KR0167574B1 - 소단위 사이에 인-함유 키랄결합을 가지는 비전하 모르폴리노기저 중합체 - Google Patents

Abstract

1 내지 3원자 길이의 비전하 인-함유 키랄 결합에 의하여 함께 연결된 모르폴리노 소단위 구조로 이루어진 중합체 조성물이 개시된다. 이들 키랄결합은 한 소단위의 모르폴리노 질소를 다른 인정 소단위의 5' 엑소시클릭 탄소에 연결시킨다.

각 소단위는 수소결합에 의하여 표적 폴리뉴클레오티드의 특이적 염기 또는 염기쌍에 효과적으로 결합하는 퓨린 또는 피리미딘 염기 페어링부를 함유한다.

Description

[발명의 명칭]

소단위 사이에 인-함유 키랄결합을 가지는 비전하모르폴리노- 기저 중합체

[발명의 분야]

본 발명은 모르폴리노- 기저 중합체에 관한 것이다.

[발명의 배경]

폴리뉴클레오티드에 염기-특이적인 결합이 형성되도록 설계된 중합체는 병원체에 특징적인 특이적 유전 서열의 실험실내 검출 및 많은 질병- 특히 바이러스성 질병을 야기하는 유전서열의 생체내 불활성에 상당한 잠재력을 가지고 있다.

표준 리보- 및 데옥시리보뉴클레오티드 중합체는 상보적 유전서열의 검출 및 더 최근에는 표적 유전서열의 불활성화에 광범위하게 이용되고 있다. 그러나 표준 폴리뉴클레오티드는 표적 올리고뉴클레오티드에의 염기-특이적 결합에 사용될 때 많은 한계점을 가지고 있다. 이들 한계점은; (i) 생물학적 막을 가로지르는 제한된 이동, (ii) 뉴클레아제 민감성, (iii) 이온 농도에 민감한 표적 결합 및 (iv) 세포 가닥-분리 메카니즘에의 민감성 등이다.

원리적으로 상기 한계점은 염기가 비전하 골격을 따라 결합된 폴리헥산 유사체를 설계함으로써 최소화되거나 극복될 수 있다. 비전하 헥산 유사체의 예들이 제시되어 있다. Pitha et al(1970a, b)는 헥산의 정상적인 당-인산 골격이 폴리비닐 골격으로 대체된 다양한 단일 중합체 폴리뉴클레오티드 유사체에 대해 개시하고 있다. 이들 헥산 유사체는 상보적인 폴리뉴클레오티드된 예상했던 왓슨/크릭 페어링 특이성을 가지나 상당히 감소된 Tm 수치를 가지는 것으로 밝혀졌다(Pitha, 1970a). 이 연구법의 심각한 한계점의 하나는 바람직한 염기 서열의 중합체를 생산하기 위하여 연속적인 소단위 첨가에 의한 중합체를 형성할 수 없다는 점이다. 따라서, 중합체는 선택된 표적 서열에의 염기-특이적 결합에 이용될 수 없다. 데옥시리보뉴클레오시드 소단위 사이에 비전하, 입체이성질의 메틸포스포네이트 결합을 함유하는 폴리뉴클레오티드 유사체도 제시되었다(Miller, 1979, 1980; Jayaraman, Murakami; Blake, 1985a, 1985b; Smith).

더 최근에는, 다양한 유사, 비전하 포스포아미데이트-결합 올리고뉴클레오티드 유사체도 또한 제시되었다(Froehler, 1988).

이들 중합체는 비전하 키랄 인-함유기를 통하여 한 소단위 3'OH기와 다른 소단위의 5'OH기에 의해 결합된 데옥시뉴클레오시드로 구성된다. 이들 화합물들은 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 표적 서열에 결합하여 선택적으로 차폐하는 것으로 밝혀졌다. 그러나 데옥시리보뉴클레오시드 소단위를 이용한 비전하 인-결합 폴리뉴클레오티드 유사체는 특히 비용이 많이들며 제조하기가 어렵다; 소단위 출발물질은 매우 고가이며 한정된 이용성을 가진다.

더 최근에는 비전하 아키랄 소단위 결합을 가지는 데옥시리보뉴클레오티드 유사체가 개발되었다(Stirchak 1987). 이들 비전하, 아키랄 데옥시리보뉴클레오시드- 유래 유사체들은 상기에서 언급한 바와 같이 출발물질의 비교적 높은 단가로 인해 제한된다.

[본 발명의 요약]

본 발명의 일반적 목적은 상기한 폴리뉴클레오티드 유사체 중합체에 관련된 많은 한계점 및 문제점을 극복하거나 최소화하는, 폴리뉴클레오티드에 서열-특이적 결합을 할 수 있는 중합체를 제공하는 것이다.

본 발명은 다음 형태 :

의 모르폴리노 고리 구조를 함유하는 중합체 조성물이다.

이 고리 구조는 한 고리구조의 모르폴리노 질소를 인접 고리구조의 5' 엑소시클릭 탄소에 결합시키는 1 내지 3 원자길이의 비전하, 인- 함유 키랄결합에 의하여 함께 연결된다.

각 고리구조는 폴리뉴클레오티드의 표적서열 염기에 염기- 특이적 수소 결합을 효과적으로 하는 퓨린 또는 피리미딘 염기- 페어링부 P_i를 포함하고 있다.

본 발명의 이들 및 기타 다른 목적 및 특징들은 이하 기술될 실시예 및 도면과 관련한 본 발명의 상세한 설명에서 더욱 분명하게 부각될 것이다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 비전하 인- 함유 키랄결합을 통하여 연결되어 본발명의 중합체를 형성하는 기본 β- 모르폴리노 고리구조를 도시한다.

P_i는 퓨린 또는 피리미딘 염기페이링부이다.

제2도는 몇개의 예시적인 퓨린- 및 피리미딘 염기-페어링부(제1도에서 도시된 고리구조의 P_i로 표시됨, X는 H, CH₃, F, Cl, Br 또는 I 이다)를 도시한다.

제3도는 중합체를 형성하기에 적합한 5- 원자(A), 6-원자(B) 및 7- 원자(C-E) 결합기를 가지는 일부 바람직한 소단위를 도시한다. 여기서 X는 -CH₂R, -O-CH₂R, -S-CH₂R, -NR₁R₂, 또는 F이고 R은 H, CH₃, 또는 표적결합을 방해하지 않는 다른 부이다.

R₁및 R₂는 (i)같거나 다른, (ii) R 또는 시클릭 지방족 또는 방향족부로 부터 선택된다.

Y₁은 O, S, CH₂또는 NR이다.

Y₂는 O, S 또는 CH₂이다.

Y₃는 O, S 또는 NR이다.

Z는 0 또는 S이다.

제4도는 제3도의 소단위 A∼E를 각각 이용하여 만든, A-A 내지 E-E로 표시된 예시적인 모르폴리노-염기 중합체의 반복 소단위 단편을 도시한다. X, Y 및 Z는 제3도에서와 동일하다.

P_i및 P_j는 퓨린 또는 피리미딘 염기 페어링부이다.

제5도는 리보뉴클레오시드로부터 몇몇 유형의 모르폴리노 소단위를 합성하는 단계를 도시한다.

제6도는 기본적인 모르폴리노 소단위의 다른 합성법을 도시한다.

제7도는 7-원자 반복-단위 골격을 가지는 중합체를 형성하기 위하여 설계된 모르폴리노 소단위의 합성 단계를 도시한다.

제8도는 각 표적 염기쌍의 극성 대-그루우브(major-groove)부위(제8a도) 및 이중 나선-결합중합체(제8b도)의 대표적 염기 서열에 대한 2-아미노-함유 퓨린의 결합 형태를 도시한다. 제8b도 a=아데닌, c=시토신, g=구아닌, t=티민, u=우라실, D=2,6-디아미노퓨린 또는 2-아미노퓨린, G=구아닌 또는 티오구아닌, I=는 고특이성 수소결합, 및; = 저특이성 수소결합이다.

제9도는 포스폰아미드 결합을 통하여 두 모르폴리노 소단위가 결합하는 단계를 도시한다.

제10도는 포스포르아미데이트 결합을 통하여 모르폴리노 소단위가 결합하는 두 방법을 도시한다.

제11도는 포스포노에스테르 결합을 통한 모르폴리노 소단위의 결합을 도시한다.

제12도는 동시적으로 모르폴리노 고리구조를 형성하는 소단위 결합과정을 예시한다.

제13도는 (모르폴리노) (C)₆/폴리(G) 복합체에 대한 열변성 그래프를 도시한다. (모르폴리노) (C)₆중합체는 본 발명에 따라 제조하였다.

제14도는 프로브-진단 시스템에 모르폴리노 중합체를 이용하는 것을 예시한다.

[발명의 상세한 설명]

본발명은 폴리뉴클레오티드 표적서열에 염기-특이적 결합을 하도록 설계된 모르폴리노-기저 중합체이다. 이 중합체는 한 구조의 모르폴리노질소를 인접 구조의 5' 엑소시클릭 탄소에 결합시키는, 1 내지 3 원자길이의 비전하 키랄 결합에 의해 함께 연결된 모르폴리노-기저 고리구조로 구성된다.

A. 모르폴리노-기저 소단위

제1도는 중합체 소단위를 기저로한 β-모르폴리노 고리구조를 도시한다. 모르폴리노 탄소원자는 본래 리보오스에서와 동일하게 번호가 정해진다. 제1도에서 알 수 있는 바와 같이 고리구조는 β-방향으로 4' 탄소에 부착된 5' 메틸렌을 함유한다.

각 고리구조는 β-방향의 결합을 통하여 골격 모르폴리노부에 부착된 퓨린 또는 피리미딘 또는 관련 수소-결합부 P_i를 포함한다.

퓨린 수소-결합부 또는 염기는 퓨린뿐만 아니라 예컨대 N3, N7 또는 N9 등의 하나 또는 그 이상의 원자가 탄소등의 적당한 원자에 의하여 대체되거나 또는 C8이 질소로 대체된 5 내지 6 융합고리를 가지는 퓨린형 평면고리 구조도 포함한다. 이와 유사하게 피리미딘부도 피리미딘뿐만 아니라 예컨대 N1등의 하나 또는 그 이상의 원자가 탄소등의 적당한 원자로 대체된 피리미딘형 평면 6-원소고리를 포함한다.

본 발명에서 바람직한 수소-결합부는 제2도에 도시된 퓨린 및 피리미딘군이다. 각 염기는 폴리뉴클레오티드 염기 또는 염기쌍에 특이적인 최소한 두 수소-결합부위를 포함한다. 중합체가 단일 가닥 폴리뉴클레오티드에 서열-특이적 결합을 위해 사용될 경우 퓨린 구조 1 내지 3은 티민 또는 우라실염기에 결합하도록 설계되고; 구조 7 내지 8은 구아닌 염기에; 구조 4 내지 6은 시토신 염기에; 그리고 구조 9는 아데닌 염기에 결합하도록 설계되어진다.

또한 본발명의 중합체는 아래에서 기술하는 바와 같이 상보가닥에는 대부분 피리미딘 염기 그리고 다른 가닥에는 대부분 퓨린 염기를 가지는 이중나선 폴리뉴클레오티드에 대-그루우브를 통하여 접근하기 쉬운 수소-결합부위에 결합하는데 효과적이다.

이중나선 헥산의 상이한 염기쌍중에 두 중심적인 극성 대-그루우브 부위의 위치 및 유사형태로 인하여(즉, CG 염기쌍의 NH₄및 06은 AT 염기쌍의 NH6 및 04와 동일한 H-결합배열를 나타낸다), 이중나선-결합 중합체의 H-결합부는 표적 유전 이중나선에서 일정 염기쌍을 특이적으로 인식하기 위하여 그 표적 염기쌍의 N7에 수소결합하여야 한다. 따라서 한 가닥에는 주로 퓨린 그리고 다른 가닥에는 주로 피리미딘을 함유하는 이중나선 유전서열을 표적으로 하는 본 발명의 중합체에 있어서, 중합체의 수소결합부는 위치2에 아민을 가지는 퓨린을 주로 함유하는데 이 아민은 표적 염기쌍의 N7에 수소결합이 이루어지도록 적당하게 위치하기 때문이다. 좀더 구체적으로 제2도의 구조2 및 3은 UA 또는 TA 염기쌍에의 특이적 결합을 제공하는 한편 구조4 및 6은 CG 염기쌍에의 특이적 결합을 제공한다. 이중나선- 결합 중합체에 특히 유용한 두 염기는 2,6-디아미노 퓨린(구조3) 및 구아닌(구조4)이다.

제8a도는 이중나선 헥산에 이들의 각 표적 염기쌍의 극성 대- 그루우브 부위에 이들 두 염기가 결합하는 것을 예시하고 있다.

주로 2-아민-함유 퓨린을 함유함으로써 이중나선 유전서열의 극성 대-그루우브 부위에의 고특이성 결합에 적합한 중합체는 모르폴리노-기저 골격 이외에 다른 대체 골격을 이용하여 이들 표적 유전 이중나선에 효과적인 결합을 제공할 수 있다.

이와 같은 대체 골격의 예로서는 인의 펜던트기가 다음의 하나인 포스포디 에스테르-결합 데옥시리보뉴클레오시드를 들수있다: 음전하를 띤 산소(예컨대 중성 DNA 골격); 메틸 또는 기타 알킬기(알킬포스포네이트로 언급); 메톡시 또는 기타 알콕시기(포스포트리에스테르로 언급): 또는 모노-또는 디알킬아민(포스포아미데이트로 언급). 또한 이들 이중나선-결합 중합체를 위한 대체 골격으로서는 2' 산소에 메틸을 가지거나 가지지 않고 상기한 바와같은 인에 펜던트기를 가지는 포스포디에스테르-결합 리보폴리뉴클레오시드를 들수있다. 본 발명의 모르폴리노 소단위는 안정한 비전하 키랄 결합을 통하여 소단위를 결합함으로써 연걸되어 중합체를 형성한다.

소단위의 결합기는 연결되어질 소단위의 친핵체와 대개 반응하는 인-함유 친전자체를 포함한다.

중합체 합성에 이용하기 위한 소단위 결합기의 선택은 몇가지 고려사항에 의해 이루어진다. 유력한 소단위간 결합(즉, 불안정하지 않은 것으로 예견 되어지고 결합에 관해 자유회전하거나 또는 단일 결합형태로 존재하는 결합)의 초기 스크리닝은 전형적으로 이중나선 DNA 또는 RNA의 컴퓨터 분자 모델 또는 공간 충전 CPK의 이용과 관련된다.

DNA 및 RNA 이중나선은 A-형에서 올리고리보뉴클레이오티드- 함유 이중나선 및 β-형에서 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 X-선 회절에 의하여 결정된 파라미터에 따라 형성되었다.

형성된 이들 이중나선의 각각에서 두 당 인산염 골격의 하나가 제거된다. 그리고 모르폴리노고리 및 소단위간 결합을 포함한 예상 골격은 가능하다면 원래의 당- 인산염 골격이 제거되어진 염기의 위치에 대체된다. 그 다음 각 생성 폴리뉴클레오티드/중합체 이중나선에서 왓슨/그릭 염기쌍의 동일 평면도(coplanarity), 예상 결합 중합체 골격에서의 비틀림 및 각 변형 헥산 가닥상에 부여된 뒤틸림 정도 및 가닥내 및 가닥간 비결합 상호작용에 대해 조사된다.

본 발명을 뒷받침하기 위해 실시된 이와 같은 유형의 초기 연구는 모르폴리노-기저 중합체가 6원자의 바람직한 단위 골격길이(즉, 중합체에 반복 골격사슬의 원자수)를 가짐을 밝혔다.

그러나 또한 모델 연구결과는 어떤 5- 원자 및 7- 원자 반복- 단위 모르폴리노-기저 골격은 표적 유전서열에의 결합에 요구되는 조건을 만족한다는 사실을 밝히고 있다.

모르폴리노 구조 그 자체는 각 반복 골격단위에 4원자를 차지하기 때문에, 5-원자, 6-원자 및 7-원자 반복 단위 골격에서의 결합은 골격길이에 각각 1,2 및 3원자를 차지한다.

모든 경우에 고리구조사이의 결합은 (a)비전하 (b)키랄 (c)안정적이고 및 (d)표적 폴리뉴클레오티드의 결합에 적합한 구조를 이루게 하여야 한다.

상기 모델 연구에서 허용되는 것으로 판단된 소단위 골격구조는 그 다음 합성 가능성에 대해서 평가한다. 소단위간 결합의 실제 화학적 안정성은 종종 모델화합물 또는 이합체로서 평가된다.

제3도는 상기에서 개괄된 제한 및 요구조건을 충족하는, 결합기를 포함하여 몇가지 바람직한 β-모르폴리노 소단위 유형을 도시한다. 중합체는 한 결합 유형이상을 포함하고 있다는 것을 인식하여야 하겠다.

제3도에서 소단위A는 모르포리노 고리가 1-원자 포스포아미드 결합에 의하여 연결된 제4도에서 A-A에 도시된 5원자 반복단위 골격을 형성하는 1-원자 인-함유 결합을 포함한다. 여기서 대응 키랄 티오닐-함유 결합(인-함유기를 S=0 부로 대신) 은 수용액에서 부적당한 안정성을 가지는 것으로 밝혀졌다.

