CN110218704A - 一种抗狂犬病毒g蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
一种抗狂犬病毒g蛋白的单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗狂犬病毒G蛋白的单克隆抗体，它是由杂交瘤细胞株RABV G Mab 7A3分泌的，所述杂交瘤细胞株RABV G Mab 7A3保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201975。本发明还公开了该单克隆抗体在制备狂犬病毒检测试剂盒中的应用以及一种狂犬病毒中和抗体竞争ELISA检测试剂盒，该试剂盒以狂犬病毒LBNSE毒株的全病毒蛋白为包被原，以量子点标记的单克隆抗体为竞争抗体，具有病毒传播风险小、检测灵敏度和准确性高，特异性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及抗狂犬病毒G蛋白的单克隆抗体及其在制备狂犬病毒检测试剂盒中的应用，属于病毒检测领域。
背景技术
狂犬病是由狂犬病毒引起的人畜共患传染病，一旦发病，致死率接近100％。狂犬病毒是弹状病毒科、狂犬病毒属的单股负链RNA病毒，其由5个结构蛋白组成，包括核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA聚合酶(L)。狂犬病毒可感染几乎所有的温血动物，其主要通过带毒的犬猫抓伤或咬伤而传播，病毒进入人或动物体内后，首先在受伤部位的肌肉处短暂复制，随后进入附近的神经组织内逆轴突传播，沿外周神经系统逆行，最终到达中枢神经系统后大量复制，引发神经性脑炎，进而产生恐风、恐水、咽喉麻痹等神经症状，最终死亡。据最新报道，世界上每年多于6万人死于狂犬病。因此，狂犬病在暴露后的紧急预防接种和检测十分关键。
世界卫生组织(WHO)和世界动物卫生组织(OIE)建议只有人或动物的体内的狂犬中和抗体水平达到0.5IU/ml时，才能有效抵御狂犬病病毒的攻击。据不完全统计，每年约有1500万人被犬猫抓伤或咬伤，近年来，我国频发“假狂犬疫苗”事件，以及不同动物或人的免疫机能不一，每年仍然有超过500人死于狂犬病。因此，人和动物狂犬疫苗免疫结束后，应及时进行狂犬病毒中和抗体的检测，当抗体水平低于保护值时应该及时加强免疫。
目前，基于酶联免疫吸附试验(ELISA)建立的狂犬病毒中和抗体检测方法主要包括间接ELISA、竞争ELISA等，其主要原理都是通过抗原抗体反应，最后通过显色反应读数。目前全世界公认的狂犬病毒中和抗体检测金标准方法为快速荧光灶抑制试验(RFFIT)和荧光抗体病毒中和实验(FAVN)，二者均为细胞水平的病毒中和试验，检测结果的重复性、敏感性和特异性均较好。但是以上检测方法不仅对检测人员操作的熟练程度要求很高，而且还需要用到活的狂犬病毒，具有潜在的传播狂犬病毒的风险，仅在少量有资质的专业实验室才能够开展使用。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种抗狂犬病毒G蛋白的单克隆抗体。
本发明的第二个目的是提供抗狂犬病毒G蛋白的单克隆抗体的应用，尤其是在制备狂犬病毒检测试剂盒中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种狂犬病毒中和抗体竞争ELISA检测试剂盒。
本发明所提供的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株RABV G Mab 7A3所分泌的，所述杂交瘤细胞株RABV G Mab 7A3，于2019年04月29日保藏在湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C201975。
所述杂交瘤细胞株RABV G Mab 7A3是以狂犬病毒LBNSE毒株的全病毒蛋白为抗原，免疫动物并进行细胞融合，然后进行抗性筛选获得的，该细胞株不仅能稳定分泌抗狂犬病毒G蛋白的单克隆抗体，而且具有较高的中和活性，所产生的单克隆抗体能特异性识别不同狂犬病毒株抗原的构象表位。
