CN111665364A - 一种评估hcp检测用多克隆抗体覆盖率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种评估HCP检测用多克隆抗体的覆盖率的方法，所述方法先将HCP多克隆抗体偶联于固体基材，再利用这种固体基材捕获HCP样品中的蛋白，随后分离所捕获的HCP蛋白并检测HCP样品中的蛋白总数和所捕获蛋白的数量就能够获得HCP多克隆抗体的覆盖率。本发明的方法操作简便、条件可控、结果可靠，并且在各次操作之间能够具备很高的一致性。
Description
技术领域
本发明涉及检测领域；具体地说，本发明涉及评估HCP检测用多克隆抗体覆盖率的方法。
背景技术
通过宿主细胞(如细菌、酵母或哺乳动物、昆虫或植物细胞系)的重组蛋白表达技术已在许多生物制药产品中得到广泛的应用。在这类产品的生产过程中，宿主细胞来源的蛋白质(Host cell proteins，HCP)会不可避免地引入生产工艺流程中，从而存在于最终的药品中。研究发现生物制药产品中残留HCP的主要危害是其有可能诱导机体产生抗HCP抗体，这些抗体可能会引起患者产生临床症状。此外，HCP可能作为免疫佐剂，诱导产生抗药抗体，影响药物安全性或有效性，因此全球各个国家的监管机构对HCP残留都有严格的限量要求。
目前本领域常规采用HCP ELISA检测试剂盒。由于存在操作方便快捷、成本较低、检测的高通量等诸多优点，该试剂盒已被监管机构和企业广泛运用于中间品及成品的放行检中。HCP ELISA检测试剂盒的开发中最重要的一环是对多克隆抗体的表征，其中就包括多克隆抗体的覆盖率验证实验，即需要证明ELISA试剂盒中所使用的多克隆抗体与大量的HCP可以广泛反应。在申报临床实验时每个企业都需要提供相关的数据来证明这一点，进而继续进行接下来的研发工作。
为验证HCP ELISA检测试剂盒中多克隆抗体的覆盖率，本领域已经开发了各种技术，例如抗体亲和提取方法(Antibody Affinity Extraction)或2D-WB法。然而，这些方法均各自存在明显的不足之处。例如，工艺复杂、时间成本和经济成本非常高，在实际运用中存在误判；检测过程受操作影响大；印迹和凝胶之间的点很难匹配并且无法标准化等等缺点。
因此，本领域急需操作简便、条件可控、结果可靠的评估HCP检测用多克隆抗体覆盖率的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种评估HCP检测用多克隆抗体覆盖率的方法，这种方法应具备以下优点：
1.与HCP ELISA检测尽可能保持一致性，从而提高结果的真实性；
2.保证结果的一致性和可重复性；
3.保证小分子量蛋白的不丢失；
4.减少非特异性吸附，确保高亲和的HCP可以洗脱；
5.实验操作的标准化。
本发明还有一目的是提供实施上述本发明方法的设备。
在第一方面，本发明提供一种评估HCP检测用多克隆抗体的覆盖率的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将所述HCP检测用多克隆抗体固定于固体基材，从而得到固定有所述HCP检测用多克隆抗体的固体基材；
(2)将步骤(1)所得的固定有所述HCP检测用多克隆抗体的固体基材与HCP样品接触，从而使得所述多克隆抗体与HCP样品中的蛋白发生特异性结合；
(3)使得所述多克隆抗体与所结合的蛋白解离；
(4)检测与所述多克隆抗体特异性结合的蛋白的数量A以及HCP样品中蛋白的数量B；和
(5)计算数量A与数量B之比得到HCP检测用多克隆抗体的覆盖率。
在具体的实施方式中，在所述步骤(4)后进行步骤(4-1)：检测所述多克隆抗体特异性结合的蛋白以及HCP样品中蛋白之间具有相同的分子量和等电点的蛋白的数量C；和
相应地，在步骤(5)中是根据以下公式计算得到HCP检测用多克隆抗体的覆盖率：A/(A+B-C)。
在具体的实施方式中，所述固体基材包括但不限于：磁珠、晶片、琼脂糖珠、树脂微球。
在优选的实施方式中，所述固体基材表面带有NH2-、COOH或NHS等用于和抗体偶联的化学基团。
在具体的实施方式中，所述固体基材是磁珠。
在具体的实施方式中，在步骤(1)中还包括在所述HCP检测用多克隆抗体固定于固体基材后封闭所述固体基材的步骤。
