CN109384832B - 重组型疫苗宿主蛋白抗体的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供重组型疫苗宿主蛋白抗体的制备方法及其应用,先将用于制备重组型疫苗的不携带任何外源基因的表达载体导入到与制备所述重组型疫苗所用的完全相同的原核或真核宿主细胞内,构建转化体,培养扩繁这些转化体,并按照与制备所述重组型疫苗所采用的完全相同的方法提取、纯化得到重组型疫苗宿主蛋白;然后经动物免疫再经抗体纯化后制得重组型疫苗宿主蛋白抗体。本发明提供的抗体可应用于重组手足口病疫苗中宿主蛋白残留检测,不仅灵敏度高、重复性好、专属性好,而且适用于一些由汉逊酵母表达的生物制品的宿主蛋白残留的检测,因此应用前景十分广阔。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗质控方法,具体地说,涉及重组型疫苗宿主蛋白抗体的制备方法及其应用。
背景技术
重组手足口病疫苗是应用汉逊酵母表达系统研制的一种基因工程产品,主要用于预防婴幼儿的手足口病。在基因工程产品中残留的宿主细胞蛋白是影响制品纯度的重要因素,反复使用含有宿主细胞蛋白的制品有可能引起接种副反应,并且影响药物的疗效。宿主蛋白(Host cell protein,HCP)成分复杂,种类繁多,且会因生产工艺及纯化工艺的不同而发生变化。HCP在生物制品中的残留量反映的不仅是制品批间的一致性,而且还是衡量生物制品质量的一个重要指标。因此,为了充分保证疫苗的安全有效,开发灵敏度高、适用性好、重复性好的宿主蛋白检测方法至关重要。
目前,酵母宿主蛋白检测方法主要有酶联免疫法(ELISA)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、毛细管电泳(CE)、等电聚焦(IEF)和高效液相层析(HPLC)等。《中国药典》三部(2015版)中宿主蛋白残留量检测方法采用酶联免疫法(ELISA)。ELISA检测方法中所用的抗宿主蛋白抗体通常是将宿主细胞破碎后,经过初步处理得到宿主蛋白,免疫动物后获得。宿主细胞破碎方法包括:有机试剂裂解;溶菌酶等酶类的酶促反应;超声、高压匀浆等物理破碎。初步处理方式包括:固液分离;超滤浓缩等。
常规的酵母HCP抗体制备方法,由于HCP分子量大小不一,成分复杂,各成分之间含量、免疫原性差异大,而不容易得到充分反映产品HCP残留的合适HCP抗体。这是因为,常规方法将酵母HCP全部成分免疫动物之后,获得抗体主要结合含量高、分子量大且免疫原性强的HCP成分,对于低含量、分子量小且免疫原性弱的HCP成分无结合能力。使用这种制备方法产生的抗体,会导致在通过ELISA(酶联免疫法)检测生物制品中HCP残留时灵敏度大大降低,并且由于部分低免疫原性的HCP成分无法检测而造成实际测定值偏低,不能充分反映出产品HCP的实际残留情况。
发明内容
本发明的目的是提供重组型疫苗宿主蛋白抗体(特别是重组手足口病疫苗宿主蛋白抗体)的制备方法及其应用。
为了实现本发明目的,第一方面,本发明提供重组型疫苗宿主蛋白的制备方法,将用于制备重组型疫苗的不携带任何外源基因的表达载体导入到与制备所述重组型疫苗所用的完全相同的原核或真核宿主细胞内,构建转化体,然后培养扩繁这些转化体,并按照与制备所述重组型疫苗所采用的完全相同的方法提取、纯化蛋白,即得重组型疫苗宿主蛋白。
本发明中,所述重组型疫苗利用DNA重组技术制备得到,选定病原体编码有效抗原的基因片段,将该基因片段与载体重组后导入原核或真核宿主细胞内,通过培养扩繁这些转化体,从细胞培养物中提取、纯化目的蛋白,即为重组型疫苗。
所述重组型疫苗包括但不限于重组手足口病疫苗,包括重组EV71疫苗、重组CA6疫苗、重组CA10疫苗、重组CA16疫苗、重组CB3疫苗、重组CB5疫苗、重组E30疫苗。
本发明中,制备重组手足口病疫苗所使用的宿主细胞为酵母菌,优选多型汉逊酵母,更优选尿嘧啶缺陷型汉逊酵母AU-0501;和/或
本发明中,制备重组手足口病疫苗所使用的表达载体为含有甲醇氧化酶启动子或甲醛脱氢酶启动子的表达载体,优选为含有甲醇氧化酶启动子的表达载体PMV-05。
第二方面,本发明提供重组型疫苗宿主蛋白抗体,所述抗体是以上述述方法制备得到的重组型疫苗宿主蛋白作为抗原,制备得到的抗体。
优选地,所述抗体是以所述重组型疫苗宿主蛋白为抗原,经动物免疫再经抗体纯化后制得的多克隆抗体。
第三方面,本发明提供所述抗体的以下任一应用:
i)在制备重组型疫苗质控检测试剂或试剂盒中的应用;
ii)在重组型疫苗质量控制中的应用;
iii)在重组型疫苗中宿主蛋白残留检测中的应用。
第四方面,本发明提供重组手足口病疫苗宿主蛋白抗体的制备方法,包括以下步骤:
a)重组菌的构建:将用于制备重组手足口病疫苗的空载体转化至汉逊酵母菌中,获得重组菌;
b)对上述重组菌进行发酵培养,收集菌体,进行细胞破碎,离心收集上清液,进行硫酸铵沉淀,复溶,超滤,离子交换层析,除菌过滤,制得汉逊酵母宿主蛋白;
c)将汉逊酵母宿主蛋白与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合,免疫动物,数次免疫后采血,获得免疫血清,纯化后即得重组手足口病疫苗宿主蛋白抗体。
优选地,所述汉逊酵母菌为尿嘧啶缺陷型汉逊酵母AU-0501。所述空载体为含有甲醇氧化酶启动子的表达载体PMV-05。
优选地,细胞破碎具体为:将发酵培养菌体用细胞裂解缓冲液重悬,使用高压匀浆机在压力1100~1400bar的条件下破碎细胞2-4次,优选压力为1200bar、破碎次数为2次。
优选地,硫酸铵沉淀具体为:将破碎后的细胞液倒入离心筒中,6000~8000rpm离心40~60min,收集上清液,将收集的上清液中加入硫酸铵至终浓度为20~40%,优选终浓度30%。
优选地,复溶具体为:将硫酸铵沉淀产物于8000~10000rpm离心40min~60min,收集沉淀,加入复溶缓冲液,搅拌30~60min,然后8000~10000rpm离心45~60min,收集复溶上清液。其中,所述复溶缓冲液为:20mM PBS,0.1~1M NaCl,pH6.8~7.4。
优选地,超滤具体为:将复溶上清液以100~500KD的膜包采用pH7.5-8.5的50mMTris溶液进行超滤,收集超滤液。
优选地,离子交换层析具体为:以Capto Q作为层析介质,采用pH7.5-8.5的50mMTris溶液平衡5~10个柱体积后上样,采用洗脱液洗脱,收集UV280nm紫外吸收峰,即为汉逊酵母宿主蛋白。其中,所述洗脱液为含有150-500mM NaCl的50mM Tris溶液,优选含有300mMNaCl的50mM Tris溶液。
前述的方法,优选分四次免疫动物,分别在第0、14、28、42天进行。所述动物包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、羊、马,优选兔、豚鼠。所述佐剂优选为氢氧化铝佐剂。
优选地,使用rProtein A FF亲和层析柱(GE)对免疫血清进行纯化。
优选地,柱纯化所用洗脱液为0.1M柠檬酸缓冲液,pH3.0。
第五方面,本发明提供重组手足口病疫苗宿主蛋白检测试剂或试剂盒,所述检测试剂或试剂盒的有效成分为根据上述方法制备得到的重组手足口病疫苗宿主蛋白抗体。
在本发明的一个具体实施方式中,所述制备重组手足口病疫苗HCP抗体的方法是通过与重组手足口病疫苗(重组EV71疫苗、重组CA6疫苗、重组CA10疫苗、重组CA16疫苗、重组CB3疫苗、重组CB5疫苗、重组E30疫苗等)相似的纯化方法将培养获得的宿主蛋白进行纯化,从而获得高丰度残留宿主蛋白制备多克隆抗体。
制备方法具体步骤如下:
1)将筛选获得的重组汉逊酵母空载体表达菌株进行发酵罐高密度发酵培养92~96小时之后,收集菌体;
2)将上述发酵诱导表达的菌体,进行细胞破碎,收集破碎上清液,进行硫酸铵沉淀,复溶,超滤,离子交换层析,除菌过滤,制得汉逊酵母HCP蛋白;
3)使用汉逊酵母HCP蛋白加上佐剂免疫动物,免疫四次后采血,获得汉逊酵母HCP抗血清;
4)使用亲和层析胶纯化获得汉逊酵母HCP抗体;
5)使用HRP将获得汉逊酵母HCP多克隆抗体进行标记。
其中,步骤1)中所述重组汉逊酵母空载体表达菌株为不含外源基因的表达载体PMV-05转化汉逊酵母尿嘧啶缺陷型宿主菌AU-0501获得的菌株。
步骤2)所述汉逊酵母HCP抗原纯化方法,具体的为:将发酵培养菌体用细胞裂解缓冲液重悬,使用高压匀浆机在压力1200bar的条件下破碎细胞2次;将破碎后的细胞液倒入离心筒中,进行6000~8000rpm离心40~60min,收集上清液,将收集的上清液中加入硫酸铵浓度至终浓度为30%;将硫酸铵沉淀产物采用8000~10000rpm离心40min~60min,收集沉淀,并加入复溶缓冲液(20mM PBS,0.1~1M NaCl,pH6.8~7.4),搅拌30~60min,8000~10000rpm离心45~60min,收集复溶上清液;将复溶上清液以100~500KD的膜包采用50mMTris(pH7.5~8.5)进行超滤,收集超滤液;将超滤液进行离子交换层析,以Capto Q层析介质为例,采用50mM Tris(pH7.5~8.5)平衡5~10个柱体积后上样,采用洗脱液(含有300mMNaCl的50mM Tris溶液)洗脱,收集UV280nm紫外吸收峰,即为汉逊酵母HCP蛋白。
