JP2000157272A - バイオチップ及びその製造方法 - Google Patents

バイオチップ及びその製造方法

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敏明 伊藤
Kenji Yamamoto
顕次 山本
Toshimasa Watanabe
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以子 百合野
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 プレートのプローブをプロットした以外の部
分にサンプルＤＮＡが付着することのないバイオチップ
を提供する。 【解決手段】 プローブ１と結合剤４とを混合した混合
物をプレート３に植え付ける。あるいは、プローブを植
え付けるべきプレート上の位置に、先ずプローブとプレ
ートとの結合剤を局所的に付着させ、次に、結合剤が付
着しているプレート上の位置にプローブを植え付ける。
こうして、プローブをプロットしたか所為が異の箇所に
結合剤が付着していないバイオチップ２０を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、複数種類のプロー
ブをプレートにスポットしたバイオチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】従来から、複数種類のＤＮＡ、ＲＮＡ、
たんぱく質等の生体高分子からなるプローブをガラスな
どのプレートにスポットして、バイオチップを製造する
ことが行われていた。図４は、この従来の方法の原理を
説明する図である。図４（ａ）に示すように、複数種類
のプローブＤＮＡ１が入っているマイクロプレート２を
用意する。一方、図４（ｂ）に示すよう、プレート３と
してガラス板を用意しておき、図４（ｃ）で示すよう
に、プレート３の表面にpoly-l-LysineをＤＮＡとガラ
スの結合剤４としてコーティングする。この後、図４
（ｄ）で示すように、マイクロプレート２に入っている
プローブＤＮＡ１をピンに付着させ、表面にＤＮＡとガ
ラスの結合剤（poly-l-Lysine）４がコーテイングして
あるガラスプレート３の上に、ピン５に付着させたプロ
ーブＤＮＡ１を接触させてスポットする。マイクロプレ
ート２に入っている全てのプローブＤＮＡをスポットし
終わるまでこの作業を繰り返し、図４（ｅ）に示すバイ
チップを製造していた。このように、従来はプレートに
予めＤＮＡとガラスの結合剤を全面コーティングし、そ
の上にＤＮＡをプロットしてバイオチップを製造してい
た。
【０００３】図５は、バイチップを利用したハイブリダ
イゼーションの原理を説明する図である。図５（ａ）に
示すように、プローブＤＮＡ１が結合剤４でガラスのプ
レート３にスポットされているバイチップと、蛍光物質
１０で標識したサンプルＤＮＡ１１を、ともにハイブリ
ダイゼーション溶液に入れてハイブリダイズさせる。ハ
イブリダイゼーション溶液は、ホルムアルデヒド、ＳＳ
Ｃ（NaCl, trisodiumcitrate）、ＳＤＳ（sodium dodec
yl sulfate）、ＥＤＴＡ（ethylenediamidetetraacetic
acid）、蒸留水などからなる混合液であり、混合比率
は使用するＤＮＡの性質により異なる。
【０００４】このとき、サンプルＤＮＡ１１とバイチッ
プ上のプローブＤＮＡ１が相補鎖ＤＮＡであれば、両者
は二重らせん構造をとり結合する。一方、両者が相補鎖
でなければ結合せず、蛍光物質１０で標識したサンプル
ＤＮＡ１１がガラスのプレート３上にコーティングされ
ている結合剤４と結合し、ガーベージとして残る。
【０００５】その後、図５（ｂ）に示すように、ガラス
のプレート３上に残った蛍光物質１０で標識したサンプ
ルＤＮＡ１１を水１２の中に入れて洗い流すと、プロー
ブＤＮＡ１と結合していないサンプルＤＮＡ１１は排出
される。その後、図５（ｃ）に示すように、プローブＤ
ＮＡと結合しているサンプルＤＮＡに標識している蛍光
物質をランプ１４からの光エネルギーで励起させ、蛍光
