JP4118858B2 - 微量反応追跡装置および反応方法 - Google Patents

Description

本発明は、撥水基板上で、水を溶媒とする反応させたい物質を含む液体が液滴となる現象と、液滴を転がして所定の位置に移動できる現象を利用し、反応させたい溶質を含む複数の極微量液滴を基板上で衝突させ、それぞれの液滴が含む溶質の化学反応を高速に行なわせる反応装置及び反応方法に関する。

多くの場合、化学反応においては、反応させたい物質同士を混合して反応を行うが、このため、一般的には反応させたい溶質を溶液状態にして、別々の容器に入れ、片方の容器から他方の容器に溶液を添加し反応を開始させる。２種の溶液は混じり合い、反応が進行する。

ここで、反応の素過程を分析する方法として、ストップドフローと呼ばれる方法が知られている。これは、酵素反応のような、非常に高速で起こる反応を追跡するために開発された方法で、その装置は、たとえば、検出に用いる分光装置に取り付けて使用する。ストップドフローはミリ秒オーダーの反応を追跡するのに向いている。多くの場合、一定温度での測定が可能となっている。

原理は、２つの容器に数ｍｌの反応させる溶液を別々にシリンジに入れ、ピペットから急速に押し出して混合し、測定セル内で流れを止めて反応に伴って変化する物理量を高速記録するものである。

ストップドフローは、上記のように、ミリ秒オーダーの高速反応を追跡するのに適しているが、近年の生化学分野では、反応の微量化が進み、ほとんどの酵素反応は数μｌからおおくても数十μｌで反応が行われるようになってきた。生化学分野では、反応させたい試料の組み合わせが多岐にわたり、反応の微量化と、マルチ同時反応によるハイスループット化が主流である。

このような流れの下、従来の２本のシリンジに反応させたい液を入れ、同時にセルの中に高速で押し出すタイプのストップドフローでは、微量化とマルチ化が困難である点が問題となってきている。マイクロリットルオーダーの微量反応で同時に多種類の反応の反応素過程を追跡することのできる技術と装置のニーズが高まっている。

本発明は、このような世の中のニーズに答えるため、従来のストップドフローとは異なる原理の高速反応追跡が可能な極微量反応追跡装置を提案する。

本発明は、撥水基板上で水を主体とする溶媒が液滴となり、転がる現象を利用している。液滴はわずかな外力で任意の位置に移動できる。この現象を利用し、反応させたい溶質を含む複数の極微量液を液滴として基板上に配し、液滴同士を衝突させることで高速に反応を開始させる。液滴は基本的にサブマイクロリットルから数マイクロリットルであるので、瞬時に反応を開始させることができる。

近代生化学で必須となっているマイクロリットルオーダーでの高速な反応追跡が可能となるのみならず、ハイスループットが実現できる。

（実施例１）
実施例１では、ＤＮＡのハイブリダイゼーション過程を追跡する目的で本発明を用いる例で説明する。

図１（Ａ）は、本発明の実施に好適な反応基板１００の平面図、（Ｂ）は平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの断面図である。１はシリコン基板であり、例えば、その厚さは１ｍｍ、大きさは２０ｍｍ×２０ｍｍである。基板１の表面は疎水性領域２とされ、そのなかに、三つの親水性領域３_１，３_２，３_３が配列される。親水性領域３の大きさは、この親水性領域３に保持したい液滴の直径に比べ十分に小さい大きさ、例えば、０．０１ｍｍ^２である。三つの親水性領域３_１，３_２，３_３間は、幅の狭い、例えば、２μｍの親水性の溝４_１，４_２で結ばれる。５は位置決め用のマーカーであり、シリコン基板１の一面に形成される。

図１（Ｂ）で、基板１の中央部の全部が親水性領域となっているのは、断面位置が、三つの親水性領域３_１，３_２，３_３と、これらを結ぶ親水性の溝４_１，４_２であるからである。