제3도에서 소단위 B는 제4도에서 B-B에 도시된 바와같이 6-원자 반복단위 골격으로 설계되어진다. 구조B에서 5' 모르폴리노 탄소를 인기에 연결시키는 원자 Y는 황, 질소, 탄소 또는 바람직하게는 산소이다. 인으로부터 매달리는 X부는 다음중의 하나이다; 플루오린; 알킬 또는 치환알킬; 알콕시 또는 치환알콕시; 티오알콕시 또는 치환 티오알콕시; 또는 환형 구조를 포함하여 비치환, 단일치환 또는 이치환 질소. X부에 적합한 몇몇 환형 이치환 질소부는 모르폴린, 피롤 및 피라졸이다.

제3도에 소단위 C내지 E는 제4도에서 C-C 내지 E-E에 대해 도시된 바와 같은 7-원자단위길이 골격으로 설계된다. 구조 C에서 X부는 구조 B에서와 같고 Y부는 메틸렌, 황, 또는 바람직하게는 산소이다. 구조 D에서 X 및 Y부는 구조 B에서와 같다. 구조 E에서 X는 구조 B에서와 같고 Y는 O,S 또는 NR이다.

B. 소단위 합성

모르폴리노-소단위 합성을 위한 가장 경제적인 출발물질은 일반적으로 리보뉴클레오시드이다. 전형적으로 수소-결합부 또는 염기(예컨대 A,U,G,C)을 함유하는 리보뉴클레오시드가 합성되어 중합체 합성을 위한 소단위의 완전한 군을 제공한다. 적당한 리보뉴클레오시드가 이용가능하지 않을 경우에는 1-할로리보오스 또는 바람직하게는 1α-브로모글루코오스 유도체도 적당한 염기에 연결될 수 있으며 그 다음 이 뉴클레오시드 유사체는 과요오드산염 절단처리되고 생성 디알데히드는 적당한 아민에 접근하여 소망 β-모르폴리노 구조로 전환되어진다. 소단위 합성 활성 및/또는 결합에 이용되는 화합물의 반응성 때문에 일반적으로 염기의 엑소시클릭 고리 질소를 보호하는 것이 바람직하고 종종 필요하다. 이들 보호기의 선택은 (i) 보호되어질 질소의 상대적 반응성 (ii) 소단위 합성 및 결합에 관련되는 반응의 유형 및 (iii)염기 탈보호전에 완성된 중합체의 안정성에 의하여 결정된다.

매우 흔한 많은 리보뉴클레오시드염기 보호방법은 실시예1에 주어져 있다. 이 실시예에서 상세히 기술된 방법은 일반적으로 아민-보호기로 뉴클레오시드를 형성하는데 적용된다. 핵산 화학에서 사용되는 표준 염기-보호기로는 다음 기 등이 보통 적합하다: C의 N4에 대하여 벤조일; 아데닌(A)의 N6에 대하여 벤조일 또는 P-니트로벤조일; 구아닌(G)의 N2에 대해서는 아세틸, 페닐아세틸 또는 이소부티릴 및 2,6-디아미노퓨린 잔기에 대해서는 N2, N6-비스(이소부티릴).

이들 보호기들은 중합체 형성후 수산화암모늄으로 처리하여 제거될 수 있다.

때때로 친핵 염기이외의 다른 것에 의하여 쉽게 제거될 수 있는 기로 모르폴리노 소단위의 염기부를 보호하는 것도 바람직하다. β-제거 매카니즘을 통하여 강한 비-친핵염기에 의해 제거될 수 있는 적당한 염기 보호기로서는 C의 N4 및 A의 N6 모두에 대해서 2-(4-니트릴로페닐) 에톡시 카르보닐 또는 2-(페닐술포닐) 에톡시카르보닐; 및 G의 N2 및 2,6-디아미노퓨린의 N2 및 N6에 대해서 9-플루오로에닐 메톡시카르보닐 등이 있다. 이들 기들은 중합체 형성후 엄격한 무수조건하에서 강한 비친핵 염기 1,8-디아자비시클로 [5.4.0]-운데-7-센(DBU)로 처리하여 제거될 수 있다.

대표적인 모르폴리노 소단위의 합성은 특히 실시예1 내지 7에서 기술되어 있다. 제5도에 도시된 합성 도시에 관해서, 염기-보호 리보뉴클레오시드는 과요오드산 나트륨과 반응하여 일시적인 2'-3'디알데히드를 형성하고 이것은 그 다음 암모니아에 접근하여 2' 및 3' 수산기(원래 리보오스에서와 동일하게 번호를 붙임, 제1도 참조)를 가지는 모르폴리노-고리를 형성한다. 그 다음 이 화합물은 시아노보로하이드라이드나트륨으로 처리되어 고리 수산기가 환원된다. 고리질소는 트리틸 유도체화 되거나 또는 뒤이은 소단위 결합 공정을 위한 벤즈히드랄옥시카르보닐기에 의하여 바람직하게 보호된다. 보호기는 제6도에서 도시되고 실시예3 및 5에서 기술된 바와 같이 모르폴리노 소단위를 염하트리틸 또는 니트로페닐 벤즈히드랄 카보네이트와 반응시킴으로써 또는 알데히드를 1차 아민으로 반응시킴으로써 첨가될 수 있다.

뉴클레오시드 출발물질의 입체화학은 이미늄 단계에서 반응 혼합물을 pH가 약 10이상 상승하지 않거나 약 4이하로 되지 않는 한 유지된다.

상기 합성은 이용가능한 5'-수산기를 가지는 모르폴리노-고리를 생성한다. 5'-수산기는 5' 아민 및 술포히드랄(실시예6) 또는 5' 포스포네이트(실시예4)를 포함하여 다른 활성기로 전환될 수 있다.

상기 모르폴리노 합성에 있어서, 다양한 질소원 특히 암모니아, 수산화암모늄, 탄산 암모늄 및 이탄산 암모늄 등이 이용될 수 있다. 반응용액이 산화 및 모르폴리노 고리닫힘 반응동안 거의 중성으로 유지될 때 가장 좋은 결과가 얻어진다. 이것은 반응 혼합물을 계속해서 적정함으로써 또는 보다 편리하게는 암모니아원으로서 이붕산 암모늄을 이용함으로써 이루어질 수 있다. 용액이 너무 산성일 때 생성물의 수율은 낮고 너무 염기성일 때에는 소망 생성물로부터 분리하기 어려운 부산물(1' 및/또는 4' 탄소의 에피머화에 기인하는 것으로 예상)이 생성된다. 생성물 수율에 거의 효과를 미치지 않고 산화단계 전, 후 또는 그 동안에 환원제가 첨가될 수 있다. 또한 염기 보호기가 없는 리보뉴클레오시드도 연속적으로 수용액에서 산화, 고리닫힘 및 환원되어 모르폴리노 고리를 형성한다. 그러나 염기보호가 없으면 특히 시티딘의 경우에 바라지 않던 부산물의 수 및 양이 흔히 증가한다.

상기 방법에 의하여 형성된 소단위는 5'-OH, SH 또는 아민을 함유하며 이것은 하기하는 바와 같이 제2 모르폴리노 소단위에의 결합에 적합하도록 변형, 반응 및/또는 활성화 된다.

예컨대 제5도는 모르폴리노 소단위의 5'-OH가 포스포닐 결합부로 전환되어 5-원자단위 길이 골격 중합체를 형성하도록 결합되는 소단위(구조10)를 형성하는 전환단계를 도시하고 있다. 소단위 합성의 상세한 내용은 실시예4에 주어져 있다; 티오포스포닐 결합부에의 변형도 기술되어 있다.

다른 한편으로는 소단위는 모르폴리노 고리질소에 직접 또는 간접적으로 부착된 인-함유기를 포함하도록 설계되어지며 이것은 제2 모르폴리노 소단위의 5'부에 결합된다(제7)도. 이와 같은 유형의 소단위는 7-원자 반복-단위 골격의 모르폴리노 중합체를 형성하는데 적합하다.

7-원자 단위-길이 골격에 적합한 소단위의 합성예가 실시예5에 상세히 기술되어 있다(제7도에 관하여).

실시예7은 제3도에 구조E에 관하여, 중합체 형성동안 모르폴리노 구조로 전환되는 비-모르폴리노 소단위의 제조에 대해 기술하고 있다.

C. 활성화 및 커플링 반응

대개 한 소단위(보호된 모르폴리노 질소를 가짐)의 5' 수산기를 활성화시키고 이 활성화 소단위를 실시예9에서 기술된 바와같이 비보호된 모르폴리노 질소를 가지는 다른 소단위와 접촉시킴으로써 통제된, 연속적 방식으로 상기에서 제조된 소단위를 결합시킨다. 하기에서 예시되는 것과 같은 상이한 유형의 결합이 한 중합체의 구성에 이용되어진다는 사실을 인식하여야 하겠다.

가장 단순한 모르폴리노-형 결합 중합체는 모르폴리노 질소가 다른 소단위의 5' 산소에 카르보닐기를 통하여 연결된 카르바메이트-연결 중합체들이다.

본발명을 뒷받침하기 위해 실시된 실험결과들로부터 이와 같은 중합체가 단일-가닥 DNA 표적서열에 효과적으로 결합한다는 사실을 알수있다. 그러나 RMA 표적으로 실시한 결합 연구에서는 중합체 320 내지 230nm 스펙트럼 범위에서 높은 비전형적 흡광감소성프로필 및 정상적인 열변성의 결여에 의하여 증명되는 바와 같이 중합체는 비정상적 결합을 나타냈다.

초기 모델 연구결과는 B형으로 존재하는 DNA에 결합된 카르바메이트-결합 중합체에서 중합체의 골격이 결합의 적당한 길이를 제공하며 중합체 골격의 카르바메이트부는 거의 평면구조를 이룬다는 사실을 나타냈다. 이 모델 결과는 DNA에 카르바메이트- 결합 중합체의 효과적인 결합과 잘 일치한다. 이와는 반대로, 유사한 모델 연구에서 RNA 표적에 카르바메이트-결합 중합체의 결합이 다음의 하나를 필요로 한다는 사실을 제시하고 있다 : (i) 중합체의 카르바메이트 결합은 실질적으로 비평면 구조를 이루거나 또는 (ii) RNA 표적 서열은 염기-스태킹 상호작용이 정상적인 A형 구조에서와는 상당히 다른 찌그러진 구조를 이룬다. 이와 같은 관찰 사실은 RNA 표적 서열에 카르바메이트-결합 중합체의 비전형적 결합을 설명할 수 있다.

또한 모델 연구결과는 아키랄 술포닐-함유 소단위간 결합 또는 키랄 인-함유 결합으로 카르보닐 소단위간 결합부를 대체함으로써 소단위간 결합당 약 0.32Å의 증가된 길이가 제공된다는 사실을 나타냈다. 또한 이와 같은 결합은 주 결합에 대해 더 큰 자유회전성, 및 이들의 표준 구조에서 RNA 및 DNA 표적서열과 쌍을 짓기에 적합한 올리고머 골격 구조와 화합가능한 소단위당 결합의 결합각을 제공한다. 제4도에서 구조 A-A의 결합(5- 원자 골격)은 실시예8에서 상세히 기술되고 제9도에 도시된 반응도식에 따라 형성될 수 있다. 간략히 모르폴리노 소단위의 5'-OH는 실시예4에 기술된 바와 같이 인-함유부로 전환된다. 이 기는 실시예9에서 상세히 기술되고 제9도에서 도시된 바와 같이 활성화되고 비보호된 고리 질소를 가지는 제2 소단위에 결합되어진다. 중합체 형성은 이합체의 모르폴리노 고리 질소를 탈보호하고 이합체를 제3의 활성 소단위와 반응시킴으로써 계속되어 진다.

제4도의 구조 B-B(6-원자 단위- 길이 골격)에서 포스포아미드 결합은 실시예9에서 상세히 기술되고 제10도에서 도시된 반응도식에 따라 형성될 수 있다. 보호된 소단위(제5도의 구조4)의 5' 수산기는 디클로로-N,N-디메틸아미노 포스페이트 등과 같은 적당한 인-함유 화합물과 반응하여 활성 소단위를 형성한다. 그 다음 소단위는 탈보호된 모르폴리노 고리 질소를 가지는 제2 소단위와 반응한다. 펜던트 X부는 많은 다양한 변형이 가능하며 실시예9에서 기술된 바와 같이 X부의 실체는 활성화 및 결합의 용이성 형성 결합의 안정도 및 어느 정도는 표적- 결합친화성에 영향을 미친다.

A-A 및 B-B 결합의 합성에 있어서, P=0 기는 근본적으로 P=S 기와 상호교환가능하다. 어느 하나와의 반응은 일반적으로 다른 하나에도 적용할 수 있다.

포스포아미드 및 포스포노에스테르 결합뿐만 아니라 제4도의 B-B 유형의 결합을 형성하는 다른 방법은 카르보디이미드 결합을 이용하는 것이다. 예로서 카르보디이미드는 디시클로헥실카르보디이미드(DCC)이다. 카르보디이미드결합은 실시예 8,9 및 10에 기술되어 있다. Smith et al(1958)의 관찰사실을 탐구한 바에 따르면 카르보디이미드 시약도 (a)인 (또는 티오인) 결합부를 소단위에 첨가하거나 또는 (b) 펜던트 X부를 인(또는 티오인) 결합부에 부착하는데 이용될 수 있다.

유형 B-B(제4도)의 다른 부가적 결합은 소단위를 활성화하여 중합체로 결합시키기 전에 다른 가능기(예컨대 SH, CH₂, NR)로 5' 히드록실 전환함으로써 형성할 수 있다.

모르폴리노 소단위로부터 제조된 많은 7- 원자 단위길이 골격(제4도의 구조C-C 및 D-D에 대응)은 염기-페어링부 사이에 특징거리를 가지는 중합체의 구조에 더 높은 유연성을 허용한다. 7-원자 단위 길이 결합을 이용하여, 모르폴리노-소단위 사이의 거리, 결과적으로 염기-페어링부 사이의 거리는 길어질 수 있다. 소단위간 결합의 이와같은 신장은 제8도에서 도시된 결합형태를 통하여 B-형 구조의 이중나선 유전서열을 표적으로 할 때 특히 유용하다.

7-원자 골격 중합체는 실시예10에서 기술된 일반적 결합 반응을 이용하여 상기한 바와 같이 형성된 소단위 C 및 D로부터 용이하게 합성될 수 있다. 예컨대 제4도의 구조 C-C는 (a)소단위 C(제3도)의 인산염(또는 티오인산염)을 카르보디이미드와 반응시키고 (b)활성 소단위를 비보호 모르폴리노 고리질소를 가지는 제2 소단위와 결합시킴으로써 생성될 수 있다.

이와 유사하게, 제4도의 구조 D-D는 실시예10에서와 같이 인산염(또는 티오-인산염)을 카르보디이미드로 활성화시키고 활성화 소단위를 비보호 5'산소, 황 또는 아민을 가지는 제2 소단위와 결합시킴으로써 생성될 수 있다.

제4도의 구조D-D/E-E에 대응하는 결합를 형성하는 신규방법은 한 소단위의 비시닐 히드록실을 산화시키고(제3e도) 생성된 디알데히드를 다른 소단위의 1차 아민에 접근시킨 후 시아노보로하이드라이드로 환원시키는 공정을 수반한다. 원칙적으로 이와같은 도식은 한 소단위의 2차 아민과 제2 소단위의 모노-알데히드를 결합시키는 데에도 사용될 수 있다. 그러나, 1차 아민에 리보오스-유도 디알데히드의 커플링은 실질적으로 빨리 진행되며 더 나은 수율을 제공한다. 실시예7은 5'에 1차 아민을 함유하는 리보뉴클레오시드의 합성을 기술하고 있다.

제12도에서 기술된 바와 같이 모르폴리노 중합체의 형성에 이들을 사용하는 것이 실시예11에 기술되어 있다.

D. 중합체 어셈블리

바람직한 중합체길이 및 인식부 서열을 선택한후(이에 대한 지침은 하기에 주어져 있음), 상기한 바와같은 일반적 공정에 따라 중합체를 어셈블리한다. 중합체를 어셈블리하는 한 방법은 올리고머 블럭의 적당한 세트를 처음에 제조한후 그 다음 이들 블럭을 연결시켜 최종 길이의 중합체를 어셈블리하는 것으로 관련된다. 중합체 합성에 사용된 올리고머 블럭은 동일한 크기일 필요는 없다.

이들 블럭은 실질적으로 실시예12 및 13에서 참고로 기술된 결합방법에 따라 용액에서 체크한다. 실시예13에서는 5합체를 형성하기 위한 블럭의 합성을 개괄적으로 기술하고 있다.

블럭어셈블리방법의 특별한 잇점은 전체길이의 중합체의 형성에 있어 결합상의 잘못은 소망 중합체로부터 쉽게 분리되는 잘못된 서열을 발생시킨다는 점이다. 실시예12는 이 방법에 의한 단순한 단일중합체의 어셈블리에 대해 기술하고 있다. 실시예13은 이중형 중합체에 사용하기에 적합한 블럭의 제조에 대해 기술하고 있다.

실시예14 및 15는 생물학적으로 활성인 이형 중합체를 형성하는 블럭의 어셈블리에 대하여 기술하고 있다. 따라서 실시예13,14 및 15는 모두 올리고머 블럭이 단계적으로 용액에서 모으고 난 다음 이들 올리고머들이 전-길이 중합체로 결합되는 어셈블리방법의 조합을 이용하는 합성법에 대해 기술하고 있다.