物質が励起して発光する光をＣＣＤなどの光センサー１
３で検出することでハイブリダイゼーションの検出を行
う。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】バイチップを用いた実
験では、バイチップにサンプルＤＮＡをふりかけ、バイ
チップにスポットしてあるプローブＤＮＡとハイブリダ
イズさせ、どのプローブＤＮＡとサンプルＤＮＡが結合
したかを検出している。検出の前処理として、ハイブリ
ダイズしたあとに、結合しなかったサンプルＤＮＡを排
除するためにバイオチップを水で洗っている。しかし、
プレートにＤＮＡとガラスの結合剤を全面コーティング
しているため、プローブＤＮＡと結合しなかったサンプ
ルＤＮＡが必要以外の部分、すなわち、プローブＤＮＡ
がスポットされていない結合剤部分に張り付き、結合剤
４と結合しているサンプルＤＮＡ１１は水洗いによって
もガラスのプレート３上から除去されない。それが検出
時ノイズとなって現われ、感度が低くなっていた。つま
り、サンプルＤＮＡの一部がプローブＤＮＡとの特異結
合ではなく単に結合剤４に張り付いた状態でバイオチッ
プ上にガーベージとして残り、そのサンプルＤＮＡに標
識されている蛍光物質も励起されて発光するため、ノイ
ズとして検出され、Ｓ／Ｎが悪くなるという問題があっ
た。
【０００７】本発明は、このような従来技術の問題点に
鑑みなされたもので、プレートのプローブをプロットし
た以外の部分にサンプルＤＮＡが付着することのないバ
イオチップを提供すること、及びそのバイオチップの製
造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に、本発明では、プローブをスポットするプレート上の
特定部分にだけプローブとガラスの結合剤を付着させ
る。すなわち、プレートにプローブをスポットした部分
以外にはプローブとガラスの結合剤を付着させないた
め、サンプルＤＮＡを入れてハイブリダイズさせた後、
プローブと結合しなかったサンプルＤＮＡは水で洗い流
せばチップ上から無くなるため、検出時ノイズが無くな
りＳ／Ｎのを向上させることができ、高感度となる。
【０００９】すなわち、本発明によるバイオチップは、
プレート上の複数の位置にプレートとプローブとを結合
させる結合剤を用いてプローブを植え付けたバイオチッ
プにおいて、結合剤はプローブが植え付けられている位
置に局在していることを特徴とする。
【００１０】本発明によるバイオチップの製造方法は、
プレートに該プレートとプローブを結合させる結合剤を
用いてプローブを植え付けてバイオチップを製造するバ
イオチップの製造方法において、プローブと結合剤とを
混合した混合物をプレートに植え付けることを特徴とす
る。
【００１１】本発明によるバイオチップの製造方法は、
また、プレートにプローブを植え付けてバイオチップを
製造するバイオチップの製造方法において、プローブを
植え付けるべきプレート上の位置に、プローブとプレー
トとの結合剤を局所的に付着させるステップと、結合剤
が付着しているプレート上の位置にプローブを植え付け
るステップとを含むことを特徴とする。プレートはガラ
ス製とすることができる。また、ピンヘッドが窪んだピ
ンを用いてプローブを植え付けるのが好ましい。
【００１２】本発明のピンは、プレートにプローブを植
え付けるのに使用されるピンにおいて、プローブを付着
させるピンヘッドが窪んでいることを特徴とする。本発
明のピンは、また、プレートにプローブを植え付けるの
に使用されるピンにおいて、プローブを付着させるピン
ヘッドに十字型の溝を形成したことを特徴とする。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施形態について
説明する。ここでは、プローブとしてＤＮＡを用いる場
合について説明する。しかし、プローブとして用いるこ
とができるのはＤＮＡに限られず、ＲＮＡあるいはたん
ぱく質をプローブとして用いることもできる。また、プ
レートとしてガラスプレートを用いた例で説明するが、
ガラス以外にナイロン製のメンブレン等も使用可能であ
る。
【００１４】図１は、本発明の第１の実施の形態の原理
