CN116463300A - 一种犬细小病毒生产纯化工艺及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种犬细小病毒生产纯化工艺及应用，所述纯化工艺将犬细小病毒培养物经过滤澄清后，利用阴离子柱填料进行粗纯和浓缩，然后利用填料Core400进行精纯后得到纯化的犬细小病毒；所述纯化工艺在保证毒价不损失的情况下，除杂率达98％；整个工艺病毒得率达到100％，满足应用于生产中产能放大的需求，提高了生产效率，并能实现车间GMP级百升级CPV料液的纯化。
Description
技术领域
本发明涉及病毒纯化技术领域，更具体地说，本发明涉及一种犬细小病毒生产纯化工艺及应用。
背景技术
犬细小病毒(CPV，Canine Parvovirus)对多种理化因素和常用消毒剂具有较强的抵抗力，主要感染幼犬，传染性极强，致死率也极高。针对犬细小病毒的全病毒纯化工艺的改进是提高犬细小全病毒疫苗有效性及安全性的提升的重要手段之一，即提升CPV毒价和纯度水平。优质的纯化工艺在满足毒价配苗要求及纯度的基础上，还需达到高得率以及生产效率，如提高批次处理量、缩短纯化时间等。
目前CPV没有纯化工艺的文献及专利报道，绝大部分全病毒常规纯化工艺应用于CPV存在得率低以及批次处理量低等问题，无法保证产品的有效性和生产成本的控制，同时，由于宠物产品市场的特点，CPV纯化工艺应做到产品的高质量以及成本控制的双要求，以确保良好的市场反响和利润。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种犬细小病毒生产纯化工艺，通过选择多种层析填料的结合实现粗纯和精纯，解决以上现有技术纯化过程存在的缺陷，以满足工业放大生产和市场需求。
基于此，本发明的技术方案如下：
一种犬细小病毒生产纯化工艺，步骤为，将犬细小病毒培养物经过滤澄清后，经阴离子柱填料NanoGel 50Q粗纯和浓缩，洗脱并收集病毒，再通过填料Core400精纯后得到纯化的犬细小病毒。
优选地，所述粗纯和浓缩步骤中，先向阴离子柱填料中加入第一缓冲液维持填料的电导率为3～7mS/cm，pH为7.5～7.8，然后再使用第二缓冲液除去蛋白杂质。
进一步地，所述第一缓冲液为50mM Tris-HCl pH 7.5；所述第二缓冲液为50mMTris-HCl 150mM NaClpH 7.5。
优选地，所述洗脱过程采用第三缓冲液：50mM Tris-HCl 500mM NaCl pH7.5。
进一步地，所述精纯步骤使用第四缓冲液维持填料的电导率为8～12mS/cm，pH7.5～7.8。
优选地，所述第四缓冲液为50mM Tris 50mM NaCl。
进一步地，所述过滤澄清过程采用0.65μm囊式滤芯。
进一步地，所述犬细小病毒纯化后的毒价相对于纯化前提高。
本发明还提出以上所述纯化工艺在工业生产犬细小病毒中的应用，所述纯化工艺能够完全满足工业生产的需求，并且获得高质量的纯化病毒。
本发明的有益效果在于：
1.本发明提供所述纯化工艺处理效率高，在保证毒价不损失的情况下，除杂率达98％；整个工艺病毒得率达到100％。
2.本发明提供所述纯化工艺可满足应用于生产中产能放大的需求，提高了生产效率，并能实现车间GMP级百升级CPV料液的纯化，保证产品的有效性和生产成本的控制。
附图说明
图1为本发明所述CPV病毒分别在粗纯和精纯后的胶图。
图2为本发明所述CPV病毒车间百升级粗纯和精纯后的胶图。
图3为本发明所述CPV病毒采用千纯4FF分子筛层析结果。
图4为本发明所述CPV病毒采用博格隆4FF分子筛层析结果。
图5为本发明所述CPV病毒采用传统工艺纯化百升级生产层析结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的实施例中，提供一种犬细小病毒生产纯化工艺，步骤包括：将犬细小病毒培养物经过滤澄清后，经阴离子柱填料NanoGel 50Q粗纯和浓缩，洗脱并收集病毒，再通过填料Core400精纯后得到纯化的犬细小病毒。
在本发明的实施例中，具体地，所述纯化工艺为：先用第一缓冲体系进行平衡50Q操作，使填料维持在电导为3～7mS/cm附近，pH 7.5～7.8附近，达成平衡；50Q平衡后，用0.65μm囊式滤芯过滤澄清犬细小病毒料液，进行上样操作，上样柱体积大约为20CV～30CV；用第二缓冲体系进行清洗杂蛋白，清洗至少5个柱体积；用第三缓冲体系进行洗脱CPV病毒颗粒，收集洗脱下的病毒；用第四缓冲液平衡Core400填料，使填料维持在电导为8～12mS/cm附近，pH7.5～7.8附近；将洗脱下来的病毒通过Core400，收集流穿液，即为精纯后病毒液。