步骤3)中所述的免疫动物,共四次,分别为在第0、14、28、42天进行;所述动物可为小鼠、大鼠、豚鼠、兔、羊、马,优选为兔和豚鼠;所述佐剂选自弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂,优选为弗氏佐剂,最优选为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。
第六方面,本发明提供一种重组汉逊酵母空载体表达菌株,所述表达菌株为不含外源基因的表达载体转化汉逊酵母尿嘧啶缺陷型宿主菌获得。
第七方面,本发明提供一种重组手足口病疫苗HCP,所述宿主蛋白为重组汉逊酵母空载体表达菌株经高密度发酵培养纯化获得,所述重组手足口病疫苗HCP较常规的酵母宿主蛋白增加了表达载体相关基因元件的蛋白成分,所述宿主蛋白纯化通过与重组手足口病疫苗相似的纯化方法获得,所述宿主蛋白更有针对性,能更真实的反应制品中HCP的实际情况。
借由上述技术方案,本发明至少具有下列优点及有益效果:
本发明针对现有技术中汉逊酵母宿主蛋白检测方法的不足,提供了一种检测灵敏度高、特异性强、适用性好的抗汉逊酵母宿主蛋白抗体及其制备方法,在宿主蛋白的制备过程中使用了重组汉逊酵母空载体表达菌株进行宿主蛋白的制备,并且使用了与制品相似的纯化工艺制备宿主蛋白,从而使得所制备的HCP抗体更有针对性,能更真实的反应制品中HCP的实际情况(可检测到分子量在25-50KDa之间的宿主蛋白);同时,本发明将兔抗宿主细胞蛋白多抗进行了HRP酶标记,简化了试验操作过程,节约了试验操作时间和成本。实验结果表明,本发明提供的抗体可应用于ELISA检测HCP中,检测灵敏度提高了3倍,检测下限由原来的62.5ng/mL提高到2ng/mL,该方法对于重组手足口病疫苗(重组EV71疫苗、重组CA6疫苗、重组CA10疫苗、重组CA16疫苗、重组CB3疫苗、重组CB5疫苗、重组E30疫苗)等由汉逊酵母表达的生物制品HCP检测均通用,适用面广,应用前景广阔。
附图说明
图1为本发明实施例4中宿主蛋白含量检测标准曲线。
图2为本发明实施例5中现有技术宿主蛋白含量检测标准曲线。
图3为本发明实施例7中现有技术宿主蛋白与本发明宿主蛋白Western-blot检测结果:其中,样品1为现有技术制备宿主蛋白、样品2为本发明制备宿主蛋白;A为应用现有技术制备豚鼠抗宿主蛋白抗体的Western-blot检测结果,B为应用本发明制备豚鼠抗宿主蛋白抗体的Western-blot检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例均按照常规实验条件,如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001),或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1汉逊酵母空载体表达菌株的构建
将汉逊酵母表达载体PMV-05(CN 201210592813.5)通过电转化法转化汉逊酵母尿嘧啶缺陷型宿主菌AU-0501(汉逊酵母表达载体及汉逊酵母尿嘧啶缺陷型宿主菌的构建方法可参见CN 201210592813.5),经稳定化培养筛选获得重组汉逊酵母空载体表达菌株。
实施例2汉逊酵母HCP的制备
1、重组汉逊酵母空载体表达菌株发酵培养
将重组汉逊酵母空载体表达菌株接种到100ml一级种子培养基(酵母提取物6.7g/L,硫酸铵5g/L,葡萄糖20g/L)中,在33℃,200rpm摇床振荡培养20~24小时。然后全量接种于1000ml二级种子培养基(酵母提取物6.7g/L,硫酸铵5g/L,甘油20g/L)中,在33℃,200rpm摇床振荡培养20~24小时之后全量接种至30L发酵罐中,其中装有12L发酵培养基(甘油23.333g/L、磷酸二氢铵11.667g/L、3.333g/L氯化钾、氯化钙2.500g/L、氯化钠0.333g/L、硫酸镁2.500g/L、乙二胺四乙酸钠0.167g/L),氨水调节发酵液pH值维持在5.0,发酵温度为30℃,转速控制在350-750rpm,空气流速0.5-1.0m3/h,高密度发酵需要纯氧补充,溶氧控制在20-60%,20~24h时发酵培养基中碳源耗尽,补加甘油共计2.0L,分5次补加0.40L/次,每次碳源耗尽,溶氧上升时补加甘油,菌体生长共计36~39h左右,湿菌重最高可达0.3~0.4g/ml左右;去阻遏阶段:转速750rpm,空气流速1.0m3/h,溶氧控制在20~60%,加入1L甘油和甲醇混合液(甘油200ml,甲醇800ml)进行去阻遏培养,36~54h(共计15~18h)之间;诱导阶段:54~96h(36~42h)之间进行甲醇诱导,溶氧维持在20~40%左右。发酵结束:92~96h时,待甲醇消耗完全,溶氧上升至80%以上,降温至20℃开始下罐发酵结束,6500rpm离心15min,收获发酵菌体。
