 15,5%, 16%, 16,5%, 17%, 17,5%, 18%, 18,5%, 19%, 19,5%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, ou 60% com relação a um par saudável. Em determinadas modalidades, o aumento em produção de distrofina pode ser de cerca de 0,1% a 0,5%, 0,5% a 0,9%, 0,8% a 1%, 0,9% a 1,2%, 0,9% a 1,0%, 0,9% a 1,01%, 1% a 1,01%, 1% a 1,5%, 1,5% a 2%, 1,9% a 2,0%, 1,9% a 2,01%, 2% a 2,01%, 2% a 2,5%, 2,5% a 3%, 2,9% a 3,0%, 2,9% a 3,01%, 2% a 3,01%, 3% a

3,5%, 3,5% a 4%, 4% a 4,5%, 4,5% a 5%, 5% a 6%, 6% a 7%, 7% a 8%, 8% a 9%, 9% a 10%, 1% a 2%, 1% a 3%, 1% a 5%, 2% a 4%, 2% a 5%, 4% a 6%, 5% a 8%, 8% a 10%, 1% a 5%, 2% a 6%, 3% a 7%, 4% a 8%, 5% a 10%, 10% a 12%, 12% a 15%, 15% a 20%, 17% a 20%, 20% a 22%, 20% a 25%, 25% a 30% ou 30% a 35% com relação a um par saudável.

[083]Em determinadas modalidades, o tratamento com um oligômero antissenso da revelação aumenta a produção de distrofina e retarda ou reduz a perda de deambulação que seria esperada sem tratamento. Por exemplo, o tratamento pode estabilizar, manter, melhorar ou aumentar habilidade de andar (por exemplo, estabilização de deambulação) no indivíduo. Em algumas modalidades, o tratamento mantém ou aumenta uma distância de caminhada estável em um paciente, conforme medido, por exemplo, pelo Teste de Caminhada de 6 Minutos (6MWT), descrito por McDonald, et al. (Muscle Nerve, 2010; 42:966 a 74, incorporado no presente documento a título de referência). Uma alteração na Distância de Caminhada de 6 Minutos (6MWD) pode ser expressa como um valor absoluto, uma alteração de porcentagem ou uma alteração no valor de % previsto. Em algumas modalidades, o tratamento mantém ou melhora uma distância de caminhada estável em um 6MWT de um défice de 20% no indivíduo com relação a um par saudável. O desempenho de um paciente com DMD no 6MWT com relação ao desempenho típico de um par saudável pode ser determinado calculando-se um valor de % previsto. Por exemplo, a % prevista de 6MWD pode ser calculada com o uso da seguinte equação para machos: 196,72 + (39,81 x idade) – (1,36 x idade2) + (132,28 x altura em metros). Para fêmeas, a % prevista de 6MWD pode ser calculada com o uso da seguinte equação: 188,61 + (51,50 x idade) – (1,86 x idade2) + (86,10 x altura em metros) (Henricson et al., PLoS Curr., 2012, versão 2, incorporado no presente documento a título de referência).

[084]Em algumas modalidades, o tratamento com um oligômero antissenso aumenta a distância de caminhada estável no paciente da linha de referência para mais que 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 ou 50 metros (que inclui todos os números inteiros entre os mesmos). Em algumas modalidades, a produção de distrofina aumentada é de cerca de 0,1%, 0,2% 0,3% 0,5%, 0,7%, 0,9%, 1%, 1,01%, 1,5%, 2%, 2,01%, 2,5%, 3%, 3,01%, 3,5%, 4%, 4,01%, 4,5%, 5%, 5,01%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5%, 15%, 15,5%, 16%, 16,5%, 17%, 17,5%, 18%, 18,5%, 19%, 19,5%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, ou 60% com relação a um par saudável. Em determinadas modalidades, o aumento em produção de distrofina pode ser de cerca de 0,1% a 0,5%, 0,5% a 0,9%, 0,8% a 1%, 0,9% a 1,2%, 0,9% a 1,0%, 0,9% a 1,01%, 1% a 1,01%, 1% a 1,5%, 1,5% a 2%, 1,9% a 2,0%, 1,9% a 2,01%, 2% a 2,01%, 2% a 2,5%, 2,5% a 3%, 2,9% a 3,0%, 2,9% a 3,01%, 2% a 3,01%, 3% a 3,5%, 3,5% a 4%, 4% a 4,5%, 4,5% a 5%, 5% a 6%, 6% a 7%, 7% a 8%, 8% a 9%, 9% a 10%, 1% a 2%, 1% a 3%, 1% a 5%, 2% a 4%, 2% a 5%, 4% a 6%, 5% a 8%, 8% a 10%, 1% a 5%, 2% a 6%, 3% a 7%, 4% a 8%, 5% a 10%, 10% a 12%, 12% a 15%, 15% a 20%, 17% a 20%, 20% a 22%, 20% a 25%, 25% a 30% ou 30% a 35% com relação a um par saudável.

[085]A perda de função do músculo em pacientes com DMD pode ocorrer contra o antecedente de crescimento e desenvolvimento durante a infância normal. De fato, crianças mais novas com DMD podem mostrar um aumento em distância caminhada durante 6MWT durante o curso de cerca de 1 ano apesar da deficiência muscular progressiva. Em algumas modalidades, a 6MWD de pacientes com DMD é comparada com indivíduos de controle tipicamente em desenvolvimento e com dados normativos existentes de indivíduos de idade e sexo correspondentes. Em algumas modalidades, o crescimento e desenvolvimento normais podem ser explicados pelo uso de uma equação com base na idade e altura ajustada aos dados normativos. Tal equação pode ser usada para converter 6MWD em um valor de porcentagem previsto

(% prevista) em indivíduos com DMD. Em determinadas modalidades, a análise de dados de % prevista de 6MWD representa um método para explicar o crescimento e desenvolvimento normais, e pode mostrar que os ganhos na função nas idades precoces (por exemplo, menor ou igual a 7 anos de idade) representam habilidades estáveis em vez de melhoradas em pacientes com DMD (Henricson et al., PLoS Curr., 2012, versão 2, incorporado no presente documento a título de referência).

[086]Um sistema de nomenclatura de molécula antissenso foi proposto e publicado para distinção entre as diferentes moléculas antissenso (consultar Mann et al. (2002) J Gen Med 4, 644 a 654). Essa nomenclatura se tornou especialmente relevante ao testar diversas moléculas antissenso levemente diferentes, todas direcionadas na mesma região-alvo, conforme mostrado abaixo: H#A/D(x:y).

[087]A primeira letra designa a espécie (por exemplo, H: ser humano, M: murino, C: canino). “#” designa o número de éxon de distrofina-alvo. “A/D” indica sítio de splice aceitante ou doador no começo e fim do éxon, respectivamente. (x y) representa as coordenadas de anelamento em que "-" ou "+" indicam sequências intrônicas ou exônicas, respectivamente. Por exemplo, A(-6+18) indicaria as últimas 6 bases do íntron anteriores ao éxon-alvo e as primeiras 18 bases do éxon-alvo. O sítio de splice mais próximo seria o aceitante, assim, essas coordenadas seriam antecedidas por um "A". Descrever coordenadas de anelamento no sítio de splice doador seria D(+2-18), em que as últimas 2 bases exônicas e as primeiras 18 bases intrônicas correspondem ao sítio de anelamento da molécula antissenso. Coordenadas de anelamento inteiramente exônicas que seriam representadas por A(+65+85), isto é, o sítio entre o 65o e 85o nucleotídeo a partir do início desse éxon. II.Oligonucleotídeos antissenso

[088]Oligonucleotídeos antissenso que alvejam o pré-mRNA do gene de distrofina para efetuar o salto de éxon 53 são usados de acordo com os métodos desta revelação.

[089]Tal oligonucleotídeo antissenso pode ser projetado para bloquear ou inibir a tradução de mRNA ou inibir o processamento de splice de pré-mRNA natural, e pode-se dizer que é "direcionado para" ou "alvejado contra" uma sequência-alvo com a qual hibridiza. A sequência-alvo é tipicamente uma região que inclui um códon de partida AUG de um mRNA, um Oligômero de Supressão de Tradução, ou sítio de splice de um mRNA pré-processado, um Oligômero de Supressão de Splice (SSO). A sequência-alvo para um sítio de splice pode incluir uma sequência de mRNA que tem sua extremidade 5’ de 1 a cerca de 25 pares de base a jusante de uma junção aceitante de splice normal em um mRNA pré-processado. Em algumas modalidades, uma sequência-alvo pode ser qualquer região de um mRNA pré-processado que inclui um sítio de splice ou está contida inteiramente em uma sequência codificadora de éxon ou abrange um sítio aceitante ou doador de splice. Um oligômero é dito, de modo mais geral, "alvejado contra" um alvo biologicamente relevante, tal como uma proteína, vírus ou bactéria, quando é alvejado contra o ácido nucleico do alvo da maneira descrita acima.

[090]Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso hibridiza especificamente em uma região-alvo de éxon 53 do pré-mRNA de Distrofina e induz o salto de éxon 53. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso que hibridiza em uma região-alvo de éxon 53 do pré-mRNA de Distrofina e induz o salto de éxon 53 é um Oligômero de Morfolino de Fosforodiamidato (PMO).

[091]Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso é golodirsen.

[092]Golodirsen pertence a uma distinta classe de produtos terapêuticos de RNA antissenso sintéticos inovadores denominada Oligômeros de Morfolino de Fosforodiamidato (PMO), que são uma remodelação da estrutura de ácido nucleico natural. Golodirsen é um PMO que hibridiza em uma região-alvo de éxon 53 do pré-

mRNA de Distrofina e induz salto de éxon 53. Golodirsen pode ser preparado por síntese de fase sólida gradual, empregando-se métodos detalhados nas referências citadas acima, e adicionalmente no Pedido de Patente Internacional nº de Série PCT/US17/40318 cuja totalidade está expressamente incorporada a título de referência no presente documento.

[093]PMOs oferecem potenciais vantagens clínicas com base em observações não clínicas in vivo. PMOs incorporam modificações no anel de açúcar de RNA que protege o mesmo da degradação enzimática através de nucleases de modo a assegurar a estabilidade in vivo. PMOs são distinguidas dos ácidos nucleicos naturais e outras classes de oligonucleotídeo antissenso, em parte, através do uso de anéis de morfolino sintéticos com 6 membros, que substituem os anéis de ribofuranosila com 5 membros encontrados em RNA, DNA e diversos outros oligonucleotídeos de RNA antissenso sintéticos.

[094]As ligações de fosforodiamidato não carregadas específicas para PMOs são consideradas por potencialmente conferir ligação às proteínas fora do alvo reduzida. PMOs têm uma ligação de fosforodiamidato não carregada que liga cada anel de morfolino em vez da ligação de fosforotioato negativamente carregada usada em outros oligonucleotídeos de RNA antissenso sintéticos de estágio clínico.

[095]Uma potencial abordagem terapêutica para o tratamento de DMD causada por mutações fora do quadro no gene de DMD é sugerida pela forma mais leve de distrofinopatia conhecida como BMD, que é causada por mutações dentro do quadro. A habilidade em converter uma mutação fora do quadro em uma mutação dentro do quadro preservaria, hipoteticamente, o quadro de leitura de mRNA e produziria uma proteína distrofina internamente encurtada, porém, funcional. Golodirsen foi projetada para realizar isso.

[096]Golodirsen alveja pré-mRNA de distrofina e induz salto de éxon 53, assim, é excluído ou omitido da transcrição de mRNA com splice madura. Ao saltar éxon 53, o quadro de leitura rompido é restaurado em uma mutação dentro do quadro. Embora DMD seja compreendida por vários subtipos genéticos, golodirsen foi especificamente projetado para saltar éxon 53 de pré-mRNA de distrofina. Mutações de DMD suscetíveis ao salto de éxon 53 incluem deleções de éxons contíguos ao éxon 53 (isto é, que incluem a deleção de éxon 52 ou éxon 54), e compreendem um subgrupo de pacientes com DMD (8%).

[097]A sequência de 25 nucleobases de golodirsen é projetada para ser complementar a uma sequência-alvo específica dentro de éxon 53 de pré-mRNA de distrofina. Cada anel de morfolino em golodirsen está ligado a um dentre quatro nucleobases heterocíclicas encontradas em DNA (adenina, citosina, guanina e timina).

[098]Hibridização de golodirsen com a sequência de pré-mRNA alvejada interfere com a formação do complexo de splicing de pré-mRNA e deleta éxon 53 do mRNA maduro. A estrutura e conformação de golodirsen permitem o pareamento de base de sequência específica com a sequência complementar. Por exemplo, eteplirsen, que é um PMO que foi projetado para saltar éxon 51 de pré-mRNA de distrofina permite o pareamento de base de sequência específica com a sequência complementar contida no éxon 51 de pré-mRNA de distrofina. Restauração do Quadro de Leitura de Distrofina com o uso de Salto de Éxon

[099]mRNA de distrofina normal que contém todos os 79 éxons produzirá a proteína distrofina normal.

[0100]mRNA de Distrofina sem éxons inteiros do gene de distrofina resultam, tipicamente, em DMD.

[0101]Outro PMO de salto de éxon, eteplirsen, salta éxon 51 para restaurar o quadro de leitura de mRNA. Visto que o éxon 49 termina em um códon completo e o éxon 52 começa com o primeiro nucleotídeo de um códon, a deleção de éxon 51 por salto de éxon restaura o quadro de leitura, o que resulta em produção de uma proteína distrofina internamente encurtada com um sítio de ligação de distroglicano intacto.