親水性領域と疎水性領域の作成方法は、例えば、疎水性のシリコン基板１の上面を酸化して、一旦、全領域を親水性のＳｉＯ_２薄膜とする。その後、疎水性とすべき領域のＳｉＯ_２薄膜をフッ酸で溶解除去して疎水性領域を作成すれば良い。あるいは、基板１の材質が表面があらかじめＳiＯ₂薄膜形成してある親水性表面の場合、フッ素系樹脂，シリコン系樹脂等の疎水性材料を、その上に配置することで、疎水性領域を形成すれば良い。この場合は、疎水性領域中に存在する親水性領域が、疎水性材料の厚さだけ低くなったものとなる。図１の例は後者方法によって疎水性領域３，４を形成した例である。

実施例１では、予め、親水性領域３_１と３_３に反応させたい物質を含む液体の液滴を形成しておき、それぞれの液滴を親水性の溝４_１，４_２でガイドして親水性領域３_２に移動させ、親水性領域３_２で衝突させる。

図２（Ａ）は、本発明の実施に好適な反応基板１００の親水性領域３_１と３_３に反応させたい物質を含む液滴を構成するシステム構成の例を説明する概念図、（Ｂ）は、反応基板１００の親水性領域３に３_１と３_３に反応させたい物質を含む液滴が形成された反応基板１００の一部を示す平面図である。

図２（Ａ）では、反応させたい物質を含む液滴を形成するためのピペット１１の先端の液滴を光学的にモニターしながら反応基板１００の親水性領域３_１と３_３に反応させたい物質を含む液滴を形成する。１９はＸＹ方向に駆動されるステージであり、２７はステージ１９の駆動装置である。ステージ１９の上面には反応基板１００が載置される。反応基板１００の上部には、液滴に包含されるべき反応させたい物質を含む懸濁液１３があらかじめ吸い上げられて保持されているピペット１１が配置される。ピペット１１の根元部には、チューブ３０を介してシリンジポンプ３１が設けられ、シリンジポンプ３１には駆動装置３２が取り付けられている。シリンジポンプ３１が駆動装置３２により駆動されると、ピペット１１内の懸濁液１３が反応させたい物質とともに押し出される。なお、ピペット１１の根元部とチューブ３０との接続部が離れたように図示されているのは、ピペット１１を拡大して表示するためであり、分離されているわけではない。

また、ピペット１１の先端部に形成された液滴を反応基板１００の親水性領域３_１と３_３に移すためのピペットの上下動駆動装置３７が設けられる。ここでは、上下動駆動装置３７はピペット１１に連係するものとする。上下動駆動装置３７に、使用者により、ピペット１１を下げる信号が与えられると、ピペット１１は下に動き、ピペット１１の先端部に形成された液滴を反応基板１００の親水性領域３_１と３_３に移す。上下動駆動装置３７に、使用者により、ピペット１１を復旧させる信号が与えられると、ピペット１１は図に示す位置に戻る。ピペット１１の図に示す位置への復旧は、下げ操作から、パソコン２６により、タイムシーケンシャルに行われるものとしても良い。一点差線３９は上下動駆動装置３７とピペット１１との連係を意味する。

さらに、ピペット１１の先端部の近傍の内部および先端部に形成される液滴の大きさをモニターするための光学系を構成する光源１６、集光レンズ１７が設けられ、これに対向する位置で反応基板１００の下部にコリメートレンズ１８およびモニター２５が設けられる。したがって、反応基板１００およびステージ１９は、光学的に透明である必要がある。２６は、いわゆる、パソコンであり、モニター２５からの入力信号に応じて、あらかじめ格納してある所定のプログラムから得られる制御信号、および、使用者がモニター２５の表示画面を見ながら与える操作入力信号２８に応じて駆動装置２７，３２，３６および３７に必要な信号を与える。なお、ここでは、図示しなかったが、モニター２５の検出している画面と同一の表示をパソコン２６のモニターに表示するのが便利である。そうすれば、モニター２５は、小型のＣＣＤカメラとすることができる。また、操作入力信号２８は、パソコン２６の入力装置を介して与えられるものである。

なお、反応基板１００およびステージ１９が、光学的に透明でない場合には、上面から照明して、反射光によるモニターとすれば良い。

ここで、ピペット１１のサイズについて考えると以下のようである。ピペット１１は、その先端に、反応させたい物質を含む適当な大きさの液滴を構成できるようにすることが必要である。一方、ピペット１１内には、反応させたい物質を含む懸濁液１３をピペット１１で吸い上げてから使用するので、必要な大きさの液滴２１を構成するために必要な容積の懸濁液１３を保持できるものである必要がある。

