JP4941719B2 - 液体吐出装置およびバイオチップの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、液体吐出装置およびバイオチップの製造方法、特に、生体試料を基板上に固定するバイオチップの製造方法、それに用いる装置に関するものである。

近年、遺伝的疾患の治療や予防に、ＤＮＡ（deoxyribonucleic acid、デオキシリボ核酸）検査又は抗体検査が利用され始めている。このような検査では、生体試料（検体）を膨大な数の核酸やタンパク質に反応させる必要があり、小量の検体で大量の検査を簡便に行えるバイオチップが用いられている。ここで言うバイオチップは、基板上に複数の生体試料が配置されたものである。このような試料は、一般に、ピンヘッドにより植え付けられているが、ピンヘッドを用いた方法では操作に時間を要するため、最近、液滴吐出装置の利用が検討されている。例えば、下記特許文献１（特開平１１−１８７９００号公報）にはインクジェットヘッドを用いたプローブＤＮＡの固相上へのスポッティング技術が開示されている。

また、下記特許文献２（特表２００３−５２４１９３号公報）には、隣接するサンプルの交差汚染を防止するために、ピラー上の高い位置にサンプルを配置したチップが記載されている。
特開平１１−１８７９００号公報 特表２００３−５２４１９３号公報

本発明者は、バイオチップやそれを用いた分析システムの研究、開発に従事している。このバイオチップを形成する際、生体試料の塗布条件は、バイオチップの用途により多岐に渡る。また、検査（試料）の種類によっては、試料の量が多く必要な場合もある。よって、バイオチップによっては、複数の液滴を重ねて吐出することにより、必要量の生体試料を固定する手法が取られている。

しかしながら、追って詳細に説明するように、複数の液滴を重ねて吐出した場合、（１）気泡の巻き込みや（２）液滴集の液面の移動が見られ、乾燥後の生体試料膜厚にばらつきが生じる。その結果、試薬との反応性にばらつきが生じ、正確な判定ができないといった問題があった。

また、単一液滴で必要量を吐出する場合には、液滴の飛散により、所定量の液を基板上に確保することが困難であった。特に、低粘度の試料においては、液滴が飛散し易いといった問題があった。

また、上記特許文献２に記載の液滴の移動を抑える技術を用いても、基板に撥水・親水処理を施す、また、ピラーを設けるなどの工夫が必要である。このような場合、製造コストの増加を招き、また、生体試料の性質によっては、十分な効果がでない場合もある。

よって、本発明は、バイオチップの特性を向上させるバイオチップの製造方法およびそれに用いられる液体吐出装置を提供することを目的とする。特に、生体試料を基板上に良好に固定する方法および装置を提供することを目的とする。

（１）本発明に係る液体吐出装置は、液体を吐出するノズル部と、前記ノズル部と対向して配置され、前記液体の吐出先である基板が載置されるステージと、前記ステージに接続された冷却手段と、を有し、前記基板は、前記冷却手段により−１０℃以上−５℃以下の範囲で冷却されるものである。

かかる構成によれば、冷却手段により生体試料を基板上に固定することができる。

例えば、前記液体は生体試料であり、前記基板上には、固定された前記生体試料が形成される。かかる構成により、バイオチップの特性を向上させることができる。

例えば、前記冷却手段は、ペルチェ素子である。かかる構成によれば、簡易な手段で効率よく基板を冷却することができる。

例えば、前記冷却手段は、前記基板を前記生体試料の粘度を１００ｃｐ以下とする温度まで冷却する。このように、生体試料の粘度を上昇させることにより基板上に固定してもよい。

例えば、前記冷却手段は、前記基板を前記試料の凝固点以下に冷却する。かかる構成によれば、基板に試料を固定することができる。

例えば、前記ノズル部と前記基板とは相対的に移動可能に制御される。かかる構成によれば、試料の吐出位置を制御することができ、吐出量が多い場合であっても、膜厚や試料形状の制御を容易に行うことができる。

（２）本発明に係るバイオチップの製造方法は、液体状の生体試料を−１０℃以上−５℃以下の範囲で冷却された基板上に吐出することにより、前記基板上に前記生体試料をほぼ固定するものである。

かかる方法によれば、生体試料を基板上に固定することができる。

（３）本発明に係るバイオチップの製造方法は、液体状の生体試料を冷却された基板上に吐出することにより、前記基板上にほぼ固定した前記生体試料を形成する工程と、前記基板上の前記生体試料を真空凍結乾燥する工程と、を有する。