2、汉逊酵母HCP纯化
将发酵培养菌体用细胞裂解缓冲液重悬,使用高压匀浆机在压力1200bar的条件下破碎细胞2次;
将破碎后的细胞液倒入离心筒中,进行7000rpm离心50min,收集上清液,将收集的上清液中加入硫酸铵浓度至终浓度为30%;
将硫酸铵沉淀产物采用9000rpm离心50min,收集沉淀,并加入复溶缓冲液(20mMPBS,0.5M NaCl,pH7.2),搅拌40min,9000rpm离心50min,收集复溶上清液;
将复溶上清液以300KD的膜包采用50mM Tris(pH8.0)进行超滤,收集超滤液;
将超滤液进行离子交换层析,以Capto Q层析介质为例,采用50mM Tris(pH8.0)平衡8个柱体积后上样,采用洗脱液(含有300mM NaCl的50mM Tris溶液)洗脱,收集UV280nm紫外吸收峰,并经0.22μm的除菌过滤器无菌过滤后即得汉逊酵母HCP。
汉逊酵母HCP浓度检测(Lowry法):精确量取标准蛋白牛血清白蛋白溶液(200μg/ml)0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml,分别置于试管中,加蒸馏水补至1ml,同时量取10倍稀释纯化HCP液1ml于试管中,分别加5ml碱性铜液,0.5ml酚试剂,于比色杯中用650nm波长测定吸光度值。以标准蛋白的蛋白含量做为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线,计算待检测蛋白液浓度。检测结果如表1所示。
表1纯化蛋白浓度(Lowry法)检测结果
Lowry法检测汉逊酵母HCP终浓度为1078μg/ml。
实施例3汉逊酵母HCP抗体的制备
1动物免疫
1.1兔子免疫
第一次免疫:取6ml稀释至1mg/ml的宿主蛋白,加入6ml弗氏完全佐剂(FCA)进行乳化,取一滴至水面不散开为乳化完全。用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂(FCA)乳化液2ml(含1mg宿主蛋白),在颈部和背部皮下多点分别注入0.2mL。
第二次免疫:间隔10-14天后,进行二免。取6ml稀释至0.5mg/mL的宿主蛋白,加入弗氏不完全佐剂(FIA)6ml乳化,取一滴至水面不散开为乳化完全。用2ml注射器吸取弗氏不完全佐剂(FIA)乳化液2ml(含0.5mg宿主蛋白),在颈部和背部皮下多点分别注入0.2mL。
第三次免疫:间隔10-14天后,进行三免,方法同第二次免疫。
第四次免疫:间隔10-14天后,进行四免,取6ml稀释至0.5mg/mL的宿主蛋白过滤,通过耳缘静脉注射1ml(含0.5mg的宿主蛋白)。
采血:四免14天后用心脏采血法采血。分离血清,分装后贮于-80℃以下冰箱保存,并测定血清效价。
1.2豚鼠免疫
第一次免疫:取5ml稀释至0.4mg/ml的宿主蛋白,加入等体积5ml弗氏完全佐剂(FCA)震荡乳化,取一滴至水面不散开为乳化完全。取1ml(含0.2mg宿主蛋白)乳化液背部皮下多点注射。
第二次免疫:间隔10~14天后,进行二免;取5ml稀释至0.2mg/ml的宿主蛋白,加入等体积5ml弗氏不完全佐剂(FIA)震荡乳化,取一滴至水面不散开为乳化完全。取1ml(含0.1mg宿主蛋白)乳化液背部皮下多点注射。
第三次免疫:间隔10~14天后,进行三免,方法同第二次免疫。
第四次免疫:间隔10~14天后,进行四免,方法同第二次免疫。
采血:四免14天后用心脏采血法采血。分离血清,分装后贮于-80℃以下冰箱保存,并测定血清效价。
2抗体纯化
2.1兔血清多抗纯化
层析柱:柱体积(CV)为1ml,介质:GE rProtein A FF。
样品处理:取血清7.5ml采用平衡液3倍稀释,0.45μm滤器过滤纯化备用。
层析柱处理:采用平衡液处理5~10个CV,1ml/min。
上样:上样量20ml,采用平衡液处理5~10个CV,1ml/min。
洗脱:在收集管中预先加入1ml中和液,收集洗脱产物。
柱再生:采用0.1M NaOH洗杂2~5个CV,水洗10个CV,20%乙醇10个CV保存。
其中,平衡液的配方为:磷酸氢二钠1.392g/L,一水磷酸二氢钠1.224g/L,氯化钠8.766g/L。中和液为1M Tris(pH 9.0)。
2.2豚鼠血清多抗纯化
层析柱:CV1ml,介质:GE rProtein AFF。
样品处理:取血清6ml采用平衡液3倍稀释,0.45μm滤器过滤纯化备用。
