JPH1019893A

JPH1019893A - 免疫測定試薬及び免疫測定法

Info

Publication number: JPH1019893A
Application number: JP8179161A
Authority: JP
Inventors: Motohito Tamaki; 元人玉木; Yoshie Matsumoto; 美枝松本
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1996-07-09
Filing date: 1996-07-09
Publication date: 1998-01-23
Anticipated expiration: 2016-07-09
Also published as: JP3618909B2

Abstract

(57)【要約】【課題】抗原抗体反応により検体中の特定の抗原物質を
測定する試薬及び方法において、不溶性担体の立体障害
による凝集阻害がなく、多量の抗体を用いることができ
る、高感度の免疫測定試薬及び免疫測定法を提供する。【解決手段】特定の抗原物質に対する異なる２種以上の
モノクローナル抗体と水不溶性担体からなり、上記モノ
クローナル抗体の一部が水不溶性担体に担持された免疫
測定試薬。水不溶性担体に担持されないモノクローナル
抗体は、例えば水可溶性担体に担持されるか、多量体と
される。また上記試薬と抗原物質との凝集の度合いによ
り抗原物質を測定する免疫測定法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗原抗体反応による凝
集反応によって抗原物質を測定する免疫測定法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】近年、病院や検査センター等において
は、人手不足、コスト削減、あるいは多量検体処理の要
請等の点から、臨床検査などの諸検査の自動化及び測定
時間の短縮化が図られている。このような自動化に適し
た方法として、不溶性担体粒子の凝集反応を利用して抗
原性物質を定性ないし定量する方法が汎用されている
（例えば、特公昭５８−１１５７５号公報等）。上記の
凝集法とは、被検試料中の抗原性物質を測定する場合、
抗原性物質に特異的に結合する抗体もしくはそのフラグ
メントを担持させた不溶性担体と試料とを反応させ、不
溶性担体の凝集の度合いを測定することにより、前記抗
原性物質を検出または定量するものである。

【０００３】上記抗体としては通常ポリクローナル抗体
又はモノクローナル抗体が選択される。しかしながら、
ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を比較する
と、抗原に対する特異性はモノクローナル抗体の方がだ
んぜん優れている。またポリクローナル抗体は動物の固
体差や採血の時期により同じ品質のものを常に得ること
は難しく、特異抗体に精製する段階での抗体自信の損失
や活性の低下が大きいのに対し、モノクローナル抗体は
その点では品質の一定した抗体の大量生産に向いてい
る。一方モノクローナル抗体は、抗原分子上の特定のエ
ピトープのみと反応するため、抗原性物質が多価抗原で
ある場合でも、特定のエピトープに関しては多価である
とは限らない。従って、抗原は、特定のモノクローナル
抗体に対するエピトープに関しては一価となる可能性が
高くなる。測定の目的とする抗原物質が一価抗原である
場合、不溶性担体に担持された１種のモノクローナル抗
体と試料中の抗原性物質が反応もしくは結合しても、通
常凝集はおこらない。このため、実質的にはポリクロー
ナル抗体が多用されている。

【０００４】このような問題点に対し、特公平３−４０
３４１号公報には、特定の抗原に対して、異なる２種又
は３種のモノクローナル抗体を不溶性担体に担持させ、
抗原と反応させて不溶性担体の凝集の程度を測定するこ
とにより、抗原性物質を検出または定量する方法が開示
されている。しかしながら、上記のような従来のモノク
ローナル抗体を不溶性担体に担持させる方法では、不溶
性担体の立体障害により、抗体と抗原性物質との間の抗
原抗体反応とそれに続く凝集が阻害される可能性があ
る。すなわち抗原性物質が１種類のモノクローナル抗体
と、少なくとももう１種類のモノクローナル抗体とに同
時に結合することによって、不溶性担体の凝集が生じる
わけであるが、全てのモノクローナル抗体が不溶性担体
に担持されていると、２種のモノクローナル抗体の認識
する抗原のエピトープが構造的に接近した部位にある場
合、不溶性担体間の立体構造により、異なる２種または
３種のモノクローナル抗体が１つの抗原性物質に対し、
同時に結合することが阻害される場合がある。また、こ
の方法では、不溶性担体に担持させうる抗体量に限界が
あり、不溶性担体への担持が困難なモノクローナル抗体
もある。さらにモノクローナル抗体の性状によっては、
不溶性担体に担持させた場合、自己凝集が生じて試薬と
しての性能を発揮できない場合がある。従って、上記の
方法では抗原性物質を正確に定量できない可能性があ
る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
を解決するものであり、その目的とするところは、不溶
性担体の立体障害による凝集阻害がなく、多量の抗体を
用いることができ、その結果、正確な測定値を得ること
のできる免疫測定試薬及び免疫測定法を提供することで
ある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明の免疫測定試薬
は、特定の抗原物質に対する異なる２種以上のモノクロ
ーナル抗体と水不溶性担体とからなり、上記特定の抗原
物質に対するモノクローナル抗体の一部が水不溶性担体
に担持される。上記特定のモノクローナル抗体の水不溶
性担体に担持されない抗体は、抗原抗体反応に伴う凝集
反応において、水不溶性担体と立体障害をおこさない状
態とされていればよく、例えば、水可溶性担体に担持さ
れるか又は２以上の多量体とされるのが好ましい。