かかる方法によれば、基板上に凍結乾燥された生体試料を形成することができる。

例えば、前記基板は、前記生体試料の粘度を１００ｃｐ以下とする温度まで冷却される。このように、粘度を向上させることにより、基板上に生体試料を固定することができる。

例えば、前記基板は、前記生体試料の凝固点以下に冷却される。かかる方法によれば、基板上に生体試料を完全に固定することができる。

例えば、前記基板は、−４℃以下まで冷却される。また、前記基板は、−１０℃以上−５℃以下の範囲で冷却される。

以下、図面を参照しながら本実施の形態について説明する。なお、同一の機能を有するものには同一もしくは関連の符号を付し、その繰り返しの説明を省略する。

図１は、本実施の形態の液滴吐出装置（液体吐出装置、液滴塗布装置、基板冷却装置、バイオチップ製造装置）の構成を示す図である。

図１に示すように、液滴吐出装置は、液滴吐出部１００、ステージ（作業台）１０１、Ｙ方向駆動軸１０２、Ｘ方向ガイド軸１０４、ステージ駆動モータ１０５、基台１０６、制御部１０７を備えて構成されている。また、ステージ１０１上には、バイオチップに用いられる基板１０８が載置されている。基板１０８は、ステージ１０１上に例えば４８枚並べられている。この基板１０８上に所望の生体試料溶液（生体溶液、プローブ溶液）をスポッティングすることにより、バイオチップ（プローブアレイ、マイクロアレイ、生体試料サンプル）を製造できる（図３参照）。

Ｙ方向駆動軸１０２には、Ｙ方向駆動モータ１０３が接続されている。Ｙ方向駆動モータ１０３は、例えばステッピングモータ等であり、制御部１０７からＹ軸方向に対向する動作信号が供給されると、Ｙ方向駆動軸１０２を回転させる。Ｙ方向駆動軸１０２が回転させられると、液滴吐出部１００はＹ方向に移動する。

Ｘ軸方向ガイド軸１０４は、基台１０６に固定されている。また、ステージ１０１には、ステージ駆動モータ１０５が接続されている。ステージ駆動モータ１０５は、例えばステッピングモータ等であり、制御部１０７からＸ軸方向に対応する駆動信号が供給されると、ステージ１０１をＸ方向に移動させる。すなわち、ステージ１０１をＸ方向に駆動し、液滴吐出部１００をＹ方向に駆動することによって、液滴吐出部１００を基板１０８上の所望の場所に自在に移動させることができる。なお、液滴吐出部１００および基板１０８を相対的に移動させる手段としては、上記構成に限られず適宜変更可能である。

制御部１０７は、生体試料溶液の吐出タイミング、吐出回数等を制御する為の駆動信号を液滴吐出部１００に供給する。また、制御部１０７は、Ｙ方向駆動モータ１０３及びステージ駆動モータ１０５のそれぞれに対して、これらの動作を制御する為の駆動信号を供給する。

次いで、液滴吐出部１００の構成例について説明する。図２は、液滴吐出ヘッドの構成を示す図である。このような液滴吐出ヘッド３０が液滴吐出部１００内に、ノズル３２１が基板１０８と対向するよう内蔵される。この液滴吐出ヘッドは、いわゆる静電駆動方式である。

図２（Ａ）に示すように、液滴吐出ヘッド３０は、カバーガラス３１と加圧室基板３２と電極基板３３とによって構成されている。また、図２（Ｂ）に示すように、加圧室基板３２には、タンク（図示せず）から供給される液体の受領口３２３と、加圧室３２２とノズル３２１が連通するように形成されている。加圧室３２２の壁の一部には振動板が設けられており、この振動板と対向する側であって、流路とは反対側に、空隙を介して電極３３４（対向電極）が設けられている。振動板と対向電極３３４に電位差を与えると、振動板は、対向電極３３４に静電圧力により引き付けられて、加圧室に負圧を発生させる。この電位差を、解除した際に、振動板の復元力により、加圧室内の液体がノズル３２１から吐出される。

上記ノズル３２１から基板１０８上に生体試料溶液をスポッティングすることによりバイオチップ（プローブアレイ）を形成することができる（図３参照）。図３は、基板上にアレイ状に配置された生体試料（スポット）を示す上面図である。