因此，本发明提供的单克隆抗体能用于制备狂犬病毒检测试剂盒。
一种狂犬病毒中和抗体竞争ELISA检测试剂盒，含有包被在固相载体上的包被原和稀释的竞争抗体，所述包被原为狂犬病毒LBNSE毒株的全病毒蛋白，所述竞争抗体为以上所述的抗狂犬病毒G蛋白的单克隆抗体。
优选地，所述单克隆抗体是量子点标记的单克隆抗体。
进一步优选地，所述量子点是羧基化的ZnCdSe/ZnS量子点。
进一步优选地，所述包被原的包被浓度为6.25ug/ml，所述竞争抗体的稀释度为1：100。
该试剂盒针对人或动物狂犬病毒中和抗体的检测，其原理是基于直接单抗竞争ELISA技术，先将0.2％甲醛灭活的狂犬病毒LBNSE毒株经蔗糖密度梯度离心法纯化获得的全病毒蛋白作为包被原，包被酶标板，再将人或动物血清以及阴、阳性血清与量子点标记的竞争抗体等体积混合后，加入到包被有抗原的酶标板中，最后根据荧光强度来判断待测样品中狂犬病毒中和抗体的含量。本发明所使用的包被原和竞争抗体均为首创。
该试剂盒最大的优点在于以狂犬病全病毒蛋白代替了狂犬病活病毒，从而降低了潜在的传播狂犬病毒的风险，能在更大范围内推广应用。其次，该试剂盒采用的竞争抗体是量子点标记的单克隆抗体，其检测灵敏度是传统酶标抗体的1000倍左右。该试剂盒具有检测准确性高，特异性好等优点。
附图说明
图1是LBNSE毒株与SAD B19毒株的G蛋白氨基酸差异比较。
图2是蔗糖密度梯度离心法纯化后的LBNSE全病毒蛋白的考马斯亮蓝染色图。
图3是通过亚克隆筛选到的9株杂交瘤细胞，均能稳定分泌抗狂犬病毒G蛋白单克隆抗体。
图4是9株杂交瘤细胞的中和抗体滴度试验结果。
图5是中和抗体对不同狂犬病毒株的识别能力。
图6是血清抗体滴度与相对荧光强度的线性曲线。
图7是采用量子点标记的7A3单克隆抗体进行ELISA检测的最低检测限。
图8是采用酶标7A3单克隆抗体进行ELISA检测的最低检测限。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1LBNSE全病毒蛋白抗原的制备
1.毒株来源
狂犬病毒LBNSE毒株是以狂犬病毒SAD B19毒株为亲本，将SAD B19的G蛋白第194位氨基酸从天冬氨酸突变成丝氨酸，第333位氨基酸从精氨酸突变成谷氨酸，从而得到的一株致弱狂犬病疫苗毒株，LBNSE毒株的构建及其基因序列均已在发明人之前申请的专利中公开，具体可参阅CN105695421A、CN 103525776A等专利文献。
LBNSE毒株与SAD B19毒株的G蛋白氨基酸差异比较具体见图1。
2.蔗糖梯度离心法获得LBNSE全病毒蛋白抗原
1)扩毒。将LBNSE病毒以MOI＝0.01接种BSR细胞，12h后换成2％维持液，第3-4天左右细胞上清溶液微黄时收毒。
2)病毒灭活。将步骤1)收集的病毒上清中加入0.2％甲醛溶液，37℃摇转灭活24h。
3)病毒浓缩。将步骤2)灭活的病毒在3000kD的浓缩管中进行浓缩，浓缩条件为4℃，8000rpm/min，离心15min，反复上样，直至病毒上清全部经浓缩管浓缩。
4)病毒纯化。将浓度分别为30％、40％、50％和60％的蔗糖溶液分别以10ml、10ml、10ml和6ml体积依次小心均匀的加入超离管中，最后将步骤3)浓缩的病毒液加入适量体积至最上层。离心条件为4℃，25000rpm/min，离心3h，反复上样，直至浓缩病毒全部经超离管纯化。
5)病毒纯化后鉴定。取少量步骤4)纯化的病毒蛋白，经托马斯亮蓝染色鉴定纯化蛋白的纯度。
通过蔗糖密度梯度离心法纯化后获得的LBNSE全病毒蛋白，其主要分布在蔗糖浓度为40％-50％交界面处，30％-40％交界面也会有少量存在。经BCA试剂盒检测蛋白浓度，表明LBNSE全病毒蛋白浓度为25mg/ml。经考马斯亮蓝染色，表明LBNSE全病毒蛋白的纯度良好。如图2。
实施例2杂交瘤细胞株RABV G Mab 7A3的筛选
1)以实施例1获得的LBNSE全病毒蛋白作为抗原，与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂等体积乳化分别以皮下多点注射或者腹腔注射的方式免疫6周龄雌性Balb/c小鼠，获得免疫完全小鼠。
