CN111100795A - 表达手足口病疫苗抗原的重组汉逊酵母细胞破碎缓冲液及其制备方法与应用 - Google Patents

表达手足口病疫苗抗原的重组汉逊酵母细胞破碎缓冲液及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明实施例公开了一种表达手足口病疫苗抗原的重组汉逊酵母细胞破碎缓冲液及其制备方法与应用。所述细胞破碎缓冲液包含以下组分：氨丁三醇1.00‑100.00g/L、药用氯化钠10.00‑100.00g/L、甘油1.00‑100.00g/L。实施本发明，可显著提高重组汉逊酵母细胞破碎产物的破碎率、目标蛋白含量和目标抗原含量。

Description

表达手足口病疫苗抗原的重组汉逊酵母细胞破碎缓冲液及其 制备方法与应用
技术领域
本发明涉及重组汉逊酵母表达的手足口病疫苗制备技术领域，尤其涉及一种表达手足口病疫苗抗原的重组汉逊酵母细胞破碎缓冲液及其制备方法与应用。
背景技术
重组汉逊酵母表达的手足口病疫苗的制备过程中，需要对发酵产物进行固液分离，细胞破碎，最终目标收集目标蛋白和目标抗原。现有技术常用的细胞破碎方法是采用高压均浆破碎，工艺过程中必须使用大量细胞破碎缓冲液，细胞破碎缓冲液质量的好坏直接影响重组汉逊酵母表达的手足口病疫苗制备过程中细胞破碎产物的破碎效果、目标蛋白含量、目标抗原含量。
现有技术中常用的细胞破碎缓冲液采用氨丁三醇(Tris)配制。
然而，发明人在实施本发明的过程中发现，在相同工艺条件下采用高压均浆破碎，使用目前市场常用的氨丁三醇(Tris)缓冲液做细胞破碎，重组汉逊酵母细胞破碎产物的细胞破碎率、目标蛋白含量和目标抗原含量都不理想。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种表达手足口病疫苗抗原的重组汉逊酵母细胞破碎缓冲液，可显著提高重组汉逊酵母细胞破碎产物的破碎率、目标蛋白含量和目标抗原含量。
本发明进一步所要解决的技术问题是，提供一种表达手足口病疫苗抗原的重组汉逊酵母细胞破碎方法，该方法可显著提高重组汉逊酵母细胞破碎产物的破碎率、目标蛋白含量和目标抗原含量。
本发明进一步所要解决的技术问题是，提供一种表达手足口病疫苗抗原的重组汉逊酵母细胞破碎缓冲液在重组手足口病疫苗制备过程中的应用，该应用可显著提高重组汉逊酵母细胞破碎产物的破碎率、目标蛋白含量和。
为解决上述技术问题，本发明公开了以下技术方案：
一种表达手足口病疫苗抗原的重组汉逊酵母细胞破碎缓冲液，包含以下组分：
氨丁三醇1.00-100.00g/L、药用氯化钠10.00-100.00g/L、甘油1.00-100.00g/L。
在一些具体的实施方式中，还包括盐酸1-10ml/L。
在一些具体的实施方式中，所述氨丁三醇10.00-80.00g/L。
在一些具体的实施方式中，所述药用氯化钠10.00-80.00g/L。
在一些具体的实施方式中，所述甘油10.00-50.00g/L。
在一些具体的实施方式中，所述药用氯化钠的浓度为0.1-0.5ml/L。
在一些具体的实施方式中，溶剂为注射用水。
在一些具体的实施方式中，所述手足口病疫苗抗原为重组柯萨奇病毒A16型疫苗抗原。
相应地，本发明还公开了一种表达手足口病疫苗抗原的重组汉逊酵母细胞破碎缓冲液的制备方法，包括：
按量分别称取氨丁三醇1.00-100.00g/L、氯化钠10.00-100.00g/L、甘油1.00-100.00g/L，先用注射用水对氨丁三醇进行溶解，用盐酸调节pH值7.0-8.0，然后再加入氯化钠、甘油定容，搅拌澄清后分装。
相应地，本发明还公开了上述细胞破碎缓冲液在重组手足口病疫苗制备过程中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明的实施例通过在氨丁三醇溶液中添加药用氯化钠、甘油等，从而显著提高了重组汉逊酵母细胞破碎产物的破碎率、目标蛋白含量和目标抗原含量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的表达手足口病疫苗抗原的重组汉逊酵母细胞破碎缓冲液的配置工艺流程示意图。