なお、液滴吐出部１００に液滴吐出ヘッド３０を複数内蔵させてもよい。この場合、タンクを各ヘッドに共通に配置してもよいし、ヘッド毎に個別にタンクを接続してもよい。タンクを共通とすれば、同一の生体試料溶液をスポッティングすることができる。また、個別にタンクを配置すれば、多種の生体試料溶液をスポッティングすることができる。もちろん、１の基板に１のスポットを形成してもよいし、１の基板に複数のスポットを形成してもよい。

また、図２においては、液滴吐出ヘッド３０として、静電駆動方式のヘッドを例示したが、これに限らず、ピエゾ方式、気泡方式のヘッドも採用することができる。なお、貯留する液体に生体材料を用いる場合には、生体材料の分解・変質等を防止するため、瞬間的な発熱を併有しない静電駆動方式若しくはピエゾ方式のヘッドを採用することが好ましい。

上記液滴吐出装置であれば、より多くの種類の生体試料溶液を基板１０８上に吐出することができ、作業効率を向上させることが可能となる。

ここで、本実施の形態の液滴吐出装置の特徴は、基板１０８が搭載されるステージ１０１に冷却手段１１０が接続されている点にある（図１参照）。かかる構成部分を図４の模式図を参照しながら説明する。図４は、本実施の形態の液滴吐出装置の要部断面図である。

図４に示すように、液滴吐出部１００のノズル３２１の下部に基板１０８が配置されている。この基板１０８は、ステージ１０１上にはめ込まれ、固定されている。ステージ１０１の裏面には、冷却手段としてペルチェ素子１１０Ａが接続（配置）されている。

図５に、ペルチェ素子１１０Ａの断面図を示す。図示するように、ｐ型半導体１とｎ型半導体３が導電性膜５Ａ、５Ｂを介して複数対接続されている。これらの半導体に電位を印加することにより、導電性膜５Ｂ側が冷却される。これは、ＰＮ接合部に電流を流すと、Ｎ→Ｐ接合部では吸熱現象が生じ、Ｐ→Ｎ接合部では放熱現象が生じること（ペルチェ現象）による。ペルチェ素子を用いることで、簡易な構成で効率良く冷却することができる。ステージ１０１は、熱伝導性の良好な材料で形成されることが好ましい。例えば、アルミニウム（Ａｌ）や銅（Ｃｕ）合金材料を用いることが好ましい。なお、１１０Ｂは、配線を示す。

冷却手段としては、ステージ１０１内に配管を内蔵させ、この配管内に冷却ガス（例えば、ヘリウム（Ｈｅ）など）や冷却水などを循環させる構成としてもよい。

このように、本実施の形態の液滴吐出装置によれば、冷却手段１１０によりステージ１０１を介して基板１０８を冷却することができるため、ノズル３２１から基板１０８上に滴下された生体試料溶液３５０を凍結（凝固）させ、基板１０８上に固定することができる。

次いで、バイオチップの製造方法に従ってさらに詳細に説明する。

まず、図４に示すように、ステージ１０１上に基板１０８を配置する。この際、ペルチェ素子１１０Ａにより基板１０８は、生体試料溶液の凝固点以下の温度、例えば、−５℃以下に冷却されている。ここで、装置（チャンバー）内を、乾燥窒素雰囲気とすることで、基板１０８に対する結露を防止することができる。

次いで、ノズル３２１から生体試料溶液３５０を基板１０８上に吐出する。ノズル３２１内の生体試料溶液は例えば室温（２４℃）に保持されている。なお、試料の変質を防止するため室温以下（但し、吐出可能な温度）、例えば１０℃程度に保持してもよい。

生体試料溶液は、ＤＮＡやタンパク質等の水溶性の試料を含んだ溶液である。溶媒は、水である。よって、吐出された生体試料溶液３５０は、基板１０８上で凍結する。一回の吐出量は、装置によっても異なるが、ピコリットルオーダーである。よって、基板１０８上に到達した生体試料溶液３５０は短時間で凍結する。さらに、試料の必要量に応じて、連続して液滴を吐出すれば、図４に示すように、凍結試料３５０ａを積み上げることが可能である。