反応基板１００の親水性領域３に反応させたい物質を含む液滴２１を形成する操作について以下説明する。まず、システムが起動されると、使用者は、図１（Ａ）で説明したマーカー５に着目して反応基板１００が所定の起動位置にあるように位置決めする。次に、反応させたい物質を含む液滴２１の載置位置をピペット１１の先端部に対応する位置に移動させる操作入力信号２８に応じて、駆動装置２７によりステージ１９を操作する。反応基板１００が所定の位置まで来ると、ピペット１１内部の反応させたい物質を含む懸濁液１３を排出する操作を行う。この際、ピペット１１の先端部の外側と先端部近傍の内部を光源１６とモニター２５からなる光学系で監視する。モニター２５の出力をパソコン２６に取り込み、パソコン２６の画像演算結果をもとに駆動装置３２を動作させて、シリンジポンプ３１の送液を制御することができる。

モニター２５でピペット１１の先端を監視しながら、駆動装置３２を動作させて、シリンジポンプ３１を動かし、反応させたい物質を含む懸濁液１３をピペット１１の先端から排出して、ピペット先端に液滴２１を形成する。このとき、液滴２１が所定の大きさになったことをモニター２５を通してパソコン２６が認識し、駆動装置３２に停止指令を出して、シリンジポンプ３１を停止させる。

このようにして作成した反応させたい物質を含む懸濁液の液滴２１は、ピペット１１の上下動駆動装置３７により、ステージ１９の上に置かれた基板１の上の親水性領域３_３に接触させられ、反応基板１００の親水性領域３_３に移動する。液滴２１は、疎水性領域２にはじかれ、エネルギー的に安定な親水性領域３_３の位置で自己形成的に固定される。反応させたい物質を含む液滴２１が反応基板１００の親水性領域３_３に移動したことが確認されると、使用者は、ステージ１９を移動させ、反応基板１００の親水性領域３_１に液滴２１を載置する操作に移る。この操作は、ピペット１１を交換して、中に、他の反応させたい物質を含む懸濁液を吸引して、前述した操作をくり返して、実行できる。

図２（Ｂ）は、図２（Ａ）を参照して説明した、反応基板１００に反応させたい物質を含む液滴を形成するシステムによって、反応基板１００の親水性領域３_１、３_３に反応させたい物質を含む液滴が載置された結果を示す平面図である。反応基板１００上の親水性領域３_１、３_３に反応させたい物質を含む液滴１５_１、１５_２が配置されている。

図３（Ａ）は、図２（Ｂ）に示すように、反応基板１００上に形成された二つの液滴１５_１、１５_２を衝突させて反応させるための装置の実施例の概要を示す斜視図、（Ｂ）は、二つの液滴１５_１、１５_２が衝突して、一つの液滴になった様子を模式的に示す図である。図３で説明する装置は、独立の形であるが、図２で説明した液滴を構成するシステムと一体的で隣接した形で構成され、ステージ１９の制御による反応基板１００の移動、二つの液滴１５_１、１５_２を移動させるガスの噴射等をパソコン２６で制御できるものとするのが好都合である。

図３（Ａ）において、反応基板１００の上下には、液滴のモニターおよび反応のモニターのために、それぞれ光学系が設けられる。二つの液滴１５_１、１５_２とこれらを結ぶ親水性の溝４_１，４_２の延長線上にガス噴射ノズル２２_１，２２_２が設けられる。それぞれのガス噴射ノズル２２_１，２２_２には、ガス圧力タンクに接続されたチューブ２４_１，２４_２が接続され、バルブ２３_１，２３_２の開閉により、ガス噴射ノズル２２_１，２２_２によるガス噴射が制御される。ガス噴射ノズル２２_１，２２_２からガスが噴射されると、液滴１５_１、１５_２は親水性の溝４_１，４_２にガイドされて親水性領域３_２に移動し、親水性領域３_２上で衝突する。

