JP2002167441A - リン含有キラルインターサブユニットリンケージを有する非電荷モルホリノー基体ポリマー - Google Patents
リン含有キラルインターサブユニットリンケージを有する非電荷モルホリノー基体ポリマーInfo
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- C08G79/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing atoms other than silicon, sulfur, nitrogen, oxygen, and carbon with or without the latter elements in the main chain of the macromolecule a linkage containing phosphorus
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 リン含有キラルインターサブユニットリンケ
ージを有する非電荷モルホリノー基体ポリマー 【解決手段】 ポリマーは、長さ１ないし３個の原子
の、非電荷リン- 含有キラルリンケージによって一緒に
連結されたモルホリノサブユニット構造から成ることが
明らかである。これらのキラルリンケージは、隣接サブ
ユニットの5'エキソ環状炭素にあるサブユニットのモル
ホリノ窒素を結合する。各サブユニットは、ターゲット
ポリヌクレオチド中で特異的塩基又は塩基- 対に結合す
る水素によって結合するのに有効なプリン又はピリミジ
ン塩基の対合部分を含有する。
ージを有する非電荷モルホリノー基体ポリマー 【解決手段】 ポリマーは、長さ１ないし３個の原子
の、非電荷リン- 含有キラルリンケージによって一緒に
連結されたモルホリノサブユニット構造から成ることが
明らかである。これらのキラルリンケージは、隣接サブ
ユニットの5'エキソ環状炭素にあるサブユニットのモル
ホリノ窒素を結合する。各サブユニットは、ターゲット
ポリヌクレオチド中で特異的塩基又は塩基- 対に結合す
る水素によって結合するのに有効なプリン又はピリミジ
ン塩基の対合部分を含有する。
Description
【０００１】本発明の分野 本発明は、モルホリノー基体ポリマーに関する。
【０００２】文献 アガルヴアル、Proc Nat Acad Sci 85：7079(1988). アテンシオ、E. J., 等、 (編集者) 、Nucleotide Seq
uences: a compilation from GENBANK and EMBL data l
ibraries, 第６巻ウイルス、アカデミックプレス(1986-
87). バルゴビン、N., 等、テトラヘドロンレター、22:3667
(1981). ベリコバ、テトラヘドロンレター、37:3557(1967). ブラケ等、Biochem,24:6132(1985a). ブラケ等、Biochem 24:6139(1985b). ボバー等、Nucleic Acids Res.15:4915(1987). デクスヒト等、Canadian J Chem,66:2989(1988). フローラー等、Nucleic Acids Res.16:4831(1988). ホックス、J.J., 等、J Am Chem Soc,80:1669(1958). ガイト、 "オリゴヌクレオチド合成 実験的 "アプロー
チ" 第31−33頁、IRLPress ( オックスホード、英国)(1
984). グリフエン等、Biomed. & Environ. Mass Spectrometry
17:105(1987). ゴールドバーグ、M.L.等、酵素学の方法68:206(1979). グリーンリー、J Org Chem, 49 2632(1984). グルンスタイン、M.等; 68:379(1979). ヒンメルスバッハ、F., and W. プスライターラー、テ
トラヘドロンレター、24:3583(1983). ジェアーマン等、Proc Natl Acad Sci USA 78:1537(19
81). カミムラ等、Chem Lett (The Chem. Soc. of Japan) p
g. 1051(1983) ラプランチ等、Nucleic Acids Res,14:9081(1986). レーマン、L.S., "DNA Probes: Applications in Genet
ic and InfectiousDisease and Cancer, "Current Comm
in Molec Biol (Cold Spring HarborLaboratory)(198
6). レトジンガー及びミラー、J Amer Chem Soc,91:3356(19
69). マイヤ、G., 等、 (編集者) 、Human Retroviruses and
AIDS: A compilationand analysis of amino acid and
nucleic acid sequences, TheoreticalBiology and Bi
ophysics Group, Los Alamos NM (LAUR90-1393)(1990). マクブリッジ等、J Amer Chem Soc 108:2040(1986). Miller等、Biochemistry 18:5134(1979). Miller等、J Biol Chem 255:6959(1980). Miller等、Biochimie 67:769(1985). Murakami等、Biochemistry 24:4041(1985). ニードバルラ、U., 及びH.ホルブルゲン、J Org Chem,
39:3668(1974). ピタ、Biochem Biophys Acta 204:39(1970a). ピタ、Biopolymers 9:965(1970b). Reese, C.B.,及びR.S. Saffhill, J Chem Soc Perkintr
ans,1:2937(1972). スミス等、J.A.C.S.80:6204(1958). スミス等、Proc Natl Acad Sci USA 83:2787(1986). Southern, E.; Methods in Enzymology 68:152(1979) スチルチャク E.P. 等、Organic Chem. 52:4202(1987). サマートン、J., 等、J Molec Biol 122:145(1978) サマートン、J., 等、J Molec Biol 78:61(1979a). サマートン、J., J Molec Biol 78:77(1979b). スゾスタック、J.W.等、Methods in Enzymology 68:419
(1979). トーマス、P.; Methods in Enzymology 100:255(1983). トウルメ等、Proc Nat Acad Sci USA,83:1227(1986). トリヒチンガー等、テトラヘドロンレター 24:711(198
3).本発明の背景 ポリヌクレオチドに塩基- 特異的結合するためのポリマ
ーは、病原体の特異的な遺伝子配列特徴の試験管内検出
及び多くの疾病──特にウィルス疾病──を引き起こす
遺伝子配列の生体内不活性化の両方に著しい可能性を有
する。
uences: a compilation from GENBANK and EMBL data l
ibraries, 第６巻ウイルス、アカデミックプレス(1986-
87). バルゴビン、N., 等、テトラヘドロンレター、22:3667
(1981). ベリコバ、テトラヘドロンレター、37:3557(1967). ブラケ等、Biochem,24:6132(1985a). ブラケ等、Biochem 24:6139(1985b). ボバー等、Nucleic Acids Res.15:4915(1987). デクスヒト等、Canadian J Chem,66:2989(1988). フローラー等、Nucleic Acids Res.16:4831(1988). ホックス、J.J., 等、J Am Chem Soc,80:1669(1958). ガイト、 "オリゴヌクレオチド合成 実験的 "アプロー
チ" 第31−33頁、IRLPress ( オックスホード、英国)(1
984). グリフエン等、Biomed. & Environ. Mass Spectrometry
17:105(1987). ゴールドバーグ、M.L.等、酵素学の方法68:206(1979). グリーンリー、J Org Chem, 49 2632(1984). グルンスタイン、M.等; 68:379(1979). ヒンメルスバッハ、F., and W. プスライターラー、テ
トラヘドロンレター、24:3583(1983). ジェアーマン等、Proc Natl Acad Sci USA 78:1537(19
81). カミムラ等、Chem Lett (The Chem. Soc. of Japan) p
g. 1051(1983) ラプランチ等、Nucleic Acids Res,14:9081(1986). レーマン、L.S., "DNA Probes: Applications in Genet
ic and InfectiousDisease and Cancer, "Current Comm
in Molec Biol (Cold Spring HarborLaboratory)(198
6). レトジンガー及びミラー、J Amer Chem Soc,91:3356(19
69). マイヤ、G., 等、 (編集者) 、Human Retroviruses and
AIDS: A compilationand analysis of amino acid and
nucleic acid sequences, TheoreticalBiology and Bi
ophysics Group, Los Alamos NM (LAUR90-1393)(1990). マクブリッジ等、J Amer Chem Soc 108:2040(1986). Miller等、Biochemistry 18:5134(1979). Miller等、J Biol Chem 255:6959(1980). Miller等、Biochimie 67:769(1985). Murakami等、Biochemistry 24:4041(1985). ニードバルラ、U., 及びH.ホルブルゲン、J Org Chem,
39:3668(1974). ピタ、Biochem Biophys Acta 204:39(1970a). ピタ、Biopolymers 9:965(1970b). Reese, C.B.,及びR.S. Saffhill, J Chem Soc Perkintr
ans,1:2937(1972). スミス等、J.A.C.S.80:6204(1958). スミス等、Proc Natl Acad Sci USA 83:2787(1986). Southern, E.; Methods in Enzymology 68:152(1979) スチルチャク E.P. 等、Organic Chem. 52:4202(1987). サマートン、J., 等、J Molec Biol 122:145(1978) サマートン、J., 等、J Molec Biol 78:61(1979a). サマートン、J., J Molec Biol 78:77(1979b). スゾスタック、J.W.等、Methods in Enzymology 68:419
(1979). トーマス、P.; Methods in Enzymology 100:255(1983). トウルメ等、Proc Nat Acad Sci USA,83:1227(1986). トリヒチンガー等、テトラヘドロンレター 24:711(198
3).本発明の背景 ポリヌクレオチドに塩基- 特異的結合するためのポリマ
ーは、病原体の特異的な遺伝子配列特徴の試験管内検出
及び多くの疾病──特にウィルス疾病──を引き起こす
遺伝子配列の生体内不活性化の両方に著しい可能性を有
する。
【０００３】標準のリボ- 及びデオキシリボヌクレオチ
ドポリマーは、相補的遺伝子配列の検出及び比較的最近
ではターゲットの遺伝子配列の不活性化の両方に広く使
用されている。しかし、標準のポリヌクレオチドは、タ
ーゲットオリゴヌクレオチドに塩基- 特異的結合するの
に使用される場合、多くの制限に悩まされている。この
制限は、(i) 生体膜を横切る限定された通路、(ii)ヌク
レアーゼ感受性、(ii)イオン濃度に敏感なターゲット結
合、及び(iv)細胞の標準- 分離メカニズムに対する感受
率を含む。
ドポリマーは、相補的遺伝子配列の検出及び比較的最近
ではターゲットの遺伝子配列の不活性化の両方に広く使
用されている。しかし、標準のポリヌクレオチドは、タ
ーゲットオリゴヌクレオチドに塩基- 特異的結合するの
に使用される場合、多くの制限に悩まされている。この
制限は、(i) 生体膜を横切る限定された通路、(ii)ヌク
レアーゼ感受性、(ii)イオン濃度に敏感なターゲット結
合、及び(iv)細胞の標準- 分離メカニズムに対する感受
率を含む。
【０００４】原則的に、上記制限を、塩基が非電荷要素
に沿って連結されるポリ核酸同族体を形成することによ
って克服し又は最小化することができる。非電荷核酸同
族体の例は、報告されている。Pitha 等(1970a,b) は、
核酸の正常糖- ホスフエート要素をポリビニル要素によ
って置き代えられた、種々のホモポリマーポリヌクレオ
チド同族体について述べている。これらの核酸同族体
は、相補的ポリヌクレオチドと、しかし実質上減少され
たTm値と共に予想されるワトソン／クリックペアリング
特異性を有すると報告されている(Pitha, 1970a)。この
研究の１つの重大な制限は、所望された塩基配列でポリ
マーを製造するために、配列サブユニット付加によって
ポリマーを構成することができない。かくてポリマー
を、選択されたターゲット配列に塩基- 特異的結合する
のに使用することができない。デオキシリボヌクレオシ
ドサブユニットの間の非電荷の、しかし立体異性のメチ
ルホスホナートリンケージを有するポリヌクレオチド同
族体も報告されている (ミラー, 1979, 1980, ジェアー
マン；ムラカミ；ブラケ，1985a, 1985b; スミス) 。比
較的最近、種々の非電荷ホスホルアミダート- 結合した
オリゴヌクレオチド同族体も、報告されている (フエー
ラー, 1988) 。これらのポリマーは、非電荷キラルリン
- 含有基を介して１個のサブユニットの3'OH基及び他の
サブユニットの5'OH基で結合したデオキシヌクレオシド
を有する。これらの化合物は、一本鎖ポリヌクレオチド
ターゲット配列に結合する及び選択的にブロックするこ
とが分る。しかし、デオキシリボヌクレオシドフザユニ
ットを用いて非電荷リン- 結合したポリヌクレオチド同
族体は特に高価で、製造が困難である；サブユニット出
発材料は、極めて高価であり、限定された入手可能性を
有する。
に沿って連結されるポリ核酸同族体を形成することによ
って克服し又は最小化することができる。非電荷核酸同
族体の例は、報告されている。Pitha 等(1970a,b) は、
核酸の正常糖- ホスフエート要素をポリビニル要素によ
って置き代えられた、種々のホモポリマーポリヌクレオ
チド同族体について述べている。これらの核酸同族体
は、相補的ポリヌクレオチドと、しかし実質上減少され
たTm値と共に予想されるワトソン／クリックペアリング
特異性を有すると報告されている(Pitha, 1970a)。この
研究の１つの重大な制限は、所望された塩基配列でポリ
マーを製造するために、配列サブユニット付加によって
ポリマーを構成することができない。かくてポリマー
を、選択されたターゲット配列に塩基- 特異的結合する
のに使用することができない。デオキシリボヌクレオシ
ドサブユニットの間の非電荷の、しかし立体異性のメチ
ルホスホナートリンケージを有するポリヌクレオチド同
族体も報告されている (ミラー, 1979, 1980, ジェアー
マン；ムラカミ；ブラケ，1985a, 1985b; スミス) 。比
較的最近、種々の非電荷ホスホルアミダート- 結合した
オリゴヌクレオチド同族体も、報告されている (フエー
ラー, 1988) 。これらのポリマーは、非電荷キラルリン
- 含有基を介して１個のサブユニットの3'OH基及び他の
サブユニットの5'OH基で結合したデオキシヌクレオシド
を有する。これらの化合物は、一本鎖ポリヌクレオチド
ターゲット配列に結合する及び選択的にブロックするこ
とが分る。しかし、デオキシリボヌクレオシドフザユニ
ットを用いて非電荷リン- 結合したポリヌクレオチド同
族体は特に高価で、製造が困難である；サブユニット出
発材料は、極めて高価であり、限定された入手可能性を
有する。
【０００５】より最近では、非電荷のアキラルサブユニ
ットリンケージを有するデオキシリボヌクレオチド同族
体が、構成されている (スチルチャック1987) 。これら
の非電荷のアキラルデオキシリボヌクレオシド- 誘導さ
れた同族体は、上述の様に、出発材料の比較的高い価格
によって制限される。
ットリンケージを有するデオキシリボヌクレオチド同族
体が、構成されている (スチルチャック1987) 。これら
の非電荷のアキラルデオキシリボヌクレオシド- 誘導さ
れた同族体は、上述の様に、出発材料の比較的高い価格
によって制限される。
【０００６】本発明の要旨 一つの一般的、本発明の目的は、ポリヌクレオチドへの
配列- 特異的結合を可能にするポリマーを提供し、上記
ポリマーに準じるポリヌクレオチドに関連する多くの問
題及び制限を克服する又は最小化することである。
配列- 特異的結合を可能にするポリマーを提供し、上記
ポリマーに準じるポリヌクレオチドに関連する多くの問
題及び制限を克服する又は最小化することである。
【０００７】本発明は、次の形：
【０００８】
【化１０】
【０００９】のモルホリノ環構造を有するポリマーを包
含する。
含する。
【００１０】環構造は、１個の環構造のモルホリノ窒素
を隣接環構造の5'エキソ環状炭素に結合する、長さ１〜
３個の原子の、非電荷リン- 含有キラルリンケージによ
って一緒に連結されている。
を隣接環構造の5'エキソ環状炭素に結合する、長さ１〜
３個の原子の、非電荷リン- 含有キラルリンケージによ
って一緒に連結されている。
【００１１】夫々の環構造は、ポリヌクレオチド中でタ
ーゲット配列中の塩基に塩基特異的水素結合によって結
合するのに有効なプリン又はピリミジン残基Piを有す
る。
ーゲット配列中の塩基に塩基特異的水素結合によって結
合するのに有効なプリン又はピリミジン残基Piを有す
る。
【００１２】これら及び他の目的及び本発明の特色は、
本発明の次の詳細な記載が添付された例及び図面と共に
読まれた時に、より一層十分に明らかとなる。
本発明の次の詳細な記載が添付された例及び図面と共に
読まれた時に、より一層十分に明らかとなる。
【００１３】図面の簡単な説明 第１図は、塩基性β- モルホリノ環構造を示し、これは
非電荷の、リン- 含有キラルリンケージによって連結さ
れ、本発明のポリマーを形成する。Piはプリン又はピリ
ミジン塩基残基である。
非電荷の、リン- 含有キラルリンケージによって連結さ
れ、本発明のポリマーを形成する。Piはプリン又はピリ
ミジン塩基残基である。
【００１４】第２図は、いくつかの典型的なプリン- 及
びピリミジン塩基残基 (第１図中に示される環構造のPi
として表わされる) を示し、その際X=H, CH3, F, Cl,
Br又はI 。
びピリミジン塩基残基 (第１図中に示される環構造のPi
として表わされる) を示し、その際X=H, CH3, F, Cl,
Br又はI 。
【００１５】第３図は、ポリマー形成に適する5-原子
(A), 6-原子(B) 及び7-原子(C-E) 連結基を有するいく
つかの好ましいサブユニットを示す。この際X=-CH2R, -
O-CH2R, -S-CH2R, -NR1R2 , 又はF, CH3, 又はターゲッ
ト結合を妨害しない他の部分。R1及びR2は、(i) 同一又
は異なり、(ii) R又は脂環式又は芳香族部分から選択さ
れてよい。Y1=O, S, CH2, 又はNR。Y2=O, S, 又はCH2,
Y3=O, S, 又はNR。Z=O又はS 。
(A), 6-原子(B) 及び7-原子(C-E) 連結基を有するいく
つかの好ましいサブユニットを示す。この際X=-CH2R, -
O-CH2R, -S-CH2R, -NR1R2 , 又はF, CH3, 又はターゲッ
ト結合を妨害しない他の部分。R1及びR2は、(i) 同一又
は異なり、(ii) R又は脂環式又は芳香族部分から選択さ
れてよい。Y1=O, S, CH2, 又はNR。Y2=O, S, 又はCH2,
Y3=O, S, 又はNR。Z=O又はS 。
【００１６】第４図は、典型的なモルホリノ- 基体ポリ
マーのくり返しサブユニットセグメントを示し、これは
第３図の、サブユニットA-E 夫々を用いて構成され、A-
A からE-E で表わされる。X, Y, 及びZ は第３図中と同
じである。Pi及びPjは、プリン又はピリミジン塩基残基
である。
マーのくり返しサブユニットセグメントを示し、これは
第３図の、サブユニットA-E 夫々を用いて構成され、A-
A からE-E で表わされる。X, Y, 及びZ は第３図中と同
じである。Pi及びPjは、プリン又はピリミジン塩基残基
である。
【００１７】第５図は、リボヌクレオシドからいくつか
のタイプのモルホリノサブユニットを合成する工程を示
す。
のタイプのモルホリノサブユニットを合成する工程を示
す。
【００１８】第６図は、塩基性モルホリノサブユニット
の別の合成を示す。
の別の合成を示す。
【００１９】第７図は、7-原子くり返し- 単位要素を有
するポリマーの構造で示されるモルホリノサブユニット
を合成する工程を示す。
するポリマーの構造で示されるモルホリノサブユニット
を合成する工程を示す。
【００２０】第８図は、2-アミン- 含有プリンの夫々の
ターゲット塩基- 対の極性主要- 溝基 (第8a図) 及び二
重- 結合ポリマーの代表的塩基配列 (第8b図) への結合
様式を示す。第8b図中、a=アデニン；c=チトシン；g=グ
アニジン；t=チミン；u=ウラシル；D=2,6-ジアミノプリ
ン又は2-アミノプリン；G=グアニジン又はチオグアニジ
ン；l=高特異性水素結合；及び:=低特異性水素結合。
ターゲット塩基- 対の極性主要- 溝基 (第8a図) 及び二
重- 結合ポリマーの代表的塩基配列 (第8b図) への結合
様式を示す。第8b図中、a=アデニン；c=チトシン；g=グ
アニジン；t=チミン；u=ウラシル；D=2,6-ジアミノプリ
ン又は2-アミノプリン；G=グアニジン又はチオグアニジ
ン；l=高特異性水素結合；及び:=低特異性水素結合。
【００２１】第９図は、ホスホンアミドリンケージによ
って２個のモルホリノサブユニットを連結する工程を示
す。
って２個のモルホリノサブユニットを連結する工程を示
す。
【００２２】第10図は、ホスホルアミダートリンケージ
によってモルホリノサブユニットを連結する工程を示
す。
によってモルホリノサブユニットを連結する工程を示
す。
【００２３】第11図は、ホスホンエステルリンケージに
よるモルホリノサブユニットの連結を示す。
よるモルホリノサブユニットの連結を示す。
【００２４】第12図は、モルホリノ環構造を同時に生じ
るサブユニットカップリング操作を示す。
るサブユニットカップリング操作を示す。
【００２５】第13図は、( モルホリノ)(6)6/ポリ(G) 複
合に関する末端変性プロットを示し、そこで (モルホリ
ノ)(C)6 ポリマーを、本発明に従って構成する。
合に関する末端変性プロットを示し、そこで (モルホリ
ノ)(C)6 ポリマーを、本発明に従って構成する。
【００２６】第14図は、プローブ- 診断システム中でモ
ルホリノポリマーの使用を示す。
ルホリノポリマーの使用を示す。
【００２７】本発明の詳細な説明 本発明は、ポリヌクレオチドのターゲット配列に塩基-
特異的結合するためのモルホリノ- 基体ポリマーを含
む。このポリマーは、モルホリノ- 基体環構造から成
り、この構造は隣接構造の5'エキソ環状炭素に１つの構
造のモルホリノ窒素を接続する、長さ１〜３個の原子
の、非電荷の、キラルリンケージによって一緒に連結す
る。
特異的結合するためのモルホリノ- 基体ポリマーを含
む。このポリマーは、モルホリノ- 基体環構造から成
り、この構造は隣接構造の5'エキソ環状炭素に１つの構
造のモルホリノ窒素を接続する、長さ１〜３個の原子
の、非電荷の、キラルリンケージによって一緒に連結す
る。
【００２８】Ａ．モルホリノ- 基体サブユニット 第１図は、ポリマーサブユニットを基体とするβ- モル
ホリノ環構造を示す。そこでモルホリノ炭素原子に、親
リボースに於ける様に番号をつける。第１図中に見られ
る様に、環構造はβ- 配向で4'炭素に結合する5'- メチ
レンを有する。
ホリノ環構造を示す。そこでモルホリノ炭素原子に、親
リボースに於ける様に番号をつける。第１図中に見られ
る様に、環構造はβ- 配向で4'炭素に結合する5'- メチ
レンを有する。
【００２９】夫々の環構造は、プリン又はピリミジンあ
るいは関連する水素- 結合部分、β- 配向でリンケージ
によって骨格モルホリン部分に結合するPiを有する。
るいは関連する水素- 結合部分、β- 配向でリンケージ
によって骨格モルホリン部分に結合するPiを有する。
【００３０】プリン水素- 結合部分又は塩基は、プリン
及び原子１又は数個、たとえばN3,N7, 又はN9が適当な
原子、たとえば炭素によって、又はC8は窒素によって代
えられる 5−6 員縮合環を有するプリン- 様プレーナー
環構造を有する。ピリミジン部分も同様に、ピリミジン
及び原子１又は数個、たとえばN1が適する原子、たとえ
ば炭素によって代えられるピリミジン- 様プラナー6-員
環を有する。本発明に於て、好ましい水素- 結合部分
は、第２図中に示される一連のプリン及びピリミジンを
有する。夫々の塩基は、ポリヌクレオチド塩基又は塩基
- 対に特異的な、水素- 結合部位少なくとも２個を有す
る。ポリマーを一本鎖ポリヌクレオチドへの配列- 特異
的に結合に使用する場合、プリン構造１から３はチアミ
ン又はウラシル塩基に；構造 7−8 はグアニジン塩基
に、構造 4−6 はチトシン塩基；及び構造９はアデニン
塩基に結合する。
及び原子１又は数個、たとえばN3,N7, 又はN9が適当な
原子、たとえば炭素によって、又はC8は窒素によって代
えられる 5−6 員縮合環を有するプリン- 様プレーナー
環構造を有する。ピリミジン部分も同様に、ピリミジン
及び原子１又は数個、たとえばN1が適する原子、たとえ
ば炭素によって代えられるピリミジン- 様プラナー6-員
環を有する。本発明に於て、好ましい水素- 結合部分
は、第２図中に示される一連のプリン及びピリミジンを
有する。夫々の塩基は、ポリヌクレオチド塩基又は塩基
- 対に特異的な、水素- 結合部位少なくとも２個を有す
る。ポリマーを一本鎖ポリヌクレオチドへの配列- 特異
的に結合に使用する場合、プリン構造１から３はチアミ
ン又はウラシル塩基に；構造 7−8 はグアニジン塩基
に、構造 4−6 はチトシン塩基；及び構造９はアデニン
塩基に結合する。
【００３１】本発明のポリマーは、以下に説明する様
に、一本鎖中にほとんどプリン塩基及び相補的鎖中にほ
とんどピリミジン塩基を有する二重ポリヌクレオチド中
で主要- 溝によって接近可能な水素- 結合部位と結合す
るのに有利である。
に、一本鎖中にほとんどプリン塩基及び相補的鎖中にほ
とんどピリミジン塩基を有する二重ポリヌクレオチド中
で主要- 溝によって接近可能な水素- 結合部位と結合す
るのに有利である。
【００３２】二重核酸の種々の塩基- 対中で２個の中央
極性主要- 溝部位の類似タイプ及び位置に基づき (すな
わちCG塩基- 対のNH6 及び04はAT- 塩基- 対のNH6 およ
び04として同一 H- 結合配列を提示する。）、二重- 結
合ポリマーのH-結合部分は、ターゲット遺伝子二重体中
に一定の塩基対を特有に認めるために、そのターゲット
塩基- 対のN7への水素- 結合がなければならない。かく
て、一方の鎖に主にプリン及びもう一方の鎖にピリミジ
ンを有する二重遺伝子配列をターゲットとする本発明の
ポリマーに於て、ポリマーの水素- 結合部分は２位にア
ミンを有するプリンを含有するのが好ましい。というの
はそのアミンをターゲット塩基- 対のN7へのH-結合に対
して位置づけるのが適当であるからである。より特異的
に、第２図の構造２のよび３は、TA又はUA塩基- 対への
特異的結合を提供し、一方構造４及び６はCG塩基- 対へ
の特異的結合を提供する。二重- 結合ポリマー中で特に
有用である２個の塩基は、2,6-ジアミノプリン (構造
３）及びグアニン（構造４）である。第8A図は、この２
個の塩基が二重核酸中でその夫々のターゲット塩基対の
極性主要- 溝への結合を示す。第8B図は、二重状態でタ
ーゲット遺伝子配列を結合するポリマーの代表的な塩基
配列を示す。
極性主要- 溝部位の類似タイプ及び位置に基づき (すな
わちCG塩基- 対のNH6 及び04はAT- 塩基- 対のNH6 およ
び04として同一 H- 結合配列を提示する。）、二重- 結
合ポリマーのH-結合部分は、ターゲット遺伝子二重体中
に一定の塩基対を特有に認めるために、そのターゲット
塩基- 対のN7への水素- 結合がなければならない。かく
て、一方の鎖に主にプリン及びもう一方の鎖にピリミジ
ンを有する二重遺伝子配列をターゲットとする本発明の
ポリマーに於て、ポリマーの水素- 結合部分は２位にア
ミンを有するプリンを含有するのが好ましい。というの
はそのアミンをターゲット塩基- 対のN7へのH-結合に対
して位置づけるのが適当であるからである。より特異的
に、第２図の構造２のよび３は、TA又はUA塩基- 対への
特異的結合を提供し、一方構造４及び６はCG塩基- 対へ
の特異的結合を提供する。二重- 結合ポリマー中で特に
有用である２個の塩基は、2,6-ジアミノプリン (構造
３）及びグアニン（構造４）である。第8A図は、この２
個の塩基が二重核酸中でその夫々のターゲット塩基対の
極性主要- 溝への結合を示す。第8B図は、二重状態でタ
ーゲット遺伝子配列を結合するポリマーの代表的な塩基
配列を示す。
【００３３】主に2-アミン- 含有プリンを含有し、しか
も二重遺伝子配列の極性主要- 溝部位への高- 特異性結
合に適するポリマーは、モルホリノ- 基体骨格に加え
て、他の骨格を用いてそのターゲットとされる遺伝子二
重体への有効な結合を提供することができる。この様な
他の骨格の例は、ホスホジエステル- 結合されたデオキ
シリボヌクレオシドを有し、そこでリン上のペンダント
基は次のものの１つである：負に電荷した酸素（すなわ
ち天然DNA 骨格) ；メチル又は他のアルキル基 (アルキ
ルホスホナートと呼ばれる）；メトキシ又は他のアルコ
キシ基 (ホスホトリエステルと呼ばれる）；又はモノ-
又はジアルキルアミン (ホスホルアミダートと呼ばれ
る）。この二重- 結合ポリマーに対する他の骨格は上述
の様にリン上にペンダント基を有する及び2'- 酸素上に
メチルを有する又は有しないホスホジエステル- 結合さ
れたリボヌクレオシドも有する。
も二重遺伝子配列の極性主要- 溝部位への高- 特異性結
合に適するポリマーは、モルホリノ- 基体骨格に加え
て、他の骨格を用いてそのターゲットとされる遺伝子二
重体への有効な結合を提供することができる。この様な
他の骨格の例は、ホスホジエステル- 結合されたデオキ
シリボヌクレオシドを有し、そこでリン上のペンダント
基は次のものの１つである：負に電荷した酸素（すなわ
ち天然DNA 骨格) ；メチル又は他のアルキル基 (アルキ
ルホスホナートと呼ばれる）；メトキシ又は他のアルコ
キシ基 (ホスホトリエステルと呼ばれる）；又はモノ-
又はジアルキルアミン (ホスホルアミダートと呼ばれ
る）。この二重- 結合ポリマーに対する他の骨格は上述
