JP2003156493A - 複数の異なる結合剤を固体支持体の分離された位置に固定化させる方法 - Google Patents
複数の異なる結合剤を固体支持体の分離された位置に固定化させる方法Info
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Abstract
する結合アッセイに用いる固体支持体上に固定化された
複数の異なる結合剤を作成すること。 【解決手段】 固体支持体上の分離された位置に複数の
異なる捕獲剤(各々の捕獲剤が供された結合剤の尾部に
結合できる)を固定化して、結合剤(各々の結合剤は供
された被検体に特異的な結合部位と、尾部を有する)を
前記複数の異なる捕獲剤が固定化された固体支持体と接
触させて、前記結合剤がその尾部によりその各々の捕獲
剤と特異的に結合させる。捕獲剤は、オリゴヌクレオチ
ドであって対応する結合剤の尾部における相補的配列と
ハイブリッド形成できる配列を有するものである。
Description
剤、特にオリゴヌクレオチド尾部を有する結合剤を用い
る結合アッセイに関する。これらの結合アッセイは、液
体サンプル中の被検体の濃度を決定するのに有用であ
る。
的な結合部位を有する結合剤に液体サンプルを接触さ
せ、結合した被検体を有する結合剤を分離し、そして被
検体により占有されている結合剤の結合部位のフラクシ
ョンを表す値を測定することにより、液体サンプル中の
薬又はホルモンのような被検体の濃度を測定することが
知られている。典型的には、その後、被検体の周知の濃
度を含む一連の標準溶液から得られる値に対して、被検
体により占有された結合部位のフラクションを表現する
値を比較することによって、液体サンプル中の被検体の
濃度が決定され得る。
法のいずれかを用いる標識された発現試薬での逆適定に
より占有された結合部位のフラクションの測定が通常行
われていた。
る結合剤は典型的にはその被検体の標識されたものであ
るか又はその結合剤の空の結合部位を認識することがで
きる抗イディオタイプ抗体である標識された発現試薬を
用いて、同時又は連続的のいずれかで逆適定される。発
現剤は、濃度が測定されている被検体と結合剤上の結合
部位について競合すると表現され得る。標識された被検
体で占有されるに至った結合部位のフラクションは、そ
の後上述のように被検体の濃度に関連し得る。
する結合剤は、結合した被検体に、又は結合剤上の占有
された結合部位のいずれかに結合することができる標識
された発現剤で逆適定される。被検体により占有された
結合部位のフラクションは、その後標識された発現剤の
存在を検出することにより測定され得、ちょうど競合ア
ッセイを用いるように、上述のように液体サンプル中の
被検体の濃度に関連し得る。
は該発現剤が検出され得るようにマーカーで標識され
る。過去において種々のマーカー、例えば放射性同位
体、酵素、化学発光マーカー及び蛍光マーカーが用いら
れている。
セイは、バーソン及びヤロー(Berson and Yalow) によ
り説かれる、即ち“Methods in Investigative and Dia
gnostic Endocrinology"(1973)111〜116 頁における設
計原理に従って一般に行われている。バーソン及びヤロ
ーは、競合イムノアッセイの実行において、結合剤の量
がおおよそ30〜50%の低濃度の検出されるべき被検体に
結合するのに用いられる時に最大の感度が達成されるこ
とを提案した。非競合イムノアッセイにおいて、液体サ
ンプル中の100 %に近い被検体に結合するのに十分な結
合剤を用いて、最大の感受性が達成されると一般的に考
えられる。しかしながら、両方の場合において、これら
の広く受け入れられている指針に従って設計されたイム
