CN115894677A - 一种提高hcp检测抗体覆盖率的抗体组合及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高HCP检测抗体覆盖率的抗体组合及其应用。所述抗HCP抗体组合使用抗原分别免疫动物后制备得到；所述抗原包括低免疫原性HCP。本发明通过分级HCP免疫的方法进行抗体的制备，通过抗体配比组合优化，使得检测方法获得较高的检测灵敏度，同时满足高覆盖率要求。利用本发明的抗HCP抗体组合可尽可能多地识别含有大量蛋白分子的HCP抗原。

Description

一种提高HCP检测抗体覆盖率的抗体组合及其应用

技术领域

本发明属于检测领域，具体涉及一种提高HCP检测抗体覆盖率的方法。

背景技术

在传统化学药物开发难度及成本越来越大的形势下，目前，由于生物技术类药物的诸多优势，其在全球范围内已得到迅猛的发展。生物技术类药物种类较多，包括重组蛋白类药物，例如单抗，重组蛋白疫苗等；细胞及基因治疗药物(cell and gene therapy，CGT)，例如CAR-T，溶瘤病毒等；mRNA治疗技术，例如mRNA疫苗等。这些生物技术类药物的生产工艺比较复杂，会引入较多的杂质，对药物的质量产生潜在的负面影响，因此监管层对生物技术类药物的质量控制也提出了更高的要求。

目前生物技术类药物始终需要通过工程类细胞，如细菌、酵母或哺乳动物、昆虫或植物细胞系等，来进行原料的生产。经典的重组蛋白表达技术已在许多生物制药产品中得到广泛的应用，主要采用宿主细胞进行外源蛋白质的表达和修饰。CGT药物生产关键物料，如质粒，也是在大肠杆菌中扩增纯化获取。基因治疗的假病毒载体需要在HEK293等细胞内重新合成组装。在这类产品的生产过程中，宿主细胞来源的蛋白质(host cell proteins，HCP)会不可避免地被引入到生产工艺流程中，从而产生最终药品中HCP的残留风险。科学研究已发现生物制药产品中残留HCP的主要危害是其有诱导机体产生抗HCP抗体的可能性，这些抗体可能会引起患者产生临床症状。此外，HCP可能作为免疫佐剂，诱导产生抗药抗体，影响药物安全性或有效性，因此全球各个国家的监管机构对HCP残留都有严格的限量要求。

目前，HCP的分析检测方法较多，其中HCP ELISA方法由于其操作方便快捷，成本较低，检测通量较高等优点，已被监管机构和企业广泛运用于纯化工艺开发和原液的放行检中。HCP ELISA检测方法原理是采用多克隆抗体的双抗体夹心法，其中关键点之一是采用的多克隆抗体能识别尽可能多的HCP，即高覆盖率，否则会导致漏检的风险。高覆盖率的HCP抗体是HCP ELISA检测方法验证的关键参数之一。由于HCP是多种蛋白质的复合物，分子量从5kDa到250kDa，等电点在3-11区间，常规方法制备的抗体覆盖率往往不够理想，并且直接导致实际样本的检测适用性低，漏检的风险高。

发明内容

为了克服上述样本检测适用性低、覆盖率低，且检测灵敏度、检测效率不高的缺陷，本发明提供一种提高HCP检测抗体覆盖率的方法。

本方法是针对HCP抗原，其含有上千种以上的蛋白分子，如何使获得的多克隆抗体尽可能多地识别这些HCP抗原是目前需要解决的关键问题。从动物产生抗体的免疫学原理来理解，需要合适的抗原量，免疫周期和途径等方面进行优化。并且抗原本身分子量大小也会影响抗体的产生。因此，用总的HCP抗原免疫会导致对某些HCP抗原的免疫反应较弱，无法获得抗体。

本发明通过将低分子量分离，提升对低分子量HCP抗原的免疫反应。通过将HCP抗原中高丰度或高分子的容易产生抗体和HCP抗原分离，加强对免疫原性低的抗原的免疫反应。

为了解决现有技术的缺陷，本发明第一方面提供一种抗HCP抗体组合，使用抗原分别免疫动物后制备得到各抗体的组合；所述抗原包括低免疫原性HCP，优选还包括以下抗原中的一种或多种：宿主细胞总HCP(host cell proteins)、低分子量HCP和高分子量HCP所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞；优选所述真核细胞为CHO细胞，所述原核细胞为大肠杆菌，所述大肠杆菌例如为Escherichia coli。