[0102]A viabilidade de amenizar o fenótipo de DMD com o uso de salto de éxon para restaurar o quadro de leitura aberto de mRNA de distrofina é sustentada pela pesquisa não clínica. Diversos estudos nos modelos animais distróficos de DMD mostraram que a restauração de distrofina através de salto de éxon resulta em melhoramentos confiáveis em força e função muscular (Sharp 2011; Yokota 2009; Wu 2008; Wu 2011; Barton-Davis 1999; Goyenvalle 2004; Gregorevic 2006; Yue 2006; Welch 2007; Kawano 2008; Reay 2008; van Putten 2012). Um exemplo convincente disso vem de um estudo no qual os níveis de distrofina depois da terapia de salto de éxon (com o uso de um PMO) foram comparados com a função do músculo no mesmo tecido. Em camundongos mdx distróficos, os músculos tibiais anteriores (TA) tratados com um PMO de camundongo específico mantiveram ~75% de capacidade de força máxima após contrações induzidas por estresse, enquanto músculos TA contralateral não tratados mantiveram apenas ~25% de sua capacidade de força máxima (p < 0,05) (Sharp 2011). Em outro estudo, 3 cães com CXMD distróficos receberam na (2 a 5 meses de idade) terapia de salto de éxon com o uso de um PMO específico para sua mutação genética uma vez por semana por 5 a 7 semanas ou em semanas alternadas por 22 semanas. Depois da terapia de salto de éxon, todos os 3 cães demonstraram expressão extensiva pelo corpo de distrofina em músculo esquelético, assim como mantiveram ou melhoraram deambulação (teste de corrida de 15 m) com relação à linha de referência. Por outro lado, cães CXMD de idade correspondente não tratados demonstraram uma diminuição significativa em deambulação durante o curso do estudo (Yokota 2009).

[0103]PMOs demonstraram ter mais atividade de salto de éxon em concentrações equimolares do que fosforotioatos tanto em camundongos mdx quanto no modelo de camundongo com DMD humanizada (hDMD), que expressa a transcrição de DMD humana inteira (Heemskirk 2009). Experimentos in vitro que usam reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) e Western blot (WB) em células de músculo esquelético humano normal ou células musculares de pacientes com DMD com diferentes mutações suscetíveis ao salto de éxon 51 identificaram eteplirsen (um PMO) como um indutor potente de salto de éxon 51. Salto de éxon 51 induzido por eteplirsen foi confirmado in vivo no modelo de camundongo com hDMD (Arechavala-Gomeza 2007).

[0104]Resultados clínicos para analisar o efeito de um oligonucleotídeo antissenso que hibridiza especificamente com uma região-alvo de éxon 53 do pré- mRNA de Distrofina e induz salto de éxon 53 incluem um aumento da linha de referência de porcentagem de fibras de distrofina positiva (PDPF), teste de caminhada de 6 minutos (6MWT), perda de deambulação (LOA), Avaliação Ambulatória North Star (NSAA), testes de função pulmonar (PFT), habilidade em levantar (de uma posição supina) sem apoio externo, produção de distrofina de novo e outras medições funcionais.

[0105]Golodirsen foi estudado em estudos clínicos. Estudo 4053-101

[0106]Estudo 4053-101 é um estudo de Fase I/II de SRP-4053 (golodirsen) em pacientes com DMD. Esse estudo é um Estudo de 2 Partes, Aleatorizado, Duplamente Cego, Controlado por Placebo, Titulação de Dose, Segurança, Tolerabilidade e Farmacocinética (Parte 1) Seguido por uma Avaliação de Eficácia e Segurança Aberta (Parte 2) de SRP-4053 em Pacientes com Distrofia Muscular de Duchenne Suscetível ao Salto de Éxon 53. Medições de resultado primário incluem Incidência de Eventos Negativos [Período de Tempo: aproximadamente 12 semanas (Parte 1)], Alteração em Teste de Caminhada de 6 Minutos (6MWT) a partir da Linha de Referência [Período de Tempo: 144 semanas (Parte 2)] e Porcentagem de fibras de distrofina positiva [Período de Tempo: 48 semanas (Parte 2)]. Medições de resultado secundário incluem concentração de fármaco em plasma [Período de

Tempo: Aproximadamente 12 semanas (Parte 1)], % prevista de Pressão Inspiratória Máxima (MIP), % prevista de Pressão Expiratória Máxima (MEP) [Período de Tempo: 144 semanas (Parte 2)]. Detalhes adicionais desse estudo são encontrados em www.clinicaltrials.gov (NCT02310906). III.Formulações e Modos de Administração

[0107]Em determinadas modalidades, a presente revelação fornece formulações ou composições farmacêuticas adequadas para a entrega terapêutica de oligonucleotídeos antissenso, conforme descrito no presente documento. Portanto, em determinadas modalidades, a presente revelação fornece composições farmaceuticamente aceitáveis que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais dentre os oligonucleotídeos antissenso descritos no presente documento, formulados juntamente com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis (aditivos) e/ou diluentes. Embora seja possível que um oligonucleotídeo antissenso da presente revelação seja administrado sozinho, é preferencial administrar o composto como uma formulação farmacêutica (composição).

[0108]Métodos para a entrega de moléculas de ácido nucleico são descritos, por exemplo, em Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2:139; e Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar; Sullivan et al., PCT WO 94/02595. Esses e outros protocolos podem ser utilizados para a entrega de virtualmente qualquer molécula de ácido nucleico, que inclui os oligonucleotídeos antissenso da presente revelação.

[0109]Conforme detalhado abaixo, as composições farmacêuticas da presente revelação podem ser especialmente formuladas para administração em forma sólida ou líquida, que inclui aquelas adaptadas para o seguinte: (1) administração oral, por exemplo, pulverizações de água (soluções ou suspensões aquosas ou não aquosas), comprimidos, por exemplo, aqueles alvejados para absorção bucal, sublingual e sistêmica, bolus, pós, grânulos, pastas para aplicação na língua; (2) administração parenteral, por exemplo, através de injeção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou epidural como, por exemplo, uma solução ou suspensão estéril, ou formulação de liberação prolongada; (3) aplicação tópica, por exemplo, como um creme, pomada ou um adesivo de liberação controlada ou aspersão aplicada na pele; (4) por via intravaginal ou intrarretal, por exemplo, como um pessário, creme ou espuma; (5) por via sublingual; (6) por via ocular; (7) por via transdérmica; ou (8) por via nasal.

[0110]Alguns exemplos de materiais que podem servir como carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, sem limitação: (1) açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; (2) amidos, tais como amido de milho e amido de batata; (3) celulose e seus derivados, tais como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; (4) agradante em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras supositórias; (9) óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de cártamo, óleo de sésamo, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, tais como propilenoglicol; (11) polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; (12) ésteres, tais como oleato de etila e laurato de etila; (13) ágar; (14) agentes tamponantes, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água livre de pirogênio; (17) solução salina isotônica; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções de pH tamponado; (21) poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; e (22) outras substâncias compatíveis não tóxicas empregadas em formulações farmacêuticas.

[0111]Exemplos sem limitação adicionais de agentes adequados para formulação com os oligonucleotídeos antissenso da presente revelação incluem: ácidos nucleicos de PEG conjugado; ácidos nucleicos de fosfolipídio conjugado; ácidos nucleicos que contêm porções químicas lipofílicas; fosforotioatos; inibidores de P-glicoproteína (tais como Pluronic P85) que pode aprimorar a entrada de fármacos em vários tecidos; polímeros biodegradáveis, tais como microesferas de poli(DL- lactídeo-coglicólido) para entrega de liberação prolongada após implantação (Emerich, D F et al., 1999, Cell Transplant, 8, 47 a 58) Alkermes, Inc. Cambridge, Mass.; e nanopartículas carregadas, tais como aquelas produzidas a partir de polibutilcianoacrilato, que podem entregar fármacos através da barreira hematoencefálica e podem alterar os mecanismos de absorção neuronal (Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941 a 949, 1999).

[0112]A revelação também apresenta o uso da composição que compreende lipossomas de superfície modificada que contêm lipídios de poli(etilenoglicol) (PEG modificado, ramificado e não ramificado ou combinações dos mesmos, ou lipossomas de longa circulação ou lipossomas furtivos). Oligonucleotídeos antissenso da revelação também podem compreender moléculas de PEG covalentemente ligadas de vários pesos moleculares. Essas formulações oferecem um método para aumentar a acumulação de fármacos em tecidos alvo. Essa classe de carreadores de fármaco resiste à opsonização e eliminação pelo sistema fagocítico mononuclear (MPS ou RES), desse modo, se permite tempos de circulação sanguínea mais longos e exposição de tecido aprimorada para o fármaco encapsulado (Lasic et al., Chem. Rev. 1995, 95, 2.601 a 2.627; Ishiwata et al., Chem. Pharm Bull. 1995, 43, 1.005 a 1.011). Tais lipossomas se acumularam seletivamente em tumores, presumivelmente através do extravasamento e captura nos tecidos alvo neovascularizados (Lasic et al., Science 1995, 267, 1.275 a 1.276; Oku et al., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86 a 90). Os lipossomas de longa circulação aprimoram a farmacocinéticas e farmacodinâmicas de DNA e RNA, particularmente em comparação com lipossomas catiônicos convencionais que são conhecidos por se acumular em tecidos do MPS (Liu et al., J. Biol. Chem. 1995, 42, 24.864 a 24.870; Choi et al., Publicação PCT Internacional nº WO 96/10391; Ansell et al., Publicação PCT Internacional nº WO 96/10390; Holland et al., Publicação PCT Internacional nº WO 96/10392). Os lipossomas de longa circulação também são propensos a proteger fármacos da degradação de nuclease em um grau maior em comparação com lipossomas catiônicos, com base em sua capacidade em evitar a acumulação em tecidos de MPS metabolicamente agressivos, tais como o fígado e baço.

[0113]Em uma modalidade adicional, a presente revelação inclui composições farmacêuticas de oligonucleotídeo antissenso preparadas para entrega, conforme descrito nos documentos de Patente nº 6.692.911, 7.163.695 e 7.070.807. Com relação a isso, em uma modalidade, a presente revelação fornece um oligômero da presente revelação em uma composição que compreende copolímeros de lisina e histidina (HK) (conforme descrito nos documentos de Patente nº 7.163.695, 7.070.807 e 6.692.911) sejam sozinhos ou em combinação com PEG (por exemplo, PEG ramificado ou não ramificado ou uma mistura de ambos), em combinação com PEG e uma porção química de alvejamento, ou qualquer um dos supracitados em combinação com um agente de reticulação. Em determinadas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos antissenso em composições farmacêuticas que compreendem poli-histidina modificada com ácido glucônico ou poli-histidina gliconilada/polilisina de transferrina. Uma pessoa versada na técnica também reconhecerá que aminoácidos com propriedades similares a His e Lys podem ser substituídos dentro da composição.

[0114]Determinadas modalidades de oligonucleotídeos antissenso descritas no presente documento podem conter um grupo funcional básico, tal como amino ou alquilamino e, assim, têm capacidade para formar sais farmaceuticamente aceitáveis com ácidos farmaceuticamente aceitáveis. O termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" a esse respeito se refere aos sais de adição de ácido inorgânico e orgânico relativamente não tóxicos de compostos da presente revelação. Esses sais podem ser preparados in situ no veículo de administração ou no processo de fabricação de forma de dosagem, ou reagindo-se separadamente um composto purificado da revelação em sua forma de base livre com um ácido orgânico ou inorgânico adequado, e isolando-se o sal assim formado durante purificação subsequente. Sais representativos incluem os sais de bromidrato, cloridrato, sulfato, bissulfato, fosfato, nitrato, acetato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartarato, naftilato, mesilato, glicoeptonato, lactobionato e laurilsulfonato e semelhantes. (Consultar, por exemplo, Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1 a 19).

[0115]Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos oligonucleotídeos antissenso individuais incluem os sais não tóxicos convencionais ou sais de amônia quaternária dos compostos, por exemplo, dos ácidos orgânicos ou inorgânicos não tóxicos. Por exemplo, tais sais não tóxicos convencionais incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos, tais como clorídrico, bromídrico, sulfúrico, sulfâmico, fosfórico, nítrico e semelhantes; e os sais preparados dentre ácidos orgânicos, tais como ácido acético, propiônico, succínico, glicólico, esteárico, lático, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, palmítico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutâmico, benzoico, salicíclico, sulfanílico, 2-acetoxibenzoico, fumárico, toluenossulfônico, metanossulfônico, etanodissulfônico, oxálico, isotiônico e semelhantes.

[0116]Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso da presente revelação podem conter um ou mais grupos funcionais ácidos e, assim, têm capacidade para formar sais farmaceuticamente aceitáveis com bases farmaceuticamente aceitáveis. O termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" nesses casos, se refere aos sais de adição de base inorgânico e orgânico relativamente não tóxicos de compostos da presente revelação. Esses sais podem ser, da mesma forma, preparados in situ no veículo de administração ou no processo de fabricação de forma de dosagem, ou reagindo-se separadamente o composto purificado em sua forma de ácido livre com uma base adequada, tal como o hidróxido, carbonato ou bicarbonato de um cátion de metal farmaceuticamente aceitável, com amônia, ou com uma amina primária, secundária ou terciária orgânica farmaceuticamente aceitável. Sais alcalinos ou alcalinos terrosos representativos incluem os sais de lítio, sódio, potássio, cálcio, magnésio e alumínio e semelhantes. Aminas orgânicas representativas úteis para a formação de sais de adição de base incluem etilamina, dietilamina, etilenodiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina e semelhantes. (Consultar, por exemplo, Berge et al., supra).

[0117]Agentes umectantes, emulsificantes e lubrificantes, tais como sulfato de laurila de sódio e estearato de magnésio, assim como agentes corantes, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes perfumantes, conservantes e antioxidantes também podem estar presentes nas composições.