在优选的实施方式中，封闭所述固体基材的步骤包括但不限于利用牛血清白蛋白、Tris-HCl缓冲液或磷酸缓冲液封闭所述固体基材。
在具体的实施方式中，在步骤(2)中，在所述多克隆抗体与HCP样品中的蛋白发生特异性结合后，还任选包括除去非特异性结合蛋白的步骤。
在优选的实施方式中，在步骤(2)中，在所述多克隆抗体与HCP样品中的蛋白发生特异性结合后，利用PBS缓冲液洗涤所述固体基材以便除去非特异性结合的蛋白。
在优选的实施方式中，步骤(3)包括使得所述多克隆抗体与所结合的蛋白解离，并去除固定有所述多克隆抗体的固体基材。
在优选的实施方式中，在步骤(3)中，利用尿素缓冲液、甘氨酸溶液(pH 1.0～4.0)使得所述多克隆抗体与所结合的蛋白解离。
在优选的实施方式中，在步骤(3)中，采用磁性分离的方式除去固定有所述多克隆抗体的固体基材。
在优选的实施方式中，步骤(4)中检测与所述多克隆抗体特异性结合的蛋白的数量、HCP样品中蛋白的数量以及之间具有相同的分子量和等电点的蛋白的数量可以通过本领域已知的各种检测蛋白数量的方法实现，包括但不限于2D电泳、2D-DIGE、HPLC、质谱、UPLC-MS。
在优选的实施方式中，在步骤(5)中，利用计算机计算数量A与数量B加数量A减数量C之比，从而得到HCP检测用多克隆抗体的覆盖率。
在优选的实施方式中，所述方法还包括输出得到的HCP检测用多克隆抗体覆盖率的步骤。
在第二方面，本发明提供一种评估HCP检测用多克隆抗体的覆盖率的设备，所述设备包括：
(1)用于将所述HCP检测用多克隆抗体固定于固体基材的装置；
(2)将固定有所述HCP检测用多克隆抗体的固体基材与HCP样品接触的装置；
(3)使得所述多克隆抗体与所结合的蛋白解离的装置；
(4)检测与所述多克隆抗体特异性结合的蛋白的数量A以及HCP样品中蛋白的数量B的装置；和
(5)计算数量A与数量B之比，得到HCP检测用多克隆抗体的覆盖率的装置。
在具体的实施方式中，所述装置(1)包括盛放所述固体基材和所述多克隆抗体的容器以及将所述多克隆抗体固定于固体基材的器件。
在优选的实施方式中，将所述多克隆抗体固定于固体基材的器件包括漩涡震荡器、磁力架、旋转混匀仪。
在优选的实施方式中，所述固体基材包括但不限于：磁珠、晶片、琼脂糖珠、树脂微球；优选磁珠。
在优选的实施方式中，所述装置(1)中还任选包括在所述HCP检测用多克隆抗体固定于固体基材后封闭所述固体基材的器件。
在优选的实施方式中，封闭所述固体基材的器件是指将牛血清白蛋白、Tris-HCl缓冲液或磷酸缓冲液等与固定有HCP检测用多克隆抗体的固体基材进行孵育的器件。
在具体的实施方式中，所述装置(2)包括但不限于用于容纳所述固体基材与HCP样品的容器、转移所述固体基材与HCP样品的器件以及将所述固体基材与HCP样品接触的器件。
在优选的实施方式中，所述装置(2)中还任选包括在所述多克隆抗体与HCP样品中的蛋白发生特异性结合后，除去非特异性结合蛋白的器件。
在优选的实施方式中，所述除去非特异性结合蛋白的器件是指利用PBS缓冲液洗涤所述固体基材以便除去非特异性结合的蛋白的器件。
在具体的实施方式中，所述装置(3)包括旋转混匀仪、漩涡震荡器、磁力架。
在具体的实施方式中，所述装置(4)包括但不限于实施2D电泳、2D-DIGE、HPLC、质谱、UPLC-MS的器件。
在优选的实施方式中，所述装置(5)是计算机，从而能够计算数量A和总数量B之比。
在优选的实施方式中，所述设备还可以任选包括输出覆盖率的装置(6)。
在具体的实施方式中，所述装置(4)是检测与所述多克隆抗体特异性结合的蛋白的数量A、HCP样品中蛋白的数量B和与所述多克隆抗体特异性结合的蛋白以及HCP样品中蛋白之间具有相同的分子量和等电点的蛋白的数量C的装置；和
相应地，所述装置(5)是根据以下公式计算得到HCP检测用多克隆抗体的覆盖率的装置：A/(A+B-C)。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了CHO HCP 2D银染的照片；
图2显示了免疫磁珠捕获HCP的2D银染照片；
图3显示了免疫磁珠捕获HCP的2D银染照片；
图4显示了免疫磁珠捕获HCP的2D银染照片；
图5显示了常规二维聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质免疫印迹方法(2D-WB法)得到的2D银染照片；
