CN117106732A - 一株犬细小病毒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株犬细小病毒及其应用，涉及生物技术领域。该犬细小病毒于2023年7月18日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:V202377。本发明还提供该犬细小病毒在制备犬细小病毒疫苗中的应用。本发明提供的犬细小病毒是来源于中国本土流行的犬细小病毒毒株，更符合国内犬细小病毒毒株流行规律，遗传进化分析表明该病毒株与其它犬细小病毒流行病毒株之间具有更好的亲缘关系，该犬细小病毒具有良好的突破母源抗体的潜力，能够产生良好的交叉保护作用，具有较高的病毒滴度，还具有降低犬细小病毒疫苗生产成本的潜力。

Description

一株犬细小病毒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一株犬细小病毒及其应用。
背景技术
犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine Parvovirus，CPV)感染引起的一种急性烈性的传染病，根据临床症状将其分为肠炎型与心肌炎型，患病动物伴有食欲减退、精神沉郁、发烧、呕吐腹泻等症状，患犬排出带有恶臭气味“番茄样粪便”是其比较典型的症状。心肌炎型往往出现在幼犬，一旦发病死亡率接近100％。
CPV属于细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒属(Protoparvovirus genus)，是单股负链DNA病毒，病毒基因组大约在5200nt，基因组由两个开放阅读框(open readingframes，ORFs)组成，分别编码结构蛋白VP1和VP2，其中VP2是主要的免疫蛋白，以及非结构蛋白NS1和NS2，在基因组两端存在调节基因复制与表达的发卡(hairpin)结构，病毒粒子无囊膜，呈直径为25nm的二十面体结构。衣壳由6个结构蛋白VP1与54个VP2组成。
据Appel研究表明CPV-2在20世纪90年代开始在世界范围内广泛流行。此后在环境压力与病毒本身复制错配情况下，不断出现新的变异株，在1979年发现了新的变异毒株，该病毒与CPV-2在VP2蛋白氨基酸水平上相比出现了5个突变，并将其命名为CPV-2a(426Asn)。此后，将VP2蛋白的426(2a Asn)位点氨基酸作为分类标准，1984年出现了CPV-2b(Asn426Asp)，在此之后又出现了新的变异株，依据297位氨基酸的差异将新出现的变异株命名为new CPV-2a和new CPV-2b，Buonavoglia研究发现2000年出现了另外一个变异CPV-2c(Asn 426Glu)。
在Qi等人的研究结果中表明早在1970年CPV疑似病例就在中国东部、东南以及东北地区的警犬当中广泛流行，但是直到1982年才确定中国存在CPV流行。中国幅员辽阔，全国各个地区CPV的流行状况有所差异，Zhao等学者在东北地区的调查中发现主要流行毒株是CPV-2a、CPV-2b，同时也发现CPV-2c在山东省开始出现。在东部以及东南沿海地区，Wu等调查发现北京市2014年为止细小病毒只有这三种：CPV-2C、New CPV-2a、new CPV-2b。Chunmei Ju等在深圳发现了New CPV-2a，Yiping Zhu等发现了一株CPV-2a，这表明CPV在不断地向各地传播与扩散。Zhao等在南京地区调查发现主要的流行毒株是CPV-2a。在中部地区Xiangdong Li等研究表明猫细小new CPV-2a and CPV-2在河南省广泛流行。ZhanqinZhao等对河南省做了2009-2014年为期5年的CPV流行病学调查发现流行毒株主要以CPV-2a与CPV-2b为主。在西南西北地区J.Xu等对甘肃和四川省进行了CPV的流行病学调查结果显示除了GS-K11是CPV-2b之外其它均是CPV-2a。Shi-Chong Han等在兰州分离出CPV-LZ1和CPV-LZ2分别属于New CPV-2a和New CPV-2b。Qing-ye Zhuang等的研究表明在四川省同时流行着CPV-2a、New CPV-2b和CPV-2c。
疫苗免疫接种是目前最有效且最经济的防控手段，但是现阶段的商品化疫苗并不能完全提供保护，疫苗免疫失败的案例时有发生。经调查发现当前国内所用的疫苗主要以进口疫苗为主，且进口疫苗毒株是比较原始的CPV-2毒株，疫苗毒株与本地流行毒株的差异是免疫失败的重要原因之一，此外，母源抗体的干扰问题同样不能忽视。