[0118]Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tal como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e semelhantes; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tal como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propilgalato, alfa-tocoferol e semelhantes; e (3) agentes quelantes de metal, tal como ácido cítrico, ácido tetra- acético de etilenodiamina (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e semelhantes.

[0119]Formulações da presente revelação incluem aquelas adequadas para administração oral, nasal, tópica (que inclui bucal e sublingual), retal, vaginal e/ou parenteral. As formulações podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem em unidade e podem ser preparadas por meio de qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica de farmácia. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material de carreador para produzir uma única forma de dosagem variará dependendo do hospedeiro que é tratado e do modo particular de administração. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material de carreador para produzir uma única forma de dosagem será, de modo geral, aquela quantidade do composto que produz um efeito terapêutico. De modo geral, de cem por cento, essa quantidade estará na faixa de cerca de 0,1 por cento a cerca de noventa e nove por cento de ingrediente ativo, preferencialmente de cerca de 5 por cento a cerca de 70 por cento, com máxima preferência de cerca de 10 por cento a cerca de 30 por cento.

[0120]Em determinadas modalidades, uma formulação da presente revelação compreende um excipiente selecionado a partir de ciclodextrinas, celuloses, lipossomas, agentes de formação de micela, por exemplo, ácidos biliares, e carreadores poliméricos, por exemplo, poliésteres e polianidridos; e um oligômero da presente revelação. Em determinadas modalidades, uma formulação mencionada acima rende de maneira oralmente biodisponível um oligômero da presente revelação.

[0121]Métodos para preparar essas formulações ou composições farmacêuticas incluem a etapa de ligar em associação um oligonucleotídeo antissenso da presente revelação com o carreador e, opcionalmente, um ou mais ingredientes auxiliares. Em geral, as formulações são preparadas ligando-se uniforme e intimamente em associação um composto da presente revelação com carreadores líquidos, ou carreadores sólidos finamente divididos, ou ambos e, então, caso necessário, conformando-se o produto.

[0122]Formulações da revelação adequadas para administração oral podem estar na forma de cápsulas, hóstias, pílulas, comprimidos, drágeas (com o uso de uma base saborizada, normalmente sacarose e acácia ou agradante), pós, grânulos, ou como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou não aquoso, ou como uma emulsão líquida de óleo em água ou água em óleo, ou como um elixir ou xarope, ou como pastilhas (com o uso de uma base inerte, tal como gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia) e/ou como enxaguantes e semelhantes, em que cada um contém uma quantidade predeterminada de um composto da presente revelação como um ingrediente ativo. Um oligonucleotídeo antissenso da presente revelação também pode ser administrado como um bolo, eleituário ou pasta.

[0123]Em formas de dosagem sólidas da revelação para administração oral (cápsulas, comprimidos, pílulas, drágeas, pós, grânulos, trouxas e semelhantes), o ingrediente ativo pode ser misturado com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis, tais como citrato de sódio ou fosfato dicálcico, e/ou qualquer um dos seguintes: (1) cargas ou extensores, tais como amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol e/ou ácido silícico; (2) ligantes, tais como, por exemplo, carboximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarose e/ou acácia; (3) umectantes, tal como glicerol; (4) agentes desintegrantes, tais como ágar-ágar, carbonato de cálcio, amido de batata ou tapioca, ácido algínico, determinados silicatos e carbonato de sódio; (5) agentes retardantes de solução, tal como parafina; (6) aceleradores de absorção, tais como compostos de amônia quaternária e tensoativos, tais como poloxâmero e sulfato de laurila de sódio; (7) agentes umectantes, tais como, por exemplo, álcool cetílico, monostearato de glicerol e tensoativos não iônicos; (8) absorventes, tais como caulim e argila de bentonita; (9) lubrificantes, tais como talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietilenoglicóis sólidos, sulfato de laurila de sódio, estearato de zinco, estearato de sódio, ácido esteárico e misturas dos mesmos; (10) agentes corantes; e (11) agentes de liberação controlada, tais como crospovidona ou etilcelulose. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as composições farmacêuticas também podem compreender agentes tamponantes. Composições farmacêuticas sólidas de um tipo similar também podem ser empregadas como cargas em cápsulas de gelatina de invólucro macio e duro com o uso de tais excipientes como lactose ou açúcares de leite, assim como polietilenoglicóis de alto peso molecular e semelhantes.

[0124]Um comprimido pode ser produzido por meio de compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Comprimidos podem ser preparados com o uso de ligante (por exemplo, gelatina ou hidroxipropilmetilcelulose), lubrificante, diluente inerte, conservante, desintegrante (por exemplo, glicolato de amido de sódio ou carboximetilcelulose de sódio reticulado), agente de distribuição ou ativo em superfície. Comprimidos moldados podem ser produzidos moldando-se em uma máquina adequada uma mistura do composto em pó úmido com um diluente líquido inerte.

[0125]Os comprimidos, e outras formas de dosagem sólidas das composições farmacêuticas da presente revelação, tais como drágeas, cápsulas, pílulas e grânulos, podem ser opcionalmente classificadas ou preparadas com revestimentos e invólucros, tais como revestimentos entéricos e outros revestimentos bem conhecidos na técnica de formulação farmacêutica. Os mesmos também podem ser formulados de modo a fornecer liberação lenta ou controlada do ingrediente ativo nos mesmos com o uso, por exemplo, de hidroxipropilmetilcelulose em proporções variantes para fornecer o perfil de liberação desejado, outras matrizes poliméricas, lipossomas e/ou microesferas. Os mesmos podem ser formulados para liberação rápida, por exemplo, liofilizados. Os mesmos podem ser esterilizados, por exemplo, através de filtração através de um filtro de retenção de bactérias, ou incorporando-se agentes esterilizantes na forma de composições farmacêuticas sólidas estéreis que podem ser dissolvidas em água estéril, ou alguns outros meios injetáveis estéreis imediatamente antes do uso. Essas composições farmacêuticas também podem conter, opcionalmente, agentes opacificantes e podem ser de uma composição em que liberam o ingrediente ativo (ou ingredientes ativos) apenas, ou preferencialmente, em uma determinada porção do trato gastrointestinal, opcionalmente, de uma maneira atrasada. Exemplos de composições de integração que podem ser usadas incluem substâncias e ceras poliméricas. O ingrediente ativo também pode estar em forma microencapsulada, caso seja apropriado, com um ou mais dentre os excipientes descritos acima.

[0126]Formas de dosagem líquida para administração oral dos compostos da revelação incluem emulsões, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Adicionalmente ao ingrediente ativo, as formas de dosagem líquidas podem conter diluentes inertes normalmente usados na técnica, tal como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes solubilizantes e emulsificantes, tais como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzílico, benzoato de benzila, propilenoglicol, 1,3-butilenoglicol, óleos (em particular, óleos de semente de algodão, amendoim, milho, germe, oliva, rícino e sésamo), glicerol, álcool tetra-hidrofurílico, polietilenoglicóis e ésteres de ácido graxo de sorbitana e misturas dos mesmos.

[0127]Além de diluentes inertes, as composições farmacêuticas orais também podem incluir adjuvantes, tais como agentes umectantes, agentes emulsificantes e de suspensão, agentes edulcorantes, saborizantes, corantes, perfumantes e conservantes.

[0128]Suspensões, adicionalmente aos compostos ativos, podem conter agentes de suspensão como, por exemplo, álcoois isostearílicos etoxilados, sorbitol de polioxietileno e ésteres de sorbitana, celulose microcristalina, meta-hidróxido de alumínio, bentonita, ágar-ágar e agradante, e misturas dos mesmos.

[0129]Formulações para administração retal ou vaginal podem ser apresentadas como um supositório, que pode ser preparado misturando-se um ou mais compostos da revelação com um ou mais excipientes ou carreadores não irritantes adequados que compreendem, por exemplo, manteiga de cacau, polietilenoglicol, uma cera supositória ou um salicilato, e que é sólido em temperatura ambiente, porém, líquido em temperatura corporal e, portanto, derreterá no reto ou cavidade vaginal e liberará o composto ativo.

[0130]Formulações ou formas de dosagem para a administração tópica ou transdérmica de um oligômero, conforme fornecido no presente documento, incluem pós, pulverizações, pomadas, pastas, cremes, loções, géis, soluções, adesivos e inalantes. Os oligonucleotídeos antissenso ativos podem ser misturados sob condições estéreis com um carreador farmaceuticamente aceitável, e com qualquer conservante, tampão ou propulsor que possa ser necessário. As pomadas, pastas, cremes e géis podem conter, adicionalmente a um composto ativo dessa revelação, excipientes, tais como gorduras animal e vegetal, óleos, ceras, parafinas, amido, agradante, derivados de celulose, polietilenoglicóis, silicones, bentonitas, ácido silícico, óxido de talco e zinco, ou misturas dos mesmos.

[0131]Pós e aspersões podem conter, adicionalmente a um oligômero da presente revelação, excipientes, tais como lactose, talco, ácido silícico, hidróxido de alumínio, silicatos de cálcio e pó de poliamida, ou misturas dessas substâncias. Aspersões podem conter, adicionalmente, propulsores tradicionais, tais como clorofluoro-hidrocarbonetos e hidrocarbonetos não substituídos voláteis, tais como butano e propano.

[0132]Adesivos transdérmicos têm a vantagem adicional de fornecer entrega controlada de um oligômero da presente revelação ao corpo. Tais formas de dosagem podem ser produzidas dissolvendo ou distribuindo-se o oligômero no meio apropriado. Aprimoradores de absorção também podem ser usados para aumentar o fluxo do agente através da pele. A taxa de tal fluxo pode ser controlada fornecendo-se uma membrana de controle de taxa ou distribuindo-se o agente em uma matriz polimérica ou gel, dentre outros métodos conhecidos na técnica.

[0133]Composições farmacêuticas adequadas para administração parentérica podem compreender um ou mais oligonucleotídeos antissenso da revelação em combinação com uma ou mais soluções aquosas ou não aquosas isotônicas estéreis farmaceuticamente aceitáveis, dispersões, suspensões ou emulsões, ou pós estéreis que podem ser reconstituídos em soluções ou dispersões injetáveis estéreis pouco antes do uso, que podem conter açúcares, álcoois, antioxidantes, tampões, bacteriostatos, solutos que rendem a formulação isotônica com o sangue do recipiente ou agentes de suspensão ou espessantes destinados. Exemplos de carreadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da revelação incluem água, etanol, polióis (tal como glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol e semelhantes), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila. Fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de dispersões e pelo uso de tensoativos.

[0134]Essas composições farmacêuticas também podem conter adjuvantes, tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da ação de micro-organismos sobre os oligonucleotídeos antissenso individuais pode ser garantida pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e semelhantes. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açucares, cloreto de sódio e semelhantes, nas composições. Adicionalmente, absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pela inclusão de agentes que atrasam a absorção, tal como monoestearato de alumínio e gelatina.

[0135]Em alguns casos, de modo a prolongar o efeito de um fármaco, é desejável retardar a absorção do fármaco a partir de injeção subcutânea ou intramuscular. Isso pode ser realizado através do uso de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo que tem pouca solubilidade em água, dentre outros métodos conhecidos na técnica. A taxa de absorção do fármaco depende, então, de sua taxa de dissolução que, por sua vez, pode depender do tamanho de cristal e forma cristalina. Alternativamente, a absorção atrasada de uma forma de fármaco administrada por via parental é realizada dissolvendo ou suspendendo-se o fármaco em um veículo oleoso.

[0136]Formas de depósito injetáveis podem ser produzidas formando-se matrizes de microcápsulas dos oligonucleotídeos antissenso individuais em polímeros biodegradáveis, tais como polilactídeo-poliglicólido. Dependendo da razão de oligômero para polímero e a natureza do polímero particular empregado, a razão de liberação de oligômero pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli(orto-ésteres) e poli(anidridos). Formulações injetáveis de depósito também podem ser preparadas encapsulando-se a droga em lipossomos ou microemulsões que são compatíveis com tecidos corporais.

[0137]Quando os oligonucleotídeos antissenso da presente revelação são administrados como produtos farmacêuticos, a seres humanos e animais, os mesmos podem ser dados per se ou como uma composição farmacêutica que contém, por exemplo, de 0,1 a 99% (mais preferencialmente, de 10 a 30%) do ingrediente ativo em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0138]Conforme observado acima, as formulações ou preparações da presente revelação podem ser dadas por via oral, parenteral, tópica ou retal. As mesmas são tipicamente dadas em formas adequadas para cada rota de administração. Por exemplo, são administradas em forma de comprimidos ou cápsula, através de injeção, inalação, loção ocular, pomada, supositório, etc., a administração através de injeção, infusão ou inalação; tópica através de loção ou pomada; e retal através de supositórios.

[0139]Independentemente da rota de administração selecionada, os oligonucleotídeos antissenso da presente revelação, que podem ser usados em uma forma hidratada adequada, e/ou as composições farmacêuticas da presente revelação, podem ser formuladas em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis através de métodos convencionais conhecidos por aqueles versados na técnica. Níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas desta revelação podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para obter a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração particular, sem que seja inaceitavelmente tóxico ao paciente.

[0140]O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores que incluem a atividade do oligômero particular da presente revelação empregado, ou o éster, sal ou amida do mesmo, a rota de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção ou metabolismo do oligômero particular que é empregado, a taxa e grau de absorção, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com o oligômero particular empregado, a idade, sexo, peso, afecção, saúde geral e histórico médico antecedente do paciente que é tratado, e fatores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas.