图6显示了常规二维聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质免疫印迹方法(2D-WB法)得到的Western Blot照片；
图7显示了本发明方法原理图；
图8显示了2D-WB方法覆盖率分析示意图；
图9显示了本发明方法覆盖率分析示意图；
图10显示了通过PDQuest分析图1银染图结果；
图11显示了通过PDQuest分析图2银染图结果
图12显示了通过PDQuest软件对本发明方法实验结果的一致性分析；
图13显示了通过PDQuest软件计算HCP检测用多克隆抗体的覆盖率；
图14显示了本发明设备的示意图；和
图15显示了本发明设备的进一步优化的实施方式的示意图。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现先将HCP多克隆抗体偶联于固体基材，再利用这种固体基材捕获HCP样品中的蛋白，随后分离所捕获的HCP蛋白并检测HCP样品中的蛋白总数和所捕获蛋白的数量就能够获得HCP多克隆抗体的覆盖率。本发明的方法操作简便、条件可控、结果可靠，并且在各次操作之间能够具备很高的一致性。在此基础上完成了本发明。
术语定义
HCP
本文所述的“HCP”、“宿主细胞蛋白”具有相同的含义，均是指宿主细胞来源的蛋白质。
目前，不同的细胞表达系统被用于生产医药产品，如细菌(大肠杆菌、荧光假单胞菌)、酵母(酿酒酵母、毕赤酵母)、哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠骨髓瘤细胞系NS0等)，昆虫细胞(杆状病毒感染的草地贪夜蛾细胞)和植物(烟草、拟南芥、水稻)的细胞。在特定的培养条件和制造工艺下，特定宿主细胞的特定HCP谱是独特和特异的。取决于所使用的宿主细胞和生产工艺，HCP可以在等电点(3-11)和疏水性方面发生变化，并且HCP显示出宽范围的分子量(从～5kDa到至少～250kDa)。根据宿主细胞和培养条件，上游样品中的HCP数量可以从几百到一千多种蛋白质。
在哺乳动物细胞中，重组蛋白通常与许多HCP一起从细胞分泌到细胞培养液中。残留HCP有可能影响产品的质量、安全性和有效性。生物制品中HCP的主要问题是可能诱导机体产生抗HCP抗体，而这些抗体可能会引起患者产生临床症状。此外，HCP可能作为免疫佐剂诱导产生抗药抗体，影响药物安全性或有效性。HCP对产品本身的质量也有直接的影响。例如，有蛋白水解功能的HCP，即使存在极少量的HCP，也能逐渐水解产品蛋白，减弱或消除产品的生物学效力，或者改变产品的稳定性。
HCP检测方法
鉴于生物制品中的宿主细胞残留蛋白会导致过敏反应或潜在毒性等不良临床反应风险。因此必须建立合适的HCP检测验证方法来严格控制生物制品的质量。夹心法免疫测定是最常用的HCP检测方法，包括比色、电化学发光(ECL)、化学发光、放射性等方式。目前生物制品行业多以商业化的通用型HCP ELISA试剂盒(如Cygnus Technologies)来检测产品中的宿主蛋白残留。
免疫测定方法依赖于尽可能广泛地识别进入下游纯化过程HCP群体的抗体；因此，用多克隆抗体设计的夹心免疫测定法是HCP监测和定量的首选方法。但宿主细胞的分泌型蛋白和部分死亡细胞释放的结构蛋白成分复杂，不同的工艺，加上相关基因产物需要经过独特的翻译后修饰，这些都大大增加了HCP的品种数量和生化复杂性。因此，通用型商品化HCP ELISA试剂盒中的多克隆抗体对宿主残留蛋白的特异性问题很难进行评估。若商品化ELISA试剂盒中的多克隆抗体特异性和适用性不够高，则会带来漏检HCP的风险，从而对生物制品质量安全带来风险。
因此，世界各地的监管部门比如FDA，CFDA对生物制品企业使用的商品化HCPELISA试剂盒需要提供相关证明，需要证明该ELISA试剂盒中使用的抗体与已知工艺流程中发现的大量HCP可以广泛反应，即试剂盒适用性或抗原覆盖率验证。在申报临床实验时每个企业都需要提供相关的数据来证明这一点，进而继续进行接下来的研发工作。