또한 실시예16에서 기술된 바와같이 고체 지지체상에 단계적인 소단위 첨가에 의하여서도 중합체가 합성된다.

일반적으로 산-안정성의 긴-사슬 절단가능 링커로 유도체화된 유리 비이드등과 같은 고체 지지체가 고체상 합성을 위한 지지체 물질로서 사용되어 실시예15 및 16에서 기술한 바와 같이 소단위 블럭 또는 제1 소단위의 부착을 위해 제조된다. 유리 비이드는 일반적으로 질소상에 용이하게 절단가능한 보호기를 가지는 소단위와 반응한다. 모르폴리노소 단위가 5' 위치에서 자체 모르폴리노 질소 또는 5' 위치의 기를 통하여 지지체에 결합되는지의 여부는 다음 소단위가 부착되어질 방향 즉 중합체 합성방향에 좌우된다.

제2 소단위(또는 용액에서 결합된 올리고머)를 지지체에 결합시킨 후 반응되지 않은 원핵부위는 P-니트로페닐 아세테이트 또는 무수 아세트산 등의 적당한 캡핑시약을 첨가하여 캡핑시킨다. 그 다음 지지체를 세척한다. 말단 소단위의 질소상의 보호기는 산 처리하여 제거하고 중화시킨 후 지지체는 상기에서 개괄된 한 방법에 따라 활성화된 과량의 다음 서열의 소단위(또는 중합체 단위)와 반응시킨다.

단량체 소단위의 단계적 첨가공정을 이용하는 고체 지지체 어셈블리방법의 한 특징은 각 소단위 첨가단계에서 높은 커플링 효율이 요구된다는 점이다. 이와같은 높은 커플링 효율은 일반적으로 신장되는 지지체-결합 사슬의 수를 최대로 하는 활성 소단위 과량을 첨가함으로써 이루어진다. 사슬 신장은 소망길이 및 서열의 중합체가 이루어질때까지 각 소단위 첨가후 결합 서열의 선택적 캡핑단계와 함께 이와같은 방식으로 계속되어진다.

최종 소단위의 첨가후 말단 골격부는 실시예12에서 기술한 바와 같이 적당한 전하 또는 비전하기와 반응할 수 있다. 그 다음 지지체-결합 중합체에 대하여 중합체는 예컨대 지지체에 중합체를 결합시키는 링커에 β-제거반응을 일으키게 하는데 적합한 비-친핵 염기 또는 수산화암모늄으로 처리함으로써 절단된다. 염기는 탈보호되고 중합체는 실시예 12, 14, 15 및 16 그리고 하기에서 기술하는 바와 같이 정제된다.

E. 중합체 프로세싱(Processing)및 정제

용액에서 어셈블리된 결합중합체(실시예12및 14)는 전형적으로 DMSO 또는 DMF에 현탁되고 현탁액에 진한 수산화암모늄 동일부피량을 적층함으로써 염기-탈보호된다. 이 제제를 캡핑하고 그 다음 진동시키면서 혼합하고 30℃에서 16시간 배양하였다. 조작공정(workup)에는 감압하에서 암모니아를 제거하는 단계도 포함한다. 보호기(일반적으로 트리딜 또는 산-불안정부)가 존재한다면 이 기는 분리되고 조 중합체 제제는 정제를 위하여 적당한 완충용액에 현탁된다. 에스테르 결합을 통하여 지지체에 결합된, 고체상 방법(실시예15 및 16)에 의해 어셈블리된 결합 중합체는 DMS에 건조 지지체를 현탁하고 진한 NH₄OH 동일부피량에 적층하고 단단하게 캡핑하고 그리고 천천히 30℃에서 16시간 휘저음으로써 지지체로부터 분리될 수 있다. 고체상 물질은 여과로 제거하고 여과물은 상기한 바와같이 처리하였다.

한편, β-제거반응에 민감한 링커를 통하여 지지체에 결합된 결합 중합체는 DMF에서 강력한 비친핵성염기 1,8-디아주비시클로(5.4.0) 운데-7-센(DBU)을 이용하여 지지체로부터 분리될 수 있다. 이 방법에 따라 여전히 염기 보호된 중합체를 유리할 수 있으며 따라서 이 중합체는 FAB(fast atom bombardment) 질량분광계를 통하여 다른 변형 및/또는 구조확인에 적합하다.

염기-탈보호 중합체의 정제는 중합체 염기부의 pK에 따라서 pH 2.5 또는 pH 11에서 실시하는 것이 바람직하다. pH 2.5에서 시토신, 아데신, 및 2,6-디아미노퓨린부는 양전하를 띠며 구아닌은 부분적 양전하를 띤다. pH 11에서, 우라실 및 히포크샨틴은 음전하를 띤다. pH 2.5에서 30% 또는 그 이상의 염기 페어링부가 이온화된 중합체에 대하여, 경제공정은 pH 2.5에 완충된 완만한 NaCl 구배로 전개된 S-Sepharose fst-flow(Pharmacia)컬럼상에서 양이온 교환에 의해 실시한다. 254nm에서 용출물을 모니터하고 단편 콜렉터로 모았다. 더 짧은 결합서열(failure sequence) 다음에 용출되는 전-길이 중합체는 다시 포름산으로 pH 2.5에 조정된 메탄올 또는 아세토니트릴 액상 구배로 용출된 크로마토그래피용 폴리프로필렌컬럼(Polysciences Inc.)에서 탈염하고 정제하고, 용출물을 254nm에서 모니터하였다. 순수 생성물을 함유하는 단편은 중화하고 감압하에서 건조하였다. 트리플루오로에탄올에 중합체를 용해하고 여과하고 트리플루오로에탄올을 증발시켜 염을 제거하였다.

pH 11에서 30% 또는 그 이상의 염기쌍부가 이온화되는 중합체에 대한 정제는 NaCl의 액상 pH 11 구배로 전개된 Q-Sepharose fast flow 음이온 교환컬럼(Pharmacia)에서 실시한다. 더 짧은 결항서열 다음에 용출되는 전-길이 중합체는 다시 아세토니트릴의 액상 pH 11 구배로 용출된 폴리프로필렌 컬럼상에서 탈염하고 정제하였다. 순수 생성물을 함유하는 단편은 상기한 바와 같이 처리한다.

상기 기술된 정제방법은 아데닌 염기페어링부를 함유하는 중합체가 유력한 염기 불안정성 문제를 회피하기 위하여 실온에서 수시간 이상 pH 11에서 노출되지 않도록 실시되어야 한다.

정제방법에 대해 상세한 내용은 실시예 12,14 및 15 에 개괄되어 있다.

중성 수용액에서 더 긴 모르폴리노 중합체는 기대했던 것보다 낮은 용해도를 가진다. 그러므로 예컨대 폴리에틸렌글리콜과 같은 하나 또는 그 이상의 친수부를 첨가함으로써 중합체의 용해도를 증가시키는 것이 바람직하다. 본 명세서에서 개시되는 대부분의 중합체 유형에 대해서는 이 과정은 완전한 중합체로부터 말단 골격보호기를 분리시키고 여전히 보호된 상태의 염기를 가지는 중합체를 과량의 카르보닐디이미다졸-활성 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 반응시킴으로써 이루어질 수 있다. 그 다음에 결합 중합체는 수산화암모늄으로 처리하여 염기-보호기를 제거하고 중합체는 상기에서와 같이 정제한다. 용해수준은 PEG 물질의 바람직한 선택에 의해 쉽게 조정된다. 200,400,600,1000,1540,3400,4000,6000,7500 및 18500달톤의 평균분자량을 가지는 적당한 PEG 단편은 상업적으로 입수가능하며(예컨대 Polysciences, Inc.), 보통 PEG 1000이 가장 우수한 용해성을 제공한다. 용해부는 필요하다면 분리가능한 결합을 통하여 중합체에 결합되어 중합체가 예컨대 에스테라아제 또는 펩티디아제 효소등에 의하여 용해제로부터 유리하게 한다.

중합체는 공지방법에 따라 더욱 유도체화 또는 표식화될 수 있음을 인식하여야 한다. 예컨대 중합체는 방사표식 리보튜클레오시드로부터 중합체 소단위를 제조하거나 또는 한 말단에 방사표식된 아미노산을 부착시킴으로써 방시표식될 수 있다. 중합체는 예컨대 상기 소단위 결합반응의 변형을 이용하여 효소, 발색기 등으로 용이하게 유도체화될 수 있다. 여기서, 중합체는 진단 프로브로서 사용되어진다. 또한 중합체는 특정 조직 또는 세포유형에 중합체를 표적화하는 생체분자로 유도체화 될 수도있다.

F. 구조 특성확인

종간크기(10 내지 20 소단위)의 완전히 보호된 결합 중합체는 종종 FAB(fast Atom Bombardment) 질량 분광계에서 강한 분자이온을 생성하는데 이것은 중합체 길이를 확인하게 하는 주요사항이다.

더욱이 탈보호 및 정제된 중합체의 COSY-NMR(2차원 상관 분광계)은 중합체의 상이한 염기-페어링부의 비율에 대한 정보뿐만 아니라 결합되어질 용해부 또는 기타 유형의 부에 결합하는 중합체의 비율에 대한 정량적인 정보를 제공한다.

또한 이온교환컬럼상에서의 이동성은 pH 2.5에서 정제를 실시할때 중합체에 C+A염기페어링부의 수에 대한 정보 및 pH 11에서 정제를 실시할때 G+U 잔기의 수에 대한 정보를 제공한다.

결항서열은 전-길이 서열과 실질적으로 더욱 상이하기 때문에 중합체와 실시예12, 14 및 15에서와 같은 올리고머 블럭으로부터 어셈블리되어질때 구조적 증명이 가장 용이하다.

pH 1.7 및 13에서 중합체의 UV 프로필은 중합체의 상대적 뉴클레오티드 조성에 대한 정보를 제공한다. 표적 서열에 대한 모르폴리노-기저 중합체의 진화성의 평가는 실시예12에서 예시된 바와 같이 중합체/표적 이중사슬의 융해곡선을 조사함으로써 실시될 수 있다. 또한 정규 헥산 이중나선(예컨대 p(dC)₆/p(dG)₆)의 융해곡선과 대응 모르폴리노-기저 중합체(예컨대 (모르폴리노 C)₆/p(dG)₆)을 함유하는 하이브리드 이중나선의 융해곡선의 비교도 실시하였다.

상기 특성확인 단계는 실시예12에서와 같이 Y는 산소, X는 N(CH₃)₂및 Z는 산소인 모르폴리노- 기저 포스포디이미데이트- 결합 폴리(C) 6 합체에도 실시하였다. 전-길이 롤리고머의 특성확인은 양성자 NMR 및 음이온 FAB 질량 분광계로 이루어졌다. 이들 모르폴리노 올리고머로는, 올리고머의 단편화는 크게 억제되어서 서열 정보에 대해서는 거의 얻을수가 없게 된다. 그러나 본래의 이온 시그날은 매우 강하여서 모르폴리노 올리고머의 조성을 확인할 수 있게한다. (실시예12 참조). 수용해성을 증가시키기 위하여 폴리에틸글리콜(PEG) 꼬리를 올리고머에 부착시켰다. PEG 1000의 5 당량을 비스(p-니트로페닐) 카보네이트 1당량으로 처리하여 단일활성 PEG를 얻었다. 트리플루오로에탄올에서 1% 아세트산으로 6합체를 탈-트리틸화시키면 자유 모르폴리노 고리질소가 이용가능하다. 자유 아민을 함유하는 6합체를 표준 결합조건하에서 활성 PEG 1000 으로 처리하여 6합체에 PEG 꼬리를 부착하였다. 염기는 24시간 진한 암모니아로 꼬리달린 6합체를 처리함으로써 탈보호하였다. 꼬리달린 6합체는 pH 2.5 완충용액에서 채취하여 염화칼륨구배로 용출된 S-Sepharose fast flow^TM상의 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 중화시킨 후 용출물은 물/아세토니트릴 구배로 용출되는 폴리프로필렌컬럼상에서 탈염시켰다. 꼬리달린 6합체는 pH 7.5 완충용액에서 자유로이 용해가능한 것으로 밝혀졌다.

꼬리달린 6합체와 상보 헥산의 복합체의 안정성은 열변성 실험에서 조사하였다. 꼬리달린 6합체와 선택된 포스포디에스테르 상보체의 혼합 및 비혼합 샘플간의 스펙트럼차이는 14℃ 내지 85℃에서 320내지 260nm 파장 범위에서 얻어졌다(실시예12).

C 단량체의 60 마이크로몰농도 및 G 단량체의 60 마이크로몰농도에서 폴리(dG)와 꼬리달린 6합체(morp C)₆의 UV 스펙트럼 차이는 79℃의 Tm 수치를 나타냈다. 대응(morp C)₆와 β폴리(G)는 51.5℃의 Tm 수치를 나타냈다(실시예12 및 제13도 참조).

G. 진단방법에의 이용

본 발명의 표적-특이적 중합체는 특정 표적서열을 가지는 RNA 또는 DNA을 검출하기 위한 다양한 진단분석법에 이용될 수 있다. 일반적으로 한 이용분야에서 중합체는 적당한 방사표식 또는 기타 검출가능 표시기로 표식된다. 표적 폴리뉴클레오티드, 전형적으로 고체 지지체에 결합된 단일가닥 폴리뉴클레오티드, 혼성화 조건하에서 중합체와 반응하고 어닐링된 후 샘플을 중합체 표시기의 존재 여부에 대하여 검사한다.

진단분석법은 표적영역과 중합체의 혼성화를 가능하게 하는 혼성화 조건을 적당하게 조절하여 표준 공정에 따라 실시될 수 있다. 또한, 중합체는 중합체 결합이 골격 전하 반발효과를 수반하지 않기 때문에 상보적 폴리뉴클레오티드, 가닥보다 더 높은 융해온도에서 표적과 혼성화하도록 디자인될 수 있다. 그러므로 중합체는 정상적인 폴리뉴클레오티드 용액온도 이상의 온도에서 표적과 결합할 수 있다. 이것은 종래의 올리고 뉴클레오티드 프로브에 대한 중합체의 장점의 하나이다. 고온에서의 이 결합은 프로브와 진단·혼합물에 존재할 수도 있는 대응 단일-가닥 올리고 뉴클레오티드 사이에 표적에의 결합에 대한 경쟁 문제점을 최소화시킨다.

제2의 일반적인 진단 이용 유형에서 중합체는 지지체에 표적 RNA 또는 DNA 의 포획을 위하여 고체 지지체에 결합된다. 고체 지지체 예컨대 중합체성 미세입자는 상기 방법에 따라 지지체의 중합체를 결합시킴으로써 또는 종래 유도체화 공정에 따라서 제조될 수 있다. 한편 중합체가 지지체상에서 합성될 경우 이 지지체도 분석 지지체로서 작용한다.

본 분석 시스템의 한 특징에 따라, 중합체에의 염기-특이적 결합에 의하여 지지체상에 포획된 표적 폴리뉴클레오티드 분자는 지지체-결합 중합체자체가 실질적으로 전하를 띠지 않기 때문에 이들의 골격 전하에 근거하여 검출될 수 있다. 부가하여 분석시스템은 선택된 결합 조건하에서 완전하게 전하를 띤 분석체 골격에는 전하를 띠지 않는(또는 실질적으로 비전하의) 중합체 골격에는 결합하지 않도록 설계되어진다-양이온성 표시기 분자도 포함한다. 일 구체예에서 표시기 분자는 표시기가 진단시약에 담지된 다소 미약한 전하 또는 비전하 결합 중합체에는 결합하지 않는 조건하에서 다-양이온성부로 구성되거나 또는 완전하게 전하를 띤 폴리뉴클레오티드에 정전기적으로 결합하도록 꼬리 설계되어진다. 하나 또는 그 이상의 표시기는 꼬리에 부착되어, 표시기의 존재가 검출되어질 수 있는 시그날을 형성하도록 수정되어진다.

다-양이온 분자를 형성하고 양이온 화합물에 표시기 분자를 부착시키기 위한 방법은 문헌에 공지되어있다.

각 표시기 문자는 하나 또는 그 이상의 표시기를 가지며 각 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 수천 또는 그 이상의 표시기 분자의 결합을 도모할 수 있다. 따라서 이 시스템은 결합된 분석체 분자당 표시기 시그날로 환산하여 몇차수 크기의 증폭계수를 가진다. 또한 본 발명은 상보 뉴클레오티드 가닥과의 결합 경쟁이 일어나지 않는 조건하에서 폴리뉴클레오티드 결합반응이 실시될 수 있다는 상기에서 주지된 장점을 가진다.

진단시약으로서 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드 결합 중합체를 제조하는데 적용되는 설계 고려사항은 분석체가 분석되어질 반응 조건 및 표적 분석체의 성질에 좌우된다. 첫번째 고려사항에서는, 중합체가 결합될 비-단일 중합체성 표적 염기서열을 선택하는데 있다. 이 표적서열은 일반적으로 단일-가닥이며 분석될 분석체에 독특한 것이 바람직하다.

주어진 n- 염기 표적서열의 발생 가능성은 대략(1/4)ⁿ이다.