作为优选的实施例，所述第一缓冲液为50mM Tris-HCl pH 7.5；所述第二缓冲液为50mM Tris-HCl 150mM NaCl pH 7.5。所述洗脱过程采用第三缓冲液：50mM Tris-HCl500mM NaClpH 7.5。所述精纯步骤使用第四缓冲液维持填料的电导率为8～12mS/cm，pH7.5～7.8。所述第四缓冲液为50mM Tris50mM NaCl。在上述实验条件下，病毒毒价未损失，病毒得率达到100％，除杂率达到98％以上，检测胶图显示无明显杂蛋白条带。
本方案中，由于CPV粒径过小，传统的超滤膜包浓缩工艺及分子筛纯化工艺中损失过大，极大降低了旧工艺的效率。通过阴离子层析50Q填料初步纯化CPV，可达到浓缩10～30倍并初步去杂蛋白的目的。可将毒价为6.5TCID50/0.1mL的犬细小病毒培养物提升至CPV7.5TCID50/0.1mL配苗的要求；后通过Core400填料精纯，保证毒价不损失情况下，除杂率达98％的新工艺流程；整个工艺病毒得率达到100％，满足生产中产能放大的需求，缩短了用工时间，并能实现车间GMP级百升级CPV料液的纯化。
实施例
1.CPV料液的培养方案：培养生长良好的F81细胞(科前生物有限公司提供)单层，弃掉生长液，消化细胞，将细胞悬液按照3.0105个/ml接种至反应器，载体用量为2～5g/L，设定反应器参数(温度37℃、溶氧45～60％、PH值7.2～7.3)，待细胞长满单层后按维持液2％比例接种常规疫苗用犬细小病毒种毒。待出现80％左右细胞病变时，收获病毒液，置-20℃以下保存；
2.CPV浓缩条件的摸索：选择科百特公司的超滤浓缩膜包、纳微公司NanoGel 50Q填料、Cytiva公司的CaptoQ填料作为筛选方案；科百特公司浓缩膜包方案结果显示该工艺毒价损失较大，毒价从6.5TCID50/0.1mL降至4.0TCID50/0.1mL，Cytiva Capto Q填料毒价从6.5TCID50/0.1mL降至5.5TCID50/0.1mL，两个方案毒价均损失较大；只有NanoGel 50Q填料达到浓缩毒价提高的效果，即毒价从6.5TCID50/0.1mL提高至7.5TCID50/0.1mL；
3.精纯方案的优化：比较博格隆、以及千纯公司的4FF分子筛填料，以及Cytiva公司的复合型填料纯化效果，结果显示两家公司的分子筛填料纯化后除杂率达到98％，但是毒价损失较大，不符合要求，只有Cytiva公司的Core400满足除杂率98％以及毒价不损失的双要求；
4.50Q层析缓冲体系的选择：根据线性洗脱，选择第一缓冲液体系：50mM Tris-HClpH 7.5作为50Q填料的平衡盐；第二缓冲体系：50mM Tris-HCl150mM NaCl pH 7.5作为洗杂液；第三缓冲体系：50mM Tris-HCl 500mM NaCl pH 7.5作为病毒洗脱液；在该实验条件下，病毒得率达到100％，除杂率达到98％以上，胶图检测无明显杂蛋白条带；
5.摸索50Q洗脱条件范围：进一步摸索洗脱范围，明确层析参数的范围以控制生产过程中可操作空间，根据DoE(Design ofExperiments)工具，做了一些列实验优化，确定层析步骤中洗脱液pH范围为7.5～7.8，pH低于7.5导致毒价损失，pH高于7.8不符合配苗标准；洗脱液电导范围为18.7～19.7mS/cm；电导高于这个范围毒价损失较大，低于这个范围除杂效率降低；
6.Core400层析缓液冲体系：按照该填料的通用缓冲液，第四缓冲体系：50mM Tris50mM NaCl作为Core400填料的平衡盐。
实验例1实验室不同规模的纯化工艺验证
利用实施例中所述的CPV培养液，按照实施例中摸索得到的工艺，我们在实验室完成了3个规模的工艺验证，分别是：
1)用5mL 50Q填料和5mL Core400填料完成100mL CPV料液的纯化；
2)用50mL 50Q填料和5mL Core400填料完成1000mL CPV料液的纯化；
3)用500mL 50Q填料和100mL Core400填料完成10～19L CPV料液的纯化；
病毒分别在粗纯和精纯后的毒价、及最终纯化所得CPV除杂率和得率数据结果如表1所示。纯化胶图如图1所示。
表1：
表1中结果显示：纯化后CPV毒价相对于培养液毒价有所提高，且均高于7.5，整体除杂率大于98％，得率为100％，图1中精纯后无明显杂蛋白痕迹。
实验例2车间百升级纯化工艺验证
在GMP车间中，利用8.5L 50Q填料和3.5L Core400填料完成如表2所示多批次50-100L的料液的测试；所得结果为：除杂率均大于98％、得率均能满足100％。以126L规格生产为例，纯化胶图如图2所示，精纯后未现明显蛋白杂质痕迹。
表2：