目前，本领域已经为此项验证开发了各种技术，例如抗体亲和提取方法或2D-WB法。然而，抗HCP树脂制备难，抗体亲和提取方法的工艺太过复杂，结果取决于树脂负载和洗脱条件，难以重复；抗体使用量大，时间成本和经济成本均非常高；高亲和力的HCP难以洗脱，导致覆盖率偏低，低浓度蛋白可能漏检。抗体相对HCP固定的方式导致结合的效率大打折扣。因此，目前本领域广泛采用的HCP检测用多克隆抗体覆盖率验证方法是二维聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质免疫印迹(2D SDS-PAGE/Western blot，2D-WB)。在该方法中，蛋白基于等电点和分子量的不同而在凝胶上通过SDS-PAGE方法被分离。其中一张凝胶作银染，另一张凝胶的蛋白转到PVDF膜或硝酸纤维素膜上，随后结合ELISA试剂盒中的抗体进行Western Blotting检测。两张图片通过电子手段进行叠加，然后计算分析覆盖率。
然而，由于该实验方法本身存在一定局限性和无法避免的缺陷。例如，在实际运用中，该方法存在很多缺点，例如HCP抗原是变性的，可能不代表在ELISA检测中所见的抗原，从而可能将合格的产品误判为不合格；转膜过程会造成蛋白丢失，从而可能将不合格的产品误判为合格；检测过程受操作的影响很大，从而造成检测结果的重复性差，不同实验室和人员做出来的结果差别大；广泛的HCP谱使转移效率难以优化，导致由于通过膜的过度转移或者不能从凝胶转移而低估；印迹膜作Western Blotting后，浓度高的点往往会模糊，分辨不清，导致印迹和凝胶之间的点很难匹配并且没有标准化等。
为克服现有技术中的各种HCP检测用多克隆抗体覆盖率验证方法的缺陷，本发明人创造性地将HCP检测用多克隆抗体固定于固体基材；将固定有所述多克隆抗体的固体基材与HCP样品接触，从而捕获所述HCP样品中能够与所述多克隆抗体发生特异性结合的蛋白；然后分离捕获的蛋白与所述多克隆抗体；再检测与所述多克隆抗体特异性结合的蛋白的数量A以及HCP样品中蛋白的总数量B；最后利用数量A和总数量B之比得到所述多克隆抗体的覆盖率。
本发明人进一步注意到，当采用二维电泳方法检测HCP样品中蛋白的总数量时，可能会因为HCP样品浓度过高或者电泳检测的灵敏度不够高造成电泳凝胶上的条带或斑点无法区分，即，可能一个条带或斑点中包含多个蛋白，从而造成检测得到的HCP样品中的蛋白总数量低于实际的蛋白总数量；而抗体检测的灵敏度高于电泳，因此可能出现检测得到的HCP样品中的蛋白总数量中可能遗漏了一些蛋白，而这些遗漏的蛋白能够与抗体结合，从而包括在能够与抗体特异性结合的蛋白的数量中，进而过高评估HCP检测用多克隆抗体的覆盖率，即，有可能将覆盖率不合格的产品评估为合格产品。
为此，本发明可以采用进一步优选的实施方式，即，在检测与所述多克隆抗体特异性结合的蛋白的数量A以及HCP样品中蛋白的总数量B之余，进一步检测它们两者之间具有相同的分子量和等电点的蛋白的数量C；最后利用数量A和总数量B加数量A减数量C之比，即，根据公式：A/(A+B-C)得到所述多克隆抗体的覆盖率。
本领域技术人员可以理解，上述优选的实施方式也可以作为对本发明的基本方法，即，检测A与B之比的验证，从而能够更客观、准确地验证HCP检测用多克隆抗体的覆盖率。上述优选的实施方式的计算方法如图13所示。
基于本发明的教导，本领域技术人员可以理解，本发明方法所用的固体基材可以是本领域常规使用的各种固体基材，只要该固体基材适用于固定抗体即可。例如，所述固体基材包括但不限于：磁珠、晶片、琼脂糖珠、树脂微球的形式且其上带有NH2-、COOH或NHS化学基团。在优选的实施方式中，所述固体基材是磁珠，从而可以在固体基材上的多克隆抗体从HCP样品中特异性捕获蛋白后，通过磁性方式分离固体基材与HCP样品，而无需离心。如此的液相反应具备反应充分，速度快，效率高，时间短(可在3小时内完成HCP捕获)等优点，减少了抗体使用量和实验时间。
基于本发明的教导和本领域的公知常识，本领域技术人员还可以理解，在将所述多克隆抗体固定于固体基材后，可以封闭所述固体基材上的其它活性位点以免捕获HCP样品中不能与所述多克隆抗体特异性结合的蛋白。例如利用Tris-HCl缓冲液或磷酸缓冲液配置的牛血清白蛋白或酪蛋白溶液封闭固体基材。
在利用固定有所述多克隆抗体的固体基材从所述HCP样品捕获能够与所述多克隆抗体发生特异性结合的蛋白后，还可以对所述固体基材进行洗涤以除去非特异性结合的蛋白。因此，在优选的实施方式中，本发明的方法还任选包括进行洗涤以除去非特异性结合蛋白的步骤。