具体实施方式
下面参考附图详细描述本发明提供的表达手足口病疫苗抗原的重组汉逊酵母细胞破碎缓冲液的实施例；本实施例的主要成分及配方如下表一：
表一、细胞破碎缓冲液配方
成分 配方 成分 配方
注射用水 约1000.0g/L 氨丁三醇 1.00-100.00g/L
甘油 1.00-100.00g/L 药用氯化钠 10.00-100.00g/L
在一些具体的实施方式中，还包括盐酸1-10ml/L。
在一些具体的实施方式中，所述氨丁三醇10.00-80.00g/L。
在一些具体的实施方式中，所述药用氯化钠10.00-80.00g/L。
在一些具体的实施方式中，所述甘油10.00-50.00g/L。
在一些具体的实施方式中，所述药用氯化钠的浓度为0.1-0.5ml/L。
在一些具体的实施方式中，溶剂为注射用水。
氨丁三醇(Tris)缓冲液在医药工业广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，是行业配制细胞破缓冲碎液通用试剂。氨丁三醇(Tris)缓冲液中的酶蛋白比纯水中稳定，其中的离子对维持蛋白质三维结构有正向效果。在下游工艺中，我公司对重组手足口病疫苗抗原做阴离子交换第一步层析处理，工艺过程选用氨丁三醇(Tris)盐酸缓冲液体系。经本公司多年研发经验，pH7.0-pH8.0氨丁三醇(Tris)缓冲液缓冲能力最强，适用于重组手足口病疫苗抗原的纯化分离。
蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物提取出来得到目标蛋白。中性盐溶液的特性与水分子的亲和力大于蛋白质，会使蛋白质分子周围的水化层减弱、逐步消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和。更加导致蛋白质溶解度降低，使蛋白质分子聚集而沉淀易于收集目标蛋白。加入适量的氯化钠，经多次实验，证实对重组手足口病疫苗抗原的纯化分离、细胞破碎效果良好，因为氯化钠因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性，方便于下游工艺纯化分离蛋白质。
甘油是丙三醇的俗称，分子式为C3H8O3。经大量实验发现，添加甘油与不添加甘油，初纯步骤的目标蛋白回收率相差非常大，因此添加适量浓度的甘油可使细胞破碎达到85％以上回收率。原理分析如果不添加甘油，目标蛋白会形成聚集而不稳定，高浓度甘油又会增加溶液粘度。引起超滤和层析压力增高，不利于纯化。因此配方中采用1.00-100.00g/L的甘油溶液有助于细胞破碎缓冲液缓冲体系中细胞悬浮，避免细胞结团，保护蛋白不易变性。
下面参考图1详细描述本发明实施例的表达手足口病疫苗抗原的重组汉逊酵母细胞破缓冲碎液的制备方法；该方法主要包括以下步骤：
按量分别称取氨丁三醇1.00-100.00g/L、氯化钠10.00-100.00g/L、甘油1.00-100.00g/L，先用注射用水对氨丁三醇进行溶解，用盐酸调节pH值，然后再加入氯化钠、甘油定容，搅拌澄清后分装。
根据细胞破碎工艺使用要求，将溶液用特定厂家生产的0.45+0.20μm除菌过滤器除菌分装至合适的容器内备用。
为了更进一步阐释本实施例为达成预定发明目的所采取的技术手段和效果，对本实施例表达手足口病疫苗抗原的重组汉逊酵母细胞破碎缓冲液的具体成分，通过实例数据详细说明如下。
其中，第1次实验目标确定氨丁三醇(Tris)缓冲液最佳pH区间，第2次实验目标确定氨丁三醇(Tris)缓冲液加入氯化钠的的最佳浓度。第3次实验目标确定氨丁三醇(Tris)缓冲液加入氯化钠、甘油的最佳含量。形成替增优化关系，最终目标确定氨丁三醇(Tris)缓冲液最佳配方。需要特别说明，本公司摸索最佳细胞破碎缓冲液配方过程中，以下所列实验只是其中一小部分。
