CN111172048A - 重组汉逊酵母表达的ca16病毒样颗粒的粗纯工艺、ca16病毒疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例公开了一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒样颗粒的粗纯工艺、CA16病毒疫苗及其制备方法。包括以下步骤：将破碎后的菌体悬液用0.45um‑0.65um孔径的膜包，控制透过流速为0.05‑0.2L/min/m2，浓缩1‑2倍，用缓冲液洗滤2‑5倍，获得微滤澄清液；将所述澄清液进行离子交换膜层析，得到目标蛋白液。实施本发明，可显著提高抗原回收率、蛋白去除率和纯化速度，经济可行，适用于规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品领域，尤其涉及一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒样颗粒的粗纯工艺、CA16病毒疫苗及其制备方法。
背景技术
病毒样颗粒疫苗的出现为研发新型安全有效的疫苗提供了一个新的契机。对于柯萨奇病毒A16型(CA16)疫苗，将含CA16外壳蛋白P1基因和3CD蛋白酶基因的重组汉逊酵母工程菌发酵，具遗传性质稳定、操作简单、高密度发酵培养、目的产物产量高、生产成本低、适合于工业化大生产等特点，还具有原核生物表达系统所不具有的外源蛋白翻译后加工等优势，是一种优于大肠杆菌和其它真核表达系统的较为先进的VLP疫苗表达系统。
现阶段制约汉逊酵母表达的CA16病毒样颗粒大规模生产的因素为没有经济可行的纯化方式。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒样颗粒的粗纯工艺，该工艺可显著提高抗原回收率、蛋白去除率和纯化速度，经济可行，适用于规模化生产。
本发明进一步所要解决的技术问题是，提供一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒疫苗的制备方法，该方法可显著提高抗原回收率、蛋白去除率和纯化速度，经济可行，适用于规模化生产。
本发明进一步所要解决的技术问题是，提供一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒疫苗，该疫苗具有显著提高的抗原回收率、蛋白去除率和纯度，适用于规模化生产。
为解决上述技术问题，本发明公开了以下技术方案：
一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒样颗粒的粗纯工艺，包括以下步骤：
将破碎后的菌体悬液用0.45um-0.65um孔径的膜包，控制透过流速为0.05-0.2L/min/m2，浓缩1-2倍，用缓冲液洗滤2-5倍，获得微滤澄清液；
将所述澄清液进行离子交换膜层析，得到目标蛋白液。
在一些可能的实施方式中，所述离子交换膜层析具体包括：
调节所述微滤澄清液至电导为2-10ms/cm；
将离子交换膜柱用流速为5-10个柱体积/min的缓冲液平衡5-10个柱体积；
用5-10个柱体积/min的流速将调节后的所述微滤澄清液上样至离子交换膜柱，继续用流速为5-10个柱体积/min的缓冲液平衡5-10个柱体积；
用流速为5-10个柱体积/min缓冲液洗脱后，即获得所述目标蛋白液。
在一些可能的实施方式中，在所述膜包之前，还包括以下步骤：
将破碎后的菌体悬液倒入离心瓶中离心后，收集上清液。
在一些可能的实施方式中，所述膜的孔径为0.45um。
在一些可能的实施方式中，所述膜的孔径为0.65um。
在一些可能的实施方式中，所述缓冲液包括：20-50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷和0-10％的甘油，pH值为6.5-8.5。
在一些可能的实施方式中，所述缓冲液还包括：0.05-0.35mol/L的NaCl。
在一些可能的实施方式中，所述缓冲液包括：50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、5％甘油的0.15mol/L的NaCl，pH值6.5-8.5。
相应地，本发明还公开了一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒疫苗的制备方法，包括有如上所述的粗纯工艺。
相应地，本发明还公开了一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒疫苗，采用如上所述的制备方法制备得到。
本发明的有益技术效果是：
本发明的实施例通过采用0.45um-0.65微滤微滤膜包直接微滤澄清去杂，从而显著提高了抗原回收率、蛋白去除率和纯化速度。抗原回收率75％以上，杂蛋白去除率30％以上，可以代替离心步骤，设备和操作简单，为大规模生产节约大量人力和时间成本。
具体实施方式
下面详细描述本发明提供的重组汉逊酵母表达的CA16病毒样颗粒的粗纯工艺的实施例；本实施例主要包括以下步骤：
将破碎后的菌体悬液用0.45um-0.65um孔径的膜包，控制透过流速为0.05-0.2L/min/m2，浓缩1-2倍，用缓冲液洗滤2-5倍，获得微滤澄清液；
将所述澄清液进行离子交换膜层析，得到目标蛋白液。