在所述多克隆抗体特异性结合HCP样品中的蛋白后，可以采用常规方式解离所述多克隆抗体与所结合的蛋白。例如，利用尿素溶液或甘氨酸溶液(pH 1.0～4.0)解离所述多克隆抗体与所结合的蛋白。而在解离所述多克隆抗体与所结合的蛋白之后，可以采用常规方法，例如磁性分离的方式除去固定有所述多克隆抗体的固体基材，从而将与多克隆抗体结合的蛋白与固定有所述多克隆抗体的固体基材分开，以供检测与所述多克隆抗体特异性结合的蛋白的数量A。
本领域技术人员知晓检测所述多克隆抗体特异性捕获的蛋白的数量以及HCP样品中蛋白的总数量的各种方法，包括但不限于：2D电泳、2D-DIGE、HPLC、质谱、UPLC-MS等等。
基于本发明的教导，本领域技术人员可以想到各种方式来实施本发明。例如，在具体的实施方式中，可以通过制备HCP多克隆抗体偶联磁珠来结合HCP中的蛋白，然后洗脱结合的HCP蛋白，最后洗脱液通过二维电泳和银染的方法对比分析来计算HCP抗体的覆盖率。
在本发明的验证HCP检测用多克隆抗体的覆盖率的方法的基础上，本发明人还提供了实施所述方法的设备；即，评估HCP检测用多克隆抗体的覆盖率的设备，所述设备中包括用于实施上述本发明方法的各种具体装置，例如，将HCP检测用多克隆抗体固定于固体基材的装置；将固定有所述多克隆抗体的固体基材与HCP样品接触的装置；使得所述多克隆抗体与所结合的蛋白解离的装置；检测与所述多克隆抗体特异性结合的蛋白的数量A以及HCP样品中蛋白的数量B的装置；和计算数量A与数量B之比，得到HCP检测用多克隆抗体的覆盖率的装置。
基于本发明的教导，本领域技术人员知晓上述设备中的各装置。例如，将HCP检测用多克隆抗体固定于固体基材的装置中可以装有适合的固体基材包括但不限于：磁珠、晶片、琼脂糖珠、树脂微球的形式且其上带有NH2-、COOH或NHS化学基团，以及将所述多克隆抗体固定于固体基材必需的器件，例如漩涡震荡器、磁力架、旋转混匀仪；将HCP检测用多克隆抗体固定于固体基材的装置中还任选包括在所述多克隆抗体固定于固体基材后封闭所述固体基材的装置。
再例如，将固定有所述多克隆抗体的固体基材与HCP样品接触的装置中可以装有，例如(但不限于)用于容纳所述固体基材与HCP样品的容器、转移所述固体基材与HCP样品的器件以及将所述固体基材与HCP样品接触的器件。将固体基材与HCP样品接触的装置中还任选包括除去非特异性结合蛋白的器件。
为更客观、准确地验证HCP检测用多克隆抗体的覆盖率，如上所述，本发明的方法还包括检测与所述多克隆抗体特异性结合的蛋白以及HCP样品中总蛋白之间具有相同的分子量和等电点的蛋白的数量；最后利用数量A和总数量B加数量A减数量C之比，即，根据公式：A/(A+B-C)得到所述多克隆抗体的覆盖率。相应地，实施本发明方法的设备也包括检测与所述多克隆抗体特异性结合的蛋白以及HCP样品中蛋白之间具有相同的分子量和等电点的蛋白的数量C的装置；和根据公式：A/(A+B-C)计算得到HCP检测用多克隆抗体的覆盖率的装置。
在具体的实施方式中，将所述HCP检测用多克隆抗体固定于固体基材的装置包括固体基材以及将所述多克隆抗体固定于固体基材必需的器件；将所述多克隆抗体固定于固体基材必需的器件包括但不限于漩涡震荡器、磁力架、旋转混匀仪；
将固定有所述HCP检测用多克隆抗体的固体基材与HCP样品接触的装置中可以装有，例如(但不限于)用于容纳所述固体基材与HCP样品的容器、转移所述固体基材与HCP样品的器件以及将所述固体基材与HCP样品接触的器件，还任选包括在所述多克隆抗体与HCP样品中的蛋白发生特异性结合后，除去非特异性结合蛋白的器件；例如在所述多克隆抗体与HCP样品中的蛋白发生特异性结合后，利用PBS缓冲液洗涤所述固体基材以便除去非特异性结合的蛋白的器件；
使得所述多克隆抗体与所结合的蛋白解离的装置包括但不限于旋转混匀仪、漩涡震荡器、磁力架等等；
检测与所述多克隆抗体特异性结合的蛋白的数量以及HCP样品中蛋白的数量的装置包括但不限于实施2D电泳、2D-DIGE、HPLC、质谱、UPLC-MS的装置。
在具体的实施方式中，可以利用本领域的各种常规装置，例如计算机计算进行各数量之比，从而获得多克隆抗体的覆盖率。在获得覆盖率之后，还可以通过输出装置输出所述覆盖率。因此，本发明的设备还可以任选包括输出所得覆盖率以及所评估的HCP检测用多克隆抗体的覆盖率是否合格的装置。
实施本发明方法的设备以及进一步优化设备的示意图如图14和15所示。