を説明する図である。図１（ａ）に示すように、マイク
ロプレート２には複数種類のプローブＤＮＡ１が入って
いる。図１（ｂ）に示すように、バイオチップのプレー
トとしてはガラスのプレート３を使用する。図１（ｃ）
に示すように、ＤＮＡとガラスとの結合剤４をマイクロ
プレートの各ウェルに分注し、プローブＤＮＡ１と混合
する。ＤＮＡとガラスとの結合剤４としては、例えばpo
ly-l-Lysineあるいはカルボジイミドを用いることがで
きる。
【００１５】次に、図１（ｄ）に示すように、結合剤４
とプローブＤＮＡ１を混ぜたものをピン５で吸い上げ
（もしくは溶液をピン５の先に付着させて）、プレート
３にスポットする。この処理をマイクロプレート２に入
っているすべてのプローブＤＮＡに対して繰り返し行う
ことで、図１（ｅ）に示すように、必要な部分にのみ結
合剤４が付着し、プローブをスポットした以外の部分に
は結合剤４が付着していないバイチップ２０を作ること
ができる。
【００１６】図２は、本発明の第２の実施の形態の原理
を説明する図である。図２（ａ）に示すように、マイク
ロプレート２にはプローブＤＮＡ１が入っている。図２
（ｂ）に示すように、バイチップのプレートとしてガラ
スプレート３を使用する。図２（ｃ）に示すように、結
合剤４を例えば毛細管６で吸い上げ、ガラスプレート３
上のプローブＤＮＡをスポットする位置に吐き出す。こ
うすることで、ガラスプレート３上のプローブＤＮＡ１
をスポットする位置に、予め結合剤４をスポットして付
着させておく。その後、図２（ｄ）に示すように、マイ
クロプレート２に入っているプローブＤＮＡ１を結合剤
４でフォーマットされたプレート３に、ピン５で吸い上
げ（もしくはピン５に溶液を付着させて）繰り返しスポ
ットする。こうして、図２（ｅ）に示すように、必要な
部分にのみ結合剤４が付着し、プローブをスポットした
以外の部分には結合剤４が付着していないバイチップ２
０を作ることができる。
【００１７】図６に、本発明で用いたピン５のヘッド形
状を示す。図６（ａ）に示したピン５ａは、ヘッド部
分、すなわちプローブを付着させる部分がアーチ型に窪
んだピンである。また、図６（ｂ）に示したピン５ｂ
は、ヘッド部分がアーチ型に窪み、さらに窪みの中に十
字型に溝を切ったピンである。ピンのヘッドをアーチ状
に窪ませることで、スポットするプローブの中にピンを
入れたときに表面張力でうまくピンヘッドにプローブ溶
液が吸い込まれるしくみになっている。アーチの深さは
任意である。このピンを使うことで、ヘッドが平坦な従
来のピンを用いる場合より、プレートへのＤＮＡスポッ
ト量を約１０倍に増やすことができる。図６（ｃ）に示
したピン５ｃは、平坦なヘッドの表面に十字型に溝を切
ったものである。このピンによってもヘッドが単に平坦
な従来のピンに比較してスポット量を増やすことができ
る。
【００１８】図３は、本発明によるバイチップを利用し
たハイブリダイゼーションの原理を説明した図である。
図３（ａ）に示すように、プローブＤＮＡ１が結合剤４
でガラスプレート３にスポットされているバイチップ２
０と、蛍光物質１０で標識したサンプルＤＮＡ１１を、
ともにハイブリダイゼーション溶液に入れてハイブリダ
イズさせる。ハイブリダイゼーション溶液は、ホルムア
ルデヒド、ＳＳＣ（NaCl,trisodium citrate）、ＳＤＳ
（sodium dodecyl sulfate）、ＥＤＴＡ（ethylenediam
idetetraacetic acid）、蒸留水などからなる混合液で
あり、混合比率は使用するＤＮＡの性質により異なる。
【００１９】このとき、サンプルＤＮＡ１１とバイチッ
プ上のプローブＤＮＡ１が相補鎖ＤＮＡであれば、両者
は二重らせん構造をとり結合する。一方、両者が相補鎖
でなければ結合せず、蛍光物質１０で標識したサンプル
ＤＮＡ１１がガラスのプレート３上にガーベージとして
残る。図３（ｂ）に示すように、ガラスのプレート３上
に残った蛍光物質１０で標識したサンプルＤＮＡ１１を
水１２の中に入れて洗い流すと、ガラスとＤＮＡは結合
が弱いため、ガーベージのサンプルＤＮＡ１１が排出さ
れ、ガラスのプレート３上から無くなる。図３（ｃ）に
