CN104628830A - 重组酿酒酵母表达HBsAg的制备工艺及其分离纯化工艺、HBsAg和乙肝疫苗 - Google Patents

重组酿酒酵母表达HBsAg的制备工艺及其分离纯化工艺、HBsAg和乙肝疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种重组酿酒酵母表达HBsAg的制备工艺及其分离纯化工艺，所述分离纯化工艺包括：细胞破碎步骤，将经过发酵后提取的酵母细胞供入高压匀浆器内，在15000±1500PSIG压力下对其进行细胞破碎；纯化步骤，对破碎后的料液进行纯化，制备HBsAg原液；在所述细胞破碎步骤后、纯化步骤之前还包括：料液加热步骤，对破碎后的料液进行加热操作，使其温度上升到50-80℃后，再将其降温到2～8℃。本发明还公开了相应的乙肝疫苗和HBsAg。本发明可在无需在细胞破碎前加入蛋白酶抑制剂的情况下使蛋白酶失去活性，从而避免蛋白酶抑制剂带来的二度污染，且可明显提高后续纯化得到的原液收率，并大大改善原液的“比活”、“Sub-p24”等质量指标，具有很高的经济效益及社会效益。

Description

重组酿酒酵母表达HBsAg的制备工艺及其分离纯化工艺、HBsAg和乙肝疫苗
技术领域
本发明涉及重组基因的乙肝疫苗制备工艺技术，尤其涉及一种重组酿酒酵母表达乙肝表面抗原(HBsAg)的制备工艺及其分离纯化工艺、HBsAg和乙肝疫苗。
背景技术
我国是乙型肝炎高流行区，每年平均报告发病人50多万例，而接种乙肝疫苗是预防乙型肝炎最有效、最经济，也是最有保障的方法。我国于1992年将乙型肝炎疫苗纳入计划免疫管理，2009年开始，国家又将乙型肝炎免费接种范围扩大至对15岁以下青少年儿童，以及医务人员、大学生和现役军人等，全国接种乙肝疫苗的需求愈来愈大，覆盖范围越来越广。2010版新版GMP的实施，对药企的生产及药品质量提出了更高的要求。如今全国各乙肝疫苗厂家均在积极通过生产技术优化、改进及革新等措施，力求进一步提高生产效率和提升产品质量，以确保接种范围扩大后的市场需求和质量保证。
现有技术中，在表达HBsAg的重组酿酒酵母细胞破碎和纯化的生产过程中，为防止HBsAg被蛋白酶分解，主要采用在破碎前加入苯甲基磺酰氟溶液(苯甲基磺酰氟是一种蛋白酶抑制剂，对眼睛、鼻子及喉咙有刺激作用)的方法。
然而，发明人在实施本发明的过程中发现，上述加入蛋白酶抑制剂的方案存在以下缺陷：
由于蛋白酶抑制剂半衰期短(约30分钟)，而在大规模生产中，细胞破碎所需要的时间较长(60～80分钟)，往往导致破碎过程的后期，蛋白酶抑制剂的作用已经下降或者消失，使破碎释放出的目标物HBsAg被蛋白酶一定程度的分解，从而提高了后续纯化难度，导致纯化得到的原液收率及质量均受到影响；另外，由于加入的蛋白酶抑制剂进入缓冲体系，还带来了二度污染问题。
发明内容
本发明所解决的技术问题是，提供一种重组酿酒酵母表达HBsAg的分离纯化工艺，该工艺可在无需在细胞破碎前加入蛋白酶抑制剂的情况下使蛋白酶失去活性，从而避免蛋白酶抑制剂带来的二度污染，且可明显提高后续纯化得到的原液收率，并大大改善原液的“比活”、“Sub-p24”等质量指标，具有很高的经济效益及社会效益。
本发明进一步所解决的技术问题是，提供一种重组酿酒酵母表达HBsAg的制备工艺，该工艺可在无需在细胞破碎前加入蛋白酶抑制剂的情况下使蛋白酶失去活性，从而避免蛋白酶抑制剂带来的二度污染，且可明显提高后续纯化得到的原液收率，并大大改善原液的“比活”、“Sub-p24”等质量指标，具有很高的经济效益及社会效益。
为了解决上述技术问题，本发明公开了以下方案：
一种重组酿酒酵母表达HBsAg的分离纯化工艺，包括有：
细胞破碎步骤，将经过发酵后提取的酵母细胞供入高压匀浆器内，在15000±1500PSIG压力下对其进行细胞破碎；
纯化步骤，对破碎后的料液进行纯化，制备HBsAg原液；
在所述细胞破碎步骤后、纯化步骤之前还包括：
料液加热步骤，对破碎后的料液进行加热操作，使其温度上升到50-80℃后，再将其降温到2～8℃。
优选地，在所述料液加热步骤中，使其温度上升到60-80℃。
优选地，在所述料液加热步骤中，使其温度上升到60-70℃。