【０００７】この時、水不溶性担体に担持されるモノク
ローナル抗体と、水可溶性担体に担持されるあるいは多
量体とされるモノクローナル抗体は、特定の抗原物質に
対する異なるモノクローナル抗体である。少なくとも１
種の異なるモノクローナル抗体が担持あるいは多量体と
されていれば、例えば、水不溶性担体に２種、水可溶性
担体に別の１種が担持されていてもよい。また、特定の
抗原物質に対する異なる２種以上のモノクローナル抗体
の混合物の、一部が水不溶性担体に担持され、一部が水
可溶性担体に担持されるかあるいは２以上の多量体とさ
れていてもよく、１種のモノクローナル抗体が水不溶性
担体に担持され、異なる２種以上のモノクローナル抗体
の混合物が水可溶性担体に担持されるかあるいは２以上
の多量体とされていてもよい。

【０００８】上記モノクローナル抗体の水不溶性担体に
担持される量は、少なくなると凝集はしても凝集の程度
を測定するのが困難となり、多くなると立体障害による
凝集反応阻害が起こりやすくなるので、モノクローナル
抗体全体の３０〜８０％が好ましい。

【０００９】上記モノクローナル抗体としては、細胞融
合技術分野において、公知の手法を適宜選択し、または
それらを組み合わせることによりモノクローナル抗体産
生融合細胞株を形成し、この細胞株を利用して産生、取
得したものを用いることができる（「単クローン抗体・
ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ」，岩崎辰夫ら著；講談
社）。

【００１０】その一態様としては、ある特定の完全抗原
を用いて、これを適当な動物、例えばマウス、ラット、
ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の動物に、例え
ば、アジュバントとともに皮下注射するなどの手法によ
り投与し、動物を免疫した後、この免疫動物、例えば免
疫マウスの上記抗原に対する抗体産生細胞、例えば脾細
胞、胸腺細胞、リンパ節細胞及び／又は末梢血細胞等の
細胞を採取し、これらの細胞と自己増殖能を有するが実
質的に抗体産生能を有しない適当な株化細胞（ミエロー
マ細胞）、例えばマウス骨髄腫株化細胞とを、公知の手
法により細胞融合処理する。モノクローナル抗体を得る
ための抗体産生細胞とミエローマ細胞との組み合わせ
は、各細胞が融合して増殖しつつ抗体を産生することが
可能であれば、それぞれの細胞の由来する動物の種類は
限定されず、任意に組み合わせることができる。

【００１１】上記ミエローマ細胞としては、特に限定さ
れないが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト等の
種々の動物の細胞体を用いることができる。好ましく
は、株化細胞は薬剤抵抗性のものであり、かつ未融合の
ミエローマ細胞が選択培地で生存せず、融合細胞のみが
生存するようなものである。一般には、８−アザグアニ
ジン抵抗性の株化細胞が用いられ、これはヒポキサンチ
ン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠
損し、ヒポキサンチン・アミンプテリン・チミジン（Ｈ
ＡＴ）培地に生育できない性質を有する。さらに、株化
細胞としては非分泌型のものが好ましく、例えば、マウ
スミエローマＭＯＰＣ−２１株由来のＰ₃／Ｘ６３−Ａ
ｇ８Ｕ₁(Ｐ₃Ｕ₁)、Ｐ₃／Ｘ６３−Ａｇ８・６・５・
３、Ｐ₃／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ
１４、ラットミエローマ２１０・ＲＣＹ３・Ａｇ１・２
・３等が挙げられる。