따라서 주어진 n-염기 표적서열은 4ⁿ염기를 함유하는 중합체에서 대략 1개 발생하는 것으로 기대할 수 있다. 그러므로 주어진 n-염기 서열이 전부 N개의 단일-서열 염기 모두를 함유하는 폴리뉴클레오티드에서 발생할 활률 P는 대략 P=N/4ⁿ이다. 예컨대 9-염기 표적서열이 20kb 폴리뉴클레오티드에서 발견될 확률 P는 약 20×10³/2×10⁵또는 0.08 이며 16-염기 표적서열이 존재할 확률은 약 20×10³/4.3×10⁹또는 0.0000047이다. 이러한 계산으로부터 한정된 9 내지 16 염기 표적 서열에 특이적인 9 내지 16 인식부를 가지는 중합체는 가장 높은 복합도가 단일-서열 염기의 약 400K에 해당하는 바이러스 게놈만을 함유하는 분석 혼합물의 표적서열에 높은 특이성을 가진다는 사실을 알 수 있다.

유사한 계산 결과로부터 12 내지 16 소단위 중합체는 가장 큰 게놈크기가 약 5000 kb인 바이러스 및 박테리아 게놈 물질만을 함유하는 분석 혼합물의 바이러스 또는 박테리아 표적 서열에 바람직한 특이성을 제공할 수 있음을 알 수 있다. 16 내지 22 소단위 중합체는 단일- 서열 DNA의 약 50억 염기쌍 게놈크기의 포유동물 게놈 DNA 물질을 함유하는 폴리뉴클레오티드 혼합물의 표적서열에 적합한 특이성을 제공할 수 있다. 중합체/분석체 결합친화성, 및 특히 중합체가 단지 표적서열과 결합하는 온도(융해온도, Tm)는 다음 조건에 따라 선택적으로 변화할 수 있다:

(a) 중합체의 소단위 수, (b) 염기페어링부와 분석체 표적서열의 대응 상보적 염기사이에 형성될 수 있는 소수결합의 수, (c) 중합체 골격의 단위길이, (d) 특정 소단위간 결합 및 (e) 융해온도를 낮추는 예컨대 포름아미드등의 변성제의 농도.

모델 헥산 이중사슬에 대한 많은 연구 결과로부터 10 내지 20 bp 범위의 올리고뉴클레오티드 이중사슬의 융해온도는 두 소수결합에 의하여 형성된 부가적 염기쌍마다 대략 3℃ 증가하며 세 수소결합에 의하여 형성된 부가적 염기쌍마다 약 6℃ 증가한다. 그러므로, 중합체와 높은 결합 특이성을 보장하도록 처음부터 선택된 표적서열 길이를 선택한 분석조건하에서 소망 융해 온도를 달성하도록 연장될 수도 있다.

또한 중합체의 형성에 사용된 인식부가 표준 헥산염기인 경우에 표적서열은 상대적으로 높은 중합체/분석체 융해온도를 달성하기 위하여 높은 구아닌+시토신 염기 비율을 가지도록 선택될 수 있다. 한편, 더 낮은 융해온도를 달성하기 위하여서는 비교적 높은 아데닌+티민염기 비율을 가지는 표적 서열을 선택한다.

진단시스템의 결합구성분은 기술한 바와같은 고체-지지체 진단 방법에서 기능하기 때문에 제14도에 예시되어 있다. 이 도면에서 분석 시제S는 파선으로 표시된 스페이서 암(spacer arm)을 통하여 표면에 부착된 많은 결합 중합체를 가지는 고체 지지체이다. 분석 공정에서 단일 가닥형의 표적 DNA는 혼성화조건하에서 지지체-결합 중합체와 반응하고 그 다음 고체지지체는 비-혼성화 핵산물질을 제거하기 위하여 세척한다.

그 다음 세척된 지지체는 표적 DNA 골격에 표시체 양이온부의 정전기적 결합에 바람직한 조건하에서 표시기와 반응한다. 제14도에 도시된 표시체는 표시기 R을 가지는 2-양이온성 분자이다. 전형적으로 상온에서 수초동안 표시체 용액과 반응후 시제는 비결합 표시체를 제거하기 위하여 세척하고 그 다음 분석시제는 결합 표시체에 대해 분석한다. 특히 형광 또는 발색 표시체기의 경우에 시제에 결합된 표시체의 양을 측정하는 한 방법은 높은 염 용액으로 시제로부터 표시체를 용출시키고 그 다음 용출물을 표시체에 대하여 분석한다.

본 발명의 중합체는 이중나선의 대-그루우브로 접근가능한 염기쌍-특이적 수소결합부위를 통하여 이중나선 헥산에 서열 특이적 결합을 이룬다. 이 결합은 한 가닥에 적어도 70% 의 염기가 퓨린이고 다른 한 가닥의 염기의 대응 비율이 피리미딘인 이중나선영역에서 일어난다. 이중나선결합 중합체는 제8도에서 예시된 바와같이 바람직하게는 T-A 또는 U-A염기쌍에의 결합을 위한 2,6-디아미노퓨린 수소결합부 및 C-G 염기쌍에의 결합을 위한 구아닌 수소 결합부를 포함한다. 따라서 이들 특별한 표적서열에 대하여 본 발명의 중합체는 기술한 유형의 진단 분석법에 이용될 수 있다. 표적 헥산은 비변성 이중나선형태이다.

H. 기타 이용

본 발명의 중합체는 많은 표준 실험공정을 위한 표준 RNA 또는 DNA 올리고머를 대신해 사용될 수 있다. 상기 언급한 바와같이 모르폴리노- 기저 중합체는 예컨대 폴리A 단편으로부터 특정 mRNA 을 정제하기 위하여 고체 지지체에 고정되어 상보적 핵산서열을 분리하는데 이용될 수 있다(Goldberg et al.).

이 중합체는 저렴하고 활성 소단위로부터 바로 제조되기 때문에 이와같은 이용에 바람직하다.

분자 생물학의 다양한 응용 분야에서도 표식 모르폴리노-기저 중합체를 이용할 수 있다. 모르폴리노-기저 중합체는 상기한 바와 같이 중합체 합성 최종 단계에서 표식된 합성 모르폴리노-기저 소단위 또는 바람직하게는³⁵S-표식 메티오닌의 합입에 의하여 용이하고 효과적으로 말단-표식된다. 사용되는 표식의 유형은 중합체의 최종 이용에 좌우되며, 이들 표식은 방사성(³H,¹⁴C,³²P 또는³⁵C)뉴클레오시드 또는 아미노산, 또는 비오틴 등이다. 표식 모르폴리노-기저 올리고뉴클레오티드 유사체는 예컨대 콜로니 혼성화(Grunstein et al). RNA 혼성화(Thomas), DNA 혼성화(Southern) 및 유전자 뱅크 스크리닝(Szostak et al) 등에서 효과적인 프로브로서 작동한다.

또한 본 발명의 중합체는 안티센스 요법제로서 유력하게 이용된다. DNA와 거의 구조가 유사한 많은 비전하 헥산 유사체들은 항-바이러스 및 항-암 제제로서 사용되어 왔다. 본 발명의 모르폴리노-기저 중합체는 HIV-I(Human Immunodeficiency Virus)에 대해 인비트로(in vitro)테스트하였다. HIV-I의 프라이머 결합부위에 상보적인 16-합체(Myers et al.)은 대략 35% 정도 바이러스 P24 단백질 합성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다(실시예14 및 15). 대응 비감염 세포에서 모르폴리노-기저 중합체는 뚜렷한 세포독성을 야기하지 않았다.

또한 본 발명의 중합체는 쥐의 HSV-I(Herpes Simplex Virus I)안구 감염에 대해 생체(in vivo) 테스트를 실시하였다(실시예16). HSV-I의 스플라이스 접합부위에 상보적인 12-합체는 HSV-I에 안구 감염된 쥐를 보호하는 능력에 대해 테스트되었다. 비감염 쥐는 감염 5일째에 65% 생존율을 나타낸 반면 모르폴리노-기저 중합체를 함유하는 국소연고로 치료된 쥐는 90%의 생존율을 나타냈다.

상기 기술된 모르폴리노-기저 중합체의 생체내 및 시험관내 항-바이러스 특성 이외에 본 발명의 중합체는 종래의 안티센스 제제보다 더 많은 장점을 제공한다.

첫번째로, 모르폴리노 중합체는 데옥시리보뉴클레오시드-유래 중합체보다 합성하는데 비용이 적게든다. 이 사실은 중합체 합성에 이용된 모르폴리노 소단위가 데옥시리보튜클레오시드보다 더욱 싸고 흔한 리보뉴클레오시드로부터 유례한다는 사실에 부분적으로 기인한다. 또한 상기에서 주지한 바와같이 제2 소단위의 아민과 인사이 커플링 반응은 비교적 순한 조건하에서 일어나 보호단계 및 원하지 않았던 반응을 회피하기 위한 예방수단이 단순화된다. 이것은 인산염 에스테르 결합을 통한 커플링이 커플링 시약이 매우 반응성이 강하고 이 반응이 엄격한 반응/보호 조건하에서 실시되어야 함을 필요로 하는 표준 리보-및 데옥시리보 뉴클레오티드 중합체 합성과는 대조적이다. 또한 이와 같은 중합체 합성의 장점은 물론 중합체의 진단 이용에도 적용된다.

두번째로, 표적에의 중합체의 결합은 모르폴리노 중합체/표적 이중나선이 세포에서 이중나선 풀림 메카니즘에 민감하지 않기 때문에 DNA-형 안티센스 제제보다는 더 우수한 표적 불활성화를 나타낸다.

세번째로, 모르폴리노-기저 중합체는 또한 모르폴리노 중합체 골격 결합이 세포 뉴클레아제에 의한 절단에 민감하지 않기 때문에 DNA, RNA 및 이들의 티오인삼염- 결합 유사체보다 훨씬 더 세포내에서 안정하다.

네번째로, 화합물의 세포흡수에 관련되는 치료이용분야에서 비전하 모르폴리노 중합체는 전하를 띤 올리고뉴클레오티드보다 훨씬 더 효과적으로 세포에 침투한다.

치료 분야에서 본 발명의 모르폴리노 중합체는 제8도에서 예시된 바와 같이 한 가닥이 주로 퓨린을 함유하고 다른 가닥은 주로 피리미딘을 함유하는 이중-가닥 유전서열을 표적으로 한다.

또한 전령 RNA가 이중나선 표적 서열이 거의 퓨린인 가닥으로 코드될 때 이중나선에 표적된 모르폴리노 결합 중합체는 mRNA를 불활성화시키는 잠재력을 가진다. 따라서, 이 중합체는 단일-가닥 및 이중-가닥등 모든 형태의 병원체의 유전서열을 불활성화시키는데 잠재력을 가지고 있다.

1981년 원핵생물 mRNA의 샤인-달가노 공통 서열의 일부에 상보적인 짧은 (3 내지 7 소단위) 메틸포스포네이트-결합 DNA 유사체가 박테리아 용해물 및 특정 박테리아 침투 균주에서 박테리아성 단백질 합성을 방해하는데 효과적이라는 사실을 보고 되었다. 그러나 이 제제는 정상 박테리아에서 단백질 합성을 억제하지 못하였다(Jayaramon, 1981).

본 발명을 뒷받침하기 위해 실시한 실험결과로부터 3 내지 5 소단위 길이의 중합체가 고 표적- 결합 친화력을 초래하는 염기 조합을 이용함으로써 정상박테리아에서 단백질 합성을 차단하는데 효과적이다라는 사실을 알 수 있다.

좀더 구체적으로, 다음 올리고머와 올리고머의 조합은완전한 정상 박테리아에서 단백질의 합성을 방해할 수 있다(D는 2,6-디아미노퓨린 또는 아데닌; G를 구아닌, B는 5-브로모우라실, 기타 5-할로우라실 또는 우라실, 그리고 서열은 좌측에 5' 말단으로 도시되어 있다):

DGG, BDDG, DDGG; DGGD; GGDG; GDGG; DGGB; GGBG; GGAGG; GGDAA; 및 조합 BDD + GGDG; DDG + GDGG; DGG + DGGB; GGD + GGBG; BDDG + GDG; DDGG + DGG; DGGD + GGB; GGDG + GBG; BDD + GGDG + GBG.

유기체의 표적군의 대사작용에 중요한 역할을 하지만 더 고등 유기체에서는 그에 상당하는 주요 기능을 하지 않는 RNA 서열의 생물학적 활성을 방해하기 위한 짧은 결합-증진 올리고머의 이용은 더 긴 중합체의 침입을 배제하는 세포벽을 가지는 다양한 병원성 유기체(예컨대 박테리아 및 곰팡이)에 폭넓게 적용되어질 수 있어야 한다.

다음 실시예를 통하여 본발명의 소단위 및 중합체 합성방법, 그리고 중합체 조성물의 이용을 예시하고자 한다. 이들 실시예는 결코 본발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

[실시예 1]

리보뉴클레오시드의 염기보호

다음 리보뉴클레오시드는 Sigma Dhemical Co. (St. Louis, MO)로부터 얻었다: 우리딘, 구아노신, 5-메틸우리딘, 아데노신, 시티딘, 5-브로모우리딘 및 이노신.

2,6-디아미노-9-(B-D-리보푸라노실)-9H-퓨린(2,6-디아미노퓨린 리보시드)는 Pfaltz and Bauer, Inc., Division of Aceto chemical CO., Inc. (Waterbury, CT)로부터 얻었다.

다음 뉴클레오시드는 제시된 문헌의 공지방법에 따라 제조하였다: C-1-β-D-리보푸라노실)-2-피리미디논(2-히드록시-피리미딘 리보시드)는 Niedballa의 공정에 따라 제조하였다. 2-아미노-9-β-D-리보푸라노실)-1,6-디히드로-6h-퓨린-6-티온(티오구아노신)은 Fox의 공정에 따라 제조하였다. 염화디메톡시트리틸, N6-벤조일아데노신, N4-벤조일시티딘 및 N2-벤조일 구아노신은 Sigma Chemicals로부터 얻었다. 염화 9-플루오르에닐메톡시카르보닐(염화 FMOC), 트리메틸클로로실란, 무수 이소부티르산, 염화 4-니트로벤조일, 무수 나프탈산 및 반응과 크로마토그래피를 위한 모든 유기 용매는 Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI)로부터 얻었다. 실리카겔은 EM Science(Cherry Hill, NJ)로부터 얻었다.

소단위의 활성화를 이할로겐화 친전자체(예컨대 P(O)Cl₂N(CH₃)₂또는 P(S)Cl₂N(CH₃)₂를 이용하여 이루어질 경우 더욱 우수한 수율의 활성 소단위가 퓨린 및 피리미딘 엑소시클릭 아민에 산성 양성자를 남기지 않는 보호기를 이용하여 종종 얻어진다.

이와 같은 엑소시클릭 아민부로서는 다음과 같은 것들을 예로들수 있다: 아데닌의 N6, 시토신의 N4, 구아닌의 N2 및 디아미노퓨린의 N2 및 N6. 이 목적을 위해 적합한 보호기로는 McBride et al(1986)에 의해 개발된 나프탈오일기(Dikshit) 및 아미딘기등이 포함된다. 또한 일반적으로 소단위 활성을 위한 이활로겐화 친전자체의 이용은 일반적으로 구아닌부의 06이 보호될 때 더 우수한 결과를 나타낸다. 이 비호는 P-니트로펜에틸(Trichtinger)을 이용하여 달성된다.

구아노신

소단위 활성과정중에 부반응을 최소화하기 위하여 종종 Trichtinger et al (1983)의 공정을 이용하여 N2 및 06 에 구아닌부를 보호하는 것이 바람직하다. 구아노신의 N-2, 9-플루오로에닐메톡시카르보닐 유도체는 뉴클레오시드 아미노기의 보호에 일반적인 하기 공정에 따라 제조된다:

구아노신(1mmole)을 피리딘(5㎖)에 현탁하고 트리메틸-클로로실란(5mmol)으로 처리하였다. 용액을 15분간 교반한후 염화 9-플루오로에닐 메톡시카르보닐(5mmol)을 첨가하고 용액을 실온에서 3시간동안 유지하였다. 반응을 얼음속에서 냉각하고 물(1㎖)을 첨가하였다. 5분간 교반한후, 진한 암모니아(1㎖)을 첨가하고 반응을 15분간 교반하였다. 용액을 거의 건조할 정도로 증발시키고 잔류물을 클로로포름(10㎖)에 용해하였다. 이 용액을 이탄산나트륨용액(5㎖, 10%)으로 세척하고 황산나트륨에서 건조하고 증발시켰다. 잔류물을 톨루엔으로 수차례 공증발시키고 염화메틸렌(0-50%)의 메탄올 구배를 이용한 실리카겔상에서 생성물을 크로마토그래피하였다.

N-2-이소부티릴구아노신은 Letsinger 방법에 따라 제조하였다. 니트로페네틸부로 06을 더욱 보호하는 것이 바람직하고 이는 몇몇 방법(Gait 1984)에 의해 실시될 수 있다. n-2-아세틸구아노신은 Reese 방법에 의해 얻었다. N-2-나프탈로일구아노신은 Dikshit 방법에 따라 제조하였다: 이 참조문헌은 뉴클레오시드아민기를 보호하는 일반적 방법을 제공하고 있다.

아데노신

N-6,2-(4-니트로페닐)-에톡시카르보닐 유도체는 Himmelsbach 방법에 의하여 제조하였다.

N-6(4-니트로벤조일) 아데노신은 FMOC 구아노신에 대해 상기 공정에 따라 제조하였으며 단 염화 4- 니트로벤조일은 염화 FMOC로 대체하였다.