の様にリン上にペンダント基を有する及び2'- 酸素上に
メチルを有する又は有しないホスホジエステル- 結合さ
れたリボヌクレオシドも有する。
【００３４】本発明のモルホリノサブユニットを一緒に
し、サブユニットを安定な、キラル、非電荷リンケージ
で連結することによってポリマーを形成する。サブユニ
ットの連結基は、リン- 含有求電子試薬を有し、通常こ
れを連結しうるサブユニットの求核試薬と反応させる。
し、サブユニットを安定な、キラル、非電荷リンケージ
で連結することによってポリマーを形成する。サブユニ
ットの連結基は、リン- 含有求電子試薬を有し、通常こ
れを連結しうるサブユニットの求核試薬と反応させる。
【００３５】ポリマー合成に使用するためのサブユニッ
ト結合基の選択は、いつくかの考慮によって導かれる。
有望なインターサブユニットリンケージの最初のスクリ
ーニング (すなわち不安定にならないことを予測し、リ
ンケージのまわりを自由に回転するか又は単一コンホメ
ーションで存在する、これらのリンケージ) は、空間-
充填CPK の又は二重DNA 又はRNA のコンピュータ分子モ
デルの使用を伴う。DNA 及びRNA 二重体は、B-型でオリ
ゴデオキシリボヌクレオチド及びA-型でオリゴリボヌク
レオチド- 含有二重体のX-線回析によって決定されたパ
ラメーターに従って構成される。
ト結合基の選択は、いつくかの考慮によって導かれる。
有望なインターサブユニットリンケージの最初のスクリ
ーニング (すなわち不安定にならないことを予測し、リ
ンケージのまわりを自由に回転するか又は単一コンホメ
ーションで存在する、これらのリンケージ) は、空間-
充填CPK の又は二重DNA 又はRNA のコンピュータ分子モ
デルの使用を伴う。DNA 及びRNA 二重体は、B-型でオリ
ゴデオキシリボヌクレオチド及びA-型でオリゴリボヌク
レオチド- 含有二重体のX-線回析によって決定されたパ
ラメーターに従って構成される。
【００３６】この構成された二重体の夫々は、２つの糖
ホスフアート骨格の１つを除き、モルホリノ環及びイン
ターサブユニットリンケージを含む予期される骨格を、
可能な場合本来の糖- ホスフアート骨格が除かれた塩基
の部位で置き代える。次いで夫々の生じるポリヌクレオ
チド／ポリマー二重体を、ワトソン／クリック塩基対の
共平面性、予期される結合ポリマー骨格中のねじれ及び
角ひずみ、核酸鎖上に加わるゆがみの度合、及び内部鎖
及び外部鎖の非結合相互作用に関して測定する。 本発
明に支持されて行われるこのタイプの最初の研究は、モ
ノホリノ- 基体ポ リマーが、６個の原子の好ましい単
位骨格の長さ（すなわちポリマー中のくり返し骨格鎖中
の原子の数）を有することを示す。しかしモデル研究
は、一定の５- 原子及び7-原子くり返し- 単位モノホリ
ノ- 基体骨格がターゲットにされた遺伝子配列への結合
に対する要求を満たすことも示す。
ホスフアート骨格の１つを除き、モルホリノ環及びイン
ターサブユニットリンケージを含む予期される骨格を、
可能な場合本来の糖- ホスフアート骨格が除かれた塩基
の部位で置き代える。次いで夫々の生じるポリヌクレオ
チド／ポリマー二重体を、ワトソン／クリック塩基対の
共平面性、予期される結合ポリマー骨格中のねじれ及び
角ひずみ、核酸鎖上に加わるゆがみの度合、及び内部鎖
及び外部鎖の非結合相互作用に関して測定する。 本発
明に支持されて行われるこのタイプの最初の研究は、モ
ノホリノ- 基体ポ リマーが、６個の原子の好ましい単
位骨格の長さ（すなわちポリマー中のくり返し骨格鎖中
の原子の数）を有することを示す。しかしモデル研究
は、一定の５- 原子及び7-原子くり返し- 単位モノホリ
ノ- 基体骨格がターゲットにされた遺伝子配列への結合
に対する要求を満たすことも示す。
【００３７】モルホリノ構造それ自体が、４個の原子を
夫々のくり返し骨格単位に分配するので、5-原子、6-原
子、及び6-原子くり返し- 単位骨格中のリンケージは、
夫々１，２，及び３個の原子を骨格の長さに分配する。
すべての場合、環構造間のリンケージは、(a) 非電荷、
(b) キラル、(c) 安定であり、及び(d) ターゲットポリ
ヌクレオチドに結合するのに適するコンホメーションの
採用を許可しなければならない。
夫々のくり返し骨格単位に分配するので、5-原子、6-原
子、及び6-原子くり返し- 単位骨格中のリンケージは、
夫々１，２，及び３個の原子を骨格の長さに分配する。
すべての場合、環構造間のリンケージは、(a) 非電荷、
(b) キラル、(c) 安定であり、及び(d) ターゲットポリ
ヌクレオチドに結合するのに適するコンホメーションの
採用を許可しなければならない。
【００３８】次いで上記モデル研究に於て満足な判断を
受けたサブユニット骨格構造を、合成の容易度で決め
る。インターサブユニットリンケージの実際の化学安定
性は、しばしばモデル化合物又は二量体を用いて決め
る。
受けたサブユニット骨格構造を、合成の容易度で決め
る。インターサブユニットリンケージの実際の化学安定
性は、しばしばモデル化合物又は二量体を用いて決め
る。
【００３９】第３図は、上記概略を述べた制限及び要求
を満たすリンケージ基を有するいくつかの好ましいβ-
モルホリノサブユニットタイプを示す。ポリマーが１よ
り多くのリンケージタイプを有するのが好ましい。
を満たすリンケージ基を有するいくつかの好ましいβ-
モルホリノサブユニットタイプを示す。ポリマーが１よ
り多くのリンケージタイプを有するのが好ましい。
【００４０】第３図中のサブユニットＡは、第４図中に
A-A で示されたくり返し単位骨格を形成する1-原子リン
含有リンケージを有する。そこではモルホリノ環を1-原
子ホスホンアミドリンケージによって結合する。対応す
るキラルチオニル- 含有リンケージ (リン- 含有基でS=
O 部分を置換している）は、水性溶液中で不十分な安定
性を有することが分ったことをここに述べる。
A-A で示されたくり返し単位骨格を形成する1-原子リン
含有リンケージを有する。そこではモルホリノ環を1-原
子ホスホンアミドリンケージによって結合する。対応す
るキラルチオニル- 含有リンケージ (リン- 含有基でS=
O 部分を置換している）は、水性溶液中で不十分な安定
性を有することが分ったことをここに述べる。
【００４１】第３図中にサブユニットＢを、第４図中の
B-B で示した様に6-原子くり返し単位骨格で示す。構造
Ｂに於て、5'モルホリノ炭素をリン基に結合する原子Ｙ
は、イオウ、窒素、炭素又は、好ましくは、酸素であっ
てよい。リンから伸びたＸ部分は次のもののどれかであ
ってよい：フッ素；アルキル又は置換されたアルキル；
アルコキシ又は置換されたアルコキシ；チオアルコキシ
又は置換されたチオアルコキシ；又は非置換、モノ置
換、又はジ置換された窒素、これらは環状構造を含む。
Ｘ部分に適するいくつかの環状置換された窒素はモルホ
リン、ピロール、及びピラゾールである。
B-B で示した様に6-原子くり返し単位骨格で示す。構造
Ｂに於て、5'モルホリノ炭素をリン基に結合する原子Ｙ
は、イオウ、窒素、炭素又は、好ましくは、酸素であっ
てよい。リンから伸びたＸ部分は次のもののどれかであ
ってよい：フッ素；アルキル又は置換されたアルキル；
アルコキシ又は置換されたアルコキシ；チオアルコキシ
又は置換されたチオアルコキシ；又は非置換、モノ置
換、又はジ置換された窒素、これらは環状構造を含む。
Ｘ部分に適するいくつかの環状置換された窒素はモルホ
リン、ピロール、及びピラゾールである。
【００４２】第３図中のサブユニット C-Eを、第４図中
に C-Cから E-Eでしめされている様に7-原子単位- 長さ
の骨格で表わされる。構造Ｃ中で、Ｘ部分は構造Ｂに於
けるのと同一であり、部分Ｙはメチレン、イオウ、又は
好ましくは酸素であってよい。構造Ｄ中、Ｘ及びＹ部分
は構造Ｂ中に於けると同一である。構造Ｅ中、Ｘは構造
Ｂ中に於けると同一であり、ＹはＯ，Ｓ，又はＮＲであ
る。
に C-Cから E-Eでしめされている様に7-原子単位- 長さ
の骨格で表わされる。構造Ｃ中で、Ｘ部分は構造Ｂに於
けるのと同一であり、部分Ｙはメチレン、イオウ、又は
好ましくは酸素であってよい。構造Ｄ中、Ｘ及びＹ部分
は構造Ｂ中に於けると同一である。構造Ｅ中、Ｘは構造
Ｂ中に於けると同一であり、ＹはＯ，Ｓ，又はＮＲであ
る。
【００４３】Ｂ．サブユニット合成 モルホリノ- サブユニットの合成に最も経済的な出発材
料は、一般にリボヌクレオシドである。一般に、水- 結
合部分又は塩基 (たとえばA, U, G, C) を含有するリボ
ヌクレオシドを合成して、ポリマー合成のためのサブユ
ニットの完全な一組を提供する。適するリボヌクレオシ
ドは入手できないので、1-ハロリボース又は、好ましく
は、1 α- ブロモグルコース誘導体を適する塩基に結合
することができ、次いでこのヌクレオシド同族体を所望
のβ- モルホリノ構造にペリオダート開裂を介して変
え、次いで適するアミン上で生じるジアルデヒドを閉環
することができる。
料は、一般にリボヌクレオシドである。一般に、水- 結
合部分又は塩基 (たとえばA, U, G, C) を含有するリボ
ヌクレオシドを合成して、ポリマー合成のためのサブユ
ニットの完全な一組を提供する。適するリボヌクレオシ
ドは入手できないので、1-ハロリボース又は、好ましく
は、1 α- ブロモグルコース誘導体を適する塩基に結合
することができ、次いでこのヌクレオシド同族体を所望
のβ- モルホリノ構造にペリオダート開裂を介して変
え、次いで適するアミン上で生じるジアルデヒドを閉環
することができる。
【００４４】サブユニット合成、活性化、及び／又はカ
ップリングに使用される化合物の反応性のために、塩基
のエキソ環状窒素を保護に通常望まれ、かつしばしば必
要である。この保護基の選択を、(i) 保護されるべき窒
素の比反応性、(ii)サブユニット合成及びカップリング
に関係する反応のタイプ、及び(iii) 塩基脱保護の前に
完成されたポリマーの安定性によって決定する。
ップリングに使用される化合物の反応性のために、塩基
のエキソ環状窒素を保護に通常望まれ、かつしばしば必
要である。この保護基の選択を、(i) 保護されるべき窒
素の比反応性、(ii)サブユニット合成及びカップリング
に関係する反応のタイプ、及び(iii) 塩基脱保護の前に
完成されたポリマーの安定性によって決定する。
【００４５】多くのより普通のリボヌクレオシドを塩基
保護する方法を、例１中に示す。例中に詳述された方法
は、一般にアミン- 保護基を有するヌクレオシドを形成
するのに利用できる。核酸化学に使用される標準の塩基
- 保護基は、しばしば好ましくは次のグループに含まれ
る：C のN4に関するベンゾイル；アデニン(A) のN6に関
するベンゾイル又はp-ニトロベンベイル；グアニン(G)
のN2に関するアセチル、フエニルアセチル又はイソブチ
リル；及び2,6-ジアミノプリン残基に関するN2, N6- ビ
ス (イソブチリル) 。この保護基を、水酸化アンモニウ
ムで処理してポリマーを集めた後に除くことができる。
保護する方法を、例１中に示す。例中に詳述された方法
は、一般にアミン- 保護基を有するヌクレオシドを形成
するのに利用できる。核酸化学に使用される標準の塩基
- 保護基は、しばしば好ましくは次のグループに含まれ
る：C のN4に関するベンゾイル；アデニン(A) のN6に関
するベンゾイル又はp-ニトロベンベイル；グアニン(G)
のN2に関するアセチル、フエニルアセチル又はイソブチ
リル；及び2,6-ジアミノプリン残基に関するN2, N6- ビ
ス (イソブチリル) 。この保護基を、水酸化アンモニウ
ムで処理してポリマーを集めた後に除くことができる。
【００４６】ときどき、求核塩基以外のものによって容
易に除くことができる基でモルホリノサブユニットの塩
基部分を保護することが望ましい。β- 脱離メカニズム
を介して強い非- 求核塩基によって除かれる、適当な塩
基保護基は次のものを含む：ＣのN4及びＡのN6の両方に
関する2-(4- ニトロフエニル) エトキシカルボニル又は
2-( フエニルスルホニル) エトキシカルボニル；及びＧ
のN2に関する9-フルオレニルメトキシカルボニル及び2,
6-ジアミノプリンのN2及びN6。ポリマーをきびしい無水
条件下に、強い非求核塩基1,8-ジアザビシクロ〔5.4.0
〕- ウンデセ-7- エン(DBU) で処理して集めた後、こ
れらの基を除去することができる。
易に除くことができる基でモルホリノサブユニットの塩
基部分を保護することが望ましい。β- 脱離メカニズム
を介して強い非- 求核塩基によって除かれる、適当な塩
基保護基は次のものを含む：ＣのN4及びＡのN6の両方に
関する2-(4- ニトロフエニル) エトキシカルボニル又は
2-( フエニルスルホニル) エトキシカルボニル；及びＧ
のN2に関する9-フルオレニルメトキシカルボニル及び2,
6-ジアミノプリンのN2及びN6。ポリマーをきびしい無水
条件下に、強い非求核塩基1,8-ジアザビシクロ〔5.4.0
〕- ウンデセ-7- エン(DBU) で処理して集めた後、こ
れらの基を除去することができる。
【００４７】代表的なモルホリノサブユニットの合成
を、特に例２−７中に記載する。第５図中に描かれた合
成式に関して、塩基- 保護されたリボヌチレオシドとナ
トリウムペリオダートとを反応させ、中間体2',3'-ジア
ルデヒドを形成し、これはその時アンモニアによって閉
環し、2'及び3'ヒドロキシル基 (親リボースに於ける様
に番号づける、第１図参照）を形成する。次いで化合物
をナトリウムシアノボロヒドリドで処理し、環ヒドロキ
シル基を還元する。環窒素をトリチル誘導化によって又
は次のサブユニットカップリングに対するベンズヒドラ
ールオキシカルボニル基によって保護するのが好まし
い。保護基を、モルホリノサブユニットとトリチルクロ
ライドと又はニトロフエニルベンズヒドリルカルボナー
トとの反応によってあるいはジアルデヒドと第一アミン
との反応によって、第6 図中に示されかつ例３及び５に
記載される様に付加することができる。ヌクレオシド出
発材料の立体化学は、イミニウム段階で反応混合物のph
が約10以上又は約4 以下にならない限り保たれる。
を、特に例２−７中に記載する。第５図中に描かれた合
成式に関して、塩基- 保護されたリボヌチレオシドとナ
トリウムペリオダートとを反応させ、中間体2',3'-ジア
ルデヒドを形成し、これはその時アンモニアによって閉
環し、2'及び3'ヒドロキシル基 (親リボースに於ける様
に番号づける、第１図参照）を形成する。次いで化合物
をナトリウムシアノボロヒドリドで処理し、環ヒドロキ
シル基を還元する。環窒素をトリチル誘導化によって又
は次のサブユニットカップリングに対するベンズヒドラ
ールオキシカルボニル基によって保護するのが好まし
い。保護基を、モルホリノサブユニットとトリチルクロ
ライドと又はニトロフエニルベンズヒドリルカルボナー
トとの反応によってあるいはジアルデヒドと第一アミン
との反応によって、第6 図中に示されかつ例３及び５に
記載される様に付加することができる。ヌクレオシド出
発材料の立体化学は、イミニウム段階で反応混合物のph
が約10以上又は約4 以下にならない限り保たれる。
【００４８】上記合成は、入手可能な5'- ヒドロキシル
を有するモルホリノ- 環を生じる。5'- ヒドロキシル
を、5'アミン及びスルフヒドラール (例６）又は5'ホス
ホナート (例４）を含む他の活性基に変えることができ
る。
を有するモルホリノ- 環を生じる。5'- ヒドロキシル
を、5'アミン及びスルフヒドラール (例６）又は5'ホス
ホナート (例４）を含む他の活性基に変えることができ
る。
【００４９】上記モルホリノ合成で、種々の窒素源を使
用することができる──特にアンモニア、水酸化アンモ
ニウム、炭酸アンモニウム、及び重炭酸アンモニウムが
挙げられる。最良の結果が、反応溶液を酸化及びモルホ
リノ環閉環反応の間ほぼ中性を保つ場合に得られる。こ
れは連続的に反応混合物を滴定して又はより一層好都合
にアンモニア起源としてアンモニアビボラートを用いて
行うことができる。溶液があまりにも酸性である場合、
生成物の収量は低く、そしてあまりにも塩基性である場
合、副生成物（恐らく1'及び／又は4'炭素のエピマー化
に基づき）を生じ、これは所望の生成物から分離するの
が困難である。還元剤を、酸化工程の前、その間、又は
その後、生成物収量に関してほとんど注目されない効果
と共に添加することができる。
用することができる──特にアンモニア、水酸化アンモ
ニウム、炭酸アンモニウム、及び重炭酸アンモニウムが
挙げられる。最良の結果が、反応溶液を酸化及びモルホ
リノ環閉環反応の間ほぼ中性を保つ場合に得られる。こ
れは連続的に反応混合物を滴定して又はより一層好都合
にアンモニア起源としてアンモニアビボラートを用いて
行うことができる。溶液があまりにも酸性である場合、
生成物の収量は低く、そしてあまりにも塩基性である場
合、副生成物（恐らく1'及び／又は4'炭素のエピマー化
に基づき）を生じ、これは所望の生成物から分離するの
が困難である。還元剤を、酸化工程の前、その間、又は
その後、生成物収量に関してほとんど注目されない効果
と共に添加することができる。
【００５０】リボヌクレオシド欠損塩基保護基を、酸化
し、閉環し、水性溶液中で還元して、モルホリノ環を生
じるのこともうまくゆく。しかし塩基保護せずに、所望
されない副生成物の数及び量はしばしば、特にシチジン
の場合に増加する。
し、閉環し、水性溶液中で還元して、モルホリノ環を生
じるのこともうまくゆく。しかし塩基保護せずに、所望
されない副生成物の数及び量はしばしば、特にシチジン
の場合に増加する。
【００５１】上記方法によって形成されるサブユニット
は、5'-OH, SH 又は変性され、以下に記載する様に反応
させ及び／又は活性化して、第二モルホリノサブユニッ
トへのカップリングに適するアミンを含有する。たとえ
ば、第５図は、モルホリノサブユニットの5'-OH をホス
ホニル結合部分に変えて、5-原子単位長さの骨格ポリマ
ーを形成するサブユニット (構造10) を形成することを
示す。サブユニット合成の詳細を、例４中に示す。チオ
ホスホニル結合部分に対する変性も記載する。
は、5'-OH, SH 又は変性され、以下に記載する様に反応
させ及び／又は活性化して、第二モルホリノサブユニッ
トへのカップリングに適するアミンを含有する。たとえ
ば、第５図は、モルホリノサブユニットの5'-OH をホス
ホニル結合部分に変えて、5-原子単位長さの骨格ポリマ
ーを形成するサブユニット (構造10) を形成することを
示す。サブユニット合成の詳細を、例４中に示す。チオ
ホスホニル結合部分に対する変性も記載する。
【００５２】その代りに、サブユニットを、モルホリノ
環窒素に直接又は間接的に結合されたリン- 含有基を有
する様に作る。この窒素を、第二モルホリノサブユニッ
トの5'部分に結合させる (第７図）。このタイプのサブ
ユニットは、7-原子くり返し単位骨格を有するモルホリ
ノポリマーを構成するのに適する。
環窒素に直接又は間接的に結合されたリン- 含有基を有
する様に作る。この窒素を、第二モルホリノサブユニッ
トの5'部分に結合させる (第７図）。このタイプのサブ
ユニットは、7-原子くり返し単位骨格を有するモルホリ
ノポリマーを構成するのに適する。
【００５３】7-原子単位- 長さ骨格に適するサブユニッ
トの合成の例は、例５中に詳述する（第７図に関係す
る）。
トの合成の例は、例５中に詳述する（第７図に関係す
る）。
【００５４】例７ち、第３図の構造Ｅに関連して、ポリ
マー集合の間モルホリノ構造に変えられる非−モルホリ
ノサブユニットの製造を記載する。
マー集合の間モルホリノ構造に変えられる非−モルホリ
ノサブユニットの製造を記載する。
【００５５】Ｃ．活性化及びカップリング反応 上記の様に製造されたサブユニットを、制限された連続
方法で、しばしば例９中に記載した様にサブユニット１
個の5'ヒドロキシルを活性化して、この活性化されたサ
ブユニットを非保護モルホリノ窒素を有する他のサブユ
ニットと接触させてカップリングする。リンケージの種
々のタイプ、たとえば下記のものを、単一ポリマーの構
成中に使用することが認められる。
方法で、しばしば例９中に記載した様にサブユニット１
個の5'ヒドロキシルを活性化して、この活性化されたサ
ブユニットを非保護モルホリノ窒素を有する他のサブユ
ニットと接触させてカップリングする。リンケージの種
々のタイプ、たとえば下記のものを、単一ポリマーの構
成中に使用することが認められる。
【００５６】最も簡単なモルホリノ- タイプ結合ポリマ
ーは、カルバマート- 連結ポリマーであり、そこでモル
ホリノ窒素を、他のサブユニットの5'酸素にカルボニル
によって結合する。本発明に従って行われる実験は、こ
のようなポリマーは、一本-鎖DNA ターゲット配列に有
効に結合することを示す。しかし、RNA ターゲットを用
いる結合研究で、ポリマーは、通常でない結合を示し、
このことは320 ないし230nm スペクトル範囲で高い非定
型の淡色性側面によって証明される。
ーは、カルバマート- 連結ポリマーであり、そこでモル
ホリノ窒素を、他のサブユニットの5'酸素にカルボニル
によって結合する。本発明に従って行われる実験は、こ
のようなポリマーは、一本-鎖DNA ターゲット配列に有
効に結合することを示す。しかし、RNA ターゲットを用
いる結合研究で、ポリマーは、通常でない結合を示し、
このことは320 ないし230nm スペクトル範囲で高い非定
型の淡色性側面によって証明される。
【００５７】初期のモデル研究は、B-コンポメーション
中に存在するDNA へのカーバマート- 連結ポリマー結合
に於て、ポリマーの骨格は結合に適した長さを提供し、
ポリマー骨格のカーバマート部分は、ほとんどプレーナ
ーコンホメーションを推測することができることを示
す。このモデルの結果は、DNA へのカーバマート- 連結
ポリマーの有効な結合に良好に一致した。対照的に、類
似のモデル研究は、RNAターゲットへのカーバマート-
連結ポリマーの結合が次の１つを要求することを提案す
る：(i) ポリマーのカーバマートリンケージは、実質上
ノンプラーナーコンホメーションを採用する、又は(ii)
RNA ターゲット配列は、塩基- スタッキング相互作用が
標準Ａコンホメーション中のそれと全く異なっているひ
ずんだコンホマーションを採用する。この観察は、カー
バマート- 連結ポリマーのRNA ターゲット配列への非定
型結合を説明する。
中に存在するDNA へのカーバマート- 連結ポリマー結合
に於て、ポリマーの骨格は結合に適した長さを提供し、
ポリマー骨格のカーバマート部分は、ほとんどプレーナ
ーコンホメーションを推測することができることを示
す。このモデルの結果は、DNA へのカーバマート- 連結
ポリマーの有効な結合に良好に一致した。対照的に、類
似のモデル研究は、RNAターゲットへのカーバマート-
連結ポリマーの結合が次の１つを要求することを提案す
る：(i) ポリマーのカーバマートリンケージは、実質上
ノンプラーナーコンホメーションを採用する、又は(ii)
RNA ターゲット配列は、塩基- スタッキング相互作用が
標準Ａコンホメーション中のそれと全く異なっているひ
ずんだコンホマーションを採用する。この観察は、カー
バマート- 連結ポリマーのRNA ターゲット配列への非定
型結合を説明する。
【００５８】更に、モデル研究は、カルボニルインター
サブユニット結合部分をアキラルスルホニル- 含有イン
ターサブユニットリンケージかアキラルリン- 含有リン
ケージのどちらかと置き代えることが、インターサブユ
ニットリンケージにつき約0.32オングストロームの付加
的な長さを提供することを示す。この様なリンケージ
は、キー結合のまわりに比較的大きい回転自由、及びイ
ンターサブユニットリンケージの結合角度も提供し、そ
の角度はオリゴマー骨格標準コンホメーション中で二つ
のRNA 及びDNA ターゲットに対するペアリングに適する
オリゴマー骨格コンホメーションに一致する。
サブユニット結合部分をアキラルスルホニル- 含有イン
ターサブユニットリンケージかアキラルリン- 含有リン
ケージのどちらかと置き代えることが、インターサブユ
ニットリンケージにつき約0.32オングストロームの付加
的な長さを提供することを示す。この様なリンケージ
は、キー結合のまわりに比較的大きい回転自由、及びイ
ンターサブユニットリンケージの結合角度も提供し、そ
の角度はオリゴマー骨格標準コンホメーション中で二つ
のRNA 及びDNA ターゲットに対するペアリングに適する
オリゴマー骨格コンホメーションに一致する。
【００５９】第４図中の構造A-A 中のリンケージ (5-原
子骨格) を、第９図中に示され、かつ例８中に詳述され
た反応式に従って形成することができる。簡単にモルホ
リノサブユニットの5'-OH を、例４中に記載されている
様にリン- 含有部分に変える。この基を活性化し、第９
図中に示されかつ例８中に記載されている様に保護され
ていない環窒素を有する第二サブユニットと結合させ
る。ポリマー集団を二量体のモルホリノ環窒素を脱保護
し、次いでに二量体と第三の活性サブユニットとを反応
させることによって続ける。
子骨格) を、第９図中に示され、かつ例８中に詳述され
た反応式に従って形成することができる。簡単にモルホ
リノサブユニットの5'-OH を、例４中に記載されている
様にリン- 含有部分に変える。この基を活性化し、第９
図中に示されかつ例８中に記載されている様に保護され
ていない環窒素を有する第二サブユニットと結合させ
る。ポリマー集団を二量体のモルホリノ環窒素を脱保護
し、次いでに二量体と第三の活性サブユニットとを反応
させることによって続ける。
【００６０】第４図の構造B-B 中のホスホルアミドリン
ケージ (6-原子単位- 長さの骨格)を、第10図中に示さ
れかつ例９中に詳述された反応式に従って形成すること
ができる。保護されたサブユニットの5'ヒドロキシル
(第５図の構造４）を、活性化されたサブユニット中に
生じる適するリン- 含有化合物、たとえばジクロロ-N,N
- ジメチルアミノホスフアートと反応させる。次いでこ
のサブユニットを非保護モノホリノ環窒素を有する第二
サブユニットと反応させる。多くの変法は、例９中に記
載されている様にペンダントＸ部分中で可能であり、Ｘ
部分の同定は、活性化及びカップリングの容易さ、生じ
るリンケージの安定性、及び多少のターゲット- 結合親
和性に影響を及ぼす。
ケージ (6-原子単位- 長さの骨格)を、第10図中に示さ
れかつ例９中に詳述された反応式に従って形成すること
ができる。保護されたサブユニットの5'ヒドロキシル
(第５図の構造４）を、活性化されたサブユニット中に
生じる適するリン- 含有化合物、たとえばジクロロ-N,N
- ジメチルアミノホスフアートと反応させる。次いでこ
のサブユニットを非保護モノホリノ環窒素を有する第二
サブユニットと反応させる。多くの変法は、例９中に記
載されている様にペンダントＸ部分中で可能であり、Ｘ
部分の同定は、活性化及びカップリングの容易さ、生じ
るリンケージの安定性、及び多少のターゲット- 結合親
和性に影響を及ぼす。
【００６１】A-A 及びB-B リンケージのこの合成で、P=
O 基をP=S 基で実質上交替できる；一方との反応は、一
般に他方に応用できる。
O 基をP=S 基で実質上交替できる；一方との反応は、一
般に他方に応用できる。
【００６２】第４図のタイプB-B のリンケージ、並びに
ホスホンアミド及びホスホノエステルリンケージを形成
するための他の方法は、カルボジイミドカップリングを
使用することである：たとえばカルボジイミドはジシク
ロヘキシルカルボジイミド(DCC) である。カルボジイミ
ドカップリングを、例８，９及び10中に記載されてい
る。スミス等(1958)の観察を利用することによって、カ
ルボンジイミド試薬を次のことに使用することもでき
る：(a) サブユニットにリン (又はチオリン) 結合部分
を加える；又は(b) ペンダントＸ部分をリン（又はチオ
リン）結合部分に結合させる。
ホスホンアミド及びホスホノエステルリンケージを形成
するための他の方法は、カルボジイミドカップリングを
使用することである：たとえばカルボジイミドはジシク
ロヘキシルカルボジイミド(DCC) である。カルボジイミ
ドカップリングを、例８，９及び10中に記載されてい
る。スミス等(1958)の観察を利用することによって、カ
ルボンジイミド試薬を次のことに使用することもでき
る：(a) サブユニットにリン (又はチオリン) 結合部分
を加える；又は(b) ペンダントＸ部分をリン（又はチオ
リン）結合部分に結合させる。
【００６３】タイプB-B(第４図）の付加的なリンケージ
を、サブユニットの活性化及びポリマーへのカップリン
グの前に5'ヒドロキシルを他の官能基 (たとえばSH, CH
2,NR) に変えることによって形成することができる。
を、サブユニットの活性化及びポリマーへのカップリン
グの前に5'ヒドロキシルを他の官能基 (たとえばSH, CH
2,NR) に変えることによって形成することができる。
【００６４】モルホリノサブユニットから製造される、
多くの7-原子単位長さの骨格 (第４図中で構造C-C 及び
D-D に相当する）は、塩基の対合部分の間の距離を特定
化するポリマーの構成に一層柔軟性を与える。7-原子単
位長さのリンケージを使用する場合、モルホリノ- サブ
ユニットの間、及びしたがって塩基の対合部分の間の距
離を伸ばすことができる。インターサブユニットリンケ
ージのこの様な伸長化は、特に有用である。その場合結
合モードを介するＢコンホメーション中で二重遺伝子配
列をターゲットにすることを、第８図中に示す。
多くの7-原子単位長さの骨格 (第４図中で構造C-C 及び
D-D に相当する）は、塩基の対合部分の間の距離を特定
化するポリマーの構成に一層柔軟性を与える。7-原子単
位長さのリンケージを使用する場合、モルホリノ- サブ
ユニットの間、及びしたがって塩基の対合部分の間の距
離を伸ばすことができる。インターサブユニットリンケ
ージのこの様な伸長化は、特に有用である。その場合結
合モードを介するＢコンホメーション中で二重遺伝子配
列をターゲットにすることを、第８図中に示す。
【００６５】7-原子骨格ポリマーを、上記の様に構成さ
れたサブユニットＣ及びＤから、例10に記載された通常
のカップリング反応を使用して容易に合成することがで
きる。たとえば、第４図中の構造C-C を、(a) サブユニ
ットＣ（第３図）のホスホナート（又はチオホスホナー
ト）基とカルボジイミドとを反応させる、及び(b) 活性
化されたサブユニットを非保護のモルホリノ環窒素を有
する第二サブユニットとカップリングすることによって
製造することができる。
れたサブユニットＣ及びＤから、例10に記載された通常
のカップリング反応を使用して容易に合成することがで
きる。たとえば、第４図中の構造C-C を、(a) サブユニ
ットＣ（第３図）のホスホナート（又はチオホスホナー
ト）基とカルボジイミドとを反応させる、及び(b) 活性
化されたサブユニットを非保護のモルホリノ環窒素を有
する第二サブユニットとカップリングすることによって
製造することができる。
【００６６】第４図中の構造D-D を、例10中に記載した
様にホスホナート (又はチオホスホナート) をカルボジ
イミドで活性化し、活性化されたサブユニットを非保護
5'酸素、イオウ、又はアミンを有する第二サブユニット
でカップリングすることによって製造することができ
る。
様にホスホナート (又はチオホスホナート) をカルボジ
イミドで活性化し、活性化されたサブユニットを非保護
5'酸素、イオウ、又はアミンを有する第二サブユニット
でカップリングすることによって製造することができ
る。
【００６７】第４図の構造D-D/E-E に相当するリンケー
ジを形成する新規方法は、一方のサブユニット (第3E
図) の近接ヒドロキシルを酸化し、もう一方のサブユニ
ットの第一アミンで生じるジアルデヒドを閉環し、次い
でシアノボロヒドリドで還元して行われる。原則的に、
この同一の式は、１つのサブユニットの第二アミンとも