【００１２】上記細胞融合処理は、例えば、イーグル最
小基本（ＭＥＭ）培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等の培
地中で、上記免疫マウスの脾細胞１〜５×１０⁸個と、
上記マウス骨髄腫株化細胞１〜５×１０⁷個とを混合し
て行うことができる。融合促進剤としては、平均分子量
１０００〜６０００のポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）、ポリビニルアルコール、ウイルス等が挙げられ、
特にＰＥＧが好ましく、ＰＥＧは約３０〜５０重量％で
用いられる。上記のようにして得られる融合細胞含有系
から、融合細胞を、公知の手法により、選別処理、抗体
活性スクリーニング処理及びクローニング処理して、免
疫マウスの形成に用いた完全抗原に対するモノクローナ
ル抗体産生能を有し、かつ自己増殖能をもつ融合細胞株
を得ることができる。

【００１３】上記融合細胞の選別処理は、例えば、２０
重量％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地等で細
胞融合を終えた細胞を適当に希釈し、９６穴マイクロプ
レートに１０⁵〜１０⁶個／ウェル程度に分注し、各ウ
ェルに選択培地（ＨＡＴ培地等）を加え、以後選択培地
の交換を行いながら、５％ＣＯ₂培養器（３７℃）で培
養を続けることにより行うことができる。ミエローマ細
胞として８−アザグアニン抵抗性株を用いれば、未融合
のミエローマ細胞はＨＡＴ培地で死滅し、また抗体産生
細胞は正常細胞なので、ｉｎｖｉｔｒｏ培養では長期
間生育できない。従って、培養後１０〜１４日ぐらいか
ら生育してくる細胞を融合細胞として選別できる。

【００１４】上記のようにして得られる融合細胞株の抗
体活性スクリーニング処理及びクローニング処理は、公
知の方法により行うことができる。例えば、融合細胞の
生育したウェルの培養上清の一部を採取し、一定量の標
識抗原とインキュベーションし、標識抗原との結合能を
測定することにより目的とする抗体を分泌しているウェ
ルを検索する方法が挙げられる。すなわち¹²⁵Ｉ、 ¹³¹
Ｉ等のラジオアイソトープ又は酵素等で標識した抗原と
培養上清を反応させた後、各反応液について抗原−抗体
結合物を分離し、標識量を測定することにより、目的と
する抗体の存在及び結合能を検索することができる。目
的とする抗体活性の認められる各ウェル中には、２種以
上の融合細胞が生育している可能性があるので、限界希
釈法や軟寒天によるコロニー形成法によりクローニング
を行い、モノクローナル抗体産生融合細胞株を得ること
ができる。

【００１５】上記のようにして得られるモノクローナル
抗体産生融合細胞株を用いて、前記免疫動物の形成に用
いた完全抗原に対するモノクローナル抗体を取得する方
法としては、例えば、上記モノクローナル抗体産生融合
細胞株を適当な培地に培養し、培地からモノクローナル
抗体を採取する方法、ミエローマ細胞由来動物と同系の
動物に上記細胞株を移植し、腹水中のモノクローナル抗
体を採取する方法等の公知の手法が挙げられる。上記前
者の態様としては、例えば、モノクローナル抗体産生融
合細胞株を１０重量％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６
４０培地等の培養液で培養し、その培養上清を硫安分
画、抗原を結合させたセファロース４Ｂ等のアフィニテ
ィークロマトグラフィーなどによって精製することによ
り目的とするモノクローナル抗体を得ることができる。

【００１６】また、上記後者の態様としては、例えば、
同系動物にプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメ
チルペンタデカン）等の鉱物油を腹腔内投与することに
よりｉｎｖｉｖｏで融合細胞を大量に増殖させ、高濃
度のモノクローナル抗体が含まれた腹水を得る。この腹
水から硫安分画及び必要に応じて前記アフィニティーク
ロマトグラフィー等により、目的とするモノクローナル
抗体を得ることができる。本発明のモノクローナル抗体
として、上述のようにして取得できるもの以外に市販の
ものを用いることも可能である。