在某些实施例中，所述低免疫原性HCP为所述宿主细胞总HCP经纯化得到的产物，和/或，所述低分子量HCP为分子量小于55KDa例如小于50KDa的HCP，例如分子量为：10KDa≤分子量<55KDa，和/或，所述高分子量HCP为分子量高于55KDa例如高于60KDa的HCP，例如分子量为：55KDa≤分子量≤250KDa；和/或，所述动物为哺乳动物优选羊例如绵羊。

在某些实施例中，所述抗原包括宿主细胞总HCP、低分子量HCP和低免疫原性HCP，或宿主细胞总HCP、低分子量HCP、高分子量HCP和低免疫原性HCP；由此得到的抗HCP抗体组合包括抗低免疫原性HCP抗体、抗总HCP抗体和抗低分子量HCP抗体，或抗低免疫原性HCP抗体、抗总HCP抗体、抗低分子量HCP抗体和抗高分子量HCP抗体。

在某些实施例中，获得所述宿主细胞总HCP的步骤包括：

(1)将宿主细胞例如E.coli BL21的菌溶液与裂解溶液混合例如以1:10的比例混合，混匀，获得混合菌液；所述菌溶液例如利用宿主细胞菌体与水混合而成；

(2)将所述混合菌液破碎后获得破碎菌液；

(3)将所述破碎菌液离心后获得的上清液即为宿主细胞总HCP；或，

所述宿主细胞总HCP通过以下步骤获得：将所述宿主细胞进行浓缩例如使用PEG20000进行浓缩，即得。

优选地，步骤(1)中，所述裂解溶液是由0.2M NaHCO₃溶液和蛋白酶抑制剂混合而得，pH为8.0-9.0例如为8.3；

步骤(2)中，所述破碎的压力为1000-1500bar例如1200bar，和/或，所述破碎的温度为10℃；所述破碎使用可细胞破碎仪等本领域常用的破碎仪器。

步骤(3)中，所述离心的速度为10000-15000g例如12000g，和/或，所述离心的温度为4℃。

在某些实施例中，所述低分子量HCP的制备方法为将所述宿主细胞总HCP经分子筛层析获得洗脱液，所述洗脱液即为所述低分子量HCP。

优选地，所述分子筛层析的步骤包括：进行平衡、进样、洗脱和收集洗脱液。

更优选地，所述平衡和洗脱使用的溶液为0.2M NaHCO₃溶液，和/或，

所述分子筛层析使用HiLoad 16/600Superdex 200pg层析柱；和/或，

所述洗脱液还进行了浓缩。

在某些实施例中，所述低免疫原性HCP由所述宿主细胞总HCP经FPLC纯化获得。

优选地，所述FPLC的步骤包括：

所述宿主细胞总HCP经过滤例如0.22μm滤膜过滤后上样，洗脱并收集洗脱液，即得所述低免疫原性HCP。

更优选地，所述FPLC的流动相为：流动相A：PBS，pH 7.4，收集流穿液；

切换流动相B：0.075％ PBST，pH 7.4；

切换流动相C：0.1M Gly-HCl，pH 2.5。

在某些实施例中，所述FPLC使用偶联抗体纯化柱，制备所述偶联抗体纯化柱的步骤包括：

(a)用酸例如0.1M HCl清洗NHS活化胶；

(b)将所述抗总HCP抗体与所述NHS活化胶混匀，离心去除上清液；所述混匀例如为室温下旋转2h；

(c)加入0.1-0.5M Tris-HCl例如0.1M Tris-HCl，pH8.0，混匀并孵育，使所述抗总HCP抗体与所述NHS活化胶发生偶联；所述混匀例如在室温下旋转2h，所述孵育例如在2-8℃培养15-20h；