う1 つのサブユニットのモノ- アルデヒドを結合するの
にも使用できる；しかし、リボース- 誘導されたジアル
デヒドの第一アミンへのカップリングは実質上より一層
速く進行し、より良く収量が得られる。例７に、5'に第
一アミンを有するリボヌクレオシドの合成を示す。第12
図に示した様にモルホリノポリマーの形成でのその使用
を、例11中に記載する。
ジを形成する新規方法は、一方のサブユニット (第3E
図) の近接ヒドロキシルを酸化し、もう一方のサブユニ
ットの第一アミンで生じるジアルデヒドを閉環し、次い
でシアノボロヒドリドで還元して行われる。原則的に、
この同一の式は、１つのサブユニットの第二アミンとも
う1 つのサブユニットのモノ- アルデヒドを結合するの
にも使用できる；しかし、リボース- 誘導されたジアル
デヒドの第一アミンへのカップリングは実質上より一層
速く進行し、より良く収量が得られる。例７に、5'に第
一アミンを有するリボヌクレオシドの合成を示す。第12
図に示した様にモルホリノポリマーの形成でのその使用
を、例11中に記載する。
【００６８】Ｄ．ポリマーの集合 所望のポリマー長さ及び認識部分配列を選択した後（こ
のことに関するガイドラインを以下に示す。）ポリマー
を上記の通常の操作を用いて集める。ポリマー集合の１
つの方法は、オリゴマーブロックの適切なセットを最初
に製造し、次いでこのブロックを結合して、最終的長さ
のポリマーを形成することを含む。ポリマー合成中に使
用されるオリゴマーブロックは、等しいサイズである必
要はない。このブロックを、実質上例12及び13に関係し
て記載されたカップリング法に従って、溶液中で製造す
る。例13に、ペンタマーを形成する、この様なブロック
合成を略述する。
のことに関するガイドラインを以下に示す。）ポリマー
を上記の通常の操作を用いて集める。ポリマー集合の１
つの方法は、オリゴマーブロックの適切なセットを最初
に製造し、次いでこのブロックを結合して、最終的長さ
のポリマーを形成することを含む。ポリマー合成中に使
用されるオリゴマーブロックは、等しいサイズである必
要はない。このブロックを、実質上例12及び13に関係し
て記載されたカップリング法に従って、溶液中で製造す
る。例13に、ペンタマーを形成する、この様なブロック
合成を略述する。
【００６９】このブロック集合法の特別な利点は、完全
な長さのポリマーの集合に於けるすべてのカップリング
失敗が、所望のポリマーから容易に分離される失敗配列
を生じることである。例12に、この方法によって簡単な
ホモポリマーの集合を示す。例13に、ヘテロポリマー中
の使用に適するブロックの製造を示す。例14及び15に生
物学的に活性なヘテロポリマーを形成するブロックの集
合を示す。かくして、例13, 14, 及び15一緒に集合方法
の組合せを使用する合成方法を示し、そこではオリゴマ
ーブロックを溶液中で段階的に集合させ、次いでこれら
のオリゴマーを完全- 長さのポリマーに接続する。
な長さのポリマーの集合に於けるすべてのカップリング
失敗が、所望のポリマーから容易に分離される失敗配列
を生じることである。例12に、この方法によって簡単な
ホモポリマーの集合を示す。例13に、ヘテロポリマー中
の使用に適するブロックの製造を示す。例14及び15に生
物学的に活性なヘテロポリマーを形成するブロックの集
合を示す。かくして、例13, 14, 及び15一緒に集合方法
の組合せを使用する合成方法を示し、そこではオリゴマ
ーブロックを溶液中で段階的に集合させ、次いでこれら
のオリゴマーを完全- 長さのポリマーに接続する。
【００７０】ポリマーを、例16に記載した様に固形担体
上で段階的サブユニット付加によって合成することがで
きる。
上で段階的サブユニット付加によって合成することがで
きる。
【００７１】一般に、固形担体、たとえば酸- 安定な、
長- 鎖の開裂しうるリンカーで誘導されたガラスビーズ
を、固相合成用担体材料として使用し、例15及び16に記
載した用に第一サブユニットの結合又はサブユニットの
ブロックを製造する。ガラスビーズを窒素上で容易に開
裂しうる保護基を一般に有するサブユニットと反応させ
る。モルホリノサブユニットを担体にそのモルホリノ窒
素を介して又は5'位である基を介して結合させるかどう
かは、ポリマー合成の方向に基づく。すなわち次のサブ
ユニットを結合する基による。
長- 鎖の開裂しうるリンカーで誘導されたガラスビーズ
を、固相合成用担体材料として使用し、例15及び16に記
載した用に第一サブユニットの結合又はサブユニットの
ブロックを製造する。ガラスビーズを窒素上で容易に開
裂しうる保護基を一般に有するサブユニットと反応させ
る。モルホリノサブユニットを担体にそのモルホリノ窒
素を介して又は5'位である基を介して結合させるかどう
かは、ポリマー合成の方向に基づく。すなわち次のサブ
ユニットを結合する基による。
【００７２】担体に第二サブユニット (又は溶液中に集
合されるオリゴマー) を担体上にカップリングした後、
すべての非反応求核部位を、すべての未反応求核部位
を、適するキヤピング剤、たとえばp-ニトロフエニルア
セタート又は無水酢酸の添加によってキヤップすること
ができ、その後担体を洗滌する。末端サブユニットの窒
素上の保護基を、一般に酸処理及びその後中和によって
除去し、担体を過剰の先入れ配列(next-in-sequence)サ
ブユニット (又はポリマーユニット) と反応させる。こ
のユニットは上記方法の１つによって活性化されてい
る。モノマーサブユニットの段階的添加を用いる固形担
体集合法の１つの特色は、夫々のサブユニット添加工程
で高いカップリング効率を要求する。この高いカップリ
ング効率を、一般に過剰の活性化されたサブユニットの
添加によって達成し、このユニットは、鎖- 伸長された
多くの担体- 結合鎖を最大化する。
合されるオリゴマー) を担体上にカップリングした後、
すべての非反応求核部位を、すべての未反応求核部位
を、適するキヤピング剤、たとえばp-ニトロフエニルア
セタート又は無水酢酸の添加によってキヤップすること
ができ、その後担体を洗滌する。末端サブユニットの窒
素上の保護基を、一般に酸処理及びその後中和によって
除去し、担体を過剰の先入れ配列(next-in-sequence)サ
ブユニット (又はポリマーユニット) と反応させる。こ
のユニットは上記方法の１つによって活性化されてい
る。モノマーサブユニットの段階的添加を用いる固形担
体集合法の１つの特色は、夫々のサブユニット添加工程
で高いカップリング効率を要求する。この高いカップリ
ング効率を、一般に過剰の活性化されたサブユニットの
添加によって達成し、このユニットは、鎖- 伸長された
多くの担体- 結合鎖を最大化する。
【００７３】鎖伸長は、この方法で所望の長さ及び配列
のポリマーを得るまで、各サブユニット添加後失敗配列
の任意のキヤッピングで続ける。
のポリマーを得るまで、各サブユニット添加後失敗配列
の任意のキヤッピングで続ける。
【００７４】最終サブユニットの添加の後、最終骨格部
分を、例12中に記載した様に、適する電荷又は非電荷基
と反応させる。担体- 結合ポリマーに関して、次いでポ
リマーを、たとえば担体にポリマーを接続するリンカー
中でβ- 脱離を行うのに適する水酸化アンモニウム又は
非- 求核塩基で処理することによって担体から切断す
る。塩基を脱保護し、ポリマーを下記の様に及び例12,
14, 15及び16に記載した様に精製する。
分を、例12中に記載した様に、適する電荷又は非電荷基
と反応させる。担体- 結合ポリマーに関して、次いでポ
リマーを、たとえば担体にポリマーを接続するリンカー
中でβ- 脱離を行うのに適する水酸化アンモニウム又は
非- 求核塩基で処理することによって担体から切断す
る。塩基を脱保護し、ポリマーを下記の様に及び例12,
14, 15及び16に記載した様に精製する。
【００７５】Ｅ．ポリマー製造及び精製 溶液中に集められた結合ポリマー（例12及び14) を、一
般にDMSO又はDMF 中に懸濁し、等量の濃水酸化アンモニ
ウムの懸濁液上に積層して、塩基- 脱保護する。調製物
は封さがれ、次いで振とうして混合し、30℃16時間温置
する。処理は、減圧下でアンモニアの除去を伴う。保護
基 (一般にトリチル又は関連する酸- 不安定部分) が存
在する場合、この基を切断し、粗製ポリマー調製物を、
精製に適する緩衝液中に懸濁する。
般にDMSO又はDMF 中に懸濁し、等量の濃水酸化アンモニ
ウムの懸濁液上に積層して、塩基- 脱保護する。調製物
は封さがれ、次いで振とうして混合し、30℃16時間温置
する。処理は、減圧下でアンモニアの除去を伴う。保護
基 (一般にトリチル又は関連する酸- 不安定部分) が存
在する場合、この基を切断し、粗製ポリマー調製物を、
精製に適する緩衝液中に懸濁する。
【００７６】エステルリンケージを介して担体に結合す
る固相方法によって集められた結合ポリマー (例15及び
16) を、DMSO中に乾燥担体を懸濁し、等量の濃NH4OH 上
に積層し、徐々に16時間、30℃で撹拌する。固形担体
を、濾過によって除去し、濾液を上述の様に処理する。
る固相方法によって集められた結合ポリマー (例15及び
16) を、DMSO中に乾燥担体を懸濁し、等量の濃NH4OH 上
に積層し、徐々に16時間、30℃で撹拌する。固形担体
を、濾過によって除去し、濾液を上述の様に処理する。
【００７７】その代りに、β- 脱離- 敏感なリンカーを
介して担体に連結する結合ポリマーを、DMF 中に強い非
求核塩基 1,8ジアズビシクロ(5.4.0) ウンデセ-7- エン
(DBU) を用いて担体から切断する。この方法を用いて、
１つをまだ保護されたその塩基を有するポリマーを遊離
し、かくてポリマーを高速原子衝撃質量分析を介して更
なる変性及び／又は構造確認に適する。
介して担体に連結する結合ポリマーを、DMF 中に強い非
求核塩基 1,8ジアズビシクロ(5.4.0) ウンデセ-7- エン
(DBU) を用いて担体から切断する。この方法を用いて、
１つをまだ保護されたその塩基を有するポリマーを遊離
し、かくてポリマーを高速原子衝撃質量分析を介して更
なる変性及び／又は構造確認に適する。
【００７８】塩基- 脱保護されたポリマーの精製を、ポ
リマー中の塩基部分のpkに従ってpH2.5 又はpH11で実施
する。pH2.5 でチトシン、アデニン、及び2,6-ジアミノ
ピリン部分は正の電荷を有し、グアニンは部分的正の電
荷を有する。pH11で、グアニン、ウラシル及びハイポキ
サンチンは負の電荷を有する。塩基の対合部分約30％又
はそれ以上がpH2.5 でイオン化されたポリマーに関し
て、精製を、pH2.5 で緩衝された浅いNaCl勾配で展開さ
れたS-セフアロースフアースト- フロー (フアルマシ
ア) のカラム上でカチオン交換体によって実施すること
ができる。流出液を254nm で追跡し、分画コレクター中
に集める。比較的短い失敗配列後に溶離する完全な長さ
のポリマーを、更に精製し、クロマトグラフィー度合い
ポリプロピレン (ポリサイエンス社) のカラムで脱塩
し、ギ酸でpH2.5 に調製されたアセトニトリル又はメタ
ノールの水性勾配で溶離し、溶出液を254nm で追跡す
る。純粋生成物を含有する分画を中和し、減圧下に乾燥
する。ポリマーをトリフルオロエタノール中に溶解し、
濾過し、トリフルオロエタノールを蒸発することによっ
て塩を除去する。
リマー中の塩基部分のpkに従ってpH2.5 又はpH11で実施
する。pH2.5 でチトシン、アデニン、及び2,6-ジアミノ
ピリン部分は正の電荷を有し、グアニンは部分的正の電
荷を有する。pH11で、グアニン、ウラシル及びハイポキ
サンチンは負の電荷を有する。塩基の対合部分約30％又
はそれ以上がpH2.5 でイオン化されたポリマーに関し
て、精製を、pH2.5 で緩衝された浅いNaCl勾配で展開さ
れたS-セフアロースフアースト- フロー (フアルマシ
ア) のカラム上でカチオン交換体によって実施すること
ができる。流出液を254nm で追跡し、分画コレクター中
に集める。比較的短い失敗配列後に溶離する完全な長さ
のポリマーを、更に精製し、クロマトグラフィー度合い
ポリプロピレン (ポリサイエンス社) のカラムで脱塩
し、ギ酸でpH2.5 に調製されたアセトニトリル又はメタ
ノールの水性勾配で溶離し、溶出液を254nm で追跡す
る。純粋生成物を含有する分画を中和し、減圧下に乾燥
する。ポリマーをトリフルオロエタノール中に溶解し、
濾過し、トリフルオロエタノールを蒸発することによっ
て塩を除去する。
【００７９】塩基の対合部分約30％又はそれ以上がpH11
でイオン化されたポリマーに関して、精製を、NaClの水
性pH11勾配で展開されたＱセフアロースフアースト- フ
ロー(フアルマシア) のアニオン交換体カラム上で、行
う。比較的短い失敗配列後に溶離する完全- 長さのポリ
マーは、更に精製され、アセトニトリルの水性pH11勾配
で溶離されるポリプロピレンカラム上で脱塩する。純粋
精製物を含有する分画を、上記の様に処理する。
でイオン化されたポリマーに関して、精製を、NaClの水
性pH11勾配で展開されたＱセフアロースフアースト- フ
ロー(フアルマシア) のアニオン交換体カラム上で、行
う。比較的短い失敗配列後に溶離する完全- 長さのポリ
マーは、更に精製され、アセトニトリルの水性pH11勾配
で溶離されるポリプロピレンカラム上で脱塩する。純粋
精製物を含有する分画を、上記の様に処理する。
【００８０】上記精製法を、アデニン塩基の対合部分を
有するポリマーを室温で数時間以上pH11にさらさず、潜
在的塩基不安定性問題を避ける様に実施しなければなら
ない。精製方法の詳細を、例12, 14, 及び15中に略述す
る。
有するポリマーを室温で数時間以上pH11にさらさず、潜
在的塩基不安定性問題を避ける様に実施しなければなら
ない。精製方法の詳細を、例12, 14, 及び15中に略述す
る。
【００８１】中性、水性溶液中で、モルホリノポリマー
は、所望されるよりも低い溶解性を有する。それ故に、
親水性部分１又は数種、たとえばポリエチレングリコー
ルの添加によってポリマー溶解度を増加させるのに有利
である。ここに開示されたほとんどのポリマータイプに
関して、これは末端の骨格保護基を完全なポリマーから
切断し、まだ保護された状態での塩基を有るポリマーと
過剰のカルボニルジイミダゾール- 活性化ポリエチレン
グリコール(PEG) と反応させて行われる。その後結合ポ
リマーを水酸化アンモニウムで処理し、塩基- 保護基を
除去し、ポリマーを上述の様に精製する。溶解のレベル
を、PEG 材料の割合選択によって容易に選択する。200,
400, 600, 1,000, 1,540, 3,400, 4,000, 6,000, 7,50
0 、及び18,500ダルトンの平均分子量を有する、適する
PEG 分画は、最良の溶解をしばしば提供するPEG1000 を
用いて化学的に入手できる (たとえばポリサイエンス、
社) 。溶解化部分を、開裂可能なリンケージによってポ
リマーを連結させ、所望の場合ポリマーをたとえばエス
テラーゼ又はペプチターゼ酵素によって、溶解化剤から
遊離させる。
は、所望されるよりも低い溶解性を有する。それ故に、
親水性部分１又は数種、たとえばポリエチレングリコー
ルの添加によってポリマー溶解度を増加させるのに有利
である。ここに開示されたほとんどのポリマータイプに
関して、これは末端の骨格保護基を完全なポリマーから
切断し、まだ保護された状態での塩基を有るポリマーと
過剰のカルボニルジイミダゾール- 活性化ポリエチレン
グリコール(PEG) と反応させて行われる。その後結合ポ
リマーを水酸化アンモニウムで処理し、塩基- 保護基を
除去し、ポリマーを上述の様に精製する。溶解のレベル
を、PEG 材料の割合選択によって容易に選択する。200,
400, 600, 1,000, 1,540, 3,400, 4,000, 6,000, 7,50
0 、及び18,500ダルトンの平均分子量を有する、適する
PEG 分画は、最良の溶解をしばしば提供するPEG1000 を
用いて化学的に入手できる (たとえばポリサイエンス、
社) 。溶解化部分を、開裂可能なリンケージによってポ
リマーを連結させ、所望の場合ポリマーをたとえばエス
テラーゼ又はペプチターゼ酵素によって、溶解化剤から
遊離させる。
【００８２】ポリマーを更に公知の操作に従って誘導す
る又は標識するのが認められる。たとえばポリマーを、
放射能標識されたリボヌクレオシドからポリマーサブユ
ニットを製造して又は１つの末端で放射能標識されたア
ミノ酸を結合させることによって、放射能標識される。
ポリマーを容易に誘導化し、たとえば酵素、発色基、等
々との上記サブユニットカップリング反応の変性を用い
て行い、そこでポリマーを、診断用プローブとして使用
することができる。更に、ポリマーに特異的組織又は細
胞タイプを標的にさせる生体分子で、ポリマーを誘導化
する。
る又は標識するのが認められる。たとえばポリマーを、
放射能標識されたリボヌクレオシドからポリマーサブユ
ニットを製造して又は１つの末端で放射能標識されたア
ミノ酸を結合させることによって、放射能標識される。
ポリマーを容易に誘導化し、たとえば酵素、発色基、等
々との上記サブユニットカップリング反応の変性を用い
て行い、そこでポリマーを、診断用プローブとして使用
することができる。更に、ポリマーに特異的組織又は細
胞タイプを標的にさせる生体分子で、ポリマーを誘導化
する。
【００８３】Ｆ．構造の特性評価 中位のサイズの完全- 保護された結合ポリマー (10ない
し20サブユニット) は、しばしばポリマー長さのキー確
認を提供するFAB(高速原子衝撃) 中で強い分子イオンを
生じる。
し20サブユニット) は、しばしばポリマー長さのキー確
認を提供するFAB(高速原子衝撃) 中で強い分子イオンを
生じる。
【００８４】更に、保護されたかつ精製されたポリマー
のCOSY-NMR (二次元相関クロマトグラフィー) は、ポリ
マー中で異なる塩基の対合部分の割合に関する情報並び
にポリマーに結合したすべての可溶性又は他のタイプの
部分に対する結合ポリマーの割合に関する定量情報を提
供する。
のCOSY-NMR (二次元相関クロマトグラフィー) は、ポリ
マー中で異なる塩基の対合部分の割合に関する情報並び
にポリマーに結合したすべての可溶性又は他のタイプの
部分に対する結合ポリマーの割合に関する定量情報を提
供する。
【００８５】イオン交換体カラム上の移動度は、また精
製をpH2.5 で実施する場合、ポリマー中でＣ＋Ａ塩基-
対部分の数に関する情報及び精製をpH11で行う場合、Ｇ
＋Ｕ残基の数に関する情報を提供する。構造の証明は、
ポリマーをオリゴマーブロックから、たとえば例12, 14
及び15の様に集める場合に最も簡単である。というのは
その時失敗配列が完全- 長さ配列ともっと実質的に異な
るからである。
製をpH2.5 で実施する場合、ポリマー中でＣ＋Ａ塩基-
対部分の数に関する情報及び精製をpH11で行う場合、Ｇ
＋Ｕ残基の数に関する情報を提供する。構造の証明は、
ポリマーをオリゴマーブロックから、たとえば例12, 14
及び15の様に集める場合に最も簡単である。というのは
その時失敗配列が完全- 長さ配列ともっと実質的に異な
るからである。
【００８６】pH1, 7及び13でポリマーのUV側面は、ポリ
マーの相対ヌクレオチド組成についての情報を提供する
ことができる。
マーの相対ヌクレオチド組成についての情報を提供する
ことができる。
【００８７】そのターゲット配列に対するモルホリノ-
基体ポリマー親和性の評価を、例12中に示した様にポリ
マー／ターゲット二重体の熔融曲線を測定することによ
って行う。更に、正規の核酸二重体 (たとえばP(dC)6/P
(dG)6)の熔融曲線と対応するモルホリノ- 基体ポリマー
を含有するハイブリッド二重体の熔融曲線との間で比較
をすることができる。
基体ポリマー親和性の評価を、例12中に示した様にポリ
マー／ターゲット二重体の熔融曲線を測定することによ
って行う。更に、正規の核酸二重体 (たとえばP(dC)6/P
(dG)6)の熔融曲線と対応するモルホリノ- 基体ポリマー
を含有するハイブリッド二重体の熔融曲線との間で比較
をすることができる。
【００８８】上記特性評価工程を、モルホリノ- 基体ホ
スホルジアミダート- 結合ポリ(C)ヘキサマーを例12中
に記載した様に適用する。式中Y は酸素、X はN(C
H3)2 、及びZ は酸素である。完全- 長さオリゴマーの
特性評価を、プロトンNMR 及び負イオンFAB マススペク
トルによって行う。このモルホリノオリゴマーを用い
て、オリゴマーのフラグメンテーションを著しく抑制す
るので、ほとんど配列情報は入手できない。しかし親イ
オンシグナルは、極めて強くかつモルホリノオリゴマー
の組成のコンホメーションを可能にする (例12参照) 。
水溶解度を増加するために、ポリエチレングリコール(P
EG) テイルをオリゴマーに結合させる。５当量のPEG 10
00を、1 当量のビス (p-ニトロフエニル) カーボナート
で処理して、モノ活性化されたPEG を生じる。トリフル
オロエタノール中で１％酢酸を用いるヘキサマーの脱ト
リチル化は、遊離モルホリノ環窒素を供給する。標準カ
ップリング条件下で活性化されたPEG 1000を用いて遊離
アミンを含有するヘキサマーの処理は、ヘキサマーへの
PEG テイルの結合を生じる。塩基を、24時間濃アンモニ
アで末端につながれたヘキサマーの処理によって脱保護
する。末端につながれたヘキサマーを、pH2.5 緩衝液中
に取り、塩化カリウム勾配で溶離されたS-セフアロース
フアーストフローTM上でカチオン交換体クロマトグラフ
ィーによって精製する。中和後、溶出液を、水／アセト
ニトリル勾配で溶離されたポリプロピレンカラム上で脱
塩する。末端につながれたヘキサマーは、pH7.5 緩衝液
中に自由に溶解することが分る。
スホルジアミダート- 結合ポリ(C)ヘキサマーを例12中
に記載した様に適用する。式中Y は酸素、X はN(C
H3)2 、及びZ は酸素である。完全- 長さオリゴマーの
特性評価を、プロトンNMR 及び負イオンFAB マススペク
トルによって行う。このモルホリノオリゴマーを用い
て、オリゴマーのフラグメンテーションを著しく抑制す
るので、ほとんど配列情報は入手できない。しかし親イ
オンシグナルは、極めて強くかつモルホリノオリゴマー
の組成のコンホメーションを可能にする (例12参照) 。
水溶解度を増加するために、ポリエチレングリコール(P
EG) テイルをオリゴマーに結合させる。５当量のPEG 10
00を、1 当量のビス (p-ニトロフエニル) カーボナート
で処理して、モノ活性化されたPEG を生じる。トリフル
オロエタノール中で１％酢酸を用いるヘキサマーの脱ト
リチル化は、遊離モルホリノ環窒素を供給する。標準カ
ップリング条件下で活性化されたPEG 1000を用いて遊離
アミンを含有するヘキサマーの処理は、ヘキサマーへの
PEG テイルの結合を生じる。塩基を、24時間濃アンモニ
アで末端につながれたヘキサマーの処理によって脱保護
する。末端につながれたヘキサマーを、pH2.5 緩衝液中
に取り、塩化カリウム勾配で溶離されたS-セフアロース
フアーストフローTM上でカチオン交換体クロマトグラフ
ィーによって精製する。中和後、溶出液を、水／アセト
ニトリル勾配で溶離されたポリプロピレンカラム上で脱
塩する。末端につながれたヘキサマーは、pH7.5 緩衝液
中に自由に溶解することが分る。
【００８９】相補的核酸で末端につながれたヘキサマー
の錯体の安定性を、末端変性実験によって調べる。末端
につながれたヘキサマーと選択されたホスホジエステル
補体の混合及び非混合サンプルの間の差スペクトルは14
℃ないし85℃で及び320 から260nm 範囲にわたって得ら
れる (例12参照) 。Ｃモノマーで60マイクロモル及びＧ
モノマーで60マイクロモルで、末端につながれたヘキサ
マー、ポリ(dG)を有する(morph C)6、の差UVスペクトル
が79℃のTm値を生じる。ポリG)を有する対する(morphC)
6 は、51.5℃のTm値を示す (例12及び第13図参照) 。
の錯体の安定性を、末端変性実験によって調べる。末端
につながれたヘキサマーと選択されたホスホジエステル
補体の混合及び非混合サンプルの間の差スペクトルは14
℃ないし85℃で及び320 から260nm 範囲にわたって得ら
れる (例12参照) 。Ｃモノマーで60マイクロモル及びＧ
モノマーで60マイクロモルで、末端につながれたヘキサ
マー、ポリ(dG)を有する(morph C)6、の差UVスペクトル
が79℃のTm値を生じる。ポリG)を有する対する(morphC)
6 は、51.5℃のTm値を示す (例12及び第13図参照) 。
【００９０】Ｇ．診断適用 本発明のターゲット- 特異的ポリマーを、一定のターゲ
ット配列を有するRNA又はDNA の種々の検出診断法中に
使用することができる。ある一般的適用で、ポリマー
を、適する放射能標識又は他の検出可能なリポーター基
で標識する。ターゲットポリヌクレオチド、一般に固形
担体に結合した一本鎖ポリヌクレオチドを、ハイブリッ
ド形成条件下にポリマーと反応させ、アニールし、次い
でサンプルをポリマーリポター基の存在について調べ
る。
ット配列を有するRNA又はDNA の種々の検出診断法中に
使用することができる。ある一般的適用で、ポリマー
を、適する放射能標識又は他の検出可能なリポーター基
で標識する。ターゲットポリヌクレオチド、一般に固形
担体に結合した一本鎖ポリヌクレオチドを、ハイブリッ
ド形成条件下にポリマーと反応させ、アニールし、次い
でサンプルをポリマーリポター基の存在について調べ
る。
【００９１】診断法を、標準操作に従ってハイブリッド
形成条件の適する調整と共に実施し、ターゲット域を有
するポリマーハイブリッド形成をさせる。更に、ポリマ
ーを相補的ポリヌクレオチド鎖よりも高い熔融温度で、
ターゲットによりハイブリッド形成を行うことができ
る。というのはポリマー結合は骨格電荷反発作用を伴う
からである。したがって、ポリマーを通常のポリヌクレ
オチド熔融温度以上の温度でターゲットに結合させるこ
とができる: これは従来のオリゴヌクレオチドプローブ
に関するポリマーの１つの利点である。高められた温度
でのこの結合は、プローブと診断混合物中に存在するす
べての対応する一本鎖オリゴヌクレオチドとの間でター
ゲットへの結合に対する競合の問題を最小化する。
形成条件の適する調整と共に実施し、ターゲット域を有
するポリマーハイブリッド形成をさせる。更に、ポリマ
ーを相補的ポリヌクレオチド鎖よりも高い熔融温度で、
ターゲットによりハイブリッド形成を行うことができ
る。というのはポリマー結合は骨格電荷反発作用を伴う
からである。したがって、ポリマーを通常のポリヌクレ
オチド熔融温度以上の温度でターゲットに結合させるこ
とができる: これは従来のオリゴヌクレオチドプローブ
に関するポリマーの１つの利点である。高められた温度
でのこの結合は、プローブと診断混合物中に存在するす
べての対応する一本鎖オリゴヌクレオチドとの間でター
ゲットへの結合に対する競合の問題を最小化する。
【００９２】診断適用の第二一般タイプに於て、ポリマ
ーをターゲットRNA 又はDNA の担体への捕獲に関して、
固形担体と結合させる。固体ポリマー、たとえばポリマ
ー性微粒子を、上記方法に従って又は従来の誘導化操作
によって担体にポリマーを結合させることによって製造
することができる。その代りにポリマーを固形担体上で
合成するので、この担体を検出担体としても役に立つ。
ーをターゲットRNA 又はDNA の担体への捕獲に関して、
固形担体と結合させる。固体ポリマー、たとえばポリマ
ー性微粒子を、上記方法に従って又は従来の誘導化操作
によって担体にポリマーを結合させることによって製造
することができる。その代りにポリマーを固形担体上で
合成するので、この担体を検出担体としても役に立つ。
【００９３】この検定法の１つの特色に従って、ポリマ
ーへの塩基- 特異的結合によって担体上に捕獲されるタ
ーゲットポリヌクレオチド分子を、その骨格電荷に基づ
いて検定することができる。というのは担体- 結合ポリ
マーはその自体実質上非電荷である。この末端に検定法
はポリカチオン性リポーター分子も伴い、この分子は選
択された結合条件下で、完全に電荷された被検体骨格へ
結合を行うが、非電荷( 又は実質上非電荷) のポリマー
骨格への結合を行わない。
ーへの塩基- 特異的結合によって担体上に捕獲されるタ
ーゲットポリヌクレオチド分子を、その骨格電荷に基づ
いて検定することができる。というのは担体- 結合ポリ
マーはその自体実質上非電荷である。この末端に検定法
はポリカチオン性リポーター分子も伴い、この分子は選
択された結合条件下で、完全に電荷された被検体骨格へ
結合を行うが、非電荷( 又は実質上非電荷) のポリマー
骨格への結合を行わない。
【００９４】一つの具体例で、リポーター分子は、リポ
ーター基が診断剤上に有するより僅かな電荷又は非電荷
結合ポリマーに結合しない条件下で、ポリカチオン性分
子又は静電的に完全に電荷されたポリヌクレオチドへの
結合を行うテイルから成る;リポーター１又は数種を、
末端に結合させ、リポーターの存在を検出することがで
きるシグナルを産生するのに適する。
ーター基が診断剤上に有するより僅かな電荷又は非電荷
結合ポリマーに結合しない条件下で、ポリカチオン性分
子又は静電的に完全に電荷されたポリヌクレオチドへの
結合を行うテイルから成る;リポーター１又は数種を、
末端に結合させ、リポーターの存在を検出することがで
きるシグナルを産生するのに適する。
【００９５】ポリカチオン性分子の形成法及びカチオン
化合物へのリポーター分子の結合法は知られている。
化合物へのリポーター分子の結合法は知られている。
【００９６】各リポーター分子は、リポーター基１又は
数種を有し、各ポリヌクレオチドは、一般的に数４又は
それ以上のリポーター分子の結合を適合させることがで
きる。かくてこの系は、結合被検体分子につきリポータ
ーシグナルの間にいくつかの大きさの順序の増幅フアク
ターを有する。更に、この方法は上述の様な利点を有
し、それはポリヌクレオチド結合反応を相補的ヌクレオ
チド鎖との結合競合が生じない条件下で実施することが
できることである。
数種を有し、各ポリヌクレオチドは、一般的に数４又は
それ以上のリポーター分子の結合を適合させることがで
きる。かくてこの系は、結合被検体分子につきリポータ
ーシグナルの間にいくつかの大きさの順序の増幅フアク
ターを有する。更に、この方法は上述の様な利点を有
し、それはポリヌクレオチド結合反応を相補的ヌクレオ
チド鎖との結合競合が生じない条件下で実施することが
できることである。
【００９７】診断剤として使用するためのポリヌクレオ
チド結合ポリマーを製造するのに適用される考察される
考慮は、被検体を検定すべき条件下でターゲット被検体
の性質及び反応条件によって左右される。第一の考慮と
して、ポリマーが目ざす非-ホモポリマーターゲット塩
基配列が選択される。このターゲット配列を選択するこ
とである。このターゲット配列は一般に一本- 鎖であ
り、好ましくは検定される被検体に特異的である。
チド結合ポリマーを製造するのに適用される考察される
考慮は、被検体を検定すべき条件下でターゲット被検体
の性質及び反応条件によって左右される。第一の考慮と
して、ポリマーが目ざす非-ホモポリマーターゲット塩
基配列が選択される。このターゲット配列を選択するこ
とである。このターゲット配列は一般に一本- 鎖であ
り、好ましくは検定される被検体に特異的である。
【００９８】一定のn-塩基ターゲット配列の発生の確立
は、約 (1/4)n である。したがって、一定のn-塩基ター
ゲット配列が、 4n 塩基を有するポリマー中でほぼ一度
生じることが予想される。したがってＮ非反復- 配列塩
基の全量を含有するポリヌクレオチド中に一定のn-塩基
配列が生じる確立は、約 P=N/4n である。描写するため
に、20キロ塩基ポリヌクレオチド中に9-塩基ターゲット
配列が認められる確立Ｐは、約20×103/2 ×105 又は0.