优选地，在所述料液加热步骤中，使其温度上升到65±1℃。
优选地，在所述料液加热步骤中，通过在套设于所述匀浆器外部的夹套中传递传热介质，对所述匀浆器内经细胞破碎后的料液进行加热。
优选地，所述夹套中传热介质的传递方向与匀浆器内料液的流动方向相反。
优选地，在所述细胞破碎步骤之前包括：
冷冻悬液融化步骤，将经过发酵后提取并冷冻保存的酵母细胞悬液从冷冻保存装置中转移到温度稳定在26±1℃的水浴锅内，至其融化完成；
所述提纯步骤包括：
澄清抗原制备步骤，除去在所述匀浆器破碎并加热后的料液中的酵母菌碎片后，通过加入硅胶380吸附目标抗原，并通过引入硼酸，将抗原由硅胶上解吸附，收集合并洗脱液，制备成澄清抗原；
原液制备步骤，将所述澄清抗原进一步用疏水色谱法纯化HBsAg，用硫氰酸盐处理，用磷酸盐缓冲液稀释，除菌过滤后即为原液。
相应地，本发明还公开了一种重组酿酒酵母表达HBsAg的制备工艺，包括发酵步骤和分离纯化步骤，所述分离纯化步骤采用如上所述的分离纯化工艺。
相应地，本发明还公开了一种重组酿酒酵母表达的HBsAg，该乙肝表面抗原采用如上所述的工艺生产制得。
相应地，本发明还公开了一种乙肝疫苗，该乙肝疫苗的活性成分包括有如上所述的重组酿酒酵母表达的HBsAg。
本发明的有益效果是：
本发明的实施例通过在细胞破碎步骤后，将破碎后的料液进行加热使其温度快速上升到50-80℃，使蛋白酶失去活性后，再对料液进行纯化，从而不仅实现了无需在细胞破碎前加入蛋白酶抑制剂，避免了其带来的二度污染，并对目标物HBsAg的活性无任何不利影响；还明显提高了其后续纯化得到的HBsAg原液收率，并大大改善了HBsAg原液的“比活”、“Sub-p24”等质量指标，具有很高的经济效益及社会效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的重组酿酒酵母表达HBsAg的分离纯化工艺一个实施例中破碎后料液加热状态示意图。
图2是本发明的重组酿酒酵母表达HBsAg的分离纯化工艺第四实施例与现有技术的抗原收率对比示意图。
图3是本发明的重组酿酒酵母表达HBsAg的分离纯化工艺第四实施例与现有技术的比活值对比示意图。
图4是本发明的重组酿酒酵母表达HBsAg的分离纯化工艺第四实施例与现有技术的Sub-p24值对比示意图。
具体实施方式
下面参考图1详细描述本发明提供的重组酿酒酵母表达HBsAg的分离纯化工艺的第一实施例；本实施例实现一次重组酿酒酵母表达HBsAg的分离纯化流程主要包括以下步骤：
在细胞破碎步骤中，将经过发酵后提取的酵母细胞供入高压匀浆器内，在15000±1500PSIG压力下对其进行细胞破碎；
在纯化步骤中，对破碎后的料液进行纯化，制备HBsAg原液。
并且，关键地，在所述细胞破碎步骤后、纯化步骤之前还包括：
在料液加热步骤中，对破碎后的料液进行加热操作，使其温度上升到50-80℃后，再将其降温到2～8℃。
具体实现时，在所述料液加热步骤中，可通过在套设于所述匀浆器外部的夹套中传递传热介质，对所述匀浆器内经细胞破碎后的料液进行加热。
进一步地，所述夹套中传热介质的传递方向可设置为与匀浆器内料液的流动方向相反，从而达到更充分地交换传递热量、加快温度升高所需时间的效果。
更进一步地，可通过自控装置PID控制加热过程中的各项参数，如控制传热介质流向、设定加热温度等。
本实施例中，所述传热介质可采用乙二醇，具体实现时，可先通过工业蒸汽或电加热的方式将乙二醇加热至所需的温度后，沿与匀浆器内料液流向相反的方向从传热介质入口进入所述夹套中对所述料液进行热交换。
另外，本实施例中，在所述细胞破碎步骤之前还可包括：
在冷冻悬液融化步骤中，将经过发酵后提取并冷冻保存的酵母细胞悬液从冷冻保存装置中转移到温度稳定在26±1℃的水浴锅内，至其融化完成；
所述提纯步骤可具体包括：
在澄清抗原制备步骤中，除去在所述匀浆器破碎并加热后的料液中的酵母菌碎片后，通过加入硅胶380吸附目标抗原，并通过引入硼酸，将抗原由硅胶上解吸附，收集合并洗脱液，制备成澄清抗原；
在原液制备步骤中，将所述澄清抗原进一步用疏水色谱法纯化HBsAg，用硫氰酸盐处理，用磷酸盐缓冲液稀释，除菌过滤后即为原液。