ノアッセイは、知られているサンプルの量並びに正確に
知られて、もしくは一定であることが知られて用いられ
る結合剤の量を要求する。
体サンプル中の被検体の濃度は、被検体に特異的な結合
部位を有する少量の結合剤に、液体サンプルを接触させ
ることにより測定され得ることを私は開示した。この
「 周囲の被検体(ambient analyte)」 法において、結
合剤の量が液体サンプル中の被検体の濃度に不十分な影
響しか与えない程度の少量であるなら、被検体により占
有される結合剤上の結合部位のフラクションがサンプル
の量と効果的に無関係である。
に精密化される。これは、WO84/010131におけるアッセ
イ中の感度及び発現の容易さが、Vがサンプルの容量で
ありKが被検体に対する結合剤のアフィニティー定数で
ある、固体支持体上の小さな領域(又は「ミクロスポッ
ト」)上に位置した0.1 V/Kより少ない量の結合剤を
用いることにより改良されることを開示する。両方のこ
れらの引用において、被検体により占有された結合部位
のフラクションは、上述のように競合又は非競合技術の
いずれかを用いて測定される。
れた速度を有する結合アッセイを開発することの絶え間
ない必要性がある。加えて、アッセイの使用者が異なる
群の被検体を検出するのに容易に適合させられ得る結合
アッセイを提供することが要求されるであろう。
体サンプル中の被検体の濃度を決定する方法であって、
(a)固体支持体上に1以上の捕獲剤を固定化するステ
ップであって、各々の捕獲剤が、供された結合剤に特異
的に結合することができることを特徴とするステップ
と、(b)1以上の結合剤に前記液体サンプルを接触さ
せるステップであって、各々の結合剤が、結合部位のフ
ラクションが被検体により占有されるに至るように供さ
れた前記被検体に特異的な前記結合部位と、対応する捕
獲剤に結合するのに適合した尾部と、を有することを特
徴とするステップと、(c)前記結合剤が該結合剤各々
の捕獲剤に結合するに至るように、ステップ(b)と同
時又は連続的のいずれかで、前記固定化された捕獲剤に
前記液体サンプルを接触させるステップと、(d)被検
体により占有された結合剤の前記結合部位の前記フラク
ションを測定して前記サンプル中の前記被検体の濃度を
決定するステップと、を含むことを特徴とする方法を提
供する。
体の表面よりむしろ液相において起こることを特徴とす
るアッセイを提供する。これは被検体と結合剤との反応
の速度を増加させる。
合及び捕獲剤に液体サンプルを同時に接触させることに
より、例えばただ一つの反応容器を用いて、ただ一つの
ステップにおいてアッセイを行うことが可能になる。あ
るいは特に液体が血清又は血液であり、非特異的結合が
誤差の重要な原因である場合に、結合剤及び捕獲剤の連
続的な接触が好ましい。これらの場合において、結合剤
は第1の容器において液体サンプルに最初に接触され
得、その後サンプルは、捕獲剤が結合剤に結合して固体
支持体に結合するのを許容する第2の容器に移される。
に1以上の結合剤を固定化する方法であって、各々の結
合剤が、供された被検体に特異的な結合部位及び捕獲剤
に結合するのに適合した尾部を有し、(a)支持体上に
1以上の捕獲剤を固定化するステップであって、各々の
捕獲剤が、供された結合剤の尾部に結合することができ
ることを特徴とするステップと、(b)前記結合剤が該
結合剤各々の捕獲剤に該捕獲剤の尾部を通して特異的に
結合するに至るように、支持体上に固定化された前記捕
獲剤を有する前記支持体に前記結合剤を接触させるステ
ップと、を含むことを特徴とする方法を提供する。
された捕獲剤にさらす前に、前記結合剤に前記尾部を付
着させるステップを更に含むことができる。
と、及び結合剤がその尾部によって個々に結合すること