08であり、16- 塩基ターゲット配列が存在する確立は、
約20×103/4.3 ×109 又は0.0000047 である。この計算
から定義された9−16塩基ターゲット配列に特異的な 9
−16認識部分を有するポリマーは、ウイルスゲノムしか
含有しない検定混合物中にターゲット配列に対して高い
特異性を有しなければならない。このゲノムの最も大き
い複合性は約400K非反復- 配列に相当する。
は、約 (1/4)n である。したがって、一定のn-塩基ター
ゲット配列が、 4n 塩基を有するポリマー中でほぼ一度
生じることが予想される。したがってＮ非反復- 配列塩
基の全量を含有するポリヌクレオチド中に一定のn-塩基
配列が生じる確立は、約 P=N/4n である。描写するため
に、20キロ塩基ポリヌクレオチド中に9-塩基ターゲット
配列が認められる確立Ｐは、約20×103/2 ×105 又は0.
08であり、16- 塩基ターゲット配列が存在する確立は、
約20×103/4.3 ×109 又は0.0000047 である。この計算
から定義された9−16塩基ターゲット配列に特異的な 9
−16認識部分を有するポリマーは、ウイルスゲノムしか
含有しない検定混合物中にターゲット配列に対して高い
特異性を有しなければならない。このゲノムの最も大き
い複合性は約400K非反復- 配列に相当する。
【００９９】類似の計算は、12ないし16サブユニットポ
リマーがウイルス及び細菌ゲノム材料しか含有しない検
定混合物中でウイルス又は細菌ターゲット配列に適した
特異性を提供することができることを示す; 最も大きい
ゲノムサイズは約5,000 キロ塩基。16ないし22サブユニ
ットポリマーは、哺乳類ゲノムDNA 材料を含有するポリ
ヌクレオチド混合物中にターゲット配列に適する特異性
を提供することができる; 非反復- 配列DNA の約50億の
ゲノムサイズ。
リマーがウイルス及び細菌ゲノム材料しか含有しない検
定混合物中でウイルス又は細菌ターゲット配列に適した
特異性を提供することができることを示す; 最も大きい
ゲノムサイズは約5,000 キロ塩基。16ないし22サブユニ
ットポリマーは、哺乳類ゲノムDNA 材料を含有するポリ
ヌクレオチド混合物中にターゲット配列に適する特異性
を提供することができる; 非反復- 配列DNA の約50億の
ゲノムサイズ。
【０１００】ポリマー／被検体結合親和性、及び特にポ
リマーがターゲット配列と丁度結合する温度（熔融温
度、又はTm) を、次の基準に従って選択的に変えること
ができる: (a) ポリマー中のサブユニットの数; (b) 塩
基の対合部分と対応する、被検体ターゲット配列の相補
的塩基との間に形成されうる水素結合の数; (c) ポリマ
ー骨格の単位長さ; (d) 特別なインターサブユニットリ
ンケージ; 及び(e) 熔融温度を減少させる変性剤、たと
えばホルムアルデヒドの濃度。
リマーがターゲット配列と丁度結合する温度（熔融温
度、又はTm) を、次の基準に従って選択的に変えること
ができる: (a) ポリマー中のサブユニットの数; (b) 塩
基の対合部分と対応する、被検体ターゲット配列の相補
的塩基との間に形成されうる水素結合の数; (c) ポリマ
ー骨格の単位長さ; (d) 特別なインターサブユニットリ
ンケージ; 及び(e) 熔融温度を減少させる変性剤、たと
えばホルムアルデヒドの濃度。
【０１０１】モデル核酸二重体に関する多くの研究か
ら、10ないし20bp範囲でオリゴヌクレオチド二重体の熔
融温度は、２個の水素結合によって形成される付加的な
塩基対につき約３℃、そして３個の水素結合によって形
成される付加的な塩基対につき約６℃上がることが知ら
れている。したがってターゲットポリマーとの高い結合
特異性を保証するために、本来選択されたターゲット配
列長さを伸ばして選択された検定条件下に所望の熔融温
度を達成する。
ら、10ないし20bp範囲でオリゴヌクレオチド二重体の熔
融温度は、２個の水素結合によって形成される付加的な
塩基対につき約３℃、そして３個の水素結合によって形
成される付加的な塩基対につき約６℃上がることが知ら
れている。したがってターゲットポリマーとの高い結合
特異性を保証するために、本来選択されたターゲット配
列長さを伸ばして選択された検定条件下に所望の熔融温
度を達成する。
【０１０２】また、ポリマーを構成するのに使用される
確認部分は、標準核酸塩基である場合、ターゲット配列
を高百分率のグアニジン プラス チトシン塩基を有す
る様に選択して、比較的高いポリマー／被検体熔融温度
を達成する。一方、低い熔融温度を達成するために、比
較的高い百分率のアデニン プラス チミン塩基を含有
するターゲット配列を選択する。
確認部分は、標準核酸塩基である場合、ターゲット配列
を高百分率のグアニジン プラス チトシン塩基を有す
る様に選択して、比較的高いポリマー／被検体熔融温度
を達成する。一方、低い熔融温度を達成するために、比
較的高い百分率のアデニン プラス チミン塩基を含有
するターゲット配列を選択する。
【０１０３】診断システム中の結合成分は、丁度記載し
た固体- 担体診断法中で作用する様に第14図中に示す。
この際 "S"、検定試剤は、固体- 担体でありソーツース
(sowtooth)ラインによって示されるスペーサーアームで
その表面に結合ひる多くの結合ポリマーを有する。検定
操作で、一本鎖形のターゲットDNA と担体- 結合ポリマ
ーとをハイブリッド形成条件下に反応させ、次いで固体
担体を、洗滌して、非ハイブリッド形成核酸材料を除
く。
た固体- 担体診断法中で作用する様に第14図中に示す。
この際 "S"、検定試剤は、固体- 担体でありソーツース
(sowtooth)ラインによって示されるスペーサーアームで
その表面に結合ひる多くの結合ポリマーを有する。検定
操作で、一本鎖形のターゲットDNA と担体- 結合ポリマ
ーとをハイブリッド形成条件下に反応させ、次いで固体
担体を、洗滌して、非ハイブリッド形成核酸材料を除
く。
【０１０４】次いで洗滌された担体と、ターゲットDNA
骨格へのリポーターカチオン性部分の静電的結合を助け
る条件下でリポーターとを反応させる。第14図に示され
たリポーターは、リポーター基Ｒを有するジカチオン分
子である。
骨格へのリポーターカチオン性部分の静電的結合を助け
る条件下でリポーターとを反応させる。第14図に示され
たリポーターは、リポーター基Ｒを有するジカチオン分
子である。
【０１０５】一般に室温で数秒間リポーター溶液と反応
後、試剤を洗滌し、未結合リポーターを除き、次いで検
定試剤を結合リポーターに関して評価する。試剤と結合
するリポーターの量を決定するある方法、特に蛍光又は
発色リポーターグループの場合の方法は、高い塩溶液を
用いて試剤からリポーターを溶離し、次いで溶出液をリ
ポーターに関して評価する。
後、試剤を洗滌し、未結合リポーターを除き、次いで検
定試剤を結合リポーターに関して評価する。試剤と結合
するリポーターの量を決定するある方法、特に蛍光又は
発色リポーターグループの場合の方法は、高い塩溶液を
用いて試剤からリポーターを溶離し、次いで溶出液をリ
ポーターに関して評価する。
【０１０６】本発明のポリマーは、二重核酸への配列特
異的結合を、二重らせんの主要溝によって得られる塩基
- 対- 特異的水素結合部位を介して行うことができる。
この結合は、一本鎖上の少なくとも70％の塩基はプリン
であり、もう一方の鎖上の塩基の対応する百分率はピリ
ミジンである二重領域中に生じることができる。二重結
合ポリマーは、第８図中に示した様にT-A 又はU-A 塩基
対への結合に関する2,6-ジアミノプリン水素結合部分、
及びC-G 塩基対への結合に関するグアニン水素結合部分
を含むのが好ましい。かくてこの特別をターゲット配列
に関して、本発明のポリマーを、丁度記載したタイプの
診断検定に使用することができ、しかしその際ターゲッ
ト核酸は、非変性、二重形である。
異的結合を、二重らせんの主要溝によって得られる塩基
- 対- 特異的水素結合部位を介して行うことができる。
この結合は、一本鎖上の少なくとも70％の塩基はプリン
であり、もう一方の鎖上の塩基の対応する百分率はピリ
ミジンである二重領域中に生じることができる。二重結
合ポリマーは、第８図中に示した様にT-A 又はU-A 塩基
対への結合に関する2,6-ジアミノプリン水素結合部分、
及びC-G 塩基対への結合に関するグアニン水素結合部分
を含むのが好ましい。かくてこの特別をターゲット配列
に関して、本発明のポリマーを、丁度記載したタイプの
診断検定に使用することができ、しかしその際ターゲッ
ト核酸は、非変性、二重形である。
【０１０７】Ｈ．他の適用 本発明のポリマーを、標準RNA 又はDNA の代りに多くの
標準研究室操作に関して使用することができる。上述の
様に、モルホリノ- 基体とするポリマーを固体担体に固
定し、相補核酸配列を、たとえば特異的mRNAの精製によ
ってポリ-A分画(ゴールドバーク等) から単離するのに
使用することができる。本発明のポリマーは、この様な
適用に有利である。というのはこれらは活性化されたサ
ブユニットから製造するのに安価かつ簡単であるからで
ある。
標準研究室操作に関して使用することができる。上述の
様に、モルホリノ- 基体とするポリマーを固体担体に固
定し、相補核酸配列を、たとえば特異的mRNAの精製によ
ってポリ-A分画(ゴールドバーク等) から単離するのに
使用することができる。本発明のポリマーは、この様な
適用に有利である。というのはこれらは活性化されたサ
ブユニットから製造するのに安価かつ簡単であるからで
ある。
【０１０８】分子生物学に於ける大多数の適用を、標識
されたモルホリノ- 基体ポリマーに関して見い出すこと
ができる。モルホリノ- 基体ポリマーを、ポリマー合成
の最後の工程での包接によって，すなわち上述の様に活
性化されかつ標識されたモルホリノ- 基体サブユニット
又は好ましくは35S-標識されたメチオニンによって容易
にかつ効果的に末端- 標識することができる。使用され
るべき標識のタイプは、ポリマーの最終適用による; こ
の様な標識は、放射能活性(3H, 14C, 32P,又は 35S)ヌク
レオシド又はアミノ酸、又はビオチンを含む。標識され
たモルホリノ-基体オリゴヌクレオチド同族体は、たと
えばコロニーハイブリット形成（ク゛ルンスタイン 等) 、RNA
ハイブリット形成(トーマス ）、DNA ハイブリット形成(サウサ
゛ーン) 、及び遺伝子バンクスクリーンニング(スツオスタック等)
中で有効なブローブとして作用することができる。
されたモルホリノ- 基体ポリマーに関して見い出すこと
ができる。モルホリノ- 基体ポリマーを、ポリマー合成
の最後の工程での包接によって，すなわち上述の様に活
性化されかつ標識されたモルホリノ- 基体サブユニット
又は好ましくは35S-標識されたメチオニンによって容易
にかつ効果的に末端- 標識することができる。使用され
るべき標識のタイプは、ポリマーの最終適用による; こ
の様な標識は、放射能活性(3H, 14C, 32P,又は 35S)ヌク
レオシド又はアミノ酸、又はビオチンを含む。標識され
たモルホリノ-基体オリゴヌクレオチド同族体は、たと
えばコロニーハイブリット形成（ク゛ルンスタイン 等) 、RNA
ハイブリット形成(トーマス ）、DNA ハイブリット形成(サウサ
゛ーン) 、及び遺伝子バンクスクリーンニング(スツオスタック等)
中で有効なブローブとして作用することができる。
【０１０９】本発明のポリマーは、 "アンチセンス" 治
療剤として潜在的使用も有する。DNA とほぼ同型構造で
ある、多くの非電荷核酸同族体は、抗ウイルス及び抗-
癌剤として使用される。本発明のモルホリノ- 基体ポリ
マーを、HIV-I(ヒト免疫不全ウイルス) に対して試験管
内でテストする。HIV-I(メイヤー等) の第一結合部位への16
-mer相補性は、約35％までウイルスP24 プロテインの合
成を減少させることを示す。対応する非感染の細胞中
で、モルホリノ- 基体ポリマーは、見掛け細胞毒性を生
じない。
療剤として潜在的使用も有する。DNA とほぼ同型構造で
ある、多くの非電荷核酸同族体は、抗ウイルス及び抗-
癌剤として使用される。本発明のモルホリノ- 基体ポリ
マーを、HIV-I(ヒト免疫不全ウイルス) に対して試験管
内でテストする。HIV-I(メイヤー等) の第一結合部位への16
-mer相補性は、約35％までウイルスP24 プロテインの合
成を減少させることを示す。対応する非感染の細胞中
で、モルホリノ- 基体ポリマーは、見掛け細胞毒性を生
じない。
【０１１０】本発明のポリマーを、HSV-I(Herpes Simpl
ex Virus I) に対してマウスで目感染を生体内でもテス
トする (例16) 。HSV-I 中でスプライス部位への12-mer
相補性を、HSV-I で感染されたマウスの目を保護するそ
の能力についてテストする。未処理マウスは、感染５日
後で65％の残存率を示すが、モルホリノ- 基体ポリマー
を含有する局所軟膏で処理されたマウスは、90％の残存
率を有する。
ex Virus I) に対してマウスで目感染を生体内でもテス
トする (例16) 。HSV-I 中でスプライス部位への12-mer
相補性を、HSV-I で感染されたマウスの目を保護するそ
の能力についてテストする。未処理マウスは、感染５日
後で65％の残存率を示すが、モルホリノ- 基体ポリマー
を含有する局所軟膏で処理されたマウスは、90％の残存
率を有する。
【０１１１】上記のモルホリノ- 基体ポリマーの、試験
管内及び生体内抗- ウイルス性質に加えて、本発明のポ
リマーは、従来のアンチ- センス剤に比していくつかの
利点を提供する。
管内及び生体内抗- ウイルス性質に加えて、本発明のポ
リマーは、従来のアンチ- センス剤に比していくつかの
利点を提供する。
【０１１２】第一に、モルホリノポリマーは、デオキシ
リボヌクレオシド- 誘導ポリマーよりも合成に費用がか
からない。これは、むしろより一層得がたくかつより一
層高価なデオキシリボヌクレオシドよりもポリマー合成
で使用されるモルホリノサブユニットをリボヌクレオシ
ドから導かれるという事実に部分的に基づく。また上述
の様に、リンと第二サブユニットのアミンの間のカップ
リング反応は、比較的穏やかな条件下に生じるので、保
護工程及び望まれない反応を避けるために必要とされる
他の予防策は簡略化される。このことは標準のリボ- 及
びデオキシリボヌクレオチドポリマー合成とは対照的で
あり、その合成に於て、ホスフアートエステルリンケー
ジによるカップリングは、カップリング試剤が高度に反
応でなければならず、かつ反応をきびしい反応／保護条
件下に実施しなければならないことを要求する。ポリマ
ー合成に於けるこの利点は、当然のことながらポリマー
の診断使用にもむけられる。
リボヌクレオシド- 誘導ポリマーよりも合成に費用がか
からない。これは、むしろより一層得がたくかつより一
層高価なデオキシリボヌクレオシドよりもポリマー合成
で使用されるモルホリノサブユニットをリボヌクレオシ
ドから導かれるという事実に部分的に基づく。また上述
の様に、リンと第二サブユニットのアミンの間のカップ
リング反応は、比較的穏やかな条件下に生じるので、保
護工程及び望まれない反応を避けるために必要とされる
他の予防策は簡略化される。このことは標準のリボ- 及
びデオキシリボヌクレオチドポリマー合成とは対照的で
あり、その合成に於て、ホスフアートエステルリンケー
ジによるカップリングは、カップリング試剤が高度に反
応でなければならず、かつ反応をきびしい反応／保護条
件下に実施しなければならないことを要求する。ポリマ
ー合成に於けるこの利点は、当然のことながらポリマー
の診断使用にもむけられる。
【０１１３】第二に、そのターゲットに結合するポリマ
ーは、DNA-タイプアンチセンス剤を用いるよりも良好な
ターゲット不活性化を生じる。というのはモルホリノポ
リマー／ターゲット二重体が細胞中で二重にほどけるメ
カニズムに敏感であるからである。
ーは、DNA-タイプアンチセンス剤を用いるよりも良好な
ターゲット不活性化を生じる。というのはモルホリノポ
リマー／ターゲット二重体が細胞中で二重にほどけるメ
カニズムに敏感であるからである。
【０１１４】第三に、モルホリノ- 基体ポリマーは、DN
A, RNA, 及びそのチオホスフアート- 結合同族体よりも
細胞内でも安定である。というのはモルホリノポリマー
骨格リンケージが細胞ヌクレアーゼによる開裂に敏感で
ないからである。
A, RNA, 及びそのチオホスフアート- 結合同族体よりも
細胞内でも安定である。というのはモルホリノポリマー
骨格リンケージが細胞ヌクレアーゼによる開裂に敏感で
ないからである。
【０１１５】第四に、化合物の細胞吸収を伴う治療適用
で、非電荷モルホリノポリマーは、電荷オリゴヌクレオ
チドよりももっと有効に細胞に入り込む。
で、非電荷モルホリノポリマーは、電荷オリゴヌクレオ
チドよりももっと有効に細胞に入り込む。
【０１１６】治療適用の状況に於て、本発明のモルホリ
ノポリマーを二本- 鎖遺伝子配列をターゲットにし、第
８図に示した様にその配列中である鎖は主にプリンを有
し、もう一方の鎖は主にピリミジンを有する。
ノポリマーを二本- 鎖遺伝子配列をターゲットにし、第
８図に示した様にその配列中である鎖は主にプリンを有
し、もう一方の鎖は主にピリミジンを有する。
【０１１７】更に、メッセンジャーRNA が二重ターゲッ
ト配列のほとんどプリン鎖によって暗号化される時、二
重鎖にターゲットされるモルホリノ結合ポリマーは、mR
NAを不活性化するための能力も有する。かくして、この
様なポリマーは、一本- 鎖及び二本- 鎖形の両方中に病
原体のキー遺伝子配列を不活性化するための能力を有す
る。
ト配列のほとんどプリン鎖によって暗号化される時、二
重鎖にターゲットされるモルホリノ結合ポリマーは、mR
NAを不活性化するための能力も有する。かくして、この
様なポリマーは、一本- 鎖及び二本- 鎖形の両方中に病
原体のキー遺伝子配列を不活性化するための能力を有す
る。
【０１１８】1981年に、原核mRNAs のシヤイン−ダルガ
ルノ共通配列の部分に相補的な短い(3ないし7 サブユニ
ット) メチルホスホナート- 結合されたDNA 同族体は、
微生物ライゼート及び微生物の特別な浸透性株中で微生
物によるたん白合成を崩壊させるのに有効であると報告
された。しかし、この様な試剤は、標準の微生物中でた
ん白合成を阻害するのに役立たなかった(シ゛エアーマン , 198
1) 。
ルノ共通配列の部分に相補的な短い(3ないし7 サブユニ
ット) メチルホスホナート- 結合されたDNA 同族体は、
微生物ライゼート及び微生物の特別な浸透性株中で微生
物によるたん白合成を崩壊させるのに有効であると報告
された。しかし、この様な試剤は、標準の微生物中でた
ん白合成を阻害するのに役立たなかった(シ゛エアーマン , 198
1) 。
【０１１９】本発明を補助するために行われた実験は、
長さ３ないし５サブユニットのポリマーが、高いターゲ
ット- 結合親和性を生じる塩基の組合せを用いることに
よって標準微生物中でのたん白合成を止めるのに有効で
あることを示す。更に特異的に、次のオリゴマー及びオ
リゴマー組合せは、標準無傷の微生物中でたん白合成を
かき乱すことができる (そこでＤは2,6-ジアミンプリン
又はアデニンである；Ｇはグアニンである；Ｂは5-ブロ
モウラシル、他の5-ハロウラシル又はウラシルである；
及び配列は左にその5'末端を有して示される) ：DGG, B
DDG, DDGG;DGGD; GGDG; GDGG; DGGB; GGBG; GGAGG; GGD
GG; 及び組合せ BDD＋GGDG; DDG ＋GDGG; DGG ＋DGGB;
GGD ＋GGBG; BDDG＋GDG; DDGG ＋DGG; DGGD ＋GGB; GGD
G ＋GBG; BDD＋GGDG＋GBG.短い結合- 増加させるオリゴ
マーの使用は、RNA 配列の生物学的活性を崩壊し、その
配列は生物のターゲットクラスの物質代謝に主要な役割
を果すが、より多くの生物中での同様に重要な役割は、
より長いポリマーの入口を排除する細胞壁を有する種々
の病原性生物 (たとえば微生物及びカビ) に幅広く適応
させてはならない。
長さ３ないし５サブユニットのポリマーが、高いターゲ
ット- 結合親和性を生じる塩基の組合せを用いることに
よって標準微生物中でのたん白合成を止めるのに有効で
あることを示す。更に特異的に、次のオリゴマー及びオ
リゴマー組合せは、標準無傷の微生物中でたん白合成を
かき乱すことができる (そこでＤは2,6-ジアミンプリン
又はアデニンである；Ｇはグアニンである；Ｂは5-ブロ
モウラシル、他の5-ハロウラシル又はウラシルである；
及び配列は左にその5'末端を有して示される) ：DGG, B
DDG, DDGG;DGGD; GGDG; GDGG; DGGB; GGBG; GGAGG; GGD
GG; 及び組合せ BDD＋GGDG; DDG ＋GDGG; DGG ＋DGGB;
GGD ＋GGBG; BDDG＋GDG; DDGG ＋DGG; DGGD ＋GGB; GGD
G ＋GBG; BDD＋GGDG＋GBG.短い結合- 増加させるオリゴ
マーの使用は、RNA 配列の生物学的活性を崩壊し、その
配列は生物のターゲットクラスの物質代謝に主要な役割
を果すが、より多くの生物中での同様に重要な役割は、
より長いポリマーの入口を排除する細胞壁を有する種々
の病原性生物 (たとえば微生物及びカビ) に幅広く適応
させてはならない。
【０１２０】次の例は、サブユニット及びポリマー合成
の方法、及び本発明のポリマー組成物の使用を示す。本
発明は例によって限定されない。
の方法、及び本発明のポリマー組成物の使用を示す。本
発明は例によって限定されない。
【０１２１】例１ リボヌクレオシドの塩基保護 次のリボヌクレオシドを、シグマケミカル社、 (セント
ルイス、ミズリー) から得る: ウリジン、グアノシン、
5-メチルウリジン、アデノシン、シチジン、5-プロモウ
リジン、及びイソシン。
ルイス、ミズリー) から得る: ウリジン、グアノシン、
5-メチルウリジン、アデノシン、シチジン、5-プロモウ
リジン、及びイソシン。
【０１２２】2,6-ジアミノ-9-(B-D-リボフラノシル)-9H
- プリン(2,6- ジアミノプリンリボシド) を、フアルツ
及びバウアー(Pfoltz and Bauer)社、アセトケミカル社
の支社 (ウオーターバリー、コネチカット) から得る。
次のヌクレオシドを提示した文献の方法で製造する:1-
β-D- リボフラノシル)-2-ピリミジン(2- ヒドロキシ-
ピリミジンリボシド) を、ニードバラ(Niedballa) の処
理によって製造する。
- プリン(2,6- ジアミノプリンリボシド) を、フアルツ
及びバウアー(Pfoltz and Bauer)社、アセトケミカル社
の支社 (ウオーターバリー、コネチカット) から得る。
次のヌクレオシドを提示した文献の方法で製造する:1-
β-D- リボフラノシル)-2-ピリミジン(2- ヒドロキシ-
ピリミジンリボシド) を、ニードバラ(Niedballa) の処
理によって製造する。
【０１２３】2-アミノ-9- β-D- リボフラノシル)-1,6-
ジヒドロ-6h プリン-6- チオン (チオグアノシン) を、
フオックス(Fox) の処理によって製造する。ジメトキシ
トリチルクロライド、N6- ベンゾイルアデノシン、N4-
ベンゾイルシチジン、及びN2- ベンゾイルグアノシン
が、シグマケミカルから得られる。9-フルオレニルメト
キシカルボニルクロライド(FMOC クロライド) 、トリメ
チルクロロシラン、無水イソ酪酸、4-ニトロベンゾイル
クロライド、無水ナフタリン酸、及び反応及びクロマト
グラフィーに対するすべての有機溶剤がアルドリッチケ
ミカル社 (ミルウォキー、ウィスコンシン) から得られ
る。シリカゲルがEMサイエンス (チエリーヒル、ニュー
ジヤージー) から得られる。
ジヒドロ-6h プリン-6- チオン (チオグアノシン) を、
フオックス(Fox) の処理によって製造する。ジメトキシ
トリチルクロライド、N6- ベンゾイルアデノシン、N4-
ベンゾイルシチジン、及びN2- ベンゾイルグアノシン
が、シグマケミカルから得られる。9-フルオレニルメト
キシカルボニルクロライド(FMOC クロライド) 、トリメ
チルクロロシラン、無水イソ酪酸、4-ニトロベンゾイル
クロライド、無水ナフタリン酸、及び反応及びクロマト
グラフィーに対するすべての有機溶剤がアルドリッチケ
ミカル社 (ミルウォキー、ウィスコンシン) から得られ
る。シリカゲルがEMサイエンス (チエリーヒル、ニュー
ジヤージー) から得られる。
【０１２４】サブユニットの活性化を、ジハロゲン化さ
れた求電子試薬 (たとえばP(O)Cl2N(CH3)2又はP(S)Cl2N
(CH3)2) を用いて行った場合、活性化されたサブユニッ
トのより良い収量を、プリン及びピリミジンエキソ環状
アミン上に全く酸性プロトンを遊離しない保護基を使用
することによってしばしば得られる。この様なエキソ環
状アミン部分の例は、次の通りである：アデノシンのN
6、チトシンのN4、グアニジンのN2、及びジアミノプリ
ンのN2及びN6。この目的に適する保護基は、ナフタロイ
ル基 (デクスヒト) 及びマクブライド(McBride) 等(198
6)によって開発されたアミジン基を有する。更に、サブ
ユニット活性化にジハロゲン化された求電子試薬を使用
することは、一般により良い結果が得られる。その際グ
アニン部分の06を保護する；この保護を、p-ニトロフエ
ネチル基を用いて行う (トリヒチンガー) 。
れた求電子試薬 (たとえばP(O)Cl2N(CH3)2又はP(S)Cl2N
(CH3)2) を用いて行った場合、活性化されたサブユニッ
トのより良い収量を、プリン及びピリミジンエキソ環状
アミン上に全く酸性プロトンを遊離しない保護基を使用
することによってしばしば得られる。この様なエキソ環
状アミン部分の例は、次の通りである：アデノシンのN
6、チトシンのN4、グアニジンのN2、及びジアミノプリ
ンのN2及びN6。この目的に適する保護基は、ナフタロイ
ル基 (デクスヒト) 及びマクブライド(McBride) 等(198
6)によって開発されたアミジン基を有する。更に、サブ
ユニット活性化にジハロゲン化された求電子試薬を使用
することは、一般により良い結果が得られる。その際グ
アニン部分の06を保護する；この保護を、p-ニトロフエ
ネチル基を用いて行う (トリヒチンガー) 。
【０１２５】グアノシン サブユニット活性化の間副反応を最小化するために、ト
リヒチンガー等(1983)の処理を用いてN2及び06両方でグ
アニン部分を保護することがしばしば望まれるからであ
る。
リヒチンガー等(1983)の処理を用いてN2及び06両方でグ
アニン部分を保護することがしばしば望まれるからであ
る。
【０１２６】グアノシンのN2 9-フルオレニルメトキシ
カルボニル誘導体を、ヌクレオシドアミノ基の保護に一
般的である以下の操作によって製造する：グアノシン(1
モル) をピリジン(5ml) 中に懸濁し、トリメチル- クロ
ロシラン(5mmol) で処理する。溶液を15分間撹拌後、9-
フルオレニルメトキシ- カルボニルクロライド(5mmol)
を加え、溶液を室温で３時間維持する。反応を氷浴中で
冷却し、水(1ml) を加える。５分間の撹拌後、濃アンモ
ニア(1ml) を加え、反応を15分間撹拌する。溶液をほぼ
蒸発乾固し、残渣をクロロホルム(10ml)中に溶解する。
この溶液を重炭酸ナトリウム溶液(5ml, 10％) で洗滌
し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発する。残渣を数回ト
ルエンで蒸発し、生成物を、メチレンクロライド(0−50
％) 中のメタノールの勾配を用いてシリカゲル上でクロ
マトグラフィー分離する。
カルボニル誘導体を、ヌクレオシドアミノ基の保護に一
般的である以下の操作によって製造する：グアノシン(1
モル) をピリジン(5ml) 中に懸濁し、トリメチル- クロ
ロシラン(5mmol) で処理する。溶液を15分間撹拌後、9-
フルオレニルメトキシ- カルボニルクロライド(5mmol)
を加え、溶液を室温で３時間維持する。反応を氷浴中で
冷却し、水(1ml) を加える。５分間の撹拌後、濃アンモ
ニア(1ml) を加え、反応を15分間撹拌する。溶液をほぼ
蒸発乾固し、残渣をクロロホルム(10ml)中に溶解する。
この溶液を重炭酸ナトリウム溶液(5ml, 10％) で洗滌
し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発する。残渣を数回ト
ルエンで蒸発し、生成物を、メチレンクロライド(0−50
％) 中のメタノールの勾配を用いてシリカゲル上でクロ
マトグラフィー分離する。
【０１２７】N-2-イソブチルグアノシンをレトシンガー
の方法によって製造する。更にニトロフエネチル部分を
有する06の保護はしばしば望まれ、いくつかの方法によ
って実施することができる (ガイト、1984) 。
の方法によって製造する。更にニトロフエネチル部分を
有する06の保護はしばしば望まれ、いくつかの方法によ
って実施することができる (ガイト、1984) 。
【０１２８】N-2-アセチルグアノシンを、リーゼの方法
でよって得る。N-2-ナフタロイルグアノシンを、デクス
ヒットの方法によって製造する；この文献は、ヌクレオ
シドアミン基の保護に関する一般的方法を提供する。
でよって得る。N-2-ナフタロイルグアノシンを、デクス
ヒットの方法によって製造する；この文献は、ヌクレオ
シドアミン基の保護に関する一般的方法を提供する。
【０１２９】アデノシン N-6- 2-(4-ニトロフエニル)-エトキシカルボニル誘導体
を、ヒンメルスバッハの方法によって製造する。
を、ヒンメルスバッハの方法によって製造する。
【０１３０】N-6 84- ニトロベンゾイル) アデノシン
を、4-ニトロ- ベンゾイルクロライドをFMOCクロライド
に置き代えた他は、FMOC- グアノシンに対する上記操作
によって製造する。
を、4-ニトロ- ベンゾイルクロライドをFMOCクロライド
に置き代えた他は、FMOC- グアノシンに対する上記操作
によって製造する。
【０１３１】N-6 2-( フエニルスルホニル)-エトキシカ
ルボニル誘導体を、2-( フエニルスルホニル)-エチルク
ロロホルマート (バルゴビン) をアシル化剤として使用
し、N-メチルイミダゾール又はピリジン及びN-メチルイ
ミダゾール又はピリジンを溶剤として使用する他は、FM
OCグアノシンに対する操作によって製造する。
ルボニル誘導体を、2-( フエニルスルホニル)-エチルク
ロロホルマート (バルゴビン) をアシル化剤として使用
し、N-メチルイミダゾール又はピリジン及びN-メチルイ
ミダゾール又はピリジンを溶剤として使用する他は、FM
OCグアノシンに対する操作によって製造する。
【０１３２】N-6 ナフトイルアデノシンを、デクスヒッ
トの方法によって製造する；この文献は、ヌクレオシド
アミン基の保護に関する一般的方法を提供する。
トの方法によって製造する；この文献は、ヌクレオシド
アミン基の保護に関する一般的方法を提供する。
【０１３３】2,6-ジアミノプリン リボシド 2,6-ジアミノプリン リボシドのN-2,N-6-ビス(9- フル
オレニルメトキシカルボニル) 誘導体を、グアノシンに
関して記載された一般的操作によって製造する。
オレニルメトキシカルボニル) 誘導体を、グアノシンに
関して記載された一般的操作によって製造する。
【０１３４】N-2,N-6-ビス( イソブチリル) 誘導体をグ
アノシンに関して記載された一般的操作によって製造す
る。
アノシンに関して記載された一般的操作によって製造す
る。
【０１３５】チオグアノシン チオグアノシンのN-2(9-フルオレニルメトキシカルボニ
ル) 誘導体を、グアノシンに関して記載された一般的操
作によって製造する。
ル) 誘導体を、グアノシンに関して記載された一般的操
作によって製造する。
【０１３６】ウリジン サブユニット活性化工程の間、所望されない副生成物を
最小化するために、時々ウラシル部分のN3を保護するこ
とが時々望まれる。5'O-トリチレート化されたウリジン
-2',3'- アセトニドをカミムラ等(1983)の操作によって
N3アニソイル誘導体に変える。次いで生成物をTHF 中で
熱い80％酢酸又は0.1N HClで処理して、リボース部分上
の保護基を切断する。
最小化するために、時々ウラシル部分のN3を保護するこ
とが時々望まれる。5'O-トリチレート化されたウリジン
-2',3'- アセトニドをカミムラ等(1983)の操作によって
N3アニソイル誘導体に変える。次いで生成物をTHF 中で
熱い80％酢酸又は0.1N HClで処理して、リボース部分上
の保護基を切断する。
【０１３７】例２ 5'-OH モルホリノサブユニットの合成 処理中の工程を、第５図中に示された構造に関連して、
第５図中に表示す。
第５図中に表示す。
【０１３８】塩基- 保護されたリボヌクレオシドをペリ
オダートで酸化し、2'-3' ジアルデヒドとなす (構造
1)。ジアルデヒドをアンモニア又は第一アミン上で閉環
し (構造2)、2'及び3'ヒドロキシル (親リボース中に於
けるとして番号をつける）を、シアノボロヒドリドで還
元して除く (構造3)。
オダートで酸化し、2'-3' ジアルデヒドとなす (構造
1)。ジアルデヒドをアンモニア又は第一アミン上で閉環
し (構造2)、2'及び3'ヒドロキシル (親リボース中に於
けるとして番号をつける）を、シアノボロヒドリドで還
元して除く (構造3)。
【０１３９】この一般的合成式の例は、塩基- 保護され
たチトシン (Pi* ) モルホリノサブユニットの合成に関
連して以下に記載する。メタノール1.6lに、撹拌しなが
ら水100ml 中に溶解されたN4- ベンゾイルシチジン0.1
モル及びナトリウムペリオダート0.105 モルを加える。
５分後、アンモニウムビボラート0.12モルを加え、混合
物を１時間室温で撹拌し、冷やし、濾過する。濾液に、
ナトリウムシアノボロヒドリド0.12モルを加える。10分
後、トリエンスルホン酸0.20モルを加える。更に30分
後、更にトルエンスルホン酸0.20モルを加え、混合物を
冷やし、濾過する。固形の沈殿物を水500ml づつで２回
洗滌し、減圧下に乾燥して、構造３中に示される遊離ア
ミンのトシルレート塩を生じる。
たチトシン (Pi* ) モルホリノサブユニットの合成に関
連して以下に記載する。メタノール1.6lに、撹拌しなが
ら水100ml 中に溶解されたN4- ベンゾイルシチジン0.1
モル及びナトリウムペリオダート0.105 モルを加える。
５分後、アンモニウムビボラート0.12モルを加え、混合
物を１時間室温で撹拌し、冷やし、濾過する。濾液に、
ナトリウムシアノボロヒドリド0.12モルを加える。10分
後、トリエンスルホン酸0.20モルを加える。更に30分
後、更にトルエンスルホン酸0.20モルを加え、混合物を
冷やし、濾過する。固形の沈殿物を水500ml づつで２回
洗滌し、減圧下に乾燥して、構造３中に示される遊離ア
ミンのトシルレート塩を生じる。
【０１４０】中位に強い(pKa<3) 芳香族酸、たとえばト
ルエンスルホン酸又は2-ナフタレンスルホン酸の使用
は、容易な処理、著しく改良された収量、及び生成物純
度の高いレベルを提供する。
ルエンスルホン酸又は2-ナフタレンスルホン酸の使用
は、容易な処理、著しく改良された収量、及び生成物純
度の高いレベルを提供する。
【０１４１】次いで塩基- 保護されたモルホリノサブユ
ニットを、トリチルクロライド又はベンジヒドラールニ
トロフエニルカルボナートを用いてモルホリノ環の輪状
窒素で保護する (構造4)。その代りに、5'ヒドロキシル
を、トリアルキルシリル基で保護することができる。
ニットを、トリチルクロライド又はベンジヒドラールニ
トロフエニルカルボナートを用いてモルホリノ環の輪状
窒素で保護する (構造4)。その代りに、5'ヒドロキシル
を、トリアルキルシリル基で保護することができる。
【０１４２】保護工程の例としては、アセトニトリル２
リットルに、撹拌しながらトシラート塩0.1 モル、次い
でトリエチルアミン0.26モル及びトリチルクロライド0.
