CN111153969A

CN111153969A - 一种肉毒毒素抗原蛋白、重组载体及其应用

Info

Publication number: CN111153969A
Application number: CN202010033332.5A
Authority: CN
Inventors: 章金勇; 罗萍; 程平; 敬海明; 庄园; 邹全明
Original assignee: Army Medical University
Current assignee: Army Medical University
Priority date: 2020-01-13
Filing date: 2020-01-13
Publication date: 2020-05-15
Anticipated expiration: 2040-01-13
Also published as: CN111153969B

Abstract

本发明公开了一种肉毒毒素抗原蛋白BoNT‑Ag，所述抗原蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO:2，编码该肉毒毒素抗原蛋白的基因优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。本发明还公开表达该抗原蛋白的重组载体、宿主菌，并进一步公开了该抗原蛋白的分离纯化方法和应用。采用本发明所述方法制备的抗原蛋白可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答，可作为肉毒毒素疫苗的候选抗原。

Description

一种肉毒毒素抗原蛋白、重组载体及其应用

技术领域

本申请涉及生物制药和多肽合成技术领域，具体涉及一种用于制备肉毒毒素疫苗的候选抗原蛋白和重组载体，以及该抗原蛋白在制备肉毒毒素重组蛋白疫苗中的应用。

背景技术

肉毒毒素是由肉毒杆菌所分泌的一种神经毒素，是目前已知毒性最强的蛋白毒素，被国际上列为重要的生物毒素战剂，也是恐怖分子最有可能使用的生物恐怖剂之一。肉毒毒素小鼠LD50为0.00625ng，少至0.1～1.0μg的肉毒毒素就可导致人中毒死亡。该毒素可分为7型，其中我国肉毒杆菌食物中毒大多是由A型引起的。

结构研究表明：肉毒毒素由轻链(L链，50KDa)与重链(H链，100KDa)通过一个二硫键连接而成。轻链是毒性亚单位，与肉毒毒素毒性密切相关，而重链与肉毒毒素的受体特异结合有关，其羧基端分子量约50KDa的片段(HC)是肉毒毒素的受体结合区(K Turton,etal.Trends in Biochemical Sciences，2002)，目前认为肽段729–747,757–775和799–817中的某些氨基酸残基参与了受体的结合(BV Ayyar,et al.BBA,2016)。毒素与受体结合后，位于重链N端的毒素转运区域构象发生变化，在宿主细胞膜上形成离子通道，L链通过此通道进入胞液。在胞内，毒素分解底物蛋白释放乙酰胆碱，导致肌肉松弛或痉挛麻痹。重链HC段与受体的结合是毒素发挥活性的前提，一旦毒素与神经细胞受体结合后，抗体就不能中和毒素(MA Hanson,et al.Nat Struct Biol,2000)，因此通过疫苗免疫或抗体治疗阻断毒素与受体的结合是防治肉毒中毒的有效医学措施。研究表明肉毒毒素具有很强的免疫原性和抗原性，而HC片段是肉毒毒素的主要保护性抗原，含有中和性B细胞表位(MTDertzbaugh,et al.Vaccine，1996)。

A型肉毒毒素重链全长1296个氨基酸，分子量过大难以实现全长蛋白的可溶表达，目前也没有成功的先例，现有研究也对重链的某些区域进行了表达用于疫苗研究，如HC873-1296，HC1096-1296等(M Tavallaiea,et al.FEBS Lett，2004)，但这些片段不含关键的受体结合区。

发明内容

本申请通过对毒素晶体结构(BZ Dolimbek,Immunobiology,2011)的分析，对密码子、表达系统和载体等的优化，获得了其718-1132片段(BoNT-Ag，SEQ ID NO:2)的高效可溶表达，该片段包含了所有的受体结合位点，且包含了HC端的高免疫原性区域。在表达的基础上通过亲和层析和分子筛层析两步纯化得到了高纯度的抗原蛋白，动物实验表明BoNT-Ag具有良好的免疫原性，能够诱导高效的体液免疫应答，可作为有效的疫苗候选抗原。基于上述研究本发明提供一种肉毒毒素重组蛋白抗原BoNT-Ag，其可应用于肉毒毒素亚单位疫苗的制备。

