MXPA00003045A - Reactivo y metodo para conectar moleculas objetivo a una superficie - Google Patents

Abstract

Método y composición de reactivo para ligar en forma covalente moléculas objetivo, tales comoácidos nucleícos, sobre la superficie de un substrato. La composición de reactivo incluye grupos capaces de atraer la molécula objetivo asícomo grupos capaces de ligar covalentemente a la molécula objetivo, una vez atraídos. Opcionalmente, al composición pueden contener Grupos fotorreactivos para utilizar en conectar la composición de reactivo a la superficie.

Description

REACTIVO Y MÉTODO PARA CONECTAR MOLÉCULAS OBJETIVO A UNA SUPERFICIE CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a métodos para conectar moléculas objetivo tales como oligonucleótidos (oligos) a una superficie y a composiciones para utilizar en estos métodos. En otro aspecto, la invención se relaciona a las propias superficies revestidas resultantes.

Todavía en otro aspecto, la invención se relaciona al uso de medios fotoquímicos y termoquímicos, para conectar moléculas a una superficie. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La inmovilización de ácido de desoxirribonucleico ADN (DNA = deoxyribonucleic acid) sobre superficies de soporte) se ha vuelto un aspecto importante del desarrollo de sistemas de ensayo basados en ADN, así como para otros propósitos, incluyendo el desarrollo de estructuras microfabricadas para análisis de ADN. Ver por ejemplo "The Development of Microfabricated Arrays of DNA Sequencing and Analysis" (El desarrollo de conjuntos microfabricados de secuenciado y análisis de ADN), O ' Donnell-Maloney y colaboradores, TIBTECH 14:40 1-407 (1996). En general, estos procedimientos se llevan a cabo en la superficie de placas de micropozos, tubos, perlas, portaobjetos de microscopio, obleas de silicona o membranas. Ciertos enfoques en particular se han desarrollado para permitir o mejorar la probabilidad de conexión de punto extremo de un oligo sintético a una superficie. La conexión de punto extremo (es decir con la secuencia de ácido nucleico conectada a través de uno o el otro nucleótido terminal) es conveniente debido a que toda la longitud de la secuencia estará disponible para hibridización a otra secuencia de ácido nucleico. Esto es particularmente ventajoso para la detección de cambios de pares base simples bajo condiciones de hibridización estrictas. La hibridización es el método empleado más rutinariamente para medir ácidos nucleicos por formación de pares base a sondas inmovilizadas en un soporte sólido. Cuando se combinan con técnicas de amplificación tales como reacción en cadena polimerasa (PCR = polymerase chain reaction) o reacción de cadena ligasa (LCR = ligase chain reaction) los ensayos de hibridización son una herramienta poderosa para diagnóstico e investigación. Las placas de micropozos en particular son conveniente y útiles para ensayar números de muestras relativamente grandes . Varios métodos se han empleado para inmovilización de sondas de ácido nucleico sobre placas de micropozos. Algunos de estos involucran adsorción de oligos no modificados o modificados en placas de poliestireno. Otros involucran inmovilización covalente. Diversos métodos también se han empleado para incrementar la sensibilidad de ensayos de hibridización. Las sondas de detección y captura poliméricas se han sintetizado y utilizado para obtener sensibilidades hasta 107 moléculas de ADN/ml . Otro método empleado utiliza oligos ramificados para incrementar la sensibilidad de ensayos de hibridización. Todavía otro método emplea un método de mejora de anticuerpo de múltiples etapas. Otros tipos de sonda de ácidos nucleicos tales como ácido ribonucleico ARN (RNA = ribonucleic acid) , ADN complementario ADNc (cDNA = complementary DNA) y ácidos nucleicos péptidos (PNA's = peptide nucleic acids) también se han inmovilizado en placas de microprozos para hibridización de productos PCR en aplicaciones de diagnóstico. Además, cebadores PCR se han inmovilizado sobre placas de micropozos para PCR de fase sólida. Hasta la fecha solo unos enfoques relativamente menores a inmovilizar ADN, han encontrado su camino hacia productos comerciales. Un producto tal se conoce como "NucleoLink™" , y está disponible de Nalge Nunclnternational (Ver por ejemplo Nunc Tech Note Vol. 3, No. 17) . En este producto, el ADN se reacciona con una carbodiimida para activar grupos 5 '-fosfato que luego reaccionan con grupos funcionales en la superficie. Desventajas de este enfoque son que requiere la etapa extra de agregar el reactivo carbodiimida así como un tiempo de reacción de cinco horas para inmovilización de ADN, y se limita a un solo tipo de material de substrato. Como otro ejemplo, Pierce recientemente ha introducido un producto de inmovilización de ADN de propiedad conocido como "Reacti-BindMR DNA Coating Solutions" (ver instrucciones - solución de revestimiento Reacti-BindMR DNA" 1/1997) . Este producto es una solución que se mezcla con ADN y aplica a superficies tales como poliestireno o polipropileno. Después de incubación durante la noche, la solución se retira, la superficie se lava con amortiguador y seca, después de lo cual está lista para hibridización. Aunque la literatura de producto lo describe como útil para todas las superficies de plástico común empleadas en el laboratorio, tiene algunas limitaciones. Por ejemplo, los solicitantes no fueron capaces de demostrar inmovilización útil de ADN sobre polipropileno utilizando las instrucciones del fabricante. Además, este producto requiere grandes cantidades de ADN. Las instrucciones indican que el ADN deberá utilizarse en una concentración entre 0.5 y 5 µg/ml . Similarmente, Costar vende un producto denominado "DNA-BINDMR" para utilizar en conectar ADN a la superficie de un pozo en una placa de micropozos (ver por ejemplo la "guía de aplicación" de DNA-BINDMR) . La superficie de la placa DNA-BIND se reviste con un reactivo heterobinfuncional sin carga, no polimérico, de bajo peso molecular, que contiene un grupo reactivo N-oxisuccinimida (NOS) . Este grupo reacciona con nucleófilos tales como aminas primarias. El reactivo de revestimiento heterobifuncional también contiene un grupo fotoquímico y un brazo espaciador que liga covalentemente el grupo reactivo con la superficie de la placa de poliestireno. Posteriormente, ADN modificado con amina puede acoplarse covalentemente a la superficie de NOS. El ADN se modifica al agregar una amina primaria, ya sea durante el proceso de síntesis al oligómero naciente o enzimáticamente a la secuencia preformada. Ya que el producto DNA-BINDMR se basa en poliestireno, es de uso limitado para aquellas aplicaciones que requieren temperaturas elevadas tales como ciclado térmico. Estos diversos productos pueden ser útiles para algunos propósitos, o bajo ciertas circunstancias, pero todos tienden a presentar una o más desventajas y restricciones. En particular, ya tienden a requerir grandes cantidades de oligo, a tener niveles de interferencia de fondo que son inadecuada versatilidad alta y/o carentes .

Sería altamente conveniente el poder conectar moléculas tales como oligos a una superficie en una forma que evite algunas o todas las desventajas de estos enfoques previos . COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método y composición de reactivo para conexión covalente de moléculas objetivos sobre la superficie de un substrato, tal como placas de micropozos, tubos, perlas, portaobjetos de microscopio, obleas o membranas de silicona. En una modalidad preferida, el método y composición se utilizan para inmovilizar sondas de ácido nucleico sobre materiales plásticos tales como placas de microprozos, por ejemplo para utilizar en ensayos de hibridización. Las placas de micropozos por ejemplo pueden prepararse a partir de una variedad de materiales, incluyendo, pero no limitados a poliestireno, policarbonato, cloruro de polivinilo y propileno, y revestirse con un reactivo de la invención. La composición de reactivo luego puede utilizarse tanto para atraer como conectar covalentemente un ácido nucleico, que a su vez puede emplearse para hibridizar a su hebra complementaria . Una composición de reactivo de la invención contiene grupos termoquímicamente reactivos (es decir grupos que tienen una velocidad de reacción que depende de la temperatura) y grupos atractivos o atrayentes. Opcionalmente y de preferencia, la composición también puede contener grupos fotorreactivos . Adicionalmente, el reactivo puede comprender uno o más polímeros hidrofílicos, para los cuales los grupos termoquímicamente reactivos atrayentes y/o foto reactivos pueden depender o ser secundarios. Los grupos fotorreactivos (referidos en forma alterna aquí como "fotogrupos" ) pueden emplearse por ejemplo para conectar moléculas de reactivo a la superficie del soporte ante la aplicación de una fuente de energía conveniente tal como luz. Los grupos termoquímicamente reactivos pueden emplearse para forma enlaces covalentes con grupos funcionales apropiados y complementarios en la molécula objetivo. En general, las moléculas reactivo primero se conectarán a la superficie por activación de los otros grupos, posteriormente la molécula objetivo (por ejemplo un oligo) se atrae al reactivo ligado, substancialmente debido a interacciones iónicas entre grupos atrayentes (es decir iónicos) en el reactivo ligado y grupos cargados opuestos en el objetivo. Una vez atraídos al reactivo ligado y a su vez a la superficie, la molécula objetivo puede acoplarse termoquímicamente al reactivo ligado por reacción entre los grupos reactivos del reactivo ligado y grupos funcionales apropiados en la molécula objetivo. Los grupos termoquímicamente reactivos y los grupos iónicos ya pueden estar en el mismo polímero o en diferentes polímeros que se coinmovilizan en la superficie. Mientras que no se pretende estar ligado por teoría, parece que la presencia de grupos iónicos, por ejemplo grupos catiónicos tales como grupos de amonio cuaternario o aminas terciarias protonadas (es decir acidificadas) , sirven para atraer la secuencia d ácido nucleico a la superficie mediante fuerzas electrostáticas y otras. Esta atracción a su vez mejora la capacidad de los grupos reactivos para acoplar eficientemente con grupos reactivos correspondientes en la secuencia de ácido nucleico. Opcionalmente y de preferencia, la molécula objetivo puede prepararse o proporcionarse con grupos funcionales ajustados a la medida con grupo reactivo de la molécula de reactivo. Durante su síntesis, por ejemplo, los oligos pueden prepararse con grupos funcionales tales como grupos amina y sulfhidrilo. La invención además proporciona un método para conectar una molécula objetivo tal como un oligo, a una superficie al emplear un reactivo como se describe aquí. A su vez, la invención proporciona una superficie que tiene ácidos nucleicos conectados mediante este reactivo, así como un material (placa de micropozos) que proporciona esta superficie.