15モルを加える混合物をおおい、１時間室温で撹拌し、
その後メタノール100mlmを加え、次いで15分間撹拌す
る。回転蒸発器によって乾燥後、メタノール400mlmを加
える。固体を十分にスラリーとして懸濁した後に、水５
ｌを加え、混合物を30分間撹拌し、濾過する。固体を水
１ｌで洗滌し、濾過し、減圧で乾燥する。固体をジクロ
ロメタン500ml 中に懸濁し、沈殿がまさに開始するまで
回転蒸発し、その後ヘキサン１ｌを加え、15分間撹拌す
る。固体を濾過によって除去し、減圧で乾燥する。
リットルに、撹拌しながらトシラート塩0.1 モル、次い
でトリエチルアミン0.26モル及びトリチルクロライド0.
15モルを加える混合物をおおい、１時間室温で撹拌し、
その後メタノール100mlmを加え、次いで15分間撹拌す
る。回転蒸発器によって乾燥後、メタノール400mlmを加
える。固体を十分にスラリーとして懸濁した後に、水５
ｌを加え、混合物を30分間撹拌し、濾過する。固体を水
１ｌで洗滌し、濾過し、減圧で乾燥する。固体をジクロ
ロメタン500ml 中に懸濁し、沈殿がまさに開始するまで
回転蒸発し、その後ヘキサン１ｌを加え、15分間撹拌す
る。固体を濾過によって除去し、減圧で乾燥する。
【０１４３】上記操作は、モルホリノ窒素上でトリチレ
ート化された及び遊離5'ヒドロキシルを有する塩基- 保
護されたモルホリノサブユニットを生じる (構造4)。
ート化された及び遊離5'ヒドロキシルを有する塩基- 保
護されたモルホリノサブユニットを生じる (構造4)。
【０１４４】例３ モルホリノサブユニットの他の合成 この例に、モルホリノ環窒素に結合した酸- 不安定部分
を含有するモルホリノサブユニットの他の製造を示す。
を含有するモルホリノサブユニットの他の製造を示す。
【０１４５】サブユニットを、例２に於ける様に、リボ
ヌクレオシドをペリオダートで酸化し、生じるジアルデ
ヒド（構造1)を、ベンゾトリアゾール、又はp-ニトロフ
エノールで緩衝された第１アミン4,4'- ジメトキシベン
ズヒドリルアミン (これはグリーンリーの方法によって
製造することができる1984) 上で閉環して製造する。例
２に於ける様に行われる、ナトリウムシアノボロヒドリ
ドでの還元は、モルホリノ窒素上に4,4'- ジメトキシベ
ンズヒドリル基を有するモルホリノサブユニット (構造
2)を生じる。
ヌクレオシドをペリオダートで酸化し、生じるジアルデ
ヒド（構造1)を、ベンゾトリアゾール、又はp-ニトロフ
エノールで緩衝された第１アミン4,4'- ジメトキシベン
ズヒドリルアミン (これはグリーンリーの方法によって
製造することができる1984) 上で閉環して製造する。例
２に於ける様に行われる、ナトリウムシアノボロヒドリ
ドでの還元は、モルホリノ窒素上に4,4'- ジメトキシベ
ンズヒドリル基を有するモルホリノサブユニット (構造
2)を生じる。
【０１４６】この操作の１つの特徴は、塩基（たとえば
ウリジン）上に保護基を有しないリボヌクレオシドから
モルホリノサブユニットを製造するのに特に有用である
ことである。
ウリジン）上に保護基を有しないリボヌクレオシドから
モルホリノサブユニットを製造するのに特に有用である
ことである。
【０１４７】例４ 5'- ホスホナートサブユニットの合成 この方法の工程を、第５図中の構造に関連して示す。
【０１４８】二重- 保護されたモルホリノサブユニット
の5'- ヒドロキシル (構造4)を、次の様にホスホナート
に変える。N4- ベンゾイルシチジン-2',3'- アセトニド
（１mmol) を、20時間室温でアルゴン下でDMF(20ml) 中
メチルトリフエノキシホスホニウムヨーダイドと反応さ
せて、5'- ヨード誘導体に変える。メタノール(5ml)
を、反応混合物に加え、30分後混合物を減圧で蒸発す
る。残渣を酢酸エチル中で溶解し、溶液を先ず水性チオ
硫酸ナトリウムで、次いでブラインで洗滌する。硫酸ナ
トリウムで乾燥し、溶剤の蒸発後、生成物をイソプロパ
ノール／クロロホルム溶剤を用いてシリカ上でクロマト
グラフィーによって精製する。
の5'- ヒドロキシル (構造4)を、次の様にホスホナート
に変える。N4- ベンゾイルシチジン-2',3'- アセトニド
（１mmol) を、20時間室温でアルゴン下でDMF(20ml) 中
メチルトリフエノキシホスホニウムヨーダイドと反応さ
せて、5'- ヨード誘導体に変える。メタノール(5ml)
を、反応混合物に加え、30分後混合物を減圧で蒸発す
る。残渣を酢酸エチル中で溶解し、溶液を先ず水性チオ
硫酸ナトリウムで、次いでブラインで洗滌する。硫酸ナ
トリウムで乾燥し、溶剤の蒸発後、生成物をイソプロパ
ノール／クロロホルム溶剤を用いてシリカ上でクロマト
グラフィーによって精製する。
【０１４９】上記製造されたヨーダイド誘導体を、十分
に密封された容器中で２日間50℃でエタノール中で大過
剰の無水ホスフィンで処理する。この期間の終了時に、
容器を冷却し、放出し、そして過剰ホスフィンを徐々に
蒸発させる。排出された蒸気を、次亜塩素酸ナトリウム
を含有する溶液中であわ立て、毒性ガスを分解する。第
一ホスフィンのアルコール性溶液を溶液を冷却しながら
固形炭酸ナトリウム及び冷えた過剰の30％過酸化水素で
処理する。精製物ホスホン酸を、アニオン交換カラム上
でイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。
に密封された容器中で２日間50℃でエタノール中で大過
剰の無水ホスフィンで処理する。この期間の終了時に、
容器を冷却し、放出し、そして過剰ホスフィンを徐々に
蒸発させる。排出された蒸気を、次亜塩素酸ナトリウム
を含有する溶液中であわ立て、毒性ガスを分解する。第
一ホスフィンのアルコール性溶液を溶液を冷却しながら
固形炭酸ナトリウム及び冷えた過剰の30％過酸化水素で
処理する。精製物ホスホン酸を、アニオン交換カラム上
でイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。
【０１５０】対イオンはトリエチルアンモニウムである
このジアニオンホスフアート精製物を、所望のペンダン
トＸ部分のカルボジイミド- 媒介付加を生じる (第3a
図) 過剰の試剤と混合する。適する試剤の例は、次の通
りである；メタノールの添加は、X-メトキシを生じる；
そしてジメチルアミンの付加は、X=N(CH3)2 を生じる。
この混合物に、カルボジイミド、たとえばDCC,を加え
る。生じるサブユニットは、第3a図中に示される形であ
る。実質上より小さい塩基性対イオン (たとえばピリジ
ン) を使用してはならない。というのは２個のＸ部分を
ホスホナート部分に加えねばならないからである。
このジアニオンホスフアート精製物を、所望のペンダン
トＸ部分のカルボジイミド- 媒介付加を生じる (第3a
図) 過剰の試剤と混合する。適する試剤の例は、次の通
りである；メタノールの添加は、X-メトキシを生じる；
そしてジメチルアミンの付加は、X=N(CH3)2 を生じる。
この混合物に、カルボジイミド、たとえばDCC,を加え
る。生じるサブユニットは、第3a図中に示される形であ
る。実質上より小さい塩基性対イオン (たとえばピリジ
ン) を使用してはならない。というのは２個のＸ部分を
ホスホナート部分に加えねばならないからである。
【０１５１】例５ N-メタンホスホナートモルホリノサブユニットの合成 この例に、7-原子単位- 長さの骨格を有するポリマー
(第3d図) を製造するのに適するモルホリノ環窒素に結
合するメチルホスホナート部分を有するサブユニットの
製造を示す。この工程を、第７図中に示される構造に関
して示す。
(第3d図) を製造するのに適するモルホリノ環窒素に結
合するメチルホスホナート部分を有するサブユニットの
製造を示す。この工程を、第７図中に示される構造に関
して示す。
【０１５２】塩基- 保護されたリボヌクレオシドとジ(p
- メトキシ) トリチルクロライドとを反応させて、構造
１を生じる。次いでリボース部分を、アミノメタンホス
ホン酸(AMPA)及びN-エチルモルホリンの存在下にパーリ
オダートで酸化する。酸化をナトリウムシアノボロヒド
リドでベンゾトリアゾールの存在下に還元して、モルホ
リノ窒素上にメタンホスホン酸基を有するモルホリノサ
ブユニットを生じる(構造2)。その後精製物を、トリエ
チルアミン中にクロロホルム／メタノール混合物１％で
展開されたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製
する。
- メトキシ) トリチルクロライドとを反応させて、構造
１を生じる。次いでリボース部分を、アミノメタンホス
ホン酸(AMPA)及びN-エチルモルホリンの存在下にパーリ
オダートで酸化する。酸化をナトリウムシアノボロヒド
リドでベンゾトリアゾールの存在下に還元して、モルホ
リノ窒素上にメタンホスホン酸基を有するモルホリノサ
ブユニットを生じる(構造2)。その後精製物を、トリエ
チルアミン中にクロロホルム／メタノール混合物１％で
展開されたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製
する。
【０１５３】対イオンはトリエチルアンモニウムである
このジアニオンホスホナート精製物を、所望のペンダン
トＸ部分 (構造3d) の付加を生じる過剰の試剤と混合す
る。適する試剤の例は次の通りである：メタノールの付
加はX=メトキシを生じる；そしてジメチルアミンの付加
は、X=N(CH3)2 を生じる。この混合物に、カルボジイミ
ド、たとえばジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC) を
加えて、第７図の構造３を生じる。実質上より小さい塩
基性対イオン（たとえばピリジン）を使用した場合、２
個のＸ部分はホスホナート部分に加わる。
このジアニオンホスホナート精製物を、所望のペンダン
トＸ部分 (構造3d) の付加を生じる過剰の試剤と混合す
る。適する試剤の例は次の通りである：メタノールの付
加はX=メトキシを生じる；そしてジメチルアミンの付加
は、X=N(CH3)2 を生じる。この混合物に、カルボジイミ
ド、たとえばジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC) を
加えて、第７図の構造３を生じる。実質上より小さい塩
基性対イオン（たとえばピリジン）を使用した場合、２
個のＸ部分はホスホナート部分に加わる。
【０１５４】例６ 5'ヒドロキシから5'アミンへ及び5'スルホヒドラールへ
の変換 Ａ．アミンへの変換 二重- 保護されたモルホリノサブユニットの5'ヒドロキ
シル (構造４，第５図）を、次の様にアミンに変えるこ
とができる。DMSO 500mlに、ピリジン(Pyr)1.0モル、ト
リフルオロ酢酸(TFA)0.5モル、及びモルホリノサブユニ
ット0.1 モルを加える。混合物を、すべての成分が溶解
するまで撹拌し、次いで0.5 モルのジイソプロピルカル
ボジイミド(DIC) 又はジシクロヘキシルカルボジイミド
(DCC) のどちらかを加える。２時間後、反応混合物を、
急速に撹拌されたブライン８ｌに加える。この溶液を30
分間撹拌し、次いで濾過する。生じる固体を簡単に乾燥
し、氷冷ヘキサン１ｌで洗滌し、濾過する。固体をメタ
ノール１ｌ中でナトリウムシアノボロヒドリド0.2 モル
に加え、10分間撹拌する。この混合物に、0.4 モルのベ
ンゾトリアゾール又はp-ニトロフエノールを加え、メチ
ルアミン(H2O中で40％)0.2モルの添加を続ける。調製物
を、室温で４時間撹拌する。〔注：ベンゾトリアゾール
又はp-ニトロフエノールは、還元アルキル化のイミニウ
ム工程でサブユニットの4'炭素でラセミ化を保護するた
めに反応混合物を緩衝する。〕最後に、反応混合物を、
水５ｌ中に注ぎ入れ、良好な沈殿が形成されるまで撹拌
し、固体（構造６，第５図）を集め、次いで乾燥する。
の変換 Ａ．アミンへの変換 二重- 保護されたモルホリノサブユニットの5'ヒドロキ
シル (構造４，第５図）を、次の様にアミンに変えるこ
とができる。DMSO 500mlに、ピリジン(Pyr)1.0モル、ト
リフルオロ酢酸(TFA)0.5モル、及びモルホリノサブユニ
ット0.1 モルを加える。混合物を、すべての成分が溶解
するまで撹拌し、次いで0.5 モルのジイソプロピルカル
ボジイミド(DIC) 又はジシクロヘキシルカルボジイミド
(DCC) のどちらかを加える。２時間後、反応混合物を、
急速に撹拌されたブライン８ｌに加える。この溶液を30
分間撹拌し、次いで濾過する。生じる固体を簡単に乾燥
し、氷冷ヘキサン１ｌで洗滌し、濾過する。固体をメタ
ノール１ｌ中でナトリウムシアノボロヒドリド0.2 モル
に加え、10分間撹拌する。この混合物に、0.4 モルのベ
ンゾトリアゾール又はp-ニトロフエノールを加え、メチ
ルアミン(H2O中で40％)0.2モルの添加を続ける。調製物
を、室温で４時間撹拌する。〔注：ベンゾトリアゾール
又はp-ニトロフエノールは、還元アルキル化のイミニウ
ム工程でサブユニットの4'炭素でラセミ化を保護するた
めに反応混合物を緩衝する。〕最後に、反応混合物を、
水５ｌ中に注ぎ入れ、良好な沈殿が形成されるまで撹拌
し、固体（構造６，第５図）を集め、次いで乾燥する。
【０１５５】Ｂ．スルヒドラルへの変換 二重- 保護されたモルホリノサブユニットの5'ヒドロキ
シルを、次の様にスルヒドラルへ変換する。1/10モルの
5'- ヒドロキシルサブユニット (構造４，第５図）を、
ピリジン１ｌに加え、次いでトルエンスルホニルクロチ
イド0.12モルを加える。この溶液を、室温で３時間撹拌
し、反応は第５図の構造７として示された生成物を生じ
る。ピリジンを回転蒸発によって除き、固体にNaＩを含
有するメタノールDMF １ｌ中で新鮮なナトリウムヒドロ
スルフイッド0.5 モルを加える。この反応混合物を室温
で一晩撹拌する。混合物を水５ｌに加え、20分撹拌し、
乾燥して、第５図の構造８として示された生成物が得ら
れる。
シルを、次の様にスルヒドラルへ変換する。1/10モルの
5'- ヒドロキシルサブユニット (構造４，第５図）を、
ピリジン１ｌに加え、次いでトルエンスルホニルクロチ
イド0.12モルを加える。この溶液を、室温で３時間撹拌
し、反応は第５図の構造７として示された生成物を生じ
る。ピリジンを回転蒸発によって除き、固体にNaＩを含
有するメタノールDMF １ｌ中で新鮮なナトリウムヒドロ
スルフイッド0.5 モルを加える。この反応混合物を室温
で一晩撹拌する。混合物を水５ｌに加え、20分撹拌し、
乾燥して、第５図の構造８として示された生成物が得ら
れる。
【０１５６】例７ 5'アミノメチルホスホナートリボシドサブユニットの合
成 この例中に、リボシドに結合されたアミノメチルホスホ
ナート部分を含有するリボシドサブユニットの製造を示
す。この例中に関連する構造を、第12図中に示す。
成 この例中に、リボシドに結合されたアミノメチルホスホ
ナート部分を含有するリボシドサブユニットの製造を示
す。この例中に関連する構造を、第12図中に示す。
【０１５７】アミノメチルホスホン酸 (アルドリッチ化
学社) とトリチルクロライドをトリエチルアミンの存在
下に反応させる。対イオンがトリエチルアンモニウムで
あるジアニオンホスホナート生成物を、所望のペンダン
トＸ部分の付加（たとえばメタノールの付加はX=メトキ
シを生じ、ジメチルアミンの付加はX=N(CH3)2 を生じ
る) に適する過剰の試剤と混合し、次いでカルボジイミ
ド、たとえばジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC) 、
を加える。生じるモノアニオン性生成物を、ピリジニウ
ムヒドロクロチイドを含有する水とクロロホルムとの混
合物と共に振とうする。この操作は、ピリジニウム対イ
オンを有するモノイオンホスホン酸を生じる。この生成
物を、N4- ベンゾイルシチジン-2',3'- フエニルホロナ
ートを含有するクロロホルムに加え、DCC を加える。生
成物を乾燥し、メタノール／クロロホルム混合物を用い
てシリカ上でクロマトグラフィー分離する。次いで純粋
な生成物を、1,3-ジヒドロキシプロパンで処理し、第12
図の構造２を生じ、更に一部をトリフルオロエタノール
中で酢酸で処理し、構造１を生じる。
学社) とトリチルクロライドをトリエチルアミンの存在
下に反応させる。対イオンがトリエチルアンモニウムで
あるジアニオンホスホナート生成物を、所望のペンダン
トＸ部分の付加（たとえばメタノールの付加はX=メトキ
シを生じ、ジメチルアミンの付加はX=N(CH3)2 を生じ
る) に適する過剰の試剤と混合し、次いでカルボジイミ
ド、たとえばジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC) 、
を加える。生じるモノアニオン性生成物を、ピリジニウ
ムヒドロクロチイドを含有する水とクロロホルムとの混
合物と共に振とうする。この操作は、ピリジニウム対イ
オンを有するモノイオンホスホン酸を生じる。この生成
物を、N4- ベンゾイルシチジン-2',3'- フエニルホロナ
ートを含有するクロロホルムに加え、DCC を加える。生
成物を乾燥し、メタノール／クロロホルム混合物を用い
てシリカ上でクロマトグラフィー分離する。次いで純粋
な生成物を、1,3-ジヒドロキシプロパンで処理し、第12
図の構造２を生じ、更に一部をトリフルオロエタノール
中で酢酸で処理し、構造１を生じる。
【０１５８】例８ ホスホンアミドリンケージを生じるカップリング この例中、例４に於ける様に製造されたホスホナートサ
ブユニットを遊離のモルホリノ環窒素を有する第二サブ
ユニットとカップリングすることを示す。例を、第９図
中の構造に関連して示す。
ブユニットを遊離のモルホリノ環窒素を有する第二サブ
ユニットとカップリングすることを示す。例を、第９図
中の構造に関連して示す。
【０１５９】出発材料は、例４で製造された、塩基- 保
護された、モルホリノ窒素保護されたホスホナートサブ
ユニットである。このサブユニットのトリエチルアミン
塩を、クロロホルム中に懸濁し、ピリジニウムヒドロク
ロチイドを含有する水で振とうし、クロロホルム相中に
サブユニットのピリジン塩 (構造1)を生じる。有機相を
分離し、水洗し、次いで乾燥する。生じる固体の１部
を、過剰の3-ヒドロキシプロピオニトリルと混合する；
次いでDCC を混合物に加える。生じる反応の生成物をト
リフルオロエタノール中で２％酢酸で脱トリチレート化
し、構造２を生じる。次いで構造１及び２を、DCC の存
在下に混合し、構造３として示された結合されたダイマ
ーを生じる。このダイマーを、より長いオリゴマーブロ
ック又はポリマーに集めるためのどちらかの末端で選択
的に脱保護する。シアノエチル基を、非プロトン性溶剤
（たとえばDMF)中でDBU と共に除去するか又はトリチル
部分を上述の様に切断することができる。
護された、モルホリノ窒素保護されたホスホナートサブ
ユニットである。このサブユニットのトリエチルアミン
塩を、クロロホルム中に懸濁し、ピリジニウムヒドロク
ロチイドを含有する水で振とうし、クロロホルム相中に
サブユニットのピリジン塩 (構造1)を生じる。有機相を
分離し、水洗し、次いで乾燥する。生じる固体の１部
を、過剰の3-ヒドロキシプロピオニトリルと混合する；
次いでDCC を混合物に加える。生じる反応の生成物をト
リフルオロエタノール中で２％酢酸で脱トリチレート化
し、構造２を生じる。次いで構造１及び２を、DCC の存
在下に混合し、構造３として示された結合されたダイマ
ーを生じる。このダイマーを、より長いオリゴマーブロ
ック又はポリマーに集めるためのどちらかの末端で選択
的に脱保護する。シアノエチル基を、非プロトン性溶剤
（たとえばDMF)中でDBU と共に除去するか又はトリチル
部分を上述の様に切断することができる。
【０１６０】例９ ホスホルアミドリンケージを生じる活性化及びカップリ
ング Ａ．X=-CH3 例９Ａに、例２又は３に於ける様に製造された5'ヒドロ
キシルサブユニットが活性化され、遊離モルホリノ環窒
素を有する第二サブユニットにカップリングして、アル
キルホンホンアミダートインターサブユニットリンケー
ジを生じることを示す。例を、Ｘがアルキル基である、
第10図中の構造に関連して示す。
ング Ａ．X=-CH3 例９Ａに、例２又は３に於ける様に製造された5'ヒドロ
キシルサブユニットが活性化され、遊離モルホリノ環窒
素を有する第二サブユニットにカップリングして、アル
キルホンホンアミダートインターサブユニットリンケー
ジを生じることを示す。例を、Ｘがアルキル基である、
第10図中の構造に関連して示す。
【０１６１】塩基- 保護されかつモルホリノ窒素上でト
リチレート化された (第５図の構造4)5'ヒドロキシルサ
ブユニット１mmolを、ジクロロメタン20ml中に溶解す
る。この溶液に、N-エチルモルホリン４mmol及びメチル
ホスホンジクロライド1.1mmol、Z=O(又はメチルチオホ
スホンジクロライド、Z=S)を加え、次いでN-メチルイミ
ダゾール１mmolを加える。１時間後、反応溶液を、水性
NaH2PO4 で洗滌する。活性化されたサブユニットを、酢
酸エチルで展開されたシリカゲル上でクロマトグラフィ
ー分離して、単離する(Xがメチルである第10図の構造
2)。この活性化されたサブユニットは、DMF 中でこれを
混合して第二サブユニット (構造3)のモルホリノ窒素と
直接結合することができる。このカップリング反応は、
構造４(Xは-CH3である）として示されたダイマーを生じ
る。
リチレート化された (第５図の構造4)5'ヒドロキシルサ
ブユニット１mmolを、ジクロロメタン20ml中に溶解す
る。この溶液に、N-エチルモルホリン４mmol及びメチル
ホスホンジクロライド1.1mmol、Z=O(又はメチルチオホ
スホンジクロライド、Z=S)を加え、次いでN-メチルイミ
ダゾール１mmolを加える。１時間後、反応溶液を、水性
NaH2PO4 で洗滌する。活性化されたサブユニットを、酢
酸エチルで展開されたシリカゲル上でクロマトグラフィ
ー分離して、単離する(Xがメチルである第10図の構造
2)。この活性化されたサブユニットは、DMF 中でこれを
混合して第二サブユニット (構造3)のモルホリノ窒素と
直接結合することができる。このカップリング反応は、
構造４(Xは-CH3である）として示されたダイマーを生じ
る。
【０１６２】別の活性化及びカップリング操作は、ジク
ロロメタン20ml中でモルホリノ窒素(第５図の構造4)上
で塩基- 保護されかつトリチレート化された5'ヒドロキ
シルサブユニット１mmolを溶解しなければならない。溶
解後、メチルホスホンジクロライド1.1mmol 、Z=O(又は
メチルチオホスホンジクロライド、Z=S)、を加える。２
時間後、生成物(Xはメチルである第10図の構造2)を、10
％アセトン／90％クロロホルムで展開されたシリカゲル
上でクロマトグラフィー分離によって単離する。この活
性化されたサブユニット１mmolをN,N-ジイソプロピルア
ミノエチルイソブチラート(DIPAEIB)1.5mmolを含有する
ジクロロメタン中でこれを混合して第二サブユニットの
モルホリノ窒素（構造3)と直接結合させ、構造４(Xは-C
H3である）として示されるダイマーを生じる。
ロロメタン20ml中でモルホリノ窒素(第５図の構造4)上
で塩基- 保護されかつトリチレート化された5'ヒドロキ
シルサブユニット１mmolを溶解しなければならない。溶
解後、メチルホスホンジクロライド1.1mmol 、Z=O(又は
メチルチオホスホンジクロライド、Z=S)、を加える。２
時間後、生成物(Xはメチルである第10図の構造2)を、10
％アセトン／90％クロロホルムで展開されたシリカゲル
上でクロマトグラフィー分離によって単離する。この活
性化されたサブユニット１mmolをN,N-ジイソプロピルア
ミノエチルイソブチラート(DIPAEIB)1.5mmolを含有する
ジクロロメタン中でこれを混合して第二サブユニットの
モルホリノ窒素（構造3)と直接結合させ、構造４(Xは-C
H3である）として示されるダイマーを生じる。
【０１６３】第三アミン／エステル、DIPAEIB 、をイソ
ブチリルクロライド1.1 モル、N,N-sジイソプロピルア
ミノエタルール１モル、及びピリジン1.5 モルを混合
し、次いで30分 110℃で加熱して製造する。調製物を、
H2O 500ml 中でNaOH 0.5モルで洗滌し、蒸発して、 115
℃、30mmHgで沸騰する所望のアミン／エステルを生じ
る。 アルキルホスホンアミダートインターサブユニッ
トリンケージ(Xは-CH3である 構造4)は、塩基脱保護に
使用されるアンモニアに極めて安定である。対照的に、
リンケージは比較的に弱い酸に敏感である。たとえばリ
ンケージは、クロロホルムメタン中の２％シクロロ酢酸
中で約３時間の開裂半減期を有する。しかしリンケージ
は、トリフルオロエタノール中の２％酢酸中で18時間後
検出可能な開裂を示さず、モルホリノ窒素の脱トリチレ
ート化に適する状態にする。
ブチリルクロライド1.1 モル、N,N-sジイソプロピルア
ミノエタルール１モル、及びピリジン1.5 モルを混合
し、次いで30分 110℃で加熱して製造する。調製物を、
H2O 500ml 中でNaOH 0.5モルで洗滌し、蒸発して、 115
℃、30mmHgで沸騰する所望のアミン／エステルを生じ
る。 アルキルホスホンアミダートインターサブユニッ
トリンケージ(Xは-CH3である 構造4)は、塩基脱保護に
使用されるアンモニアに極めて安定である。対照的に、
リンケージは比較的に弱い酸に敏感である。たとえばリ
ンケージは、クロロホルムメタン中の２％シクロロ酢酸
中で約３時間の開裂半減期を有する。しかしリンケージ
は、トリフルオロエタノール中の２％酢酸中で18時間後
検出可能な開裂を示さず、モルホリノ窒素の脱トリチレ
ート化に適する状態にする。
【０１６４】Ｂ．X=-O-CH2CH3 例９Ｂに、例２又は３に於ける様に製造された5'ヒドロ
キシルサブユニットの活性化及び遊離のモルホリノ環窒
素を有する第二サブユニットへのカップリングがホスホ
ジエステルアミドインタロサブユニットリンケージを生
じることを示す。例を、Ｘがアルコキシド基である第10
図中の構造に関連して示す。
キシルサブユニットの活性化及び遊離のモルホリノ環窒
素を有する第二サブユニットへのカップリングがホスホ
ジエステルアミドインタロサブユニットリンケージを生
じることを示す。例を、Ｘがアルコキシド基である第10
図中の構造に関連して示す。
【０１６５】塩基- 保護されかつモルホリノ窒素上でト
リチレート化された (第５図の構造4)5'ヒドロキシルサ
ブユニット１mmolを、ベンゼン80ml及びN-メチルイミダ
ゾール2.2mmol 中に溶解する。サブユニットの溶解後、
エチルジクロロホスフアート1.2mmol 、Z=O(又はエチル
ジクロロチオホスフアート、Z=S)を加える。１時間後、
反応溶液を、水性NaH2PO4 で洗滌する。活性化されたサ
ブユニットを、酢酸エチルで展開されたシリカゲル上で
クロマトグラフィー分離して単離する(Xが-O-CH2CH3 で
ある第10図の構造2)。この活性化されたサブユニット
は、DMF 中でこれを混合して第二サブユニット (構造3)
のモルホリノ窒素と直接結合することができる。このカ
ップリング反応は、構造４として示されたダイマーを生
じる。
リチレート化された (第５図の構造4)5'ヒドロキシルサ
ブユニット１mmolを、ベンゼン80ml及びN-メチルイミダ
ゾール2.2mmol 中に溶解する。サブユニットの溶解後、
エチルジクロロホスフアート1.2mmol 、Z=O(又はエチル
ジクロロチオホスフアート、Z=S)を加える。１時間後、
反応溶液を、水性NaH2PO4 で洗滌する。活性化されたサ
ブユニットを、酢酸エチルで展開されたシリカゲル上で
クロマトグラフィー分離して単離する(Xが-O-CH2CH3 で
ある第10図の構造2)。この活性化されたサブユニット
は、DMF 中でこれを混合して第二サブユニット (構造3)
のモルホリノ窒素と直接結合することができる。このカ
ップリング反応は、構造４として示されたダイマーを生
じる。
【０１６６】エチルジクロロチオホスフアート(Z=S) を
サブユニットの活性化に使用する場合、改良された収量
が次の変化で得られる。モルホリノ窒素 (第５図の構造
4)上で塩基- 保護されかつトリチレート化された5'ヒド
ロキシルサブユニット１mmolをクロロホルム20ml中に懸