【００１７】前記水不溶性担体としては、従来より免疫
化学的凝集反応及び凝集阻止反応において、一般的に用
いられている微粒子の担体を用いることができるが、工
業的に大量生産が可能な有機系微粒子が好ましい。上記
有機系微粒子としては、例えば、スチレン、塩化ビニ
ル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステ
ル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単一
重合体及び／又は共重合体；スチレン−ブタジエン共重
合体、メタクリル酸メチル−ブタジエン共重合体等のブ
タジエン系共重合体；並びに官能基としてカルボキシル
基、第１級アミノ基、カルボアミノ基（−ＣＯＮＨ₂)、
水酸基、アルデヒド基等を有し、かつ基体が前記有機系
微粒子からなる反応性有機系微粒子などが挙げられ、抗
体の吸着性に優れ、生物学的活性を長期間安定に保持で
きる等の理由から、特にスチレンを主成分とするポリス
チレン系のラテックス粒子が好ましい。

【００１８】その他、動物の赤血球、細菌の細胞等の生
物学的粒子；ベントナイト、コロジオン、コレステロー
ル結晶、シリカ、カオリン、炭素末等の非生物学的粒子
なども用いることができる。上記水不溶性担体の平均粒
径は、測定方法、測定機器によって異なるが、０．０５
〜１．０μｍのものが通常用いられる。

【００１９】上記水不溶性担体にモノクローナル抗体を
担持させる方法としては、公知の方法を用いることがで
き、例えば、水不溶性担体に物理的に吸着させる方法、
官能基を有する水不溶性担体表面に、公知の化学結合法
や共有結合法により担持させる方法等が挙げられる。

【００２０】前記水可溶性担体としては、モノクローナ
ル抗体を２以上担持でき、かつ水可溶性であれば特に限
定されない。例えば、二塩酸スベリミジン酸ジメチル、
アルキルジイミデート等のビスイミドエステル類；アシ
ルアジド類；イソシアネート類；グルタルアルデヒド等
のジアルデヒド類；メルカプトアルキルイミデート類；
イミノチオ等のチオール化試薬；ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシ
ンイイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ
ート）；ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミド）；ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイ
ミドブチリルオキシ）スクシンイミド）；ＥＭＣＳ（Ｎ
−（ε−マレイミドヘキサノイルオキシ）スクシンイミ
ド）；ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド）；ニトレン類；アリールハ
ライド類；スルホニルハライド類；ブロモシアン；過ヨ
ウ素酸塩等の低分子化合物などのタンパク質の架橋剤が
挙げられ、なかでも二塩酸スベリミジン酸ジメチルが好
ましい。その他、メチルセルロース、カルボキシメチル
セルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース等
のセルロース誘導体；ポリビニルアルコール等の水溶性
高分子化合物などが挙げられる。

【００２１】上記水可溶性担体にモノクローナル抗体を
担持させる方法としては、公知の方法を用いることがで
き、例えば、公知の化学結合法や共有結合法により担持
させる方法、水可溶性担体に物理的に吸着させる方法、
アビジン−ビオチン等の親和性をもつ物質を用いて担持
させる方法等が挙げられる。

【００２２】前記モノクローナル抗体を２以上の多量体
にする方法としては、公知の方法を用いることができ、
例えば、抗体濃度５〜３０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７〜１０の
抗体希釈液を加熱し、熱変性により抗原認識部位に関与
しないＦｃ部位で抗体どうしを結合させる方法等が挙げ
られる。上記加熱処理は、温度が高かったり時間が長く
なると抗体が変性するため、４０〜８０℃で６０分以内
が好ましく、より好ましくは５０〜７５℃で３０分以内
である。

【００２３】本発明の免疫測定法は、上記本発明の免疫
測定試薬と、上記特定の抗原物質とを反応させ、凝集の
度合いにより上記特定の抗原物質を測定する方法であ
る。

【００２４】上記抗体が担持された水不溶性担体、及び
抗体が担持された水可溶性担体又は少なくとも２以上の
抗体の多量体と、特定の抗原物質との反応は、抗原抗体
反応及びそれに伴う凝集反応である。反応条件は、上記
反応が起こりうるものであれば特に限定されないが、反
応温度は恒温で２５〜３７℃の範囲内で行うのが好まし
い。反応時間は５秒〜１５分が好ましい。上記反応を行
う際の反応液としては、抗原抗体反応が起こりうる生理
的条件を満たす水溶液であれば特に限定されず、例え
ば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、
トリス緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。反応液の
ｐＨは、５．５〜８．５が好ましく、さらに好ましくは
６．５〜８．０である。