Todavía en otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende uno o varios reactivos de esta invención en combinación con una molécula objetivo que contiene uno o más grupos funcionales reactivos con el o los grupos termoquímicamente reactivos del reactivo. Un ejemplo particularmente preferido, por ejemplo es aquel descrito aquí como "fotopoliCuat " (fotopoliQuat) , en donde una pluralidad de grupos foto y una pluralidad de grupos catiónicos (en la forma de grupos de amonio cuaternarios) se conectan a una estructura principal polimérica hidrofilica. Este reactivo proporciona versatilidad excepcional, al co- inmovilizarse con un fotopoliNOS a concentraciones óptimas y proporciones de inmovilización de moléculas objetivo. Al utilizar estos reactivos, los solicitantes han encontrado que las sondas de captura pueden movilizarse covalentemente como una variedad de superficies, incluyendo superficies que de otra forma no adsorberán las sondas (tales como polipropileno y cloruro de polivinilo) . Las superficies resultantes proporcionan señales comparables con o mejores que aquellas contenidas con oligos modificados adsorbidos sobre poliestireno o policarbonato. El método y reactivo de inmovilización presentes pueden emplearse en métodos de amplificación en una forma que es más simple que las previamente reportadas, y también pueden proporcionar superficies mejoradas para la inmovilización covalente de estos ácidos nucleicos derivatizados -nucleófilo. Además de sondas inmovilizadas para ensayos de hibridización y métodos de amplificación, los reactivos de esta invención pueden proporcionar inmovilización de ácido nucleico mejorada para secuenciado en fase sólida y para inmovilizar cebadores para PCR y otras técnicas de amplificación. DESCRIPCIÓN DETALLADA Una composición de reactivo preferido de la presente invención comprende una estructura principal hidrofilica que contiene uno o más grupos iónicos que tienen la capacidad por atraer una molécula objetivo correspondiente, junto con uno o más grupos fotorreactivos útiles para conectar el reactivo a una superficie, y uno o más grupos termoquímicamente, útiles para formar un enlace covalente con el grupo reactivo correspondiente de la molécula objetivo. En forma opcional y de preferencia, la composición puede incluir el uso de dos o más moléculas de reactivos diferentes, la primera comprende una estructura principal hidrofílica que contiene uno o más grupos iónicos que tienen la capacidad por atraer una molécula objetivo correspondiente junto con uno o más grupos fotorreactivos útiles para conectar el reactivo a una superficie. La segunda molécula de reactivo comprende una estructura principal hidrofílica que contiene uno o más grupos termoquímicamente reactivos útiles para formar un enlace covalente con el grupo funcional correspondiente de la molécula objetivo, junto con uno o más grupos fotorreactivos útiles para conectar el reactivo a una superficie. Opcionalmente, solo una de las moléculas reactivo se requiere que tenga los grupos fotorreactivos ya que ese reactivo es capaz de co- inmovilizar el segundo polímero a través de entrelazamiento fotoquímico. En este caso, sin embargo la molécula objetivo debe tener dos o más grupos fotorreactivos, a fin de proporcionar acoplamiento a la superficie y al segundo polímero. En una extensión adicional de la invención, no es necesario que tanto el grupo iónico como el grupo termoquímicamente reactivo estén incorporados como parte del polímero hidrofílico. Una pequeña molécula heterobifuncional, por ejemplo que tiene uno o más grupos fotorreactivos y uno o más grupos termo-químicamente reactivos, separada por un espaciador conveniente, puede emplearse con un polímero hidrofílico fotorreactivo que tiene el grupo iónico para lograr la inmovilización de secuencias de ácido nucleico. Por el contrario, una molécula heterobifuncional que tiene uno o más grupos fotorreactivos y uno o más grupos iónicos separados por un espaciador conveniente, puede emplearse con un polímero hidrofílico fotorreactivo que tiene el grupo termoquímicamente reactivo. Aunque se prefiere, el uso de una estructura principal polimérica hidrofílica simplemente es opcional, ya que tanto los grupos iónicos y los grupos termoquímicamente reactivos pueden incorporarse como dos moléculas heterobifuncionales fotorreactivas separadas o como una sola molécula fotorreactiva que contiene ambos tipos de grupos . En otra modalidad de la invención, es posible el inmovilizar secuencias de ácido nucleico, sin el uso de grupos fotorreactivos. Por ejemplo, la superficie de material a revestir puede proporcionarse con grupos termoquímicamente reactivos, que pueden utilizarse para inmovilizar polímeros hidrofílicos que tienen grupos reactivos iónicos y termoquímicos como se describió anteriormente. Por ejemplo, puede tratarse una superficie con un plasma de amoníaco para introducir un número limitado de aminas reactivo en la superficie del material. Si esta superficie luego se trata con un polímero hidrofílico que tiene tanto el grupo amina cuaternario como grupos NOS, entonces el polímero puede inmovilizarse a través de reacción de los grupos NOS con aminas en la superficie. De preferencia, los grupos NOS en el polímero están en exceso respecto a las aminas en la superficie, para asegurar que una cantidad suficiente de estos grupos termoquímicamente reactivos permanezca siguiendo la inmovilización para permitir acoplamiento con la secuencia de ácido nucleico. Aquellos con destreza en la especialidad, dada la presente descripción, serán capaces de identificar y seleccionar grupos iónicos conveniente dependiendo el tipo de moléculas objetivo de interés. Moléculas objetivo incluyen pero no están limitadas a ADN plásmido, ADN cósmido, ADN bacteriófago, ADN genómico (incluye pero no limitado a levadura, viral, bacterial, mamífero, insecto) ARN, ADNc, APN y oligos. Grupos iónicos convenientes incluyen sales de amonio cuaternarias, aminas terciarias protonadas y otros grupos catiónicos tales como compuestos fosfonio. También se incluyen grupos de amina terciaria capaces de protonarse cuando se colocan en un ambiente ácido. Sales de amonio cuaternarias incluyen compuestos de alquil amonio cuaternario, tales como cloruro de [3- (metacriloílamino) propil] trimetilamonio (MAPTAC) , así como grupos de aromáticos de amonio cuaternario tales compuestos piridinio. Los compuestos fosfonio incluyen polímeros preparados a partir de monómeros tales como cloruro de tributil (4 -vinilbenzil) fosfonio y se describen en J. Appl . Polymer Sci. 53: 1237 (1994), la descripción de los cuales aquí se incorpora también por referencia.

Una estructura principal polimérica ya puede ser de origen natural o sintética, y de preferencia es un polímero sintético seleccionado del grupo que consiste de oligomeros, homopolímeros y copolímeros que resultan de adición o polimerización por condensación. Polímeros de origen natural, tales como polisacáridos, polipéptidos pueden emplearse por igual . Estructuras principales preferidas son biológicamente inertes, ya que no proporcionan una función biológica que es inconsistente con o nociva a su uso en la forma descrita. Estas estructuras principales poliméricas pueden incluir acrílicos, tales como aquellos polimerizados a partir de hidroxietil acrilato, hidroxietil metacrilato, gliceril acrilato, gliceril metacrilato, acrilamida y metacrilamida, vinilos, tales como polivinil pirrolidona y alcohol polivinilico, nylons tales como policaprolactama, polilauril lactama, polihexametilen adipamida y polihexametilen dodecandiamida, poliuretanos y óxido de polietileno . Las estructuras principales poliméricas de la invención se eligen para proporcionar estructuras principales hidrofílicas capaces de coatener el número deseado y tipo de grupos iónicos, fotogrupos y grupos termoquímicamente reactivos, la combinación depende del reactivo selecto. La estructura principal polimérica también se elige para proporcionar un espaciador entre la superficie y los diversos grupos iónicos y termoquímicamente reactivos. De esta manera, el reactivo puede ligarse a una superficie o a una molécula de reactivo adyacente, para proporcionar los otros grupos con suficiente libertad de movimiento para demostrar la actividad óptima. Las estructuras principales poliméricas de preferencia son hidrofílicas (por ejemplo solubles en agua) con poliacrilamida y polivinil pirrolidona que son polímeros particularmente preferidos. Reactivos de la invención transportan uno o más grupos reactivos latentes secundarios (de preferencia fotorreactivos) ligados covalentemente a la estructura principal polimérica. Grupos fotorreactivos aquí se definen, y grupos preferidos son suficientemente estables para almacenarse bajo condiciones en donde retienen estas propiedades. Ver por ejemplo la patente de los E.U.A. No. 5,002,582, la descripción de la cual aquí se incorpora por referencia. Grupos reactivos latentes pueden seleccionarse que responden a diversas porciones del espectro electromagnético, con aquellos que responden a porciones ultravioleta y visible del espectro (aquí referidos como "fotorreactivo") se prefieren en particular. Grupos fotorreactivos responden a estímulos externos aplicados específicos para someterse a una generación de especie activa con unión covalente resultante con una estructura química adyacente, por ejemplo como se proporciona por la misma o una diferente molécula. Grupos fotorreactivos son aquellos grupos de átomos en una molécula que retienen sus enlaces covalentes sin cambio bajo condiciones de almacenamiento, pero que ante activación por una fuente de energía externa, forman enlaces covalentes con otras moléculas. Los grupos fotorreactivos generan especies activas tales como radicales libres y particularmente nitrenos, carbenos y estados excitados de cetonas ante absorción de energía electromagnética. Pueden seleccionarse grupos fotorreactivos para responder a diversas porciones del espectro electromagnético y grupos fotorreactivos que responden por ejemplo a porciones ultravioleta y visible del espectro se prefieren y pueden referirse aquí ocasionalmente como "grupo fotoquímico" o "fotogrupo" . Aril cetonas fotorreactivas se prefieren, tales acetofenona, benzofenona, antraquinona, antrona, y heterociclos tipo antrona (es decir, análogos h terociclicos de antrona tales como aquellos que tienen N, 0, o S en la posición 10) , o sus derivados substituidos (por ejemplo substituidos en anillo) . Los grupos funcionales de estas cetonas se prefieren, ya que son fácilmente capaces de someterse al ciclo de activación/inactivación/reactivación aquí descritos. La benzofenona es una porción fotorreactiva particularmente preferida, ya que es capaz de excitación fotoquímica con la formación inicial de un estado singlete excitado que se somete a cruce intersistema al estado triplete. El estado triplete excitado puede insertarse en enlaces de carbono -hidrógeno por abstracción de un átomo de hidrógeno (a partir de una superficie de soporte, por ejemplo) de esta manera creando un par de radicales. Colapso subsecuente del par de radicales conduce a la formación de un nuevo enlace de carbono-carbono . Si un enlace reactivo (por ejemplo carbono-hidrógeno) no está disponible para unión, la excitación inducida por luz ultravioleta del grupo bezofenona es reversible y la molécula regresa al nivel de energía de estado basal ante remoción de la fuente de energía. Aril cetonas fotoactivables tales como benzofenona y acetofenona, son de importancia particular ya que estos grupos están sujetos a múltiple reactivación en agua y por lo tanto proporcionan eficiencia de revestimiento incrementada. Por lo tanto, se prefieren particularmente arilcetonas fotorreactivas . Las azidas constituyen una clase preferida de grupos fotorreactivos e incluyen aril azidas (C6R5N3) tales como fenil azidas y particularmente 4-fluoro-3-nitrofenil azida, acil azidas (-CO-N3) tales como benzoil azida y p-metilbenzoil azida, azido formatos (-0-CO-N3) tales como etil azidoformato, fenil azidoformato, sulfonil azidas (-S02-N3) tales como benzensulfonil azida, y fosforil azidas (RO)2PON3 tales como difenil fosforil azida y dietil fosforil azida. Compuestos diazo constituyen otra clase de grupos fotorreactivos e incluyen diazoalcanos (-CHN2) tales como diazometano y difenildiazometano, diazocetonas (-CO-CHN2) tales como diazoacetofenona y 1-trifluorometil-1-diazo-2 -pencanona, diazoacetatos (-0-CO-CHN2) tales como t-butil diazoacetato y fenil diazoacetato, y beta-ceto-alfa-diazoacetatos ( -CO-CN2-CO-0- ) tales como t-butil alfa diazoacetoacetato . Otros grupos fotorreactivos incluyen diazirinas (-CHN2) tales como 3-trifluorometil-3 -fenildiazirina, y cetenos (-CH=C=0) tales como ceteno y difenilceteno. Aril cetonas fotoactivables tales como benzofenona y acetofenona, son de importancia particular ya que estos grupos están sujetos a múltiple reactivación en agua y por lo tanto proporcionan eficiencia de revestimiento incrementada. Ante activación de los grupos fotorreactivos, las moléculas de reactivo se ligan covalentemente entre sí y/o a la superficie de material por enlaces covalentes a través de residuos de los grupos fotorreactivos. Grupos fotorreactivos ejemplares y sus residuos ante activación se ilustran como sigue. fotorreactivo Grupo Funcional i dad de Residuo aril azidas amina R-NH-R' acil azidas amida R-CO-NH-R' azidoformatos carbamato R-O-CO-NH-R' sulfonil azidas sulfonamida R-S02-NH-R' fosforil azidas fosforamida (RO) 2PO-NH-R' diazoalcanos nuevo enlace C-C diazocetonas nuevo enlace C-C y cetona diazoacetatos nuevo enlace C-C y éster beta-ceto-alfa-diazoacetatos nuevo enlace C-C y beta-cetoéster azo alifático nuevo enlace C-C diazirinas nuevo enlace C-C cetenos nuevo enlace C-C cetonas nuevo enlace C-C fotoactivadas alcohol ketones Aquellos con destreza en la especialidad, dada la presente descripción, serán capaces de identificar y seleccionar grupos termoquímicamente reactivos convenientes para proporcionar inmovilización covalente de secuencias de ácido nucleico derivatizadas apropiadamente. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico derivatizada con amino, se someterá a una reacción de acoplamiento covalente con un éster activado tal como un éster NOS para proporcionar un grupo de enlace amida. Esteres activados similares tales como p-nitrofenil y pentafluorofenil esteres también proporcionará enlaces amida cuando se reaccionan con grupos amina. Aquellos con destreza en la especialidad también reconocerán numerosos otros grupos funcionales reactivos de amina tales como isocianatos, tioisocianatos, cloruros de ácido carboxílico, epóxidos, aldehidos, alquil haluros y sulfonato esteres, tales como mesilato, tosilato y tresilato, cada uno de los cuales puede servir como grupo termoquímicamente reactivo. En otro ejemplo, la secuencia de ácido nucleico puede derivatizarse con un grupo sulfhidrilo utilizando técnicas bien conocidas en la especialidad. El grupo termoquímicamente reactivo correspondiente por ejemplo será una estructura de anillo maleimido o un -yodoacetamida. Cualquiera de estas estructuras reaccionará fácilmente para proporcionar un enlace covalente con la secuencia de ácido nucleico derivatizada sulfhidrilo.