为了解决当下CPV疫苗免疫效果差和母源抗体干扰免疫效果的问题，亟需开发可突破较高母源抗体，且来源于本土流行病毒株的CPV疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供一株犬细小病毒及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该犬细小病毒具有良好的突破母源抗体的潜力，能够产生良好的交叉保护作用，具有较高的病毒滴度，还具有降低犬细小病毒疫苗生产成本的潜力。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一株犬细小病毒(Canine Parvovirus)，于2023年7月18日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:V202377。
本发明还提供上述的犬细小病毒在制备犬细小病毒疫苗中的应用。
本发明还提供一种犬细小病毒疫苗，活性成分包括经过减毒和/或灭活处理的上述的犬细小病毒。
进一步地，所述犬细小病毒疫苗还包括药学上可接受的辅料。
本发明还提供一种上述的犬细小病毒疫苗的制备方法，包括将上述的犬细小病毒进行减毒和/或灭活处理，得到所述犬细小病毒疫苗的步骤。
本发明还提供上述的犬细小病毒在制备犬细小病毒抗体中的应用。
进一步地，所述犬细小病毒抗体包括结合抗体或中和抗体。
本发明还提供上述的犬细小病毒在制备检测犬细小病毒的产品中的应用。
进一步地，所述产品包括试剂或试剂盒。
本发明还提供上述的犬细小病毒在制备预防和/或治疗犬细小病毒所致疾病的药物中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供的犬细小病毒是来源于中国本土流行的犬细小病毒毒株，更符合国内犬细小病毒毒株流行规律，遗传进化分析表明该病毒株与其它犬细小病毒流行病毒株之间具有更好的亲缘关系。本发明提供的犬细小病毒具有良好的突破母源抗体的潜力，能够产生良好的交叉保护作用，具有较高的病毒滴度，还具有降低犬细小病毒疫苗生产成本的潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为CPV-W1025F81细胞上的病变；
图2为利用CPV特异性引物进行PCR检测的结果；其中，M：为2000bpmarker，1为阴性对照、2～5为检测样品；
图3为CPV-W1025在F81上的间接免疫荧光检测结果；
图4为CPV-W1025在传代过程中病毒滴度的变化；
图5为CPV-W1025的生长曲线测定结果；
图6为CPV-W1025株F80和F120代次毒接种犬后的体温变化；
图7为CPV-W1025株F80和F120代次毒接种犬后的体重变化；
图8为CPV-W1025株F80和F120代次毒接种犬后的抗体水平变化；
图9为CPV-W1025株免疫实验犬产生的中和抗体检测结果；
图10为CPV效检毒对CPV-W1025株F80代次毒免疫接种最小抗原含量实验抗体变化；
图11为CPV效检毒对CPV-W1025株F80代次毒免疫接种最小抗原含量实验攻毒后的体温度变化；
图12为CPV效检毒对CPV-W1025株F80代次毒免疫接种最小抗原含量实验攻毒后的体重变化；
图13为CPV效检毒对CPV-W1025株F80代次毒免疫接种最小抗原含量实验攻毒后的存活率；
图14为市售疫苗与CPV-W1025株免疫原性比较结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中使用的F81细胞购自尚恩生物。
实施例1
1.方法
1.1CPV-W1025的分离及鉴定
(1)从宠物医院收集确诊犬细小病毒病的病料，病料多为粪便。将粪便用10倍体积的生理盐水稀释，混匀(冰上操作)，4℃，8000rpm，20min。离心取上清，0.22μm滤器过滤，分装至无菌EP管中，作为待分离病毒，-80℃保存。
(2)在六孔板中将易感细胞F81培养到细胞密度50％-60％，将上步处理后的病料按照1:10的比例接种易感细胞F81中，放入37℃培养箱，吸附2h，之后换成含2倍双抗的2％DMEM维持液，放入37℃、5％CO2培养箱培养5天，观察是否有病变出现。