[0141]Um médico ou veterinário que tem habilidade comum na técnica pode determinar e prescrever prontamente a quantidade eficaz da composição farmacêutica necessária. Por exemplo, o médico ou veterinário poderia iniciar as doses dos compostos da revelação empregadas na composição farmacêutica em níveis inferiores àqueles necessários de modo a obter o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até que o efeito desejado seja alcançado. Em geral, uma dose diária adequada de um composto da revelação será aquela quantidade do composto que é a menor dose eficaz para produzir um efeito terapêutico. Tal dose eficaz dependerá, de modo geral, dos fatores descritos acima. De modo geral, doses oral, intravenosa, intracerebroventricular e subcutânea dos compostos desta revelação para um paciente, quando usadas para os efeitos indicados, estarão na faixa de cerca de 0,0001 a cerca de 100 mg por quilograma de peso corporal por dia.

[0142]Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso da presente revelação são administrados em doses, de modo geral, de cerca de 4 a 160 mg/kg,

10 a 160 mg/kg ou 20 a 160 mg/kg. Em alguns casos, doses maiores que 160 mg/kg podem ser necessárias. Em algumas modalidades, doses parenterais, tais como, por exemplo, administração i.v., são de cerca de 0,5 mg a 160 mg/kg. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados em doses de cerca de 4 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 17 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 25 mg/kg, 26 mg/kg, 27 mg/kg, 28 mg/kg, 29 mg/kg, 30 mg/kg, 31 mg/kg, 32 mg/kg, 33 mg/kg, 34 mg/kg, 35 mg/kg, 36 mg/kg, 37 mg/kg, 38 mg/kg, 39mg/kg, 40mg/kg, 41mg/kg, 42mg/kg, 43mg/kg, 44mg/kg, 45mg/kg, 46mg/kg, 47mg/kg, 48mg/kg, 49mg/kg 50mg/kg, 51mg/kg, 52mg/kg, 53mg/kg, 54mg/kg, 55mg/kg, 56mg/kg, 57mg/kg, 58mg/kg, 59mg/kg, 60mg/kg, 65mg/kg, 70mg/kg, 75mg/kg, 80mg/kg, 85mg/kg, 90mg/kg, 95mg/kg, 100mg/kg, 105mg/kg, 110mg/kg, 115mg/kg, 120mg/kg, 125mg/kg, 130mg/kg, 135mg/kg, 140mg/kg, 145mg/kg, 150mg/kg, 155mg/kg, 160mg/kg, que incluem todos os números inteiros entre os mesmos. Em algumas modalidades, o oligômero é administrado a 30 mg/kg. Em algumas modalidades, o oligômero é administrado a 40 mg/kg. Em algumas modalidades, o oligômero é administrado a 60 mg/kg. Em algumas modalidades, o oligômero é administrado a 80 mg/kg. Em algumas modalidades, o oligômero é administrado a 160 mg/kg. Em algumas modalidades, o oligômero é administrado a 50 mg/kg.

[0143]Caso seja desejado, a dose diária eficaz do composto ativo pode ser administrada como dois, três, quatro, cinco, seis ou mais subdoses administradas separadamente em intervalos apropriados ao longo do dia, opcionalmente, em formas de dosagem unitária. Em determinadas situações, a dosagem é uma administração por dia. Em determinadas modalidades, a dosagem é uma ou mais administrações a cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 dias, ou a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 semanas ou a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses, conforme necessário, para manter a expressão desejada de uma proteína distrofina funcional. Em determinadas modalidades, a dosagem é uma administração uma vez por semana. Em determinadas modalidades, a dosagem é uma ou mais administrações uma vez a cada duas semanas. Em algumas modalidades, a dosagem é uma administração a cada duas semanas. Em várias modalidades, a dosagem é uma ou mais administrações a cada mês. Em determinadas modalidades, a dosagem é uma administração a cada mês.

[0144]Em várias modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados semanalmente a 4 mg/kg. Em várias modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados semanalmente a 10 mg/kg. Em várias modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados semanalmente a 20 mg/kg. Em várias modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados semanalmente a 30 mg/kg. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados semanalmente a 40 mg/kg. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados semanalmente a 60 mg/kg. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados semanalmente a 80 mg/kg. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados semanalmente a 100 mg/kg. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados semanalmente a 160 mg/kg. Conforme usado no presente documento, a cada semana é entendido como o significado aceito na técnica de toda semana.

[0145]Em várias modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados quinzenalmente a 4 mg/kg. Em várias modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados quinzenalmente a 10 mg/kg. Em várias modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados quinzenalmente a 20 mg/kg. Em várias modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados quinzenalmente a 30 mg/kg. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados quinzenalmente a 40 mg/kg. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados quinzenalmente a 60 mg/kg. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados quinzenalmente a 80 mg/kg. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados quinzenalmente a 100 mg/kg. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados quinzenalmente a 160 mg/kg. Conforme usado no presente documento, quinzenalmente é entendido como o significado aceito na técnica de a cada duas semanas.

[0146]Em várias modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados a cada três semanas a 4 mg/kg. Em várias modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados a cada três semanas a 10 mg/kg. Em várias modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados a cada três semanas a 20 mg/kg. Em várias modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados a cada três semanas a 30 mg/kg. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados a cada três semanas a 40 mg/kg. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados a cada três semanas a 60 mg/kg. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados a cada três semanas a 80 mg/kg. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados a cada três semanas a 100 mg/kg. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados a cada três semanas a 160 mg/kg. Conforme usado no presente documento, a cada três semanas é entendido como o significado aceito na técnica de uma vez em três semanas.

[0147]Em várias modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados mensalmente a 4 mg/kg. Em várias modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados mensalmente a 10 mg/kg. Em várias modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados mensalmente a 20 mg/kg. Em várias modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados mensalmente a 30 mg/kg. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados mensalmente a 40 mg/kg. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados mensalmente a 60 mg/kg. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados mensalmente a 80 mg/kg. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados mensalmente a 100 mg/kg. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados mensalmente a 160 mg/kg. Conforme usado no presente documento, mensalmente é entendido como o significado aceito na técnica de todo mês.

[0148]Conforme seria entendido na técnica, administrações semanalmente, quinzenalmente, a cada três semanas ou mensalmente podem estar em uma ou mais administrações ou subdoses, conforme abordado acima.

[0149]Moléculas de ácido nucleico podem ser administradas em células através de uma variedade de métodos conhecidos por aqueles familiares à técnica, que incluem, porém, sem limitação, a encapsulação em lipossomas, por iontoforese, ou por incorporação em outros veículos, tal como hidrogéis, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradáveis e microesferas bioadesivas, conforme descrito no presente documento e conhecido na técnica. Em determinadas modalidades, a tecnologia de microemulsificação pode ser utilizada para melhorar a biocapacidade de agentes farmacêuticos lipofílicos (insolúveis em água). Exemplos incluem Trimetrina (Dordunoo, S. K., et al., Drug Development and Industrial Pharmacy, 17(12), 1.685 a 1.713, 1991) e REV 5901 (Sheen, P. C., et al., J Pharm Sci 80(7), 712 a 714, 1991). Dentre outros benefícios, a microemulsificação fornece biocapacidade aprimorada preferencialmente direcionando-se a absorção no sistema linfático em vez do sistema circulatório, que, desse modo, desvia do fígado, e evita a destruição dos compostos na circulação hepatobiliar.

[0150]Em um aspecto da revelação, as formulações contêm micelas formadas a partir de um oligômero, conforme fornecido no presente documento, e pelo menos um carreador anfifílico, no qual as micelas têm um diâmetro médio menor que cerca de 100 nm. Modalidades mais preferenciais fornecem micelas que têm um diâmetro médio menor que cerca de 50 nm, e modalidades ainda mais preferenciais fornecem micelas que têm um diâmetro médio menor que cerca de 30 nm, ou ainda menor que cerca de 20 nm.

[0151]Embora todos os carreadores anfifílicos adequados sejam contemplados, os carreadores atualmente preferenciais são geralmente aqueles que têm a situação Geralmente Reconhecida como Segura (GRAS), e que podem tanto solubilizar o composto da presente revelação quanto microemulsificar o mesmo em um último estágio quando a solução entra em contato com uma fase de água complexa (tal como uma encontrada no trato gastrointestinal humano). Normalmente, ingredientes anfifílicos que satisfazem essas exigências têm valores de HLB (equilíbrio hidrofílico para lipofílico) de 2 a 20, e suas estruturas contêm radicais alifáticos de cadeia linear na faixa de C-6 a C-20. Exemplos são glicerídeos graxos de polietileno glicolizado e polietilenoglicóis.

[0152]Exemplos de carreadores anfifílicos incluem glicerídeos de ácido graxo polietilenoglicolizados saturados e monoinsaturados, tais como aqueles obtidos a partir de vários óleos vegetais completa ou parcialmente hidrogenados. Tais óleos podem consistir vantajosamente em glicerídeos de ácido tri, di e mono graxo, e ésteres de di e monopoli(etilenoglicol) dos ácidos graxos correspondentes, com uma composição de ácido graxo particularmente preferencial que inclui 4 a 10% de ácido cáprico, 3 a 9% de ácido cáprico, 40 a 50% de ácido láurico, 14 a 24% de ácido mirístico, 4 a 14% de ácido palmítico e 5 a 15% de ácido esteárico. Outra classe útil de carreadores anfifílicos inclui sorbitana e/ou sorbitol parcialmente esterificado, com ácidos graxos saturados ou monoinsaturados (série SPAN) ou análogos etoxilados correspondentes (série TWEEN).

[0153]Carreadores anfifílicos comercialmente disponíveis podem ser particularmente úteis, que incluem a série Gelucire, Labrafil, Labrasol ou Lauroglicol (todos fabricados e distribuídos pela Gattefosse Corporation, Saint Priest, França), mono-oleato de PEG, di-oleato de PEG, monolaurato e dilaurato de PEG, Lecitina, Polissorbato 80, etc. (produzidos e distribuídos por diversas empresas nos E.U.A. e em todo o mundo).

[0154]Em determinadas modalidades, a entrega pode ocorrer através do uso de lipossomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas de lipídio, vesículas e semelhantes, para a introdução das composições farmacêuticas da presente revelação em células hospedeiras adequadas. Em particular, as composições farmacêuticas da presente revelação podem ser formuladas para entrega sejam encapsuladas em uma partícula de lipídio, um lipossoma, uma vesícula, uma nanoesfera, uma nanopartícula ou semelhantes. A formulação e o uso de tais veículos de entrega podem ser realizados com o uso de técnicas conhecidas e convencionais.

[0155]Polímeros hidrofílicos adequados para uso na presente revelação são aqueles que são prontamente solúveis em água, podem ser covalentemente ligados a um lipídio de formação de vesícula, e que são tolerados in vivo sem efeitos tóxicos (isto é, são biocompatíveis). Polímeros adequados incluem polietilenoglicol (PEG), polilático (também denominado polilactídeo), ácido poliglicólico (também denominado poliglicólido), um copolímero de ácido polilático-poliglicólico e álcool polivinílico. Em determinadas modalidades, polímeros têm um peso molecular de cerca de 100 ou 120 daltons até cerca de 5.000 ou 10.000 daltons, ou de cerca de 300 daltons a cerca de

5.000 daltons. Em outras modalidades, o polímero é polietilenoglicol que tem um peso molecular de cerca de 100 a cerca de 5.000 daltons, ou que tem um peso molecular de cerca de 300 a cerca de 5.000 daltons. Em determinadas modalidades, o polímero é polietilenoglicol de 750 daltons (PEG(750)). Polímeros também podem ser definidos pelo número de monômeros nos mesmos; uma modalidade preferencial da presente revelação utiliza polímeros de pelo menos cerca de três monômeros, em que tais polímeros de PEG consistem em três monômeros (aproximadamente 150 daltons).

[0156]Outros polímeros hidrofílicos que podem ser adequados para uso na presente revelação incluem polivinilpirrolidona, polimetoxazolina, polietiloxazolina, metacrilamida de poli-hidroxipropila, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida e celuloses derivadas, tais como hidroximetilcelulose ou hidroxietilcelulose.

[0157]Em determinadas modalidades, uma formulação da presente revelação compreende um polímero biocompatível selecionado a partir do grupo que consiste em poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, polímeros de ésteres acrílicos e metacrílicos, polímeros de polivinila, poliglicólidos, polissiloxanos, poliuretanos e copolímeros dos mesmos, celuloses, polipropileno, polietilenos, poliestireno, polímeros de ácido lático e ácido glicólico, polianidridos, poli(orto)ésteres, poli(ácido bútico), poli(ácido valérico), poli(lactídeo-co-caprolactona), polissacarídeos, proteínas, ácidos poli-hialurônicos, policianoacrilatos e mesclas, misturas ou copolímeros dos mesmos.

[0158]Ciclodextrinas são oligossacarídeos cíclicos, que consistem em 6, 7 ou 8 unidades de glicose, designadas pela letra grega α, β ou γ, respectivamente. As unidades de glicose são ligadas por ligações α-1,4-glicosídicas. Como consequência da conformação de cadeia das unidades de açúcar, todos os grupos hidroxila secundários (em C-2, C-3) estão localizados em um lado do anel, enquanto todos os grupos hidroxila primários em C-6 estão situados no outro lado. Como resultado, as faces externas são hidrofílicas, o que torna as ciclodextrinas solúveis em água. Por outro lado, as cavidades das ciclodextrinas são hidrofóbicas, visto que são revestidas pelo hidrogênio de átomos C-3 e C-5, e por oxigênios como éter. Essas matrizes permitem complexação com uma variedade de compostos relativamente hidrofóbicos, que incluem, por exemplo, compostos de esteroide, tais como 17α-estradiol (consultar,

por exemplo, van Uden et al., Plant Cell Tiss. Org. Cult. 38:1 a 3 a 113 (1994)). A complexação ocorre por interações de Van der Waals e por formação de ligação de hidrogênio. Para uma revisão geral da química de ciclodextrinas, consultar Wenz, Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 33:803 a 822 (1994).