本实施例中，采用的重组酿酒酵母菌可为Saccharomyces cerevisiae 2150-2-3(pHBS56-GAP347/33)，该酵母菌为腺嘌呤缺陷型。
下面详细描述本实施例的分离纯化工艺对蛋白酶的抑制原理。
由于酵母细胞蛋白酶多属于酸性蛋白酶，在温度达到50℃时便很不稳定，60℃以上很快失去活性，并具有不可逆性；而HBsAg的活性即使在80℃时仍不受影响。因而，本实施例通过将破碎后的料液快速升温到50-80℃，使蛋白酶失去活性，却对目标物HBsAg活性没有带来不利影响，从而实现了将现有技术采用化学方法防止HBsAg被蛋白酶分解，转变为采用加热到适当温度的物理方法实现对蛋白酶的抑制，不但避免了加入蛋白酶抑制剂带来的二度污染；还明显提高了后续纯化得到的原液收率、大大完善了原液的“比活”、“Sub-p24”等质量指标；最大限度地提高了生产效率和提升了产品质量，更符合新版GMP的要求，具有很高经济效益及社会效益。
下面参考图1详细描述本发明提供的重组酿酒酵母细胞表达HBsAg的制备工艺的第二实施例；本实施例与前述第一实施例相比，区别仅在于：在所述料液加热步骤中，使其温度上升到60-80℃，在该温度范围内可达到更好的蛋白酶抑制效果，相同之处，不再赘述。
下面参考图1详细描述本发明提供的重组酿酒酵母细胞表达HBsAg的制备工艺的第三实施例；本实施例与前述第一实施例相比，区别仅在于：在所述料液加热步骤中，使其温度上升到60-70℃，在该温度范围内可达到更好的蛋白酶抑制效果，相同之处，不再赘述。
下面参考图1详细描述本发明提供的重组酿酒酵母细胞表达HBsAg的制备工艺的第四实施例；本实施例与前述第一实施例相比，区别仅在于：在所述料液加热步骤中，使其温度上升到65±1℃，在该温度范围内可达到更理想的蛋白酶抑制效果。
下面采用前述第四实施例描述的分离纯化工艺，选用重组酿酒酵母菌种(以DNA重组技术构建的表达HBsAg的菌种)经发酵工艺生产所得的三个批次的冷冻酵母细胞，每一批细胞做一个组别，每个组均分现有技术和本实施例各三批进行对比实验，具体实验步骤如下：
融化冷冻的细胞悬液：
将-70℃的冷冻酵母细胞从超低温冰箱转移到已经预先准备的温度稳定在26±1℃的水浴锅内融化，2小时内融化完成，并将融化后的细胞悬浮液无菌操作转移到已灭菌的不锈钢密封罐，降温到2～3℃；
细胞破碎：
以20PSIG压力无菌操作供入高压匀浆器的进口，在15000±1500PSIG压力下进行细胞破碎，所述匀浆器已经过灭菌、润湿和检漏；
料液加热：
通过在匀浆器外部套设的夹套中传递的传热介质，对经细胞破碎后的料液加热，使其温度快速上升到65±1℃后，再将其降温到2～8℃；
制备澄清抗原：
用500K分子量中空纤维柱过滤去除小分子，保留截留液，加入硅胶380吸附目标抗原，并12℃保温2.5小时后，加入硼酸，将抗原由硅胶上解吸附，收集合并洗脱液，得到澄清抗原；
制备原液：
将所述澄清抗原上样丁基琼脂糖层析柱(B.A.)，进行疏水层析后，洗脱收集液经硫氰酸盐转型得到纯III型抗原，用磷酸盐缓冲液稀释，除菌过滤后即为原液(含目标抗原蛋白)。
实验结果显示，与现有技术相比，采用本实施例的分离纯化工艺，原液的收率提高了10％左右，同时原液的比活及Sub-p24等指标得到了明显完善，具体数据详见下表1-3、图2-图4。
表1(1组)、现有技术与本实施例的工艺参数对照表
批号 投料量(公斤) 原液中HBsAg含量(克) 比活 Sub-p24
现有技术1 10.0 3.18 0.83 21.2％
现有技术2 10.0 3.15 0.75 19.5％
现有技术3 10.0 3.19 0.80 18.5％
本实施例1 10.0 3.52 0.91 13.2％
本实施例2 10.0 3.45 0.88 12.8％
本实施例3 10.0 3.50 0.93 14.9％
表2(2组)现有技术与本实施例的工艺参数对照表
批号 投料量(公斤) 原液中HBsAg含量(克) 比活 Sub-p24
现有技术4 10.0 3.06 0.81 16.2％
现有技术5 10.0 3.08 0.73 17.1％
现有技术6 10.0 3.04 0.82 14.8％