濁する。この溶液に、N-メチルイミダゾール１ml、次い
でエチルジクロロチオホスフアート1.6ml(アルドリッチ
化学社) を加える。１時間後、サブユニット生成物を、
20％アセトン／80％クロロホルムで展開されたシリカゲ
ルクロマトグラフィーによって精製する。この活性化さ
れたサブユニット(Xは-O-CH2-CH3, Z はイオウである構
造2)を、上述の様に第二サブユニットのモルホリノ窒素
にカップリングすることができる。
サブユニットの活性化に使用する場合、改良された収量
が次の変化で得られる。モルホリノ窒素 (第５図の構造
4)上で塩基- 保護されかつトリチレート化された5'ヒド
ロキシルサブユニット１mmolをクロロホルム20ml中に懸
濁する。この溶液に、N-メチルイミダゾール１ml、次い
でエチルジクロロチオホスフアート1.6ml(アルドリッチ
化学社) を加える。１時間後、サブユニット生成物を、
20％アセトン／80％クロロホルムで展開されたシリカゲ
ルクロマトグラフィーによって精製する。この活性化さ
れたサブユニット(Xは-O-CH2-CH3, Z はイオウである構
造2)を、上述の様に第二サブユニットのモルホリノ窒素
にカップリングすることができる。
【０１６７】別の活性化及びカップリング操作は、ジク
ロロメタン20ml中でモルホリノ窒素(第５図の構造4)上
で塩基- 保護されかつトリチレート化された5'ヒドロキ
シルサブユニット１mmolを溶解しなければならない。こ
の溶液に、N,N-ジエチルアニリン４mmol及び4-メトキシ
ピリジン-N- オキシド0.2mmol を加える。溶解後、エチ
ルジクロロホスフアート1.1mmol 、Z=O(又はエチルジク
ロロチオホスフアート、Z=S)、を加える。１時間後、生
成物(Xはエトキシである第10図の構造2)を、10％アセト
ン／90％クロロホルムで展開されたシリカゲル上でクロ
マトグラフィー分離によって単離する。この活性化され
たサブユニット１mmolをN,N-ジイソプロピルアミノエチ
ルイソブチラート(DIPAEIB)1.5mmolを含有するジクロロ
メタン中でこれを混合して第二サブユニットのモルホリ
ノ窒素 (構造3)と直接結合させ、構造４(XはO-CH2-CH3
である）として示されるダイマーを生じる。
ロロメタン20ml中でモルホリノ窒素(第５図の構造4)上
で塩基- 保護されかつトリチレート化された5'ヒドロキ
シルサブユニット１mmolを溶解しなければならない。こ
の溶液に、N,N-ジエチルアニリン４mmol及び4-メトキシ
ピリジン-N- オキシド0.2mmol を加える。溶解後、エチ
ルジクロロホスフアート1.1mmol 、Z=O(又はエチルジク
ロロチオホスフアート、Z=S)、を加える。１時間後、生
成物(Xはエトキシである第10図の構造2)を、10％アセト
ン／90％クロロホルムで展開されたシリカゲル上でクロ
マトグラフィー分離によって単離する。この活性化され
たサブユニット１mmolをN,N-ジイソプロピルアミノエチ
ルイソブチラート(DIPAEIB)1.5mmolを含有するジクロロ
メタン中でこれを混合して第二サブユニットのモルホリ
ノ窒素 (構造3)と直接結合させ、構造４(XはO-CH2-CH3
である）として示されるダイマーを生じる。
【０１６８】Ｃ．X=-F 例９Ｃに、例２又は３に於ける様に製造された5'ヒドロ
キシルサブユニットが活性化され、遊離モルホリノ環窒
素を有する第二サブユニットにカップリングして、フル
オロホスホルアミダートインターサブユニットリンケー
ジを生じることを示す。例を、Ｘがフッ素である、第10
図中の構造に関連して示す。
キシルサブユニットが活性化され、遊離モルホリノ環窒
素を有する第二サブユニットにカップリングして、フル
オロホスホルアミダートインターサブユニットリンケー
ジを生じることを示す。例を、Ｘがフッ素である、第10
図中の構造に関連して示す。
【０１６９】出発材料はβ脱離メカニズムで除去できる
基で塩基- 保護されかつモルホリノ窒素上でトリチレー
ト化された (第５図の構造4)5'ヒドロキシルサブユニッ
ト１mmolである。サブユニットをN-メチルイミダゾール
６mmol、次いでフルオロリン酸2.5mmol が添加されたジ
クロロメタン20ml中に溶解する。DCC ５mmolを加え、溶
液を３時間撹拌する。反応溶液を水性NaH2PO4 で洗滌
し、有機相を減圧下に乾燥し、フルオロホスフアート塩
を生じる(XはF, 対イオンはN-メチルイミダゾールであ
る構造5)。生成物をピリジン中でメタノール／クロロホ
ルム混合物１％で展開されたシリカゲルクロマトグラフ
ィーによって精製し、ピリジニウム塩を生じる。乾燥
後、精製された生成物は、遊離モルホリノ窒素 (構造6)
を有する5'-保護されたサブユニットにジクロロメタン
中でDCC を用いてカップリングするのに適する。このカ
ルボジイミドカップリング反応は、構造７(XはF であ
る）として示されるダイマーを生じる。
基で塩基- 保護されかつモルホリノ窒素上でトリチレー
ト化された (第５図の構造4)5'ヒドロキシルサブユニッ
ト１mmolである。サブユニットをN-メチルイミダゾール
６mmol、次いでフルオロリン酸2.5mmol が添加されたジ
クロロメタン20ml中に溶解する。DCC ５mmolを加え、溶
液を３時間撹拌する。反応溶液を水性NaH2PO4 で洗滌
し、有機相を減圧下に乾燥し、フルオロホスフアート塩
を生じる(XはF, 対イオンはN-メチルイミダゾールであ
る構造5)。生成物をピリジン中でメタノール／クロロホ
ルム混合物１％で展開されたシリカゲルクロマトグラフ
ィーによって精製し、ピリジニウム塩を生じる。乾燥
後、精製された生成物は、遊離モルホリノ窒素 (構造6)
を有する5'-保護されたサブユニットにジクロロメタン
中でDCC を用いてカップリングするのに適する。このカ
ルボジイミドカップリング反応は、構造７(XはF であ
る）として示されるダイマーを生じる。
【０１７０】フルオロホスホルアミダートインターサブ
ユニットリンケージを含有するポリマーを、強い求核試
薬、たとえばアンモニアにさらしてはならない。したが
って、この様なポリマーを集めるのに使用されるサブユ
ニットの塩基を、強い求核試薬の使用なしに切断するこ
とができる基で保護しなければならない。例１に記載し
た様にβ脱離メカニズムを介して切断できる保護基は、
この目的に適する。
ユニットリンケージを含有するポリマーを、強い求核試
薬、たとえばアンモニアにさらしてはならない。したが
って、この様なポリマーを集めるのに使用されるサブユ
ニットの塩基を、強い求核試薬の使用なしに切断するこ
とができる基で保護しなければならない。例１に記載し
た様にβ脱離メカニズムを介して切断できる保護基は、
この目的に適する。
【０１７１】Ｄ．X=N(CH3)2 例９Ｄに、例２又は３に於ける様に製造された5'ヒドロ
キシルサブユニットが遊離モルホリノ環窒素を有する第
二サブユニットにカップリングして、ホンホルアミダー
トインターサブユニットリンケージを生じることを示
す。例を、Ｘが置換された窒素である、第10図中の構造
に関連して示す。
キシルサブユニットが遊離モルホリノ環窒素を有する第
二サブユニットにカップリングして、ホンホルアミダー
トインターサブユニットリンケージを生じることを示
す。例を、Ｘが置換された窒素である、第10図中の構造
に関連して示す。
【０１７２】塩基- 保護されかつモルホリノ窒素上でト
リチレート化された (第５図の構造4)5'ヒドロキシルサ
ブユニット１mmolを、ジクロロメタン20ml中に溶解す
る。この溶液に、N-エチルモルホリン６mmol及びジメチ
ルアミノジクロロホスフアート(OP(Cl)2N(CH3)2)２mmo
l、Z=O(又はチオホスフアート同族体、Z=S)を加え、次
いでN-メチルイミダゾール0.5mmol を加える。反応の終
了後 (薄層クロマトグラフィーによって決定する）、反
応溶液を水性NaH2PO4 で洗滌する。活性化されたサブユ
ニットを、アセトン／クロロホルムで展開されたシリカ
ゲル上でクロマトグラフィー分離して単離する(XがN(CH
3)2 である第10図の構造2)。この活性化されたサブユニ
ットは、反応で生じるHCl を中和するのに十分なトリエ
チルアミンを含有するDMF 中で第二サブユニット (構造
3)のモルホリノ窒素と直接結合し、構造４として示され
たダイマーを生じる。
リチレート化された (第５図の構造4)5'ヒドロキシルサ
ブユニット１mmolを、ジクロロメタン20ml中に溶解す
る。この溶液に、N-エチルモルホリン６mmol及びジメチ
ルアミノジクロロホスフアート(OP(Cl)2N(CH3)2)２mmo
l、Z=O(又はチオホスフアート同族体、Z=S)を加え、次
いでN-メチルイミダゾール0.5mmol を加える。反応の終
了後 (薄層クロマトグラフィーによって決定する）、反
応溶液を水性NaH2PO4 で洗滌する。活性化されたサブユ
ニットを、アセトン／クロロホルムで展開されたシリカ
ゲル上でクロマトグラフィー分離して単離する(XがN(CH
3)2 である第10図の構造2)。この活性化されたサブユニ
ットは、反応で生じるHCl を中和するのに十分なトリエ
チルアミンを含有するDMF 中で第二サブユニット (構造
3)のモルホリノ窒素と直接結合し、構造４として示され
たダイマーを生じる。
【０１７３】蒸気操作で使用されるジメチルアミノジク
ロロホスフアート(Xは-N(CH3)2及びZ は酸素である）
を、次の通り製造する：オキシ塩化リン0.2 モル中にジ
メチルアミンヒドロクロライド0.1 モルを含有する懸濁
液を、12時間還流し、次いで蒸留する (沸点は0.5mmHg
で36℃である）。蒸気使用されるジメチルアミノジクロ
ロチオホスフアート(Xは-N(CH3)2、Z はイオウである）
を、次の様に製造する：チオホスホリルクロライド0.2
モル中にジメチルアミンヒドロクロチイド0.1 モルを含
有する懸濁液を、18時間還流し、次いで蒸留する (沸点
15mmHgで85℃) 。
ロロホスフアート(Xは-N(CH3)2及びZ は酸素である）
を、次の通り製造する：オキシ塩化リン0.2 モル中にジ
メチルアミンヒドロクロライド0.1 モルを含有する懸濁
液を、12時間還流し、次いで蒸留する (沸点は0.5mmHg
で36℃である）。蒸気使用されるジメチルアミノジクロ
ロチオホスフアート(Xは-N(CH3)2、Z はイオウである）
を、次の様に製造する：チオホスホリルクロライド0.2
モル中にジメチルアミンヒドロクロチイド0.1 モルを含
有する懸濁液を、18時間還流し、次いで蒸留する (沸点
15mmHgで85℃) 。
【０１７４】別の活性化及びカップリング操作は、ジク
ロロメタン20ml中でモルホリノ窒素( 第５図の構造4)上
で塩基- 保護されかつトリチレート化された5'ヒドロキ
シルサブユニット１mmolを溶解しなければならない。こ
の溶液に、N,N-ジエチルアニリン４mmol及び4-メトキシ
ピリジン-N- オキシド１mmolを加える。溶解後、ジメチ
ルアミノジクロロホスフアート２mmol、Z=O(又はジメチ
ルアミノジクロロチオホスフアート、Z=S)を加える。２
時間後、生成物(Xはジメチルアミンである第10図の構造
2)を、10％アセトン／90％クロロホルムで展開されたシ
リカゲル上でクロマトグラフィー分離によって単離す
る。この活性化されたサブユニット１mmolをN,N-ジイソ
プロピルアミノエチルイソブチラート(DIPAEIB)1.5mmol
を含有するジクロロメタン中でこれを混合して第二サブ
ユニットのモルホリノ窒素 (構造3)と直接結合させ、構
造４(Xは-N(CH3)2である）として示されるダイマーを生
じる。
ロロメタン20ml中でモルホリノ窒素( 第５図の構造4)上
で塩基- 保護されかつトリチレート化された5'ヒドロキ
シルサブユニット１mmolを溶解しなければならない。こ
の溶液に、N,N-ジエチルアニリン４mmol及び4-メトキシ
ピリジン-N- オキシド１mmolを加える。溶解後、ジメチ
ルアミノジクロロホスフアート２mmol、Z=O(又はジメチ
ルアミノジクロロチオホスフアート、Z=S)を加える。２
時間後、生成物(Xはジメチルアミンである第10図の構造
2)を、10％アセトン／90％クロロホルムで展開されたシ
リカゲル上でクロマトグラフィー分離によって単離す
る。この活性化されたサブユニット１mmolをN,N-ジイソ
プロピルアミノエチルイソブチラート(DIPAEIB)1.5mmol
を含有するジクロロメタン中でこれを混合して第二サブ
ユニットのモルホリノ窒素 (構造3)と直接結合させ、構
造４(Xは-N(CH3)2である）として示されるダイマーを生
じる。
【０１７５】例10 ホスホンエステルリンケージを生じるためのカップリン
グ この例中、例５に於ける様に製造されたメチルホスホナ
ートサブユニットを遊離のモルホリノ環窒素を有する第
二サブユニットとカップリングすることを示す。例を第
11図中の構造に関連して示す。
グ この例中、例５に於ける様に製造されたメチルホスホナ
ートサブユニットを遊離のモルホリノ環窒素を有する第
二サブユニットとカップリングすることを示す。例を第
11図中の構造に関連して示す。
【０１７６】出発材料は、例５で製造された、塩基- 保
護された、モルホリノ窒素- 保護されたメチルホスホナ
ートサブユニットである。このサブユニットのトリエチ
ルアミン塩を、クロロホルム中に懸濁し、２％ピリジニ
ウムヒドロクロライドを含有する水で振とうし、クロロ
ホルム相中にサブユニットのピリジニウム塩 (構造1)を
生じる。有機相を分離し、水洗し、次いで乾燥する。生
じる固体の１部を、過剰の3-ヒドロキシプロピオニトリ
ルと混合する；次いでDCC を混合物に加える。生じる反
応の生成物をジクロロメタン中で１％ジクロロ酢酸で脱
トリチレート化し、構造２を生じる。次いで構造１及び
２を、DCC の存在下に混合し、構造３として示された結
合されたダイマーを生じる。このダイマーを、より長い
オリゴマーブロック又はポリマーに集めるためのどちら
かの末端で選択的に脱保護する；シアノエチル基を、非
プロトン性溶剤（たとえばDMF)中でDBU と共に除去する
か又はジメトキシトリチル部分を上述の様に切断するこ
とができる。
護された、モルホリノ窒素- 保護されたメチルホスホナ
ートサブユニットである。このサブユニットのトリエチ
ルアミン塩を、クロロホルム中に懸濁し、２％ピリジニ
ウムヒドロクロライドを含有する水で振とうし、クロロ
ホルム相中にサブユニットのピリジニウム塩 (構造1)を
生じる。有機相を分離し、水洗し、次いで乾燥する。生
じる固体の１部を、過剰の3-ヒドロキシプロピオニトリ
ルと混合する；次いでDCC を混合物に加える。生じる反
応の生成物をジクロロメタン中で１％ジクロロ酢酸で脱
トリチレート化し、構造２を生じる。次いで構造１及び
２を、DCC の存在下に混合し、構造３として示された結
合されたダイマーを生じる。このダイマーを、より長い
オリゴマーブロック又はポリマーに集めるためのどちら
かの末端で選択的に脱保護する；シアノエチル基を、非
プロトン性溶剤（たとえばDMF)中でDBU と共に除去する
か又はジメトキシトリチル部分を上述の様に切断するこ
とができる。
【０１７７】例11 同時のモルホリノ環形成及びサブユニットカップリング この例中に、たとえば例７で製造された5'メチレンを介
して結合された保護されたアミンを有するリボヌクレオ
シドの酸化、及び他のサブユニットの非保護アミンにカ
ップリングして、同時にモルホリノ環構造の形成及びサ
ブユニットの結合を行うことを示す。この例中に関連す
る構造を、第12図中に示す。
して結合された保護されたアミンを有するリボヌクレオ
シドの酸化、及び他のサブユニットの非保護アミンにカ
ップリングして、同時にモルホリノ環構造の形成及びサ
ブユニットの結合を行うことを示す。この例中に関連す
る構造を、第12図中に示す。
【０１７８】アミン保護 5'メチレンを介して結合された 1o アミンを含有するリ
ボヌクレオシド (構造1)10mmolとトリチルクロライド11
mmolとを反応させて、アミン (構造2)を保護する。
ボヌクレオシド (構造1)10mmolとトリチルクロライド11
mmolとを反応させて、アミン (構造2)を保護する。
【０１７９】酸化 メタノール中で、トリチレート化されたサブユニット
(構造2)とNaIO4 11mmolとを反応させて、ジアルデヒド
(構造3)を生じる。
(構造2)とNaIO4 11mmolとを反応させて、ジアルデヒド
(構造3)を生じる。
【０１８０】カップリング カップリング溶液があまりにも酸性である場合、反応は
極めて遅く、溶液があまりにも塩基性である場合、構造
３成分のエピマー化が生じる。弱酸を使用してアミン成
分 (構造1)を中和し、反応をこのカップリング工程で緩
衝する。この目的に適すると認められる弱酸は次のもの
である：カルボン、オルト及びパラニトロフエノール、
及びベンゾトリアゾール。したがってジアルデヒド (構
造3)を、水／メタノール混合物中に構造１の適する塩と
一緒にし、結合された生成物 (構造4)を生じる。
極めて遅く、溶液があまりにも塩基性である場合、構造
３成分のエピマー化が生じる。弱酸を使用してアミン成
分 (構造1)を中和し、反応をこのカップリング工程で緩
衝する。この目的に適すると認められる弱酸は次のもの
である：カルボン、オルト及びパラニトロフエノール、
及びベンゾトリアゾール。したがってジアルデヒド (構
造3)を、水／メタノール混合物中に構造１の適する塩と
一緒にし、結合された生成物 (構造4)を生じる。
【０１８１】還元 モルホリノ閉環工程の間又はその後のどちらかにシアノ
ボロヒドリドを加え、ジヒドロキシモルホリノ環 (構造
4)を還元し、所望のモルホリノ生成物 (構造5)となす。
ボロヒドリドを加え、ジヒドロキシモルホリノ環 (構造
4)を還元し、所望のモルホリノ生成物 (構造5)となす。
【０１８２】例12 構造確認を有する簡単なプロトタイプモルホリノポリマ
ーの溶液- 相集合、脱保護、精製、及びターゲットRNA
配列へのその結合の評価 この例に、簡単なホスホルジアミダート- 結合されたモ
ルホリノポリマーのターゲット結合親和性の製造、構造
確認及び評価を示す。
ーの溶液- 相集合、脱保護、精製、及びターゲットRNA
配列へのその結合の評価 この例に、簡単なホスホルジアミダート- 結合されたモ
ルホリノポリマーのターゲット結合親和性の製造、構造
確認及び評価を示す。
【０１８３】すべてのPi部分がチトシンであるモルホリ
ノヘキサマーを、例９Ｄ中に於ける様に製造されたダイ
マーから集める。このダイマー調製物の1/3 を、２％酢
酸を含有するトリフルオロエタノール(TFE) で脱トリチ
レート化する；次いでTFE を減圧で除く。残渣をエーテ
ル洗滌し、すべて残存する酢酸を除く。ダイマー調製物
の残存する2/3 を活性化する (例９Ｄに於ける様に) 。
活性化されたダイマーの半分と脱トリチレート化ダイマ
ーとを反応させ、６％メタノール／94％クロロホルムで
展開されたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製
されたテトラマー生成物を生じる。テトラマーを脱トリ
チル化し、残存する活性化ダイマーと反応させ、10％メ
タノール／90％クロロホルムで展開されたシリカゲルク
ロマトグラフィーによって精製されたヘキサマー生成物
を生じる。
ノヘキサマーを、例９Ｄ中に於ける様に製造されたダイ
マーから集める。このダイマー調製物の1/3 を、２％酢
酸を含有するトリフルオロエタノール(TFE) で脱トリチ
レート化する；次いでTFE を減圧で除く。残渣をエーテ
ル洗滌し、すべて残存する酢酸を除く。ダイマー調製物
の残存する2/3 を活性化する (例９Ｄに於ける様に) 。
活性化されたダイマーの半分と脱トリチレート化ダイマ
ーとを反応させ、６％メタノール／94％クロロホルムで
展開されたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製
されたテトラマー生成物を生じる。テトラマーを脱トリ
チル化し、残存する活性化ダイマーと反応させ、10％メ
タノール／90％クロロホルムで展開されたシリカゲルク
ロマトグラフィーによって精製されたヘキサマー生成物
を生じる。
【０１８４】モルホリノ窒素上にトリチル部分を有する
ホスホルジアミダート- 結合5'OH、塩基- 保護されたヘ
キサマーは、pd(mC)6-トリチルを示す。負イオン高速原
子衝撃質量分析 (3-ニトロベンジルアルコールマトリッ
クス) は、次の値を示す：M-1=2667。9(100)。
ホスホルジアミダート- 結合5'OH、塩基- 保護されたヘ
キサマーは、pd(mC)6-トリチルを示す。負イオン高速原
子衝撃質量分析 (3-ニトロベンジルアルコールマトリッ
クス) は、次の値を示す：M-1=2667。9(100)。
【０１８５】次いでこのPd(mC)6-トリチルポリマーを、
上述の様に脱トリチレート化し、次いで塩基脱保護す
る。
上述の様に脱トリチレート化し、次いで塩基脱保護す
る。
【０１８６】可溶化基をモルホリノポリマーに加えるこ
とを望む場合、このことは次の様に好都合に行うことが
できる。N-末端モルホリノ窒素を、トリフルオロエタノ
ール中で２％酢酸を用いて脱トリチラレート化する。ポ
リエチレングリコール1000(ポリサイエンス社、ウェリ
ントン、ペンシルバニア、米国) を、乾燥DMF 中に溶解
して、次いで溶剤を減圧下に蒸発して十分に乾燥する。
固体を、純粋な乾燥DMF の最小容量及び0.5 モル当量(P
EG1000に対して) のビス (p-ニトロフエニル) カーボナ
ート中に懸濁し、TEA 1 モル当量を加える。調製物を、
封入し、一晩30℃で温置し、p-ニトロフエニルカーボナ
ート- 活性化されたPEG 1000を生じる。
とを望む場合、このことは次の様に好都合に行うことが
できる。N-末端モルホリノ窒素を、トリフルオロエタノ
ール中で２％酢酸を用いて脱トリチラレート化する。ポ
リエチレングリコール1000(ポリサイエンス社、ウェリ
ントン、ペンシルバニア、米国) を、乾燥DMF 中に溶解
して、次いで溶剤を減圧下に蒸発して十分に乾燥する。
固体を、純粋な乾燥DMF の最小容量及び0.5 モル当量(P
EG1000に対して) のビス (p-ニトロフエニル) カーボナ
ート中に懸濁し、TEA 1 モル当量を加える。調製物を、
封入し、一晩30℃で温置し、p-ニトロフエニルカーボナ
ート- 活性化されたPEG 1000を生じる。
【０１８７】脱トリチレート化された完全- 長さモルホ
リノポリマーを、実質上モル過剰の(一般に10ないし20
倍) に加え、次いで２時間、室温で温置する。次いで全
調製物を、一晩30℃で濃水酸化アンモニウムで処理す
る。次いでアンモニアを減圧下に除去する。精製をカチ
オン交換クロマトグラフィーによって行い、次いで水洗
され、、次にメタノールで溶離されたポリプロピレンの
カラムで脱塩して行う。
リノポリマーを、実質上モル過剰の(一般に10ないし20
倍) に加え、次いで２時間、室温で温置する。次いで全
調製物を、一晩30℃で濃水酸化アンモニウムで処理す
る。次いでアンモニアを減圧下に除去する。精製をカチ
オン交換クロマトグラフィーによって行い、次いで水洗
され、、次にメタノールで溶離されたポリプロピレンの
カラムで脱塩して行う。
【０１８８】この精製された、末端につながれたヘキサ
マー、Pd(mC)6-PEG 1000は、算出されたモル吸光度42,8
00を有する中性水性溶液中で267.1nm で吸収最大を示
す。pH1 で水性溶液中、同一材料は、算出されたモル吸
光度77,100で、吸収最大275.7nmを示す。
マー、Pd(mC)6-PEG 1000は、算出されたモル吸光度42,8
00を有する中性水性溶液中で267.1nm で吸収最大を示
す。pH1 で水性溶液中、同一材料は、算出されたモル吸
光度77,100で、吸収最大275.7nmを示す。
【０１８９】pd(mC)6PEG-1000 ポリマーのターゲット-
結合親和性を評価するために、ポリG RNA(シグマ化学社
から得られる) １mgを脱イオン水中に溶解し、DMSO４容
量 (アルトリック化学社の分光光度合) を加える (スト
ック溶液A)。末端につながれたモルホリノヘキサマー、
pd(mC6)-PEG 1000、を分光光度合DMSO中に溶解する(ス
トック溶液B)。ホスフアート緩衝液を、リン酸を用いて
0.05NaOHのpHを7.4に調整して調製する (緩衝液C)。
結合親和性を評価するために、ポリG RNA(シグマ化学社
から得られる) １mgを脱イオン水中に溶解し、DMSO４容
量 (アルトリック化学社の分光光度合) を加える (スト
ック溶液A)。末端につながれたモルホリノヘキサマー、
pd(mC6)-PEG 1000、を分光光度合DMSO中に溶解する(ス
トック溶液B)。ホスフアート緩衝液を、リン酸を用いて
0.05NaOHのpHを7.4に調整して調製する (緩衝液C)。
【０１９０】ストック溶液Ａ及びＢを、UVによってポリ
マーの実際濃度に関して検定する；ストック溶液Ａの吸
光度を0.1N NaOH 中で測定し、ストック溶液Ｂを0.1N H
Cl中で測定する。このpH高度での測定は、成分モノマー
に比例することなく吸光度値を生じることができる塩基
積み重ね及び他のポリマーの相互作用を最小化する。ス
トック溶液Ａ及びＢを緩衝液Ｃで希釈し、ポリマー中に
10マイクロモルの最終濃度を有する溶液を生じる。要求
された希釈を溶液Ａ、ポリ(G) に対して6,500及び溶液
Ｂ、pd(mC)6-PEG 1000に対して77,100のモル吸光度を用
いて算出する。
マーの実際濃度に関して検定する；ストック溶液Ａの吸
光度を0.1N NaOH 中で測定し、ストック溶液Ｂを0.1N H
Cl中で測定する。このpH高度での測定は、成分モノマー
に比例することなく吸光度値を生じることができる塩基
積み重ね及び他のポリマーの相互作用を最小化する。ス
トック溶液Ａ及びＢを緩衝液Ｃで希釈し、ポリマー中に
10マイクロモルの最終濃度を有する溶液を生じる。要求
された希釈を溶液Ａ、ポリ(G) に対して6,500及び溶液
Ｂ、pd(mC)6-PEG 1000に対して77,100のモル吸光度を用
いて算出する。
【０１９１】ターゲット結合親和性の評価を、参考ビー
ム中に細胞２個及びサンプルビーム中に２個に適する温
度- 制御されたセルハウジングを有する複先束走査スペ
クトロフォトメーター中で実施する。
ム中に細胞２個及びサンプルビーム中に２個に適する温
度- 制御されたセルハウジングを有する複先束走査スペ
クトロフォトメーター中で実施する。
【０１９２】４つの組合せられた石英セルを用いて、１
つにＧモノマーに対してポリ(G)0.5ml、60マイクロモル
及び緩衝液Ｃ 0.5mlを充填し、第二番目に10マイクロモ
ノマーpd(mC)6-PEG 1000 0.5ml及び緩衝液Ｃ 0.5mlを充
填する。この２つのセルを、温度- 制御されたセルハウ
ジングの参考ビーム中に置く。次いで、第三セルに緩衝
液Ｃ１mlを充填し、第四番目にＧモノマーに対するポリ
(G)0.5ml、60マイクロモル及び10マイクロモルpd(mC)6-
PEG 1000 0.5mlを充填する。この２つのセルをセルハウ
ジングのサンプルビーム中に置く。次いでセルハウジン
グを50℃に加熱し、14℃に徐々に冷やし、第四セル中で
ポリマーとそのターゲットポリヌクレオチドの間に完全
な対を確かめる。次いで走査を320nm から240nm で測定
するこれはポリマー- ターゲット混合物中で淡色シフト
に基づいて実質上の吸光度差を示し、約273nm を中心に
おく。次いでセルホルダーの温度を２度増加して72℃に
上げ、その際夫々２度上昇後に測定する。
つにＧモノマーに対してポリ(G)0.5ml、60マイクロモル
及び緩衝液Ｃ 0.5mlを充填し、第二番目に10マイクロモ
ノマーpd(mC)6-PEG 1000 0.5ml及び緩衝液Ｃ 0.5mlを充
填する。この２つのセルを、温度- 制御されたセルハウ
ジングの参考ビーム中に置く。次いで、第三セルに緩衝
液Ｃ１mlを充填し、第四番目にＧモノマーに対するポリ
(G)0.5ml、60マイクロモル及び10マイクロモルpd(mC)6-
PEG 1000 0.5mlを充填する。この２つのセルをセルハウ
ジングのサンプルビーム中に置く。次いでセルハウジン
グを50℃に加熱し、14℃に徐々に冷やし、第四セル中で
ポリマーとそのターゲットポリヌクレオチドの間に完全