N-6-2-(페닐술포닐)-에톡시카르보닐 유도체는 FMOC 구아노신에 대한 공정에 따라 제조하였으며 단 2-(페닐술포닐)-에틸 클로로포르메이트(Balgobin)을 아실 화제로 이용하였으며 N-메틸이미다졸 또는 피리딘을 용매로 이용하였다. N-6 나프토일 아데노신은 Dikshit 방법에 따라 제조하였다; 참고문헌은 뉴륵레오시드 아미노기의 보호를 위한 일반적 방법을 제공하고 있다.

2,6-디아미노퓨린 리보시드

2,6-디아미노퓨린 리보시드의 N-2,N-6- 비스(9-플루오르에닐메톡시카르보닐) 유도체는 구아노신에 대하여 기술한 일반적 공정에 따라 제조하였다. N-2,N-6(이소부티릴)유도체는 구아노신에 대해 일반적 공정에 따라 제조하였다.

티오구아노신

티오구아노신 리보시드의 N-2,N-6- 비스(9-플루오르에닐메톡시카르보닐) 유도체는 구아노신에 대해 기술된 일반적 공정에 따라 제조하였다.

우리딘

소단위 활성화 단계동안 에 바람직하지 않은 부산물을 최소화하기 위하여 가끔 우라부실의 N3를 보호하는 것이 요망된다.

5'0-트리티딜화 우리딘-2'-3'-아세토나이드는 Kamimura et al (1983)의 공정에 따라 N3 아니소릴 유도체로 전환하였다. 그 다음 생성물 THF 에서 0.1N HCl 또는 고온의 80% 아세트산으로 처리하여 리보오스부상의 보호기를 절단하였다.

[실시예 2]

5'-OH 모르폴리노 소단위의 합성

제5도에 도시된 구조를 참고로 하여 합성방법의 단계는 제5도에서 예시되어 있다. 염기-보호 리보뉴클레오시드는 페리오데이트를 이용하여 2'-3' 디알데히드로 산화시켰다(구조 1). 디알데히드는 암모니아 또는 1차 아민에 접근시키고(구조2), 2' 및 3' 히드록실(원 리보오스에서와 같이 번호를 붙임)은 시아노보로하이드라이드로 환원시켜 제거하였다(구조3).

이 일반적 합성도식의 예는 염기-보호 시토신(Pi^*) 모르폴리노 소단위의 합성에 관하여 하기에서 기술한다. 물 100㎖에 용해된 과요오드산나트륨 0.105mole 및 N4-벤조일시티딘 0.1 mole를 메탄올 1.6ℓ에 교반하면서 첨가하였다. 5분후, 이붕산암모늄 0.12 mole을 첨가하고 혼합물을 실온에서 1시간 교반하고 냉각 및 여과하였다. 여과물에 0.12mole 시아노보로하이드라이드 나트륨을 첨가하였다. 10분후 톨루엔 술폰산 0.20mole을 첨가하였다. 다시 30분후, 톨루엔술폰산 0.20mole을 첨가하고 혼합물을 냉각 및 여과하였다. 고체 침전물을 물 500㎖로 2회 세척하고 진공에서 건조하여 구조3에 도시된 자유아민의 토실레이트 염을 얻었다.

톨루엔 술폰산 또는 2- 나프탈렌술폰산 등의 적당하게 강한(pKa3) 방향족 산의 이용은 처리의 용이함, 상당히 개선된 수율 및 높은 수준의 생성물 순도를 제공한다.

그 다음 염기-보호 모르폴리노 소단위는 염화트리틸 또는 벤즈히드랄 니트로페닐카보네이트를 이용하여 모르폴리노고리의 환상질소에 보호된다(구조4).

한편 5' 히드록실은 트리알킬실릴기로 보호될 수 있다.

보호단계의 예로서, 아세토니트릴 2ℓ에 상기에서 얻은 토실레이트 염 0.1mole을 교반하면서 첨가한후 트리에틸아민 0.1mole 및 영화트리릴 0.15mole 를 첨가하였다. 혼합물을 덮고 실온에서 1시간 교반한후 메탄올 100㎖을 첨가하고, 그 다음 15분동안 교반하였다. 로토베이핑에 의해 건조한후 메탄올 400㎖을 첨가하였다. 고체를 슬러리로서 완전하게 현탁한후 진공에서 건조하였다. 고체를 디클로로메탄 500㎖에 재현탁하고 여과하고 침전이 막 시작될 때까지 로토베이프한 다음 헥산 1ℓ를 첨가하고 15분간 교반하였다. 고체를 여과로 제거하고 진공상에서 건조하였다. 위의 과정에 의해 모르폴리노 질소상에 트리틸화되고 자유 5' 히드록실을 갖는 염기-보호된 모르폴리노 소단위가 생성된다.

[실시예 3]

모르폴리노 소단위의 다른 합성방법

본 실시예에서는 모르폴리노 고리 질소에 결합된 산-불안정부를 함유하는 모르폴리노 소단위의 다른 제법에 대해 기술한다. 이들 단계들은 제6도를 참조로 하여 기술된다.

실시예2에서와 같이 과요오드산염으로 리보뉴클레오시드를 산화시키고 p-니트로 페놀 또는 벤조트리아졸로 완충된 1차 아민 4,4'-디메톡시 벤즈히드릴아민(Greenlee의 방법에 따라 제조됨 1984)에 생성 디알데히드(구조1)를 접근시킴으로써 소단위를 제조하였다.

실시예2에서와 같이 실시된 소듐 시아노보로하이드라이드와의 환원반응은 모르폴리노 질소에 4,4'-디메톡시벤즈히드릴기를 가지는 모르폴리노 소단위(구조2)를 생성한다.

이 고정의 한 특징은 염기(예컨대 우리딘)에 보호기를 가지지 않은 리보뉴클레오시드로부터 모르폴리노 소단위를 제조하는데 특히 유용하다는 사실이다.

[실시예 4]

5'-포스포네이트 소단위의 합성

제5도의 구조를 참조로하여 이 합성방법의 단계들을 기술한다.

이중-보호 모르폴리노 소단위의 5'히드록실(구조4)는 다음과 같이 포스포네이트로 전환시켰다. N4-벤조일시티딘-2',3'-아세토나이드(1mmole)은 실온 아르곤하에서 20시간동안 DMF(20㎖)에서 메틸트리페녹시포스포늄요오드와 반응시켜 5'-요오도유도체로 전환시켰다. 메탄올을 반응 혼합물에 첨가하였으며 30분후 혼합물을 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 에틸아세테이트에서 용해하고 용액을 먼저 수성 소듐 티오술페이트로 세척하고 그다음 염수로 세척하였다. 소듐 술페이트로 건조하고 용매를 증발시킨 후 생성물을 이소프로판올/클로로포름 용매를 이용하여 실리카상의 크로마토그래피로 정제하였다.

상기에서 제조된 요오다이드 유도체는 잘 밀폐된 용기에서 50℃, 2일간 에탄올중의 무수포스핀 과량으로 처리하였다. 이 시간이 끝나갈 무렵에 용기를 냉각하고 통기시키고 과량의 포스핀을 천천히 증발시켰다. 발산된 증기는 소듐 히포클로라이트를 함유하는 용액으로 버블링시켜 독성가스를 분해하였다. 1차 포스핀의 알코올성 용액은 용액을 냉각하면서 고체 소듐 카보네이트 및 냉각된 30% 과산화수소 과량으로 처리하였다. 생성 포스폰산은 음이온 교환컬럼상의 이온교환크로마토그래피로 정제하였다. 짝이온이 트리에틸암모늄인 이음이온성 포스페이트 산물은 소망 팬던트 X부의 카르보디이미드-매개 첨가반응을 초래하는 다량의 시약과 혼합하였다(제3a도). 적당한 시약의 예로는 다음과 같다; 메탄올의 첨가는 X-메톡시를 제공하고 디메틸아민의 첨가는 X=N(CH₃)₂를 제공한다. 이 혼합물에 DCC 와 같은 카르보디이미드를 첨가하였다. 형성 소단위는 제3a도에 도시된 형태이다. 실질적으로 덜 염기성인 짝이온 (예컨대 피리딘)은 두 X부를 포스포네이트부에 첨가되도록 하기 때문에 사용되어서는 안된다.

[실시예 5]

N-메탄포스포네이트 모르폴리노 소단위의 합성

본 실시예에서는 7- 원자 단위- 길이 골격을 가지는 중합체(제3d도)를 제조하기에 적합한 모르폴리노 고리질소에 결합된 메틸포스포네이트부를 함유하는 소단위의 제조에 대하여 기술한다. 제7도에 도시된 구조를 참조하여 이들 단계들을 기술한다.

염기-보호 리보뉴클레오시드는 디(p-메톡시)트리틸 클로라이드로 처리하여 구조1를 생성하였다. 그 다음 리보오스부는 아미노메탄포스폰산(AMPA)및 N-에틸모르폴린의 존재하에 과요오드산염으로 산화시켰다. 산화후 벤조트리아졸(반응 혼합물을 완충시키는데 사용)의 존재하에 소듐 시아노보로하이드라이드로 환원시켜 모르폴리노 질소에 메탄포스폰산기를 가지는 모르폴리노 소단위를 형성하였다(구조2).

그 다음 생성물은 트리에틸아민중의 클로로포름/메탄올 혼합물 1%로 전개된 실리카겔 크로마토그래피로 정제하였다.

짝이온이 트리에틸암모늄인 이음이온성 포스포네이트 생성물은 소망 펜던트 X부 (제3d도)의 첨가를 초래하는 과량의 시약과 혼합하였다. 적당한 시약의 예로서는 다음과 같다: 메탄올의 첨가는 X=메톡시를 제공하고, 디메틸아민의 첨가는 X=N(CH₃)₂를 제공한다. 이 혼합물에 디시클로헥실 카르보디이미드(DDC) 등의 카르보디이미드를 첨가하여 제7도의 구조3을 형성하였다. 실질적으로 덜 염기성인 짝이온 (예컨대 피리딘)이 사용된다면 두 X부는 포스포네이트부에 첨가될 수 있다.

[실시예 6]

5' 히드록실에서 5' 아민 및 5' 술프히드랄로의 전환

제5도에 도시된 구조를 참고로하여 합성법의 단계들을 기술한다.

A. 아민으로의 전환

이중-보호 모르폴리노 소단위(구조4, 제5도)의 5'히드록실은 다음과 같이 아민으로 전환될 수 있다.

DMSO 500㎖에 피리딘(Pyr) 1.0 mole, 트리플루오로아세트산(TFA) 0.5 mole 및 모르폴리노 소단위 0.1 mole를 첨가하였다.

이 혼합물을 모든 성분이 용해될때까지 교반하고 그 다음 디이소프로필카르보디이미드(DIC) 또는 디시클로헥실 카르보디이미드(DCC) 0.5 mole를 첨가하였다. 2시간후 반응혼합물은 빠르게 교반한 염수 8ℓ에 첨가하였다. 이 혼합물을 30분간 교반하고 그 다음 여과하였다. 생성 고체를 간단히 건조하고 얼음 냉각 헥산 1ℓ로 세척하고 여과하였다. 이 고체에 1ℓ메탄올상의 소듐 시아노보로하이드라이드 0.2mloe을 첨가하고 10분간 교반하였다. 이 혼합물에 벤조트리아졸 또는 p-니트로페놀 0.4mole 를 첨가한후 메틸아민(H₂O 중에 40%) 0.2mole 첨가하였다. 이 제제를 실온에서 4시간 교반하였다. [주: 벤조트리아졸 또는 p-니트로페놀은 반응을 완충시켜 환원 알킬화반응의 이미늄 단계에서 소단위의 4'탄소에 라세미화를 방지한다].

끝으로 반응 혼합물은 물 5ℓ에 넣고 침전이 생성될 때까지 교반하고 고체(구조6, 제5도)는 모우고 건조하였다.

B. 술프히드랄로의 전환

이중-보호 모르폴리노 소단위의 5'히드록실은 다음과 같이 술프히드랄로 전환된다.

5'-히드록실 소단위(구조4, 제5도)의 1.0 mole을 피리딘 1ℓ에 첨가한 후 톨루엔술포닐클로라이드 0.12mole을 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 3시간 교반하였으며 반응은 제5도에 구조7로 도시된 생성물을 형성하였다. 피리딘은 로토베이핑으로 제거하고 NaI를 함유하는 메탄올 DMF-1ℓ에 신선한 소듐 히드로설파이드 0.5mole을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 혼합물을 물 5ℓ에 첨가하고 20분간 교반하고 생성 고체물질을 여과로 모아서 건조하여 제5도의 구조8로 도시된 생성물을 얻었다.

[실시예 7]

5' 아미노메틸포스포네이트 리보시드 소단위의 합성

본 실시예에서는 리보시드에 결합된 아미노메틸 포스포네이트부를 함유하는 리보시드 소단위의 제조에 대해 기술한다.

아미노메틸포스폰산(Aldrich Chem. Co.)은 트리에틸아민의 존재하에 트리틸클로라이드와 반응시켰다. 짝이온이 트리에틸암모늄인 이음이온성 포스포네이트 생성물은 소망 펜던트 X부의 첨가(예컨대 X = 메톡시기를 제공하며 디메틸아민의 첨가는 X=N(CH₃)₂)을 제공한다)에 적합한 과량의 시약과 혼합한후 디시클로헥실카르보디이미드(DDC)등의 카르보디이미드를 첨가하였다. 생성된 단일-음이온성 생성물은 피리디듐 히드로클로라이드를 함유하는 클로로포름 및 물의 혼합물과 함께 섞었다. 이 공정에서 피리미늄 짝이온을 가지는 단일 이온성 포스폰산을 얻었다. N4-벤조일시티딘-2', 3'-페닐보로네이트를 함유하는 클로로포름에 이 생성물을 첨가하고 DCC를 첨가하였다. 생성물을 건조하고 메탄올/클로로포름 혼합물을 이용한 실리카상에서 크로마토그래피하였다. 순수 혼합물을 1,3-디히드로프로판으로 처리하여 제12도의 구조2 화합물을 얻었으며 다시 일부를 트리플루오로에탄올중의 아세트산으로 처리하여 구조1 화합물을 얻었다.

[실시예8]

주어진 포스폰아미드 결합을 제공하기 위한 커플링

본 실시예에서는 자유 모르폴리노 고리질소를 가지는 제2 소단위와 실시예4에서와 같이 제조된 포스포네이트 소단위의 커플링에 대해 기술한다. 제9도의 구조를 참조하여 본 실시예를 기술한다.

출발물질은 실시예4에서 제조된 염기-보호된 모르폴리노 질소 보호 포스포네이트 소단위이다. 이 소단위의 트리에티라민 염을 클로로포름에 현탁하고 피리디늄 히드로클로라이드를 함유하는 물과 함께 섞어 클로로포름층에 소단위의 피리딘염(구조1)을 형성하였다. 유기층을 분리하고 물로 세척하고 건조하였다. 얻어진 고체의 일부를 과량의 3-히드록시프로피오니트릴과 혼합하였다; 그 다음 DCC를 혼합물에 첨가하였다. 형성된 반응의 생성물을 트리플루오로에탄올중의 2% 아세트산으로 탈트리시켜 구조2 화합물을 얻었다. 그 다음 구조1 및 구조2 을 DCC의 존재하에 혼합하여 구조3으로 도시된 결합된 이합체를 형성하였다. 이 이합체는 더 긴 올리고머 블럭 또는 중합체로 어셈블리하기 위하여 어느 한 말단에 선택적으로 탈보호될 수 있다. 시아노에틸기는 비양성자성 용매(예컨대 DMF)에서 DBU로 제거하거나 트리틸부는 상기한 바대로 절단될 수 있다.

[실시예 9]

주어진 포스포아미드 결합을 제공하기 위한 커플링 및 합성

A. X=CH₃

실시예 9A에서는 알킬포스폰아미데이트 소단위간 결합을 제공하기 위한 자유 모르폴리노고리 질소를 가지는 제2 소단위에 실시예2 또는 3에서와 같이 제조된 5'히드록실 소단위의 커플링 및 활성화에 대해 기술한다.

X가 알킬기인 제10도의 구조를 참조하여 본 실시예를 기술한다. 모르폴리노질소(제5도의 구조4)에 트리틸화되고 염기-보호된 5'히드록실 소단위 1mmole을 디클로로메탄 20㎖에 용해하였다. 이 용액에 N-에틸모르폴리노 4mmole 및 Z=0에 대해 메틸포스폰 디클로라이드 1.1mmole(또는 Z=S에 대해 메틸티오포스폰 디클로라이드)을 첨가한후 N-메릴이미다졸 1mmole을 첨가하였다. 1시간후 반응용액을 수성 NaH₂PO₄로 세척하였다. 에틸아세테이트로 전개된 실리카겔상의 크로마토그래피에 의해 활성 소단위를 단리하였다(X가 메틸인 제10도의 구조2). 이 활성 소단위는 DMF에 이들를 혼합함으로써 제2 소단위(구조3)의 모르폴리노 질소에 직접 결합될 수 있다. 이 커플링 반응은 구조4(X는 CH₃)로 도시된 이합체를 형성한다.