ができる、支持体上に固定化された捕獲剤を有する一般
的な前記支持体と共に適合された結合剤を用いることに
おいて、アッセイの使用者が使用のために結合剤を適合
させることが可能である。
剤に結合されるに至った後に、液体サンプルに支持体を
さらすことによりアッセイが行われる。
剤がその尾部を通して基体に固定化された捕獲剤に間接
的に結合することを特徴とするアッセイを提供する。
尾部を含む相補的配列にハイブリッド形成し得るオリゴ
ヌクレオチド配列である。捕獲剤又は結合剤の尾として
作用するオリゴヌクレオチドは、アッセイ中に用いられ
る厳重な条件下において強くかつ特異的なハイブリッド
形成を供するのに十分に長い。典型的には、少なくとも
約8又は9ヌクレオチドの長さの相補性オリゴヌクレオ
チドが用いられる。好ましい実施形態において、オリゴ
ヌクレオチドは好ましくは8〜30塩基、更に好ましくは
16〜20塩基の長さである。しかしながら極めて長いポリ
ヌクレオチドを用いることは好ましくない。というの
は、これらは異なる捕獲剤に結合する特異性の消滅又は
自己ハイブリッド形成を導き、ヘアピンループ(二重鎖
領域)を形成し得るからである。しかしながらアッセイ
条件のセットに適したオリゴヌクレオチドの長さ及び配
列は、当業者により容易に決定され得る。
合部位を有する抗体である。従って、支持体上の捕獲剤
が液相の結合剤にさらされた時、結合剤は固体支持体に
結合するに至る。あるいは、被検体が核酸配列である場
合、結合剤はオリゴヌクレオチドであり得る。このよう
に、本実施形態において、結合剤は、被検体とハイブリ
ッド形成することができる第1の配列と尾部として作用
する第2の配列とを有する。
要がないように、WO84/01031 号又はEP304,202 号に開
示されるアッセイに従って少量の結合剤が用いられる。
このように液体サンプル中の被検体の周囲の濃度に重要
な影響を与えないように、結合剤の量は十分に小さくあ
るべきである。典型的には、5%未満の被検体に結合す
る量の結合剤を用いることが好ましい。しかしながら、
例えば2%又は1%の被検体に結合する、より少量の結
合剤を用いることは、更に、被検体の周囲の濃度を乱す
ことを削減し、被検体濃度を決定することにおいて誤差
を最小化することを助ける。
4,202 号に従ってアッセイを行う場合、結合剤に対する
被検体の結合のアフィニィー定数(K)は、標準的な実
施に従って測定される。これは、どれだけの量の結合剤
が0.1 V/Kモルを構成するかを決定するのに用いられ
るアフィニティー定数が、アッセイにおいて用いられる
条件(例えば反応物、インキュベーションの時間、pH、
温度等)下で得られる値であることを意味する。
の供された結合剤に結合するために過剰に用いられる。
これはアッセイの感度を最大化して、そして用いられる
結合剤の量が知られる又は一定であることが知られる必
要がある時、アッセイの使用者はアッセイにおいて用い
られる実質的に全ての結合剤が支持体上のその捕獲剤に
結合するに至ることを確信することができることを確実
にする。
ロスポットとして、分離した位置において支持体上に固
定化される。これは、支持体上の一連の位置における複
数の異なる捕獲剤を用いて、複数の異なる被検体が同時
に測定されることを許容する。捕獲剤がミクロスポット
として固定化される場合、アッセイの感度は、高密度で
捕獲剤を固定化することが改良され得、これによりシグ
ナル対ノズル比が改良される(例えば我々の同時係属出
願PCT /GB94/02814 号を参照のこと) 。0.1〜1.0 ml
の次数のサンプル容量を仮定すると、ミクロスポットは
好ましくは、1mm2 未満の領域と1000〜100000分子/μ