为实现上述目的，本发明提供一种肉毒毒素抗原蛋白，所述肉毒毒素抗原蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。全长的肉毒毒素重链分子量较大，无法在大肠杆菌中进行重组表达。因此，本发明在系统分析A型肉毒毒素重链的氨基酸组成、受体结合位点和B/T细胞表位分布，并参考其晶体结构的基础上，通过大量的摸索和尝试，最终发现718-1132片段可以在大肠杆菌中得到高效表达，该片段包含了所有的受体结合位点，且包含了HC端的高免疫原性区域，安全无毒，是理想的疫苗候选抗原。本发明将该片段命名为BoNT-Ag，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2:

LeuAlaLysValAsnThrGlnIleAspLeuIleArgLysLysMetLysGluAlaLeuGluAsnGlnAlaGluAlaThrLysAlaIleIleAsnTyrGlnTyrAsnGlnTyrThrGluGluGluLysAsnAsnIleAsnPheAsnIleAspAspLeuSerSerLysLeuAsnGluSerIleAsnLysAlaMetIleAsnIleAsnLysPheLeuAsnGlnCysSerValSerTyrLeuMetAsnSerMetIleProTyrGlyValLysArgLeuGluAspPheAspAlaSerLeuLysAspAlaLeuLeuLysTyrIleTyrAspAsnArgGlyThrLeuIleGlyGlnValAspArgLeuLysAspLysValAsnAsnThrLeuSerThrAspIleProPheGlnLeuSerLysTyrValAspAsnGlnArgLeuLeuSerThrPheThrGluTyrIleLysAsnIleIleAsnThrSerIleLeuAsnLeuArgTyrGluSerAsnHisLeuIleAspLeuSerArgTyrAlaSerLysIleAsnIleGlySerLysValAsnPheAspProIleAspLysAsnGlnIleGlnLeuPheAsnLeuGluSerSerLysIleGluValIleLeuLysAsnAlaIleValTyrAsnSerMetTyrGluAsnPheSerThrSerPheTrpIleArgIleProLysTyrPheAsnSerIleSerLeuAsnAsnGluTyrThrIleIleAsnCysMetGluAsnAsnSerGlyTrpLysValSerLeuAsnTyrGlyGluIleIleTrpThrLeuGlnAspThrGlnGluIleLysGlnArgValValPheLysTyrSerGlnMetIleAsnIleSerAspTyrIleAsnArgTrpIlePheValThrIleThrAsnAsnArgLeuAsnAsnSerLysIleTyrIleAsnGlyArgLeuIleAspGlnLysProIleSerAsnLeuGlyAsnIleHisAlaSerAsnAsnIleMetPheLysLeuAspGlyCysArgAspThrHisArgTyrIleTrpIleLysTyrPheAsnLeuPheAspLysGluLeuAsnGluLysGluIleLysAspLeuTyrAspAsnGlnSerAsnSerGlyIleLeuLysAspPheTrpGlyAspTyrLeuGlnTyrAspLysProTyrTyrMetLeuAsnLeuTyrAspProAsnLysTyrValAspValAsnAsnValGlyIleArgGly。

本发明还提供了上述肉毒毒素抗原蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。为增加BoNT-Ag在大肠杆菌工程菌内的表达量，本发明优化了其DNA编码序列，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了一种用于表达肉毒毒素抗原蛋白的重组载体，所述重组载体包含上述的肉毒毒素抗原蛋白的编码基因。

在根据本发明的一个实施方案中，在重组载体中所述肉毒毒素抗原蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

在根据本发明的一个实施方案中，所述重组载体的骨架质粒中包含标签蛋白表达序列。

在根据本发明的一个实施方案中，所述标签蛋白为组氨酸标签。

在根据本发明的一个实施方案中，所述组氨酸标签为在表达后连接在肉毒毒素抗原蛋白的C-端。

本发明优选采用pET30a载体来构建重组表达质粒，其主要特点是载体上在目的蛋白的C-端连接有一个6个组氨酸组成的标签，便于目的蛋白的筛选。同时该载体具有卡那霉素抗性，可用于阳性重组子的筛选。此外，该载体具有纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。

本发明进一步提供了一种用于表达肉毒毒素抗原蛋白的重组工程菌，所述重组工程菌为表达上述重组载体的原核细菌。所述原核细菌优选为大肠杆菌，更优选地为大肠杆菌BL21菌株。