对比实验：传统工艺纯化效果对比
用超滤膜包将实施例准备的CPV料液浓缩30倍后，过4FF分子筛，对收集到的各组分进行纯度和毒价检测，对除杂率和终得率进行计算；实验数据显示，两家公司的4FF分子筛型号(千纯、博格隆)对浓缩30倍的CPV料液纯度均达标，无明显杂蛋白，除杂率大于98％，但得率分别为6.2％和2.6％；百升级生产实验数据与此相同，除杂率达标，无明显杂蛋白条带，得率仅为1.5％。
1.采用千纯4FF分子筛层析情况如表3所示，结果如图3所示。
表3：
| 原样 | E1 | E2 | E1+E2 | |
| 浓度(mg/mL) | 6.585 | 0.275 | 0.283 | 0.279 |
| LgTCID50(0.1mL) | 7.3 | 4.43 | 6 | - |
| 体积(mL) | 10 | 16 | 12 | 28 |
其中，E1：纯化峰；E2：平台峰；E3：色素峰；E1+E2：收获样。
2.采用博格隆4FF分子筛层析情况如表4所示，层析结果如图4所示。
表4：
其中，E1：纯化峰；E2：平台峰；E3：色素峰；E4:色素峰尾；E1+E2：收获样。
3.百升级生产实验数据
百升级生产实验所得毒价结果如表5所示，层析结果如图5所示。
表5：
最后应说明的几点是，虽然上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (9)
1.一种犬细小病毒生产纯化工艺，其特征在于，将犬细小病毒培养物经过滤澄清后，经阴离子柱填料NanoGel 50Q粗纯和浓缩，洗脱并收集病毒，再通过填料Core400精纯后得到纯化的犬细小病毒。
2.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，所述粗纯和浓缩步骤中，先向阴离子柱填料中加入第一缓冲液维持填料的电导率为3～7mS/cm，pH为7.5～7.8，然后再使用第二缓冲液除去蛋白杂质。
3.根据权利要求2所述的纯化工艺，其特征在于，所述第一缓冲液为50mM Tris-HCl pH7.5；所述第二缓冲液为50mM Tris-HCl 150mM NaCl pH7.5。
4.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，所述洗脱过程采用第三缓冲液：50mMTris-HCl 500mM NaCl pH 7.5。
5.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，所述精纯步骤使用第四缓冲液维持填料的电导率为8～12mS/cm，pH 7.5～7.8。
6.根据权利要求5所述的纯化工艺，其特征在于，所述第四缓冲液为50mM Tris 50mMNaCl。
7.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，所述过滤澄清过程采用0.65μm囊式滤芯。
8.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，所述犬细小病毒纯化后的毒价相对于纯化前提高。
9.权利要求1-8任意一项所述纯化工艺在工业生产犬细小病毒中的应用。
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| CN202310238813.3A Pending CN116463300A (zh) | 2023-03-07 | 2023-03-07 | 一种犬细小病毒生产纯化工艺及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116463300A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117106732A (zh) * | 2023-09-07 | 2023-11-24 | 华中农业大学 | 一株犬细小病毒及其应用 |
-
2023
- 2023-03-07 CN CN202310238813.3A patent/CN116463300A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117106732A (zh) * | 2023-09-07 | 2023-11-24 | 华中农业大学 | 一株犬细小病毒及其应用 |
| CN117106732B (zh) * | 2023-09-07 | 2024-02-06 | 华中农业大学 | 一株犬细小病毒及其应用 |
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