m2 の結合剤の最終表面密度とを有する。
度の一連の測定が同時に行われ得るように、複数の位置
において支持体上に固定化され得る。
部位のフラクションは、上述のような競合及び/又は非
競合法において発現剤を用いて検出される。発現剤は、
結合剤の占有された又は未占有の結合部位に、又は結合
した被検体に結合することができ、結合した発現剤が検
出されることを可能にするために標識される。好ましく
は発現剤は標識された抗体である。
光マーカー又は蛍光マーカーであり得る。蛍光染料マー
カーを用いることが特に好ましい。というのは蛍光染料
は検出のための適切な色の範囲(励起及び発光波長)の
蛍光を供するように選択され得るからである。蛍光染料
は、クマリン、フルオレセイン、ローダミン及びテキサ
スレッド(Texas Red)を含む。長期の蛍光期間を有する
蛍光染料分子が用いられ得、これにより、バックグラウ
ンドの蛍光が減衰した後時間分解蛍光が蛍光シグナルの
長さを測定するのに用いられることを許容する。蛍光も
しくは他のマーカーを含む、又は表面上にそれらを有す
るラテックス(Latex)ミクロスフィアーも本文脈におい
て用いられ得る。マーカーからのシグナルは、レーザー
走査共焦顕微鏡を用いて測定され得る。
特異的な活性標識を用いることもできる。化学発光標識
の場合、結合剤又は発現剤をマークするのに用いられる
異なる化学発光標識からのシグナルは、例えばチャージ
カップルド(charge-coupled) 装置(CCD)を用いて同時
に検出され得る。
団を用いて便利に標識され得る。EP271,974 号に説かれ
る方法に従うと、これはアッセイの使用者が結合剤の量
を知ること又はそれが一定であることを知ることが必要
でないことを意味する。これは、結合剤からのシグナル
及び被検体により占有される結合剤の結合部位のフラク
ションを示すシグナルの比率が、被検体により占有され
る結合剤の部位のフラクションに依存するが全量の存在
する結合剤には依存しないからである。
容量を知っているなら、アッセイが周囲の被検体条件下
で行われないようにより大量の結合剤を用いることがで
きる。これは、被検体の濃度が、発現剤上の1つの標識
を用いて、そして結合剤の量が一定であることを知るか
もしくはその量が知られているような第2のマーカーで
結合剤を標識するかのいずれかで決定されることを許容
する。
号に開示される) このアプローチの変形において、2つ
の標識された発現剤、即ち結合剤の未占有の結合部位に
特異的に結合することができる第1の発現剤、並びに占
有された結合部位もしくは結合した被検体に結合するこ
とができる第2の発現剤を用いることができる。このよ
うに、いずれのマーカーからのシグナルも被検体により
占有された結合部位のフラクションを表し、一方シグナ
ルの総計は用いられた結合剤の全量を表す。
ける変化が直ちに補正され得るので、結合剤の一定量が
用いられることを知る必要性を避けることもできる。こ
れらの環境下において、サンプル容量Vは知られている
か、又は一定であるかのいずれかでなければならない。
これは、2つの標識された発現剤がサンプル中の被検体
の濃度にいかに関係するかを示す以下の式から判断され
得る。
れた発現剤をマークする標識により発せられるシグナル
をSoとし、
た発現剤をマークする標識により発せられるシグナルを
Suとし、占有された又は未占有の部位に対する各々のシ
グナルに関する定数を各々εo及びεu とし、K=被検
体と結合剤との間の反応を支配する有効平衡定数とす
る。そして、サンプル中の被検体濃度をYとすると、 Y=(S0/εo ) 〔εu /(KSu) +1/V〕 Vが知られていると仮定すると、この等式は2つの未知
の定数、So及びεu /Kを含む。一連の周知の被検体濃