[0159]As propriedades físico-químicas dos derivados de ciclodextrina dependem fortemente do tipo e do grau de substituição. Por exemplo, sua solubilidade em água está na faixa de insolúvel (por exemplo, triacetil-beta-ciclodextrina) até 147% solúvel (p/v) (G-2-beta-ciclodextrina). Adicionalmente, são solúveis em diversos solventes orgânicos. As propriedades das ciclodextrinas permitem o controle sobre a solubilidade de vários componentes de formulação ao aumentar ou diminuir sua solubilidade.

[0160]Diversas ciclodextrinas e métodos para sua preparação foram descritos. Por exemplo, Parmeter (I), et al. (documento de Patente nº U.S. 3.453.259) e Gramera, et al. (documento de Patente nº U.S. 3.459.731) descreveram ciclodextrinas eletroneutras. Outros derivados incluem ciclodextrinas com propriedades catiônicas [Parmeter (II), documento de Patente nº U.S. 3.453.257], ciclodextrinas reticuladas insolúveis (Solms, documento de Patente nº U.S. 3.420.788) e ciclodextrinas com propriedades aniônicas [Parmeter (III), documento de Patente nº U.S. 3.426.011]. Dentre os derivados de ciclodextrina com propriedades aniônicas, ácidos carboxílicos, ácidos de fósforo, ácidos fosfinosos, ácidos fosfônicos, ácidos fosfóricos, ácidos tiofosfônicos, ácidos tiossulfínicos e ácidos sulfônicos foram ligados à ciclodextrina parente [consultar Parmeter (III), supra]. Adicionalmente, derivados de ciclodextrina de éter sulfoalquílico foram descritos por Stella, et al. (documento de Patente nº U.S. 5.134.127).

[0161]Lipossomas consistem em pelo menos uma membrana de bicamada lipídica que envolve um compartimento interno aquoso. Lipossomas podem ser caracterizados por tipo de membrana e por tamanho. Pequenas vesículas unilamelares (SUVs) têm uma única membrana e tipicamente estão na faixa entre 0,02 e 0,05 μm em diâmetro; grandes vesículas unilamelares (LUVS) são tipicamente maiores que 0,05 μm. Grandes vesículas oligolamelares e vesículas multilamelares têm múltiplas, normalmente concêntricas, camadas de membrana e são, tipicamente, maiores que 0,1 μm. Lipossomas com diversas membranas não concêntricas, isto é, diversas vesículas menores contidas em uma vesícula maior, são denominadas vesículas multivesiculares.

[0162]Um aspecto da presente revelação se refere às formulações que compreendem lipossomas que contêm um oligonucleotídeo antissenso da presente revelação, sendo que a membrana de lipossoma é formulada para fornecer um lipossoma com capacidade de carregamento aumentada. Alternativa ou adicionalmente, o composto da presente revelação pode estar contido ou adsorvido na bicamada de lipossoma do lipossoma. Um oligonucleotídeo antissenso da presente revelação pode ser agregado com um tensoativo lipídico e carregado dentro do espaço interno do lipossoma; nesses casos, a membrana de lipossoma é formulada para resistir aos efeitos perturbadores do agregado de agente ativo e tensoativo.

[0163]De acordo com uma modalidade da presente revelação, a bicamada lipídica de um lipossoma contém lipídeos derivados com polietilenoglicol (PEG), de modo que as cadeias de PEG se estendam da superfície interna da bicamada lipídica para o espaço interior encapsulado pelo lipossoma, e se estendem do exterior da bicamada lipídica no ambiente circundante.

[0164]Agentes ativos contidos nos lipossomas da presente revelação estão na forma solubilizada. Agregados de tensoativo e agente ativo (tais como emulsões ou micelas que contêm o agente ativo de interesse) podem ser apanhados dentro do espaço interno dos lipossomas de acordo com a presente revelação. Um tensoativo atua para distribuir e solubilizar o agente ativo, e pode ser selecionado a partir de qualquer tensoativo alifático, cicloalifático ou aromático adequado, que inclui, porém,

sem limitação, lisofosfatidilcolinas (LPGs) biocompatíveis de comprimentos de cadeia variantes (por exemplo, de cerca de C14 a cerca de C20). Lipídeos derivados de polímero, tais como lipídeos de PEG também podem ser utilizados para formação de micela na medida em que atuam para inibir fusão de micela/membrana, e como a adição de um polímero em moléculas de tensoativo diminui a CMC do tensoativo e auxilia na formação de micela. Tensoativos com CMOs na faixa micromolar são preferenciais; tensoativos de CMC maior podem ser utilizados para preparar micelas apanhadas dentro de lipossomas da presente revelação.

[0165]Lipossomas de acordo com a presente revelação podem ser preparados através de qualquer uma dentre uma variedade de técnicas que são conhecidas na arte. Consultar, por exemplo, o documento de Patente nº U.S.

4.235.871; os pedidos PCT publicados nº WO 96/14057; New RRC, Liposomes: A practical approach, IRL Press, Oxford (1990), páginas 33 a 104; Lasic DD, Liposomes from physics to applications, Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam, 1993. Por exemplo, lipossomas da presente revelação podem ser preparados difundindo-se um lipídeo derivado com um polímero hidrofílico em lipossomas pré-formados, tal como expondo-se lipossomas pré-formados em micelas compostas por polímeros enxertados com lipídeo, em concentrações de lipídeo que correspondem à porcentagem em mol final de lipídeo derivado que é desejada no lipossoma. Lipossomas que contêm um polímero hidrofílico também podem ser formados através de homogeneização, hidratação de campo de lipídeo ou técnicas de extrusão, conforme conhecidas na arte.

[0166]Em outro procedimento de formulação exemplificativo, o agente ativo é primeiro distribuído por sonicação em uma lisofosfatidilcolina ou outro tensoativo de CMC baixa (que inclui lipídeos enxertados com polímero) que solubiliza prontamente as moléculas hidrofóbicas. A suspensão micelar resultante de agente ativo é, então, usada para reidratar uma amostra de lipídeo seca que contém uma porcentagem em mol adequada do lipídeo enxertado com polímero ou colesterol. A suspensão de lipídeo e agente ativo é, então, formada em lipossomas que usam técnicas de extrusão conforme conhecidas na arte, e os lipossomas resultantes separados da solução não encapsulada por separação de coluna padrão.

[0167]Em um aspecto da presente revelação, os lipossomas são preparados para ter tamanhos substancialmente homogêneos em uma faixa de tamanho selecionada. Um método de dimensionamento eficaz envolve extrusão de uma suspensão aquosa dos lipossomas através de uma série de membranas de policarbonato que têm um tamanho de poro uniforme selecionado; o tamanho de poro da membrana corresponderá aproximadamente aos maiores tamanhos de lipossomas produzidos por extrusão através dessa membrana. Consultar, por exemplo, o documento de Patente nº U.S. 4.737.323 (12 de abril de 1988). Em determinadas modalidades, reagentes, tais como DharmaFECT® e Lipofectamine® podem ser utilizados para introduzir polinucleotídeos ou proteínas em células.

[0168]As características de liberação de uma formulação da presente revelação dependem do material de encapsulação, da concentração de fármaco encapsulado e da presença de modificadores de liberação. Por exemplo, a liberação pode ser manipulada para ser dependente do pH, por exemplo, com o uso de um revestimento sensível ao pH que libera apenas em um pH baixo, como no estômago, ou um pH superior, como no intestino. Um revestimento entérico pode ser usado para evitar que a liberação ocorra até depois da passagem pelo estômago. Múltiplos revestimentos ou misturas de cianamida encapsuladas em diferentes materiais podem ser usados para obter uma liberação inicial no estômago, seguido por liberação tardia no intestino. A liberação também pode ser manipulada por inclusão de sais ou agentes de formação de poro, que podem aumentar a absorção de água ou liberação de fármaco através de difusão da cápsula. Excipientes que modificam a solubilidade do fármaco também podem ser usadas para controlar a taxa de liberação. Agentes que aprimoram a degradação da matriz ou liberação da matriz também podem ser incorporados. Podem ser adicionados ao fármaco, adicionados como uma fase separada (isto é, como particulados) ou podem ser codissolvidos na fase de polímero dependendo do composto. Na maioria dos casos a quantidade deve estar entre 0,1 e trinta por cento (p/p de polímero). Tipos de aprimoradores de degradação incluem sais inorgânicos, tais como sulfato de amônia e cloreto de amônia, ácidos orgânicos, tais como ácido cítrico, ácido benzoico e ácido ascórbico, bases inorgânicas, tais como carbonato de sódio, carbonato de potássio, carbonato de cálcio, carbonato de zinco e hidróxido de zinco, e bases orgânicas, tais como sulfato de protamina, espermina, colina, etanolamina, dietanolamina e trietanolamina, e tensoativos, tais como Tween® e Pluronic®. Agentes de formação de poro que adicionam microestrutura às matrizes (isto é, compostos solúveis em água, tal como sais inorgânicos e açúcares) são adicionados como particulados. A faixa está tipicamente entre um e trinta por cento (p/p de polímero).

[0169]Absorção também pode ser manipulada alterando-se o tempo de permanência das partículas no intestino. Isso pode ser alcançado, por exemplo, revestindo-se a partícula com, ou selecionando-a como, o material de encapsulação, um polímero adesivo da mucosa. Exemplos incluem a maioria dos polímeros com grupos carboxila livre, tal como quitosana, celuloses e especialmente poliacrilatos (conforme usado no presente documento, poliacrilatos se referem aos polímeros que incluem grupos acrilato e grupos acrilato modificados, tais como cianoacrilatos e metacrilatos).

[0170]Um oligonucleotídeo antissenso pode ser formulado de modo a estar contido na, ou adaptado à, liberação através de um dispositivo ou implante cirúrgico ou médico. Em determinados aspectos, um implante pode ser revestido ou de outra forma tratado com um oligonucleotídeo antissenso. Por exemplo, hidrogéis ou outros polímeros, tais como polímeros biocompatíveis e/ou biodegradáveis, podem ser usados para revestir um implante com as composições farmacêuticas da presente revelação (isto é, a composição pode ser adaptada para uso com um dispositivo médico com o uso de um hidrogel ou outro polímero). Polímeros e copolímeros para revestir dispositivos médicos com um agente são bem conhecidos na técnica. Exemplos de implantes incluem, porém, sem limitação, stents, stents de eluição de fármaco, suturas, próteses, cateteres vasculares, cateteres de dialise, enxertos vasculares, válvulas cardíacas protéticas, marcapassos cardíacos, cardioversor desfibrilador implantável, agulhas IV, dispositivos para alinhamento e formação de ossos, tais como pinos, parafusos, placas e outros dispositivos, e matrizes de tecido artificiais para cicatrização de feridas.

[0171]Adicionalmente aos métodos fornecidos no presente documento, os oligonucleotídeos antissenso para uso de acordo com a revelação podem ser formulados para administração de qualquer maneira conveniente para uso na medicina humana ou veterinária, por analogia com outros produtos farmacêuticos. Os oligonucleotídeos antissenso e suas formulações correspondentes podem ser administrados sozinhos ou em combinação com outras estratégias terapêuticas no tratamento de distrofia muscular, tal como transplante de mioblasto, terapias com células tronco, administração de antibióticos de aminoglicosídeo, inibidores proteasoma e terapias de regulação crescente (por exemplo, regulação crescente de utrofina, um parálogo autossômico de distrofina).

[0172]Em algumas modalidades, o produto terapêutico adicional pode ser administrado antes, de maneira simultânea ou subsequente à administração do oligonucleotídeo antissenso da presente revelação. Por exemplo, os oligonucleotídeos antissenso podem ser administrados em combinação com um esteroide e/ou antibiótico. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso são administrados a um paciente que está em teoria de esteroide de fundo (por exemplo, terapia de esteroide de fundo intermitente ou crônica/contínua). Por exemplo, em algumas modalidades, o paciente foi tratado com um corticosteroide antes da administração de um oligômero antissenso e continua a receber a terapia de esteroide. Em algumas modalidades, o esteroide é glicocorticoide ou prednisona.

[0173]As rotas de administração descritas são planejadas apenas como uma orientação visto que um praticante habilidoso terá capacidade para determinar prontamente a rota ideal de administração e qualquer dosagem para qualquer animal e afecção particular. Diversas abordagens para introduzir novo material genético funcional em células, tanto in vitro quanto in vivo foram tentadas (Friedmann (1989) Science, 244:1.275 a 1.280). Essas abordagens incluem integração do gene a ser expresso em retrovírus modificados (Friedmann (1989) supra; Rosenberg (1991) Cancer Research 51(18), suppl.: 5074S a 5079S); integração em vetores de não retrovírus (por exemplo, vetores virais adeno-associados) (Rosenfeld, et al. (1992) Cell, 68:143 a 155; Rosenfeld, et al. (1991) Science, 252:431 a 434); ou entrega de um transgene ligado a um elemento promotor-aprimorador heterólogo por meio de lipossomas (Friedmann (1989), supra; Brigham, et al. (1989) Am. J. Med. Sci., 298:278 a 281; Nabel, et al. (1990) Science, 249:1.285 a 1.288; Hazinski, et al. (1991) Am. J. Resp. Cell Molec. Biol., 4:206 a 209; e Wang e Huang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. (E.U.A.), 84:7.851 a 7.855); acoplados aos sistemas de transporte à base de cátion de ligante específico (Wu e Wu (1988) J. Biol. Chem., 263:14.621 a 14.624) ou o uso de DNA nu, vetores de expressão (Nabel et al. (1990), supra); Wolff et al. (1990) Science, 247:1.465 a 1.468). Injeção direta de transgenes em tecido produz apenas expressão localizada (Rosenfeld (1992) supra); Rosenfeld et al. (1991) supra; Brigham et al. (1989) supra; Nabel (1990) supra; e Hazinski et al. (1991) supra). O grupo de Brigham et al. (Am. J. Med. Sci. (1989) 298:278 a 281 e Clinical Research (1991) 39 (resumo)) relatou transfecção in vivo apenas dos pulmões de camundongos depois de administração intravenosa ou intratraqueal de um complexo de lipossoma de DNA. Um exemplo de um artigo de revisão de procedimentos de terapia de gene humano é: Anderson, Science (1992) 256:808 a 813.