本发明的优点：
1.本发明方法与实际测试方法ELISA夹心免疫测定相似，因此HCP可以在原生条件下结合与固体基材偶联的抗体，因此可用于实际检测；
2.本发明的方法只需要二维电泳和银染，不需要转膜，因此操作方便，可自动化；
3.本发明方法的偶联、洗脱条件可重复，因此结果的重复性好、重现性高；和
4.本发明方法优选采用免疫磁性分离技术，不用离心，液相反应，反应充分，速度快，效率高，可在3小时内完成HCP捕获，因此捕获效率高；和
5.本发明方法能够更客观、准确地验证HCP检测用多克隆抗体的覆盖率，而不会将覆盖率不合格的产品误判为合格，也不会将覆盖率合格的产品误判为不合格。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料与方法：
实验用材料：
NHS基团修饰的磁珠：购自美国Thermo Fisher Scientific公司；
CHO HCP蛋白：CHO K1细胞培养收集细胞培养上清；
HCP多克隆抗体：购自Cygnus公司，anti-CHO HCP Ab(3G-0016-AF)；
磁珠洗涤液：1mM HCl溶液；
偶联缓冲液：200mM NaHCO3，pH 8.3；
封闭缓冲液：100mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0；
洗脱液：8M尿素。
方法
基于磁珠偶联HCP多克隆抗体方法分析HCP抗体覆盖率
1.磁珠偶联HCP多克隆抗体制备
1.1CHO HCP溶液配制：
取适量的待偶联CHO HCP用偶联缓冲液溶解配制，浓度大于3mg/ml。注：需通过透析或者脱盐的方式事先去除蛋白原液中含伯胺基的物质。
1.2取磁珠悬液500μl于1.5ml离心管中，将离心管置于磁性分离器上，富集磁珠，去除上清液。
1.3加1ml 4℃预冷的磁珠洗涤液，涡旋15s，使磁珠充分混匀。
1.4将离心管置于磁性分离器上，富集磁珠，去除上清液。
1.5加总量为0.2mg-0.6mg，体积为200μl-400μl的CHO HCP抗体，涡旋30s，使其充分混合，室温条件下在旋转混匀仪上2-4h，然后4℃过夜。
1.6将离心管置于磁性分离器上，富集磁珠，去除上清液。
1.7加1ml封闭缓冲液于离心管中，涡旋30后将离心管置于磁性分离器上，富集磁珠，弃上清。
1.8重复步骤1.7四次
1.9加1ml封闭缓冲液于离心管中，涡旋30后将离心管置于旋转混匀仪上2h。
1.10将离心管置于磁性分离器上，富集磁珠，去除上清液。
1.11加1ml超纯水于离心管中，充分混合，用磁性分离器富集磁珠，弃上清液。
1.12加1ml PBS缓冲液于离心管中，洗涤2次，最后一次加入500μl PBS缓冲液，含总浓度为0.01％-0.05％的柳硫汞，4℃长期保存。
2.利用CHO HCP抗体偶联磁珠，评估HCP抗体的覆盖率。
2.1取上述制备的磁珠置于磁性分离器上，富集磁珠，去除上清液。
2.2加入5％BSA溶液，室温条件下在旋转混匀仪上孵育2h。
2.3将离心管置于磁性分离器上，富集磁珠，弃上清。
2.4加1ml PBS缓冲液洗涤15s，将离心管置于磁性分离器上，富集磁珠，去除上清液。
2.5重复上述步骤4次。
2.6加入CHO HCP抗原(体积200μl-400μl，浓度大于1mg/ml)，室温条件下在旋转混匀仪上孵育2h。
2.7将离心管置于磁性分离器上，富集磁珠，去除上清液。
2.8加1ml PBS缓冲液洗涤15s，将离心管置于磁性分离器上，富集磁珠，去除上清液。
2.9重复上述步骤3次。
2.10加洗脱液200μl，室温条件下在旋转混匀仪上孵育15min。
2.11将离心管置于磁性分离器上，富集磁珠，收集上清液。
2.12再重复上述步骤两次，三次的上清液混合后超滤浓缩。
2.13取适量上清液，用Bradford法测定蛋白浓度。
3.上述取得的上清液按如下实验方法分析：
3.1双向电泳及银染
3.1.1第一向等电聚焦
1)从-20℃冰箱取出2条18cm胶条，放置IPG泡胀盘，室温平衡20min。
2)样品12000rpm离心5min，然后按照18cm胶条的优化上样量用水化液补至340ul，用枪将混合好的溶液小心加入胶条槽中。