(3)第一代若未出现病变，将第一代的培养物取出在-80℃与常温之间冻融3次，8000rpm，4℃，20min，取上清，按照1:10的比例接于50％-60％密度的F81细胞上，吸附2h，换成维持液，培养5天，观察病变。如此盲传5代，直到出现病变。
(4)将出现病变的代次同样冻融3次，离心，取上清，分装至无菌离心管中，即为原始毒，记为P0代毒。
(5)PCR鉴定：提取病变病毒液基因组1μL，进行PCR鉴定，鉴定体系为2×Taqmastermix5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，模板1μL，水3μL。(引物序列：上游引物：GAATCTGCTACTCAGCCACCAAC；下游引物：GTGCACTATAACCAACCTCAGC)将上述试剂充分混匀，按下列条件进行扩增：95℃变性3min后进入循环，循环参数：95℃15s，56℃15s，72℃30s，35个循环后72℃延伸10min，16℃5min。反应结束后，将PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测。
(6)间接免疫荧光鉴定：将F81细胞培养于6孔培养板，细胞长成50-60％左右即可，加入100μL病毒液，吸附2h，换成2％维持液，放入培养箱培养48h。出现50％病变，弃掉孔中培养基，用PBS清洗3遍后加入4％多聚甲醛室温作用30min；弃掉废液，用PBS洗3次后加入含1％BSA的PBST封闭液，在37℃静置作用1h左右；PBS洗3次后加入1:3000稀释的一抗(CPV鼠单克隆抗体)，37℃静置作用1h；PBST洗4次后加入1：1000加入羊抗鼠荧光二抗，37℃避光温育1h；弃掉二抗，PBS洗3次，每孔加入1mLPBST，在荧光显微镜下观察并采集图片。
1.2CPV-W1025的噬斑纯化
(1)将F81细胞消化均匀后调节细胞浓度，以适宜的浓度接种6孔板，当细胞密度为50％-60％，准备病毒液，进行10倍倍比稀释，获得五个浓度的病毒液。分别向每个孔里滴加入稀释后的病毒液100μL，37℃吸附2h，每隔15min摇一下板子，使病毒液充分吸附细胞，2h后吸弃病毒液，PBS洗两遍。
(2)制备2％的低熔点琼脂糖溶液，72℃融化，置于37℃水浴锅中保温待用，2×DMEM也置于37℃水浴锅中预热。
(3)将上述2％低琼脂糖溶液与2×DMEM维持液(2％血清，1％双抗)按照1:1的比例混匀后，加入各孔中，2mL/孔，将6孔板放于4℃冰箱10min，使其充分凝固。待琼脂糖凝固后，倒置于37℃，CO2培养箱中培养。24，36h观察病变。
(4)对光观察，对噬斑做标记，选取合适大小的噬斑连同琼脂一起挑起使用黄色枪头，提前剪掉尖端部位，使枪头口径与噬斑大小相仿，然后用移液器直接吸取，覆盖物一起被吸入枪头，溶解在适量细胞培养液中，用作病毒的下一轮增殖与鉴定。如此重复3轮。
1.3CPV-W1025生长动力学的测定
(1)将状态良好的F81细胞传代接种于24孔板中，待细胞密度达到约60％～70％，消化细胞进行细胞计数，以1、0.1、0.05、0.01、0.001MOI的病毒量感染细胞，同时换成2％的维持液，置于37℃培养箱中培养。
(2)接毒后分别在24、48、72、96、120h准时收取病毒培养上清，4℃，8000rpm离心10min，用F81细胞检测病毒TCID50。
(3)将细胞传代接种于96孔板中，待细胞密度达到约50％，用细胞维持液将病毒按10倍倍比稀释后，每孔加入100μL病毒液，每个稀释度作8个重复，放入培养箱中培养。
(4)60h后取出，用间接免疫荧光的方法对毒价结果进行测定，并用Reed-Muench法计算病毒TCID50。
1.4CPV-W1025传代致弱
为了确保CPV-W1025作为减毒疫苗的安全性，本发明将CPV-W1025在F81细胞上进行连续传代培养，具体步骤如下：
(1)将已经病变80％左右的CPV-W1025细胞培养物，置于-80℃与常温之间反复冻融3次，4℃8000rpm离心10min，收取上清，放置于-80℃保存备用。
(2)将生长状态良好的F81细胞，进行消化培养，每次在T25细胞培养瓶中的细胞数目在106个左右，将培养基补充到5ml。
(3)取保存于-80℃的CPV-W1025培养上清，按照T25培养基体积的1/5加入到刚传完的F81细胞中，混匀，放置于37℃，5％CO2的培养条件下培养3天，之后进行以上重复操作，直至安全。
2.结果