【００２５】上記反応液には、更に必要に応じて、牛血
清アルブミン、ショ糖等の安定化剤、感度を高める効果
が期待されるポリエチレングリコール、デキストラン等
の水溶性多糖類、アジ化ナトリウム等の防腐剤、塩化ナ
トリウム等の塩濃度調整剤などを添加してもよい。

【００２６】本発明の方法において、測定対象となる試
料としては、抗原、抗体等の免疫学的に活性な抗原物質
を含有する試料、特に生体試料である。生体試料として
は、例えば、血液、胸水、腹水、リンパ液等の体液、
尿、便、汗等の排泄物、及び組織の抽出物などが挙げら
れる。

【００２７】上記特定の抗原物質としては、抗原抗体反
応しうる抗原、抗体等の免疫学的に活性なあらゆる物
質、すなわち従来測定されていた物質のいずれもが包含
され、例えばタンパク質、ポリペプチド、多糖類、脂
質、ステロイド等が挙げられる。上記タンパク質として
は、例えば、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、フ
ィブリノーゲン分解産物（ＦＤＰ）、Ｃ反応性タンパク
（ＣＲＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）等の
血液中タンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢ）、Ｃ型肝
炎ウイルス（ＨＣ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
等の感染症に対する抗原及びその抗体、レセプター、酵
素などが挙げられる。

【００２８】前記凝集の度合いを測定する方法として
は、特に限定されないが、例えば、凝集を定性的又は半
定量的に測定する場合には、既知の試料の濁度の程度と
の比較から、測定すべき試料の濁度の程度を目視により
観察する方法を用いることができ、定量的に測定する場
合には、簡便性及び精度の点から、上記濁度の程度を光
学的に測定する方法が好ましい。

【００２９】上記目視により観察する方法としては、、
試料と抗体が担持された水不溶性担体及び抗体が担持さ
れた水可溶性担体（又は多量体）を含む溶液を判定板上
で混合し、揺り動かした後、凝集の有無を判定する。判
定には、単に肉眼で判定する以外に、ビデオカメラで撮
影し画像処理を施すことによって判定することもでき
る。

【００３０】上記光学的に測定する方法としては、公知
の方法が用いられ、例えば、凝集塊の形成を濁度の増加
としてとらえる比濁法、凝集塊の形成を粒度分布又は平
均粒径の変化としてとらえる方法、凝集塊の形成による
前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し透過光強度と
の比を比較する積分球濁度法等が挙げられる。上記の測
定法において、異なる時点で少なくとも２つの測定値を
得、これらの時点間における測定値の増加分（すなわち
増加速度）に基づき凝集の程度を求める速度試験（レー
トアッセイ）、及びある時点（通常は反応の終点と考え
られる時点）で１つの測定値を得、この測定値に基づき
凝集の程度を求める終点試験（エンドポイントアッセ
イ）を利用でき、測定の簡便性、迅速性の点から比濁法
による速度試験を行うことが好ましい。

【００３１】

【作用】上述のように、本発明によれば、特定の抗原物
質に対する２種以上のモノクローナル抗体の一部が水不
溶性担体に担持され、例えば、残りの一部が水可溶性担
体に担持されるか又は２以上の多量体とされていること
により、凝集反応の際に水不溶性担体の立体障害による
凝集反応阻害が抑えられるので、特定の抗原物質との結
合物を選択的に凝集させることができ、高感度に抗原物
質量を測定することができる。

【００３２】

【実施例】本発明を実施例につき説明する。実施例及び
比較例に用いた試薬は以下のとおりである。〔抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体〕マウスの培養細胞
上清からプロテインＡにより精製した、エピトープの異
なる２種のマウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体、ク
ローンＮｏ．ＡＦＰ４−Ｆ１１（ＩｇＧ−１、以下抗体
Ｉとする）、及びクローンＮｏ．ＡＦＰ４−Ｆ６７（Ｉ
ｇＧ−１、以下抗体IIとする）を用いた（共にＤＡＣＯ
社製）。〔抗体架橋反応用緩衝液〕２００ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄
と２００ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄をｐＨ８となるように混
合して用いた。〔ラテックス希釈用緩衝液、抗体希釈用緩衝液〕５０ｍ
ＭＮａ₂ＨＰＯ₄と５０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄をｐＨ
７．５となるように混合して用いた。〔ブロッキング用緩衝液〕１００ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄
と１００ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄をｐＨ７．４となるよう
に混合し、さらにウシ血清アルブミン（フラクション
Ｖ、Reagent Grade、ＭｉｌｅｓＣｏｒｐ．社製）を
１％（Ｗ／Ｖ）になるように、またＮａＮ₃（試薬特
級、ナカライテスク社製）を０．１％（Ｗ／Ｖ）になる
ように添加し溶解させたものを用いた。〔検体希釈液〕上記ブロッキング用緩衝液に、ポリエチ
レングリコール６０００（平均分子量７５００、和光純
薬社製）を３％（Ｗ／Ｖ）となるように溶解して用い
た。