度についてシグナルSo及びSuを決定することにより、こ
れらの定数は決定され得、未知の被検体濃度は、対応す
るSo及びSuの決定から見積もられる。このようにこのア
ッセイは周知の被検体条件下で作業を行う必要がない。
周囲の被検体条件下において、1/V項は無視すること
ができ、So/Suは周囲の被検体濃度に比例する。
上述のような方法において、液体サンプル中の1以上の
被検体の濃度を決定するためのキットであって、該キッ
トが、(a)固体基材に付着し、結合剤に特異的に結合
することができる捕獲剤を複数の位置に有する前記固体
基材と、(b)1以上の結合剤であって、各々の結合剤
が被検体に特異的な結合部位と、1以上の捕獲剤に結合
するのに適合した尾部と、を有することを特徴とする結
合剤と、(c)占有された結合剤結合部位もしくは結合
剤に結合した被検体又は未占有の結合剤結合部位に結合
することができるマーカーを有する1以上の発現剤と、
を含むことを特徴とするキットを提供する。
1以上の被検体の濃度を決定するためのアッセイを適合
させるためのキットであって、(a)各々が結合剤への
付着のためである1以上の尾部と、(b)固体基材に付
着され、尾部に特異的に結合することができる1以上の
捕獲剤を複数の位置に有する固体基材と、を含み、アッ
セイの使用者が前記尾部を前記結合剤に付着させること
により、前記捕獲剤が上述のような方法において付着さ
れた固体基材と共に用いられ得る結合剤を供することを
特徴とするキットを提供する。
概略図を参照することにより記載される。
な結合部位を有する2種類の結合剤2、4が用いられる
結合アッセイを示す。各々の結合剤2、4はオリゴヌク
レオチド尾部12、16が供された抗体10、14を含む。オリ
ゴヌクレオチド尾部は異なるヌクレオチド配列を有し、
その配列は、ミクロスポットの形態で固体支持体22上に
固定化された捕獲剤18、20の配列の1つに相補的であ
る。この例において、オリゴヌクレオチドは8ヌクレオ
チド長である。
の被検体6、8は、該被検体6、8のフラクションが抗
体10、14に結合するに至るように結合剤2、4にさらさ
れる。この反応は液相中でおこるので抗体10、14と被検
体(抗原)6、8の間の反応の速度は最適化される。
に、液体サンプル及び結合剤は、固体支持体22上に固定
化された捕獲剤18、20を有する前記固体支持体22にさら
される。これは結合剤2、4のヌクレオチド配列12、16
が支持体22上に固定化された捕獲剤18、20の相補性配列
に結合することを許容する。これを図2に示す。しかし
ながら、捕獲剤16、18は実質的に全ての結合剤10、14が
支持体22に結合することを確実にするため、一般的に過
剰に用いられる。このように、図2及び3において、捕
獲剤28の1分子が未占有のものとして残る。
は、その後慣用の逆適定技術を用いて決定され得る。こ
のように図3において標識された抗体24、26は、各々占
有された結合剤2、4の存在をマークするために、非競
合技術において用いられる。抗体24、26は、マーカー
(非表示)で標識されるので、結合剤2、4の結合部位
のフラクションが、その後決定され得る。次にこれは、
例えば一連の周知の被検体濃度の溶液を用いて得られた
結果を参照することにより、液体サンプル中の被検体の
濃度が見い出されることを許容する。
体22上に固定化された捕獲剤18、20を有する同様の前記
固体支持体22を用いて、被検体のいずれの対の濃度を測
定するのに適合され得る。これは、結合剤がミクロスフ
ィアー18、20の1つに特異的に結合するであろうよう
に、被検体をオリゴヌクレオチド尾部12、16に結合させ
るのに適した結合剤を提供することにより行われ得る。
このように、アッセイの使用者は、ミクロスポットの全