在一些可能的实施方式中，所述离子交换膜层析具体包括：
调节所述微滤澄清液至电导为2-10ms/cm；
将离子交换膜柱用流速为5-10个柱体积/min的缓冲液平衡5-10个柱体积；
用5-10个柱体积/min的流速将调节后的所述微滤澄清液上样至离子交换膜柱，继续用流速为5-10个柱体积/min的缓冲液平衡5-10个柱体积；
用流速为5-10个柱体积/min缓冲液洗脱后，即获得所述目标蛋白液。
在一些可能的实施方式中，在所述膜包之前，还包括以下步骤：
将破碎后的菌体悬液倒入离心瓶中离心后，收集上清液。
在一些可能的实施方式中，所述膜的孔径为0.45um。
在一些可能的实施方式中，所述膜的孔径为0.65um。
在一些可能的实施方式中，所述缓冲液包括：20-50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷和0-10％的甘油，pH值为6.5-8.5。
在一些可能的实施方式中，所述缓冲液还包括：0.05-0.35mol/L的NaCl。
在一些可能的实施方式中，所述缓冲液包括：50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、5％甘油的0.15mol/L的NaCl，pH值6.5-8.5。
本发明实施例提供的一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒疫苗的制备方法，包括有前述所述的粗纯工艺，其余与现有技术相同，不再一一赘述。
本发明实施例提供的一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒疫苗，采用前述实施例所述的制备方法制备得到，不再一一赘述。
为了更进一步阐释本实施例为达成预定发明目的所采取的的技术手段和效果，对本实施例重组汉逊酵母表达的CA16病毒样颗粒的粗纯工艺的具体步骤，通过实例数据详细说明如下。
实施例1：微滤+膜层析
步骤1：
将工程菌采用破碎缓冲液重悬，在压力1350bar的条件下破碎细胞2次；所述破碎缓冲液(20-50mM Tris，0.2-1M NaCl，0-10％甘油，2mM EDTA-Na2，2mM PMSF，pH7.5-8.5)；
步骤2：
将步骤1破碎后的菌体悬液用0.65um孔径的膜包，控制透过流速为0.05-0.2L/min/m2，浓缩1-2倍，用缓冲液洗滤2-5倍获得微滤澄清液。所述洗滤缓冲液(20-50mMTris，0-10％甘油，pH值6.5-8.5)。
采用20-50mm三羟甲基氨基甲烷(含0-10％甘油，pH(6.5-8.5)的缓冲液调节微滤澄清液至样品电导为2-10ms/cm；
将离子交换膜柱用20-50mm三羟甲基氨基甲烷(含0-10％甘油，pH(6.5-8.5)的缓冲液平衡5-10个柱体积，流速5-10个柱体积/min；
用5-10个柱体积/min将调节后的样品上样至离子交换膜柱上；
继续用20-50mm三羟甲基氨基甲烷(含0-10％甘油，pH(6.5-8.5)的缓冲液平衡5-10个柱体积，流速5-10个柱体积/min；
用洗脱缓冲液(20-50mM Tris，0.05-0.35M NaCl，0-10％甘油，pH6.5-8.5)洗脱，流速5-10个柱体积/min，即获得目标蛋白液。
步骤3：
使用PALL公司的MustangQXT系列的阴离子柱膜，用1M的氢氧化钠溶液，5-10个柱体积/min流速清洗柱膜5-10个柱体积；
用含氯化钠的20-50mm三羟甲基氨基甲烷溶液(含0-10％甘油，pH(6.5-8.5，1M氯化钠)的缓冲液平衡5-10个柱体积，流速5-10个柱体积/min；
用20-50mm三羟甲基氨基甲烷(含0-10％甘油，pH(6.5-8.5)的缓冲液平衡5-10个柱体积，流速5-10个柱体积/min。
将步骤二收集的澄清液用20-50mm三羟甲基氨基甲烷(含0-10％甘油，pH6.5-8.5调节电导至2-10ms/cm上样，采用洗脱缓冲液(20-50mMTris，0.05-0.35MNaCl，0-10％甘油，pH6.5-8.5)洗脱，流速5-10个柱体积/min。即为粗纯产物。
继续用用含氯化钠的20-50mm三羟甲基氨基甲烷溶液(含0-10％甘油，pH(6.5-8.5，1M氯化钠)的缓冲液平衡5-10个柱体积，流速5-10个柱体积/min；
用1M的氢氧化钠溶液，5-10个柱体积/min流速清洗柱膜5-10个柱体积；
最后含0.1氢氧化钠的1M氯化钠的溶液，5-10个柱体积/min流速清洗柱膜5-10个柱体积。
实施例2：微滤+膜层析
步骤1：
将工程菌采用破碎缓冲液重悬，在压力1350bar的条件下破碎细胞2次；所述破碎缓冲液(20-50mM Tris，0.2-1M NaCl，0-10％甘油，2mM EDTA-Na2，2mM PMSF，pH7.5-8.5)；
步骤2：
将步骤1破碎后的菌体悬液倒入离心瓶中，进行离心(6000-8000rpm，40-60min)，收集破碎上清液；
用0.45um孔径的膜包所述上清液，浓缩1-2倍，用缓冲液洗滤2-5倍获得微滤澄清液。所述洗滤缓冲液(20-50mMTris，0-10％甘油，pH(6.5-8.5)。
步骤3：
使用PALL公司的MustangQXT系列的阴离子柱膜，用1M的氢氧化钠溶液，5-10个柱体积/min流速清洗柱膜5-10个柱体积；