[0174]Em uma modalidade adicional, composições farmacêuticas da revelação podem compreender adicionalmente um carboidrato, conforme fornecido em Han et al., Nat. Comms. 7.10981 (2016), cuja totalidade está incorporada no presente documento a título de referência. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da revelação podem compreender 5% de um carboidrato de hexose. Por exemplo, a composição farmacêutica da revelação pode compreender 5% de glicose, 5% de frutose ou 5% de manose. Em determinadas modalidades, as composições farmacêuticas da revelação podem compreender 2,5% de glicose e 2,5% de frutose. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da revelação podem compreender um carboidrato selecionado a partir de: arabinose presente em uma quantidade de 5% em volume, glicose presente em uma quantidade de 5% em volume, sorbitol presente em uma quantidade de 5% em volume, galactose presente em uma quantidade de 5% em volume, frutose presente em uma quantidade de 5% em volume, xilitol presente em uma quantidade de 5% em volume, manose presente em uma quantidade de 5% em volume, uma combinação de glicose e frutose, cada um presente em uma quantidade de 2,5% em volume, e uma combinação de glicose presente em uma quantidade de 5,7% em volume, frutose presente em uma quantidade de 2,86% em volume e xilitol presente em uma quantidade de 1,4% em volume. IV.Kits

[0175]A revelação também fornece kits para tratamento de um paciente com uma doença genética (por exemplo, DMD), esse kit compreende pelo menos uma molécula antissenso (por exemplo, golodirsen), embalada em um recipiente adequado, juntamente com instruções para seu uso. Os kits também podem conter reagentes periféricos, tais como tampões, estabilizadores, etc. Aqueles de habilidade comum no campo devem verificar que as aplicações do método acima têm ampla aplicação para identificar moléculas antissenso adequadas para uso no tratamento de diversas outras doenças.

EXEMPLOS

[0176]Todos os exemplos são derivados do seguinte ensaio clínico, primeiramente em seres humanos, em andamento, que testa a segurança e eficácia de SRP-4053. Resultados relatados no presente documento foram obtidos na Semana 48 durante a Parte 2 do Estudo. Estudo de Fase I/II de SRP-4053 em Pacientes com DMD Identificador em ClinicalTrials.gov: NCT02310906

[0177]Esse é um estudo de 2 partes de múltiplas doses, primeiramente em seres humanos, para avaliar a segurança, tolerabilidade, eficácia e farmacocinéticas de SRP-4053 em pacientes com distrofia muscular de Duchenne (DMD) com deleções suscetíveis ao salto de éxon 53. Tipo de Estudo: Intervencional Projeto de Estudo: Alocação: Aleatorizado Modelo de Intervenção: Atribuição Paralela Ocultação: Quádruplo (Participante, Prestador de Cuidados, Investigador, Avaliador de Resultados) Propósito Primário: Tratamento Título Oficial: Um Estudo de 2 Partes, Aleatorizado, Duplamente Cego, Controlado por Placebo, Titulação de Dose, Segurança, Tolerabilidade e Farmacocinética (Parte 1) Seguido por uma Avaliação de Eficácia e Segurança Aberta (Parte 2) de SRP- 4053 em Pacientes com Distrofia Muscular de Duchenne Suscetível ao Salto de Éxon 53. Materiais e Métodos Fármaco de Estudo

[0178]A substância de fármaco, Golodirsen (a/k/a SRP-4053), é um PMO da estrutura química descrita no presente documento e foi fornecido pela Sarepta Therapeutics, Inc. O produto de fármaco golodirsen foi formulado em uma concentração de 50 mg/ml como uma solução aquosa tamponada de fosfato isotônica estéril que é fornecida em frascos de uso único. O produto de fármaco foi diluído com solução salina normal (injeção de 0,9% de cloreto de sódio) antes da administração por meio de infusão IV em uma configuração clínica. Pacientes: Elegibilidade

[0179]Pacientes elegíveis tinham de 6 a 15 anos de idade com deleções fora do quadro do gene de DMD que são suscetíveis ao salto de éxon 53. Critérios de inclusão: Diagnosticado com DMD, genotipicamente confirmado. Músculos do bíceps direito e esquerdo intactos ou um grupo de músculo do braço superior alternativo. Função pulmonar e cardíaca estável. Desempenho mínimo em 6MWT, Avaliação Ambulatória North Star e teste de se levantar (Gowers) conforme especificado no protocolo de estudo. Em uma dose estável de corticosteroides por pelo menos 6 meses. Critérios de Exclusão: O tratamento anterior com os agentes experimentais BMN-195 (SMT C1100) ou PRO053. O tratamento atual ou anterior com quaisquer outros tratamentos experimentais dentro de 12 semanas antes da entrada no estudo. Grande cirurgia nos últimos 3 meses. Presença de outra enfermidade clinicamente significativa. Grande alteração no regime de terapia física nos últimos 3 meses. Outros critérios de inclusão e exclusão podem se aplicar.

Projeto de Estudo

[0180]Um resumo do projeto de estudo é mostrado na Figura 1 e na Tabela imediatamente abaixo.

Braços Intervenções Atribuídas Experimentais: Parte 1, Parte 2 SRP-4053 Fármaco: SRP-4053 Aproximadamente 8 pacientes com DMD genotipicamente confirmados suscetíveis ao salto de éxon 53 Comparador de Placebo: Parte 1 Placebo, Parte 2 SRP- Fármaco: Fármaco de 4053 Placebo: SRP-4053 Aproximadamente 4 pacientes com DMD genotipicamente confirmados suscetíveis ao salto de éxon 53 Experimentais: Parte 2 SRP-4053 Fármaco: SRP-4053 Aproximadamente 24 pacientes com DMD genotipicamente confirmados suscetíveis ao salto de éxon 53 Sem Intervenção: Parte 2 Controle não Tratado Até 24 pacientes com DMD genotipicamente confirmados com deleções não suscetíveis ao salto de éxon 53 Descrição Detalhada:

[0181]Parte 1: Titulação de dose controlada por placebo aleatorizada para avaliar a segurança, tolerabilidade e farmacocinéticas de 4 níveis de dose de SRP- 4053 em pacientes com DMD genotipicamente confirmados com deleções suscetíveis ao salto de éxon 53. Triagem/Linha de Referência:

[0182]Pacientes com DMD com mutações confirmadas suscetíveis à triagem de éxon 53 participaram de um período de Triagem de 4 a 6 semanas para assegurar elegibilidade. Uma ressonância magnética de músculo da perna pré-tratamento e MRS de músculo (em sítios selecionados com capacidades para MRS) foram realizados e biopsias musculares e cutâneas foram obtidas. O teste funcional (teste de caminhada de 6 minutos [6MWT], Avaliação Ambulatória North Star [NSAA] e outras medições funcionais foram realizadas e amostras sanguíneas para potenciais biomarcadores relacionados a doença foram obtidas. O teste de função pulmonar (PFT), um ecocardiograma (ECHO) e ECG também foram realizados durante a triagem. Titulação de Dose:

[0183]Pacientes foram aleatorizados (2:1) para receber SRP-4053 ou placebo. Pacientes receberam uma infusão IV semanalmente de placebo ou SRP- 4053 em níveis de dose progressivos, cada uma por pelo menos 2 semanas: 4 mg/kg/semana nas Semanas 1 e 2; 10 mg/kg/semana nas Semanas 3 e 4; 20 mg/kg/semana nas Semanas 5 e 6; e 30 mg/kg/semana com começo na Semana 7. Uma vez que o último paciente recebeu sua segunda dose a 30 mg/kg, dados de segurança acumulativos de Parte 1 revistos de DMC independente antes da dosagem na Parte 2 foram iniciados. A DMC reviu os dados de segurança da Parte 1 e recomendou avançar para infusões IV de 30 mg/kg uma vez na semana no segmento aberto (Parte 2) do estudo.

[0184]Parte 2: Avaliação aberta de SRP-4053 em pacientes da Parte 1, juntamente com pacientes com DMD recentemente inscritos com deleções suscetíveis ao salto de éxon 53, em comparação com pacientes com DMD de controle não tratados com deleções não suscetíveis ao salto de éxon 53.

[0185]Parte 2 é uma avaliação aberta de 144 semanas da segurança e eficácia de infusão IV de 30 mg/kg de SRP-4053 uma vez na semana em pacientes em comparação com um grupo de controle concorrente não tratado de pacientes com DMD com mutações não suscetíveis ao salto de éxon 53. Triagem/Linha de Referência:

[0186]Pacientes da Parte 1 (tanto SRP-4053 quanto placebo) continuaram para a Parte 2. Novos pacientes com DMD com deleções suscetíveis ao salto de éxon 53 foram inscritos para o tratamento com SRP-4053 aberto para um total de 25 pacientes no grupo tratado. Até 24 pacientes com DMD com deleções não suscetíveis ao salto de éxon 53 que correspondem, de outra forma, aos critérios de elegibilidade também são inscritos na Parte 2 para servir como um grupo de controle não tratado. A elegibilidade de todos os novos pacientes da Parte 2 é confirmada durante um período de triagem de 4 a 6 semanas. Tratamento Aberto por 144 Semanas:

[0187]Na Parte 2, todos os pacientes no grupo tratado receberam SRP-4053 a 30 mg/kg uma vez por semana como uma infusão IV por 144 semanas. Novos pacientes tratados na Parte 2 passam por uma biopsia muscular e cutânea na Linha de Referência, e todos os pacientes tratados devem passar por uma segunda biopsia muscular na Semana 48 da Parte 2. Pacientes também passam por teste funcional (como acima para Parte 1) e PFTs, e passam por um ECG a cada 12 a 24 semanas. Eventos negativos e medicações concomitantes são monitorados e coletados continuamente durante o curso do estudo. Após a elegibilidade de estudo ser confirmada, pacientes no grupo de controle não tratado passam pelos mesmos procedimentos de estudo que os pacientes tratados na Parte 2, exceto por uma programação abreviada de exames físicos e avaliações laboratoriais, e nenhuma amostragem de PK ou biopsia. Medições de Resultado Primário:

Incidência de Eventos Negativos [Período de Tempo: aproximadamente 12 semanas (Parte 1)] Incidência de anormalidades laboratoriais clínicas (hematologia, química, coagulação, uranálise) [Período de Tempo: aproximadamente 12 semanas (Parte 1)] Incidência de anormalidades em sinais vitais e exames físicos [Período de Tempo: aproximadamente 12 semanas (Parte 1)] Incidência de anormalidades em ECGs e ECHOs [Período de Tempo: aproximadamente 12 semanas (Parte 1)] Alteração no Teste de Caminhada de 6 Minutos (6MWT) a partir da linha de referência [Período de Tempo: Linha de Referência até a Semana 144 (Parte 2)] Níveis de proteína distrofina determinados por western blot [Período de Tempo: Linha de Referência até a Semana 48 (Parte 2)] Medições de Resultado Secundário: Concentração de fármaco em plasma [Período de Tempo: Aproximadamente 12 semanas (Parte 1)] Testes de função pulmonar [Período de Tempo: Linha de Referência até a Semana 144 (Parte 2)] % de pressão expiratória máxima (MEP), % de pressão inspiratória máxima (MIP) Porcentagem de fibras de distrofina positiva determinada por IHC [Período de Tempo: Linha de Referência até a Semana 48 (Parte 2)] Salto de éxon 53 [Período de Tempo: Linha de Referência até a Semana 48 (Parte 2)] Outras Medições de Resultado: Incidência de Eventos Negativos [Período de Tempo: 144 semanas (Parte 2)]

Incidência de anormalidades laboratoriais clínicas (hematologia, química, coagulação, uranálise) [Período de Tempo: 144 semanas (Parte 2)]

Incidência de anormalidades em sinais vitais e exames físicos [Período de Tempo: 144 semanas (Parte 2)] Incidência de anormalidades em ECGs e ECHOs [Período de Tempo: 144 semanas (Parte 2)] Imunogenicidade [Período de Tempo: 144 semanas (Parte 2)] Exemplo 1: Avaliações de Eficácia Bioquímica

[0188]Biopsias musculares pareadas do bíceps braquial na linha de referência e durante tratamento foram obtidas a partir de 25 pacientes que participam em um ensaio, primeiramente em seres humanos, de múltiplos sítios que avalia a segurança, tolerabilidade e produção de distrofina de 30 mg/kg de SRP-4053 administrados semanalmente através de infusão intravenosa (Identificador em ClinicalTrials.gov: NCT02310906). Para cada cirurgia, dois pedaços de músculo foram excisados: Bloco A e bloco B. Blocos A e B foram analisados separadamente em todos os ensaios.