このように、本実施の形態によれば、高い位置決め精度で基板１０８上に生体試料を固定することができる。

例えば、生体試料を固定する方法としては、図６に示す方法がある。図６は、生体試料溶液の移動の様子、および生体試料溶液を基板に固定する方法を示す断面図である。図６（Ａ）に示すように、単に基板上に生体試料溶液を吐出しただけでは、基板の表面状態や帯電状態により液滴が移動する。この移動を防止するため、図６（Ｂ）〜（Ｄ）に示す方法がある。図６（Ｂ）は、試料の固定位置を親水処理し、その周りを撥水処理した場合、図６（Ｃ）は、試料の固定位置に凹部を形成した場合、図６（Ｄ）は、試料の固定位置にピット（ピラー）を形成した場合を示す。このように、試料の固定には、基板表面の特殊処理や基板の加工が必要である。よって、コストの増加を余儀なくされる。また、バイオチップ内に試料の分析のための電極を配置する場合には、上記処理や加工が行えない場合も多い。

これに対し、本実施の形態においては、基板の処理や加工の必要がなく、所望の位置に生体試料を固定させることができる。また、電極や試薬などがあらかじめ形成された基板上の所望の位置に生体試料を固定させることができる。例えば、曲面部にも固定可能である。なお、もちろん上記処理や加工を施した基板に本実施の形態を適用しても何ら問題はない。

図４においては、数滴の液滴を吐出させ、凍結試料を積み上げたが、図７に示すように、ノズル３２１と基板１０８とを相対的に移動させ、凍結試料塊（膜）を形成してもよい。図７は、本実施の形態のバイオセンサの製造方法を示す要部断面図である。

図示するように、ノズル３２１の位置を移動させながら生体試料溶液３５０を吐出することで、所望の位置に必要量の生体試料を固定（凍結）させることができる。例えば、図７（Ａ）に示すように、第１段の液滴を液滴が重ならないよう一定の間隔を開けて吐出し、凍結試料３５０ａとした後、第２段の液滴を第１段の液滴間に吐出する。次いで、第３段の液滴を第２段の液滴間に吐出し、さらに、第３段の液滴間に第４段の液滴を吐出する。

このように、本実施の形態によれば、吐出量が多くなっても、凍結試料３５０ａ上に生体試料溶液３５０を吐出することができ、安定的に生体試料を固定（形成）することができる。

これに対し、基板を冷却しない場合には、図８に示すように、液滴の滴下に伴い、基板上の液溜りが大きくなる。この中に、さらに液滴が滴下されると、液溜り中に波紋ができ、その内部に気泡が混入する。このような生体試料を乾燥させると試料の厚さにムラが生じ、以降の分析工程において、試薬との反応性が低下する、もしくは、反応結果にムラが生じ正確な判定ができないなどの不都合が生じる。図８は、気泡の巻き込みの様子を示す模式図である。

これに対し、本実施の形態によれば、吐出量が多くなっても、上記気泡の巻き込みを低減できる。よって、所望の位置に所定量の試料を固定できる。また、試料量や膜厚の均一性を向上させることができる。よって、判定ミスを低減できる。

例えば、血糖値測定などにおいては、ＤＮＡ判定に必要な試料量の１０００倍程度の試料が必要である。本実施の形態においては、このような血糖値測定のための試料の固定を高精度に行うことができる。その結果、気泡による試料の形状崩れを防止でき、反応ムラによる試薬の濃淡を低減できる。よって、試薬の濃淡を光学的に読み取る際の測定ミスを低減できる。

なお、図７に示す形状に限られず、本実施の形態によれば、薄く大きい凍結試料（スポット）や、狭く高い（高アスペクト比の）凍結試料などを形成することができる。このように、本実施の形態によれば、凍結試料の形状を必要に応じて制御することが可能である。

次いで、凍結試料３５０ａが形成された基板１０８を凍結乾燥装置内に搬送し、凍結試料３５０ａを真空凍結乾燥（凍結乾燥、真空乾燥、減圧乾燥、フリーズドライ）する。この際、基板上に試料が固定（凝固）されているため、ハンドリングが容易である。また、冷却されているため、生体試料の変質（タンパク質の凝固等）を低減できる。さらに、凍結乾燥することにより、不要な溶媒を昇華（揮発）させることができる。また、真空乾燥させることにより多孔質の試料となり、試薬との反応面積が増加する。よって、正確な測定が可能である。また、あらかじめ、凍結試料３５０ａを高アスペクト比で形成しておけば、さらに、反応性を向上させることができる。

この後、凍結乾燥試料と試薬とを反応させ、分析（検査、測定、判定）を行う。例えば、血糖値を光学的に測定する。分析に必要な、試薬や電極は、予め基板１０８上に配置しておいても良いし、当該基板１０８の試料面を他のμＴＡＳチップ（マイクロ総合分析システム：Micro-Total Analysis Systems）の検査面と接触（接合）させ、分析を行っても良い。