通过对疑似感染CPV病犬的病料进行病毒的分离鉴定，成功分离到一株CPV-2b亚型分离株，其在易感细胞F81上表现出CPV样的病变(图1)，细胞出现拉网、拉丝、变狭长、破碎、脱落等病变。通过用CPV特异性引物进行PCR检测，检测出相应大小的条带(图2)。通过CPV单克隆抗体进行IFA检测，细胞中检测到了特异性的荧光(图3)。
对该CPV-2b亚型分离株进行多轮噬斑纯化后，得到了单一纯合的病毒株，命名为CPV-W1025，并于2023年7月18日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：V202377。
将CPV-W1025连续在F81细胞上传代培养，并每隔10代进行一次病毒滴度的测定，病毒滴度随培养代次的增加而逐渐升高并逐渐趋于稳定(图4)，同时在传代过程中对VP2进行测序，并将氨基酸突变情况进行整理(表1)。在病毒滴度逐渐稳定之后，本发明按照不同的MOI进行了CPV-W1025在F81细胞上生长特性的研究，其在同步接种后72h毒价达到最高，为107.5TCID50/mL(图5)。
表1CPV-W1025传代培养过程中VP2蛋白部分氨基酸突变
对分离到的CPV-W1025株进行了全基因组测序，VP2基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，CPV-W1025的全长基因组序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.1：
ATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCAGACGGTGGTCAGCCTGCTGTCAGAAATGAAAGAGCTACAGGATCTGGGAACGGGTCTGGAGGCGGGGGTGGTGGTGGTTCTGGGGGTGTGGGGATTTCTACGGGTACTTTCAATAATCAGACGGAATTTAAATTTTTGGAAAACGGATGGGTGGAAATCACAGCAAACTCAAGCAGACTTGTACATTTAAATATGCCAGAAAGTGAAAATTATAGAAGAGTGGTTGTAAATAATTTGGATAAAACTGCAGTTAACGGAAACATGGCTTTAGATGATACCCATGCACAAATTGTAACACCTTGGTCATTGGTTGATGCAAATGCTTGGGGAGTTTGGTTTAATCCAGGAGATTGGCAACTAATTGTTAATACTATGAGTGAGTTGCATTTAGTTAGTTTTGAACAAGAAATTTTTAATGTTGTTTTAAAGACTGTTTCAGAATCTGCTACTCAGCCACCAACTAAAGTTTATAATAATGATTTAACTGCATCATTGATGGTTGCATTAGATAGTAATAATACTATGCCATTTACTCCAGCAGCTATGAGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATGGAAACCAACCATACCAACTCCATGGAGATATTATTTTCAATGGGATAGAACATTAATACCATCTCATACTGGAACTAGTGGCACACCAACAAATATATACCATGGTACAGATCCAGATGATGTTCAATTTTACACTATTGAAAATTCTGTGCCAGTACACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAGGAACATTTTATTTTGATTGTAAACCATGTAGACTAACACACACATGGCAAACAAATAGAGCATTGGGCTTACCACCATTTCTAAATTCTTTGCCTCAAGCTGAAGGAGCTACTAACTTTGGTTATATAGGAGTTCAACAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTCAAATGGGAAATACAAACATTATTACTGAAGCTACTATTATGAGACCAGCTGAGGTTGGTTATAGTGCACCATATTATTCTTTTGAGGCGTCTACACAAGGGTCATTTAAAACACCTATTGCAGCAGGACGGGGGGGAGCGCAAACAGATGAAAATCAAGCAGCAGATGGTGATCCAAGATATGCATTTGGTAGACAACATGGTCAAAAAACTACCACAACAGGAGAAACACCTGAGAGATTTACATATATAGCACATCAAGATACAGGAAGATATCCAGAAGGAGATTGGATTCAAAATATTAACTTTAACCTTCCTGTAACAGATGATAATGTATTGCTACCAACAGATCCAATTGGAGGTAAAGCAGGAATTAACTATACTAATATATTTAATACTTATGGTCCTTTAACTGCATTAAATAATGTACCACCAGTTTATCCAAATGGTCAAATTTGGGATAAAGAATTTGATACTGACTTAAAACCAAGACTTCATGTAAATGCACCATTTGTTTGTCAAAATAATTGTCCTGGTCAATTATTTGTAAAAGTTGCGCCTAATTTAACAAATGAATATGATCCTGATGCATCTGCTAATATGTCAAGAATTGTAACTTACTCAGATTTTTGGTGGAAAGGTAAATTAGTATTTAAAGCTAAACTAAGAGCCTCTCATACTTGGAATCCAATTCAACAAATGAGTATTAATGTAGATAACCAATTTAACTATCTACCAAGTAATATTGGAGGTATGAAAATTGTACATGAAAAATCTCAACTAGCACCTAGAAAATTATACTAA。
SEQ ID NO.2：
ATGTCTGGCAACCAGTATACTGAGGAAGTTATGGAGGGAGTAAATTGGTTGAAGAGACATGCAGAAAATGAAGCATTTTCGTTTGTTTTTAAATGTGACAACGTCCAACTAAATGGAAAGGATGTTCGCTGGAACAACTATACCAAACCAATTCAAAATGAAGAGCTAACATCTTTAATTAGAGGAGCACAAACAGCAATGGATCAAACCGAAGAAGAAGAAATGGACTGGGAATCGGAAGTTGATAGCCTCGCCAAAAAGCAAGTACAAACTTTTGATGCATTAATTAAAAAATGTCTTTTTGAAGTCTTTGTTTCTAAAAATATAGAACCAAATGAATGTGTTTGGTTTATTCAACATGAATGGGGAAAAGATCAAGGCTGGCATTGTCATGTTTTACTTCATAGTAAAAACTTACAACAAGCAACTGGTAAATGGCTACGCAGACAAATGAATATGTATTGGAGTAGATGGTTGGTGACTCTTTGTTCGGTAAACTTAACACCAACTGAAAAGATTAAGCTCAGAGAAATTGCAGAAGATAGTGAATGGGTGACTATATTAACATACAGACATAAGCAAACAAAAAAAGACTATGTTAAAATGGTTCATTTTGGAAATATGATAGCATATTACTTTTTAACAAAGAAAAAAATTGTCCACATGACAAAAGAAAGTGGCTATTTTTTAAGTACTGATTCTGGTTGGAAATTTAACTTTATGAAGTATCAAGACAGACAAATTGTCAGTACACTTTACACTGAACAAATGAAACCAGAAACCGTTGAAACCACAGTGACGACAGCACAGGAAACAAAGCGCGGGAGAATTCAAACTAAAAAGGAAGTGTCAATCAAATGTACTTTGCGGGACTTGGTTAGTAAAAGAGTAACATCACCTGAAGACTGGATGATGTTACAACCAGATAGTTATATTGAAATGATGGCACAACCAGGAGGTGAAAATCTTTTAAAAAATACACTTGAAATTTGTACTTTGACTTTAGCAAGAACAAAAACAGCATTTGAATTAATACTTGAAAAAGCAGATAATACTAAACTAACTAACTTTGATCTTGCAAATTCTAGAACATGTCAAATTTTTAGAATGCATGGATGGAATTGGATTAAAGTTTGTCACGCTATAGCATGTGTTTTAAATAGACAAGGTGGTAAAAGAAATACAGTTCTTTTTCATGGACCAGCAAGTACAGGAAAATCTATCATTGCTCAAGCCATAGCACAAGCTGTGGGTAATGTTGGTTGTTATAATGCAGCAAATGTGAATTTTCCATTTAATGACTGTACCAATAAAAATTTAATTTGGATTGAAGAAGCTGGTAACTTTGGTCAACAAGTTAATCAATTTAAAGCAATCTGTTCTGGACAAACAATTAGAATTGATCAAAAAGGTAAAGGAAGTAAGCAAATTGAACCAACTCCAGTAATTATGACAACTAATGAAAATATAACAATTGTGAGAATTGGATGCGAAGAAAGACCTGAACATACACAACCAATAAGAGACAGAATGTTGAACATTAAGTTAGTATGTAAGCTTCCAGGAGACTTTGGTTTGGTTGATAAAGAAGAATGGCCTTTAATATGTGCATGGTTGGTTAAACATGGCTTTGTATCAACCATGGCTAACTATACACATCATTGGGGAAAAGTGCCAGAATGGGATGAAAACTGGGCGGAGCCTAAAATACAAGAAGGTATAAATTCACCAGGTTGCAAAGACTTAAAGACACAAGCGGCAAGCAATCCTCAGAGTCAAGACCAAGTTCTAACTCCTCTGACTCCGGACGTAGTGGACCTTGCACTGGAACCGTGGAGTACTCCAGATACGCCTATTGCAGAAACTGCAAATCAACAATCAAACCAACTTGGCGTTACTCACAAAGACGTGCAAGCGAGTCCAACGTGGTCCGAAATAGAGGCAGACCTGAGAGCCATCTTTACTTCTGAACAATTGGAAGAAGATTTTCGAGACGACTTGGATTAAGGTACGATGGCACCTCCGGCAAAGAGAGCCAGGAGAGGTAAGGGTGTGTTAGTGAAGTGGGGGGAGGGGAAGAATTTAATGACTTAACTAAGTATGTGTTTTTTTATAGGACTTGTGCCTCCAGGTTATAAATATCTTGGGCCTGGGAACAGTCTTGACCAAGGAGAACCAACTAACCCTTCTGACGCCGCTGCAAAAGAACACGACGAAGCTTACGCTGCTTATCTTCGCTCTGGTAAAAACCCATACTTATATTTCTCGCCAGCAGATCAACGCTTTATAGATCAAACTAAGGACGCTAAAGATTGGGGGGGGAAAATAGGACATTATTTTTTTAGAGCTAAAAAGGCAATTGCTCCAGTATTAACTGATACACCAGATCATCCATCAACATCAAGACCAACAAAACCAACTAAAAGAAGTAGACCACCACCTCATATTTTCATCAATCTTGCAAAAAAAAAAAAAGCCGGTGCAGGACAAGTAAAAAGAGACAATCTTGCACCAATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCAGACGGTGGTCAGCCTGCTGTCAGAAATGAAAGAGCTACAGGATCTGGGAACGGGTCTGGAGGCGGGGGTGGTGGTGGTTCTGGGGGTGTGGGGATTTCTACGGGTACTTTCAATAATCAGACGGAATTTAAATTTTTGGAAAACGGATGGGTGGAAATCACAGCAAACTCAAGCAGACTTGTACATTTAAATATGCCAGAAAGTGAAAATTATAGAAGAGTGGTTGTAAATAATTTGGATAAAACTGCAGTTAACGGAAACATGGCTTTAGATGATACCCATGCACAAATTGTAACACCTTGGTCATTGGTTGATGCAAATGCTTGGGGAGTTTGGTTTAATCCAGGAGATTGGCAACTAATTGTTAATACTATGAGTGAGTTGCATTTAGTTAGTTTTGAACAAGAAATTTTTAATGTTGTTTTAAAGACTGTTTCAGAATCTGCTACTCAGCCACCAACTAAAGTTTATAATAATGATTTAACTGCATCATTGATGGTTGCATTAGATAGTAATAATACTATGCCATTTACTCCAGCAGCTATGAGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATGGAAACCAACCATACCAACTCCATGGAGATATTATTTTCAATGGGATAGAACATTAATACCATCTCATACTGGAACTAGTGGCACACCAACAAATATATACCATGGTACAGATCCAGATGATGTTCAATTTTACACTATTGAAAATTCTGTGCCAGTACACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAGGAACATTTTATTTTGATTGTAAACCATGTAGACTAACACACACATGGCAAACAAATAGAGCATTGGGCTTACCACCATTTCTAAATTCTTTGCCTCAAGCTGAAGGAAGTACTAACTTTGGTTATATAGGAGTTCAACAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTCAAATGGGAAATACAAACATTATTACTGAAGCTACTATTATGAGACCAGCTGAGGTTGGTTATAGTGCACCATATTATTCTTTTGAGGCGTCTACACAAGGGCCATTTAAAACACCTATTGCAGCAGGACGGGGGGGAGCGCAAACAGATGAAAATCAAGCAGCAGATGGTGATCCAAGATATGCATTTGGTAGACAACATGGTCAAAAAACTACCACAACAGGAGAAACACCTGAGAGATTTACATATATAGCACATCAAGATACAGGAAGATATCCAGAAGGAGATTGGATTCAAAATATTAACTTTAACCTTCCTGTAACAGATGATAATGTATTGCTACCAACAGATCCAATTGGAGGTAAAGCAGGAATTAACTATACTAATATATTTAATACTTATGGTCCTTTAACTGCATTAAATAATGTACCACCAGTTTATCCAAATGGTCAAATTTGGGATAAAGAATTTGATACTGACTTAAAACCAAGACTTCATGTAAATGCACCATTTGTTTGTCAAAATAATTGTCCTGGTCAATTATTTGTAAAAGTTGCGCCTAATTTAACAAATGAATATGATCCTGATGCATCTGCTAATATGTCAAGAATTGTAACTTACTCAGATTTTTGGTGGAAAGGTAAATTAGTATTTAAAGCTAAACTAAGAGCCTCTCATACTTGGAATCCAATTCAACAAATGAGTATTAATGTAGATAACCAATTTAACTATGTACCAAGTAATATTGGAGGTATGAAAATTGTATATGAAAAATCTCAACTAGCACCTAGAAAATTATACTAACATACTTACTATGTTTTTATGTTTATTACATATTATTTTAAGATTAATTAAATTACAGCATAGAAATATTGTACTTGTATTTGATATAGGATTTAGAAGGTTTGTTATATGGTATACAATAACTGTAAGAAATAGAAGAACATTTAGATCATAGTTAGTAGTTTGTTTTATAAAATGTATTGTAAACCATTAATGTATGTTGTTATGGTGTGGGTGGTTGGTTGGTTTGCCCTTAGAATATGTTAAGGACCAAAAAAATCAATAAAAGACATTTAAAACTAAATGGCCTCGTATACTGTCTATAAGGTGAACTAACCTTACCATAAAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATCGTAATACAGGTTCAT。
实施例2
1.方法
(1)测定CPV-W1025P80和P120代次毒株的毒价后，分别进行犬活苗免疫实验，每只犬颈部皮下注射107.25TCID50的剂量(以市售疫苗为参照，注射剂量相同)。
(2)免疫之后每天定点称体重，量体温，观察临床症状，评估疫苗的安全性。
(3)每周对犬进行前肢静脉采血，通过中和实验检测中和抗体水平。
中和实验：将采得的静脉血4℃过夜，析出血清，4500rpm，5min，取上清，56℃灭活30min。使用2％DMEM将血清进行2倍比稀释(4个重复)，加入96孔板，50μL/孔。将CPV病毒液稀释到100TCID50/50μL，与稀释好的血清等量混合，加入96孔板，50μL/孔，37℃感作1h。感作完成后，取出96孔板，同步接种加入细胞，50μL/孔细胞液，使细胞密度在50％-60％。
本步骤采用的CPV病毒为：CPV-2(accession:MW650832.1)、CPV-2a(accession：MK388674.1)、CPV-2b(accession：KC881278.1)以及CPV-2c(accession：MK388674.1)毒株。