层析柱处理:采用平衡液处理5~10个CV,5ml/min。
上样:上样量18ml,采用平衡液处理5~10个CV,5ml/min。
洗脱:在收集管中预先加入1ml中和液,收集洗脱产物。
柱再生:采用0.1MNaOH洗杂2~5个CV,水洗10个CV,20%乙醇10个CV保存。
3抗体标记
称取20mgHRP溶解于5ml蒸馏水中;于上液中加入1ml新配的0.1M NaIO4溶液,室温下避光搅拌20分钟;将上述溶液装入透析袋中,对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4℃过夜;加200μl 0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液,使以上HRP的pH升高到9.0-9.5,然后立即加入40mgIgG,在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2小时;加0.5ml新配的4mg/ml NaBH4液,混匀,再置4℃ 2小时;将上述液装入透析袋中,对0.15M pH7.4 PBS透析,4℃过夜;在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃ 1小时;3000rpm离心半小时,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15M pH7.4的PBS中;将上述溶液装入透析袋中,对0.15M pH7.4的PBS缓冲盐水透析,去除铵离子后(用萘氏试剂检测),10,000rpm离心30分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,按照1:1的体积加入甘油,分装后冰冻保存,并测定效价。
4效价测定
采用间接ELISA法检测抗血清、纯化后抗体及HRP标记抗体效价,具体为:将汉逊酵母宿主蛋白用碳酸盐缓冲液稀释至2μg/ml,加入100μl/孔,2~8℃过夜;洗板3次,加入3%BSA(洗涤液)150μl/孔,封闭2h;洗板3次,加入待测血清(兔子、豚鼠)、纯化抗体(兔子、豚鼠)以及HRP标记抗体,以1:40000倍开始倍比稀释8个稀释度,100μl/孔,孵育1h;洗板3次,分别加入1:5000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP,1:10000、1:20000、1:30000、1:40000稀释的羊抗豚鼠IgG-HRP 100μl/孔,孵育1h;洗板3次,加入显色液100μl/孔,室温显色10min,终止反应,酶标仪450nm读数,并计算抗体效价,抗体效价结果如表2所示。
表2动物抗体效价结果
编号 | 兔抗1 | 兔抗2 | 豚鼠抗1 | 豚鼠抗2 | 豚鼠抗3 |
效价 | 5*10<sup>6</sup> | 2*10<sup>6</sup> | 2*10<sup>6</sup> | 1*10<sup>6</sup> | 6*10<sup>5</sup> |
编号 | 豚鼠抗4 | 兔抗纯化 | 豚鼠抗纯化 | HRP标记兔抗 | |
效价 | 2*10<sup>6</sup> | 1*10<sup>6</sup> | 3*10<sup>5</sup> | 1*10<sup>5</sup> |
实施例4双抗体夹心法测定汉逊酵母宿主蛋白含量
包被:用包被液(0.05M NaHCO3,pH9.6)将豚鼠抗汉逊酵母宿主细胞抗体稀释至1:10000,100μl/孔,2~8℃包被过夜。除去包被液,用PBST溶液洗涤3次。每孔加入150μl封闭液(3%BSA+PBST)于37℃保温2小时。除去包被液,PBST溶液洗涤3次。
加样:将实施例2中制备的HCP汉逊酵母宿主蛋白分别稀释至250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.63ng/mL、7.81ng/mL、3.9ng/mL、1.95ng/mL,稀释缓冲液为含0.5%BSA的PBS,各孔加入100ul稀释样品,单加稀释缓冲液的孔作为阴性对照。于37℃保温1小时,除去宿主蛋白溶液,PBST溶液洗涤3次。
加酶标抗体:向每孔加入用稀释缓冲液以1:40000稀释的HRP酶标的兔子抗体100μl,37℃保温45min后除去酶标液,PBST溶液洗涤4次。
比色及结果计算:每孔中加入100μl显色液,室温避光作用10min后加2M H2SO450μL终止液终止反应,并用酶标比色仪测定OD450值。用四参数曲线拟合法绘制标准曲线,结果见图1。由图1可知,标准曲线R2为0.999,应用该方法检测汉逊酵母宿主蛋白的灵敏度达到2ng/mL。