【００３３】（実施例１）１）水可溶性担体試薬の調製抗体Ｉを、抗体架橋反応用緩衝液１５００ｍｌで透析し
た後、タンパク濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように抗体架
橋反応用緩衝液で希釈し、抗体液とした。また、二塩化
スベリミジン酸ジメチル（東京化成社製）１１．４ｍｇ
を上記抗体架橋反応用緩衝液５ｍｌに溶解し、抗体架橋
剤を調製した。上記抗体液１ｍｌを２５℃のインキュベ
ーター中でマグネチックスターラーで攪拌しながら、上
記抗体架橋剤１μｌを２分おきに計５回添加し、その後
さらに１０分間攪拌した。次いで、酢酸アンモニウム
（試薬特級、和光純薬社製）７．７ｍｇを上記抗体架橋
反応用緩衝液５００μｌに溶解して調製した抗体架橋反
応停止剤５μｌを添加し、この粗生成物を０．１５Ｍ
ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で
平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ＨＲ１０／３０（ゲル
濾過カラム、ファルマシア社製）に供し、同緩衝液で
０．５ｍｌ／分で溶出させ、分子量２５００００〜５０
００００の画分を分取した。最終タンパク濃度が４０μ
ｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希釈し、水可
溶性担体試薬を調製した。

【００３４】２）ＡＦＰ測定試薬の調製平均粒径０．３０４μｍのポリスチレンラテックス（固
形分１０％（ｗ／ｖ）、積水化学工業社製）１容に、上
記ラテックス希釈用緩衝液９容を添加希釈し、ラテック
ス液とした。抗体IIは、タンパク濃度が６６．７μｇ／
ｍｌとなるように上記抗体希釈用緩衝液で希釈し、感作
抗体液とした。上記ラテックス液６００μｌを２５℃の
インキュベーター中で、マグネチックスターラーで攪拌
しながら、上記感作抗体液１２００μｌを素早く添加
し、さらに１時間攪拌した。次いでブロッキング用緩衝
液３ｍｌを添加し、２５℃で続けて２時間攪拌した。そ
の後１５℃、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し沈
殿を得た。この沈殿にブロッキング用緩衝液４ｍｌを添
加し、同様に遠心分離して沈殿を洗浄した。この洗浄操
作をさらに２回行った後、ブロッキング用緩衝液１．８
ｍｌを添加し、よく攪拌し、超音波破砕機で分散処理を
行った。この分散液に上記水可溶性担体試薬１．８ｍ
ｌを添加し、固形分０．１７％（ｗ／ｖ）のＡＦＰ測定
試薬を調製した。この試薬は４℃で保存した。

【００３５】３）ＡＦＰ量の測定ヒトプール血清から精製されたＡＦＰ標準品（ＷＨＯ標
準品、９０８９０I.U.／ｍｌ、１１０μｇ／ｍｌ、ＤＡ
ＣＯ社製）を用い、生理食塩水で２０００、５００、１
００、２０、１０、５ｎｇ／ｍｌにそれぞれ希釈し、各
濃度のＡＦＰ標準品を調製した。また、ＡＦＰ標準品を
含まない生理食塩水のみのものを０ｎｇ／ｍｌとした。
測定は、各ＡＦＰ標準品２０μｌを分注後、直ちに上記
検体希釈液２１０μｌを添加混合し、次いで上記ＡＦＰ
測定試薬３０μｌの添加混合を行った。生化学用自動
分析装置（日立７１５０型、日立製作所社製）を使用
し、測定条件は温度３７℃、波長５７０ｎｍとした。反
応量は、ＡＦＰ測定試薬添加後８０秒後の吸光度と３２
０秒後の吸光度を測定し、その差を１００００倍したも
のを吸光度変化量とし、各ＡＦＰ標準品の抗体濃度と吸
光度変化量の検量線を作成した。結果を表２及び図１に
示す。