用含氯化钠的20-50mm三羟甲基氨基甲烷溶液(含0-10％甘油，pH(6.5-8.5，1M氯化钠)的缓冲液平衡5-10个柱体积，流速5-10个柱体积/min；
用20-50mm三羟甲基氨基甲烷(含0-10％甘油，pH(6.5-8.5)的缓冲液平衡5-10个柱体积，流速5-10个柱体积/min。
将收集的澄清液用20-50mm三羟甲基氨基甲烷(含0-10％甘油，pH6.5-8.5调节电导至2-10ms/em上样，采用洗脱缓冲液(20-50mMTris，0.05-0.35MNaCl，0-10％甘油，pH6.5-8.5)洗脱，流速5-10个柱体积/min。
继续用用含氯化钠的20-50mm三羟甲基氨基甲烷溶液(含0-10％甘油，pH(6.5-8.5，1M氯化钠)的缓冲液平衡5-10个柱体积，流速5-10个柱体积/min；
用1M的氢氧化钠溶液，5-10个柱体积/min流速清洗柱膜5-10个柱体积；
最后含0.1氢氧化钠的1M氯化钠的溶液，5-10个柱体积/min流速清洗柱膜5-10个柱体积。
对照例1：硫酸铵沉降+复溶+过滤+超滤
步骤1：
将工程菌采用破碎缓冲液重悬，在压力1350bar的条件下破碎细胞2次；所述破碎缓冲液(20-50mMTris，0.2-1MNaCl，0-10％甘油，2mMEDTA-Na2，2mMPMSF，pH7.5-8.5)；
步骤2：
或者破碎后的菌体悬液倒入离心瓶中，进行离心(6000-8000rpm，40-60min)，收集破碎上清液。加入饱和硫酸铵沉淀蛋白质，静置16-24小时，排去上层清液，取下层悬浊液，离心(6000-8000rpm，40-60min)，弃上清得到硫酸铵沉淀；
步骤3：
向硫酸铵沉淀中加入复溶缓冲液复溶，静置16-24小时，离心(6000-8000rpm，40-60min)，取上清液弃沉淀得到复溶上清液；
步骤4：
用SartobranP0.45+0.2μm溶液过滤器过滤复溶上清液，得粗纯产物。
表一：微滤+膜层析数据统计结果
| 实施方案 | 蛋白去除率 | 抗原回收率 | 单位体积单次工艺时间 |
| 微滤+膜层析 | 89％ | 76％ | 8小时 |
| 硫酸铵沉降+复溶+过滤+超滤 | 81％ | 60％ | 40小时 |
与硫酸铵沉降和复溶后超滤过滤工艺对比可知，本发明采用的微滤微滤膜包直接微滤澄清去杂破碎液方案，抗原回收率和蛋白去除率高，可以代替离心步骤，设备和操作简单，为大规模生产节约大量人力和时间成本。离子交换膜层析，采用结合模式上样，能进一步澄清去除杂质，动态载量高，单次处理微滤产物量可超过100L/个，并可以实现并联扩大工艺规模。实现洗脱后抗原回收率75％以上，蛋白去除率80％以上。杂蛋白的大量去除能提高下游精纯的单次处理量。且离子交换膜层析操作简单，工艺流速快，可实现3-10个柱体积/min，劳动强度低，减少设备占用空间。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒样颗粒的粗纯工艺，其特征在于，包括以下步骤：
将破碎后的菌体悬液用0.45um-0.65um孔径的膜包，控制透过流速为0.05-0.2L/min/m2，浓缩1-2倍，用缓冲液洗滤2-5倍，获得微滤澄清液；
将所述澄清液进行离子交换膜层析，得到目标蛋白液。
2.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述离子交换膜层析包括：
调节所述微滤澄清液至电导为2-10ms/cm；
将离子交换膜柱用流速为5-10个柱体积/min的缓冲液平衡5-10个柱体积；
用5-10个柱体积/min的流速将调节后的所述微滤澄清液上样至离子交换膜柱，继续用流速为5-10个柱体积/min的缓冲液平衡5-10个柱体积；
用流速为5-10个柱体积/min缓冲液洗脱后，即获得所述目标蛋白液。
3.如权利要求1或2所述的工艺，其特征在于，在所述膜包之前，还包括以下步骤：
将破碎后的菌体悬液倒入离心瓶中离心后，收集上清液。
4.如权利要求3所述的工艺，其特征在于，所述膜的孔径为0.45um。
5.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述膜的孔径为0.65um。
6.如权利要求1-3中任一项所述的工艺，其特征在于，所述缓冲液包括：20-50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷和0-10％的甘油，pH值为6.5-8.5。
7.如权利要求6所述的工艺，其特征在于，所述缓冲液还包括：0.05-0.35mol/L的NaCl。
8.如权利要求7所述的工艺，其特征在于，所述缓冲液包括：50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、5％甘油的0.15mol/L的NaCl，pH值6.5-8.5。
9.一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括有1-8中任一项所述的粗纯工艺。
10.一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒疫苗，其特征在于，采用如权利要求9所述的制备方法制备得到。
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