2)取免疫完全小鼠的脾细胞与SP2/0细胞在聚乙二醇的作用下进行细胞融合，铺96孔板，在HAT培养基中培养数天。
3)将通过反向遗传操作获得的表达狂犬病毒G蛋白的犬瘟热重组病毒(也可用其它表达狂犬病G蛋白的重组病毒)感染Vero细胞后，铺96孔板，48h后，丙酮固定，用于狂犬病毒G蛋白单克隆抗体的筛选。
4)取适量融合成功的杂交瘤细胞上清，加入步骤3)所述的96孔板中，37℃温箱中孵育1h，再加入适量比例稀释的羊抗小鼠FITC荧光二抗，37℃温箱中孵育1h，最后荧光显微镜下观察结果，有荧光表明该杂交瘤细胞中含有抗狂犬病毒G蛋白的单克隆抗体。
5)将步骤4)中含有抗狂犬病毒G蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞进行三次亚克隆，亚克隆杂交瘤细胞上清的鉴定方法同步骤4)，获得能稳定分泌抗狂犬病毒G蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株共9株，分别命名为：1E11、2B10、5E9、6G10、7A3、8A5、9A7、9F7、9F10。如图3。
6)取适量步骤5)中的杂交瘤细胞株上清，经荧光抗体病毒中和实验(FAVN)，确定狂犬病毒G蛋白中和抗体，即将上清在96孔板内3倍梯度稀释后，加入100FFU/孔的B2c-eGFP，37℃，5％CO2培养箱孵育1h，铺2×104/孔的BSR，48h后，荧光显微镜下观察结果。结果表明，共筛选到5株狂犬病毒G蛋白中和抗体，分别为：1E11、6G10、7A3、8A5、9A7，其中7A3的中和抗体滴度最高，为4.5IU/ml，相较于其它中和抗体，以杂交瘤细胞株RABV G Mab 7A3分泌的单克隆抗体来进行检测效果最好。如图4。
7)利用间接免疫荧光试验(IFA)分析中和抗体对不同狂犬病毒株的识别情况，即将实验室储存的七种狂犬病毒株(SAD、B2c、N2c、DRV、SHBRV、HUN、AH08)分别以MOI＝1接种BSR细胞，36～48h后弃上清，丙酮固定，以7A3中和抗体的细胞上清为一抗，FITC标记的羊抗小鼠IgG为二抗。结果显示，杂交瘤细胞株RABV G Mab 7A3所产生的单克隆抗体均呈现明显的特异性荧光，说明该杂交瘤细胞株所产生的中和抗体能特异性地识别不同狂犬病毒株抗原的构象表位。如图5。
实施例3单克隆抗体的大量制备及纯化
1)腹水制备。选取体重20g以上的雌性Balb/c小鼠数只，腹腔注射弗氏不完全佐剂，500ul/只。7-10天后，取生长状态良好的7A3杂交瘤细胞株，腹腔注射细胞，1×106/只。7-10天后，待小鼠腹部明显鼓起，小鼠行动变得迟缓后，将腹水用5ml注射器小心取出。腹水经2次离心后小管分装，至-20℃保存。
2)腹水纯化。按常规方法进行纯化。
实施例4羧基水溶性量子点标记单克隆抗体
采用羧基水溶性量子点对实施例3制备的单克隆抗体进行标记，本实施例所采用的量子点为羧基化的ZnCdSe/ZnS量子点，该量子点为现有技术，可参考CN 105969359A的方法制备，标记单克隆抗体的具体步骤为：
1)取8uM的ZnCdSe/ZnS羧基量子点30ul，加入1mL的MES溶液中洗涤。
2)12000r/min，离心10min后弃上清。
3)重复洗涤1次。
4)用100μL的MES溶液将量子点重悬。
5)加入一定量的EDC/NHS活化30min。
6)12000r/min，离心10min后弃上清。
7)用MES溶液洗涤2次。
8)加入0.2mg抗狂犬病毒G蛋白的单克隆抗体7A3，补加MES溶液至100μL。
9)室温震荡孵育2h。
10)12000r/min，离心10min后弃上清。
11)加入30μL偶联物稳定剂于4℃保存。
所涉及的溶液按如下方法配制：
MES溶液：称取2-吗啉乙磺酸0.9762g，溶于100ml蒸馏水中混匀；
EDC溶液：称取1-乙基-(3-二甲基氨基现基)碳二亚胺盐酸盐0.0767g加入到1L蒸馏水中混匀；
NHS溶液：称取N-羟基琥珀酰亚胺0.0668g加入到1L蒸馏水中混匀；
偶联物稳定剂(10mM硼酸缓冲液，pH8.5)：称取四硼酸钠2.02g加入到1L蒸馏水中混匀，调节pH至8.5。