【００３６】（比較例１）１）ＡＦＰ測定試薬の調製上記実施例１のＡＦＰ測定試薬の調製において、分散
液に水可溶性担体試薬を添加するかわりに、ブロッキ
ング用緩衝液１．８ｍｌを添加したこと以外は同様にし
て、ＡＦＰ測定試薬を調製した。２）ＡＦＰ測定試薬の調製上記ＡＦＰ測定試薬の調製において、抗体として抗体
Ｉを用いて感作抗体液としたこと以外は同様にして、Ａ
ＦＰ測定試薬を調製した。３）ラテックス凝集免疫試薬の調製上記ＡＦＰ測定試薬とＡＦＰ測定試薬を等量混合
し、固形分０．１７％（ｗ／ｖ）のラテックス凝集免疫
試薬を調製した。この試薬は４℃で保存した。４）ＡＦＰ量の測定上記実施例１のＡＦＰ量の測定において、ＡＦＰ測定試
薬のかわりに、上記ラテックス凝集免疫試薬を用いた
こと以外は同様にして、ＡＦＰ量を測定し、検量線を作
成した。結果を表２及び図１に示す。

【００３７】（実施例２）１）抗体多量体の調製抗体Ｉの１ｍｌを、抗体架橋反応用緩衝液１５００ｍｌ
で透析した後、タンパク濃度が５ｍｇ／ｍｌになるよう
に抗体架橋反応用緩衝液で希釈した。この抗体液１ｍｌ
を５６℃のインキュベーター中で３０分間加熱した後、
氷冷した。この後タンパク濃度が４０μｇ／ｍｌになる
ように抗体希釈用緩衝液で希釈し、抗体多量体を調製
した。

【００３８】２）ＡＦＰ測定試薬の調製上記実施例１のＡＦＰ測定試薬の調製において、分散
液に水可溶性担体試薬を添加するかわりに、上記抗体
多量体１．８ｍｌを添加したこと以外は同様にして、
ＡＦＰ測定試薬を調製した。この試薬は４℃で保存し
た。３）ＡＦＰ量の測定上記実施例１のＡＦＰ量の測定において、ＡＦＰ測定試
薬のかわりに、上記ＡＦＰ測定試薬を用いたこと以
外は同様にして、ＡＦＰ量を測定し、検量線を作成し
た。結果を表２及び図２に示す。

【００３９】（実施例３）１）水可溶性担体試薬の調製抗体Ｉ及びIIを、同じ濃度で等量混合し、抗ＡＦＰ抗体
混合液とした。上記実施例１の水可溶性担体試薬の調
製において、抗体Ｉのかわりに、上記抗ＡＦＰ抗体混合
液を用いたこと以外は同様にして、水可溶性担体試薬
を調製した。２）ＡＦＰ測定試薬の調製上記実施例１のＡＦＰ測定試薬の調製において、抗体
IIのかわりに上記抗ＡＦＰ抗体混合液を用い、分散液に
水可溶性担体試薬を添加するかわりに上記水可溶性担
体試薬１．８ｍｌを添加したこと以外は同様にして、
ＡＦＰ測定試薬を調製した。この試薬は４℃で保存し
た。３）ＡＦＰ量の測定上記実施例１のＡＦＰ量の測定において、ＡＦＰ測定試
薬のかわりに、上記ＡＦＰ測定試薬を用いたこと以
外は同様にして、ＡＦＰ量を測定し、検量線を作成し
た。結果を表２及び図３に示す。

【００４０】（実施例４）１）抗体多量体の調製上記実施例２の抗体多量体の調製において、抗体Ｉの
かわりに、上記実施例３で調製した抗ＡＦＰ抗体混合液
を用いたこと以外は同様にして、抗体多量体を調製し
た。２）ＡＦＰ測定試薬の調製上記実施例１のＡＦＰ測定試薬の調製において、抗体
IIのかわりに上記抗ＡＦＰ抗体混合液を用い、分散液に
水可溶性担体試薬を添加するかわりに上記抗体多量体
１．８ｍｌを添加したこと以外は同様にして、ＡＦＰ
測定試薬を調製した。この試薬は４℃で保存した。３）ＡＦＰ量の測定上記実施例１のＡＦＰ量の測定において、ＡＦＰ測定試
薬のかわりに、上記ＡＦＰ測定試薬を用いたこと以
外は同様にして、ＡＦＰ量を測定し、検量線を作成し
た。結果を表２及び図４に示す。