本发明还提供了肉毒毒素抗原蛋白的提取纯化方法，该提取纯化方法包括：

依次包括以下步骤：

重组工程菌的收集与破碎；亲和层析；分子筛层析。该方法工艺简单，所获得目标蛋白纯度高，容易放大、重复性好，回收率较好。

优选地，重组工程菌收集与破碎包括：

离心收集诱导表达后的菌体,然后加入lysis buffer重悬获得重悬菌液，将重悬菌液通过超声裂解，离心收集上清作为样品用于后续纯化。

优选地，亲和层析包括：

将Ni–NTA亲和层析填料以lysis buffer进行平衡；将样品上样后以wash buffer除杂；最后以elution buffer洗脱，得到洗脱液。

优选地，分子筛层析包括：

将亲和层析得到的洗脱液浓缩后上样(优选地，通过超滤浓缩)，根据分子筛出峰位置收取目的蛋白，即得。

本发明进一步提供了所述肉毒毒素抗原蛋白在制备用于动物免疫接种试剂中的应用，所述试剂包含所述的肉毒毒素抗原蛋白。优选地，所述试剂还包含佐剂；进一步优选地，佐剂选自氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、单硬脂酸铝佐剂、MF59、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、分枝杆菌卡介苗佐剂中的一种或多种。

本申请具有如下优点：

1)重组BoNT-Ag抗原蛋白包含了A型肉毒毒素所有可能的受体结合位点，以及主要的免疫优势区域，目前尚无该片段重组表达的相关报导。

2)重组BoNT-Ag抗原蛋白可在原核表达系统－大肠杆菌中表达，成本低，产量高；

3)选择pET30a载体时，BoNT-Ag重组蛋白以可溶形式表达；通过载体上的标签可实现蛋白的亲和纯化，使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，得到的BoNT-Ag蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。

4)重组BoNT-Ag蛋白能够诱导动物产生特异性的抗体：利用本发明重组BoNT-Ag蛋白制备的亚单位疫苗可通过皮下(肌肉)注射途径进行免疫接种，能够激发机体产生高滴度IgG抗体，证实其具有良好的免疫原性。

附图说明

图1为重组质粒pET30a-BoNT-Ag的双酶切鉴定结果；其中，泳道1：核酸(DNA)分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：4500、3000、2000、1200、800、500、200bp；泳道2～4：重组表达质粒pET30a-BoNT-Ag经酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段约5000bp和约1245bp；

图2为BoNT-Ag蛋白诱导表达鉴定结果；其中，泳道1：蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：100kDa、70kDa、55kDa、45kDa、35kDa、25kDa、15kDa、10kDa；泳道2：结合诱导表达的超声上清的GST填料；泳道3：经PP酶酶切后的上清；泳道4：经PP酶酶切后的GST填料；

图3为亲和层析纯化后的BoNT-Ag蛋白SDS-PAGE电泳结果；其中，泳道M：蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：130kDa、100kDa、70kDa、55kDa、45kDa、35kDa、25kDa、15kDa、10kDa；泳道1-3：纯化的BoNT-Ag蛋白；

图4为分子筛层析图谱；其中，根据出峰位置判断，图谱中前面的峰为BoNT-Ag，后面的峰为杂蛋白；

图5为分子筛层析纯化后的BoNT-Ag蛋白SDS-PAGE电泳结果；其中，泳道M：蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：130kDa、100kDa、70kDa、55kDa、45kDa、35kDa、25kDa、15kDa、10kDa；泳道1-3：纯化的BoNT-Ag蛋白；

图6为纯化后的BoNT-Ag蛋白HPLC鉴定结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。

下面将更详细地描述本申请的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

如无特别说明，本发明所使用的菌株与各种试剂的获得途径均如下所示：

质粒pET30a、大肠杆菌菌株BL21购买于北京索莱宝科技有限公司，申请人保存；

prime STAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、限制性内切酶Nde I和Xho I、蛋白Marker购自大连TakaRa公司；

EB购自上海俊晟生物科技有限公司；

质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购自美国Omega公司；

细菌基因组提取试剂盒、超薄回收试剂盒及显色液购自天根公司；

T4 DNA Ligase购自Fermentas公司；

Ni–NTA亲和层析填料和分子筛层析柱(HiLoad 16/60 Superdex 200 prep-gradegel-filtration column)购自美国GE Healthcare公司。