다른 활성화 및 커플링 공정은 디클로로로메탄 20㎖에 모르폴리노 질소에 염기 보호 및 트리틸화된 5' 히드록실 소단위(제5도의 구조4) 1mmole를 용해하는 과정을 수반한다. 이 용액에 N,N-디에틸아닐린 4mmole 및 4-메톡시피리딘-N-옥사이드 0.1 mmole을 첨가하였다. 용해후 Z=O에 대해 메틸포스폰 디클로라이드 1.1 mmole(또는 Z=S에 대해 메틸티오포스포 디클로라이드 1.1mmole)을 첨가하였다. 2시간후 생성물(제10도의 구조 2, X는 메틸)을 10% 아세톤/90% 클로로포름으로 전개된 실리가겔상의 크로마토그래피로 단리하였다. 이 활성 소단위 1mmole은 N,N-디이소프로필 아미노에틸 이소부티레이트(DIPAEIB) 1.5mmole을 함유하는 디클로로포름에 이들을 혼합함으로써 제2 소단위(구조3)의 모르폴리노 질소에 직접 결합되어 구조4(X는 -CH₃)로 도시된 이합체를 형성한다. 3차 아민/에스테르, DIPAEIB는 이소부티릴 클로라이드 1.1 mmole, N,N-디이소프로필아미노에탄올 1mole 및 피리딘 1.5mmole를 혼합하고, 110℃에서 30분간 가열하고 제조하였다. 이 제제를 H₂O 500㎖중의 NaOH 0.5 mole 로 세척하고 증류하여 30 mmHg 115℃ 에서 소망 아민/에스테르를 얻었다.

알킬포스폰아미데이트 소단위간 결합(X가 -CH₃인 구조4)은 염기-탈보호를 위해 사용되는 암모니아에 매우 안정하다. 반대로 이 결합은 비교적 강산에 민감하다. 예컨대 이 결합은 디클로로메탄중의 2% 디클로로 아세트산에서 약 3시간의 절단 반감기를 가진다. 그러나, 이 결합은 모르폴리노 질소의 탈트리틸화에 적합한 조건, 트리플루오로에탄올중의 2% 아세트산에서 18시간후에 어떠한 절단도 검출되지 않았다.

B. X=-O-CH₂CH₃

실시예 9B에서는 포스포디에스테르아미드 소단위간 결합을 제공하기 위한 자유 모르폴리노 고리질소를 가지는 제2 소단위에 실시예2 또는 3에서와 같이 제조된 5' 히드록실 소단위의 커플링 및 활성화에 대해 기술한다. X가 알콕시드기인 제10도의 구조를 참조하여 본 실시예를 기술한다.

모르폴리노 질소에 염기-보호되고 트리틸화된 5' 히드록실 소단위(제5도의 구조4) 1mmole을 벤젠 80㎖에 현탁하고 N-메틸이미다졸 2.2mmole를 첨가하였다. 소단위를 용해한후 Z=0에 대해 에틸 디클로로포스페이트(또는 Z=S에 대해 에틸디클로로티오포스페이트) 1.2 mmole을 첨가하였다. 1시간후 반응 용액을 수성 NaH₂PO₄로 세척하였다. 활성 소단위를 에틸아세테이트로 전개된 실리카겔상의 크로마토그래피로 단리하였다(X는 -O-CH₂CH₃인 제10도의 구조2). 이 활성 소단위는 DMF에서 혼합함으로써 제2 소단위(구조3)의 모르폴리노 질소에 직접 결합될 수 있다. 이 커플링 반응은 구조4로 도시된 이합체를 형성하였다.

에틸디클로로티오포스페이트(Z=S)를 소단위의 활성화를 위해 사용할 때 다음과 같이 변화된 개선된 수율이 얻어졌다. 모르폴리노질소(제5도의 구조4)에 염기-보호 및 트리틸화된 5' 히드록실 소단위 1mmole을 클로로포름 20㎖에 현탁하였다. 이 용액에 N-메틸이미다졸 1㎖을 첨가한후 에틸디클로로티오포스페이트(Aldrich Chem. Co.) 1.6㎖을 첨가하였다. 1시간후 20% 아세톤/80% 클로로포름으로 전개된 실리카겔 크로마토그래피로 소단위 생성물을 정제하였다. 이 활성 소단위(X는-O-CH₂CH₃이고 Z는 황인 구조2)는 상기한 바와같이 제2 소단위의 모르폴리노 질소에 결합될 수 있다.

다른 활성 및 커플링 공정은 모르폴리노질소에 염기보호 및 트리틸화된 5' 히드록실 소단위(제5도의 구조4)을 디클로로메탄 20㎖에 용해하는 단계를 수반한다. 이 용액에, N,N-디에틸아날린 4 mmole 및 4- 메톡시피리딘 -N- 옥사이드 0.2 mmole을 첨가하였다. 용해후, Z=O에 대해 에틸디클로로포스페이트(또는 Z=S에 대해 에틸디클로로티오포스페이트) 1.1mmole을 첨가하였다. 1시간후 생성물(X가 에톡시인 제10도의 구조 2)은 10% 아세톤/90% 클로로포름으로 전개된 실리카겔상의 크로마토그래피로 단리하였다. 이 활성 소단위 1mmole을 N,N-디이소프로필아미노에틸 이소부티레이트(DIPAEIB) 1.5mmole을 함유하는 디클로로메탄에 이들을 혼합함으로써 제2 소단위(구조3)의 모르폴리노 질소에 직접 결합시켜 구조4(X는 O-CH₂CH₃)로 도시된 이합체를 얻었다.

C. X=-F

실시예 9C에서는 플루오로포스포아미데이트 소단위간 결합을 제공하기 위한 자유 모르폴리노 고리질소를 가지는 제2 소단위에 실시예2 또는 3에서와 같이 제조된 5' 히드록실 소단위의 커플링에 대해 기술한다. X가 불소인 제10도의 구조를 참조로 본 실시예를 기술한다.

출발물질은 모르폴리노 질소에 β-제거 메카니즘에 의해 제거가능한 기로 염기 보호되고 트리틸화된 5' 히드록실 소단위(제5도의 구조4) 1mmole이다. 이 소단위를 디클로로메탄 20㎖에 용해하고 여기에 N-메틸이미다졸 6mmole을 첨가하고 그 다음 플루오로포스포르산 2.5mmole을 첨가하였다. DCC 5mmole을 첨가하고 용액을 3시간 교반하였다. 반응용액을 수성 NaH₂PO₄로 세척하고 유기층을 감압하에 건조하여 플루오로포스페이트염(X는 F이고 짝이온은 N-메틸이미다졸인 구조5)을 얻었다. 1 피리미딘중에 메탈올/클로로포름 혼합물 1%로 전개된 실리카겔 프로마토그래피로 생성물을 정제하여 피리디늄 염을 얻었다. 건조후 정제 생성물은 디클로로메탄중의 DCC를 이용하여 자유 모르폴리노 질소(구조6)를 가지는 5'-보호 소단위에의 커플링에 적합하다. 이 카르보디이미드 커플링 반응은 구조7(X는 F)로 도시된 이합체를 형성하였다. 플루오로포스포로아미데이트 소단위간 결합을 함유하는 중합체는 암모니아와 같은 강한 친핵체에 노출되지 않아야 한다. 결과적으로 이와같은 중합체를 어셈블리하는데 사용된 소단위의 염기는 강한 천핵체의 이용없이도 절단될 수 있는 기로 보호되어야 한다. 실시예1에서 기술된바와 같이 β-제거 메카니즘에 의하여 절단가능한 보호기는 이 목적에 적합하다.

D. X=N(CH₃)₂

실시예 9D에서는 포스포디아미데이트 소단위간 결합를 제공하기 위한 자유 모르폴리노 고리 질소를 가지는 제2 소단위에 실시예2 또는 3에서와 같이 제조된 5' 히드록실 소단위의 커플링에 대해 기술한다. X가 이치환된 질소인 제10도의 구조를 참조로 이 실시예를 기술한다. 모르폴리노 질소에 염기보호 및 트리틸화된 5'히드록실 소단위(제5도의 구조4)의 1mmole을 디클로로메탄 5㎖에 용해하였다. Z=0에 대해 디메틸아미노디클로로포스페이트(OP(Cl)₂N(CH₃)₂) (또는 Z=S에 대해 티오포스페이트 유사체) 2mmole 및 N-에틸모르폴린 6mmole을 용액에 첨가한후 N-메틸이미다졸 0.5mmole을 첨가하였다. 반응이 종료된후(박막 크로마토그래피로 평가) 반응용액을 수성 NaH₂PO₄로 세척하였다. 아세톤/클로로포름으로 전개된 실리카겔상의 크로마토그래피로 활성 소단위를 단리하였다(X는 N(CH₃)₂)인 제10도의 구조2). 활성 소단위는 반응에서 생긴 HCl을 중화하기에 충분한 트리에틸아민을 함유하는 DMF에서 소단위(구조3)의 모르폴리노질소에 직접 결합되어 구조4로 도시된 이합체를 형성할 수 있다.

상기 공정에서 사용된 디메틸아미노디클로로 포스페이트 (X는 -N(CH₃)₂이고 Z는 산소)는 다음과 같이 제조하였다.

옥시염화인 0.2 mole중에 디메틸아민 히드로클로라이드 0.1 mole를 함유하는 현탁액을 12시간 환류한 다음 증류시켰다(끓는점은 0.5 mmHg에서 36℃이다). 상기 공정에서 사용된 디메틸아미노디클로로티오포스페이트(X는 -N(CH₃)₂이고 Z는 황이다)는 다음과 같이 제조하였다: 염화옥시인 0.2mole중에 디메틸아민 히드로클로라이드 0.1mole 를 함유하는 현탁액을 18시간 환류하고 그 다음 증류하였다(15 mmHg에서 끓는점 85℃).

다른 활성 및 커플링 공정은 디클로로메탄 20㎖에 모르폴리노 질소에 염기-보호 및 트리틸화된 5' 히드록실 소단위(제5도의 구조4) 1mmole을 용해하는 단계를 수반한다. 이 용액에 4-메톡시피리딘-N-옥사이드 1 mmole 및 N,N- 디에틸아닐린 4mmole을 첨가하였다.

용해후, Z=0에 대해 디메틸아미노디클로로 포스페이트(또는 Z=S에 대해 디메틸 아미노클로로티오포스페이트) 2mmole을 첨가하였다. 2시간후, 10% 아세톤/90% 클로로포름으로 전개된 실리카겔상의 크로마토그래피로 생성물(X는 디메틸아미노닌 제10도의 구조2)을 단리하였다. 이 활성 소단위 1mmole은 N,N-디이소프로필아미노에틸 이소부티레이트(DIPAEIB) 1.5mmole을 함유하는 디클로로메탄에 이들을 혼합함으로써 제2 소단위(구조3)의 모르폴리노 질소에 직접 연결되어 구조4(X는 -N(CH₃)₂)로 도시된 이합체를 얻을 수 있다.

[실시예 10]

포스폰에스테르 결합을 제공하는 커플링

본 실시예에서는 자유 5' 히드록실을 가지는 제2 소단위와 실시예5 에서와 같이 제조된 메틸포스포네이트 소단위의 커플링에 대해 기술한다.

제10도의 구조를 참조하여 이 실시예를 기술한다.

출발물질은 실시예5에서와 같이 제조된 염기-보호, 모르폴리노 질소- 보호된 메틸 포스포네이트 소단위이다. 이 소단위의 트리에틸아민염을 클로로포름에 현탁하고 2% 피리디늄 히드로클로라이드를 함유하는 물과 섞어 클로로포름층에서 소단위의 피리디늄 염(구조1)를 형성하였다.

유기층을 분리하고 물로 세척하고 건조하였다. 생성된 고체의 일부를 과량의 3-히드록시프로피오니트릴과 혼합하고 그 다음 DDC 2당량을 혼합물에 첨가하였다. 반응의 생성물을 디클로로메탄에서 1% 디클로로아세트산으로 탈트리틸화하여 구조 2 화합물을 얻었다. 그 다음 구조1 및 2을 DDC의 존재하에 혼합하여 구조3으로 도시된 결합 이합체를 형성하였다. 이 이합체는 더 긴 올리고머 블럭 또는 중합체로 어셈블리하기 위해 어느 한 말단에 선택적으로 탈보호될 수 있다.

시아노에틸기는 비-양성자성 용매(예컨대 DMF)에서 DBU로 제거될 수 있거나 또는 디메톡시트리틸부는 상기에서와 같이 절단될 수 있다.

[실시예 11]

동시적인 모르폴리노 고리형성 및 소단위 커플링

본 실시예에서는 동시적으로 모르폴리노 고리 구조를 형성하고 소단위를 연결하기 위한 실시예7에서 제조된 것과 같은 5'메틸렌을 통하여 결합된 보호 아민을 함유하는 리보뉴클레오시드의 산화 및 다른 소단위의 비보호 아민에의 결합에 대하여 기술한다. 제12도의 구조를 참조하여 이 실시예를 기술한다.

아민보호

5' 메틸렌을 통하여 결합된 1°아민을 함유하는 리보뉴클레오시드(구조1) 10 mmole을 트리틸 클로라이드 11 mmole과 반응시켜 아민을 보호하였다(구조2).

산화

메탄올에서 트리틸화 소단위(구조2)을 NaIO₄11 mmole과 반응시켜 디알데히드(구조3)을 얻었다.

커플링

커플링 용액이 너무 산성이면 반응은 느리고 용액이 너무 염기성 이면 구조3 성분의 에피머화반응이 일어나는 것으로 보인다. 약산을 사용하여 아민성분(구조1)을 중화하고 이 커플링 단계에서 반응을 중화하였다. 이 목적에 적합한 것으로 밝혀진 약산으로는 카르본산, 오르토 및 파라 니트로페놀 및 벤조트리아졸 등이다. 이어 디알데히드(구조3) 물/메탄올 혼합물에서 구조1의 적당한 염과 합하여 결합된 생성물(구조4)을 얻었다.

환원

모르폴리노 고리 닫힘반응 단계중에 반응후에 소듐 시아노보로하이드라이드를 첨가하여 디히드록시모르폴리노 고리(구조4)를 소망 모르폴리노 생성물(구조5)로 환원시켰다.

[실시예 12]

단순 표준 모르폴리노 중합체의 어셈블리, 구조확인, 탈보호, 정제 및 표적 RNA 서열에의 결합 평가

본 실시예에서는 단순 포스포디아미데이트-결합 모르폴리노 중합체의 제조, 구조 확인 및 표적 결합 친화성의 평가에 대해 기술한다.

모든 P_i부가 시토신인 모르폴리노 6합체중 실시예 9D에서와 같이 제조된 이합체로부터 어셈블리하였다. 이 이합체 제제의 1/3을 2% 아세트산을 함유하는 트리플루오로에탄올(TFE)로 탈트리틸화하였다: 그 다음 TFE를 감압하에서 제거하였다. 잔류물을 에테르로 세척하여 잔류 아세트산을 제거하였다. 이합체 제제의 나머지 2/3을 활성화하였다(실시예 9D에서와 같이). 활성 이합체의 반을 탈트리틸화 이합체와 반응시켜 4합체 생성물을 얻었으며 이것을 6% 메탄올/94% 클로로포름으로 전개된 실리카겔 크로마토그래피로 정제하였다. 4합체는 탈트리틸화하고 나머지 활성화 이합체와 반응시켜 6 합체 생성물을 얻었으며 이것을 10% 메탄올/90% 클로로포름으로 전개된 실리카겔 프로마토그래피로 정제하였다.

모르폴리노 질소상에 트리틸부를 가지는 염기-보호된 포스포디아미데이트-결합 5'OH 6합체는 pd(mC)₆-트리틸로 표시한다. 음이온 FAB 질량 스펙트럼(3-니트로벤질 알코올 매트릭스) 은 M-1=2667.9(100)임을 나타냈다.

다음 pd(mC)₆-트리틸 중합체를 상기와 같이 탈트리틸화하고 염기 탈보호하였다.

모르폴리노 중합체에 용해기를 첨가하는 것이 요망된다면 이것은 다음과 같이 용이하게 실시될 수 있다.

N-말단 모르폴리노 질소를 트리플루오로에탄올에서 2% 아세트산을 이용하여 탈트리틸하였다. 폴리에틸렌글리콜 1000(Polysciences Inc., Warrington, Pennsylvania, USA에서 입수)을 무수 DMF 에서 용해하고 그 다음 진공하에서 용매를 증발시켜 철저하게 건조시켰다. 순수 무수 DMF 소량에 고체를 현탁하고 TEA 1 mole 당량 및 비스(p-니트로페닐) 카보네이트 0.5 mole 당량(PEG 1000에 상대적인양)을 첨가하였다. 이 제제를 밀봉하고 30℃에서 하룻밤동안 배양하여 p-니트로페닐 카보네이트- 활성 PEG 1000을 얻었다.

탈트리틸화된 전-길이 모르폴리노 중합체를 실질적으로 과량의 몰량(일반적으로 10 내지 20배)의 활성 PEG 1000을 첨가하고 실온에서 2시간 배양하였다. 그 다음 전체 제제물을 30℃에서 하룻밤동안 진한 수산화암모늄으로 처리하였다. 그 다음 암모니아를 감압하에서 제거하였다. 정제공정은 양이온 교환 크로마토그래피한뒤 물로 세척된 폴리프로필렌 컬럼상에서 탈염시키고 그 다음 메탄올로 용출시켜 실시하였다.