(d)用缓冲液例如PBS清洗，将偶联合格例如偶联率>90％的填料进行装柱。

优选地，所述的抗HCP抗体组合由抗总HCP抗体、抗低分子量HCP抗体和抗低免疫原性HCP抗体组成，优选其比例为(1～2):(1～2):1，例如为1:1:1。

本发明第二方面提供一种试剂盒，其包括如本发明第一方面所述的抗HCP抗体组合。优选地，还包括免疫相关的检测试剂，如缓冲液，例如PBS缓冲液。

上述免疫相关的检测试剂包括本领域技术人员常规所用的试剂。

本发明第三方面提供一种检测HCP的方法，所述方法包括：

将如本发明第一方面所述的抗HCP抗体组合或如本发明第二方面所述的试剂盒的抗HCP抗体组合中的各抗体按比例混合后进行检测。优选地，抗总HCP抗体、抗低分子量HCP抗体和抗低免疫原性HCP抗体的比例为(1～2):(1～2):1；更优选地为1:1:1。

适用于本发明的覆盖率的检测方法可为若干种，除了IMBS-2D，还可为2D-WB、IAC-2D、质谱等本领域常规检测覆盖率的方法。

本发明第四方面提供如本发明第一方面所述的抗HCP抗体组合或本发明第二方面所述的试剂盒在检测HCP或者制备检测HCP的诊断剂中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明通过分级HCP免疫的方法进行抗体的制备，包括总HCP蛋白，低分子量HCP蛋白(low molecular weight，LMW)，低免疫原性HCP蛋白，这3种抗原进行动物免疫，获得高效价的抗体。然后，通过抗体配比组合优化，使得检测方法获得较高的检测灵敏度，同时满足高覆盖率要求。

附图说明

图1为分子筛分离液相层析图。

图2为非还原变性SDS-PAGE(12％胶浓度)电泳结果；M：标准蛋白分子量；1-14：从头收集的各区间HCP组分。

图3为低免疫原性HCP制备液相色谱。

图4为组合抗体覆盖率分析结果。

图5为不同组合抗体2D电泳银染结果。

图6为A3S和A4S抗体IMBS/2D电泳银染结果。

图7为收集的低分子样本的分子量的非还原变性SDS-PAGE(12％胶浓度)电泳结果；Mark：标准蛋白分子量。

图8为收集低分子量(LMW)HCP抗原的图谱。

图9为收集低免疫原性HCP抗原的图谱。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1大肠杆菌分级HCP抗原和抗体制备

1.1总HCP抗原及其相应抗体的制备

(1)配制0.2M NaHCO₃溶液，按比例加入100×蛋白酶抑制剂(供应商Roche，货号11697498001)，调节pH 8.3作为大肠杆菌表达菌(E.coli-BL21)的裂解溶液。

(2)取适量大肠杆菌表达菌(E.coli-BL21)菌体，置于烧杯中加入适量超纯水解冻，大肠杆菌解冻后以1:10(W/V，单位是g/ml)的比例加入上述裂解溶液，随后在漩涡振荡器中震荡均匀。

(3)将震荡均匀的菌液利用细胞破碎仪破碎，破碎压力为1200bar，循环泵温度控制为10℃，菌液破碎4个循环过程。

(4)将破碎的菌液进行离心(12000g；4℃)，取离心上清液即为大肠杆菌表达菌(E.coli-BL21)HCP(总HCP抗原)，测定其蛋白浓度(约为10-12mg/mL)，并将其分装为5.5mL每管，储存于-80℃冰箱待用。

(5)将总HCP抗原免疫绵羊(方法参见《抗体制备与使用实验指南》第4章多克隆抗体制备)，采血测效价，符合要求(效价大于10⁵)后取血清进行抗体的纯化。采用proteinG亲合方法纯化1.1中获得的羊IgG抗体，采用bradford方法测定浓度大于1.0mg/mL。采用SDS-PAGE电泳方法进行染色评价抗体纯度，要求达到90％以上。此步获得总HCP抗体(即大肠杆菌表达菌HCP)。

1.2低分子量(LMW)HCP抗原及其相应抗体的制备

本发明采用分子筛层析方法分离HCP，具体步骤如下：

(1)利用0.2M NaHCO₃溶液对HiLoad 16/600Superdex 200pg层析柱进行充分的平衡，流速设定为1mL/min，平衡1.5个CV左右，至基线较平，无明显波动。

(2)取一管储存于-80℃冰箱的上述大肠杆菌表达菌(E.coli-BL21)HCP，用0.22μm一次性针头过滤器进行过滤，取5.5mL打入到蛋白纯化系统FPLC(快速蛋白液相色谱)的5mL样品环中。