Los polímeros funcionalizados de esta invención pueden prepararse por derivatización apropiada de un polímero preformado o más preferiblemente por polimerización de un conjunto de comonómeros para dar el patrón de substitución deseado. Este último enfoque se prefiere debido a la facilidad de cambio de la proporción de los diversos comonómeros y por la capacidad por controlar el nivel de incorporación en el polímero. Una combinación de estos dos enfoques también puede emplearse para proporcionar estructuras óptimas. En una modalidad preferida, por ejemplo, se preparan monómeros que tienen un grupo polimerizable en un extremo de la molécula, separados por un grupo espaciador a partir de un grupo fotorreactivo termoquímicamente reactivo en el otro extremo. Por ejemplo, grupos vinilo polimerizables tales como acrilamidas, acrilatos o maleimidas pueden acoplarse a través de un espaciador de hidrocarburo corto, con un éster activado tal como un éster NOS o un grupo fotorreactivo tal como una benzofenona substituida. Estos compuestos pueden prepararse y purificarse utilizando técnicas de síntesis orgánica bien conocidas por aquellos con destreza en la especialidad. Algunos de estos monómeros están comercialmente disponibles tales como MAPTAC, N- [3 - (dimetilamino) propil] metacrilamida (DMAPMA) , y N- (3 -aminopropil) metacrilamida hidrocloruro (APMA) , estos compuestos proporcionan sales de amonio cuaternarias, aminas terciarias y aminas primarias respectivamente sobre la estructura principal del polímero. Pueden prepararse copolímeros a partir de los monómeros anteriores por igual, utilizando técnicas conocidas por aquella con destreza en la especialidad. De preferencia, estos monómeros y copolímeros se someten a polimerización de radicales libres de grupos vinilo, utilizando iniciadores azo tales como 2 , 2 ' -azobisisobutironitrilo (AIBN) o peróxidos tales como peróxido de benzoilo. Los monómeros seleccionados para la polimerización se eligen con base en la naturaleza del producto de polímero final. Por ejemplo, un polímero fotorreactivo que contiene grupos de amonio cuaternario, se prepara a partir de un monómero que contiene el grupo fotorreactivo y un segundo monómero que contiene un grupo de amonio cuaternario. Un polímero fotorreactivo que contiene un grupo NOS, se prepara a partir de un monómero que contiene el grupo fotorreactivo y un segundo monómero que contiene el éster NOS activado. Un polímero fotorreactivo que contiene tanto grupos de amonio cuaternarios como esteres NOS, se prepara utilizando todos los tres monómeros . La composición del polímero final puede controlarse por una proporción en mol de los monómeros cargados a la reacción de polimerización. Típicamente, estos monómeros funcionalizados se utilizan en porcentajes molares relativamente bajos del contenido de monómero total de la reacción de polimerización, con el resto de la composición que consiste de un monómero que ni es fotorreactivo ni es termoquímicamente reactivo hacia la secuencia de ácido nucleico. Ejemplos de estos monómeros incluyen pero no están limitados a acrilamida y N-vinilpirrolidona. Con base en las reactividades relativas de los monómeros empleados, la distribución de los monómeros sobre la estructura principal es substancialmente aleatoria. En algunos casos, el grupo termoquímicamente reactivo en la estructura principal del polímero en si puede actuar como un monómero polimerizable. De estar presente durante la polimerización, de esta manera se requiere la introducción de ese grupo en una segunda etapa después de la formación inicial del polímero. Por ejemplo, la preparación de un polímero fotorreactivo que tiene maleimida sobre la estructura principal puede lograrse por una preparación inicial de un polímero que contiene tanto grupos fotorreactivos como grupos amina utilizando las técnicas anteriormente descritas, seguidas por reacción de los grupos amina con una molécula heterobifuncional que contiene un grupo maleimida y un isocianato conectado por un espaciador corto de hidrocarburo. Una amplia variedad de estas técnicas de modificación de polímero están disponibles utilizando reacciones orgánicas típicas conocidas por aquellos con destreza en la especialidad. La invención se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes. Será aparente para aquellos con destreza en la especialidad que pueden realizarse muchos cambios en las modalidades descritas sin apartarse del alcance de la presente invención. De esta manera, el alcance de la presente invención no deberá limitarse a las modalidades descritas en esta solicitud, sino solo por las modalidades descritas por el lenguaje de las reivindicaciones y los equivalentes a esas modalidades. A menos de que de otra forma se indique, todos los porcentajes se dan en peso. Estructuras de los diversos "compuestos" identificados a través de estos ejemplos, pueden encontrarse en la tabla 9 incluida a continuación. EJEMPLOS Ejemplo 1 Preparación de cloruro 4-Benzoilbenzoilo (BBA-C1) (Compuesto Ácido 4-Benzoilbenzoico (BBA) , 1.0 kg (4.42 moles) , se agrega a un matraz Morton de 5 litros, seco, equipado con condensador de reflujo y agitador superior, seguido por la adición de 645 mi (8.84 moles) de cloruro de tionilo y 725 mi de tolueno. Dimetilformamida, 3.5 mi, luego se agrega y la mezcla se calienta al reflujo por cuatro horas. Después de enfriar, los solventes se retiran bajo presión reducida y el cloruro de tionilo residual se retira por tres evaporaciones utilizando 3 x 500 mi de tolueno. El producto se recristaliza a partir de 1:4 tolueno : hexano para dar 988 g (91 % rendimiento) después de secar en un horno al vacío. El punto de fusión del producto fue 92-94°C. Análisis de resonancia magnética nuclear (RMN) a 80 MHz (H RMN (CDCl3) ) fue consistente con los protones aromáticos de producto deseado 7.20-8.25 (m, 9H) . Todos los valores de desplazamiento químico son en ppm campo bajo de una norma interna de tetrametilsilano. El compuesto final se almacena para uso en una preparación de un monómero empleado en la síntesis de polímeros fotoactivables como se describe por ejemplo en el Ejemplo 3. Ejemplo 2 Preparación de Hidrocloruro de N- (3 -Aminopropil) metacrilamida (APMA) (Compuesto II) Una solución de 1, 3 -diaminopropano, 1910 g (25.77 moles) , en 1000 mi of CH2C12 se agrega a un matraz Morton de 12 litros y enfría en un baño de hielo. Una solución de t-butil fenil carbonato, 1000 g (5.15 moles), en 250 mi de CH2C12 luego se agrega por gotas a una velocidad que mantiene la temperatura de reacción por debajo de 15 °C. Después de la adición, la mezcla se calienta a temperatura ambiente y agita dos horas. La mezcla de reacción se diluye con 900 mi de CH2C12 y 500 g de hielo, seguido por la adición lenta de 2500 mi de NaOH 2.2 N. Después de probar para asegurar que la solución era básica, el producto se transfiere a un embudo de separación y la capa orgánica se retira para separar como extracto #1. La parte acuosa luego se extrae con 3 X 1250^ mi de CH2Cl2, manteniendo cada extracción como una fracción separada. Los cuatro extractos orgánicos luego se lavan sucesivamente con una sola porción de 1250 mi de NaOH 0.6 N, empezando con la fracción #1, y procediendo hasta la fracción #4. Este procedimiento de lavado se repite una segunda vez con una porción fresca de 1250 mi de NaOH 0.6 N. Los extractos orgánicos luego se combinaron y secaron sobre Na2S04. El filtrado y evaporación de solvente a un peso constante dio 825 g de N-mono-t-BOC-l, 3 -diaminopropano que se empleó sin mayor purificación. Una solución de anhídrido metacrílico, 806 g (5.23 moles), en 1020 mi de CHCl3, se coloca en un matraz Morton de 12 litros y equipado con agitador superior y enfriado en un baño de hielo. Fenotiazina, 60 mg, se agrega como un inhibidor, seguida por la adición por gotas de N-mono-t-BOC-1, 3-diaminopropano, 825 g (4.73 moles), en 825 mi de CHCl3. La velocidad de adición se controla para mantener la temperatura de reacción inferior a 10 °C en todo tiempo. Después de completar la adición, el baño de hielo se retira y la mezcla se deja que agite durante la noche. El producto se diluye con 2400 mi de agua y transfiere a un embudo de separación. Después de mezclado completo, la capa acuosa se retira y la capa orgánica se lava con 2400 de NaOH 2 N, asegurando que la capa acuosa fuera básica. La capa orgánica luego se seca sobre Na2S04 y filtra para retirar agente de secado. Una porción del solvente CHC13 se retira bajo presión reducida, hasta que el peso combinado del producto de un solvente fue aproximadamente 3000 g. El producto deseado luego se precipita por adición lenta de 11.0 litros de hexano en la solución agitada CHC13, seguido por almacenamiento durante la noche a 4°C. El producto se aisla por filtración y el sólido se enjuaga dos veces con una combinación de solvente de 900 mi de hexano y 150 mi de CHCI3. Completo secado del sólido dio 900 g de N- [N' - (t-butiloxicarbonil) -3-aminopropil] -metacrilamida, p.f. 85.8°C por DSC. Análisis en un espectrómetro de RMN fue consistente con el producto deseado: lH RMN (CDC13) NH de amida 6.30-6.80, 4.55-5.10 (m, 2H) , protones vinilo 5.65, 5.20 (m, 2H) , metilenos adyacentes a N 2.90-3.45 (m, 4H) , metilo 1.95 (m, 3H) , metilenos restantes 1.50-1.90 (m, 2H) , y t-butilo 1.40 (s, 9H) . Un matraz de fondo redondo, con 2 litros de capacidad, de 3 cuellos, se equipó con una agitador superior y un tubo de burbujeo de gas. Metanol, 700 mi, se agrega al matraz y enfría en un baño de hielo. Mientras que se agita, se burbujea gas HCl en el solvente a una velocidad aproximada de 5 litros/minuto por un total de 40 minutos. La molaridad de la solución final- HCl/MeOH se determina como 8.5 M por titulación con NaOH 1 N utilizando fenolftaleína como un indicador. La N-[N'-(t-butiloxicarbonil) -3 -aminopropil] metacrilamida, 900 g (3.71 moles) , se agrega a un matraz Morton de 5 litros equipado con un agitador superior y un adaptador de salida de gas, seguido por adición de 1150 mi de solvente metanol. Algunos sólidos quedaron en el matraz con este volumen de solvente. Fenotiazina, 30 mg, se agrega como un inhibidor, seguida por la adición de 655 mi (5.57 moles) de una solución HCl/MeOH 8.5 M. Los sólidos se disolvieron lentamente con el desprendimiento de gas, pero la reacción no fue exotérmica. La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente para asegurar reacción completa. Cualesquiera sólidos luego se retiraron por filtración y 30 mg adicionales de fenotiazina se agregaron. El solvente luego se extrajo bajo presión reducida y el residuo sólido resultante se hizo azeótropo con 3 X 1000 mi de isopropanol con evaporación bajo presión reducida. Finalmente, el producto se disuelve en 2000 mi de isopropanol al reflujo y 4000 mi de acetato de etilo se agregaron lentamente con agitación. La mezcla se dejó que enfriara lentamente y se almacenó a 4°C durante la noche. El compuesto II se aisló por filtración y secó a peso constante, dando un rendimiento de 630 g con un punto de fusión de 124.7°C por DSC. Análisis en un espectrómetro RMN fue consistente con el producto deseado: aH RMN (D20) protones vinilo 5.60, 5.30 (m, 2H) , metileno adyacente a amida N 3.30 (t, 2H) , metileno adyacente a amina N 2.95 (t, 2H) , metilo 1.90 (m, 3H) , y metileno restante 1.65-2.10 (m, 2H) . El compuesto final se almacenó para uso en la preparación de un monómero utilizado en la síntesis de polímeros fotoactivables como se describe, por ejemplo, en el Ejemplo 3. Ejemplo 3 Preparación de N- \3 - (4-Benzoilbenzamido) propil] metacrilamida (BBA-APMA) (Compuesto III) El compuesto II, 120 g (0.672 mol), preparado de acuerdo con el método general descrito en el Ejemplo 2, se agregó a un matraz de fondo redondo de tres cuellos de 2 litros de capacidad seco, equipado con un agitador superior. Fenotiazina, 23-25 mg, se agrega como un inhibidor seguido por 800 mi de cloroformo. La suspensión se enfrió por debajo de 10 °C en un baño de hielo y 172.5 g (0.705 mol) del compuesto I, preparado de acuerdo con el método general descrito en el Ejemplo 1, se agregó con un sólido. Trietilamina, 207 mi (1.485 moles), en 50 mi de cloroformo luego se agrega por gotas durante un período de 1-1.5 horas. El baño de hielo se retira y la agitación a temperatura ambiente se continua por 2.5 horas . El producto luego se lava con 600 mi de HCl 0.3 N y 2 x 300 mi de HCl 0.07 N. Después de secar sobre sulfato de sodio, el cloroformo se retira bajo presión reducida y el producto se recristaliza dos veces a partir de 4:1 tolueno : cloroformo 23-25 mg, utilizando 23-25 mg de fenotiazina en cada recristalización para evitar polimerización. Rendimiento típicos del compuesto III fueron 90% con un punto de fusión de 147-151°C. /Análisis en un espectrómetro RMN fue consistente con el producto deseado: lR NMR (CDC13) protones aromáticos 7.20-7.95 (m, 9H) , amida NH 6.55 (amplio t, 1H) , protones vinilo 5.65, 5.25 (m, 2H) , metilenos adyacentes a N de amida 3.20-3.60 (m, 4H) , metil 1.95 (s, 3H) , y metileno restante 1.50-2.00 (m, 2H) . El compuesto final se almacena para uso en la síntesis de polímeros fotoactivables como se describe por ejemplo en los Ejemplos 9 a 11. Ejemplo 4 Preparación de N-Succinimidil 6-Maleimidohexanoato (MAL-EAC-NOS) (Compuesto IV) Un monómero funcionalizado se prepara en la siguiente forma, y se emplea como se describe en los Ejemplos 9 y 12 para introducir grupos éster activados en la estructura principal de un polímero. Ácido 6-aminohexanoico, 100.0 g (0.762 moles), se disuelve en 300 mi de ácido acético en un matraz de 3 litros de capacidad, con tres cuellos, equipado con un agitador superior y tubo de secado. Anhídrido maleico, 78.5 g (0.801 moles), se disuelve en 200 mi de ácido acético y agrega a la solución de ácido 6-aminohexanoico. La mezcla se agita por una hora mientras que se calienta en un baño de agua hirviente, resultando en formación de un sólido blanco. Después de enfriar durante la noche a temperatura ambiente, el sólido se recolecta por filtración y enjuaga con 2 x 50 mi de hexano. Después de secar, el rendimiento típico del ácido (Z) -4-oxo-5-aza-2-undecendioico fue 158-165 g (90-95%) , con punto de fusión de 160-165°C. Análisis en un espectrómetro RMN fue consistente con el producto deseado: 1H NMR (DMSO-d6) protón de amida 8.65-9.05 (m, 1H) , protones vinilo 6.10, 6.30 (d, 2H) , metileno adyacente a nitrógeno 2.85-3.25 (m, 2H) , metileno adyacente a carbonilo 2.15 (t, 2H) , y metilenos restantes 1.00-1.75 (m, 6H) . Ácido (Z) -4-0xo-5-aza-2-undecendioico, 150.0 g (0.654 moles), anhídrido acético, 68 mi (73.5 g, 0.721 moles) , y fenotiazina, 500 mg, se agregan a un matraz de fondo redondo de tres cuellos con 2 litros de capacidad, equipado con un agitador superior. Trietilamina, 91 mi (0.653 mol), y 600 mi de THF se agregan y la mezcla se calienta a reflujo mientras que se agita. Después de un total de 4 horas de reflujo, la mezcla obscura se enfría a <60°C y vacía en una solución de 250 mi de HCl 12 N en 3 litros de agua. La mezcla se agita 3 horas a temperatura ambiente y luego se filtra a través de un cojín de filtración (Celite 545, J.T. Baker, Jackson, TN) para retirar los sólidos. El filtrado se extrajo con 4 x 500 mi de cloroformo y los extractos combinados se secaron sobre sulfato de sodio. Después de agregar 15 mg de fenotiazina para evitar polimerización, el solvente se retira bajo presión reducida. El ácido 6-maleimidohexanoico se recristaliza a partir de 2 : 1 hexano : cloroformo para dar rendimiento típicos de 76-83 g (55-60%) con un punto de fusión de 81-85°C. Análisis en un espectrómetro RMN fue consistente con el producto deseado: JH NMR (CDC13) protones maleimida 6.55 (s, 2H) , metileno adyacente a nitrógeno 3.40 (t, 2H) , metileno adyacente a carbonilo 2.30 (t, 2H) , y metilenos restantes 1.05-1.85 (m, 6H) .