정제된 꼬리달린 6합체, pd(mC)₆- PEG 1000은 42, 800의 계산된 몰 흡수도를 가지면서 중성 수용액에서 267.1 nm상에 최대 흡수를 나타냈다. pH 1의 수용액에서 동일한 물질은 77,100 nm의 상에서 최대 흡수를 나타냈다.

pd(mC)₆PEG-1000 중합체의 표적-결합 친화성을 평가하기 위하여, Poly G RNA(Sigma Chem Co. 로부터 입수) 1mg을 탈이온수에 용해하고 DMSO 4 부피(Aldrich Chem, Co.의 분광분석용 등급)을 첨가하였다(표준 용액 A). 꼬리달린 모르폴리노 6합체 pd(mC)₆- PEG 1000을 분광분석용 등급 DMSO에 용해하였다(표준용액 B). 인산을 이용하여 0.05 N NaOH의 pH를 7.4에 조성하여 인산완충용액을 제조하였다(완충액 C).

표준용액 A 및 B에 대해 UV로 실제 중합체 농도를 분석하였다. 표준용액 A의 흡수도는 0.1N NaOH에서 측정하였으며 표준용액 B는 0.1N HCl에서 측정하였다. 이들 pH 극한에서의 측정은 염기-스태킹 및 기타 중합체 상호작용을 최소하며 이는 구성성분 단량체에 비례하지 않는 흡수도 수치를 제공한다. 표준용액 A 및 B을 완충액 C로 희석하여 10 마이크로몰 최종농도의 중합체용액을 얻었다. 필요한 희석물은 A용액 Ploy(G)에 대해서는 65,000의 몰 흡수도, B 용액, pd(mC)₆- PEG 1000에 대해서는 77,100을 이용하여 계산하였다.

표적 결합 친화성의 평가는 기준빔에서 두 세포 및 샘플빔에서 두 세포를 수용하는 온도-조절 셀 하우징을 가지는 이중-빔 주사 분광분석계에서 실시하였다.

4개의 적합한 석영 큐베트를 이용하여 하나는 G 단량체에 대해 60 마이크로 물농도 Ploy(G) 0.5㎖을 완충액 C 0.5㎖을 채우고 두번째 것은 10 마이크로몰 농도 pd(mC)₆- PEG 1000 0.5㎖와 완충액 C 0.5㎖을 채웠다. 이들 두 큐베트는 온도-조절 셀 하우징의 기준빔에 위치시켰다. 다음, 제3 큐베트는 완충액 C 1㎖을 채우고 제4 큐베트는 G 단량체에 대하여 60 마이크로몰농도 Ploy(G) 0.5㎖와 10 마이크로몰농도 pd(mC)₆- PEG 1000 0.5㎖을 채웠다. 이들 두 큐베트는 셀 하우징의 샘플빔에 위치시켰다. 그다음 세포 하우징을 50℃까지 가열하고 14℃까지 천천히 냉각시켜 제4 큐베트에서 중합체 및 그 표적 폴리뉴클레오티드간의 완전한 결합이 이루어지게 하였다. 그 다음 320nm 240nm까지 취해진 주사는 273nm 주위에 중심을 둔 중합체-표적 혼합물에서 흡광감소성 이동에 기인한 실제 흡광도 차이를 나타낸다. 셀 홀더의 온도를 매 2℃상승마다 주사를 실시하면서 72℃까지 2도 간격으로 증가시켰다.

모르폴리노 중합체/RNA 복합체에 대해 온도의 함수로서의 흡수도 차이 곡선은 제13도에 도시되어 있다. 복합체가 반정도 융해되는 융해온도 T_m은 이 모르폴리노 중합체/RNA에 대해 51.5℃로 나타났다.

[실시예 13]

서열 5'-CGCCA의 포스포디아미데이트- 결합 올리고머의 용액상 제조

본 실시예에서 포스포디아미데이트-결합 골격을 함유하는 짧은 올리고머(X는 N(CH₃)₂, Y는 산소 및 Z는 산소인 제4도의 구조 B-B) 어셈블리에 대해 기술한다. 이 용액 어셈블리 방법은 실시예14 및 15에서와 같이 더 긴 올리고머로 계속해서 어셈블리하기에 적합한 짧은 올리고머의 대규모 합성에 유용하다.

A. 블럭의 5' 말단에 사용하기 위한 단량체의 제조

모르폴리노 고리질소에 트리틸부를 함유하고 5' 메틸렌에 메틸아민을 가지는 모르폴리노 C 소단위(실시예6에서와 같이 제조)을 Aldrich Chem. Co., Milwaukee, Wisconsin, USA.,에서 입수한 N-(9-플루오르에닐메톡시카르보닐옥시) 숙신이미드(FMOC)와 반응시키고 실리카겔 크로마토그래피로 정제하였다.

B. 탈트리틸화

상기 A에서 제조된 FMOC-유도체와 C 소단위 1mmole, 디클로로메탄 18㎖, 트리플루오로에탄 2㎖ 및 시아노아세트산 0.4g을 분리 깔때기에 첨가하였다. 10분후 이 용액을 수성 NaHCO₃로 분획하였다. 유기층을 로토-증발에 의하여 제거하였다. 잔류물질에 아세토니트릴 20㎖을 첨가하고 로토-증발에 의해 건조될때까지 아세토니트릴을 제거하였다. 잔류물질을 1시간동안 진공하에서 건조하였다.

C. 다른 단량체의 활성

모르폴리노 고리질소상에 트리틸화된 A,C 및 G의 5'OH 모르폴리노 소단위를 실시예2에서와 같이 제조하였다. A,C 및 G 소단위는 실시예 9D에서와 같이 모르폴리노 포스포아미데이트로 전환시켜 활성화하였다.

D. 최초 커플링

상기 B의 탈트리틸화 FMOC-유도체화 C 소단위를 커플링용액(4㎖ 디클로로메탄, 2㎖ 테트라메틸렌 술폰 및 0.3㎖ DIPAEIB(실시예9에서 제조))에 현탁하였다. 이 용액에 상기 C에서 제조된 활성 G 소단위 1mmole 을 첨가하였다.

실온에서 30분후 디클로로메탄을 감압하에서 제거하고 물을 첨가하여 생성물을 침전시켰다. 5'FMOC-CG-트리틸 이합체를 5% 메탄올/95% 클로로포름으로 전개된 실리카겔상의 크로마토그래피로 정제하였다.

E. 뒤이은 다음 커플링

상기 B에서와 같은 FMOC-CG 트리틸 생성물을 탈트리탈화하고 상기 C의 활성 C 소단위 1mmole과 결합시켰다. 나머지 C 및 A 소단위는 첨가하기 위해 이 커플링 사이클을 반복하여 소망 블럭 ; 5' FMOC-CGCCA-트리틸을 얻었다. 중합체 길이가 증가함에 따라 정제 단계는 증가된 블럭의 실리카겔 크로마토그래피 정제에서 높은 농도의 메탄올을 필요로 한다.

F. 구조 확인

이 5합체 블럭의 구조는 NMR 및 음이온 FAB 질량 분광계로 대부분 용이하게 확인되었다. 일반적으로 질량 스펙트럼에서 우세종은 문자 이온이었다.

[실시예 14]

HIV-I의 프라이머 결합부위를 표적으로 하는 모로폴리노 중합체의 용액상블럭 어셈블러

본 실시예에서는 포스포디아미테이트 소단위간 결합의 용액상 어셈블를를 위한 실시예13에서와 같이 제조된 올리고머 블럭의 이용에 대해 기술한다. 단량체 대신에 짧은 올리고머의 이동은 결합서열로 부터의 최종 생성물의 분리를 크게 단순화시킨다. 이 실시예에서 합성된 모르폴리노 중합체는 HIV-I의 프라이머 결합부위에 상보적인 염기 서열을 가진다(Myers et al.).

A. 짧은 올리고머 블럭의 합성

실시예13에서와 같이 다음 올리고머를 합성하였다: 5' FMOC-GUU-트리틸(블럭1); 5' FMOC-CGGG-트리틸(블럭2); 5' FMOC-CGCCA-트리틸(블럭3); 5' FMOC-CUGL-트리틸(블럭4).

B. FMOC 부의 절단

블럭4의 1,1-밀리몰을 DMF 20㎖에 현탁하고 DBU(1,8-디아자비시클로[5,4,0] 운데-7-센) 0.4㎖를 첨가하였다. 20분후 에테르 200㎖을 첨가하고 용액을 잘 교반하고 여과하였다. 여과물을 디클로로메탄 20㎖에 재현탁하고 4개의 30㎖ 원심분리 튜브에 분배하고 잘 섞어 혼합하고 원심분리하였다.

상징액을 버리고 펠리트를 감압하에 건조하였다.

C. 디트리틸화 및 활성화

다음 실시예13B에서와 같이 블럭 3 1mmole을 탈트리틸화하였다. 감압하에 용매를 제거한후 잔류물질을 디클로로메탄 20㎖에 현탁한후 DIPAEIB(실시예9에서와 같이 제조) 1.5㎖를 첨가하였다. 급속히 교반하면서 에틸디클로로포스페이트 0.5㎖을 첨가하였다. 5분후 이 용액을 4내지 30㎖ 원심분리 튜브에 분배하였다. 각 튜브에 에테르를 충전하고 철저하게 섞고 원심분리하였다. 펠리트를 디클로로메탄 최소 부피에 재현탁하고 에테르를 첨가하였다. 그다음 튜브를 흔들어 섞고 원심분리하였다. 이 세척 공정을 다시한번 더 반복하였다. 펠리트를 커플링용액(10㎖ 디클로로메탄, 5㎖ 테트라메틸렌술폰 및 0.3㎖ DIPAEIB(실시예9에서와 같이 제조))에 현탁하였다.

D. 커플링

활성블럭3의 용액을 FMOC기가 절단된 블럭4에 첨가하였다. 1시간후 무수 아세트산 0.5㎖을 첨가하고 용액을 5분간 실온에 방치하였다. 감압하에 디클로로메탄을 제거하였다. 생성물 5'FMOC-CGCCACUGC-트리틸을 침전시키기 위하여 물을 첨가하였다. 진공에서 고체를 건조한후, 잔류 무수아세트산을 모두 철저하게 제거하기 위하여 디클로로메탄에 재현탁하였다. 그 다음 에테르를 첨가하여 생성물을 침전시켰다. 생성물을 다시 한번 디클로로메탄에 재현탁하고 에테르로 재침전시켰다.

상기 B에서와 같이 이 9합체 생성물로부터 FMOC부를 제거하였다. 상기 C에서와 같이 블럭2를 탈트리틸시키고 활성화 하였다.

상기한 바와 같이 이들 두 구성분을 결합시켜 13-합체 5'FMOC-CGGGCGCCACUGC-트리틸을 얻었다.

상기 B에서와 같이 13-합체 생성물로부터 FMOC부를 제거하였다. 상기 C에서와 같이 블럭1를 탈트리틸화하고 활성화하였다. 이들 두 구성분을 상기에서와 같이 결합시켜 16-합체; 5'FMOC-GUUCGGGCGCCACUGC-트리틸을 얻었다.

E. 탈보호

상기에서와 같이 FMOC 및 트리틸부를 제거하고 생성물을 DMF 20㎖에 현탁하고 수산화암모늄 20㎖을 첨가하였다. 이 제제물을 캡핑하고 18시간 30℃에서 배양하였다. 그 다음 용매를 로토-증발로 제거하여 16합체의 조- 제제물; 5'FMOC-GUUCGGGCGCCACUGC를 얻었다.

F. 정제

HCl로 pH 10.5에 조정된 0.05N 수성 메틸아민에 2mg/㎖농도로 16합체 제제를 현탁하였다(용액 A). 크로마토그래피에 사용되어질 물을 흡입진공하에서 가스 제거하고 메틸아민을 첨가하여 0.05N의 최종 메틸아민농도로 하였다. 이 용액에 HCl를 첨가하여 pH 10.5로 조정하였다. 해당 pH 10.5 용액을 KCl 중의 1N로 만들었다(용매 B). 용매 A를 크로마토그래피용-등급 아세토니트릴 또는 메탄올과 부피 1:1로 혼합하여 용매 C를 얻었다.

중합체 100mg 까지를 음이온-교환지지체 Q-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)로 팩킹된 크로마토그래피컬럼(직경 5cm, 길이 15cm) 상의 용매 A 50㎖에 코팅하였다. 이 컬럼을 용매 A로 철저히 세척하고 약 30㎖/분의 유속으로 30분간에 걸쳐 100% 용매A로부터 100% 용매 B 범위로 선행구배로 용출하였다. 용출물을 254 nm에서 모니터하였다. 본실시예의 16-합체는 약 0.35 N KCl에서 용출되는 것으로 밝혀졌다. 소망 결합 중합체는 일반적으로 컬럼으로부터 용출되는 마지막의 가장 큰 피이크이었다. 중합체를 블럭 어셈블리로 제조할때 종종 기저선 분리가 이루어진다. 일반적으로 피이크 형태가 비대칭일 때 문제점은 크로마토그래피 패킹의 능력 결여가 아니라 결합 중합체의 불용성이다. 이와 같은 문제점은 대개 주어진 작동에 코팅된 결합 중합체의 양을 감소시킴으로써 해결될 수 있다. 피이크가 대칭이나 기저선 분리가 이루어지지 않을 때 더욱 완만한 구배를 이용하여 용출시킴으로써 일반적으로 개선할 수 있다.

중합체를 함유하는 용출물을 다시 정제하고 35 미크론 크로마토그래피용 등급 폴리프로필렌(cat. no. 4342, Polysciences, Inc.)으로 패킹된 동일 크기 컬럼에 로딩함으로써 탈염시켰다. 이전의 양이온 교환 크로마토그래피에서 baseline 분리가 이루어졌다면 순수생성물은 용매 C로 용출시켜 얻어진다. 그러나 기저선 분리가 이루어지지 않을 경우 생성물은 100% 용매 A에서 100% 용매 C 범위의 선형구배로 용출시켰다. 본 실시예의 16합체는 아세토니트릴농도가 약 25% 부피일 때 용출되는 것으로 밝혀졌다.

G. 서열 확인

이전에 기술된 바와같이, 완전히 보호된 상태의 전-길이 중합체의 질량 스펙트럼분석은 중합체 길이 및 염기 조성물 모두를 확인할 수 있게 하나 소단위 서열에 대한 정보는 제공하지 않는다. 서열 정보를 얻기 위한 한 방법은 데옥시리보헥산 및 카르바메이트-결합데옥시리보뉴클레오시드-유래 중합체의 단편 패턴으로 부터 얻은 방법이다(Griffin et al.). 그러나 완전히 보호상태에서 본발명의 많은 모르폴리노-기저 중합체는 단편화에 내성을 가지며 최소 단편만을 가지는 분자이온을 주로 생성한다.

모르폴리노-기저 중합체의 서열을 확인하는 다른 방법은 각 올리고머 블럭을 커플링한후 성장 중합체의 일부를 취하고 중합체의 신장을 따라서 질량 스펙트럼 분석을 이용하는 것이다. 분석에서 사용된 두 블럭이 우연히 완전히 동일한 질량을 가지는 드문 경우를 제외하고 이 방법을 사용할 수 있다.

중합체 소단위 서열의 정확함을 확인토록 하는 간접적이지만 바람직한 방법은 블럭이 잘못된 순서로 어셈블리된 경우에 생길지도 모르는 DNA 서열 및 상보 DNA(이 서열은 기존방법에 의하여 확인될 수 있다)와 모르폴리노 중합체를 결합시키는 것이다. 중합체와 DNA 사이의 결합은 240 내지 290 nm파장 영역에서 흡광감소성 이동을 측정함으로써 평가될 수 있다(실시예12에서 측정된 것과 같이), 이와 같은 이동은 중합체와 그 상보 서열사이에서만 일어난다. 또한 중합체/DNA 이중나선은 240 nm영역에서의 흡수도를 모니터하면서 온도를 천천히 증가시킴으로써 부분적으로 - 미스매치된 이중나선과 구별될 수 있다. 완전히 이중나선은 일반적으로 미스매치 이중나선의 용해온도보다 10도 또는 그이상 더높은 융해온도(흡광감소성에서 50% 감소에 해당)을 가질 것이다.

H. 표적 결합 친화성의 평가

본 실시예의 16 합체는 상보 DNA와 쌍을 이룰때 가닥이 역평행일 경우 DNA와 결합하지만 평행일 경우에는 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다(이하에서 예시하는 바와같이).

역평행 결합 가닥분자는 각 가닥이 3마이크로몰 농도로 존재할 때 63℃의 T수치를 가지는 것으로 밝혀졌다(실시예12에서 기술된 바와같이 측정).

I. 생물학적 활성의 평가

AIDS 바이러스--HIVI으로 감염된 사람 세포에서 바리어스 P24 단백질의 합성을 억제하는 능력에 대해 본 실시예의 16- 합체를 테스트하였다. 예비결과는 HIV-I의 프라이머 결합 부위에 상보적인 본 실시예의 16- 합체 중합체를 HIV-I 감염 세포에 6마이크로몰 농도로 첨가할때 중합체는 바이러스 P24 단백질의 합성률 35% 감소시키는 것으로 나타났다. 더욱이 6 및 19 마이크로몰 농도에서 중합체는 비감염 세포에 검출 가능한 정도의 세포 독성은 야기하지 않았다.