【００４１】なお、各実施例及び比較例で用いたＡＦＰ
測定試薬の、担体と抗体の種類の構成を表１に示す。

【００４２】

【表１】

【００４３】

【表２】

【００４４】表２及び図１〜４より、実施例の本発明の
試薬によって作成された検量線は、ＡＦＰ低濃度域から
高濃度域まで良好な直線性を示したが、比較例１の従来
法によるラテックス凝集免疫試薬による検量線は、低濃
度域及び高濃度域において良好な直線性を示さなかっ
た。これは、本発明の特定の抗原物質に対する異なる２
種のモノクローナル抗体を、１種は水不溶性担体に、も
う１種は水可溶性担体に担持させるか又は多量体として
反応させたため、２種のモノクローナル抗体をそれぞれ
水不溶性担体に担持させて反応させた場合（比較例１）
と比べて、水不溶性担体の立体障害がないためと考えら
れる。また、低濃度域での感度も高く、モノクローナル
抗体の生理活性もより高く保持されていると考えられ
る。

【００４５】

【発明の効果】本発明の免疫測定試薬及び免疫測定方法
は上述のとおりであるので、従来のラテックス凝集免疫
試薬でみられたような水不溶性担体の立体障害による凝
集阻害がなく、かつより多くの抗体を用いることがで
き、その結果、低濃度域でも高い検出感度を示す。従っ
て、被検試料中の抗原物質を正確に定量することが可能
となり、疾患の発見、病態の把握、治療方法の決定等に
有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１の免疫測定試薬と比較例１の従来法の
ラテックス凝集免疫試薬で、既知濃度のＡＦＰ標準品を
測定したときのＡＦＰ量と吸光度変化量の相関を示すグ
ラフである。

【図２】実施例２の免疫測定試薬と比較例１の従来法の
ラテックス凝集免疫試薬で、既知濃度のＡＦＰ標準品を
測定したときのＡＦＰ量と吸光度変化量の相関を示すグ
ラフである。

【図３】実施例３の免疫測定試薬と比較例１の従来法の
ラテックス凝集免疫試薬で、既知濃度のＡＦＰ標準品を
測定したときのＡＦＰ量と吸光度変化量の相関を示すグ
ラフである。

【図４】実施例４の免疫測定試薬と比較例１の従来法の
ラテックス凝集免疫試薬で、既知濃度のＡＦＰ標準品を
測定したときのＡＦＰ量と吸光度変化量の相関を示すグ
ラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】特定の抗原物質に対する異なる２種以上の
モノクローナル抗体と水不溶性担体からなり、上記モノ
クローナル抗体の一部が水不溶性担体に担持されている
ことを特徴とする免疫測定試薬。
【請求項２】特定の抗原物質に対する異なる２種以上の
モノクローナル抗体の、少なくとも１種が担持された水
不溶性担体と、少なくとも別の１種が担持された水可溶
性担体とからなることを特徴とする免疫測定試薬。
【請求項３】特定の抗原物質に対する異なる２種以上の
モノクローナル抗体の、少なくとも１種が担持された水
不溶性担体と、少なくとも別の１種の２以上の多量体と
からなることを特徴とする免疫測定試薬。
【請求項４】特定の抗原物質に対する異なる２種以上の
モノクローナル抗体の混合物の、一部が担持された水不
溶性担体と、一部が担持された水可溶性担体からなるこ
とを特徴とする免疫測定試薬。
【請求項５】特定の抗原物質に対する異なる２種以上の
モノクローナル抗体の混合物の、一部が担持された水不
溶性担体と、一部の２以上の多量体とからなることを特
徴とする免疫測定試薬。
【請求項６】上記水不溶性担体がポリスチレン系ラテッ
クスである請求項１〜５いずれかに記載の免疫測定試
薬。
【請求項７】上記特定の抗原物質がアルファフェトプロ
テインである請求項１〜６いずれかに記載の免疫測定試
薬。
【請求項８】請求項１〜７いずれかに記載の免疫測定試
薬と、上記特定の抗原物質とを反応させ、凝集の度合い
により上記特定の抗原物質を測定することを特徴とする
免疫測定法。