本实施例4 10.0 3.38 0.90 12.1％
本实施例5 10.0 3.36 0.86 10.5％
本实施例6 10.0 3.34 0.91 12.5％
表3(3组)、现有技术与本实施例的工艺参数对照表
批号 投料量(公斤) 原液中HBsAg含量(克) 比活 Sub-p24
现有技术7 10.0 3.30 0.85 21.2％
现有技术8 10.0 3.26 0.86 22.5％
现有技术9 10.0 3.29 0.83 21.3％
本实施例7 10.0 3.59 0.95 13.8％
本实施例8 10.0 3.56 0.93 15.5％
本实施例9 10.0 3.58 0.92 13.6％
备注：对于比活，数值越大代表原液的质量越高；Sub-p24则相反，数值越小代表原液的质量越高。
表4、现有技术与本实施例的其它工艺参数的检测结果对照表
结果分析
实验证明，使用本发明的分离纯化工艺对酵母细胞破碎后的料液进行加热处理后，其后续纯化得到的原液收率有较为明显的提高，同时反应原液质量的参数如比活得到提升，而Sub-p24(小分子蛋白)进一步降低，取消使用苯甲基磺酰氟溶液，避免二度污染，进一步完善了分离纯化工艺各项参数，提升了产品质量。因此，应用本发明，更有利于后续对HBsAg提纯工艺，最大可能的提高了生产效率，具有很高经济效益及社会效益。
本发明提供的重组酿酒酵母菌表达HBsAg的制备工艺，包括发酵步骤和分离纯化步骤，其中，所述分离纯化步骤可采用前述实施例描述的分离纯化工艺，不再赘述。
本发明提供的重组酿酒酵母表达的HBsAg，可采用如上所述的工艺生产制得，不再赘述。
本发明提供的乙肝疫苗，其活性成分包括有如上所述的重组酿酒酵母表达的HBsAg，不再赘述。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种重组酿酒酵母表达HBsAg的分离纯化工艺，包括有：
细胞破碎步骤，将经过发酵后提取的酵母细胞供入高压匀浆器内，在15000±1500PSIG压力下对其进行细胞破碎；
纯化步骤，对破碎后的料液进行纯化，制备HBsAg原液；
其特征在于，在所述细胞破碎步骤后、纯化步骤之前还包括：
料液加热步骤，对破碎后的料液进行加热操作，使其温度上升到50-80℃后，再将其降温到2～8℃。
2.如权利要求1所述的分离纯化工艺，其特征在于，在所述料液加热步骤中，使其温度上升到60-80℃。
3.如权利要求2所述的分离纯化工艺，其特征在于，在所述料液加热步骤中，使其温度上升到60-70℃。
4.如权利要求3所述的分离纯化工艺，其特征在于，在所述料液加热步骤中，使其温度上升到65±1℃。
5.如权利要求1-4中任一项所述的分离纯化工艺，其特征在于，在所述料液加热步骤中，通过在套设于所述匀浆器外部的夹套中传递传热介质，对所述匀浆器内经细胞破碎后的料液进行加热。
6.如权利要求5所述的分离纯化工艺，其特征在于，所述夹套中传热介质的传递方向与匀浆器内料液的流动方向相反。
7.如权利要求5所述的分离纯化工艺，其特征在于，在所述细胞破碎步骤之前包括：
冷冻悬液融化步骤，将经过发酵后提取并冷冻保存的酵母细胞悬液从冷冻保存装置中转移到温度稳定在26±1℃的水浴锅内，至其融化完成；
所述提纯步骤包括：
澄清抗原制备步骤，除去在所述匀浆器破碎并加热后的料液中的酵母菌碎片后，通过加入硅胶380吸附目标抗原，并通过引入硼酸，将抗原由硅胶上解吸附，收集合并洗脱液，制备成澄清抗原；
原液制备步骤，将所述澄清抗原进一步用疏水色谱法纯化HBsAg，用硫氰酸盐处理，用磷酸盐缓冲液稀释，除菌过滤后即为原液。
8.一种重组酿酒酵母表达HBsAg的制备工艺，包括发酵步骤和分离纯化步骤，其特征在于，所述分离纯化步骤采用如权利要求1-7中任一项所述的分离纯化工艺。
9.一种重组酿酒酵母表达的HBsAg，其特征在于：该HBsAg采用如权利要求8所述的工艺生产制得。
10.一种乙肝疫苗，其特征在于：该乙肝疫苗的活性成分包括有如权利要求9所述的重组酿酒酵母表达的HBsAg。
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