将量子点标记的单克隆抗体分别在日光灯和紫外光激发下进行颜色对比，鉴定量子点被偶联上单克隆抗体之后，能否正常的激发荧光，结果显示修饰后量子点依旧能正常发光。另外，量子点标记的单克隆抗体与ZnCdSe/ZnS量子点在同一激发光下进行比对，鉴定结果显示，量子点被偶联上单克隆抗体之后，激发波长和发射波长不会产生较大变化。
实施例5狂犬病毒中和抗体ELISA检测试剂盒
1.试剂盒所需的试剂及其配方
包被液：碳酸盐缓冲液；称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，用蒸馏水溶解后，调节pH至9.6，最后定容至1L。
洗涤液：含0.05％Tween20的PBS缓冲液；称取NaCl 8.00g，KCl 0.2g，Na2HPO43.58g，KH2PO4 0.27g，Tween20 0.05ml，用蒸馏水溶解后，调节pH至7.4，最后定容至1L。
封闭液：5％脱脂奶粉；称取脱脂奶粉5g，溶解于100ml洗涤液中。
2.试剂盒组成部分
见表1。
表1狂犬病毒中和抗体ELISA检测试剂盒的组成
实施例6方法的建立及优化
1.矩阵ELISA确定最佳的抗原包被浓度及量子点标记抗体浓度
将纯化的LBNSE全病毒蛋白分别用包被缓冲液稀释至50ug/ml、25ug/ml、12.5ug/ml、6.25ug/ml、3.125ug/ml、1.5625ug/ml，以100ul/孔包被ELISA板，4℃包被过夜。甩去ELISA板内的液体，用洗涤液洗板3次，200ul/孔，5min/次。加入5％脱脂奶粉进行封闭，200ul/孔，至37℃温箱内孵育2h。甩去ELISA板内的液体，用洗涤液洗板3次，200ul/孔，5min/次。甩去ELISA板内的液体，取中和抗体滴度为0.5IU/ml的犬标准血清，与稀释为1：50、1：100、1：200、和1：400的量子点标记的7A3单克隆抗体等体积混合，100ul/孔，加入上述不同稀释度的抗原包被孔中进行反应，至37℃温箱内孵育1h。甩去ELISA板内的液体，用洗涤液洗板3次，200ul/孔，5min/次。最后在荧光酶标仪上读数。获得最佳的抗原包被量以及量子点标记的7A3单克隆抗体的稀释浓度。
表2不同稀释度的包被抗原和量子点标记抗体组合的相对荧光强度
由上表可知，当抗原包被量为6.25ug/ml，量子点抗体1：100稀释时，相对荧光强度为10.67，所用的抗原抗体量最优。因此，选择6.25ug/ml作为包被抗原的浓度，1：100作为量子点标记竞争抗体的最佳稀释度。
2.检测范围和线性分析
将狂犬中和抗体滴度为40.5IU/ml的犬血清进行2倍倍比稀释8个梯度后，以各稀释度的血清作为样品进行量子点单抗竞争ELISA反应，获得灵敏性实验数据。根据检测结果可知，中和抗体滴度在0.32～20.25IU/ml时，与相对荧光强度呈线性关系，如表3和图6。线性回归方程为y＝-2.5842x+20.812，线性相关系数R2＝0.9353。在此浓度范围内，狂犬中和抗体滴度可进行定量分析。
表3血清抗体滴度与相对荧光强度的线性关系
| 血清抗体滴度(IU/ml) | 相对荧光强度 |
| 40.50 | 0.70 |
| 20.25 | 0.90 |
| 10.12 | 4.00 |
| 5.06 | 5.30 |
| 2.53 | 6.20 |
| 1.26 | 7.80 |
| 0.63 | 8.70 |
| 0.32 | 12.70 |
| 0.16 | 16.00 |
| 0.07 | 17.30 |
3.准确性实验
选取10份通过FAVN法检测明确中和抗体滴度的犬血清样品，按照前面所述的方法检测相对荧光强度，结果发现两者的检测结果相似度很高，说明检测结果准确可靠。
表4狂犬病毒中和抗体的检测准确性
4.特异性实验
以狂犬病毒(RABV)、犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、乙肝病毒(HBV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)的阳性血清以及PBS阴性对照作为检测样品，进行量子点ELISA检测。结果显示，除了RABV血清外，其它对照病毒的血清或PBS阴性对照均未产生非特异性反应。