El ácido 6-maleimidohexanoico, 20.0 g (94.7 mmol), se disuelve en 100 mi de cloroformo 'bajo una atmósfera de argón, seguido por la adición de 41 mi (0.47 mol) de cloruro de oxalilo. Después de agitar por 2 horas a temperatura ambiente, el solvente se retira bajo presión reducida con 4 x 25 mi de cloroformo adicional empleado para retirar lo último del exceso de cloruro de oxalilo. El cloruro de ácido se disuelve en 100 mi de cloroformo, seguido por la adición de 12.0 g (0.104 mol) de N-hidroxisuccinimida y 16.0 mi (0.114 mol) de trietilamina. Después de agitar durante la noche a temperatura ambiente, el producto se lava con 4 x 100 mi de agua y seca sobre el sulfato de sodio. La remoción de solvente dio 24.0 g de producto (82%) , que se empleó sin mayor purificación. Análisis en un espectrómetro RMN fue consistente con el producto deseado: XH NMR (CDC13) protones maleimida 6.60 (s, 2H) , metileno adyacente a nitrógeno 3.45 (t, 2H) , protones succinimidilo 2.80 (s, 4H) , metileno adyacente a carbonilo 2.55 (t, 2H) , y metilenos restantes 1.15-2.00 (m, 6H) . El compuesto final se almacena para uso en la síntesis de polímeros fotoactivables como se describe por ejemplo en los Ejemplos 9 y 12. Ejemplo 5 Preparación de N-Succinimidil 6-Metacrilamidohexanoato (MA-EAC-NOS) (Compuesto V) Un monómero funcionalizado se prepara en la siguiente forma, y se emplea como se describe en el Ejemplo 11 para introducir grupos éster activados en la estructura principal de polímero. Ácido 6-Aminocaproico, 4.00 g (30.5 mmol) , se coloca en un matraz de fondo redondo seco equipado con un tubo de secado. Anhídrido metacrílico 5.16 g (33.5 mmol) , luego se agrega y la mezcla se agita a temperatura ambiente por 4 horas. El aceite espeso resultante se tritura tres veces con hexano y el aceite restante se disuelve en cloroformo, seguido por secado, sobre sulfato de sodio. Después de filtro y evaporación, una porción de producto se purifica por cromatografía instantánea de gel de sílice utilizando un sistema de solvente metanol al 10% en cloroformo. Las fracciones apropiadas se combinaron, 1 mg de fenotiazina se agrega, y el solvente se retira bajo presión reducida. Análisis en un espectrómetro de RMN fue consistente con el producto deseado: 1H NMR (CDC13) protón de ácido _ carboxílico 7.80-8.20 (b, 1H) , protón de amida 5.80-6.25 (b, 1H) , protones vinilo 5.20 y 5.50 (m, 2H) , metileno adyacente a nitrógeno 3.00-3.45 (m, 2H) , metileno adyacente a carbonilo 2.30 (t, 2H) , grupo metilo 1.95 (m, 3H) , y metilenos restantes 1.10-1.90 (m, 6H) . Ácido 6-Metacrilamidohexanoico, 3.03 g (15.2 mmol) , se disuelve en 30 mi de cloroformo seco, seguido por adición de 1.92 g (16.7 mmoles) de N-hidroxisuccinimida y 6.26 g (30.4 mmoles) de 1, 3-diciclohexilcarbodiimida. La reacción se agita bajo una atmósfera seca durante la noche a temperatura ambiente. El sólido luego se retira por filtración y una porción se purifica por cromatografía instantánea en gel de sílice. Impurezas no polares se retiraron utilizando un solvente de cloroformo, seguido por elusión del producto deseado utilizando un solvente de tetrahidrofurano al 10% en cloroformo. Las fracciones apropiadas se reunieron, 0.2 mg de fenotiazina se agrega y el solvente se evapora bajo presión reducida. Este producto contiene pequeñas cantidades de 1,3-diciclohexilurea como una impureza, se emplea sin mayor purificación. Análisis en un espectrómetro RMN fue consistente con el producto deseado: 1H RMN (CDCl3) protón de amida 5.60-6.10 (b, 1H) , protones de vinilo 5.20 y 5.50 (m, 2H) , metileno adyacente a nitrógeno 3.05-3.40 (m, 2H) , protones succinimidilo 2.80 (s, 4H) , metileno adyacente a carbonilo 2.55 (t, 2H) , metilo 1.90 (m, 3H) , y metilenos restantes 1.10-1.90 (m, 6H) . El compuesto final se almacena para uso en la síntesis de polímeros fotoactivables como se describe, por ejemplo en el Ejemplo 11.

Ejemplo 6 Preparación de 4-Bromometilbenzofenona (BMBP) (Compuesto VI) 4-Metilbenzofenona, 750 g (3.82 moles) , se agrega a un matraz Morton de 5 litros equipado con un agitador superior y disuelve en 2850 mi de benzeno. La solución se calienta al reflujo, seguido por adición por gotas de 610 g (3.82 moles) de bromo en 330 mi de benzeno. La velocidad de adición fue aproximadamente 1.5 ml/min y el matraz se iluminó con una lámpara de luz concentrada de halógeno de 90 watts (90 joule/sec) para iniciar la reacción. Se emplea un cronómetro o sincronizador con la lámpara para proporcionar un ciclo de servicio al 10% (5 segundos encendido) 40 segundos apagado (seguido en una hora por un ciclo de servicio al 20%) (encendido 10 segundos, apagado 40 segundos) . Al final de la adición, el producto se analizó por cromatografía y gas y se encontró que contiene 71% del compuesto deseado VI, 8% del producto dibromo y 20% de 4-metilbenzofenona sin reaccionar. Después de enfriar, la mezcla de reacción se lava con 10 g de bisulfito de sodio en 100 mi de agua, seguido por lavado con 3 x 200 mi de agua. El producto se seca sobre sulfato de sodio y recristaliza dos veces a partir de 1:3 tolueno : hexano. Después de secar al vacío, 635 g del compuesto VI se aislan, proporcionan un rendimiento de 60% y que tiene un punto de fusión de 112-114°C. Análisis en un espectrómetro RMN fue consistente con el producto deseado: H RMN (CDC13) protones aromáticos 7.20-7.80 (m, 9H) y protones bencílicos 4.48 (s, 2H) . El compuesto final se almacena para uso en la preparación de un agente de transferencia de cadena fotoactivable como se describe en el Ejemplo 7. Ejemplo 7 Preparación de N-2-Mercaptoetil-3.5- bis (4-benzoilbenziloxi) benzamida (Compuesto VII) Ácido 3 , 5-dihidroxibenzoico, 46.2 g (0.30 mol), se pesa en un matraz de aproximadamente 250 mi equipado con un extractor Soxhlet y condensador. Metanol, 48.6 mi, y ácido sulfúrico concentrado, 0.8 mi , se agregaron al matraz y 48 g de tamices moleculares 3A se colocan en el extractor Soxhlet. El extractor se llena con metanol y la mezcla se calienta al reflujo durante la noche. Análisis cromatográfico de gases del producto resultante mostró una conversión al 98% al metil éster deseado. El solvente se retiró bajo presión reducida para dar aproximadamente 59 g del producto crudo. El producto se emplea en la siguiente etapa sin mayor purificación. Una pequeña muestra se purificó previamente para análisis RMN, resultando en un espectro consistente con el producto deseado: 1H RMN (DMSO-d6) protones aromáticos 6.75 (d, 2H) y 6.38 5 (t, 1H) , y metil éster 3.75 (s, 3H) . Todo el producto metil éster anterior se colocó en un matraz de 2 litros con un agitador superior y condensador, seguido por la adición de 173.25 g (0.63 mol) del compuesto VI , preparado de acuerdo con el método general descrito en el Ejemplo 6, 6,207 g (1.50 mol) de carbonato de potasio, y 1200 mi de acetona. La mezcla resultante luego se refluja durante la noche para dar la reacción completa como se indica por cromatografía de capas delgada (TLC = Thin Layer Chromatography) . Los sólidos se retiraron por filtración y la acetona se evaporó bajo presión reducida para dar 49 g de producto crudo. Los sólidos se diluyeron con un litro de agua y extrajeron con 3 1 litro de cloroformo. Los extractos se combinaron con la fracción soluble en acetona y secaron sobre sulfato de sodio, dando 177 g de producto crudo. El producto se recristalizó a partir de acetonitrilo para dar 150.2 g de un sólido blanco, un rendimiento de 90% para estas dos primeras etapas. El punto de fusión del producto fue 131.5°C (DSC) y el análisis en un espectrómetro RMN fue consistente con el producto deseado: H RMN (CDC13) protones aromáticos 7.25-7.80 (m, 18H) , 7.15 (d. 2H) , y 6.70 (t, 1H) , protones benzilicos 5.05 (s, 4H) , y metil éster 3.85 (s, 3H) .