实施例5与现有技术的对照试验
1、现有技术汉逊酵母HCP的制备
取冻存于液氮罐中的宿主菌菌种,迅速溶化,从其中取出400μl菌液接到40mlYPD(10g/L酵母提取物,10g/L蛋白胨,20g/L葡萄糖)培养基中,于37℃摇床,200rpm培养。当OD600nm值达到10时(培养18-20小时),取40ml菌液接到4000ml YPD(10g/L酵母提取物,10g/L蛋白胨,20g/L葡萄糖)中,于37℃摇床,200rpm培养。培养16-20小时后,4000rpm离心15min收集菌体。
将上述菌体用细胞裂解缓冲液重悬,使用高压匀浆机在压力1200bar的条件下破碎细胞2次。
将破碎后的细胞液倒入离心筒中,进行7000rpm离心50min,收集上清液,将收集的上清液中加入硫酸铵浓度至终浓度为30%。
将硫酸铵沉淀产物采用9000rpm离心50min,收集沉淀,并加入复溶缓冲液(20mMPBS,0.5M NaCl,pH7.2),搅拌40min,9000rpm离心50min,收集复溶上清液,并经0.22μm的除菌过滤器无菌过滤后即得汉逊酵母HCP。
汉逊酵母HCP浓度检测(Lowry法):精确量取标准蛋白牛血清白蛋白溶液(200μg/ml)0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml,分别置于试管中,加蒸馏水补至1ml,同时量取10倍稀释纯化HCP液1ml于试管中,分别加5ml碱性铜液,0.5ml酚试剂,于比色杯中用650nm波长测定吸光度值。以标准蛋白的蛋白含量做为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线,计算待检测蛋白液浓度。检测结果如表3所示。
表3纯化蛋白浓度(Lowry法)检测结果
Lowry法检测汉逊酵母HCP终浓度为1.74mg/mL。
2、现有技术抗体制备及纯化方法同实施例3所述。
3、现有技术双抗体夹心法测定汉逊酵母宿主蛋白的方法如下:
包被:用包被液(0.05M NaHCO3,pH9.6)将豚鼠抗汉逊酵母宿主细胞抗体稀释至1:2000,100μl/孔,2~8℃包被过夜。除去包被液,用PBST溶液洗涤3次。每孔加入150μl封闭液(1%BSA+PBST),于37℃保温2小时。除去包被液,PBST溶液洗涤3次。
加样:将汉逊酵母宿主蛋白稀释至1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL,稀释缓冲液为含0.5%BSA的PBST,各孔加入100ul稀释样品,单加稀释缓冲液的孔作为阴性对照。于37℃保温1小时,除去宿主蛋白溶液,PBST溶液洗涤3次。
加二抗:向每孔加入用稀释缓冲液以1:2000稀释的兔抗宿主细胞蛋白多抗100μl,37℃保温1h后除去酶标液,PBST溶液洗涤3次。
加酶标抗体:向每孔加入用稀释缓冲液以1:5000稀释的HRP酶标的兔子抗体100μl,37℃保温1h后除去酶标液,PBST溶液洗涤4次。
比色及结果计算:每孔中加入100μl显色液,室温避光作用10min后加2M H2SO450μL终止液终止反应,并用酶标比色仪测定OD450值。用线性回归法绘制标准曲线,结果见图2。由图2可知,标准曲线R2为0.9977,应用该方法检测汉逊酵母宿主蛋白的灵敏度达到62.5ng/mL。
4、本发明与现有技术的比较
本发明检测汉逊酵母宿主蛋白的灵敏度为2ng/mL远高于现有技术的62.5ng/mL,本发明将兔抗宿主细胞蛋白多抗进行了HRP酶标记,简化了试验操作过程,节约了至少一个小时的试验操作时间,同时节约了试验成本。
实施例6重组手足口病疫苗(重组EV71疫苗)的宿主蛋白残留量检测应用
本实施例中,重组EV71疫苗的制备参见WO2018/119746。
包被:用包被液(0.05M NaHCO3,pH9.6)将豚鼠抗汉逊酵母宿主细胞抗体稀释至1:10000,100μl/孔,2~8℃包被过夜。除去包被液,用PBST溶液洗涤3次。每孔加入150μl封闭液(3%BSA+PBST)于37℃保温2小时。除去包被液,PBST溶液洗涤3次。
加样:将实施例2中制备的汉逊酵母宿主蛋白稀释至250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.63ng/mL、7.81ng/mL、3.9ng/mL、1.95ng/mL,稀释缓冲液为含0.5%BSA的PBS,各孔加入100ul稀释样品,单加稀释缓冲液的孔作为阴性对照,同时加100ul待测重组EV71疫苗原液,于37℃保温1小时,除去宿主蛋白溶液,PBST溶液洗涤3次。