図３（Ｂ）は、二つの液滴１５_１、１５_２が親水性の溝４_１，４_２上を移動して、親水性領域３_２上で衝突して、一体化した状態を示す。

図３（Ａ）において、上部の光源４１より照射された光は、フィルター４２により特定の波長に調整されコンデンサレンズ４３によって集光されて、親水性領域３_２に照射される。照射された光は、透過光として対物レンズ４７、ダイクロイックミラー４８、ミラー４９、フィルター５１を介してカメラ５２に誘導され、親水性領域３_２の透過光像は、カメラ５２の受光面に結像する。すなわち、親水性領域３_２が所定の位置にあることを確認できる。従って、液滴形成と同様、反応基板１００およびステージ１９は光学的に透明な素材であることが望ましい。具体的には、ホウケイ酸ガラス、石英ガラス等のガラスや、ポリスチレン等の樹脂やプラスチック、あるいはシリコン基板等の固体基板等が好適である。反応基板１００の基板１にシリコン基板を用いる場合は、上部の光源４１は波長９００ｎｍ以上の波長の光とするのが良い。

親水性領域３_２が所定の位置にあること、すなわち、二つの液滴１５_１、１５_２とガス噴射ノズル２２_１，２２_２がライン上に並んだことが確認されると、使用者はパソコン２６に操作信号２８を与えて、バルブ２３_１，２３_２をパルス的に開として、ガス噴射ノズル２２_１，２２_２からガスを噴射させる。ガス噴射ノズル２２_１，２２_２からガスが噴射されると、液滴１５_１、１５_２は親水性の溝４_１，４_２にガイドされて親水性領域３_２に移動し、親水性領域３_２上で衝突する。

ここでは、液滴１５_１、１５_２は同じサイズのイメージとしたが、計測したい反応によっては、それぞれの大きさが異なっていても良い。この場合、二つの液滴１５_１、１５_２が、親水性領域３_２上で衝突するように、ガス噴射ノズル２２_１，２２_２から噴射されるガスが制御される必要がある。このためには、パソコン２６に対して、二つの液滴１５_１、１５_２のサイズを入力して、パソコン２６が与える信号が適当なものになるように、パソコンに適当なプログラムを持たせることは当然である。この問題は、サイズのみならず、液滴に含まれる反応させたい物質によっても考慮する必要がある場合があり得る。

二つの液滴１５_１、１５_２が、親水性領域３_２上で衝突して、液滴１５_３となって、親水性領域３_２上で反応が起こる状況は上述した光学系で計測できるのみならず、下部の光学系でも計測できる。

下部の光源４５より照射された光は、フィルター４６により波長選択された後に、ダイクロイックミラー４８によって対物レンズ４７に誘導され、液滴１５_３内部の反応観察の励起光として用いられる。液滴１５_３内部から発した蛍光は再度対物レンズ４７によって観測され、ダイクロイックミラー４８とフィルター５１によって励起光をカットした後の蛍光をカメラ５２で観察することができる。

このとき、ダイクロイックミラー４８、フィルター４２、４６、５１の組み合わせを調整することで、透過光のみをカメラ５２で観察したり、あるいは蛍光のみを観察したり、透過光像と蛍光像を同時にカメラ５２で観察することもできる。

カメラで得られた画像データはパソコン２６によって解析される。ＣＣＤカメラ５２で観察を行う。ここでも、図示しなかったが、ＣＣＤカメラ５２の検出している画像信号はパソコン２６のモニターに表示するのが便利である。

ＤＮＡのハイブリダイゼーション過程を追跡する目的の例について、具体例を説明する。二つの液滴１５_１、１５_２に、お互いに相補的な２８塩基長の合成１本鎖ＤＮＡを０．２ｐｍｏｌ／μｌの濃度にしてそれぞれＡ液とＢ液とする。溶媒は、５００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）である。Ａ液，Ｂ液ともに、２本鎖ＤＮＡに特異的にインターカレーとするエチヂウムホモダイマーが添加されている。反応基板１００上の親水性領域３_１にＡ液を１μｌ滴下し液滴１５_１を形成する。親水性領域３_３にＢ液を１μｌ滴下して液滴１５_２を形成する。二つの液滴を転がして親水性領域で衝突させる。衝突した二つの液滴は、一つの液滴１５_３になり親水性領域３_２にアンカーされて、安定にその位置に留まりいるので、Ａ液とＢ液によるハイブリダイゼーション過程が進む。