El metil 3 , 5-bis (4-benzoilbenziloxi) benzoato, 60.05 g (0.108 mol), se colocó en un matraz de 2 litros seguido por la adición de agua, 480 mi de metanol, y 6.48 g (0.162 mol) de hidróxido de sodio. La mezcla se calentó a reflujo por 3 horas para completar la hidrólisis del éster. Después de enfriar, el metanol se retiró bajo presión reducida y la sal de sodio del ácido se disolvió en 2400 mi de agua caliente. El ácido se precipitó utilizando ácido clorhídrico concentrado, filtró, lavó con agua y secó en un horno al vacío para dar 58.2 g de un sólido blanco (99% rendimiento) . Punto de fusión de producto fue 188.3 °C (DSC) y análisis en un espectrómetro RMN fue consistente con el producto deseado: H RMN (DMSO-d6) protones aromáticos 7.30-7.80 (m, 18H) , 7.15 (d, 2H) , y 6.90 (t, 1H) , y protones bencílicos 5.22 (s, 4H) . El ácido 3 , 5-bis (4-benzoilbenziloxi) benzoico, 20.0 g (36.86 mmol), se agrega a un matraz de 250 mi, seguido por 36 mi de tolueno, 5.4 mi (74.0 mmol) de cloruro de tionil, y 28 µl de N, -dimethílformamida . La mezcla se refluja por 4 horas para formar el cloruro de ácido. Después de enfriar, el solvente y exceso de cloruro de tionilo se retiran bajo presión reducida. Cloruro de tionilo residual se retira por 4 evaporaciones adicionales utilizando 20 mi de cloroformo cada una. El material crudo se recristaliza a partir de tolueno para dar 18.45 g de producto, un rendimiento de 89%. Punto de fusión en el producto fue 126.9°C (DSC) y análisis en un espectrómetro RMN fue consistente con el producto deseado: H RMN (CDC13) protones aromáticos 7.30-7.80 (m,18H), 7.25 (d, 2H) , y 6.85 (t, 1H) , y protones bencílicos 5.10 (s, 4H) . El hidrocloruro de 2 -aminoetantiol y 4.19 g (36.7 mmol) , se agrega a un matraz de 250 mi equipado con un agitador superior, seguido por 15 mi de cloroformo y 10.64 mi (76.5 mmoles) de trietilamina. Después de enfriar la solución de amina en un baño de hielo, una solución de cloruro de 3 , 5-bis (4-benzoilbenziloxi) benzoil, 18.4 g (32.8 mmol) , en 50 mi de cloroformo, se agrega por gotas sobre un período de 50 minutos. El enfriamiento en hielo se continua en 30 minutos, seguido por calentamiento a temperatura ambiente por 2 horas. El producto se diluye con 150 mi de cloroformo y lava con 5 x 250 mi de ácido clorhídrico 0.1 N. El producto se seca sobre el sulfato de sodio y recristaliza dos veces a partir de 15:1 tolueno : hexano para dar 13.3 g de producto, un rendimiento de 67%. El punto de fusión en el producto fue 115.9°C (DSC) y análisis en un espectrómetro de RMN fue consistente con el producto deseado: H RMN (DMS0-d6) protones aromáticos 7.20-7.80 (m, 18H) , 6.98 (d, 2H) , y 6.65 (t, 1H) , amida NH 6.55 (amplio t, 1H) , protones bencílicos 5.10 (s, 4H) , metileno adyacente a amida N 3.52 (q, 2H) , metileno adyacente a SH 2.10 (q, 2H) , y SH 1.38 (t, 1H) . El compuesto final se almacena para uso como un agente de transferencia de cadena en la síntesis de polímeros fotoactivables como se describe, por ejemplo en el Ejemplo 12. Ejemplo 8 Preparación de N-Succinimidil 11- (4-Benzoilbenzamido) undecanoato (BBA-AUD-NOS) (Compuesto VIII) El compuesto I (50 g, 0.204 mol), preparado de acuerdo con el método general descrito en el ejemplo 1, se disuelve en 2500 mi de cloroformo, seguido por la adición de una solución de 43.1 g (0.214 mol) de ácido 11-aminoundecanoico y 60.0 g (1.5 moles) de hidróxido de sodio en 1500 mi de agua. La mezcla se agita vigorosamente por una hora en un matraz Morton de 5 litros para asegurar completo mezclado de la dos capas. La mezcla se acidifica con 250 mi de ácido clorhídrico concentrado y agita a 30 minutos adicionales. La capa orgánica se separa y la acuosa se extrae con 3 x 500 mi de cloroformo. Los extractos orgánicos combinados se secan sobre el sulfato de sodio, filtran y evaporan para dar un sólido. El producto se recristaliza a partir de tolueno para dar 68.37 g (82 %) de ácido 11- (4- benzoilbenzamido) undecanoico con un punto de fusión de 107-109°C. Análisis en un espectrómetro RMN fue consistente con el producto deseado: H RMN (CDC13) protones aromáticos 7.20-7.80 (m, 9H) , "amida NH 6.30 (amplio t, 1H) , metileno adyacente a amida N 3.35 (m, 2H) , metileno adyacente a carbonilo 2.25 (t, 2H) , y metilenos restantes 1.00-1.80 (m, 16H) . El ácido 11- (4-benzoilbenzamido) undecanoico, 60.0 g (0.146 mol), se disuelve con calentamiento en 1200 mi de 1,4 -dioxano anhidro en un matraz de 2000 mi secado al horno. Después de enfriar a temperatura ambiente, 17.7 g (0.154 mol) de N-hidroxisuccinimida y 33.2 g (0.161 mol) de 1, 3-diciclohexilcarbodiimida se agregan a la solución y la mezcla se agita durante la noche bajo una atmósfera seca. Los sólidos luego se retiran por filtración, enjuagando la torta filtro con 1,4 -dioxano. El solvente luego se retira al vacío y el producto se recristaliza dos veces a partir de etanol. Después de completo secado en un horno al vacío, se obtienen 53.89 g (73 % rendimiento) de un sólido blanco con un punto de fusión de 97-99°C. Análisis en un espectrómetro RMN fue consistente con el producto deseado: XH RMN (CDC13) protones aromáticos 7.20-7.80 (m, 9H) , amida NH 6.25 (amplio t, 1H) , metileno adyacente a amida N 3.35 (m, 2H) , metilenos en anillo succinimidilo 2.75 (s, 4H) , metileno adyacente a carbonilo 2.55 (t, 2H) , y metilenos restantes 1.00-1.90 (m, 16H) . Ejemplo 9 Preparación de copolímero de acrilamida, BBA-APMA. v MAL-EAC-NOS (Foto PA-PoliNOS aleatorio) (Compuestos IX. A-C) Un copolímero fotoactivable de la presente invención se prepara en la siguiente forma. Acrilamida, 4.298 g (60.5 mmoles), se disuelve en 57.8 mi de tetrahidrofurano (THF), seguido por 0.219 g (0.63 mmoles) del compuesto III, preparado de acuerdo con el método general descrito en el Ejemplo 3, 3,0.483 g (1.57 mmoles) del compuesto IV, preparado de acuerdo con el método general descrito en el Ejemplo 4, 0.058 mi (0.39 mmol) de N,N,N' ,N' -tetrametiletilenediamina (TEMED), y 0.154 g (0.94 mmol) de 2 , 2 ' -azobisisobutironitrilo (A?BN) . La solución se desoxigena con burbujeo de helio por 3 minutos, seguido por burbujeo de argón por 32 minutos adicionales. El recipiente se sellado luego se calienta durante la noche a 60°C para completar la polimerización. El producto sólido se aisla por filtración y la torta filtro se enjuaga completamente con THF y CHC13. El producto se seca en un horno al vacío a 30°C, para dar 5.34 g de un sólido blanco. Análisis RMN (DMSO-d6) confirmó la presencia del grupo NOS a 2.75 ppm y la carga de fotogrupo se determina como 0.118 mmol BBA/g de polímero. , MAL-EAC-NOS constituye 2.5 % en mol de los monómeros polimerizables en esta reacción para dar el compuesto IX-A.

El procedimiento anterior se emplea para preparar un polímero que tiene 5% en mol de compuesto IV. Acrilamida, 3.849 g (54.1 mmoles), se disuelve en 52.9 mi de THF, seguido por 0.213 g (0.61 mmol) de compuesto VI, preparado de acuerdo con el método general descrito en el Ejemplo 3, 0.938 g (3.04 mmoles) del compuesto IV, preparado de acuerdo con el método general descrito en el Ejemplo 4, 0.053 mi (0.35 mmol) de TEMED y 0.142 g (0.86 mmol) de AIBN. El sólido resultante, compuesto IX-B, cuando se aisla como se describió anteriormente dio 4.935 g de producto con una carga de fotogrupo de 0.101 mmol BBA/g de polímero. El procedimiento anterior se emplea para preparar un polímero que tiene 10% en mol de compuesto IV. Acrilamida, 3.241 g (45.6 mmoles), se disuelve en 46.4 mi de THF, seguido por 0.179 g ( 0.51 mmol) de compuesto III, preparado de acuerdo con el método general descrito en el Ejemplo 3, 1.579 g (5.12 mmoles) del compuesto IV, preparado de acuerdo con el método general descrito en el Ejemplo 4, 4,0.047 mi (0.31 mmol) de TEMED y 0.126 g (0.77 mmol) de AIBN. El sólido resultante, compuesto IX-C, cuando se aisla como se describió anteriormente, dio 4.758 g de producto con una carga de fotogrupo de 0.098 mmol BBA/g de polímero. Ejemplo 10 Preparación de Copolímero de acrilamida, BBA-APMA, y cloruro de T3 - (Metacriloilamino) propill trimetilamonio (Foto PA-PolyQuat aleatorio) (Compuestos X. A-B) Un copolímero fotoactivable de la presente invención se prepara en la siguiente forma. Acrilamida, .681 g (0.150 mol), se disuelve en 150 mi de dimetilsulfóxido (DMSO), seguido por 0.592 g (1.69 mmol) del compuesto III, preparado de acuerdo con el método general descrito en el Ejemplo 3, 3.727 g (16.90 mmoles) de cloruro de [3- (metacriloilamino) propil] trimetilamonio (MAPTAC) , suministrado como 7.08 mi de una solución acuosa al 50%, 0.169 mi (1.12 mmoles) de TEMED y 0.333 g (2.03 mmoles) de AIBN. La solución se desoxigena con burbujeo de helio por 4 minutos, seguido con burbujeo de argón por 4 minutos adicionales. El recipiente sellado luego se calienta durante la noche a 55°C para completar la polimerización. La solución de DMSO se diluye con agua y dializa contra agua desionizada utilizando tubería de corte con peso molecular de 12,000 a 14,000. La liofilization de la solución resultante dio 14.21 g de un sólido blanco.