表5狂犬病毒中和抗体的检测特异性
5.量子点标记抗体和酶标抗体检测抗原检测限比较
1)量子点标记的7A3单克隆抗体：将浓度为107FFU/mL的SAD病毒进行梯度稀释，稀释比例分别为1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800，1:25600，1:51200。分别对以上梯度稀释的样品进行检测，设置PBS作为阴性对照。结果如图7，当稀释度在1:3200时，检测荧光信号相比阴性对照有三颗星的显著性差异，在1:6400或者之后的稀释度计算统计学差异时，只有一颗星。所以判定该方法最低的检测限度为3.125×103FFU/mL。
2)酶标7A3单克隆抗体：将浓度为108FFU/mL的SAD病毒进行梯度稀释，稀释比例分别为1:20，1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，1:1280，1:2560，1:5120。分别对以上梯度稀释的样品进行检测，设置PBS作为阴性对照。结果如图8，当稀释度在1:80时，检测OD值相比阴性对照有一颗星的显著性差异。所以判定该方法最低的检测限度为1.25×106FFU/mL。
综上所述，量子点标记的7A3单克隆抗体在识别狂犬病毒抗原时，其灵敏度是酶标7A3单克隆抗体的1000倍左右。
6.试剂盒检测程序
将待检测的人或动物血液37℃静置1h或4℃静置过夜后，分离血清，56℃灭活30min，取130ul样品进行检测。
1)抗原包被。包被的抗原为LBNSE全蛋白(25ug/ul)，包被量为6.25ug/ml，4℃包被过夜。
2)洗涤。洗涤液洗3次，200ul/孔，5min/次。
3)封闭。5％脱脂奶粉封闭，200ul/孔，37℃温箱封闭2h。
4)洗涤。洗涤液洗3次，200ul/孔，5min/次。
5)孵抗体。吸取130ul待检样品与等体积的1：100稀释的量子点竞争抗体至新的1.5ml的EP管内混匀，然后加加入上述酶标板内，100ul/孔，做2个复孔，37℃孵育1h。
6)洗涤。洗涤液洗3次，200ul/孔，5min/次。
7)荧光酶标仪检测荧光谱。
Claims (8)
1.一种能分泌抗狂犬病毒G蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株RABV G Mab 7A3，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201975。
2.一种抗狂犬病毒G蛋白的单克隆抗体，它是由权利要求1所述的杂交瘤细胞株RABV GMab 7A3分泌的。
3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备狂犬病毒检测试剂盒中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述狂犬病毒检测试剂盒是狂犬病毒中和抗体竞争ELISA检测试剂盒。
5.一种狂犬病毒中和抗体竞争ELISA检测试剂盒，含有包被在固相载体上的包被原和稀释的竞争抗体，其特征在于：所述包被原为狂犬病毒LBNSE毒株的全病毒蛋白，所述竞争抗体为权利要求2所述的抗狂犬病毒G蛋白的单克隆抗体。
6.如权利要求5所述的狂犬病毒中和抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述单克隆抗体是量子点标记的单克隆抗体。
7.如权利要求6所述的狂犬病毒中和抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述量子点是羧基化的ZnCdSe/ZnS量子点。
8.如权利要求5所述的狂犬病毒中和抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述包被原的包被浓度为6.25ug/ml，所述竞争抗体的稀释度为1：100。
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