[실시예 15]

HIV-I의 프라이머 결합부위를 표적으로 하는 모르폴리노 중합체의 고체상 블럭 어셈블리

본 실시예에서는 포스포디아미데이트 소단위간 결합을 함유하는 모르폴리노 중합체의 고체상 어셈블리를 위한, 실시예13에서와 같이 제조된 올리고머 블럭의 이용에 대하여 기술한다. 고체상 어셈블러는 더긴 결합 중합체의 어셈블리를 위한 신속한 방법을 제공한다. 단량체 대신에 짧은 올리고머 블럭의 이용은 결함서열로부터 최종 생성물을 분리하는 것을 매우 단순화시킨다.

A. 고체 지지체에 절단가능 링커의 부착

비스[2-(숙신이미도옥시카르보닐옥시)-에틸] 술폰(Pierce Chemical Co. Rockford, Hlinois, USA) 1 mmole 을 DMF 10㎖에 용해하고 1차 아민 기능을 가지는 적당한 고체 지지체(예컨대 Glass, Aminopropyl, Catalog # G4643, from Sigma Chem, Co., St. Louis, MO, USA -- 500Å 구멍크기, 200-400 매쉬, 81 마이크로몰/g의 아민농도 3g)을 첨가하였다. 2시간후 유리비드의 슬러리를 컬럼(바람직하다면 직경 약 1.5cm)에 넣고 디클로로메탄으로 컬럼을 철저하게 세척하고 진공에서 건조하였다. 유리 지지체에 결합된 이 링커는 탈트리틸화에 이용되는 산성 조건에 안정하나 1,8-디아자비시클로[5,4,0]운데-7-센(DBU)등의 강한 비-친핵 염기를 이를 이용하여 β-제거 메카니즘을 통하여 용이하게 절단된다.

B. 짧은 올리고머 블럭의 합성

다음 올리고머 실시예13에서와 같이 합성하였다 : 5'FMOC-GUU-트리틸(블럭1), 5'FMOC-CGGG-트리틸(블럭2), 5'FMOC-CGCCA-트리틸(블럭3), 5'FMOC-COGU-트리틸(블럭4).

C. 지지체 결합 링커에 첫번째 블럭의 첨가

블럭1 올리고머 1밀러몰을 DMF 20m에 현탁하여 DBU(1,8-디아자비시클로[5,4,0]운데-7-센) 0.4㎖을 첨가하였다. 5분후 에테르 200㎖을 첨가하고 현탁액을 잘 교반하고 여과하였다. 여과물을 디클로로메탄 20㎖에 재현탁하고 4개의 30㎖원심분리 튜브에 분배하였다. 각 튜브에 에테르 25㎖을 첨가하고 잘 섞고 원심분리하였다. 상층액을 버리고 펠리트를 감압하에서 건조하였다. 이 올리고는 DMF 12㎖에 재현탁하고 상기 A에서 제조된 고체 합성 지지체 컬럼에 첨가하였다. 유리 비드의 베드를 주기적으로 흔들어 비드의 모든 내부 표면에 올리고머 블럭을 완전하게 접근 가능하도록 하였다. 실온에서 2시간후 디클로로메탄으로 칼럼을 철저하게 세척하였다. 세척물에 존재하는 비결합 올리고머 블럭을 회수하고 재이용하였다.

D. 탈트리틸화 및 활성

디클로로메탄 88㎖, 트리플루오로에탄올 10㎖ 및 시아노아세트산 2g으로 이루어진 용액을 컬럼에 천천히 통과시킴으로써 지지체-결합 올리고머 블럭을 탈트리틸화 하였다. 디클로로메탄 40㎖로 컬럼을 세척한후 디클로로메탄중의 1% N-에틸모르폴린 40㎖로 세척하였다. 그 다음 디클로로메탄 50㎖컬럼을 다시 세척하였다. DIPAEIB(실시예9에서와 같이 제조) 5㎖ 및 에틸디클로로포스페이트 3㎖를 함유하는 디클로로메탄 100㎖를 컬럼에 천천히 통과시킴으로써 결합 올리고머말단을 활성화하였다. 그 다음 클로로포름 100㎖로 컬럼을 세척하였다.

E. 지지체-결합 올리고머에 다음 블럭의 계속적 첨가

올리고머 블럭 2 1밀리몰을 DMF 20㎖에 현탁하고 DBU(1,8-디아자비시클로[5,4,0]운데-7-센) 0.4㎖을 현탁액에 첨가하였다. 5분후 에테르 200㎖을 첨가하고 현탁액을 잘 교반하고 여과하였다. 디클로로메탄 20㎖에 여과물을 재현탁하고 4개의 30㎖원심분리 튜브에 분배하였다. 각 튜브에 에테르 25㎖을 첨가하였다. 튜브를 잘 흔들고 원심분리하였다. 상층액을 버리고 펠리트를 감압하에서 건조하였다. 올리고머를 커플링 용액(디클로로메탄 8㎖, 테트라메틸렌 술폰 4㎖ 및 DIPAEIB(실시예 9에서와 같이 제조 0.5㎖)에 재현탁하였다. 용액 1 내지 2㎖만이 컬럼배드위에 남을때까지 합성 컬럼의 베드에 용액을 천천히 주입하였다. 지지체를 주기적으로 흔들어 비드의 모든 내부구멍 표면에 커플링용액이 완전히 접근할 수 있게 하였다. 실온에서 2시간후 디클로로메탄으로 컬럼을 철저하게 세척하였다.

상기와 동일한 방법으로 블럭3 및 4를 첨가하였다.

F. 지지체로부터의 절단

1mm 통로-길이 플로우셀을 통하여 290nm에서 용출액을 모니터하면서 링커를 절단하기 위한 용액(부피부, 디에틸말로네이트 6부, DBU 12부, 테트라메틸렌 술폰 41부, 디클로로메탄 41부)을 컬럼에 천천히 통과시켰다. 모든 중합체가 용출될 때까지 (일반적으로 약 30분) 용출물을 모았다. 감압하에서 디클로로메탄을 제거하였다. 잔류물에 DBU를 중화하기에 충분한 수성 NaHPO을 첨가하고 그 다음 다량의 물을 첨가하여 중합체를 침전시켰다. 고체 생성물을 모우고 건조하였다.

G. 구조적 특성확인, 탈보호, 정제 및 테스팅

완전히 보호된 16 합체 생성물을 탈보호하고 정제하고 실시예14에서 기술한 바와같이 분석하였다. 탈보호 및 정제후, 이 실시예의16 합체를 실시예14에서 기술한 바와같이 제조된 16합체 중합체와 근본적으로 동일한 생물학적 활성 및 그 표적 DNA와 근본적으로 동일한 T수치를 나타냈다.

[실시예 16]

허피스 단순 바이러스 I (HSV-I)의 스플라이스 접합부를 표적으로 하는 모르폴리노 중합체의 단계적 고체상 합성

본 실시예에서는 포스포디아미데이트-결합 골격을 함유하는 중합체(X는 N(CH)), Y는 산소 및 Z는 산소인 제4도의 구조(B-B)를 고체 지지체상에서 단계적으로 어셈블리하는 것에 대하여 기술한다. 서열 5'-CGUUCCUCCUGC를 가지는 이 중합체는 HSV-I의 스플라이스 접합부위를 표적으로 한다(Atencio et al.).

A. 고체 지지체에의 절단가능 링커의 부착

실시예 15, A에서 기술된 바와같이 절단가능 링커를 고체 지지체에 부착하였다.

B. 지지체에 첫번째 단량체의 커플링

모르폴리노 고리질소에 트리틸부를 함유하고 5' 메릴렌에 메틸아민을 함유하는 모르폴리노 C소단위(실시예4에서와 같이 제조) 1 mmole을 DMF 12㎖에 현탁하고, 실시예 15, A에서 기술된 바와 같이 고체 합성 지지체를위해 제조된 컬럼에 첨가하였다. 유리 비드의 베드를 주기적으로 흔들어 비드의 모든 내부표면에 첫번째 소단위가 완전하게 접근할 수 있도록 하였다. 실온에서 1시간후 디클로로메탄으로 컬럼을 철저하게 세척하였다. 세척물에 남아있을 비결합 소단위는 회수하고 재이용할 수 있다.

C. 커플링 사이클

a. 탈트리틸화

디클로로메탄 88㎖, 트리플루오로에탄올 10㎖ 및 시아노아세트산 2g 을 함유하는 용액을 컬럼에 천천히 통과시킴으로써 지지체-결합 소단위를 탈트리틸화하였다. 디클로로메탄 40㎖로 세척한후 디클로로메탄중의 1% N-에틸모르폴린 40㎖로 세척하고 최종적으로 클로로포름 100㎖로 세척하였다.

b. 성장 사슬에의 소단위의 첨가

소단위(실시예2에서와 같이 제조되고 실시예9, D에서 기술된 바와 같이 N,N-디메틸아미노디클로로포스페이트로 활성화) 1mmole을 커플링 용액(디클로로메탄 8㎖, 테트라메틸렌 술폰 4㎖ 및 DIPAZIB(실시예 9에서와 같이 제조 0.5㎖)에 현탁하였다. 용액 1 내지 2 ㎖만이 베드위에 남을때까지 합성 컬럼의 베드에용액을 천천히 주입하였다. 지지체를 주기적으로 비드의 모든 내부표면에 커플링 용액이 완전하게 접근할 수 있도록 하였다. 실온에서 1시간후 디클로로메탄으로 컬럼을 철저하게 세척하였다. 세척물에 비결합 소단위는 회수하고 재사용할 수 있다.

c. 미반응 사슬 말단의 캡핑

무수아세트산 2㎖ 및 DIPAEIB 2㎖를 함유하는 디클로로메탄(실시예9에서와 같이 제조) 50밀리리터를 컬럼에 첨가하였다. DIPEIB 2㎖를 함유하는 메탄올 100㎖로 컬럼을 세척한후 디클로로 메탄 200㎖를 이용하여 다시 세척하였다.

이 커플링 사이클(상기 a,b,c로 구성)를 이용하여 소단위 G, U, U, C, C, U,C,C,U,G 및 C를 순서대로 첨가하였다.

D. 지지체로부터 절단

실시예15에서 기술된 바와 같이 지지체로부터 완전히 중합체를 절단하였다.

E. 구조적 특성확인, 탈보호, 정제 및 테스트

완전하게 보호된 12합체 생성물을 실시예14에서와 같이 탈보호하고 정제하고 분석하였다. 탈보호 및 정제후 상기에서 제조된 허피스-표적 12합체는 상보 DNA(두 가닥은 역평행)와 쌍을 지을 때 47℃의 T(실시예12에서와 같이 측정)을 가지는 것으로 밝혀졌다; 각 가닥은 2마이크로몰 농도로 존재하였다.

F. 생물학적 활성의 예비평가

표적 바이러스, HSV-I에 감염된 쥐를 보호하는 능력에 대해서 본 실시예의 12 합체를 테스트하였다. HSV-I로 눈에 감염된 쥐는 감염 5일후 65%의 생존율을 나타냈다. 본 실시예의 12-합체를 0.3mmole 농도로 함유하는 국소연고로 허피스 감염쥐를 치료할 경우 감염 5일후 생존율이 90%로 증가하였다. 본 발명의 특정 구체예, 방법 및 이용에 대하여 기술하고 있지만 본 발명에서 벗어나지 않는 본 발명의 다양한 변경 및 수정이 가능함을 인식하여야 한다. 특히, 바람직한 중합체 골격 구조를 기술하고 예시하고 있지만 다른 모르폴리노-기저 중합체도 상기 골격의 제한사항 및 요구사항에 따라 구성될 수 있음을 인식하여야 한다.

Claims (25)

1. 하기식(A)

   의 형태로 표시되는 모르폴리노 소단위 구조들로 구성되며, (i) 상기 구조들은, 하나의 소단위의 모르폴리노 질소를, 인정하는 소단위의 5'엑소시클릭 탄소에 연결시키는, 1 내지 3 원자길이의 비전하, 인-함유 키랄 결합에 의하여 함께 연결되고, (ii) P_i는, 염기-특이적 수소결합에 의하면, 폴리뉴클레오티트의 염기에 결합하는데 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기-페어링부인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 표적에 서열-특이적 결합이 가능한 중합체 조성물.
2. 제2항에 있어서, P_i는:

   (X는 H, CH₃, F, Cl, Br 또는 I)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제1항에 있어서, 결합 구조는 :

   로 구성되는 군으로부터 선택되는 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제1항에 있어서, 결합은 다음식:

   으로 표시되는 형태인 것을 특징으로 하는 조성물. 상기에서 P_i는 염기-특이적 수소결합을 통하여 폴리뉴클레오티드의 염기에 효과적으로 결합하는 퓨린 또는 피리미딘 염기-페어링부이고, X는 F, CH₂R, O-CH₂R, S-CH₂R 또는 NR₁R₂이고; 여기서 각각의 R, R₁, 및 R₂는 H, CH₃또는 상기 염기- 특이적 수소 결합을 방해하지 않는 다른부이다.
5. 제1항에 있어서, 결합은 다음 식:

   으로 표시되는 형태인 것을 특징으로 하는 조성물. 상기에서 P_i는 염기-특이적 수소결합을 통하여 폴리뉴클레오티드의 염기에 효과적으로 결합하는 퓨린 또는 피리미딘 염기-페어링부이고, X는 F, CH₂R, O-CH₂R, S-CH₂R 또는 NR₁R₂이고; 여기서 각각의 R, R₁, 및 R₂는 H, CH₃또는 상기 염기- 특이적 수소 결합을 방해하지 않는 다른부이다.
6. 제1항에 있어서, 결합은 다음 식:

   으로 표시되는 형태인 것을 특징으로 하는 조성물. 상기에서 P_i는 염기-특이적 수소결합을 통하여 폴리뉴클레오티드의 염기에 효과적으로 결합하는 퓨린 또는 피리미딘 염기-페어링부이고, Z는 0 또는 S이다.
7. 제1항에 있어서, 결합은 다음 식:

   으로 표시되는 형태인 것을 특징으로 하는 조성물. 상기에서 P_i는 염기-특이적 수소결합을 통하여 폴리뉴클레오티드의 염기에 효과적으로 결합하는 퓨린 또는 피리미딘 염기-페어링부이고, Z는 0 또는 S이다.
8. 제1항에 있어서, 결합은 다음 식:

   으로 표시되는 형태인 것을 특징으로 하는 조성물. 상기에서 P_i는 염기-특이적 수소결합을 통하여 폴리뉴클레오티드의 염기에 효과적으로 결합하는 퓨린 또는 피리미딘 염기-페어링부이고, X는 F, CH₂R, O- CH₂R, S- CH₂R 또는 NR₁R₂이고; 여기서 각각의 R, R₁, 및 R₂는 H, CH₃또는 상기 염기- 특이적 수소 결합을 방해하지 않는 다른부이다.
9. 제1항에 있어서, 결합은 다음 식:

   으로 표시되는 형태인 것을 특징으로 하는 조성물. 상기에서 P_i는 염기-특이적 수소결합을 통하여 폴리뉴클레오티드의 염기에 효과적으로 결합하는 퓨린 또는 피리미딘 염기-페어링부이고, X는 F, CH₂R, O- CH₂R, S- CH₂R 또는 NR₁R₂이고; 여기서 각각의 R, R₁, 및 R₂는 H, CH₃또는 상기 염기- 특이적 수소 결합을 방해하지 않는 다른부이다.
10. 제1항에 있어서, 수성 배지에서 분자의 용해성을 효과적으로 증가시키는 부를 한쪽 또는 양 말단에 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
11. 제10항에 있어서, 한쪽 또는 양 말단의 부는 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 조성물.
12. 제1항에 있어서, 적어도 3개의 모르폴리노 소단위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
13. 제1항에 있어서, P_i의 적어도 하나는 2,6-디아미노 퓨린인 것을 특징으로 하는 조성물.
14. 제1항에 있어서, P_i의 적어도 하나는 5-할로우라실인 것을 특징으로 하는 조성물.
15. 제1항에 있어서, P_i의 적어도 70%는 2-아민 함유 퓨린인 것을 특징으로 하는 조성물.
16. 제15항에 있어서, P_i의 적어도 하나는 2,6-디아미노 퓨린인 것을 특징으로 하는 조성물.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 고체 지지체에 부착된 것을 특징으로 하는 조성물.
18. 샘플에서 선택된 표적 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 방법에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드와 제1항의 중합체를 접촉시키는 단계; 및 보고 그룹의 존재를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 중합체는, (i) 선택된 표적 서열에 결합가능한 일련의 염기-페어링부를 가지며, (ii) 검출가능한 보고 그룹으로 표지되고, 상기 폴리뉴클레오티드와 중합체를 접촉시키는 단계는 중합체와 표적 서열간의 혼성화 복합체의 형성을 가능하게 하기 위하여 유효한 조건하에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 단일-스트랜드인 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제19항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 RNA인 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제18항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 이중-스트랜드인 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 이중 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
24. 샘플로부터, 선택된 표적 서열을 가지는 핵산를 분리하는 방법에 있어서, 상기 핵산과 제1항의 중합체를 접촉시키는 단계; 및 상기 핵산을 분리하는 단계를 포함하며, 상기 중합체는, (i) 선택된 표적 서열에 결합가능한 일련의 염기-페어링부를 가지며, (ii) 고체 지지체에 부착되고, (iii) 상기 헥산과 중합체를 접촉시키는 단계는 중합체와 표적 서열간의 혼성화 복합체의 형성을 가능하게 하기 위하여 유효한 조건하에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 분리하는 단계는 혼성화 복합체를 변성시킴에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.