3)用镊子夹住IPG胶条碱性端将胶条的保护膜撕下，胶面朝下，先将IPG胶条酸性端朝胶条槽的尖端(正极)方向放入胶条槽中慢慢下压胶条，避免产生气泡，最后放下IPG胶条碱性端，使水化液浸湿整个胶条，放置过夜(胶条标记+为酸性端，标记—为碱性端)。
4)将等电聚焦电泳仪(IPGphor3)先调整水平，将陶瓷的聚焦槽放在等电聚焦电泳仪上，将胶条转移到聚焦槽中胶面朝上，并确定胶条位于胶条槽中央，胶条酸性端放在等电聚焦电泳仪正极，胶条碱性端放在等电聚焦电泳仪负极，将湿的电极滤纸片(用150ulddH2O润湿)放在胶条的两端(大致滤纸片的三分之一放在胶面上)。
5)将电极夹放在胶条的两端，使电极夹的电极丝压在两个电极滤纸片的外缘约1/3处，旋转凸轮至Manifold胶条外缘下的位置，将电极安装入位，每根胶条上面覆盖足够的矿物油。
6)设置聚焦仪器18cm胶条的程序，设置如下：
聚焦程序(2gels)
7)聚焦开始后配置SDS-PAGE大胶，待跑第二向SDS-PAGE电泳。
3.1.2第二向SDS-PAGE电泳
1)根据Bio-Rad垂直电泳系统玻璃板安装说明进行安装玻璃板。
2)制备分离胶(15％)，将分离胶混匀后立即灌注于玻板间隙中，上层小心覆盖一层异丙醇，将胶板垂直放于室温下，待分离胶聚合完全后，倾去上铺异丙醇，用滤纸吸干。
3)聚焦结束将胶条用双蒸水清洗三次，用镊子夹着胶条立着控一下水，将胶条放在胶条槽中加入已加DTT的5ml/1根胶条平衡液，在摇床上摇15min，弃掉加DTT的平衡液，再加入已加入碘代乙酰胺的5ml/1根胶条平衡液，在摇床上摇16min,弃掉平衡液。(5ml平衡液母液加DTT 0.05g，5ml平衡液母液加碘代乙酰胺0.125g)
4)将平衡好的胶条从含碘代乙酰胺平衡液中取出，在滤纸上滴净平衡液，用1X电泳缓冲液冲洗一下。
5)用镊子夹住胶条两端，支撑面朝下，胶面朝上，平躺放于三明治长板高出部分，此时应与玻璃长板紧密结合。
6)将三明治玻璃板竖直放置在架子上，用注射器针头，将胶条沿着玻璃板向下推直至与胶面紧密接触(针头用力位置在胶条的支撑面，不能接触到胶面，以免划伤胶面)，剪一小块滤纸片置于胶条+极旁边并加10μl Marker。
7)用1ml移液器将配制好的低熔点琼脂糖沿一端加入三明治胶中，低熔点琼脂糖溶液将沿着胶面向另一端移动，排除胶条与SDS-PAGE凝胶胶面之间的气泡。
8)在低熔点琼脂糖未凝固时，用针头将胶条向下推，直至与SDS-PAGE胶面紧密接触并排除气泡。
9)带低熔点琼脂糖凝固后，然后将胶板固定于电泳装置上，上下槽各加入电泳缓冲液。设置程序：2w-1h(1w每胶条)，28w-5h(14w每胶条)，开始电泳直至溴酚蓝达到胶底部，关闭电源。
10)电泳完成后拨出凝胶，其中一块凝胶使用低背景银染试剂盒进行染色，步骤按照试剂盒说明书进行。
11)结果通过PDQuest分析评估抗体的覆盖率。
4.二维电泳和Western Blot实验，分析CHO HCP抗体的覆盖率
4.1二维电泳跑两块大胶，具体步骤见上述3中双向电泳部分，其中一块胶银染，另外一块胶做Western blot分析。
4.2western blot实验步骤如下：
1)电泳完成后小心拔出凝胶，放入已经配置好的转移液中。分别裁剪与凝胶大小一致的滤纸和硝酸纤维素膜，并放置于转移液中。
2)打开半干转印仪盖，按照滤纸-膜-凝胶-滤纸的顺序，从下到上放置，消除气泡放上盖子，20V恒压转印40min。
3)取出膜在PBST中洗涤1次，在5％的BSA(用PBST配置)中封闭1h后，使用1％BSA(用PBST配置)将合适浓度的HCP抗体并敷上，4度孵育过夜。
4)次日从4℃冰箱取出膜，摇床上温育30min后倒掉一抗，在PBST中洗涤3次，每次5min。
5)使用PBST以1:15000稀释荧光二抗，并在室温避光孵育1h。
6)取出膜在PBST中避光洗涤3次，每次5min。
7)使用双模式多光谱激光成像系统在仪器上扫描硝酸纤维素膜，并拍照保存。
8)结果通过PDQuest分析评估抗体的覆盖率。
实施例
实施例1
如“材料与方法”部分所述，本发明人分析了HCP多克隆抗体抗体的覆盖率。
结果如图1和图2所示(其中图1显示了CHO HCP的2D银染照片，图2显示了与HCP多克隆抗体偶联的免疫磁珠进行蛋白捕获的2D银染照片)，通过PDQuest软件分析(结果见图10和图11)得到的所检测的HCP多克隆抗体的覆盖率可以达到78.5％，软件分析结果如图所示。
实施例2.