部の配置と共に、用いるための結合剤を適合させること
ができるであろうことが考えられる。
マウスIgG(モノクローナル抗TSH)。 2)Sigma からのウサギIgG 、ヤギ抗マウスIgG(全体の
分子) 及びヤギ抗ウサギIgG(全体の分子) 抗体。 3)Molecular Probesからの0.1 μm径で黄色/緑色蛍
光(ex 490:em 515nm) のスルフェートフルオスフィア
ー(Sulfate Fluospheres)及び0.1 μm径で赤色蛍光
(ex 580:em 605nm) のスルフェートフルオスフィアー
(Sulfate Fluospheres)。 4)Oswell DNA Serviceからのオリゴヌクレオチド: a)5′−ビオチン修飾を有するCACACACACACACACACA
(ポリ−CA)(配列番号1) b)5′ホスホロチオエート修飾を有するGTGTGTGTGTGT
GTGTGT(ポリ−GT)(配列番号2) c)5′−ビオチン修飾を有するGAGAGAGAGAGAGAGAGA
(ポリ−GA)(配列番号3) d)5′−ホスホロチオエート修飾を有するCTCTCTCTCT
CTCTCTCT(ポリ−CT)(配列番号4) 5)Pierceからのスルホ− LC −SPDP{スルホスクシニ
ミジル6−〔3′−(2−ピリジルジチオ)−プロピオ
ンアミド〕ヘキサノエート}。 6)Pharmacia からのPD10カラム及びセフアデックスG
200 (Sephadex G200)。 7)Sigma からのRIA グレードウシ血清アルブミン(BS
A) 、Tween20 、アジ化ナトリウム、無水オルトリン酸
水素二ナトリウム、オルトリン酸二水素ナトリウム、ED
TA及びTrizma。 8)Vector Laboratories からのアビジンDX(Avidin D
X)。 9)Amiconからのセントリコン−30(Centricon−30) 及
びセントリプレップ−30 (Centriprep−30) 濃縮器。 10) NIH USA からの甲状腺刺激ホルモン(TSH) 。
スIgG 及び抗ウサギIgG 抗体の吸着 1)2%(10mg)の0.1 μm黄色/緑色フルオスフィアー
の0.5ml 分割量を、0.5ml の0.1 Mリン酸緩衝液pH7.4
中に溶解された2mgのヤギ抗マウスIgG 抗体に添加し
た。2%(10mg)の0.1 μm赤色フルオスフィアーの0.5m
l 分割量を0.5mlの0.1 Mリン酸緩衝液pH7.4 中に溶解
された2mgのヤギ抗ウサギIgG 抗体に添加した。両方の
標品を室温で一晩振とうした。 2)この2つの標品を、MSE 高回転21超遠心機(MSE Hig
h-Spin21 Ultra-centrifuge)において、8℃で10分間遠
心した。 3)各々のペレットを1%BSA を含むリン酸緩衝液2ml
中に分散させ、室温で1時間振とうし、上述のように遠
心した。 4)各々のペレットを0.5 %のTween20(商標)を含むリ
ン酸緩衝液2ml中に分散させ、室温で30分間振とうし、
上述のように遠心した。 5)各々のペレットを2mlのリン酸緩衝液中に分散さ
せ、上述のように遠心した。 6)各々のペレットを2mlのリン酸緩衝液中に分散さ
せ、上述のように遠心した。 7)各々のペレットを0.1 %アジ化ナトリウムを含む1
%BSA の2ml中に分散させ、4℃で保存した。
ナルIgG 及びウサギIgG の接合 1)3mgのスルホ−LC−SPDPを1mlのPBS /EDTA中に溶
解された4.6mg のマウス抗TSH モノクローナル又はウサ
ギIgG に添加して室温で30分間振とうした。 2)この活性化された抗体をPD10カラムで未処理のSPDP
から分離した。このサンプルをPBS /EDTAで溶出して0.