[0189]Biopsias musculares foram examinadas por métodos otimizados para avaliar a quantidade de proteína distrofina (Western blot, ponto final biológico primário) e salto de éxon (RT-PCR). Uma análise de imagem automatizada inovadora (MuscleMap™) usou imuno-histoquímica para avaliar a localização de distrofina (intensidade de fibra média).

[0190]Para a análise de Western blot: Blocos A e B foram executados em géis duplos = 4 testes promediados

[0191]Para a análise de RT-PCR: Blocos A e B foram executados em quadruplicados = 8 testes promediados

[0192]Para a análise de IHC:Blocos A e B foram executados no Nível 1 e 2 = 4 testes promediados Características de Linha de Referência:

[0193]Características de Linha de Referência dos 25 pacientes no coorte tratado com golodirsen são resumidas na Tabela 1. Cinco diferentes genótipos suscetíveis ao salto de éxon 53 (deleções de mutação em 45 a 52; 48 a 52; 49 a 52; 50 a 52; e 52) foram representados.

Dezessete pacientes receberam inicialmente placebo na Parte 1 do Estudo antes de converter para o tratamento com SRP-4053 ou foram inscritos na Parte 2 do Estudo para tratamento com SRP-4053. Oito pacientes receberam SRP-4053 na Parte 1 e Parte 2 do Estudo.

Um total de 25 pacientes receberam SRP-4053. Tabela 1. Demografia de Linha de Referência e Características de Doença

Placebo  SRP-4053 na parte 1 e Todos tratados SRP-4053 e 2 (N = 25) parte 2 apenas (N = 8) (N = 17)

Idade Média 8,0 (2,24) 8,6 (2,07) 8,2 (2,16) (SD) 6, 13 7, 13 6, 13 Mín, máx

Peso de Média 26,44 (7,922) 31,94 (10,925) 28,20 (9,139) linha de (SD) 17,1, 48,5 21,0, 49,0 17,1, 49,0 referência Mín, máx (kg)(1)

Distância Média 404,91 401,25 (58,230) 403,74 (56,661) de 6MWT (SD) (57,686) 290,0, 469,0 290,0, 512,0 de linha de Mín, máx 333,0, 512,0 referência(2)

Mutação 45 – 52 5 (29,4%) 3 (37,5%) 8 (32,0%) 48 – 52 4 (23,5%) 1 (12,5%) 5 (20,0%) 49 – 52 3 (17,6%) 2 (25,0%) 5 (20,0%) 50 – 52 3 (17,6%) 1 (12,5%) 4 (16,0%)

52 2 (11,8%) 1 (12,5%) 3 (12,0%)

1.Linha de Referência é o último valor gravado antes da primeira dose de fármaco de estudo (placebo ou SRP-4053)

2.Linha de Referência é a média do Dia 1 e Dia 2 para a última visita antes da primeira dose de fármaco de estudo (placebo ou SRP-4053) Determinação de Salto de Éxon: Análise de RT-PCR:

[0194]Salto de éxon foi medido por RT-PCR na Linha de Referência e em 48 semanas pelo projeto de estudo. Para análise de RT-PCR, RNA foi isolado das células com o uso do kit de reagente de Trizol seguindo o protocolo do fabricante. A concentração e pureza do RNA foram determinadas com o uso de um NanoDrop. Salto de éxon 53 foi medido por RT-PCR com iniciador dianteiro de mutação pareada e iniciadores reversos de acordo com a Tabela 2. Tabela 2. Iniciadores para detecção de salto de éxon 53 Nome de Sequência de Iniciador Primário (5' Tamanho Tm Iniciador Iniciador a 3') (bp) (°C) Sentido 44 a TGGCGGCGTTTTCATTATGA Dianteiro 52 nº 2 (SEQ ID NO:2) 20 58,55 Antissenso GGACGCCTCTGTTCCAAATC Reverso 44 a 52 nº 2 (SEQ ID NO:3) 20 58,91 Sentido 47 a 5'-CGCCAGGGAATTCTCAAACA Dianteiro 52 nº 2 (SEQ ID NO:4) 20 58,47 Antissenso 5'-TTTTGGGCAGCGGTAATGAG Reverso 47 a 52 nº 2 (SEQ ID NO:5) 20 58,83

Sentido 50 a 5'-CTCTGAGTGGAAGGCGGTAA Dianteiro 53 nº 1 (SEQ ID NO:6) 20 59,1 Antissenso 5'-ACCTGCTCAGCTTCTTCCTT Reverso 50 a 53 nº 1 (SEQ ID NO:7) 20 58,94

[0195]Os produtos saltados e não saltados resultaram nos tamanhos de amplicon de acordo com a Tabela 3. Tabela 3. Resumo de tamanhos de produto de amplicon saltado e não saltado de éxon 53 para cada mutação de paciente Não saltado Saltado Deleção Iniciadores (bp) (bp) 45-52 44-54 429 217 44-54 903 691 48-52 47-54 306 94 49-52 47-54 492 280 50-52 47-54 594 382 51-54 414 202 52 47-54 916 704

[0196]Após o RNA ser submetido à RT-PCR, as amostras foram analisadas com o uso de um LabChip GX, que usa eletroforese capilar em gel. O percentual de salto de éxon foi calculado com o uso da seguinte equação: (área sob a curva para bandas saltadas)/(soma de área sob curva para bandas saltadas e não saltadas)x100.

[0197]Um resumo dos resultados de RT-PCR é mostrado na Tabela 4. Todos os 25 pacientes que receberam pelo menos 48 doses semanalmente de SRP-4053 exibiram um aumento sobre os níveis de linha de referência em salto de éxon (p < 0,001).

Tabela 4. Resultados de RT-PCR Confirmam Salto de Éxon nos Pacientes com DMD Resultados de RT-PCR Pacientes de Pacientes de Parte 2/Pl Parte 1 Todos os pacientes 48 a 51 60 a 76 semanas semanas Nenhum aumento > 0,1 a partir da Linha de 0 0 0 Referência Aumento > 0,1 a partir da 17 (100,0%) 8 (100,0%) 25 (100,0%) Linha de Referência (63,1%, 95% de CI (80,5%, 100,0%) (86,3%, 100,0%) 100,0%) Diminuição a partir da 0 0 0 Linha de Referência Não alterado a partir da 0 0 0 Linha de Referência Aumento a partir da Linha 17 (100,0%) 8 (100,0%) 25 (100,0%) de Referência Valor P <0,001 0,008 <0,001 Aumento - - 7,3

[0198]A Figura 2 mostra os dados de RT-PCR (Linha de Referência e em 48 semanas após tratamento com SRP-4053) para cada um dos 25 pacientes no Estudo que resultou na determinação de que houve um aumento sobre os níveis de linha de referência no salto de éxon (p < 0,001). Determinação de Produção de Distrofina: Análise de Western Blot

[0199]Para análise de western blot, tecido foi homogeneizado com tampão de homogeneização (4% de SDS, 4 M de ureia, 125 mM de tris-HCl (pH 6,8)) em uma razão de 9 a 18 x 20-μm seções de tecido em aproximadamente 5 mm em diâmetro em 133 μl de tampão. O lisado correspondente foi coletado e submetido à qualificação de proteína com o uso do Kit de Ensaio de Proteína RC DC através das instruções do fabricante (BioRad Cat. 500-0122). As amostras de extrato de tecido foram diluídas 1:10 com o uso de tampão de homogeneização para estar dentro da faixa da curva padrão de BSA. Amostras foram preparadas de modo que 28 µl da amostra contenham 40 µg de proteína, concentração final de 1X de Tampão de Amostra NuPAGE LDS (Life Technologies Cat. NP0008, Carlsbad, Califórnia, E.U.A.), e concentração final de 1X de Agente Redutor NuPAGE (10x) (Life Technologies Cat. NP0004). Após aquecer as amostras de proteína por 5 minutos a 105 0C, as amostras foram centrifugadas e o sobrenadante foi carregado em um mini gel de 3 a 8% de tris- acetato de poliacrilamida de 1mm de 12 poços NuPAGE Novex (Life Technologies Cat. EA0375) em carga de proteína total de 40 μg por faixa. O gel foi executado em 150 volts à temperatura ambiente até que a frente de corante tivesse escorrido do gel. Os géis de proteína resultantes foram transferidos para membranas de PVDF (Life Technologies Cat. LC2007) por 75 minutos em temperatura ambiente com 30 volts com o uso de tampão de transferência NuPAGE (Life Technologies NP006-1), 10% de metanol e 0,1% de antioxidante NuPAGE (Life Technologies NP0005).

[0200]Após transferência de proteína, as membranas de PVDF foram imersas em tampão de TTBS (1X TBS (Amresco Cat. J640-4L), 0,1% (v/v) de tween-20). As membranas foram transferidas para o tampão de bloqueio (5% (p/v) de leite seco sem gordura (Lab Scientific Cat. M0841) em TTBS) e embebidos de um dia para o outro a

4 0C com agitação suave. Após bloqueio, as membranas foram incubadas por 60 minutos em temperatura ambiente em DYS1 (Leica Cat. NCL-DYS1) diluídas 1:20 com o uso de tampão de bloqueio ou 20 minutos em temperatura ambiente em anticorpo anti-α-actinina (Sigma-Aldrich Cat. NA931V) diluídas 1:100.000 com tampão de bloqueio, seguido por seis lavagens (cinco minutos cada com TTBS). IgG anti- camundongo conjugado com peroxidase de rábano (GE Healthcare Cat. NA931V) foi diluído 1:40.000 com o uso de tampão de bloqueio e adicionado nas membranas por 45 minutos (DYS1) ou 15 minutos (α-actinina), seguido, novamente, por seis lavagens. Com o uso do Kit de Detecção ECL Prime Western (GE Healthcare Cat. RPN2232), o filme foi exposto ao gel e, consequentemente, se desenvolveu. O filme desenvolvido foi digitalizado e analisado com o uso de software ImageQuant TL Plus (versão 8.1) e análise de regressão linear foi realizada com o uso de software Graphpad.

[0201]Cada gel de Western blot inclui uma curva padrão de distrofina de 5 pontos preparada com o uso de proteína total extraída do tecido normal e espetada no extrato de tecido com DMD para um controle normal final de 4%, 2%, 1%, 0,5%, 0,25% (consultar, por exemplo, as Figuras 5A e 5B). As amostras de curva padrão foram processadas conforme descrito acima. Níveis de proteína distrofina como porcentagem de níveis de distrofina de controle normal (% de NC) foram determinados comparando-se intensidades de banda de distrofina com a curva padrão de gel.

[0202]A % média de proteína distrofina normal, conforme medida por Western blot, aumentou a partir de 0,09% na linha de referência para 1,02% durante o tratamento (na faixa de 0,09 a 4,3%) que representa uma alteração média da linha de referência de +0,93% (p < 0,001).

[0203]Um resumo dos resultados de Western blot é mostrado na Tabela 5. Pacientes demonstraram um aumento estatisticamente significativo sobre a linha de referência em proteína distrofina conforme medido por Western blot. Tabela 5. Resultados de Western Blot Confirmam a Produção de Distrofina em Pacientes com DMD Resultados de Western Blot Pacientes de Pacientes de Parte 2 Parte 1 Todos os pacientes dosagem de ~48 dosagem de 60 a 51 semanas a 76 semanas n 17 8 25 % normal média de linha 0,09 (0,06) 0,10 (0,09) 0,09 (0,07) de Referência (SD) Durante tratamento 0,84 (0,64) 1,40 (1,57) 1,02 (1,03) % normal média (SD) Alteração média da linha 0,75 (0,67) 1,29 (1,51) 0,92 (1,01) de referência (SD) Valor P <0,001 0,008 P < 0,001 Aumento - -

[0204]A Figura 3 mostra os dados de Western blot (Linha de Referência e em 48 semanas após tratamento com SRP-4053) para cada um dos 25 pacientes no Estudo que resultou na determinação de que houve um aumento estatisticamente significativo sobre a linha de referência na proteína distrofina.

[0205]Uma correlação positiva entre salto de éxon e proteína distrofina de novo foi observada (Spearman-r = 0,500, p = 0,011).

[0206]Análise de intensidade de fibra média demonstrou um aumento estatisticamente significativo (p < 0,001) acima da linha de referência em distrofina de novo e que a distrofina estava corretamente localizada na membrana de sarcolema (Figuras 4A a 5B).

[0207]Salto de éxon e localização de distrofina sarcolemal foram observados em todos os pacientes.

[0208]Um resumo da porcentagem de IHC de fibras de distrofina positiva é mostrado na Tabela 6. Todos os pacientes demonstraram um aumento estatisticamente significativo sobre a linha de referência em porcentagem de fibras de distrofina positiva conforme medido por IHC. Tabela 6. Resultados de IHC PDPF PDPF Valor P Linha de Referência/Não Durante tratamento Tratados (SD) (SD) 2,7% 15,5% <0,001

[0209]Como pode ser visto nas Tabelas 5 e 6 e nas Figuras 4A a 5B, os dados de Western blot se correlacionam com PDPF e intensidade que mostram produção de distrofina em pacientes com DMD que resulta do tratamento com SRP-4053. *********************

[0210]Todas as publicações e pedidos de patente citados neste relatório descritivo estão incorporados no presente documento a título de referência com se cada publicação ou pedido de patente individual estivesse específica e individualmente indicado como incorporado a título de referência.

Claims (130)

REIVINDICAÇÕES

1.Método CARACTERIZADO pelo fato de que é para tratar distrofia muscular de Duchenne (DMD) em um paciente que necessita do mesmo que tem uma mutação do gene de DMD que é suscetível ao salto de éxon 53, que compreende administrar ao paciente uma dose de golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

2.Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada em uma dosagem de 4 mg/kg de peso corporal do paciente.