加酶标抗体:向每孔加入用稀释缓冲液以1:40000稀释的HRP酶标的兔子抗体100μl,37℃保温45min后除去酶标液,PBST溶液洗涤4次。
比色及结果计算:每孔中加入100μl显色液,室温避光作用10min后加2M H2SO450μL终止液终止反应,并用酶标比色仪测定OD450值。
以本实施例及实施例5(对照实验)所得抗体分别测定同一重组EV71疫苗蛋白样品中的汉逊酵母宿主蛋白残留量,结果如表4所示。
表4重组EV71疫苗宿主蛋白残留检测结果
本发明抗体检测结果 | 对照试验抗体检测结果 | |
ELISA检测结果 | 68.2ng | 24.2ng |
重组EV71疫苗宿主蛋白残留量 | 0.03% | 0.01% |
实施例7应用Western-blot法检测HCP
分别取实施例5(现有技术)和本发明(实施例2)制备的HCP各8μg,加入SDS缓冲液混匀,煮沸10min,上样进行SDS-PAGE凝胶电泳分离(电泳条件:100V、20min,200V、40min)。电泳结束后将SDS-PAGE凝胶上HCP电转移至PVDF上(电转移条件:200V、1h)。电转结束取下PVDF膜加入3%BSA的PBST缓冲液封闭2h,PBST洗膜3次,15min/次。分别加入一抗实施例5(现有技术)和实施例3(本发明)制备的豚鼠抗宿主蛋白多抗37℃孵育1h,PBST洗膜3次,15min/次。再加入HRP-羊抗豚鼠-IgG(北京博奥森公司)作为二抗,DAB显色。
Western-blot法检测结果显示:实施例5中制备的豚鼠抗宿主蛋白多抗仅能够与实施例5中制备的HCP较好地反应,但与本发明(实施例2)制备的分子量为25-50Kda的HCP结合反应能力差,不能切实地反映出重组手足口病疫苗生产工艺中残留HCP的实际情况(图3)。
本发明提供一种重组手足口病疫苗宿主蛋白(HCP)多克隆抗体,所述宿主蛋白为多型汉逊酵母宿主蛋白,所述宿主细胞为含有不带外源基因的表达载体转化尿嘧啶缺陷型多型汉逊酵母宿主菌,获得的重组汉逊酵母空载体表达菌株制得宿主蛋白后经动物免疫再经抗体纯化后制得。本发明还提供了该抗体的制备方法,该方法包括制备重组手足口病疫苗宿主细胞蛋白,通过与重组手足口病疫苗(重组EV71疫苗、重组CA6疫苗、重组CA10疫苗、重组CA16疫苗、重组CB3疫苗、重组CB5疫苗、重组E30疫苗等)相似的纯化方法将培养获得的宿主蛋白进行纯化,获得高丰度残留宿主蛋白制备多克隆抗体。实验结果表明,本发明提供的抗体可应用于重组手足口病疫苗中宿主蛋白残留检测,不仅灵敏度高、重复性好、专属性好,而且适用于一些由汉逊酵母表达的生物制品的宿主蛋白残留的检测,因此应用前景十分广阔。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之做一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (2)
1.重组手足口病疫苗宿主蛋白抗体,其特征在于,其制备方法包括以下步骤:
A、汉逊酵母空载体表达菌株的构建
将汉逊酵母表达载体PMV-05通过电转化法转化汉逊酵母尿嘧啶缺陷型宿主菌AU-0501,经稳定化培养筛选获得重组汉逊酵母空载体表达菌株;
B、汉逊酵母HCP的制备
B 1、重组汉逊酵母空载体表达菌株发酵培养
将重组汉逊酵母空载体表达菌株接种到100ml一级种子培养基中,在33℃,200rpm摇床振荡培养20~24小时;然后全量接种于1000ml二级种子培养基中,在33℃,200rpm摇床振荡培养20~24小时之后全量接种至30L发酵罐中,其中装有12L发酵培养基,氨水调节发酵液pH值维持在5.0,发酵温度为30℃,转速控制在350-750rpm,空气流速0.5-1.0m3/h,高密度发酵需要纯氧补充,溶氧控制在20-60%,20~24h时发酵培养基中碳源耗尽,补加甘油共计2.0L,分5次补加0.40L/次,每次碳源耗尽,溶氧上升时补加甘油,菌体生长共计36~39h,湿菌重最高可达0.3~0.4g/ml;去阻遏阶段:转速750rpm,空气流速1.0m3/h,溶氧控制在20~60%,加入1L甘油和甲醇混合液进行去阻遏培养,36~54h之间;诱导阶段:54~96h之间进行甲醇诱导,溶氧维持在20~40%;发酵结束:92~96h时,待甲醇消耗完全,溶氧上升至80%以上,降温至20℃开始下罐发酵结束,6500rpm离心15min,收获发酵菌体;
其中,一级种子培养基:酵母提取物6.7g/L,硫酸铵5g/L,葡萄糖20g/L;
二级种子培养基:酵母提取物6.7g/L,硫酸铵5g/L,甘油20g/L;
发酵培养基:甘油23.333g/L、磷酸二氢铵11.667g/L、3.333g/L氯化钾、氯化钙2.500g/L、氯化钠0.333g/L、硫酸镁2.500g/L、乙二胺四乙酸钠0.167g/L;