本发明人重复了本发明的方法，利用与磁珠偶联的HCP多克隆抗体捕获CHO HCP中的蛋白，随后对所捕获的蛋白进行2D银染。两次实验的结果如图3和图4。
实验结果表明，两次不同实验结果之间的比对率达到82.3％(分析结果见图12)，从而证明本发明的方法所得结果的一致性非常高。
实施例3.
本发明人采用本领域中的主流方法，即，2D-WB方法，利用相同的样品分析了HCP多克隆抗体抗体的覆盖率。结果如图5和6所示，其中图5显示CHO HCP的2D银染照片，图6显示了Western Blot照片。
从本实施例的结果可以看出，采用2D-WB方法得到的CHO HCP抗体的覆盖率仅为35.5％，从图6所示照片也可以明显看出2D/WB实验中小分子量的蛋白斑点没有显现出来。
因此，常规的2D-WB方法会将合格产品误判为不合格产品。
实施例4.
考虑到抗体检测的灵敏度高于电泳，因此，电泳检测得到的HCP样品中蛋白的总数量可能低于实际的蛋白总数量。
为此，本发明人另取HCP样品，检测与多克隆抗体特异性结合的蛋白的数量A、HCP样品中的蛋白的数量B以及与所述多克隆抗体特异性结合的蛋白和HCP样品中的总蛋白之间具有相同的分子量和等电点的蛋白的数量C；并根据公式：A/(A+B-C)得到所述多克隆抗体的覆盖率。
实验结果如图13所示，其中与多克隆抗体特异性结合的蛋白的数量A是“334+142”、HCP样品中的蛋白数量B是“380+334”、与所述多克隆抗体特异性结合的蛋白和HCP样品中的总蛋白之间具有相同的分子量和等电点的蛋白的数量C是“334”，计算得到所述多克隆抗体的覆盖率为(334+142)/(“334+142”+“380+334”-“334”)＝55.6％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (12)
1.一种评估HCP检测用多克隆抗体的覆盖率的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将所述HCP检测用多克隆抗体固定于固体基材，从而得到固定有所述HCP检测用多克隆抗体的固体基材；
(2)将步骤(1)所得的固定有所述HCP检测用多克隆抗体的固体基材与HCP样品接触，从而使得所述多克隆抗体与HCP样品中的蛋白发生特异性结合；
(3)使得所述多克隆抗体与所结合的蛋白解离；
(4)检测与所述多克隆抗体特异性结合的蛋白的数量A以及HCP样品中蛋白的数量B；和
(5)计算数量A与数量B之比得到HCP检测用多克隆抗体的覆盖率。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(4)后进行步骤(4-1)：检测所述多克隆抗体特异性结合的蛋白以及HCP样品中蛋白之间具有相同的分子量和等电点的蛋白的数量C；和
相应地，在步骤(5)中是根据以下公式计算得到HCP检测用多克隆抗体的覆盖率：A/(A+B-C)。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述固体基材包括但不限于：磁珠、晶片、琼脂糖珠、树脂微球。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述固体基材是磁珠。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中还包括在所述HCP检测用多克隆抗体固定于固体基材后封闭所述固体基材的步骤。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，在所述多克隆抗体与HCP样品中的蛋白发生特异性结合后，还任选包括除去非特异性结合蛋白的步骤。
7.一种评估HCP检测用多克隆抗体的覆盖率的设备，所述设备包括：
(1)用于将所述HCP检测用多克隆抗体固定于固体基材的装置；
(2)将固定有所述HCP检测用多克隆抗体的固体基材与HCP样品接触的装置；
(3)使得所述多克隆抗体与所结合的蛋白解离的装置；
(4)检测与所述多克隆抗体特异性结合的蛋白的数量A以及HCP样品中蛋白的数量B的装置；和
(5)计算数量A与数量B之比，得到HCP检测用多克隆抗体的覆盖率的装置。
8.如权利要求7所述的设备，其特征在于，所述装置(1)包括盛放所述固体基材和所述多克隆抗体的容器以及将所述多克隆抗体固定于固体基材的器件。
9.如权利要求7所述的设备，其特征在于，所述装置(2)包括但不限于用于容纳所述固体基材与HCP样品的容器、转移所述固体基材与HCP样品的器件以及将所述固体基材与HCP样品接触的器件。
10.如权利要求7所述的设备，其特征在于，所述装置(3)包括旋转混匀仪、漩涡震荡器、磁力架。
11.如权利要求7所述的设备，其特征在于，所述装置(4)包括但不限于实施2D电泳、2D-DIGE、HPLC、质谱、UPLC-MS的器件。
12.如权利要求7所述的设备，其特征在于，所述装置(4)是检测与所述多克隆抗体特异性结合的蛋白的数量A、HCP样品中蛋白的数量B和与所述多克隆抗体特异性结合的蛋白以及HCP样品中蛋白之间具有相同的分子量和等电点的蛋白的数量C的装置；和
相应地，所述装置(5)是根据以下公式计算得到HCP检测用多克隆抗体的覆盖率的装置：A/(A+B-C)。
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