なお、上記工程では、真空乾燥を行ったが、凍結試料を解凍した後、自然乾燥してもよい。また、他の乾燥方法を用いてもよい。但し、加熱乾燥は、生体試料の変質を伴うおそれがあるため、真空乾燥や室温以下での乾燥が好ましい。また、この際、解凍試料の移動を防止するため、防振台上で処理を行うことが好ましい。

以上詳細に説明したように、本実施の形態の液滴吐出装置やバイオチップの製造方法によれば、生体試料を基板上に良好に固定することができる。また、バイオチップの特性を向上させることができる。

なお、上記実施の形態によれば、凝固（凍結）を例に説明したが、冷却することにより試料の粘性が向上する。例えば、粘度が１００ｃｐ以下では、液滴の移動がほとんど無く、かかる粘度となる程度の冷却でも十分効果はある。即ち、凝固により完全に固定しなくても、粘度を１００ｃｐ以下とすることで、試料をほぼ固定することができる。また、水等の無機溶媒が多用される生体試料においては、−４℃以下、より好ましくは−１０℃以上−５℃以下の範囲に基板を冷却することで、十分効果がある。

また、本実施の形態においては、生体試料を例に説明したが、他の試料の検査（例えば、水質検査試料）などにも適用可能である。但し、生体試料は、高温で変質、分解するものが多く、冷却固定であれば、その性質を変化させることなく維持できるため、本発明は、生体試料の検査に用いて特に効果的である。

また、上記発明の実施の形態を通じて説明された実施例や応用例は、用途に応じて適宜組み合わせて、又は変更若しくは改良を加えて用いることができ、本発明は上述した実施形態の記載に限定されるものではない。

図１は、本実施の形態の液滴吐出装置（バイオチップ製造装置）の構成を示す図である。 図２は、液滴吐出ヘッドの構成を示す図である。 図３は、基板上にアレイ状に配置された生体試料を示す上面図である。 図４は、本実施の形態の液滴吐出装置の要部断面図である。 図５は、ペルチェ素子の構成を示す断面図である。 図６は、生体試料溶液の移動の様子、および生体試料溶液を基板に固定する方法を示す断面図である。 図７は、本実施の形態のバイオセンサの製造方法を示す要部断面図である。 図８は、気泡の巻き込みの様子を示す模式図である。

符号の説明

１…ｐ型半導体、３…ｎ型半導体、５Ａ、５Ｂ…導電性膜、３０…液滴吐出ヘッド、３１…カバーガラス、３２…加圧室基板、３３…電極基板、１００…液滴吐出部、１０１…ステージ、１０２…Ｙ方向駆動軸、１０３…Ｙ方向駆動モータ、１０４…Ｘ方向ガイド軸、１０５…ステージ駆動モータ、１０６…基台、１０７…制御部、１０８…基板、１１０…冷却手段、１１０Ａ…ペルチェ素子、１１０Ｂ…配線、３２１…ノズル、３２２…加圧室、３２３…受領口、３３４…電極（対向電極）、３５０…生体試料溶液（液滴）、３５０ａ…凍結試料

Claims (7)

1. 液体を吐出するノズル部と、
   前記ノズル部と対向して配置され、前記液体の吐出先である基板が載置されるステージと、
   前記ステージに接続された冷却手段と、
   を有し、前記基板は、前記冷却手段により−１０℃以上−５℃以下の範囲で冷却されることを特徴とする液体吐出装置。
2. 前記液体は生体試料であり、前記基板上には、固定された前記生体試料が形成されることを特徴とする請求項１記載の液体吐出装置。
3. 前記冷却手段は、ペルチェ素子であることを特徴とする請求項１又は２記載の液体吐出装置。
4. 前記冷却手段は、前記基板を前記液体の粘度を１００ｃｐ以下とする温度まで冷却することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項記載の液体吐出装置。
5. 前記冷却手段は、前記基板を前記液体の凝固点以下に冷却することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項記載の液体吐出装置。
6. 前記ノズル部と前記基板は相対的に移動可能に制御されることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項記載の液体吐出装置。
7. 液体状の生体試料を−１０℃以上−５℃以下の範囲で冷却された基板上に吐出することにより、前記基板上に前記生体試料をほぼ固定することを特徴とするバイオチップの製造方法。

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