5ml フラクションを収集した。 3)この活性化された抗体を含む第1のピークからのフ
ラクションをプールして、セントリコン−30濃縮器を用
いておおよそ10μlまで濃縮した。 4)5′−ホスホロチオエート修飾されたポリ−GTオリ
ゴヌクレオチド100nMを活性化されたマウスモノクロー
ナルIgG 14.8nMに添加した。5′−ホスホロチオネート
修飾されたポリ−CTオリゴヌクレオチド58.3nMを活性化
されたウサギIgG 8.7nM に添加した。両方の標品をPBS
/EDTAで1mlにして、室温で一晩振とうした。 5)オリゴヌクレオチド接合マウスおよびウサギIgG 標
品をセファデックスG200カラム(1.5×45cm)で未反応の
オリゴヌクレオチドから分離した。このサンプルをPBS
/EDTAで溶出して2mlフラクションを収集した。 6)オリゴヌクレオチド接合抗体を含む第1のピークか
らのフラクションをプールして、セントリプレップ−30
濃縮器を用いておおよそ500 μlに濃縮して4℃で保存
した。
ポットとして固相上に配された相補的オリゴヌクレオチ
ドのみとハイブリッド形成するであろうことの論証 1)ダイナテックブラックミクロフローマイクロタイタ
ーウエル(Dynatech black Microfluor microtitre wel
ls) を0.1 M重炭酸緩衝液pH8.5 中のアビジンDX 50 μ
lで5μg/mlの濃度で室温で5分間コートした。 2)0.01Mリン酸緩衝液で洗浄した後、アビジンコート
されたマイクロタイターウェルを室温で1時間、200 μ
lの1%BSA でブロックして、同じ緩衝液で再び洗浄し
て乾燥させた。 3)0.1 %BSA 中で0.025nM /mlの濃度の2つの5′−
ビオチン修飾されたポリ−CA及びポリ−GAオリゴヌクレ
オチドの各々の0.25μlドロップレットを、アビジンコ
ートされたマイクロタイターウェルの反対側に配し、湿
った雰囲気下で30分間、反応させた。その後、ドロップ
レットを吸収して、このマイクロタイターウェルをリン
酸緩衝液で洗浄した。 4)ポリ−GT接合マウスモノクローナルIgG 及びポリ−
CT接合ウサギIgG の各々0.25μg/mlを含むTris−HCl
アッセイ緩衝液の50μl分割量を対照マイクロタイター
ウェル(かわりに未接合のマウス及びウサギIgG を含む
アッセイ緩衝液50μlを対照ウェルに添加した) 以外全
てに添加し、湿った雰囲気下で1時間、振とうして、0.
05%のTween20(商標)を含むリン酸緩衝液で洗浄し
た。 5)0.3 μg/mlヤギ抗マウスIgG 抗体接合黄色/緑色
フルオスフィアー及び0.6 μg/mlヤギ抗ウサギIgG 抗
体接合赤色フルオスフィアーを含むTris−HClアッセイ
緩衝液の200 μl分割量を全マイクロタイターウェルに
添加し、室温で1時間振とうし、リン酸−Tween20 緩衝
液で洗浄して、アルゴン/クリプトン(Argon /Krypto
n)レーザーを備えた共焦レーザー走査顕微鏡で走査し
た。
IgG は、相補的ビオチン化ポリ−CAとのみハイブリッド
形成し、同じマイクロタイターウェル上に配された非相
補的ビオチン化ポリ−GAオリゴヌクレオチドミクロスポ
ットとはハイブリッド形成しなかった。 (2)ポリ−CTオリゴヌクレオチドで標識されたウサギ
IgG は、相補的ビオチン化ポリ−GAとのみハイブリッド
形成し、同じマイクロタイターウェル上に配された非相
補的ビオチン化ポリ−CAオリゴヌクレオチドミクロスポ
ットとはハイブリッド形成しなかった。
スポットの抗原結合の論証 1)ダイナテックブラックミクロフローマイクロタイタ
ーウェルを0.1 M重炭酸緩衝液pH8.5 中のアビジンDX 5
0 μlで5μg/mlの濃度で室温で5分間、コートし
た。 2)0.01Mリン酸緩衝液で洗浄した後、アビジンコート
されたマイクロタイターウェルを室温で1時間、200 μ
lの1%BSA でブロックして、同じ緩衝液で再び洗浄し
て乾燥させた。 3)0.1 %BSA 中で0.025nM /mlの濃度の5′−ビオチ
ン修飾されたポリ−CAオリゴヌクレオチドの0.25ドロッ
プレットをアビジンコートされた各々のマイクロタイタ