(3)执行蛋白纯化系统进样指令，流速设定为1mL/min将样品环中打入的样品打入到HiLoad 16/600Superdex 200pg层析柱中进行分离纯化，进样运行15mL结束进样，继续以1mL/min的流速进行分离纯化，收集92mL-110mL的洗脱液即为低分子量HCP。

(4)待样品运行1.2个CV，谱图回到基线且无明显波动，切换超纯水运行1.2个CV，随后用0.5M NaOH溶液清洗1.5CV，超纯水运行1.2个CV并运行1.2CV的20％乙醇进行保存。

(5)收集HCP利用SDS-PAGE电泳表征其分子量分布，收集低分子量50kd以下的样品，测定浓度0.5mg/ml后用3/5kDa的超滤管进行浓缩，浓度为4-5mg/ml，结果如图1和图2所示。

(6)将(5)收集的抗原进行绵羊动物免疫(方法参见《抗体制备与使用实验指南》第4章多克隆抗体制备)，获得相应的抗低分子量HCP抗体。

1.3低免疫原性HCP抗原及其相应抗体的制备

(1)偶联抗体纯化柱制备。

NHS活化胶(中科森辉)用0.1M HCl(预冷)清洗。与步骤(1)中获得的总HCP抗体(2mg/mL)30mL混合，室温旋转混匀2h，离心去除上清液。用0.1M Tris-HCl pH8.0，室温旋转混匀2h，2-8℃过夜(约17h)，用1×PBS清洗。采用Bradford方法测定流穿液抗体浓度(即不结合的抗体浓度)，计算总体的偶联率>90％。将偶联合格的填料进行装柱，5ml柱体积。

(2)低免疫原性HCP的制备

将1.1中总HCP抗原用1×PBS稀释至2mg/mL，0.22μm滤膜过滤，每次定量环上样5ml。

柱体积5mL，液相条件：1.67ml/min，保留时间为3min。切换流动相A:1×PBS，pH7.4，收集流穿液。切换流动相B:0.075％ PBST，pH 7.4。切换流动相C:0.1M Gly-HCl，pH2.5，4CV，洗脱组分收集：20mL。在收集管中事先添加3mL Tris-HCl进行中和。制备过程层析图谱如图3所示，其中左侧的虚线框为流穿峰，收集样本为低免疫原性HCP，右侧的虚线框为洗脱峰，样本为强免疫原性HCP。

(3)抗体制备

将所述低免疫原性HCP用于绵羊动物免疫(方法参见《抗体制备与使用实验指南》第4章多克隆抗体制备)，获得相应的抗低免疫原性HCP抗体。

实施例2HCP抗体的配比优化，提升试剂盒检测性能

将上述获得的3种HCP抗体，按1:1:1比例混合。采用湖州申科发明专利“一种评估HCP检测用多克隆抗体覆盖率的方法，CN2019101781059”以及实用新型专利“评估HCP检测用多克隆抗体覆盖率的设备，CN201920298412”(以下简称湖州申科IMBS-2D法)进行该抗体组合的覆盖率水平检测，得到较高覆盖率水平的抗体组合，结果如图4所示，覆盖率大于70％。