二つの１５_１、１５_２の親水性領域３_２で衝突する様子は上側の光学系でモニターして検出することができ、一つの液滴１５_３に合体されたＡ液とＢ液によるハイブリダイゼーションは下側の光学系でモニターし、５６０ｎｍ近傍の蛍光強度を分光して計測することができる。

図４は、液滴１５_３の蛍光強度をモニターして得られる蛍光強度の経時的な変化を示す波形図である。液滴衝突後数十ｍ秒のスレッショルド６１後に蛍光強度が急激に増強する。蛍光強度の増加は１本鎖ＤＮＡ同士がハイブリダイズし、２本鎖となり、そこにエチヂウムホモダイマーがインターカレートするために起きる。反応は少なくても６２，６３，６４の３段階になっており、ハイブリダイゼーションが、１本鎖ＤＮＡ同士のハイブリダイズしやすい部分を核として起こり、順次ハイブリダイゼーションが分子内で進行していくと考えられる。

実施例１では、反応液を衝突により混合して流れを止めて測定するというストップドフローと同様な反応形式となっているので、従来のストップドフローと同様なデータを得ることが容易にできる。また、液量が極微量なので貴重な試料の使用量を少なくできる。反応は液滴の衝突面での分光学的変化を顕微分光を用いて追跡してもよいし、大きな液滴に小さな液滴を打ち込み、同じく液滴の衝突面での分光学的変化を追跡しても良い。外部からのエネルギーを与えて反応が促進される問題はあるが、一瞬超音波を照射して攪拌混合して反応を開始させて液滴全体を分光することも有効である。

（その他の実施例）
図５は、顕微分光装置を用いた分光測定に好都合な反応基板１００の例を示す平面図である。図１（Ａ）と対比して容易に分かるように、この実施例では、基板１上に、親水性領域３_１，３_２および３_３と、親水性の溝４_１，４_２の組を、多数併設したものである。したがって、Ａグループの反応物質を含む多数種の液滴を親水性領域３_１にアレー状に並べ、これと反応させるＢグループの反応媒質を含む多数種の液滴を親水性領域３_３にアレー状に並べ、Ｂグループの液滴アレーの液滴を順次Ａアレーの液滴に衝突させることで、多数種の反応を時間差で開始させ、計測を行うことができる。このためには、ガス噴射ノズル２２_１，２２_２の組を、親水性領域３_１，３_２および３_３と、親水性の溝４_１，４_２の組の数だけ設けて、それぞれのバルブをパソコン２６で時系列的に開閉するか、パソコン２６でステージ１９を少しずつ移動させて、所定の位置まで移動するつどバルブを開閉する等の制御が必要である。

実施例１では、親水性領域３_１，３_２および３_３と、親水性の溝４_１，４_２の組により、二つの液滴を衝突させるものとしたが、例えば、図１の親水性領域３_１，３_２および３_３と、親水性の溝４_１，４_２の組と同じ構成の組を親水性領域３_２が重なる形で形成するとともに、これに対応するガス噴射ノズル２２_１，２２_２の組を設ければ、四つの液滴の衝突による反応を観察することができる。

また、反応させる目的の複数の反応前駆体をそれぞれ異なる液滴に溶解して、衝突させ反応させたり、細胞を挿入した液滴と、異細胞活性物質を含む液滴とを異なる液滴に溶解して、衝突させ反応させ細胞への影響を観察したりすることができる。

（Ａ）は、本発明の実施に好適な反応基板１００の平面図、（Ｂ）は平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの断面図である。 （Ａ）は、本発明の実施に好適な反応基板１００の親水性領域３_１と３_３に反応させたい物質を含む液滴を構成するシステム構成の例を説明する概念図、（Ｂ）は、反応基板１００の親水性領域３に３_１と３_３に反応させたい物質を含む液滴が形成された反応基板１００の一部を示す平面図である。 （Ａ）は、図２（Ｂ）に示すように、反応基板１００上に形成された二つの液滴１５_１、１５_２を衝突させて反応させるための装置の実施例の概要を示す斜視図、（Ｂ）は、二つの液滴１５_１、１５_２が衝突して、一つの液滴になった様子を模式的に示す図である。 液滴１５_３の蛍光強度をモニターして得られる蛍光強度の経時的な変化を示す波形図である。 顕微分光装置を用いた分光測定に好都合な反応基板１００の例を示す平面図である。