3.Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada em uma dosagem de 10 mg/kg de peso corporal do paciente.

4.Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada em uma dosagem de 20 mg/kg de peso corporal do paciente.

5.Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada em uma dosagem de 30 mg/kg de peso corporal do paciente.

6.Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada em uma dosagem de 40 mg/kg de peso corporal do paciente.

7.Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada em uma dosagem de 50 mg/kg de peso corporal do paciente.

8.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada como uma dose única.

9.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada uma vez por semana.

10.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada por via intravenosa.

11.Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada por via intravenosa através de infusão.

12.Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada por via intravenosa através de infusão durante um período de 35 a 60 minutos.

13.Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada por via intravenosa através de injeção subcutânea.

14.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente tem até 40 anos de idade.

15.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente tem até 30 anos de idade.

16.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente tem até 21 anos de idade.

17.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente tem de 1 a 21 anos de idade.

18.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente tem de 5 a 21 anos de idade.

19.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente tem de 6 a 15 anos de idade.

20.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente tem uma mutação do gene de DMD que é selecionado a partir do grupo que consiste em: éxons 3 a 52, 4 a 52, 5 a 52, 6 a 52, 9 a 52, 10 a 52, 11 a 52, 13 a 52, 14 a 52, 15 a 52, 16 a 52, 17 a 52, 19 a 52, 21 a 52, 23 a 52, 24 a 52, 25 a 52, 26 a 52, 27 a 52, 28 a 52, 29 a 52, 30 a 52, 31 a 52, 32 a 52, 33 a 52, 34 a 52, 35 a 52, 36 a 52, 37 a 52, 38 a 52, 39 a 52, 40 a 52, 41 a

52, 43 a 52, 42 a 52, 45 a 52, 47 a 52, 48 a 52, 49 a 52, 50 a 52, 54 a 58, 54 a 61, 54 a 63, 54 a 64, 54 a 66, 54 a 76, 54 a 77, e éxon 52.

21.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe cronicamente golodirsen.

22.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por pelo menos 48 semanas.

23.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de um ano.

24.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de dois anos.

25.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de três anos.

26.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de quatro anos.

27.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de cinco anos.

28.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de dez anos.

29.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de vinte anos.

30.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de trinta anos.

31.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe uma dose estável de corticosteroides durante pelo menos 6 meses antes da administração de golodirsen.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe uma dose estável de corticosteroides durante pelo menos 6 meses antes da administração de golodirsen e permanece sob corticosteroides durante a administração de golodirsen.

33.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é formulado como uma composição farmacêutica.

34.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é formulado como uma composição farmacêutica.

35.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é formulado como uma composição farmacêutica que tem uma força de 50 mg/ml.

36.Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é formulado como uma composição farmacêutica que tem uma força de 50 mg/ml e apresentado em uma forma de dosagem de 100 mg/2 ml.

37.Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tem uma força de 50 mg/ml e se apresenta em uma forma de dosagem de 500 mg/2 ml.

38.Método, de acordo com a reivindicação 35 ou 36, CARACTERIZADO pelo fato de que a forma de dosagem está contida em um frasco de uso único.

39.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 37, CARACTERIZADO pelo fato de que golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é formulado como uma composição farmacêutica que compreende golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um carreador farmaceuticamente aceitável.

40.Método, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que o carreador farmaceuticamente aceitável é uma solução tamponada de fosfato.

41.Método CARACTERIZADO pelo fato de que é para restaurar um quadro de leitura de mRNA para induzir salto de éxon em um paciente com distrofia muscular de Duchenne (DMD) que necessita do mesmo que tem uma mutação do gene de DMD que é suscetível ao salto de éxon 53, que compreende administrar ao paciente uma dose de golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

42.Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada em uma dosagem de 4 mg/kg de peso corporal do paciente.

43.Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada em uma dosagem de 10 mg/kg de peso corporal do paciente.

44.Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada em uma dosagem de 20 mg/kg de peso corporal do paciente.

45.Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada em uma dosagem de 30 mg/kg de peso corporal do paciente.

46.Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada em uma dosagem de 40 mg/kg de peso corporal do paciente.

47.Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada em uma dosagem de 50 mg/kg de peso corporal do paciente.

48.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 46, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada como uma dose única.

49.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 47, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada uma vez por semana.

50.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 48, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada por via intravenosa.

51.Método, de acordo com a reivindicação 49, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada por via intravenosa através de infusão.

52.Método, de acordo com a reivindicação 50, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada por via intravenosa através de infusão durante um período de 35 a 60 minutos.

53.Método, de acordo com a reivindicação 47, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada por via intravenosa através de injeção subcutânea.

54.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente tem até 40 anos de idade.

55.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente tem até 30 anos de idade.

56.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente tem até 21 anos de idade.

57.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores,

CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente tem de 1 a 21 anos de idade.

58.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente tem de 5 a 21 anos de idade.

59.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente tem de 6 a 15 anos de idade.

60.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente tem uma mutação do gene de DMD que é selecionado a partir do grupo que consiste em: éxons 3 a 52, 4 a 52, 5 a 52, 6 a 52, 9 a 52, 10 a 52, 11 a 52, 13 a 52, 14 a 52, 15 a 52, 16 a 52, 17 a 52, 19 a 52, 21 a 52, 23 a 52, 24 a 52, 25 a 52, 26 a 52, 27 a 52, 28 a 52, 29 a 52, 30 a 52, 31 a 52, 32 a 52, 33 a 52, 34 a 52, 35 a 52, 36 a 52, 37 a 52, 38 a 52, 39 a 52, 40 a 52, 41 a 52, 43 a 52, 42 a 52, 45 a 52, 47 a 52, 48 a 52, 49 a 52, 50 a 52, 54 a 58, 54 a 61, 54 a 63, 54 a 64, 54 a 66, 54 a 76, 54 a 77, e éxon 52.

61.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe cronicamente golodirsen.

62.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por pelo menos 48 semanas.

63.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de um ano.

64.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de dois anos.

65.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de três anos.

66.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de quatro anos.

67.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de cinco anos.

68.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de dez anos.

69.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de vinte anos.

70.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de trinta anos.

71.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe uma dose estável de corticosteroides durante pelo menos 6 meses antes da administração de golodirsen.

72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe uma dose estável de corticosteroides durante pelo menos 6 meses antes da administração de golodirsen e permanece sob corticosteroides durante a administração de golodirsen.

73.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é formulado como uma composição farmacêutica.

74.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é formulado como uma composição farmacêutica.

75.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é formulado como uma composição farmacêutica que tem uma força de 50 mg/ml.

76.Método, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é formulado como uma composição farmacêutica que tem uma força de 50 mg/ml e apresentado em uma forma de dosagem de 100 mg/2 ml.

77.Método, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tem uma força de 50 mg/ml e se apresenta em uma forma de dosagem de 500 mg/2 ml.

78.Método, de acordo com a reivindicação 74 ou 75, CARACTERIZADO pelo fato de que a forma de dosagem está contida em um frasco de uso único.

79.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 76, CARACTERIZADO pelo fato de que golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é formulado como uma composição farmacêutica que compreende golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um carreador farmaceuticamente aceitável.

80.Método, de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que o carreador farmaceuticamente aceitável é uma solução tamponada de fosfato.

81.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 78, CARACTERIZADO pelo fato de que o salto de éxon é medido através de reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa (RT-PCR).

82.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 79, em que o método é CARACTERIZADO pelo fato de que aumenta produção de distrofina no paciente.

83.Método, de acordo com a reivindicação 80, CARACTERIZADO pelo fato de que a produção de distrofina é medida através de análise de western blot.

84.Método, de acordo com a reivindicação 80, CARACTERIZADO pelo fato de que a produção de distrofina é medida através de imuno-histoquímica (IHC).

85.Método CARACTERIZADO pelo fato de que é para aumentar produção de distrofina em um paciente com distrofia muscular de Duchenne (DMD) que necessita do mesmo que tem uma mutação do gene de DMD que é suscetível ao salto de éxon 53, que compreende administrar ao paciente uma dose de golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

86.Método, de acordo com a reivindicação 80, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada em uma dosagem de 4 mg/kg de peso corporal.

87.Método, de acordo com a reivindicação 80, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada em uma dosagem de 10 mg/kg de peso corporal do paciente.

88.Método, de acordo com a reivindicação 80, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada em uma dosagem de 20 mg/kg de peso corporal do paciente.

89.Método, de acordo com a reivindicação 80, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada em uma dosagem de 30 mg/kg de peso corporal do paciente.

90.Método, de acordo com a reivindicação 80, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada em uma dosagem de 40 mg/kg de peso corporal do paciente.

91.Método, de acordo com a reivindicação 80, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada em uma dosagem de 50 mg/kg de peso corporal do paciente.

92.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 80 a 86,

CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada como uma dose única.

93.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 80 a 87, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada uma vez por semana.

94.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 80 a 88, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada por via intravenosa.

95.Método, de acordo com a reivindicação 89, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada por via intravenosa através de infusão.

96.Método, de acordo com a reivindicação 90, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada por via intravenosa através de infusão durante um período de 35 a 60 minutos.

97.Método, de acordo com a reivindicação 89, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose é administrada por via intravenosa através de injeção subcutânea.

98.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente tem até 40 anos de idade.

99.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente tem até 30 anos de idade.

100.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente tem até 21 anos de idade.

101.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente tem de 1 a 21 anos de idade.

102.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente tem de 5 a 21 anos de idade.

103.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente tem de 6 a 15 anos de idade.

104.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente tem uma mutação do gene de DMD que é selecionado a partir do grupo que consiste em: éxons 3 a 52, 4 a 52, 5 a 52, 6 a 52, 9 a 52, 10 a 52, 11 a 52, 13 a 52, 14 a 52, 15 a 52, 16 a 52, 17 a 52, 19 a 52, 21 a 52, 23 a 52, 24 a 52, 25 a 52, 26 a 52, 27 a 52, 28 a 52, 29 a 52, 30 a 52, 31 a 52, 32 a 52, 33 a 52, 34 a 52, 35 a 52, 36 a 52, 37 a 52, 38 a 52, 39 a 52, 40 a 52, 41 a 52, 43 a 52, 42 a 52, 45 a 52, 47 a 52, 48 a 52, 49 a 52, 50 a 52, 54 a 58, 54 a 61, 54 a 63, 54 a 64, 54 a 66, 54 a 76, 54 a 77, e éxon 52.

105.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe cronicamente golodirsen.

106.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por pelo menos 48 semanas.

107.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de um ano.

108.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de dois anos.

109.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de três anos.

110.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de quatro anos.

111.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de cinco anos.

112.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de dez anos.

113.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de vinte anos.

114.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe golodirsen por mais de trinta anos.

115.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe uma dose estável de corticosteroides durante pelo menos 6 meses antes da administração de golodirsen.

116. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente recebe uma dose estável de corticosteroides durante pelo menos 6 meses antes da administração de golodirsen e permanece sob corticosteroides durante a administração de golodirsen.

117.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é formulado como uma composição farmacêutica.

118.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é formulado como uma composição farmacêutica.

119.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é formulado como uma composição farmacêutica que tem uma força de 50 mg/ml.

120.Método, de acordo com a reivindicação 113, CARACTERIZADO pelo fato de que golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é formulado como uma composição farmacêutica que tem uma força de 50 mg/ml e apresentado em uma forma de dosagem de 100 mg/2 ml.

121.Método, de acordo com a reivindicação 113, CARACTERIZADO pelo fato de que golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tem uma força de 50 mg/ml e se apresenta em uma forma de dosagem de 500 mg/2 ml.

122.Método, de acordo com a reivindicação 112 ou 113, CARACTERIZADO pelo fato de que a forma de dosagem está contida em um frasco de uso único.

123.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 116, CARACTERIZADO pelo fato de que golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é formulado como uma composição farmacêutica que compreende golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um carreador farmaceuticamente aceitável.

124.Método, de acordo com a reivindicação 117, CARACTERIZADO pelo fato de que o carreador farmaceuticamente aceitável é uma solução tamponada de fosfato.

125.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 80 a 118, CARACTERIZADO pelo fato de que a produção de distrofina é medida através de análise de western blot.

126.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 80 a 118, CARACTERIZADO pelo fato de que a produção de distrofina é medida através de imuno-histoquímica (IHC).

127.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente confirmar que o paciente tem uma mutação no gene de DMD que é suscetível ao salto de éxon 53 antes de administrar golodirsen.

128.Golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso no tratamento de distrofia muscular de Duchenne (DMD) em um paciente que necessita do mesmo, sendo que o paciente tem uma mutação do gene de DMD que é suscetível ao salto de éxon 53, em que o tratamento compreende administrar ao paciente uma dose intravenosa única de eteplirsen de 30 mg/kg uma vez por semana.

129.Golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso na restauração de um quadro de leitura de mRNA para induzir salto de éxon em um paciente com distrofia muscular de Duchenne (DMD) que necessita do mesmo, sendo que o paciente tem uma mutação do gene de DMD que é suscetível ao salto de éxon 53, em que o tratamento compreende administrar ao paciente uma dose intravenosa única de eteplirsen de 30 mg/kg uma vez por semana.

130.Golodirsen ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso no aumento de produção de distrofina em um paciente com distrofia muscular de Duchenne (DMD) que necessita do mesmo, sendo que o paciente tem uma mutação do gene de DMD que é suscetível ao salto de éxon 53, em que o tratamento compreende administrar ao paciente uma dose intravenosa única de eteplirsen de 30 mg/kg uma vez por semana.