通过检测体系，捕获抗体的浓度1-10μg/ml，标记抗体浓度0.1-2μg/ml，进行配对分析，提升试剂盒的检测灵敏度，分析性能验证的结果见表1。

操作步骤如下：

1、试剂盒(湖州申科生物技术有限公司，1301301，以下试剂均同)按要求室温平衡后，取出预包被酶标板。

2、加入各浓度校准品，上述制得的样品；(稀释液稀释)100μl/孔；室温，300-500rpm振荡，1h。

3、洗涤：加入1×缓冲液，340μl/孔，3次。

4、加入生物素偶联抗E.coli HCP-E抗体；(稀释液稀释)，100μl/孔；室温，45min。

5、洗涤：加入1×缓冲液,340μl/孔，3次。

6、加SA-HRP；100μl/孔；室温，15min。(稀释液稀释)。

7、洗涤：加入1×缓冲液，340μl/孔，5次。

8、加TMB显色液：100μl/孔；室温，避光15min。

9、加终止液；50μl/孔，避光5min后读数，测450nm和620nm下吸光度。

表1：大肠杆菌HCP检测试剂盒性能验证结果

实施例3不同免疫抗原的抗体配比，提升抗体覆盖率

采用湖州申科的IMBS-2D方法，检测不同免疫原的抗体及组合抗体的覆盖率水平，结果如图5所示，比较总HCP抗体和组合抗体捕获HCP图谱，有三处标示的位点存在显著差异，然而组合抗体2D图谱中标示的方块1和方块3可与抗低免疫原性HCP抗体捕获HCP的2D图谱1和3相匹配，而组合抗体图谱中标示的方块2和方块3也与抗低分子量HCP抗体捕获HCP的2D图谱方块2和方块3相匹配，表明总HCP抗体相较于组合抗体，其捕获HCP丰度偏低，而抗低分子量HCP抗体及抗低免疫原性HCP抗体的加入，提高抗体捕获HCP丰度。

实施例4同种HCP免疫不同批次绵羊的抗体覆盖率

2021年6月，E.coli总HCP经绵羊免疫获得第一批血清，通过Protein G纯化，获得相应抗体，即为A3S抗体；2021年9月，E.coli总HCP经绵羊免疫获得第二批血清，通过Protein G纯化，获得相应抗体，即为A4S抗体。采用湖州申科的IMBS-2D方法，对比A3S和A4S抗体的捕获HCP的覆盖率水平，并用PDQuest(Bio-rad)分析，结果如图6和表2所示，捕获蛋白的总体分布一致，其中A3S图谱有748个点，A4S图谱有820个点，经匹配分析，相同的点有608个，A4S抗体捕获蛋白与A3S抗体的匹配率为81％，表明A4S抗体与A3S抗体的覆盖率水平基本一致。

表2：2D电泳图谱PDQuest分析结果

实施例5CHO分级HCP抗原和抗体制备

5.1总HCP抗原及其相应抗体的制备

取适量CHO细胞培养上清(1mg/mL)130mL，通过PEG20000浓缩12mL，浓度为10mg/mL，即得CHO细胞总HCP。将浓缩后的样本(即CHO细胞总HCP)进行绵羊动物免疫(方法参见《抗体制备与使用实验指南》第4章多克隆抗体制备)，获得相应的总HCP抗体。

5.2低分子量(LMW)HCP抗原及其相应抗体的制备

取7mL的上述浓缩后的样本加载到HiLoad 26/600Superdex 200pg层析柱，以3.0mL/min流速运行(实际流速1.5mL/min)，出峰后以4ml一管收集，图谱如图8所示，收集230-294mL部分为低分子量HCP，后续将对低分子量部分进行常规浓缩。

并通过12％SDS-PAGE的非还原电泳结果显示，收集的低分子样本的分子量≤55kd，如图7所示。将浓缩后的样本进行绵羊动物免疫(方法参见《抗体制备与使用实验指南》第4章多克隆抗体制备)，获得相应的抗低分子量HCP抗体。

5.3低免疫原性HCP抗原及其相应抗体的制备

(1)偶联抗体纯化柱制备。

NHS活化胶与步骤5.1(1)中获得的总HCP抗体混合，室温旋转混匀2h，步骤同1.3(1)。

(2)低免疫原性HCP的制备

将5.1中的CHO细胞总HCP用1×PBS稀释至2mg/mL，0.22μm滤膜过滤，每次定量环上样5ml。制备过程同步骤1.3(2)，层析图谱如图9所示，其中左侧的虚线框为流穿峰，收集样本为低免疫原性HCP，右侧的虚线框为洗脱峰，样本为强免疫原性HCP。

(3)抗体制备

将所述低免疫原性HCP用于绵羊动物免疫(方法参见《抗体制备与使用实验指南》第4章多克隆抗体制备)，获得相应的抗低免疫原性HCP抗体。

Claims (10)

1.一种抗HCP抗体组合，其特征在于，使用抗原分别免疫动物后制备得到各抗体的组合；所述抗原包括低免疫原性HCP，优选还包括以下抗原中的一种或多种：宿主细胞总HCP、低分子量HCP和高分子量HCP；所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞；优选所述真核细胞为CHO细胞，所述原核细胞为大肠杆菌，所述大肠杆菌例如为Escherichia coli。