实施例1基因的合成和亚克隆

1)基因的合成

编码BoNT-Ag的DNA(SEQ ID NO:1)的合成及其序列与pET30a的连接委托由上海生工生物工程有限公司完成。

SEQ ID NO:1序列为：

2)重组质粒的转化

从-80℃冰箱取3管大肠杆菌BL21感受态细胞(上海超研生物科技有限公司)，第一管加入pET30a质粒(GE Healthcare Life Sciences)，作阳性对照；第二管加入1μl合成的pET30a-BoNT-Ag质粒；第三管不加外源DNA，作阴性对照。冰浴50min，42℃金属浴中热击90s，迅速冰浴2min。加入600μl LB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中220rpm振摇1h。各管以5000rpm室温离心3min.，弃去300μl上清，再重悬菌体，取200μl涂布于，Kana抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。

阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落，说明感受态细胞制作正确，结果可信。挑取转化平板上分隔良好的菌落，接种于Amp抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜。

3)双酶切鉴定

取37℃摇床培养过夜的阳性质粒，按照说明书的步骤，通过快速质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)提取阳性克隆的质粒。使用Nde1(Takara公司)和Xhol(Takara公司)进行酶切，37℃水浴半小时。体系如下：

灌制1.0％琼脂糖凝胶，其中含EB(上海俊晟生物科技有限公司)0.5ug/ml，将上述酶切反应体系中各加入1μl 6×Loading buffer，通过凝胶80V电泳20min后，UV扫描仪观察酶切的结果。结果过发现阳性克隆的质粒被切成2个片段，大片段约4000bp为表达载体pET30a部分，小片段约1200bp，为插入的编码BoNT-Ag的DNA片段(图1)。

实施例2 BoNT-Ag抗原蛋白表达形式的鉴定

1)BoNT-Ag诱导表达

取过夜培养的pET30a-BoNT-Ag/BL21菌液100μL加入10mL Kana抗性的LB培养基中，180rpm 37℃培养3h，至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG使其终浓度为200μM，再置于摇床诱导表达30℃诱导表达3h。将诱导表达后的菌液取出，以12000rpm离心5min，弃去上清，加入1mLPBS混匀，超声裂解3min，于4℃14000rpm离心15min,分离上清和沉淀。

2)SDS-PAGE电泳

将10％分离胶灌入制胶版中，在加入蒸馏水将胶压平，室温放置30min使其凝固，将上层的蒸馏水倒干，再灌入浓缩胶，立即插上梳子，室温放置30min使其凝固备用。将处理好的样品分别取10μL上样，进行SDS-PAGE电泳。电压先80v电泳30min，再调至180v，电泳1～2h后，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果，pET30a-BoNT-Ag/BL21在30℃中以可溶性的形式表达(如图2中泳道3所示)。

实施例3 BoNT-Ag蛋白抗原的制备

1)放大培养获取蛋白

取保存在4℃冰箱中备用的pET30a-BoNT-Ag/BL21菌液400μL加入到30mL含Kana抗性的LB培养基中进行一次活化，200rpm 37℃培养5～6h后，取20mL一次活化的菌液加入到2000mL含Amp抗性的LB培养基中进行二次活化，37℃培养3～4h至OD600为1.0时，加入200μLIPTG(终浓度为200μM)置于30℃摇床中诱导后3h后，12000rpm离心15min收集菌体,再加50mL lysis buffer(同实施例2)重悬菌体后，将菌液进行超声裂解3min(200V)，收集上清用于后续纯化。

2)Ni–NTA亲和层析初步纯化BoNT-Ag

取5ml Ni–NTA亲和层析填料，采用lysis buffer进行平衡，然后将上述上清加入亲和层析填料中，采用wash buffer洗脱杂蛋白和非特异性结合的蛋白，最后采用elutionbuffer洗脱目的蛋白并进行SDS-PAGE电泳鉴定，见图3。

其中，lysis buffer配制方法为：11.65g Na₂HPO₄，1.65gKH₂PO₄，9gNaCl,0.68g咪唑；溶解后用0.1M氢氧化钠或盐酸调PH值到7.4，加水定容至1L；

wash buffer配制方法为：11.65g Na₂HPO₄，1.65gKH₂PO₄，9gNaCl,1.36g咪唑；溶解后用0.1M氢氧化钠或盐酸调PH值到7.4，加水定容至1L；

elution buffer配制方法为：11.65g Na₂HPO₄，1.65gKH₂PO₄，9gNaCl，17g咪唑；溶解后用0.1M氢氧化钠或盐酸调PH值到7.4，加水定容至1L；