示すように、ハイブリダイゼーションの検出は結合して
いるサンプルＤＮＡに標識している蛍光物質をランプ１
４の光で励起させ、蛍光物質が励起して発光する光をＣ
ＣＤ等の光センサー１３で検出する。このとき、バイオ
チップ２０上にガーベージのサンプルＤＮＡが無いた
め、検出のＳ／Ｎ比が向上する。
【００２０】
【発明の効果】本発明によると、プローブをスポットす
る部分のみに結合剤を付着させたバイオチップを製造す
ることができ、バイチップ読取り時、検出感度を向上さ
せることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるバイオチップの製造方法の一例を
説明する図。
【図２】本発明によるバイオチップの製造方法の他の例
を説明する図。
【図３】本発明のバイチップを用いたハイブリダイゼー
ションと検出の説明図。
【図４】従来のバイオチップの製造方法を説明する図。
【図５】従来のバイチップを用いたハイブリダイゼーシ
ョンと検出の説明図。
【図６】本発明によるプローブ付着用のピンの説明図。
【符号の説明】
１…プローブＤＮＡ、２…プローブ格納用マイクロプレ
ート、３…ガラスのプレート、４…結合剤、５…ピン、
６…毛細管、１０…蛍光物質、１１…サンプルＤＮＡ、
１２…水、１３…光センサー、１４…ランプ、２０…バ
イオチップ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山本 顕次 神奈川県横浜市中区尾上町６丁目81番地 日立ソフトウェアエンジニアリング株式会 社内 (72)発明者 渡辺 敏正 神奈川県横浜市中区尾上町６丁目81番地 日立ソフトウェアエンジニアリング株式会 社内 (72)発明者 百合野 以子 神奈川県横浜市中区尾上町６丁目81番地 日立ソフトウェアエンジニアリング株式会 社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA09 HA20 4B063 QA01 QQ42 QQ62 QR32 QR35 QR55 QS32

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 プレート上の複数の位置にプレートとプ
    ローブとを結合させる結合剤を用いてプローブを植え付
    けたバイオチップにおいて、前記結合剤は前記プローブ
    が植え付けられている位置に局在していることを特徴と
    するバイオチップ。
  2. 【請求項２】 プレートに該プレートとプローブを結合
    させる結合剤を用いてプローブを植え付けてバイオチッ
    プを製造するバイオチップの製造方法において、 プローブと結合剤とを混合した混合物をプレートに植え
    付けることを特徴とするバイオチップの製造方法。
  3. 【請求項３】 プレートにプローブを植え付けてバイオ
    チップを製造するバイオチップの製造方法において、 プローブを植え付けるべきプレート上の位置に、前記プ
    ローブと前記プレートとの結合剤を局所的に付着させる
    ステップと、 前記結合剤が付着しているプレート上の位置にプローブ
    を植え付けるステップとを含むことを特徴とするバイオ
    チップの製造方法。
  4. 【請求項４】 請求項２又は３記載のバイオチップの製
    造方法において、前記プレートはガラス製であることを
    特徴とするバイオチップの製造方法。
  5. 【請求項５】 請求項２〜４のいずれか１項記載のバイ
    オチップの製造方法において、ピンヘッドが窪んだピン
    を用いてプローブを植え付けることを特徴とするバイオ
    チップの製造方法。
  6. 【請求項６】 プレートにプローブを植え付けるのに使
    用されるピンにおいて、プローブを付着させるピンヘッ
    ドが窪んでいることを特徴とするピン。
  7. 【請求項７】 プレートにプローブを植え付けるのに使
    用されるピンにおいて、プローブを付着させるピンヘッ
    ドに十字型の溝を形成したことを特徴とするピン。
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