氨丁三醇(Tris)缓冲液不同pH值细胞破碎产物目标蛋白、抗原含量对比如下表二：
表二、不同pH值目标蛋白含量对比
Figure BDA0002341968370000041
Figure BDA0002341968370000051
数据分析：两组数据横向对比，第二组数据比第一组数据目标蛋白含量平均值提高33.7％，目标抗原含量平均值提高24.5％。至此，确定氨丁三醇(Tris)缓冲液pH7.0-pH8.0是缓冲液pH值最佳区间。
氨丁三醇(Tris)缓冲液加入不同浓度氯化钠目标蛋白、目标抗原含量对比如下表三：
表三、不同浓度氯化钠目标蛋白、抗原含量对比
Figure BDA0002341968370000052
数据分析：氨丁三醇(Tris)缓冲液加入不同浓度氯化钠，两组数据横向对比，第二组数据比第一组数据目标蛋白含量平均值提高32.4％，目标抗原含量平均值提高28.1％。
氨丁三醇(Tris)缓冲液加入不同数量甘油目标蛋白、目标抗原含量对比如下表：
表四、不同甘油含量目标蛋白、抗原含量对比
Figure BDA0002341968370000061
数据分析：氨丁三醇(Tris)缓冲液加入甘油量不同，两组数据横向对比，实验B组加入甘油目标蛋白含量平均值提高14.4％，目标抗原含量平均值提高61.6％。
(四)3次实验最佳结果数据纵向对比，挑选出细胞破碎缓冲液最佳配方。
表五、3次实验最佳结果数据纵向对比
Figure BDA0002341968370000062
数据分析：第二次数据与第一次数据纵向对比，目标蛋白含量提高61.4％，目标抗原提高36.5％；第三次数据与第二次数据纵向对比，目标蛋白含量提高23.1％，目标抗原提高26.3％。至此，从细胞破碎产物的目标蛋白含量和目标抗原含量确定细胞破碎缓冲液最佳配方。
试验结果表明，使用本发明实施例提供的细胞破碎缓冲液对表达手足口病疫苗抗原的重组汉逊酵母细胞做破碎工艺处理，相同工艺条件下采用高压均浆破碎，与现有技术相比，其重组汉逊酵母细胞破碎产物的破碎率、目标蛋白含量和目标抗原含量有很大程度提高。因此，应用本发明，有利于后续精纯工序对重组汉逊酵母表达的手足口病疫苗抗原做提纯工艺，最大可能提高了生产效率，具有很高经济效益及社会效益。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.表达手足口病疫苗抗原的重组汉逊酵母细胞破碎缓冲液，其特征在于，包含以下组分：
氨丁三醇1.00-100.00g/L、药用氯化钠10.00-100.00g/L、甘油1.00-100.00g/L。
2.如权利要求1所述的细胞破碎缓冲液，其特征在于，还包括有盐酸1-10ml/L。
3.如权利要求1所述的细胞破碎缓冲液，其特征在于，所述氨丁三醇10.00-80.00g/L。
4.如权利要求1所述的细胞破碎缓冲液，其特征在于，所述药用氯化钠10.00-80.00g/L。
5.如权利要求1所述的细胞破碎缓冲液，其特征在于，所述甘油10.00-50.00g/L。
6.如权利要求1所述的细胞破碎缓冲液，其特征在于，所述药用氯化钠的浓度为0.1-0.5ml/L。
7.如权利要求1所述的细胞破碎缓冲液，其特征在于，溶剂为注射用水。
8.如权利要求1-7中任一项所述的细胞破碎缓冲液，其特征在于，所述手足口病疫苗抗原为重组柯萨奇病毒A16型疫苗抗原。
9.表达手足口病疫苗抗原的重组汉逊酵母细胞破碎缓冲液的制备方法，其特征在于，包括：
按量分别称取氨丁三醇1.00-100.00g/L、氯化钠10.00-100.00g/L、甘油1.00-100.00g/L，先用注射用水对氨丁三醇进行溶解，用盐酸调节pH值7.0-8.0，然后再加入氯化钠、甘油定容，搅拌澄清后分装。
10.权利要求1-6中任一项所述的细胞破碎缓冲液在重组手足口病疫苗制备过程中的应用。
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