2.如权利要求1所述的抗HCP抗体组合，其特征在于，所述低免疫原性HCP为所述宿主细胞总HCP经纯化得到的产物，和/或，所述低分子量HCP为分子量小于55KDa例如小于50KDa的HCP，和/或，所述高分子量HCP为分子量高于55KDa例如高于60KDa的HCP；和/或，所述动物为哺乳动物优选羊例如绵羊。

3.如权利要求1或2所述的抗HCP抗体组合，其特征在于，所述抗原包括宿主细胞总HCP、低分子量HCP和低免疫原性HCP，或宿主细胞总HCP、低分子量HCP、高分子量HCP和低免疫原性HCP；由此得到的抗HCP抗体组合包括抗低免疫原性HCP抗体、抗总HCP抗体和抗低分子量HCP抗体，或抗低免疫原性HCP抗体、抗总HCP抗体、抗低分子量HCP抗体和抗高分子量HCP抗体。

4.如权利要求1～3任一项所述的抗HCP抗体组合，其特征在于，获得所述宿主细胞总HCP的步骤包括：

(1)将宿主细胞例如E.coliBL21的菌溶液与裂解溶液混合例如以1:10的比例混合，混匀，获得混合菌液；所述菌溶液例如利用宿主细胞菌体与水混合而成；

(2)将所述混合菌液破碎后获得破碎菌液；

(3)将所述破碎菌液离心后获得的上清液即为宿主细胞总HCP；或，

所述宿主细胞总HCP通过以下步骤获得：将所述宿主细胞进行浓缩例如使用PEG20000进行浓缩，即得；

优选地，步骤(1)中，所述裂解溶液是由0.2M NaHCO₃溶液和蛋白酶抑制剂混合而得，pH为8.0-9.0例如为8.3；

步骤(2)中，所述破碎的压力为1000-1500bar例如1200bar，和/或，所述破碎的温度为10℃；

步骤(3)中，所述离心的速度为10000-15000g例如12000g，和/或，所述离心的温度为4℃。

5.如权利要求1～4任一项所述的抗HCP抗体组合，其特征在于，所述低分子量HCP的制备方法为将所述宿主细胞总HCP经分子筛层析获得洗脱液，所述洗脱液即为所述低分子量HCP。

6.如权利要求1～5任一项所述的抗HCP抗体组合，其特征在于，所述低免疫原性HCP由所述宿主细胞总HCP经FPLC纯化获得；

优选地，所述FPLC的步骤包括：

所述宿主细胞总HCP经过滤例如0.22μm滤膜过滤后上样，洗脱并收集洗脱液，即得所述低免疫原性HCP。

7.如权利要求6所述的抗HCP抗体组合，其特征在于，

所述FPLC使用偶联抗体纯化柱，制备所述偶联抗体纯化柱的步骤包括：

(a)用酸例如0.1M HCl清洗NHS活化胶；

(b)将所述抗总HCP抗体与所述NHS活化胶混匀，离心去除上清液；

(c)加入0.1-0.5M Tris-HCl例如0.1M Tris-HCl，pH8.0，混匀并孵育，使所述抗总HCP抗体与所述NHS活化胶发生偶联；所述混匀例如在室温下旋转2h，所述孵育例如在2-8℃培养15-20h；

(d)用缓冲液例如PBS清洗，将偶联合格例如偶联率>90％的填料进行装柱；

优选地，所述的抗HCP抗体组合由抗总HCP抗体、抗低分子量HCP抗体和抗低免疫原性HCP抗体组成，优选其比例为(1～2):(1～2):1，例如为1:1:1。

8.一种试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1～7任一项所述的抗HCP抗体组合；优选地，还包括免疫相关的检测试剂，如缓冲液，例如PBS缓冲液。

9.一种检测HCP的方法，其特征在于，所述方法包括：

将如权利要求1～7任一项所述的抗HCP抗体组合或如权利要求8所述的试剂盒的抗HCP抗体组合中的各抗体按比例混合后进行检测；优选地，抗总HCP抗体、抗低分子量HCP抗体和抗低免疫原性HCP抗体的比例为(1～2):(1～2):1；更优选地为1:1:1。

10.如权利要求1～7任一项所述的抗HCP抗体组合或权利要求8所述的试剂盒在检测HCP或者制备检测HCP的诊断剂中的应用。

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