な対を確かめる。次いで走査を320nm から240nm で測定
するこれはポリマー- ターゲット混合物中で淡色シフト
に基づいて実質上の吸光度差を示し、約273nm を中心に
おく。次いでセルホルダーの温度を２度増加して72℃に
上げ、その際夫々２度上昇後に測定する。
【０１９３】モルホリノポリマー／RNA 複合体に対する
温度の関数として吸光度差のプロットを第13図中に示
す。複合体を半分熔融する熔融温度、Tmをこのモルホリ
ノポリマー／RNA に対して51.5℃であることを示す。
温度の関数として吸光度差のプロットを第13図中に示
す。複合体を半分熔融する熔融温度、Tmをこのモルホリ
ノポリマー／RNA に対して51.5℃であることを示す。
【０１９４】例13 配列5'-CGCCAのホスホルジアミダート- 結合オリゴマー
の溶液- 相製造 この例に、ホスホルジアミダート- 結合骨格を有する短
いオリゴマーの集合を示す(XはN(CH3)2 、Y は酸素、Z
は酸素である第４図の構造B-B)。この溶液集合方は、例
14及び15に於ける様に、より長いオリゴマーへの次の集
合に適する短いオリゴマーの大きい- 規模の合成に有用
である。
の溶液- 相製造 この例に、ホスホルジアミダート- 結合骨格を有する短
いオリゴマーの集合を示す(XはN(CH3)2 、Y は酸素、Z
は酸素である第４図の構造B-B)。この溶液集合方は、例
14及び15に於ける様に、より長いオリゴマーへの次の集
合に適する短いオリゴマーの大きい- 規模の合成に有用
である。
【０１９５】Ａ．ブロックの5'末端で使用するためのモ
ノマーの製造 モルホリノ環窒素上にトリチル部分を含有しかつ5'メチ
レン上にメチルアミンを有するモルホリノＣサブユニッ
ト (例６に於ける様に製造) とアルドリッチ化学社、ミ
ルウォーキー、ウィスコンシン、米国のN-(9- フルオレ
ニルメトキシカルボニルオキシ) サクシンイミド(FMOC)
とを反応させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって
精製する。
ノマーの製造 モルホリノ環窒素上にトリチル部分を含有しかつ5'メチ
レン上にメチルアミンを有するモルホリノＣサブユニッ
ト (例６に於ける様に製造) とアルドリッチ化学社、ミ
ルウォーキー、ウィスコンシン、米国のN-(9- フルオレ
ニルメトキシカルボニルオキシ) サクシンイミド(FMOC)
とを反応させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって
精製する。
【０１９６】Ｂ．脱トリチル化 分液漏斗に、上記Ａ欄で製造されたFMOC- 誘導されたＣ
サブユニット１mmol、ジクロロメタン、トリフルオロエ
タノール２ml、及びシアノ酢酸0.4gを加える。10分後、
この溶液を水性NaHCO3で分配する。有機相を、回転- 蒸
発器で除く。残存する材料にアセトニトリル20mlを加
え、アセトニトリルを回転- 蒸発乾固で除去する。残存
する材料を、１時間減圧下に乾燥する。
サブユニット１mmol、ジクロロメタン、トリフルオロエ
タノール２ml、及びシアノ酢酸0.4gを加える。10分後、
この溶液を水性NaHCO3で分配する。有機相を、回転- 蒸
発器で除く。残存する材料にアセトニトリル20mlを加
え、アセトニトリルを回転- 蒸発乾固で除去する。残存
する材料を、１時間減圧下に乾燥する。
【０１９７】Ｃ．他のモノマーの活性化 モルホリノ環窒素上でトリチレート化されたＡ、Ｃ、及
びＧの5'OHモルホリノサブユニットを、例２に於ける様
に製造する。Ａ、Ｃ、及びＧサブユニットを、例９Ｄに
於ける様にモノクロロホスホルアミダードに変換して活
性化する。
びＧの5'OHモルホリノサブユニットを、例２に於ける様
に製造する。Ａ、Ｃ、及びＧサブユニットを、例９Ｄに
於ける様にモノクロロホスホルアミダードに変換して活
性化する。
【０１９８】Ｄ．第一カップリング 上記Ｂ欄からの脱トリチレート化されたFMOC- 誘導され
たＣサブユニットをカップリング溶液 (ジクロロメタン
４ml、テトラメチレンスルホン２ml及びDIPAEIB 0.3ml
(例９に於ける様に製造) ）中に懸濁する。この溶液に
上記Ｃ欄で製造された、活性化されたＧサブユニット１
mmolを加える。30分後、室温でジクロロメタンを減圧下
に除き、生成物を水の添加によって沈殿する。5'FMOC-C
G-トリチルダイマーを、５％メタノール／95％クロロホ
ルムで展開されたシリカゲル上でクロマトグラフィーに
よって精製する。
たＣサブユニットをカップリング溶液 (ジクロロメタン
４ml、テトラメチレンスルホン２ml及びDIPAEIB 0.3ml
(例９に於ける様に製造) ）中に懸濁する。この溶液に
上記Ｃ欄で製造された、活性化されたＧサブユニット１
mmolを加える。30分後、室温でジクロロメタンを減圧下
に除き、生成物を水の添加によって沈殿する。5'FMOC-C
G-トリチルダイマーを、５％メタノール／95％クロロホ
ルムで展開されたシリカゲル上でクロマトグラフィーに
よって精製する。
【０１９９】Ｅ．次のカップリング FMOC-CG-トリチル生成物を、上記Ｂ欄に於ける様に脱-
トリチレート化し、上記Ｃ欄からの活性化されたＣサブ
ユニット１mmolと結合する。このカップリングサイクル
を、残存するＣ及びＡサブユニットを加えてくり返し
て、所望のブロックを生じる：5'FMOC-CGCCA- トリチ
ル。ポリマーの長さが増加するので、精製工程は、生長
するブロックのシリカゲルクロマトグラフィー精製中で
メタノールの増加濃度を要求する。
トリチレート化し、上記Ｃ欄からの活性化されたＣサブ
ユニット１mmolと結合する。このカップリングサイクル
を、残存するＣ及びＡサブユニットを加えてくり返し
て、所望のブロックを生じる：5'FMOC-CGCCA- トリチ
ル。ポリマーの長さが増加するので、精製工程は、生長
するブロックのシリカゲルクロマトグラフィー精製中で
メタノールの増加濃度を要求する。
【０２００】Ｆ．構造確認 このペンタマーブロックの構造を、NMR 及び負イオン高
速原子衝撃質量分析で最も容易に確認する。原則として
質量分析中で優性種は分子イオンである。
速原子衝撃質量分析で最も容易に確認する。原則として
質量分析中で優性種は分子イオンである。
【０２０１】例14 HIV-I の第一結合部位を目標とするモルホリノポリマー
の溶液- 相ブロック集合 この例に、例13に於ける様に製造されたオリゴマーブロ
ックの使用を、ホスホルジアミダートインターサブユニ
ットリンケージを含有するモルホリノポリマーの溶液-
相集合に関して記載する。モノマーの代りに短いオリゴ
マーブロックの使用は、失敗配列から最終生成物を分離
することを著しく簡易化する。この例中に合成されたモ
ルホリノポリマーは、HIV-I(マイヤー等) の第一結合部位に
相補的な塩基配列を有する。
の溶液- 相ブロック集合 この例に、例13に於ける様に製造されたオリゴマーブロ
ックの使用を、ホスホルジアミダートインターサブユニ
ットリンケージを含有するモルホリノポリマーの溶液-
相集合に関して記載する。モノマーの代りに短いオリゴ
マーブロックの使用は、失敗配列から最終生成物を分離
することを著しく簡易化する。この例中に合成されたモ
ルホリノポリマーは、HIV-I(マイヤー等) の第一結合部位に
相補的な塩基配列を有する。
【０２０２】Ａ．短いオリゴマーブロックの合成 次のオリゴマーを例13の様に合成する：5'FMOC-GUU- ト
リチル (ブロック1); 5'FMOC-CGGG-トリチル (ブロック
2); 5'FMOC-CGCCA- トリチル (ブロック3); 5'FMOC-CUG
C-トリチル (ブロック4)。
リチル (ブロック1); 5'FMOC-CGGG-トリチル (ブロック
2); 5'FMOC-CGCCA- トリチル (ブロック3); 5'FMOC-CUG
C-トリチル (ブロック4)。
【０２０３】Ｂ．FMOC部分の切断 ブロック４の１ミリモルをDMF 20ml中に懸濁し、DBU(1,
8-ジアザビシク〔5.4.0 〕ウンデセ-7- エン)0.4mlを加
える。20分後、エーテル200ml を加え、溶液を十分に撹
拌し、濾過する。濾液をジクロロメタン20ml中に再懸濁
し、４個の30ml遠心分離管に分配し、夫々にエーテル25
mlを加え、振とうして十分に混合し、遠心分離する。上
澄みを排出し、ペレットを減圧下に乾燥する。
8-ジアザビシク〔5.4.0 〕ウンデセ-7- エン)0.4mlを加
える。20分後、エーテル200ml を加え、溶液を十分に撹
拌し、濾過する。濾液をジクロロメタン20ml中に再懸濁
し、４個の30ml遠心分離管に分配し、夫々にエーテル25
mlを加え、振とうして十分に混合し、遠心分離する。上
澄みを排出し、ペレットを減圧下に乾燥する。
【０２０４】Ｃ．脱トリチル化及び活性化 次いで例13、第Ｂ欄、の様にブロック３ 1mmolを脱- ト
リチル化する。減圧下に溶剤の除去後、残存する材料を
ジクロロメタン20m;中に懸濁し、次いでDIPAEIB(例９中
に於ける様に製造)1.5mlを添加する。急速に撹拌しなが
ら、エチルジクロロホスフアート0.5ml を加える。５分
後、この溶液を 4−30ml遠心分離管に分配する。各管に
エーテルを充填し、十分に振とうし、遠心分離する。ペ
レットをジクロロメタンの最小容量中に懸濁し、次いで
エーテルを加える。次いで管を振とうして、遠心分離す
る。この洗滌操作をもう一度くり返す。ペレットをカッ
プリング溶液 (ジクロロメタン10ml、テトラメチレンス
ルホン５ml、及びDIPAEIB0.3ml(例９に於ける様に製
造))中に懸濁する。
リチル化する。減圧下に溶剤の除去後、残存する材料を
ジクロロメタン20m;中に懸濁し、次いでDIPAEIB(例９中
に於ける様に製造)1.5mlを添加する。急速に撹拌しなが
ら、エチルジクロロホスフアート0.5ml を加える。５分
後、この溶液を 4−30ml遠心分離管に分配する。各管に
エーテルを充填し、十分に振とうし、遠心分離する。ペ
レットをジクロロメタンの最小容量中に懸濁し、次いで
エーテルを加える。次いで管を振とうして、遠心分離す
る。この洗滌操作をもう一度くり返す。ペレットをカッ
プリング溶液 (ジクロロメタン10ml、テトラメチレンス
ルホン５ml、及びDIPAEIB0.3ml(例９に於ける様に製
造))中に懸濁する。
【０２０５】Ｄ．カップリング 活性化されたブロック３の溶液を、FMOC基を切断するブ
ロック４に加える。１時間後、無水酢酸0.5ml を加え、
溶液を５分間室温で放置する。ジクロロメタンを、減圧
下に除去する。生成物、5'FMOC-CGCCACUGC- トリチルを
沈殿するために、水を加える。減圧下に固体を乾燥した
後、すべての残存する無水酢酸を十分に除くために、ジ
クロロメタン中に再懸濁する。次いでエーテルを加え
て、生成物を沈殿させる。生成物をもう一度ジクロロメ
タン中に再懸濁し、エーテルで再沈殿する。
ロック４に加える。１時間後、無水酢酸0.5ml を加え、
溶液を５分間室温で放置する。ジクロロメタンを、減圧
下に除去する。生成物、5'FMOC-CGCCACUGC- トリチルを
沈殿するために、水を加える。減圧下に固体を乾燥した
後、すべての残存する無水酢酸を十分に除くために、ジ
クロロメタン中に再懸濁する。次いでエーテルを加え
て、生成物を沈殿させる。生成物をもう一度ジクロロメ
タン中に再懸濁し、エーテルで再沈殿する。
【０２０６】FMOC部分を、上記Ｂ欄の様にこの9-mer 生
成物から除く。ブロック２を脱トリチレート化し、上記
Ｃ欄に於ける様に活性化する。この２つの成分を、上述
の様に結合し、13-mer：5'FMOC-CGGGCGCCACUGC- トリチ
ルを生じる。
成物から除く。ブロック２を脱トリチレート化し、上記
Ｃ欄に於ける様に活性化する。この２つの成分を、上述
の様に結合し、13-mer：5'FMOC-CGGGCGCCACUGC- トリチ
ルを生じる。
【０２０７】FMOC部分を、上記Ｂ欄に於ける様にこの13
-mer生成物から切断する。ブロック１を脱トリチレート
化し、上記Ｃ欄に於ける様に活性化する。この２つの成
分を上述の様に結合し、16-mer：5'FMOC-GUOCGGGCGCCAC
UGC-トリチルを生じる。
-mer生成物から切断する。ブロック１を脱トリチレート
化し、上記Ｃ欄に於ける様に活性化する。この２つの成
分を上述の様に結合し、16-mer：5'FMOC-GUOCGGGCGCCAC
UGC-トリチルを生じる。
【０２０８】Ｅ．脱保護 FMOC及びトリチル部分を上述の様に除去し、生成物をDM
F20ml 中に懸濁し、水酸化アンモニウム20mlを加える。
調製物にふたをし、30℃で18時間温置する。その後、溶
剤を回転- 蒸発によって除去し16-mer：5'GUUCGGGCGCCA
CUGCの粗製調製物を生じる。
F20ml 中に懸濁し、水酸化アンモニウム20mlを加える。
調製物にふたをし、30℃で18時間温置する。その後、溶
剤を回転- 蒸発によって除去し16-mer：5'GUUCGGGCGCCA
CUGCの粗製調製物を生じる。
【０２０９】Ｆ．精製 16mer-調製物を、、HCl でpH10.5に調整された0.05N 水
性メチルアミン (溶剤A)中に2mg/mlの濃度で懸濁する。
クロマトグラフィーに使用されうる水を、吸引減圧下に
脱気し、メチルアミンを加え、最終メチルアミン濃度0.
05N を生じる。この溶液にHCl を加え、pHを10.5に調整
する。対応するpH10.5溶液をKCl 中で1Nにする (溶剤
B)。溶剤Ａを、クロマトグラフィー品質のアセトニトリ
ル又はメタノールと１：１容量で混合し、溶剤Ｃを生じ
る。
性メチルアミン (溶剤A)中に2mg/mlの濃度で懸濁する。
クロマトグラフィーに使用されうる水を、吸引減圧下に
脱気し、メチルアミンを加え、最終メチルアミン濃度0.
05N を生じる。この溶液にHCl を加え、pHを10.5に調整
する。対応するpH10.5溶液をKCl 中で1Nにする (溶剤
B)。溶剤Ａを、クロマトグラフィー品質のアセトニトリ
ル又はメタノールと１：１容量で混合し、溶剤Ｃを生じ
る。
【０２１０】ポリマー100mg までを、アニオン- 交換体
担体Q-セフアロースフアーストフロー (フアルマシア)
で充填されたクロマトグラフィーカラム (直径5cm 及び
長さ15cm) 上に溶剤Ａ50ml中に詰める。カラムを溶剤Ａ
で十分に洗滌し、約30ml／分の流速を用いて30分かけて
100％溶剤Ａから 100％溶剤Ｂの範囲にある線勾配で溶
離する。溶出液を254nm で追跡する。この例の16-merを
約0.3N KClで溶離して見い出す。所望の結合ポリマー
は、一般にカラムから溶離ための最後かつ最も大きいピ
ークである。ホリマーをブロック集合で製造した場合、
ベースライン分離をしばしば行う。一般にピーク形は非
対称であり、問題はむしろクロマトグラフィー充填剤の
容積不足よりも結合ポリマーの不溶性にある。この様な
問題を、しばしば一定の流出で充填された結合ポリマー
の量を減少することによって解決することができる。ピ
ークが対称的であるが、ベース・ライン分離が行われな
い場合、改良がより浅い勾配を用いて溶離することによ
って通常得ることができる。
担体Q-セフアロースフアーストフロー (フアルマシア)
で充填されたクロマトグラフィーカラム (直径5cm 及び
長さ15cm) 上に溶剤Ａ50ml中に詰める。カラムを溶剤Ａ
で十分に洗滌し、約30ml／分の流速を用いて30分かけて
100％溶剤Ａから 100％溶剤Ｂの範囲にある線勾配で溶
離する。溶出液を254nm で追跡する。この例の16-merを
約0.3N KClで溶離して見い出す。所望の結合ポリマー
は、一般にカラムから溶離ための最後かつ最も大きいピ
ークである。ホリマーをブロック集合で製造した場合、
ベースライン分離をしばしば行う。一般にピーク形は非
対称であり、問題はむしろクロマトグラフィー充填剤の
容積不足よりも結合ポリマーの不溶性にある。この様な
問題を、しばしば一定の流出で充填された結合ポリマー
の量を減少することによって解決することができる。ピ
ークが対称的であるが、ベース・ライン分離が行われな
い場合、改良がより浅い勾配を用いて溶離することによ
って通常得ることができる。
【０２１１】更にポリマーを含有する溶出液を精製し、
35ミクロンクロマトグラフィー品質ポリプロピレン (ポ
リサイエンス社からのCat. no. 4342)で充填された等価
- 大きさのカラムに詰めて脱塩する。カラムを十分に溶
剤Ａで洗滌する。ベースライン分離を、上記カチオン交
換体クロマトグラフィー中で行い、次いで純粋な精製物
が、溶剤Ｃで溶離して得られる。しかしもしベースライ
ン分離が行われない場合、生成物を 100％溶剤Ａから 1
00％溶剤Ｃの範囲にある線状勾配で溶離する。この例中
16-merが溶離されるのが分る。その時アセトニトリルの
濃度は、約25容量％である。
35ミクロンクロマトグラフィー品質ポリプロピレン (ポ
リサイエンス社からのCat. no. 4342)で充填された等価
- 大きさのカラムに詰めて脱塩する。カラムを十分に溶
剤Ａで洗滌する。ベースライン分離を、上記カチオン交
換体クロマトグラフィー中で行い、次いで純粋な精製物
が、溶剤Ｃで溶離して得られる。しかしもしベースライ
ン分離が行われない場合、生成物を 100％溶剤Ａから 1
00％溶剤Ｃの範囲にある線状勾配で溶離する。この例中
16-merが溶離されるのが分る。その時アセトニトリルの
濃度は、約25容量％である。
【０２１２】Ｇ．配列確認 前述の様に、完全に保護された状態で完全- 長さのポリ
マーの質量分析は、ポリマーの長さ及び塩基組成ともに
確認することに役立つことができる。しかしサブユニッ
ト配列については何らの情報を提供しない。配列情報を
得るための１つの方法は、デオキシリボ核酸とカルバマ
ート- 結合されたデオキシリボ核酸- 誘導ポリマー(ク゛ラ
フイン等) からである。しかし、完全に保護された状態
で、本発明の多くのモルホリノ- 基体ポリマーはブラグ
メンテーションに耐え、最小フラグメントしか有しない
分子イオンを主に生じる。
マーの質量分析は、ポリマーの長さ及び塩基組成ともに
確認することに役立つことができる。しかしサブユニッ
ト配列については何らの情報を提供しない。配列情報を
得るための１つの方法は、デオキシリボ核酸とカルバマ
ート- 結合されたデオキシリボ核酸- 誘導ポリマー(ク゛ラ
フイン等) からである。しかし、完全に保護された状態
で、本発明の多くのモルホリノ- 基体ポリマーはブラグ
メンテーションに耐え、最小フラグメントしか有しない
分子イオンを主に生じる。
【０２１３】モルホリノ- 基体ポリマーの配列を確認す
るための他の方法は、核オリゴマーブロックを結合後生
長するポリマーの小さい部分を取り出し、質量分析を使
用して、ポリマーの伸長を追跡することができる。この
方法は、合成で使用される２つのブロックが正確に同一
質量を偶然有するまれな場合を除いて適用することがで
きる。
るための他の方法は、核オリゴマーブロックを結合後生
長するポリマーの小さい部分を取り出し、質量分析を使
用して、ポリマーの伸長を追跡することができる。この
方法は、合成で使用される２つのブロックが正確に同一
質量を偶然有するまれな場合を除いて適用することがで
きる。
【０２１４】ポリマーサブユニット配列の修正を確認す
るのを助ける、好ましい、しかも間接的な方法は、モル
ホリノポリマーをその相補的DNA(この配列は確立された
方法で確認することができる）とブロックが間違った順
序で集められた場合生じうるであろうDNA 配列で１対に
しなければならない。ポリマーとDNA とのペアリング
を、240 ないし290nm 波長域で淡色シフトに関して査定
して、評価する (例12に於ける様に評価) 。この様なシ
フトは、ポリマーとその相補的配列の間しか生じない。
ポリマー／DNA 二重体を、徐々に温度を上げることによ
ってすべての部分的に- くいちがう二重体と区別するこ
ともできる。その間240nm ないし290nm 域中で吸光度を
追跡する。完全な二重体は、一般にすべてのくいちがう
二重体の熔融温度よりも10度又はそれ以上の熔融温度
(ハイポクロミシチィー（hypochromicity) で50％減少
に相当) を有する。
るのを助ける、好ましい、しかも間接的な方法は、モル
ホリノポリマーをその相補的DNA(この配列は確立された
方法で確認することができる）とブロックが間違った順
序で集められた場合生じうるであろうDNA 配列で１対に
しなければならない。ポリマーとDNA とのペアリング
を、240 ないし290nm 波長域で淡色シフトに関して査定
して、評価する (例12に於ける様に評価) 。この様なシ
フトは、ポリマーとその相補的配列の間しか生じない。
ポリマー／DNA 二重体を、徐々に温度を上げることによ
ってすべての部分的に- くいちがう二重体と区別するこ
ともできる。その間240nm ないし290nm 域中で吸光度を
追跡する。完全な二重体は、一般にすべてのくいちがう
二重体の熔融温度よりも10度又はそれ以上の熔融温度
(ハイポクロミシチィー（hypochromicity) で50％減少
に相当) を有する。
【０２１５】Ｈ．ターゲット結合親和性の評価 その相補的DNA と１対にされた、この例の16-merは、鎖
が非平行である時DNAを結合し、鎖が平行である時結合
しないのが分る (下記に示すように）。
が非平行である時DNAを結合し、鎖が平行である時結合
しないのが分る (下記に示すように）。
【０２１６】 結合：モルホリノポリマー：5'-GUUCGGGCGCCACUGC ターゲット DNA：3'-CAAGCCCGCGGTGACG-5' 非結合：モルホリノポリマー：5'-GUUCGGGCGCCACUGC ターゲット DNA：5'-CAAGCCCGCGGTGACG-3' 非- 平行結合鎖分子は、３マイクロモルの濃度で各鎖が
存在する場合、63℃のTm (例12中に記載された様に測
定) を有することが分る。
存在する場合、63℃のTm (例12中に記載された様に測
定) を有することが分る。
【０２１７】Ｉ．生物学的活性の評価 この例の16mer を、HIV-I----AIDS ウイルスで感染され
たヒト細胞中でウイルス性P24 プロテインの合成を阻害
するその能力についてテストする。予備の結果は、HIV-
I のプライマー結合部位に相補的である、この例の16-m
erポリマーを 6マイクロモルの濃度でHIV-I-感染された
細胞に加えた場合、ポリマーはウイルス性P24 プロテイ
ンの合成で35％減少を生じることを示す。更にポリマー
は非感染の細胞中で全く検出可能な細胞毒性を16及び19
マイクロモルの濃度で生じない。
たヒト細胞中でウイルス性P24 プロテインの合成を阻害
するその能力についてテストする。予備の結果は、HIV-
I のプライマー結合部位に相補的である、この例の16-m
erポリマーを 6マイクロモルの濃度でHIV-I-感染された
細胞に加えた場合、ポリマーはウイルス性P24 プロテイ
ンの合成で35％減少を生じることを示す。更にポリマー
は非感染の細胞中で全く検出可能な細胞毒性を16及び19
マイクロモルの濃度で生じない。
【０２１８】例15 HIV-I のプライマー結合部位を目標とするモルホリノポ
リマーの固- 相ブロック集合 この例に、例13に於ける様に製造されたオリゴマーブロ
ックの使用を、ホスホルジアミダートインターサブユニ
ットリンケージを含有するモルホリノポリマーの固- 相
集合に関して示す。固- 相集合は、より長い結合ポリマ
ーの急速集合方を提供する。モノマーの代りに短いオリ
ゴマーブロックの使用は、失敗配列からの最終生成物の
分離を著しく簡易化する。
リマーの固- 相ブロック集合 この例に、例13に於ける様に製造されたオリゴマーブロ
ックの使用を、ホスホルジアミダートインターサブユニ
ットリンケージを含有するモルホリノポリマーの固- 相
集合に関して示す。固- 相集合は、より長い結合ポリマ
ーの急速集合方を提供する。モノマーの代りに短いオリ
ゴマーブロックの使用は、失敗配列からの最終生成物の
分離を著しく簡易化する。
【０２１９】Ａ．固体担体への切断しうるリンカーの結
合 ビス〔2- (サクシンイミドオキシカルボニルオキシ)-エ
チル〕スルホン1mmol(ピアース化学社、ロックホード、
イリノイ、米国) を、DMF 10ml中に溶解し、第一アミン
官能基を有する適当な固体担体3gに加える：たとえばガ
ラス、アミノプロピル、カタログ＃Ｇ4643、シグマ化学
社、セントルイス、ミズリー、米国--500 オングストロ
ーム細孔の大きさ、200-400 メッシュ、アミン含有量81
マイクロモル/g。２時間後、ガラスビーズのスラリーを
カラム (好ましくは直径約1.5cm) に注ぎ入れ、カラム
を十分にジクロロメタンで洗浄し、減圧で乾燥する。ガ
ラス担体に結合したこのリンカーは、脱トリチレート化
に使用された酸性条件に安定であるが、強い非- 求核塩
基、たとえば1,8-ジアザビシクロ〔5.4.0 〕ウンデセ-7
- エン(DBU) を用いてベータ脱離メカニズムによって速
やかに切断することができる。
合 ビス〔2- (サクシンイミドオキシカルボニルオキシ)-エ
チル〕スルホン1mmol(ピアース化学社、ロックホード、
イリノイ、米国) を、DMF 10ml中に溶解し、第一アミン
官能基を有する適当な固体担体3gに加える：たとえばガ
ラス、アミノプロピル、カタログ＃Ｇ4643、シグマ化学
社、セントルイス、ミズリー、米国--500 オングストロ
ーム細孔の大きさ、200-400 メッシュ、アミン含有量81
マイクロモル/g。２時間後、ガラスビーズのスラリーを
カラム (好ましくは直径約1.5cm) に注ぎ入れ、カラム
を十分にジクロロメタンで洗浄し、減圧で乾燥する。ガ
ラス担体に結合したこのリンカーは、脱トリチレート化
に使用された酸性条件に安定であるが、強い非- 求核塩
基、たとえば1,8-ジアザビシクロ〔5.4.0 〕ウンデセ-7
- エン(DBU) を用いてベータ脱離メカニズムによって速
やかに切断することができる。
【０２２０】Ｂ．短いオリゴマーブロックの合成 次のオリゴマーを、例13の様に合成する:5'FMOC-GUU-
トリチル (ブロック1); 5'FMOC-CGGG-トリチル (ブロッ
ク2); 5'FMOC-CGCCA- トリチル (ブロック3); 5'FMOC-C
UGC-トリチル (ブロック4)。
トリチル (ブロック1); 5'FMOC-CGGG-トリチル (ブロッ
ク2); 5'FMOC-CGCCA- トリチル (ブロック3); 5'FMOC-C
UGC-トリチル (ブロック4)。
【０２２１】Ｃ．担体- 結合リンカーに最初のブロック
の付加 ブロック一オリゴマー１ミリモルを、DMF 20ml中に懸濁
し、DBU(1,8-ジアザビシクロ〔5.4.0 〕ウンデセ-7- エ
ン〕0.4ml を加える。５分後、エーテル200mlを加え、
懸濁液を十分に撹拌し、濾過する。濾液をジクロロメタ
ン20ml中に懸濁し、４つの30ml遠心分離管中に懸濁す
る。夫々の管にエーテル25mlを加え、十分に振とうし、
遠心分離する。上澄みを捨て、ペレットを減圧下に乾燥
する。このオリゴマーをDMF 12ml中に再懸濁し、上記Ａ
欄で製造された固体合成担体のカラムに加える。ガラス
ビーズの床を周期的に撹拌し、ビーズのすべての内部表
面へのオリゴマーブロックの接近を保証する。室温で２
時間後、カラムをジクロロメタンで十分に洗滌する。洗
滌液中に存在する非結合オリゴマーブロックを回収し、
及び再使用する。
の付加 ブロック一オリゴマー１ミリモルを、DMF 20ml中に懸濁
し、DBU(1,8-ジアザビシクロ〔5.4.0 〕ウンデセ-7- エ
ン〕0.4ml を加える。５分後、エーテル200mlを加え、
懸濁液を十分に撹拌し、濾過する。濾液をジクロロメタ
ン20ml中に懸濁し、４つの30ml遠心分離管中に懸濁す
る。夫々の管にエーテル25mlを加え、十分に振とうし、
遠心分離する。上澄みを捨て、ペレットを減圧下に乾燥
する。このオリゴマーをDMF 12ml中に再懸濁し、上記Ａ
欄で製造された固体合成担体のカラムに加える。ガラス
ビーズの床を周期的に撹拌し、ビーズのすべての内部表
面へのオリゴマーブロックの接近を保証する。室温で２
時間後、カラムをジクロロメタンで十分に洗滌する。洗
滌液中に存在する非結合オリゴマーブロックを回収し、
及び再使用する。
【０２２２】Ｄ．脱トリチレート化及び活性化 担体- 結合オリゴマーブロックを、ジクロロメタン88m