Análisis RMN (D20) confirma una presencia- de los grupos metilo en los grupos amonio cuaternarios a 3.10 ppm y la carga de fotogrupo se determina como 0.101 mmol de BBA/g de polímero. El compuesto III constituye 1% en mol % del monómero polimerizable en esta reacción para dar compuesto X-A. El procedimiento anterior se emplea para preparar un polímero que tiene 2% en mol del compuesto III. Acrilamida, 10.237 g (0.144 mol), se disuelve en 145 mi de DMSO, seguido por 1.148 g (3.277 mmoles) del compuesto III, preparado de acuerdo con el método general descrito en el Ejemplo 3, 3,3.807 g (17.24 mmoles) de MAPTAC, suministrado como 7.23 mi de una solución acuosa al 50%, 0.164 mi (1.09 mmoles) de TEMED y 0.322 g (1.96 mmoles) de AIBN. El procesamiento como se describió anteriormente dio 12.54 g de producto (Compuesto X-B) con una carga de fotogrupo de 0.176 mmol BBA/g de polímero. Ejemplo 11 Preparación de copolímero de acrilamida BBA-APMA, MA-EAC-NOS, y cloruro de r3-Metacriloilamino) propill trimetilamonio (Foto PA- PolvNOS- Polv Ouat aleatorio) (Compuesto XI) Un copolímero fotoactivable de la presente invención, se prepara en la siguiente forma. El agua en el MAPTAC acuosa al 50% comercialmente disponible se retiró por destilación azeotrópica con cloroformo. La solución de MAPTAC acuosa, 20 mi que contiene 10.88 g de MAPTAC, se diluye' con 20 mi de DMSO y 100 mi de cloroformo. Esta mezcla se refluja en un extractor líquido-líquido más pesado-y-agua que contiene sulfato de sodio anhidro para un total de 80 minutos. Se mantiene un flujo de aire lento durante el reflujo para inhibir polimerización del monómero. Al final del reflujo, el cloroformo en exceso se retira bajo presión reducida para dejar una solución de DMSO de MAPTAC a una concentración aproximada de 352 mg/ml. Acrilamida, 1.7 g (23.90 mmoles), se disuelve en 57.7 mi de dimetilsulfóxido (DMSO), seguido por 0.215 g (0.614 mmol) del Compuesto III, que se prepara de acuerdo con el método general descrito en el Ejemplo 3, 1.93 mi (0.677 g, 3.067 mmoles) de la solución anterior MAPTAC/DMSO, 0.91 g (3.068 mmoles) del Compuesto V, preparado de acuerdo con el método general descrito en el Ejemplo 5, y 0.060 g (0.365 mmoles) de AIBN. La solución se desoxigena con burbujeo de helio por 4 minutos, seguido por burbujeo de argón por 4 minutos adicionales. El recipiente sellado luego se calienta durante la noche a 55°C para completar la polimerización. El polímero se aisla al vaciar la mezcla de reacción en 600 mi de dietil éter. Los sólidos se separan por centrifugación y el producto se lava con 200 mi de dietil éter y 200 mi de cloroformo. Evaporación de solvente al vacío dio 3.278 g de producto con una fotocarga de 0.185 mmol BBA/g de polímero. Ejemplo 12 Copolímero de acrilamida y MAL-EAC-NOS utilizando N- (2 -Mercaptoetil) -3.5-bis (4-benzoilbenziloxi) benzamida (Difoto PA-PoliNOS de punto extremo) (Compuesto XII) Un copolímero fotoactivable de la presente invención se prepara en la siguiente forma. Acrilamida 3.16 g (44.5 mmoles), se disuelve en 45.0 mi de tetrahidrofurano, seguido por 0.164 g (1 mmol) de AIBN, 0.045 mi (0.30 mmol) de TEMED, 0.301 g (0.5 mmol) de Compuesto VII, preparado de acuerdo con el método general en el Ejemplo 7, y 1.539 g (5 mmoles) del compuesto IV, preparado de acuerdo con el método general descrito en el Ejemplo 4. La solución se desoxigena con burbujeo de helio por 4 minutos, seguido por burbujeo de argón por 4 minutos adicionales. Un recipiente sellado luego se calienta durante la noche a 55°C para completar la polimerización.

El polímero precipitado, se aisló por filtración y lavó con cloroformo. El producto final se seca en un horno al vacío para proporcionar 4.727 g de polímero que tiene una carga de fotogrupo de 0.011 mmol de BBA/g de polímero. Ejemplo 13 Copolímero de N- Í3- (Dimetilamino) pronill metacrilamida BBA-APMA (Foto PA-Poli Amina terciaria aleatoria) (Compuesto XIII) Un copolímero fotoactivable de la presente invención se prepara en la siguiente forma.

N- [3- (Dimetilamino) propil] metacrilamida, 33.93 g (0.2 mol), se disuelve en 273 mi de DMSO, seguido por 16.6 mi de HCl concentrado y 6.071 g (17.3 mmoles) de compuesto III, se prepara de acuerdo con el método general descrito en el Ejemplo 3. Finalmente, 0.29 mi (1.93 mmoles) de TEMED, 0.426 g (2.6 mmoles) de AIBN, y 100 mi de agua se agregan a la mezcla de reacción. La solución se desoxigena con burbujeo de helio por 10 minutos y el espacio superior luego se llena con argón. El recipiente sellado se calienta durante la noche a 55 °C para completar la polimerización. El producto luego se dializa contra agua desionizada por varios días utilizando tubería M CO de 12,000 a 14,000. El producto se filtra siguiendo diálisis para retirar cualquiera sólidos y se liofiliza para dar 47.27 g de un producto sólido. El polímero se determina que tiene una fotocarga de 0.33 mmol de BBA/g de polímero. Ejemplo 14 Comparación de foto PA-PolvNOS aleatorio (Compuesto IX-C) con Foto PA-PolyNOS-PolyOuat aleatorio (Compuesto XI) y placas de micropozos de Poliestireno (PS) . El compuesto IX-C y el compuesto XI se disolvieron separadamente en agua desionizada a 5 mg/ml.

Las placas de PS (PS, Médium Bind, Corning Costar, Cambridge, MA) que contienen 100 µl de compuesto IX y compuesto XI en pozos separados se iluminaron con una lámpara Dymax (modelo no. PC-2, Dymax Corporation, Torrington, CT) que contiene un tubo Heraeus (W.C. Heraeus GmbH, Hanau, República Federal de Alemania) . La duración de iluminación fue por 1.5 minutos a una intensidad de l-2mW/cm2 en el rango de longitud de onda de 330-340 nm. La solución de revestimiento luego se descarta y los pozos se secaron al aire por dos horas . Las placas luego se iluminaron por un minuto adicional . Las placas revestidas se emplearon inmediatamente para inmovilizar oligos almacenados en una bolsa sellada por hasta dos meses. La sonda de captura oligómero 50 base (-mero) 5 ' -NH2-GTCTGAGTCGGAGCCAGGGCGGCCGCCAACAGCAGCAGGAGCAGCGTGCACGG-3' (LD1) (sintetizado con un modificador 5 ' -amino que contiene un espaciador C-12) a 10 pmoles/pozo, se incuba en pozos PS en amortiguador fosfato 50 mM, pH 8.5 , 1 mM EDTA a 37°C por una hora. La hibridización se realiza como sigue utilizando la sonda de detección complementaria 5'-Biotina-CCGTGCACGCTGCTCCTGCTGTTGGCCGCCGCCCTGGCTCCGACTCAGAC-3' (ID 3) o el oligo no complementario 5 ' -Biotina-CGGTGGATGGAGCAGGAGGGGCCCGAGTATTGGGGAGCGGGAGACACAGAA-3 r (ID4) , ambos de los cuales se sintetizaron con una modificación 5 '-biotina. Las placas con sonda de captura inmovilizada se lavaron con salino amortiguado con fosfato (PBS, 10 mM Na2P04, 150 mM NaCl , pH 7.2) que contiene 0.05% Tween 20 utilizando un auto lavador de microplacas (modelo EL 403H, Bio-Tek Instruments, inooski, VT) . Las placas luego se bloquearon a 55°C por 30 minutos con amortiguador de hibridización, que consiste de 5X SCC (0.75 M NaCl, 0.075 M citrato, pH 7.0), 0.1% lauroílsarcosina, 1% caseína, y 0.02% de dodecil sulfato de sodio. Cuando la sonda de detección se hibridiza a la sonda de captura, 50 fmoles de sonda de detección en 100 µl se agregan por pozo e incuban por una hora a 55°C. Las placas luego se lavaron con 2X SSC que contiene dodecil sulfato de sodio al 0.1% por 5 minutos a 55°C. La sonda de detección ligada se ensaya al agregar 100 µl de un conjugado de estreptavidina y peroxidasa de rábano (SA-HRP, Pierce, Rockford, IL) a 0.5 µg/ml e incubar por 30 minutos a 37°C. Las placas luego se lavan con PBS/Tween, seguido por la adición de substrato peroxidasa (H202 y tetrametilbenzidina, Kirkegard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) y miden a 655 nm en un lector de placas de micropozos (modelo 3550, Bio-Rad Labs, Cambridge, MA) . Las placas se leyeron a 10 minutos. Los resultados enlistados en la Tabla 1 indican que las placas de micropozos revestidas con el compuesto IX-C no inmobilizan efectivamente sondas de captura amina. Sin embargo, por comparación 'el compuesto XI, como un revestimiento, proporciona señales de hibridización buenas y unión significante. El reactivo de compuesto IX-C más probablemente pasiva las superficies y evita la asociación de oligos de captura. En contraste, cuando el compuesto XI se emplea, el oligo se atrae a la superficie por interacciones iónicas en donde pudiera ligarse covalentemente con los grupos NOS. Tabla 1: Señales de hibridización (A655) de placas de micropozos PS revestidas con compuesto IX-C y compuesto XI.

Ejemplo 15 Revestimiento de diversas placas de micropozos con una mezcla de Foto PA-PoliNOS aleatoria (Compuesto IX-B) y Foto PA-PolvOuat aleatorio (Compuesto X-B) Una solución de revestimiento que contiene una mezcla de 5 mg/ml de Compuesto IX-B y 0.5 mg/ml de Compuesto X-B se prepara en agua desionizada. Esta mezcla se emplea para tratar multipozos de polipropileno (PP, Corning Costar, Cambridge, MA) , PS, policarbonato (PC, Corning Costar, Cambridge, MA) y cloruro de polivinilo (PVC, Dynatech, Chantilly, VA) como se describe en el Ejemplo 14. Un oligo de captura 30-mero, 5 ' -NH2-GTCTGAGTCGGAGCCAGGGCGGCCGCCAAC-31 (ID2), (sintetizado con un modificador 5 ' -amino que contiene un espaciador C-12) a 0.03,0.1, 0.3, 1,3, o 10 pmoles/pozo se incubó a 4°C durante la noche. La hibridización se realiza como se describió previamente en el Ejemplo 14 utilizando oligo de detección ID3 complementario u oligo ID4 no complementario. Ya que las placas PP no son ópticamente transparentes, los contenidos de cada pozo se transfirieron a pozos PS después de una incubación de 20 minutos con el substrato cromogénico. Las señales de hibridización se midieron en las placas PS . Las otras placas se leyeron sin transferir a 10 minutos. Niveles de señal solo son comparables dentro del mismo grupo de substrato debido a las diferentes geometrías de placas de micropozos realizadas a partir de diferentes materiales. La Tabla 2 enlista las señales de hibridización y muestra la relación entre la intensidad de las señales de hibridización y la cantidad de sonda de captura aplica a diversas placas de micropozos revestidas con una mezcla de compuesto IX-B y compuesto X-B. En placas PP y PVC, la adsorción de sondas fue muy baja y los revestimientos con los reactivos poliméricos mejoraron las señales dramáticamente. La señal se incrementó al incrementar la sonda de captura agregada a los pozos revestidos, pero se niveló a aproximadamente 3 p-moles/pozo de captura. La meseta en la cantidad de señal generada no se debió a un nivel de saturación de hibridización, sino más bien a los límites de la reacción de cambio de color en el ensayo colorimétrico. Derivados oligo adsorben eficientemente sobre placas de micropozos PS y PC y resultan en señales de hibridización específicas. Cros y colaboradores. (U.S. Patent No. 5,510,084) también reportó que oligos funcionalizados de amina adsorben satisfactoriamente sobre placas de micro pozos de poliestireno por mecanismos desconocidos. Sin embargo, hay una marcada variabilidad de la cantidad de adsorción en placas de PS sin revestir entre diferentes lotes (Chevier y colaboradores, FEMS 10:245, 1995) .

Tabla 2 : Señales de hibridización (A6S5) de diversos materiales de placa de micropozos revestidos con una mezcla de compuesto IX-B y compuesto X-B. Oligo de captura agregado (pmoles/pozo) 0.03 0.1 0.3 Comp NC Comp NC Comp NC Comp NC PP sin revestir 0.083 0.082 0.076 0.072 0.076 0.074 0.088 0.074 revestidoO .541 0.099 1.070 0.099 1.769 0.091 2.283 0.094 PVC sin revestir 0.074 0.079 0.081 0.075 0.097 0.078 0.137 0.076 revestidoO.423 0.116 0.875 0.110 1.326 0.112 1.583 0.142 PS sin revestir 0.235 0.099 0.435 0.091 0.827 0.090 1.205 0.093 RevestidoO .435 0.121 0.801 0.105 1.177 0.116 1.401 0.132 PC Sin revestir 0.676 0.248 1.364 0.244 2.103 0.256 2.701 0.266 Revestidol.034 0.327 1.602 0.306 2.136 0.295 2.218 0.287 Oligo de captura agregado (pmoles/pozo) 3 10 Comp NC Comp NC PP PP Sin revestir 0.070 0.067 0.078 0.073 Revestido 2.582 0.141 2.490 0.320 PVC Sin revestir 0.215 0.081 0.337 0.092 Revestido 1.628 0.186 1.604 0.332 PS Sin revestir 1.380 0.093 1.404 0.136 Revestido 1.470 0.132 1.487 0.302 PC Sin revestir 2.745 0.295 2.930 0.388 Revestido 2.380 0.342 2.500 0.572 Comp. : Sonda de detección complementaria se agrega para hibridización . NC: Sonda de detección no complementaria se agrega para hibridización . Ejemplo 16 Evaluación de Difoto PA-poliNOS punto extremo (compuesto XII) y Foto PA-PolyOuat aleatorio (Compuesto X-B) en placas de microprozos de PP y PVC.