符号の説明

１００…反応基板、１…シリコン基板、２…疎水性領域、３_１，３_２，３_３…親水性領域、４_１，４_２…親水性の溝、５…位置決め用のマーカー、１１…ピペット、１３…反応させたい物質を含む懸濁液、１６…光源、１７…集光レンズ、１８…コリメートレンズ、１９…ＸＹ方向に駆動されるステージ、２１…液滴、２２_１，２２_２…ガス噴射ノズル、２３_１，２３_２…バルブ、２４_１，２４_２…チューブ、２５…モニター、２６…パソコン、２７，３２，３７…駆動装置、２８…操作入力信号、３０…チューブ、３１…シリンジポンプ、４１…光源、４２…フィルター、４３…コンデンサレンズ、４７…対物レンズ、４８…ダイクロイックミラー、４９…ミラー、５１…フィルター、５２…カメラ。

Claims (8)

1. 異なる反応させたい物質をそれぞれ独立に含む複数の液滴を載置した基板上で液滴同士を衝突させ、衝突した液滴内での物質の反応を追跡する高速微量反応追跡装置であって、
   基板を載置するためのステージと、
   前記基板上に載置した前記複数の液滴を移動させ衝突させるためのガス噴射手段と、
   衝突した前記液滴内での前記物質の反応を追跡するための光学系と
   を備え、
   前記基板は、前記複数の液滴をガイドして衝突させるための親水性領域と該親水性領域を囲む疎水性領域からなる表面を有し、前記液滴は、前記ガス噴射手段から噴射されるガスの圧力によって前記親水性表面上を移動し衝突する、
   高速微量反応追跡装置。
2. 前記基板が、
   前記複数の液滴をそれぞれ載置するための少なくとも２つの親水性領域と、
   前記液滴を衝突させるためのさらなる親水性領域と、
   前記液滴を載置するための親水性領域と前記液滴を衝突させるための親水性領域とを結ぶ親水性の溝と
   を備え、
   前記少なくとも２つの親水性領域に載置されたそれぞれの液滴が、前記ガス噴射手段から噴射されるガスの圧力によって、前記親水性の溝上をそれぞれガイドされて前記さらなる親水性領域まで移動し、衝突する、請求項１記載の高速微量反応追跡装置。
3. 前記基板が、
   前記親水性領域と前記親水性の溝の組を多数備える、請求項２記載の高速微量反応追跡装置。
4. 衝突した液滴を攪拌する手段をさらに備える、請求項１〜３のいずれか記載の高速微量反応追跡装置。
5. 前記各液滴が、サブマイクロリットルから数マイクロリットルである、請求項１〜４のいずれか記載の高速微量反応追跡装置。
6. 目的の複数の反応させたい物質をそれぞれ異なる液滴に溶解し、
   各液滴を基板上の異なる位置に配置させ、
   各液滴を基板上で衝突させて反応させることを含む微量反応方法であって、
   前記基板は、前記各液滴をガイドして衝突させるための親水性領域と該親水性領域を囲む疎水性領域からなる表面を有し、ガス噴射手段を用いてガスを前記各液滴に噴射させることによって該各液滴を前記親水性表面上で移動させ衝突させることを特徴とする、微量反応方法。
7. 細胞を挿入した液滴と、異細胞活性物質を含む液滴とを、各液滴を基板上の異なる位置に配置させ、
   各液滴を基板上で衝突させ細胞への影響を観察することを含む微量反応方法であって、
   前記基板は、前記各液滴をガイドして衝突させるための親水性領域と該親水性領域を囲む疎水性領域からなる表面を有し、ガス噴射手段を用いてガスを前記各液滴に噴射させることによって該各液滴を前記親水性表面上で移動させ衝突させることを特徴とする、微量反応方法。
8. 請求項１〜５のいずれか記載の高速微量反応追跡装置を使用する、請求項６または７記載の微量反応方法。

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