3)分子筛层析精细纯化BoNT-Ag

采用PBS平衡分子筛层析柱HiLoad 16/60Superdex 200prep-grade gel-filtration column，将上述洗脱的蛋白采用超滤浓缩管浓缩至1ml左右后上样，分子筛层析图如图4，根据分子筛出峰位置收取目的蛋白并进行SDS-PAGE电泳鉴定，见图5。

4)HPLC检测BoNT-Ag纯化效果

使用C3柱(购自Agilent公司)对上述纯化的BoNT-Ag蛋白进行纯度检测，用0.1％TFA水溶液平衡柱子，上样5μl样品，0.1％TFA乙腈溶液洗脱，设定柱温60℃，流速0.5ml/min。洗脱程序为：0％～100％B，30min。质谱图如图6所示，结果表明BoNT-Ag纯度在98％左右，达到了生物制品对蛋白类药品的纯度要求。其中，0.1％TFA水溶液的配制：1L I级水加1ml TFA混匀，0.22μm滤膜过滤。0.1％TFA乙腈溶液的配制：1L乙腈加1ml TFA混匀。

实施例4动物免疫实验

1)首次免疫，用PBS稀释BoNT-Ag抗原，加入浓度为1mg/mL的Al(OH)₃；用5号半型针头，双侧大腿肌肉注射，每只BALB/C小鼠注射量为100μL，并设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组；

2)第二次免疫，第14天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量与首次免疫相同，免疫途径同上；

3)第三次免疫，第21天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量与首次免疫相同，免疫途径同上。

实施例5抗体的检测

第三次免疫后第7和14天，采集BALB/C小鼠的血，用ELISA检测小鼠免疫后抗原特异性IgG应答水平。

1.制备液体

1)包被液的配制：称取Na₂CO₃1.6g，NaHCO₃ 2.9g，溶于1L ddH₂O，用PH计将pH调至9.6；

2)封闭液的配制：1g牛血清Ⅴ，溶于100mL抗体稀释液(1:100)；

3)抗体稀释液的配制：将磷酸盐溶于1L ddH₂O，再加入500μL Tween 20，再用PH计将pH调至7.4；

4)洗涤液的制备：同抗体稀释液

5)显色液(TMB)，为天根公司产品；

6)终止液(2M H₂SO₄)的制备：将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mL ddH₂O中。

2.ELISA检测BoNT-Ag重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价

1)用包被液将纯化后的BoNT-Ag重组蛋白稀释为1ug/mL；

2)包被：将重组蛋白稀释液加入酶标板，100μL/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍，空干后用保鲜膜包上，置于4℃冰箱中备用；

3)封闭：酶标板加封闭液200μL/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3遍；

4)将血清进行1:1000、1:2000、1:4000、1:8000等倍比稀释；

5)取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，置于37℃孵育箱1h，洗涤3遍，空干；

6)将加HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体保存液，稀释1：5000，制成抗体工作液；

7)加入稀释抗体工作液，100μL/孔，置于37℃孵育箱40min，洗涤三遍，空干；

8)加入底物显色液(TMB)100μL/孔，室温避光反应5min；

9)加入终止液(2M H₂SO₄)，立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值；

10)结果判断：A_样品/A_阴性值≧2.1为阳性(阴性对照为小鼠免疫前血清1:1000倍稀释)。

结果：BoNT-Ag蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价几何平均滴度为1:512000；末次免疫后第7天的抗体阳性率达到100％，说明本发明构建的BoNT-Ag重组蛋白具有良好的免疫原性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本申请作了详尽的描述，但在本申请基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。

序列表

<110> 中国人民解放军陆军军医大学

<120> 一种肉毒毒素抗原蛋白、重组载体及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1245

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctggctaaag ttaacaccca gatcgacctg atccgtaaaa aaatgaaaga agctctggaa 60