l、トリフルオロメタノール10ml及びシアノ酢酸2gから
成るカラムに溶液を徐々に通して脱トリチレート化す
る。カラムをジクロロメタン40mlで、次いでジクロロメ
タン中の１％N-エチルモルホリン40mlで洗滌する。次い
でカラムを、ジクロロメタン50mlで洗滌する。接合オリ
ゴマーの末端を、DIPAEIB 5ml(例９に於ける様に製造)
及びエチルジクロロホスフアート 3mlを含有するジクロ
ロメタン100ml をカラムに徐々に通して活性化する。次
いでカラムをクロロホルム100ml で洗滌する。
l、トリフルオロメタノール10ml及びシアノ酢酸2gから
成るカラムに溶液を徐々に通して脱トリチレート化す
る。カラムをジクロロメタン40mlで、次いでジクロロメ
タン中の１％N-エチルモルホリン40mlで洗滌する。次い
でカラムを、ジクロロメタン50mlで洗滌する。接合オリ
ゴマーの末端を、DIPAEIB 5ml(例９に於ける様に製造)
及びエチルジクロロホスフアート 3mlを含有するジクロ
ロメタン100ml をカラムに徐々に通して活性化する。次
いでカラムをクロロホルム100ml で洗滌する。
【０２２３】Ｅ．担体- 結合オリゴマーに次のブロック
の付加 オリゴマーブロック２ 1ミリモルを、DMF20ml 中に懸濁
し、DBU(1,8-ジアザビシクロ〔5.4.0 〕ウンデセ-7- エ
ン)0.4mlを加える。５分後、エーテル200ml を加え、懸
濁液を十分に撹拌し、濾過する。濾液をジクロロメタン
20ml中に懸濁し、４つの30ml遠心分離管中に懸濁する。
夫々の管にエーテル25mlを加える。管を十分に振とう
し、遠心分離する。上澄みを捨て、ペレットを減圧下に
乾燥する。このオリゴマーをカップリング溶液 (ジクロ
ロメタン 8ml、テトラメチレンスルホン 4ml、及びDIPA
EIB(例９に於ける様に製造)0.5ml) 中に再懸濁する。こ
の溶液を、容量 1ないし 2mlしかカラム床上に残存しな
くなるまで、合成カラムの床に徐々に導入する。担体を
周期的に撹拌し、ビーズのすべての内部細孔表面へのカ
ップリング溶液の完全な接近を保証する。室温で２時間
後、カラムをジクロロメタンで十分に洗滌する。
の付加 オリゴマーブロック２ 1ミリモルを、DMF20ml 中に懸濁
し、DBU(1,8-ジアザビシクロ〔5.4.0 〕ウンデセ-7- エ
ン)0.4mlを加える。５分後、エーテル200ml を加え、懸
濁液を十分に撹拌し、濾過する。濾液をジクロロメタン
20ml中に懸濁し、４つの30ml遠心分離管中に懸濁する。
夫々の管にエーテル25mlを加える。管を十分に振とう
し、遠心分離する。上澄みを捨て、ペレットを減圧下に
乾燥する。このオリゴマーをカップリング溶液 (ジクロ
ロメタン 8ml、テトラメチレンスルホン 4ml、及びDIPA
EIB(例９に於ける様に製造)0.5ml) 中に再懸濁する。こ
の溶液を、容量 1ないし 2mlしかカラム床上に残存しな
くなるまで、合成カラムの床に徐々に導入する。担体を
周期的に撹拌し、ビーズのすべての内部細孔表面へのカ
ップリング溶液の完全な接近を保証する。室温で２時間
後、カラムをジクロロメタンで十分に洗滌する。
【０２２４】ブロック３及び４を、上述の様に同一方法
で加える。
で加える。
【０２２５】Ｆ．担体から切断 リンカー切断用溶液（容量なかりで：６部ジメチルマロ
ナート；12部DBU ；41部テトラメチレンスルホン；及び
41部ジクロロメタン) を徐々にカラムに通し、一方１mm
経路- 長さフローセルを介して290nm で溶出液を追跡す
る。溶出液を、ポリマーのすべてが溶離する( 一般に約
30分) まで、集める。ジクロロメタンを減圧で除去す
る。残存する材料水性NaH2PO4 を十分に中和するため
に、DBU を加え、次いで多量の水を加えて、ポリマーを
沈殿させる。固体生成物を集め、乾燥する。
ナート；12部DBU ；41部テトラメチレンスルホン；及び
41部ジクロロメタン) を徐々にカラムに通し、一方１mm
経路- 長さフローセルを介して290nm で溶出液を追跡す
る。溶出液を、ポリマーのすべてが溶離する( 一般に約
30分) まで、集める。ジクロロメタンを減圧で除去す
る。残存する材料水性NaH2PO4 を十分に中和するため
に、DBU を加え、次いで多量の水を加えて、ポリマーを
沈殿させる。固体生成物を集め、乾燥する。
【０２２６】Ｇ．構造特性評価、脱保護、精製、及びテ
スト 完全に保護された16-mer生成物を脱保護し、精製し、例
14に記載された様に分析する。脱保護及び精製の後、こ
の例の16-merポリマーは、主に例14に記載した様に製造
された16-merポリマーとそのターゲットDNA を有する同
一のTm及び主に同一の生物学的活性を示す。
スト 完全に保護された16-mer生成物を脱保護し、精製し、例
14に記載された様に分析する。脱保護及び精製の後、こ
の例の16-merポリマーは、主に例14に記載した様に製造
された16-merポリマーとそのターゲットDNA を有する同
一のTm及び主に同一の生物学的活性を示す。
【０２２７】例16 ヘルペスシムプレックスI 中でスプライス部位を目標と
するモルホリノポリマーの段階的固- 相合成 この例は、ホスホルジアミダート- 結合骨格を含有する
ポリマーの固体担体上での段階的集合を示す (第４図の
構造B-B 、そこでX はN(CH3)2 、Y は酸素、Z は酸素で
ある。）。配列、5'-CGUUCCUCCUGC を有するこのポリマ
ーは、ウイルス、ヘルペスシンプレックスI(アテンシオ 等)
中でスプライス部位を目標とする。
するモルホリノポリマーの段階的固- 相合成 この例は、ホスホルジアミダート- 結合骨格を含有する
ポリマーの固体担体上での段階的集合を示す (第４図の
構造B-B 、そこでX はN(CH3)2 、Y は酸素、Z は酸素で
ある。）。配列、5'-CGUUCCUCCUGC を有するこのポリマ
ーは、ウイルス、ヘルペスシンプレックスI(アテンシオ 等)
中でスプライス部位を目標とする。
【０２２８】Ａ．固体担体への切断可能なリンカーの結
合 切断可能なリンカーを、例15、第Ａ欄で記載された様に
固体担体に結合させる。
合 切断可能なリンカーを、例15、第Ａ欄で記載された様に
固体担体に結合させる。
【０２２９】Ｂ．担体に第一モノマーの結合 モルホリノ環窒素上にトリチルメチルを有しかつ5'メチ
レン上にメチルアミンを有するモノホリノＣサブユニッ
ト1mmol(例６に於ける様に製造) を、DMF 12ml中に懸濁
し、例15、第Ａ欄に記載された様に固体合成担体のため
に製造されたカラムに加える。ガラス床の床を周期的に
撹拌し、ビーズのすべての内部表面への第一サブユニッ
トの接近を保証する。室温で１時間後、カラムを十分に
ジクロロメタンで洗滌する。洗滌液中に存在する未結合
サブユニットを回収し、再使用する。
レン上にメチルアミンを有するモノホリノＣサブユニッ
ト1mmol(例６に於ける様に製造) を、DMF 12ml中に懸濁
し、例15、第Ａ欄に記載された様に固体合成担体のため
に製造されたカラムに加える。ガラス床の床を周期的に
撹拌し、ビーズのすべての内部表面への第一サブユニッ
トの接近を保証する。室温で１時間後、カラムを十分に
ジクロロメタンで洗滌する。洗滌液中に存在する未結合
サブユニットを回収し、再使用する。
【０２３０】Ｃ．カップリングサイクル ａ．脱トリチル化 担体- 結合サブユニットを、ジクロロメタン88ml、トリ
フルオロエタノール10ml、及びシアノ酢酸2gから成る溶
液をカラムに徐々に通して脱トリチレート化する。カラ
ムをジクロロメタン40ml、次いでジクロロメタン中で１
％N-エチルモルホリン40ml、次いで最後にクロロホルム
100ml で洗滌する。
フルオロエタノール10ml、及びシアノ酢酸2gから成る溶
液をカラムに徐々に通して脱トリチレート化する。カラ
ムをジクロロメタン40ml、次いでジクロロメタン中で１
％N-エチルモルホリン40ml、次いで最後にクロロホルム
100ml で洗滌する。
【０２３１】ｂ．生長する鎖にサブユニットの付加 サブユニット1mmol(例２に於ける様に製造し、例９、第
Ｄ欄に記載した様にN,N-ジメチルアミノジクロロホスフ
アートで活性化) を、カップリング溶液 (ジクロロメタ
ン8ml 、テトラメチレンスルホン4ml 、及びDIPAEIB 0.
5ml(例９に於ける様に製造))中に懸濁する。この溶液
を、容量の 1ないし2ml しか床上に残らなくなるまで合
成カラムの床中に導入する。担体を、周期的に撹拌し、
ビーズのすべての内部細孔表面へのカップリング溶液の
完全接近を保証する。室温で１時間後、カラムをジクロ
ロメタンで十分に洗滌する。この洗滌液中ですべての未
結合サブユニットを、回収し、再使用する。
Ｄ欄に記載した様にN,N-ジメチルアミノジクロロホスフ
アートで活性化) を、カップリング溶液 (ジクロロメタ
ン8ml 、テトラメチレンスルホン4ml 、及びDIPAEIB 0.
5ml(例９に於ける様に製造))中に懸濁する。この溶液
を、容量の 1ないし2ml しか床上に残らなくなるまで合
成カラムの床中に導入する。担体を、周期的に撹拌し、
ビーズのすべての内部細孔表面へのカップリング溶液の
完全接近を保証する。室温で１時間後、カラムをジクロ
ロメタンで十分に洗滌する。この洗滌液中ですべての未
結合サブユニットを、回収し、再使用する。
【０２３２】ｃ．未反応鎖末端のカップリング 無水酢酸 2ml及びDIPAEIB 2ml(例９に於ける様に製造）
を有するジクロロメタン50ミリリットルを、カラムに加
える。カラムを、DIPAEIB 2ml を含有するメタノール10
0ml 、次いでジクロロメタン200ml を用いて洗滌する。
を有するジクロロメタン50ミリリットルを、カラムに加
える。カラムを、DIPAEIB 2ml を含有するメタノール10
0ml 、次いでジクロロメタン200ml を用いて洗滌する。
【０２３３】このカップリングサイクル (上記ａ，ｂ，
ｃ段階から成る）を用いて、サブユニットＧ，Ｕ，Ｕ，
Ｃ，Ｃ，Ｕ，Ｃ，Ｃ，Ｕ，Ｇ，及びＣを配列に加える。
ｃ段階から成る）を用いて、サブユニットＧ，Ｕ，Ｕ，
Ｃ，Ｃ，Ｕ，Ｃ，Ｃ，Ｕ，Ｇ，及びＣを配列に加える。
【０２３４】Ｄ．担体から切断 完成したポリマーを例15に記載した様に担体から切断す
る。
る。
【０２３５】Ｅ．構造特性評価、脱保護、精製、および
テスト 完全に保護された12-mer生成物を脱保護し、精製し、例
14に記載された様に分析する。脱保護及び精製の後、上
述の様に製造されたヘルペス- ターゲット12-mer ポリ
マーは、その相補的DNA と１対となった時(2本鎖非平
行) 、47℃のTm(例12中に記載された様に測定) を有す
るのが分る：各鎖は、２マイクロモルの濃度で存在す
る。
テスト 完全に保護された12-mer生成物を脱保護し、精製し、例
14に記載された様に分析する。脱保護及び精製の後、上
述の様に製造されたヘルペス- ターゲット12-mer ポリ
マーは、その相補的DNA と１対となった時(2本鎖非平
行) 、47℃のTm(例12中に記載された様に測定) を有す
るのが分る：各鎖は、２マイクロモルの濃度で存在す
る。
【０２３６】Ｆ．生物学的活性の予備評価 この例の12-merを、ターゲットウイルス、ヘルペスシン
プレックスウイルスI(HSUI) によって感染されたマウス
を保護するその能力についてテストする。HSV I で目に
感染を受けたマウスは、感染後５日目で残存率65％を示
す。ヘルペス- 感染されたマウスを、この例中に記載さ
れた12-mer0.03mmolを含有する局所軟膏で処置した場
合、残存率を感染後５日目で90％に増加する。
プレックスウイルスI(HSUI) によって感染されたマウス
を保護するその能力についてテストする。HSV I で目に
感染を受けたマウスは、感染後５日目で残存率65％を示
す。ヘルペス- 感染されたマウスを、この例中に記載さ
れた12-mer0.03mmolを含有する局所軟膏で処置した場
合、残存率を感染後５日目で90％に増加する。
【０２３７】本発明の特別な具体例、方法、及び使用を
記載したが、本発明の種々の変化及び変更を、本発明か
ら離れることなく行うことができる。特に好ましいポリ
マー骨格構造を記載かつ描写したが、他のモルホリノ-
基体ポリマーを上述の骨格制限及び要求に従って構成す
ることができる。
記載したが、本発明の種々の変化及び変更を、本発明か
ら離れることなく行うことができる。特に好ましいポリ
マー骨格構造を記載かつ描写したが、他のモルホリノ-
基体ポリマーを上述の骨格制限及び要求に従って構成す
ることができる。
【図１】第１図は、塩基性β- モルホリノ環構造を示
す。
す。
【図２】第２図は、いくつかの典型的なプリン- 及びピ
リミジン塩基残基 (第１図中に示される環構造のPiとし
て表わされる) を示す。
リミジン塩基残基 (第１図中に示される環構造のPiとし
て表わされる) を示す。
【図３】第３図は、ポリマー形成に適する5-原子(A),
6-原子(B) 及び7-原子(C-E) 連結基を有するいくつかの
好ましいサブユニットを示す。
6-原子(B) 及び7-原子(C-E) 連結基を有するいくつかの
好ましいサブユニットを示す。
【図４】第４図は、典型的なモルホリノ- 基体ポリマー
のくり返しサブユニットセグメントを示す。
のくり返しサブユニットセグメントを示す。
【図５】第５図は、リボヌクレオシドからいくつかのタ
イプのモルホリノサブユニットを合成する工程を示す。
イプのモルホリノサブユニットを合成する工程を示す。
【図６】第６図は、塩基性モルホリノサブユニットの別
の合成を示す。
の合成を示す。
【図７】第７図は、7-原子くり返し- 単位要素を有する
ポリマーの構造で示されるモルホリノサブユニットを合
成する工程を示す。
ポリマーの構造で示されるモルホリノサブユニットを合
成する工程を示す。
【図８】第８Ａ図は、2-アミン- 含有プリンの夫々のタ
ーゲット塩基- 対の極性主要-溝基を示す。第８Ｂ図
は、二重- 結合ポリマーの代表的塩基配列 (第８Ｂ図)
への結合様式を示す。
ーゲット塩基- 対の極性主要-溝基を示す。第８Ｂ図
は、二重- 結合ポリマーの代表的塩基配列 (第８Ｂ図)
への結合様式を示す。
【図９】第９図は、ホスホンアミドリンケージによって
２個のモルホリノサブユニットを連結する工程を示す。
２個のモルホリノサブユニットを連結する工程を示す。
【図１０】第１０図は、ホスホルアミダートリンケージ
によってモルホリノサブユニットを連結する工程を示
す。
によってモルホリノサブユニットを連結する工程を示
す。
【図１１】第１１図は、ホスホンエステルリンケージに
よるモルホリノサブユニットの連結を示す。
よるモルホリノサブユニットの連結を示す。
【図１２】第１２図は、モルホリノ環構造を同時に生じ
るサブユニットカップリング操作を示す。
るサブユニットカップリング操作を示す。
【図１３】第１３図は、( モルホリノ)(6)6/ポリ(G) 複
合に関する末端変性プロットを示す。
合に関する末端変性プロットを示す。
【図１４】第１４図は、プローブ- 診断システム中でモ
ルホリノポリマーの使用を示す。
ルホリノポリマーの使用を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１３年７月１２日（２００１．７．１
２）
２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正内容】
【化１】 （式中Pi及びPjのそれぞれは塩基特異性水素結合によっ
てポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効なプリン
又はピリミジン残基である; 及びX は F,CH2R, OCH2-R,
S-CH2R,又はNR1R2 ; 及びR 、R1及び R2 のうちのそれ
ぞれはH 又はCH3である。）である繰り返しサブユニッ
トセグメントを有する、請求項１記載のポリマー。
てポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効なプリン
又はピリミジン残基である; 及びX は F,CH2R, OCH2-R,
S-CH2R,又はNR1R2 ; 及びR 、R1及び R2 のうちのそれ
ぞれはH 又はCH3である。）である繰り返しサブユニッ
トセグメントを有する、請求項１記載のポリマー。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正内容】
【化２】 （式中Pi及びPjのそれぞれは塩基特異性水素結合によっ
てポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効なプリン
又はピリミジン残基である; 及びX はF, CH2R, OCH2-R,
S-CH2R,又はNR1R2 ; 及びR 、R1及び R2 のうちのそれ
ぞれはH 又はCH3である。）である繰り返しサブユニッ
トセグメントを有する、請求項１記載のポリマー。
てポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効なプリン
又はピリミジン残基である; 及びX はF, CH2R, OCH2-R,
S-CH2R,又はNR1R2 ; 及びR 、R1及び R2 のうちのそれ
ぞれはH 又はCH3である。）である繰り返しサブユニッ
トセグメントを有する、請求項１記載のポリマー。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正内容】
【化３】 （式中Pi及びPjのそれぞれは塩基特異性水素結合によっ
てポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効なプリン
又はピリミジン残基である; 及びX はF,CH2R, OCH2-R,
S-CH2R, 又はNR1R2 ; 及びR 、R1及び R2 のうちのそれ
ぞれはH 又はCH3である。） ある繰り返しサブユニットセグメントを有する、請求項
１記載のポリマー。
てポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効なプリン
又はピリミジン残基である; 及びX はF,CH2R, OCH2-R,
S-CH2R, 又はNR1R2 ; 及びR 、R1及び R2 のうちのそれ
ぞれはH 又はCH3である。） ある繰り返しサブユニットセグメントを有する、請求項
１記載のポリマー。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正内容】
【化４】 （式中Pi及びPjのそれぞれは塩基特異性水素結合によっ
てポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効なプリン
又はピリミジン残基である; 及びX はF,CH2R, OCH2-R,
S-CH2R, 又はNR1R2 ; 及びR 、R1及び R2 のうちのそれ
ぞれはH 又はCH3である。）である繰り返しサブユニッ
トセグメントを有する、請求項１記載のポリマー。
てポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効なプリン
又はピリミジン残基である; 及びX はF,CH2R, OCH2-R,
S-CH2R, 又はNR1R2 ; 及びR 、R1及び R2 のうちのそれ
ぞれはH 又はCH3である。）である繰り返しサブユニッ
トセグメントを有する、請求項１記載のポリマー。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ウエラー・デワイト・ディー アメリカ合衆国、オレゴン州97330、カー バリス、エヌ・ダブリュ・エルムウッド、 3323 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 CA01 CA11 HA03 HA11 4B063 QA01 QA11 QA18 QR81 QR90 QS34 4C084 AA13 MA01 NA14 ZB262 ZB332 4C086 AA02 AA03 FA05 NA14 ZB26 ZB33 4J030 CB31 CB42 CB58 CB65 CG29
Claims (24)
- 【請求項１】次の形： 【化１】 （式中(i) 環構造は１つの環構造のモルホリノ窒素を、
隣接環構造の5'エキソ環状炭素に結合させる、長さ１〜
３個の原子の非電荷リン- 含有キラルリンケージによっ
て連結され、そして(ii)Piは塩基特異性水素結合によっ
てポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効なプリン
- 又はピリミジン残基である。）のモルホリノ環構造か
ら成るポリマー。 - 【請求項２】 Pi が、 【化２】 （式中X はH, CH3, F, Cl, Br,又はI である。）から成
る群より選ばれる、請求項１記載のポリマー。 - 【請求項３】環構造及びリンケージが、 【化３】 から成る群より選ばれた形を有する、請求項１記載のポ
リマー。 - 【請求項４】ポリマーが次の形： 【化４】 （式中Pi及びPjのそれぞれは塩基特異性水素結合によっ
てポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効なプリン
又はピリミジン残基である; 及びX は F,CH2R, OCH2-R,
S-CH2R,又はNR1R2 ; 及びR 、R1及び R2 のうちのそれ
ぞれはH, CH3, 又は上記塩基特異的水素結合を妨害しな
い他の部分である。）である繰り返しサブユニットセグ
メントを有する、請求項１記載のポリマー。 - 【請求項５】ポリマーが次の形： 【化５】 （式中Pi及びPjのそれぞれは塩基特異性水素結合によっ
てポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効なプリン
又はピリミジン残基である; 及びX はF,CH2R, OCH2-R,
S-CH2R,又はNR1R2 ; 及びR 、R1及び R2 のうちのそれ
ぞれはH, CH3, 又は上記塩基特異的水素結合を妨害しな
い他の部分である。）である繰り返しサブユニットセグ
メントを有する、請求項１記載のポリマー。 - 【請求項６】ポリマーが次の形： 【化６】 （式中Pi及びPjのそれぞれは塩基特異性水素結合によっ
てポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効なプリン
又はピリミジン残基である; ＺはＯ又はＳである。）で
ある繰り返しサブユニットセグメントを有する、請求項
１記載のポリマー。 - 【請求項７】ポリマーが次の形： 【化７】 （式中Pi及びPjのそれぞれは塩基特異性水素結合によっ
てポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効なプリン
又はピリミジン残基である; 及びZ はＯ又はＳであ
る。）である繰り返しサブユニットセグメントを有す
る、請求項１記載のポリマー。 - 【請求項８】ポリマーが次の形： 【化８】 （式中Pi及びPjのそれぞれは塩基特異性水素結合によっ
てポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効なプリン
又はピリミジン残基である; 及びX はF,CH2R, OCH2-R,
S-CH2R, 又はNR1R2 ; 及びR 、R1及び R2 のうちのそれ
ぞれはH, CH3, 又は上記塩基特異的水素結合を妨害しな
い他の部分である。） ある繰り返しサブユニットセグメントを有する、請求項
１記載のポリマ。 - 【請求項９】ポリマーが次の形： 【化９】 （式中Pi及びPjのそれぞれは塩基特異性水素結合によっ
てポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効なプリン
又はピリミジン残基である; 及びX はF,CH2R, OCH2-R,
S-CH2R, 又はNR1R2 ; 及びR 、R1及び R2 のうちのそれ
ぞれはH, CH3, 又は上記塩基特異的水素結合を妨害しな
い他の部分である。）である繰り返しサブユニットセグ
メントを有する、請求項１記載のポリマー。 - 【請求項１０】水性媒体中で分子の溶解度を増加させる
のに有利であるポリエチレングリコール部分を、片方又
は両方の末端に更に有する、請求項１記載のポリマー。 - 【請求項１１】少なくとも３個のモルホリノ環構造から
成る、請求項１記載のポリマー。 - 【請求項１２】 Pi の少なくとも１個が2,6-ジアミノプ
リンである、請求項１記載のポリマー。 - 【請求項１３】 Pi の少なくとも１個が、5-ハロウラシ
ルである、請求項１記載のポリマー。 - 【請求項１４】 Pi の少なくとも70％が、2-アミンを含
有するプリンである、請求項１記載のポリマー。 - 【請求項１５】 Pi の少なくとも１個が、2,6-ジアミノ
プリンである、請求項１４記載のポリマー。 - 【請求項１６】ポリマーが固形担体に結合されている、
請求項１ないし１５のいずれかに記載のポリマー。 - 【請求項１７】サンプル中で、選択されたターゲット配
列を有するポリヌクレオドの存在を検出する方法におい
て、請求の範囲１ないし１６のいずれかに記載のポリマ
ーを上記ポリヌクレオドと接触させ、その場合上記ポリ
マーは選択されたターゲット配列に結合することができ
る、一連の塩基残基Pi及びPjを有し、そしてポリマーと
ターゲット配列の間にハイブリット形成複合体を形成さ
せるのに有効な、従来公知の条件下で、ポリマーのポリ
ヌクレオドへの接触を実施することを特徴とする、上記
検出方法。 - 【請求項１８】ポリヌクレオドが一本鎖である、請求項
１７記載の方法。 - 【請求項１９】ポリヌクレオドがＤＮＡである、請求項
１８記載の方法。 - 【請求項２０】ポリヌクレオドがＲＮＡである、請求項
１８記載の方法。 - 【請求項２１】ポリヌクレオドが二本鎖である、請求項
１７記載の方法。 - 【請求項２２】ポリヌクレオドが二本鎖ＲＮＡである、
請求項２１記載の方法。 - 【請求項２３】ポリマーが検出可能なリポーター基によ
って標識されている、請求項１７ないし２２のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項２４】選択されたターゲット配列を有するポリ
ヌクレオドをサンプルから単離する方法において、請求
の範囲１ないし１５のいずれかに記載のポリマーを上記
ポリヌクレオドと接触させ、その際上記ポリマーは
（ｉ）選択されたターゲット配列に結合することができ
る、一連の塩基残基Pi及びPjを有し、（ｉｉ）固形担体
に結合されており、そして（ｉｉｉ）ポリマーとターゲ
ット配列の間にハイブリット形成複合体を形成させるの
に有効な、従来公知の条件下でポリマーをポリヌクレオ
ドと接触させ、ついで上記ポリヌクレオドを単離するこ
とを特徴とする、上記単離方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002167441A true JP2002167441A (ja) | 2002-06-11 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50289191A Expired - Lifetime JP3398378B2 (ja) | 1989-12-20 | 1990-12-20 | リン含有キラルインターサブユニットリンケージを有する非電荷モルホリノ―基体ポリマー |
| JP2001179272A Pending JP2002167441A (ja) | 1989-12-20 | 2001-06-13 | リン含有キラルインターサブユニットリンケージを有する非電荷モルホリノー基体ポリマー |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50289191A Expired - Lifetime JP3398378B2 (ja) | 1989-12-20 | 1990-12-20 | リン含有キラルインターサブユニットリンケージを有する非電荷モルホリノ―基体ポリマー |
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|---|---|
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