Una solución de revestimiento que contiene una mezcla de 5 mg/ml del compuesto XII y 0.5 mg/ml del compuesto X-B, se prepara con agua desionizada. Esta mezcla de dos reactivos se emplea para revestir placas de micropozos PP y PVC bajo condiciones comparables con aquellas descritas en el ejemplo 14. El oligo de captura ID 2 30 -mero a 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, o 10 pmoles/pozo en 0.1 mi se incuba a 4°C durante la noche. La hibridización se realiza como se describe en Ejemplo 14 utilizando oligo de detección ID3 complementario u oligo ID4 no complementario. Las señales de hibridización enlistadas en la Tabla 3 demuestran la relación entre la intensidad de las señales de hibridización y la cantidad de sonda de captura aplicada a placas de micropozos PP y PVC revestidas con una mezcla de compuesto XII y compuesto X-B. La señal se aumenta con oligos de captura incrementados que se agregan a los pozos revestidos, pero se nivela a aproximadamente 1 pmol/pozo. La relación de señal-a-interferencia de sondas de detección complementarias contra no complementarias) fue tan alta como 26 y 11 para superficies de PP y PVC, respectivamente. Tabla 3 : Señales de hibridización (A655) de placas PP y PVC revestidas con una mezcla de compuesto XII y Compuesto X-B. pmoles/pozo Placas de micropozos PP Placas micropozos de captura PVC agregada Comp. No-comp . Comp . No-comp Detección Detección 0.03 0.153±0.008 0.070+0.007 0.289±0.0290.094±0.020 0.1 0.537+0.042 0.075+0.009 0.759+0.054 0.104±0.014 0.3 1.206±0.106 0.080±0.003 1.262+0.023 0.117±0.011 1 2.157±0.142 0.081±0.003. 1.520±0.044 0.189±0.064 3 2.624±0.162 0.108+0.012 1.571±0.031 0.179+0.016 2.921+0.026 0.200±0.018 1.625±0.0400.286+0.021 Ejemplo 17 Revestimiento secuencial con Foto PA-PolyOuat aleatorio (Compuesto X-B) y BBA-AUD-NOS (Compuesto VIII) ~~ Compuesto X-B a 0.1 mg/ml en agua desionizada, se incuba en pozos de PP y PVC por 20 minutos. Las placas se iluminaron como se describió previamente en el Ejemplo 14, con la solución en los pozos por 1.5 minutos. La solución se descartó y los pozos se secaron. El compuesto VIII a 0.5 mg/ml en alcohol isopropílico (IPA) se incubó en los pozos revestidos con el compuesto X-B por 5 minutos. La solución luego se retiró, la placa secó e iluminó como se describe en el Ejemplo 14 por un minuto después de que los pozos se secaron. El oligo de captura ID 2 30 -mero a 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, o 10 pmoles/pozo en 0.1 mi se incuba a 4°C durante la noche. La hibridización se realizó como se describe en el Ejemplo 14, utilizando oligo de detección ID 3 complementario u oligo ID 4 no complementario, La Tabla 4 contiene las señales de hibridización y muestra la relación entre la intensidad de las señales de hibridización y la cantidad de la sonda de captura aplicada a placas de micropozos PP y PVC revestidas con el compuesto X-B seguido por el compuesto VIII. La señal se incrementa con aumento en la sonda de captura agregada a los pozos revestidos, pero se nivela aproximadamente un p-mol/pozo de oligo de captura. Las señales fueron hasta 29 y 11 superiores para superficies PP y PVC respectivamente en comparación con los controles no revestidos. Tabla 4: Señales de Hibridización (A65S) de placas de micropozos PP y PVC revestidas con compuesto X-B seguido por revestimiento de compuesto VIII.

Ejemplo 18 Comparación de Foto PA-PolyOuat aleatorio (Compuesto X-A) con una mezcla de Foto PA-PolyNOS aleatoria (Compuesto IX-A) y Foto PA-PolyOuat aleatoria (Compuesto X-A) El compuesto X-A a 0.5 o 0.1 mg/ml se incuba en placas de micropozos de PP por 10 minutos. Las placas luego se iluminaron como se describe en el Ejemplo 14. Una solución de revestimiento que contiene una mezcla de compuesto IX-A y compuesto X-A, se prepara en dos proporciones, 5/0.5 mg/ml y 0.5/0.1 mg/ml de compuesto IX-A/Compuesto X-A en agua desionizada para revestir placas de micropozos PP . La solución se incuba en los pozos por 10 minutos y los pozos se iluminaron como se describe en el Ejemplo 14. El oligo de captura ID 2 30-mero a 1 pmol/pozo se incuba en cada pozo a 37°C por una hora. La hibridización se efectuó como se describe en el Ejemplo 14 utilizando oligo de detección ID 3 complementario u oligo ID 4 no complementario. Los resultados enlistados en la Tabla 5 indican que el revestimiento que contiene la combinación del compuesto IX-A y compuesto X-A dio superiores señales en comparación con aquellas del revestimiento del compuesto X-A solo. Tabla 5: Señales de hibridización (A65S) de placas de micropozos PP revestidos con compuesto X-A.

Ejemplo 19 Comparación de oligo No modificado vs . oligo modificado con amida en Foto PA-PolyNOS aleatorio (Compuesto IX-B) y Foto PA-PolvOuat aleatorio (compuesto X-B) en placas de micropozos revestidos Una solución de revestimiento que contiene una mezcla de compuesto IX-B (5 mg/ml) y compuesto X-B (0.5 mg/ml) se prepara en agua desionizada para revestir placas de micro pozos PP, PS y PVC. La solución se incuba por aproximadamente 10 minutos e ilumina como se describe en el Ejemplo 14. El oligo de captura 30-mero 5 ' -NH2-TTCTGTGTCTCC CGCTCCCAATACTCGGGC-3 ' (ID 5) a 1 pmol/pozo se acopla a los pozos en amortiguador de fosfato 50 mM, pH 8.5, 1 mM EDTA a 4°C durante la noche. La hibridización se realiza como se describe en el Ejemplo 14 utilizando oligo ID 4 de detección complementario u oligo ID 3 no complementario. Para determinar el efecto de la funcionalidad amina del oligo de captura, una sonda de captura 30-mero no modificada 5 ' -TTCTGTGTCTCC CGCTCCCAATACTCGGGC-3 ' (ID 6) (sin amina) también se agrega a las superficies revestidas y pruebas. Los resultados mostrados en la Tabla 6 indican que cuando un oligo si la modificación 5 '-amina se emplea como la sonda de captura en superficies revestidas con compuesto IX-B/Compuesto X-B, la señal de hibridización fue menor que 30% de la modificación con modificación amina. Tabla 6: Señales (A6SS) generadas a partir de reacciones de hibridización con cualquiera de oligos ID 5 o ID 6 en placas de micropozos revestidas por el compuesto IX-B/Compuesto X-B. Sin Captura Agregada Captura sin modificar Detección Detección Detección Detección comp. no comp com . no comp .

PP Sin revestir 0.032±0.001 0.036±0.004 0.033±0.001 0.036±0.001 Revestido 0.038±0.002 0.040±0.001 0.555±0.041 0.044±0.001 PVC Sin revestir 0.248±0.049 0.176±0.008 0.259±0.049 0.128±0.013 RevestidoO.115±0.027 0.090±0.014 0.379±0.028 0.091±0.014 PS Sin revestir 0.084±0.013 0.089±0.014 0.668±0.047 0.085±0.023 RevestidoO .080±0.006 0.081±0.023 0.364±0.010 0.089±0.015 Captura de amina modificada Detección Detección comp . no comp . PP Sin revestir 0.037±0.005 0.033±0.001 Revestido 1.915±0.029 0.066±0.003 PVC Sin revestir 0.404±0.100 0.118±0.025 Revestido 1.319±0.027 0.101±0.017 PS Sin revestir 1.269±0.034 0.106±0.024 Revestido 1.437±0.012 0.098±0.005 Ejemplo 20 Densidades de carga oliaro en placas de micropozos revestidas con Foto PA-PolyNOS aleatorio (Compuesto IX-A) y Foto PA-PolyOuat aleatorio (Compuesto X-A) Ensayos radioetiquetados se realizaron para determinar densidades de carga oligo y para verificar resultados del sistema de ensayo colorimétrico. En este ejemplo, revestimientos de combinación del compuesto IX-A y Compuesto X-A, se realizaron en pozos PVC como se describe en el Ejemplo 14. Los oligos de captura 30 -mero ID 2 e ID 5, se inmobilizaron en pozos revestidos. Una sonda ID 2 radioetiquetada se emplea para determinar la densidad de carga de oligos de captura inmobilizados en la superficie del pozo. Una sonda de detección ID 3 radioetiquetada que se polimerizó a ID 2 , pero no ID 5 se empleó para medir reacciones de hibridización de las sondas de captura inmobilizada. Los oligos ID 2 e ID 3 se radioetiquetaron en el extremo 3 ' utilizando transferasa terminal (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) y c¿-32P-ddATP (3000 Ci/mmol, Amersham, Arlington Heights, IL) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Sondas ID 2 etiquetada 32P e ID 2 sin etiquetar y de captura ID 5 se incubaron en pozos revestidos a 50 pmoles/pozo por 2.25 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y bloquearon como se describe en el Ejemplo 14. Los pozos con las sondas de captura no etiquetadas se hibridizaron con la sonda de detección ID 3 etiquetada 32P en amortiguador de hibridización por 1 hora a 55°C. Pozos que contienen la sonda de captura etiquetada 32P se incubaron en amortiguador de hibridización sin la sonda ID 3. Después de lavar tres veces con 2X SSC que contiene SDS al 0.1% por 5 minutos a 55°C y tres veces con PBS/0.05% Tween, las placas se cortaron en pozos individuales y disolvieron en tetrahidrofurano. La cantidad de radioactividad en cada pozo se mide por conteo de destelleo en Aquasol-2 Fluor (DuPont NEN, Boston, MA) .

Los resultados en la Tabla 7 muestran que se requirió que tanto el compuesto IX-A como compuesto X-A, dieran buena inmobilización de la sonda de captura. También incrementar las concentraciones del compuesto IX-A y compuesto X-A incrementa la cantidad del oligo de captura inmobilizado. A las más altas concentraciones probadas, la relación de señal a interferencia fue mayor que 3000 a 1. Tabla 7: Densidades de oligo de captura inmobilizado y oligo de detección 32P hibridizado.

Ejemplo 21 Comparación entre Foto-PA-amina politerciaria aleatoria (Compuesto XIII) , Foto-PA-PolyNOS aleatoria (Compuesto IX-A) y una mezcla de Foto PA-PolyNOS aleatoria (Compuesto IX-A) y Foto-PA-amina polterciaria aleatoria (Compuesto XIII) El compuesto XIII a 0.02 mg/ml en agua desionizada se incuba en placas de micropozos PP por 10 minutos. Los pozos se iluminaron como se describe en el Ejemplo 14. El compuesto IX-A se reviste en pozos PP a 2 mg/ml en agua desionizada como se describe para el compuesto XIII. Una solución de revestimiento que contiene una mezcla de 2 mg/ml del compuesto IX-A y 0.02 mg/ml del Compuesto XIII en agua desionizada se prepara y reviste como se describe para el compuesto XIII. EL oligo de captura ID 2 30-mero a 5 pmoles/pozo se incuba en cada pozo a 37°C por una hora. La hibridización se realiza como se describe en el Ejemplo 14 utilizando oligo de detección ID 3 complementario y oligo ID 4 no complementario. Los contenidos de cada pozo se transfirieron a pozos PS después de una incubación de 10 minutos con el substrato peroxidasa. Los resultados enlistados en la Tabla 8 indican que la combinación de compuesto IX-A y compuesto XIII dio superiores señales en comparación con aquellos del revestimiento de compuesto IX-A o compuesto XIII solo.

Tabla 8: Señales de hibridización (A655) de placas de micro pozos PP revestidas .