aaccaggctg aagctaccaa agctatcatc aactaccagt acaaccagta caccgaagaa 120

gaaaaaaaca acatcaactt caacatcgac gacctgtctt ctaaactgaa cgaatctatc 180

aacaaagcta tgatcaacat caacaaattc ctgaaccagt gctctgtttc ttacctgatg 240

aactctatga tcccgtacgg tgttaaacgt ctggaagact tcgacgcttc tctgaaagac 300

gctctgctga aatacatcta cgacaaccgt ggtaccctga tcggtcaggt tgaccgtctg 360

aaagacaaag ttaacaacac cctgtctacc gacatcccgt tccagctgtc taaatacgtt 420

gacaaccagc gtctgctgtc taccttcacc gaatacatca aaaacatcat caacacctct 480

atcctgaacc tgcgttacga atctaaccac ctgatcgacc tgtctcgtta cgcttctaaa 540

atcaacatcg gttctaaagt taacttcgac ccgatcgaca aaaaccagat ccagctgttc 600

aacctggaat cttctaaaat cgaagttatc ctgaaaaacg ctatcgttta caactctatg 660

tacgaaaact tctctacctc tttctggatc cgtatcccga aatacttcaa ctctatctct 720

ctgaacaacg aatacaccat catcaactgc atggaaaaca actctggttg gaaagtttct 780

ctgaactacg gtgaaatcat ctggaccctg caggacaccc aggaaatcaa acagcgtgtt 840

gttttcaaat actctcagat gatcaacatc tctgactaca tcaaccgttg gatcttcgtt 900

accatcacca acaaccgtct gaacaactct aaaatctaca tcaacggtcg tctgatcgac 960

cagaaaccga tctctaacct gggtaacatc cacgcttcta acaacatcat gttcaaactg 1020

gacggttgcc gtgacaccca ccgttacatc tggatcaaat acttcaacct gttcgacaaa 1080

gaactgaacg aaaaagaaat caaagacctg tacgacaacc agtctaactc tggtatcctg 1140

aaagacttct ggggtgacta cctgcagtac gacaaaccgt actacatgct gaacctgtac 1200

gacccgaaca aatacgttga cgttaacaac gttggtatcc gtggt 1245

<210> 2

<211> 415

<212> PRT

<213> 伞形芽胞杆菌(Clostridiumbotulinum)

<400> 2

Leu Ala Lys Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys

1 5 10 15

Glu Ala Leu Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr

20 25 30

Gln Tyr Asn Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn

35 40 45

Ile Asp Asp Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met

50 55 60

Ile Asn Ile Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met

65 70 75 80

Asn Ser Met Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr

100 105 110

Leu Ile Gly Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu

115 120 125

Ser Thr Asp Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg

130 135 140

Leu Leu Ser Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser

145 150 155 160

Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg

165 170 175

Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile

180 185 190

Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu

195 200 205

Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe

210 215 220

Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser

225 230 235 240

Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly

245 250 255

Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp

260 265 270

Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile

275 280 285

Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn

290 295 300

Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp

305 310 315 320

Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile

325 330 335

Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile

340 345 350

Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys

355 360 365

Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp

370 375 380

Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn Leu Tyr

385 390 395 400

Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg Gly

405 410 415

Claims

1.一种肉毒毒素抗原蛋白，其特征在于，所述肉毒毒素抗原蛋白的氨基酸序列为SEQID NO:2。

2.权利要求1所述的肉毒毒素抗原蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

3.一种用于表达肉毒毒素抗原蛋白的重组载体，其特征在于，所述重组载体包含如权利要求1所述的肉毒毒素抗原蛋白的编码基因。

4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述肉毒毒素抗原蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

5.如权利要求3或4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的骨架质粒中包含标签蛋白表达序列。

6.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述标签蛋白为组氨酸标签。

7.如权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述组氨酸标签为在表达后连接在肉毒毒素抗原蛋白的C-端。

8.一种用于表达肉毒毒素抗原蛋白的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌为表达如权利要求3-7中任一项所述的重组载体的原核细菌，所述原核细菌优选为大肠杆菌，更优选地为大肠杆菌BL21菌株。

9.如权利要求1所述的肉毒毒素抗原蛋白的提取纯化方法，其特征在于，包括：

依次包括以下步骤：如权利要求8所述的重组工程菌的收集与破碎；亲和层析；分子筛层析；

优选地，重组工程菌收集与破碎包括：

离心收集诱导表达后的重组工程菌的菌体,然后加入lysis buffer重悬获得重悬菌液，将重悬菌液通过超声裂解，离心收集上清作为样品用于后续纯化；

优选地，亲和层析包括：

将Ni–NTA亲和层析填料以lysis buffer进行平衡；将样品上样后以wash buffer除杂；最后以elution buffer洗脱，得到洗脱液；

优选地，分子筛层析包括：

10.如权利要求1所述的肉毒毒素抗原蛋白在制备用于动物免疫接种试剂中的应用，其特征在于，所述试剂包含所述的肉毒毒素抗原蛋白；优选地，所述试剂还包含佐剂；进一步优选地，佐剂选自氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、单硬脂酸铝佐剂、MF59、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、分枝杆菌卡介苗佐剂中的一种或多种。