(4)72h之后通过对中和实验样品进行IFA，进而判定中和孔，此后用Reed-Muench法计算病毒中和抗体效价。
2.结果
本发明将P80和P120代次毒株按照107.5TCID50/头份的剂量接种于实验犬的颈背部皮下，通过测定病毒接种后14天以内实验犬的体温和体重变化进而进行安全性评价，结果见图6和图7。在整个观察期内实验犬体温未见明显异常，在正常范围内波动，同时体重也是呈现逐渐增重的趋势，由此说明P80和P120代病毒具有较好的安全性。
同时在本次实验中也进行了P80和P120免疫原性比较实验，在病毒接种前于实验犬臂头静脉采血，在接种传代毒之后每隔7天进行一次静脉采血，检测中和抗体水平，在第3周采完血之后，用CPV效检毒株进行攻毒，进而判断P80和P120免疫后攻毒保护差异，攻毒后持续监测14天，主要观察临床症状和监测体温、体重。在免疫完1周抗体水平就有所上升，在第2、3周抗体水平持续上升(图8)，说明CPVP80和P120具有良好的免疫原性，可以很好的刺激机体产生针对CPV的高水平中和抗体。
由CPV-W1025刺激产生的中和抗体可以中和不同亚型的CPV毒株，表明CPV-W1025毒株刺激机体产生的中和抗体具有较好的交叉保护作用(图9)。
此外，为了确定CPV-W1025最小免疫含量，本发明中设置了3个免疫滴度107.25TCID50/头份、106.25TCID50/头份、105.25TCID50/头份和一个空白对照组，分别进行相应得免疫接种，并在免疫前和免疫后每隔7天采集血液并测定中和抗体效价(如图10)，免疫后第三周进行攻毒，攻毒之后并未出现CPV临床症状，体温在正常范围内波动(图11)，体重呈现出递增的趋势(图12)，但是空白对照组出现典型的CPV临床症状并最终以死亡为转归(图13)。攻毒实验结果表明CPV-W1025能够提供良好的免疫保护作用(图14)。
实施例3
为了探究CPV-W1025致弱毒株的母源抗体突破能力，本发明通过测定CPV中和抗体效检，挑选了CPV母源抗体较高的实验犬，然后按照107.25TCID50/头份的剂量进行免疫接种，并在免疫后第一周和第二周分别采血，测定中和抗体，结果见表2，CPV-W1025母源抗体效价结果表明该传代致弱毒株具有良好的母源抗体突破能力，该特征在幼犬的提前免疫中具有良好的优势。
表2 CPV-W1025母源抗体突破实验结果统计
编号 母源抗体 1W 2W
1 1:90 1:1287 1:2574
2 1:724 1:203 1:2574
3 1:814 1:643 1:2574
4 1:181 1:203 1:512
5 1:256 1:160 1:1287
6 1:321 1:160 1:814
7 1:128 1:432 1:1024
8 1:512 1:181 1:2896
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一株犬细小病毒(CanineParvovirus)，其特征在于，于2023年7月18日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:V202377。
2.一株如权利要求1所述的犬细小病毒在制备犬细小病毒疫苗中的应用。
3.一种犬细小病毒疫苗，其特征在于，活性成分包括经过减毒和/或灭活处理的权利要求1所述的犬细小病毒。
4.根据权利要求3所述的犬细小病毒疫苗，其特征在于，所述犬细小病毒疫苗还包括药学上可接受的辅料。
5.一种如权利要求3或4所述的犬细小病毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的犬细小病毒进行减毒和/或灭活处理，得到所述犬细小病毒疫苗的步骤。
6.一株如权利要求1所述的犬细小病毒在制备犬细小病毒抗体中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述犬细小病毒抗体包括结合抗体或中和抗体。
8.一株如权利要求1所述的犬细小病毒在制备检测犬细小病毒的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂或试剂盒。
10.一株如权利要求1所述的犬细小病毒在制备预防和/或治疗犬细小病毒所致疾病的药物中的应用。
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