ーウェル上に配し、湿った雰囲気下で30分間反応させ
た。その後、ドロップレットを吸引して、このマイクロ
タイターウェルをリン酸緩衝液で洗浄した。 4)ポリ−GT接合抗TSH マウスモノクローナルIgG 0.25
μg/mlを含むTris−HCl アッセイ緩衝液の50μl分割
量をこのマイクロタイターウェルに添加し、湿った雰囲
気下で1時間、振とうして、0.05%のTween20(商標)を
含むリン酸緩衝液で洗浄した。 5)Tris−HCl アッセイ緩衝液中のTSH 標準の200 μl
分割量(0、0.1、0.3及び1.0 μU/ml)を3回重複で
ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートしてリン
酸−Tween20(商標)緩衝液で洗浄した。 6)50μg/ml抗TSH 発現抗体接合黄色/緑色スルフェ
ートフルオスフィアーの200 μl分割量を全マイクロタ
イターウェルに添加し、室温で1時間振とうし、リン酸
−Tween20(商標)緩衝液で洗浄して、アルゴン/クリプ
トンレーザーを備えた共焦レーザー走査顕微鏡で走査し
た。
ノクローナルIgG は、それを、アビジンコートされたマ
イクロタイターウェルに結合したビオチン化された相補
的ポリーCAオリゴヌクレオチドを通して固相に配された
結合抗体として用いた時、標準曲線の作成が成功したこ
とにより証明されるように十分に機能することができた
(図4を参照のこと)。
て固定化されている、2種類の前記捕獲剤及び2種類の
結合剤を用いて液体サンプル中の2つの被検体を検出す
るためのアッセイを示す。
る図1のアッセイを示す。
の占有率を決定する非競合法を示す。
してプロットされたシグナルのグラフを示す。
Claims (6)
- 【請求項1】 複数の異なる結合剤を固体支持体上の分
離された位置に固定化させる方法であって、各々の結合
剤は供された被検体に特異的な結合部位と、尾部とを有
し、該方法が、 (a)固体支持体上の分離された位置に複数の捕獲剤を
固定化するステップであって、各々の捕獲剤が供された
結合剤の尾部に結合できることを特徴とするステップ
と、 (b)前記結合剤を、前記複数の捕獲剤が固定化された
固体支持体と接触させて、前記結合剤がその尾部により
その各々の捕獲剤と特異的に結合するに至るようにする
ステップ、を含み、前記捕獲剤が、対応する結合剤の前
記尾部における相補的配列とハイブリッド形成できる配
列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする
方法。 - 【請求項2】 前記方法が、前記支持体に前記結合剤を
固定化する前に、該結合剤に前記尾部を付着させるステ
ップを更に含むことを特徴とする請求項1に記載の方
法。 - 【請求項3】 前記結合剤が、被検体に特異的な結合部
位を有する抗体であることを特徴とする請求項1または
2に記載の方法。 - 【請求項4】 前記結合剤が核酸被検体とハイブリッド
形成できるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする
請求項1または2に記載の方法。 - 【請求項5】 分離された位置がミクロスポットである
ことを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の
方法。 - 【請求項6】 請求項1〜5のいずれか1項に記載の方
法のためのキットであって、該キットが、 (a)複数の尾部であって、各々の尾部が結合剤への付
着のためであることを特徴とする尾部と、 (b)固体支持体に付着され、尾部に特異的に結合する
ことができる複数の異なる捕獲剤を複数の位置に有する
前記固体支持体と、を含み、前記捕獲剤が、対応する結
合剤の前記尾部における相補的配列とハイブリッド形成
することができる配列を有するオリゴヌクレオチドであ
り、前記アッセイの使用者が前記尾部を前記結合剤に付
着させることにより、前記捕獲剤が付着された前記固体
支持体と共に用い得る結合剤を供することを特徴とする
キット。
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