甘油和甲醇混合液:甘油200ml,甲醇800ml;
B2、汉逊酵母HCP纯化
将发酵培养菌体用细胞裂解缓冲液重悬,使用高压匀浆机在压力1200bar的条件下破碎细胞2次;
将破碎后的细胞液倒入离心筒中,进行7000rpm离心50min,收集上清液,将收集的上清液中加入硫酸铵浓度至终浓度为30%;
将硫酸铵沉淀产物采用9000rpm离心50min,收集沉淀,并加入复溶缓冲液,搅拌40min,9000rpm离心50min,收集复溶上清液;
将复溶上清液以300KD的膜采用50mM Tris pH8.0进行超滤,收集超滤液;
将超滤液进行离子交换层析,以Capto Q为层析介质,采用50mM Tris pH8.0平衡8个柱体积后上样,采用洗脱液洗脱,收集UV280nm紫外吸收峰,并经0.22μm的除菌过滤器无菌过滤后即得汉逊酵母HCP;
其中,复溶缓冲液:20mM PBS,0.5M NaCl,pH7.2;
洗脱液:含有300mM NaCl的50mM Tris溶液;
C、汉逊酵母HCP抗体的制备
C1、兔子免疫
第一次免疫:取6ml稀释至1mg/ml的步骤B获得的宿主蛋白,加入6ml弗氏完全佐剂进行乳化,取一滴至水面不散开为乳化完全;用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂乳化液2ml,乳化液中含1mg宿主蛋白,在颈部和背部皮下多点分别注入0.2mL;
第二次免疫:间隔10-14天后,进行二免;取6ml稀释至0.5mg/mL的宿主蛋白,加入弗氏不完全佐剂6ml乳化,取一滴至水面不散开为乳化完全;用2ml注射器吸取弗氏不完全佐剂乳化液2ml,乳化液中含0.5mg宿主蛋白,在颈部和背部皮下多点分别注入0.2mL;
第三次免疫:间隔10-14天后,进行三免,方法同第二次免疫;
第四次免疫:间隔10-14天后,进行四免,取6ml稀释至0.5mg/mL的宿主蛋白过滤,通过耳缘静脉注射1ml;
采血:四免14天后用心脏采血法采血;分离血清,分装后贮于-80℃以下冰箱保存,并测定血清效价;
C2、兔血清多抗纯化
层析柱:柱体积,即CV,为1ml,介质:GErProtein A FF;
样品处理:取血清7.5ml采用平衡液3倍稀释,0.45μm滤器过滤纯化备用;
层析柱处理:采用平衡液处理5~10个CV,1ml/min;
上样:上样量20ml,采用平衡液处理5~10个CV,1ml/min;
洗脱:在收集管中预先加入1ml中和液,收集洗脱产物;
柱再生:采用0.1M NaOH洗杂2~5个CV,水洗10个CV,20%乙醇10个CV保存;
其中,平衡液的配方为:磷酸氢二钠1.392g/L,一水磷酸二氢钠1.224g/L,氯化钠8.766g/L;中和液为1M Tris pH 9.0;
C3、抗体标记
称取20mg HRP溶解于5ml蒸馏水中;于上液中加入1ml新配的0.1M NaIO4溶液,室温下避光搅拌20分钟;将上述溶液装入透析袋中,对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4℃过夜;加200μl 0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液,使以上HRP的pH升高到9.0-9.5,然后立即加入40mg步骤C2制备得到的IgG,在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2小时;加0.5ml新配的4mg/mlNaBH4液,混匀,再置4℃2小时;将上述液装入透析袋中,对0.15M pH7.4PBS透析,4℃过夜;在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1小时;3000rpm离心半小时,弃上清;沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15M pH7.4的PBS中;将上述溶液装入透析袋中,对0.15M pH7.4的PBS缓冲盐水透析,去除铵离子后,10,000rpm离心30分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,按照1:1的体积加入甘油,分装后冰冻保存,并测定效价。
2.重组手足口病疫苗宿主蛋白检测试剂或试剂盒,其特征在于,所述检测试剂或试剂盒的有效成分为权利要求1所述的重组手足口病疫苗宿主蛋白抗体。
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