Ejemplo 22 Inmobilización de secuencia de ácido nucleico en una superficie derivatizada de amina. Un copolímero de la presente invención se prepara de la siguiente forma. Acrilamida, 5.686 g (80.0 mmoles), se disuelve en 100 mi de DMSO, seguido por la adición de 3.083 g (10.0 mmoles) del Compuesto IV, preparado de acuerdo con el método general descrito en el Ejemplo 4, y 2.207 g (10.0 mmoles) de MAPTAC, suministrado como una solución DMSO seca preparada de acuerdo con el- método general descrito en el Ejemplo 11. TEMED, 0.134 mi (0.89 mmol), y AIBN, 0.197 g (1.20 mmoles), se agregan a la mezcla y el sistema se desoxigena con burbujeo de helio por 5 minutos, seguido por burbujeo de argón por 5 minutos adicionales. El recipiente sellado se calienta a 55°C para completar la polimerización. El polímero se aisla al vaciar la mezcla de reacción en 800 mi de dietil éter y centrifugar para separar los sólidos. El producto se lava con 200 mi de dietil éter, seguido por 200 mi de cloroformo. El polímero se seca al vacío para retirar solvente restante. Una superficie de polímero se derivatiza por tratamiento con plasma utilizando una mezcla de 3:1 de gases metano y amoníaco. (Ver por ejemplo, el método general descrito en la patente de los E.U.A. No. ,643,580) . Una mezcla de metano (490 SCCM) y amoníaco (161 SCCM) se introduce a la cámara de plasma junto con la parte del polímero a revestir. Los gases se mantienen a una presión de 0.2-0.3 torr y una descarga de brillo de 300 a 500 watts, se establece dentro de la cámara. la muestra se trata por un total de 3 a 5 minutos bajo estas condiciones. La formación de una superficie derivatizada de amina se verifica por una reducción en el ángulo de contacto de agua, en comparación con la superficie sin revestir. La superficie derivatizada de amina se incuba por 10 minutos a temperatura ambiente con una solución 10 mg/ml del polímero anterior en un amortiguador fosfato 50 mM, pH 8.5. Siguiendo este tiempo de reacción, la solución de revestimiento se retira y la superficie se lava completamente con agua desionizada y seca completamente. La inmobilización de la sonda de captura oligómero y de hibridización se realiza como se describe en el Ejemplo 14. Tabla 9 : Compuestos COMPUESTO I COMPUESTO II COMPUESTO III COMPUESTO IV COMPUESTO V COMPUESTO VI COMPUESTO VII COMPUESTO VIII COMPUESTO IX COMPUESTO X COMPUESTO XI COMPUESTO XII COMPUESTO XIII

Claims (60)

1. REIVINDICACIONES 1.- Una composición de reactivo para conectar una molécula objetivo con la superficie de un substrato, la composición de reactivo se caracteriza porque comprende uno o más grupos para atraer la molécula objetivo al reactivo, y uno o más grupos reactivos termoquímicamente, para formar enlaces covalentes con grupos funcionales correspondientes en la molécula objetivo atraída.
2. 2. - Una composición de reactivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición de reactivo además comprende uno o más grupos fotorreactivos para conectar la composición de reactivo a la superficie ante aplicación de energía desde una fuente conveniente .
3. 3. - Una composición de reactivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los grupos atrayentes y los grupos termoquímicamente reactivos son secundarios sobre una o más estructuras principales poliméricas hidrofílicas.
4. 4.- Una composición de reactivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de reactivo es un ácido nucleico.
5. 5.- Una composición de reactivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los grupos atrayentes son grupos iónicos.
6. 6.- Una composición de reactivo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque los grupos iónicos se eligen del grupo que consiste de un grupo de amonio cuaternario y aminas terciarias protonadas.
7. 7. - Una composición de reactivo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el ácido nucleico comprende un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste de grupos amina y sulfhidrilo.
8. 8. - Una composición de reactivo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la composición de reactivo comprende una estructura principal polimérica hidrofílica que comprende uno o más grupos iónicos como grupos atrayentes y uno o más grupos fotorreactivos para conectar la composición del reactivo a la superficie ante aplicación de energía desde una fuente conveniente .
9. 9.- Una composición de reactivo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque los grupos iónicos comprenden grupos de amonio cuaternario.
10. 10.- Una composición de reactivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque los grupos fotorreactivos se eligen del grupo que consiste de aril cetonas fotorreactivas .
11. 11.- Una composición de reactivo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque las aril cetonas fotorreactivas cada una independientemente se elige del grupo que consiste de acetofenona, benzofenona, antraquinona, antrona, y heterociclos tipo antrona.
12. 12.- Una composición de reactivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la molécula objetivo es un ácido nucleico, los grupos atrayentes son grupos iónicos y los grupos fotorreactivos se eligen del grupo que consiste de aril cetonas fotorreactivas .
13. 13. - Una composición de reactivo de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque cada una independientemente de las aril cetonas fotorreactivas se elige del grupo de aceto fenona, benzofenona, antraquinona, antrona, y heterociclos tipo antrona.
14. 14.- Una composición de reactivo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la composición de reactivo se proporciona en la forma de una composición que comprende un primer componente reactivo que consiste de una estructura principal polimérica hidrofílica que comprende uno o más grupos atrayentes y uno o más grupos fotorreactivos y un segundo componente reactivo que comprende una estructura principal hidrofílica que comprende uno o más grupos reactivos termoquímicamente y uno o más grupos fotorreactivos.
15. 15.- Una composición de reactivo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la molécula objetivo es un ácido nucleico.
16. 16.- Una composición de reactivo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque los grupos atrayentes son grupos iónicos .
17. 17.- Una composición de reactivo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque los grupos iónicos se eligen del grupo que consiste de grupos de amonio cuaternario y aminas terciarias protonadas .
18. 18. - Una composición de reactivo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el ácido nucleico comprende un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste de grupos amina y sulfhidrilo.
19. 19.- Una composición de reactivo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque los grupos fotorreactivos se eligen del grupo que consiste _de aril cetonas fotorreactivas.
20. 20.- Una composición de reactivo de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque las aril cetonas fotorreactivas cada una independientemente se eligen del grupo que consiste de aceto fenona, benzofenona, antraquinona, antrona, y heterociclos tipo antrona.
21. 21.- Un método para conectar una molécula objetivo a la superficie de un substrato, el método se caracteriza porque comprende las etapas de: (a) proporcionar sobre la superficie de substrato, una composición de reactivo que comprende uno o más grupos para atraer la molécula objetivo a la composición de reactivo, y uno o más grupos reactivos termoquímicamente para formar enlaces covalentes con grupos funcionales correspondientes en la molécula objetivo atraída, (b) llevar la molécula objetivo en proximidad suficiente con la superficie para permitir que los grupos atrayentes atraigan la molécula objetivo a la composición de reactivo ligada y (c) permitir que los grupos termoquímicamente reactivos formen enlaces covalentes con la molécula objetivo atraída.
22. 22.- Método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la composición del reactivo además comprende uno o más grupos fotorreactivos para conectar la composición de reactivo con la superficie ante aplicación de energía desde una fuente conveniente .
23. 23.- Método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque los grupos atrayentes y grupos termoquímicamente reactivos son secundarios sobre una o más estructuras principales poliméricas hidrofílicas.
24. 24.- Método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la molécula objetivo es un ácido nucleico .
25. 25.- Método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque los grupos atrayentes son grupos iónicos.
26. 26.- Método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque los grupos iónicos se eligen del grupo que consiste de grupos de amonio cuaternario y aminas terciarias protonadas. "
27. 27.- Método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el ácido nucleico comprende un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste de grupos amina y sulfhidrilo.
28. 28.- Método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la composición de reactivo comprende una estructura principal polimérica hidrofílica que comprende uno o más grupos iónicos como grupos atrayentes y uno o más grupos fotorreactivos para conectar la composición de reactivo con la superficie ante aplicación de energía desde una fuente conveniente.
29. 29.- Método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque los grupos iónicos comprenden grupos de amonio cuaternario .
30. 30.- Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque los grupos fotorreactivos se eligen del grupo que consiste de aril cetonas fotorreactivas .
31. 31.- Método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque las aril cetonas fotorreactivas cada una independientemente se elige del grupo que consiste de aceto fenona, benzofenona, antraquinona, - antrona, y heterociclos tipo antrona.
32. 32. - Método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la molécula objetivo es un ácido nucleico y los grupos fotorreactivos se eligen del grupo que consiste de aril cetonas fotorreactivas.
33. 33.- Método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque cada una de las aril cetonas fotorreactivas se elige independientemente del grupo de aceto fenona, benzofenona, antraquinona, antrona, y heterociclos tipo antrona.
34. 34. - Método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la composición de reactivo se proporciona en la forma de una composición que comprende un primer componente reactivo que consiste de una estructura principal polimérica hidrofílica que comprende uno o más grupos atrayentes y uno o más grupos fotorreactivos y un segundo componente reactivo que comprende una estructura principal hidrofílica que comprende uno o más grupos reactivos termoquímicamente y uno o más grupos fotorreactivos .
35. 35.- Método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la molécula objetivo es un ácido nucleico .
36. 36.- Método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque los grupos atrayentes son grupos iónicos .
37. 37.- Método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque los grupos iónicos se eligen del grupo que consiste de grupos de amonio cuaternario y aminas terciarias protonadas .
38. 38.- Método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el ácido nucleico comprende un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste de grupos amina y sulfhidrilo.
39. 39.- Método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque los grupos fotorreactivos se eligen del grupo que consiste de aril cetonas fotorreactivas .
40. 40.- Método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque cada una de las aril cetonas fotorreactivas independientemente se elige del grupo que consiste de aceto fenona, benzofenona, antraquinona, antrona, y heterociclos tipo antrona.
41. 41.- Una superficie de substrato revestida con una molécula objetivo y una composición de reactivo por el método de la reivindicación 21.
42. 42. - Una superficie de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque la composición del reactivo además comprende uno o más grupos fotorreactivos para conectar la composición del reactivo a la superficie ante aplicación de energía de una fuente conveniente.
43. 43. - Una superficie de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque la molécula objetivo es un ácido nucleico.
44. 44. - Una superficie de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque los grupos atrayentes son grupos iónicos seleccionados del grupo que consiste de grupos de amonio cuaternario y aminas terciarias protonadas .
45. 45.- Una superficie de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque el ácido nucleico comprende un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste de grupos amina y sulfhidrilo.
46. 46.- Una superficie de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque los grupos fotorreactivos se eligen del grupo que consiste de aril cetonas fotorreactivas.
47. 47.- Una superficie de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque cada una_ de las aril cetonas fotorreactivas independientemente se elige del grupo que consiste de aceto fenona, benzofenona, antraquinona, antrona, y heterociclos tipo antrona.
48. 48.- Una superficie de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque la composición de reactivo se proporciona en la forma de una composición que comprende un primer componente reactivo que consiste de una estructura principal hidrofílica que comprende uno o más grupos atrayentes y uno o más grupos fotorreactivos y un segundo componente reactivo que comprende una estructura principal hidrofílica que comprende uno o más grupos reactivos termoquímicamente y uno o más grupos fotorreactivos .
49. 49.- Una superficie de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque los grupos fotorreactivos se eligen del grupo que consiste de aril cetonas fotorreactivas.
50. 50.- Una superficie de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque cada una de las aril cetonas fotorreactivas independientemente se elige del grupo que consiste de aceto fenona, benzofenona, antraquinona, antrona, y heterociclos tipo antrona.
51. 51.- Una superficie que comprende una composición de reactivo revestida de la reivindicación 1.
52. 52.- Una superficie de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque la composición de reactivo además comprende uno o más grupos fotorreactivos para conectar la composición del reactivo a la superficie ante aplicación de energía desde una fuente conveniente.
53. 53. - Una superficie de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada porque la molécula objetivo es un ácido nucleico.
54. 54. - Una superficie de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque los grupos atrayentes son grupos iónicos seleccionados del grupo que consiste de grupos de amonio cuaternario y aminas terciarias protonadas .
55. 55. - Una superficie de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el ácido nucleico comprende un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste de grupos amina y sulfhidrilo.
56. 56.- Una superficie de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque los grupos fotorreactivos se eligen del grupo que consiste de aril cetonas fotorreactivas .
57. 57.- Una superficie de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porque cada una de las aril cetonas fotorreactivas independientemente se elige del grupo que consiste de aceto fenona, benzofenona, antraquinona, antrona, y heterociclos tipo antrona.
58. 58.- Una superficie de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada porque la composición de reactivo se proporciona en la forma de una composición que comprende un primer componente reactivo que consiste de una estructura principal hídrofílica que comprende uno o más grupos atrayentes y uno o más grupos fotorreactivos y un segundo componente reactivo que comprende una estructura principal hidrofílica que comprende uno o más grupos reactivos termoquímicamente y uno o más grupos fotorreactivos .
59. 59.- Una superficie de conformidad con la reivindicación 58, caracterizada porque los grupos fotorreactivos se eligen del grupo que consiste de aril cetonas fotorreactivas.
60. 60.- Una superficie de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque cada una de las aril cetonas fotorreactivas independientemente se elige del grupo que consiste de aceto fenona, ~ benzofenona, antraquinona, antrona, y heterociclos tipo antrona.