CN117660373A - 一种慢病毒大规模纯化方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种慢病毒大规模纯化方法及其应用。应用包括：1）使用293T细胞进行慢病毒包装；2）收集经步骤1）包装的慢病毒上清液，对其进行过滤处理去除细胞杂质获得慢病毒澄清液；3）对慢病毒澄清液进行切向流超滤装置浓缩换液获得超滤浓缩液；4）先采用复合模式层析填料Capto Core 700对超滤浓缩液进行纯化得到慢病毒料液，再对所述慢病毒料液进行离子交换填料Capto Q Impres层析纯化得到慢病毒溶液；5）慢病毒溶液进行超滤换液处理；6）经超滤换液后的慢病毒溶液使用滤器过滤除菌，得到纯化后的慢病毒。本发明的方法保证了慢病毒在纯化过程中保持最大活性，提高了回收率和滴度。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种慢病毒大规模纯化方法及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
在生物医学领域，慢病毒作为一类常见的递送工具，在基因治疗和基因转导等应用中扮演着重要角色。然而，目前在慢病毒的生产和纯化过程中仍然存在一些挑战，如低产量、纯度不高、工艺繁琐等问题。慢病毒在纯化过程中存在一定的异质性，而不同的慢病毒株和表达系统可能需要不同的纯化条件。此外，慢病毒颗粒的特性可能会受到细胞培养条件、产生慢病毒的细胞类型以及病毒载体的影响，这也增加了纯化过程的复杂性。因此，开发一种高效、简便、低成本的慢病毒纯化方法成为了该领域的研究重点。
传统的慢病毒纯化方法主要采用超速离心法，但这种方法存在多次离心导致纯化周期长、不适合大规模工艺放大、容易受到外界条件变化的影响，同时也容易造成产品的损失。因此，研究人员开始寻求新的纯化技术来解决这些问题。
随着蛋白质工程和纯化技术的不断进步，两步层析纯化技术成为一种备受关注的方法。两步层析纯化技术结合了尺寸排阻层析和离子层析的优势，能够在较短的时间内高效地获得目标产品，并保持较高的产量和纯度。在慢病毒纯化过程中，通过在细胞培养上清液中选择性地捕获慢病毒，并经过一系列纯化步骤得到慢病毒制剂，这一方法具有巨大的潜力。然而，由于慢病毒颗粒本身的不稳定性，且对于温度、离子强度、pH和剪切力等条件极度敏感，现有的慢病毒层析纯化工艺往往面临回收率低、病毒活性损失严重的问题。因此，本领域急需开发一种可以保护病毒活性、稳定性好的GMP级别慢病毒纯化方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明公开了一种慢病毒大规模纯化方法及其应用。本发明通过利用优化的含保护剂的慢病毒纯化缓冲体系，结合切向流超滤装置（TFF）及层析工艺进行慢病毒纯化，层析过程采用Capto Core 700和Capto Q Impres两种类型层析填料相结合，既保证了慢病毒在纯化过程中保持最大活性，提高了回收率和滴度，同时方便纯化工艺的放大，解决了慢病毒规模化生产制备问题。
本发明的慢病毒大规模纯化方法可以达到GMP级别。GMP是英文GOODMANUFACTURING PRACTICE 的缩写，中文含义是“良好生产规范”。世界卫生组织将GMP定义为指导食物、药品、医疗产品生产和质量管理的法规。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
本发明的第一方面，提供一种慢病毒大规模纯化方法，包括以下步骤：
（1）慢病毒包装：使用293T细胞进行慢病毒包装。
（2）慢病毒澄清：收集经步骤（1）包装的慢病毒上清液，对所述慢病毒上清液进行过滤处理，去除细胞杂质获得慢病毒澄清液。
（3）切向流超滤装置TFF浓缩换液：对所述慢病毒澄清液进行切向流超滤装置TFF浓缩换液获得超滤浓缩液。
（4）层析纯化：先采用复合模式层析填料Capto Core 700对所述超滤浓缩液进行纯化，得到慢病毒料液，再对所述慢病毒料液进行离子交换填料Capto Q Impres层析纯化，得到慢病毒溶液。
（5）超滤换液：对步骤（4）得到的所述慢病毒溶液进行超滤换液处理。
（6）过滤除菌：经超滤换液后的慢病毒溶液使用孔径0.22 μm的滤器过滤除菌，得到纯化后的慢病毒。
在一种具体的实施方式中，步骤（1）中，所述使用293T细胞进行慢病毒包装，包括：
1）复苏293T细胞，依次使用T25、T75、T125和T225细胞培养瓶进行细胞传代培养，培养温度设置为37℃，CO2浓度为5~6%。
2）慢病毒包装系统为四质粒系统，质粒用量为34~36 μg/cm2，转染试剂使用PEI，PEI与质粒用量比例为2~4：1。
3）转染时先将质粒和PEI放置室温孵育4~6 min，然后将PEI加入到质粒培养基混合物中混匀，室温孵育30~60 min后加入至293T细胞培养瓶中继续培养。
4）慢病毒收获前1.5~2.5 h，按照25~30 U/ml加入核酸酶进行消化处理。
在一种具体的实施方式中，步骤（2）中，所述对所述慢病毒上清液进行过滤处理，去除细胞杂质获得慢病毒澄清液，包括：使用0.45 μm滤器过滤所述慢病毒上清液，去除细胞、细胞碎片及其他杂质，得到慢病毒澄清液。
在一种具体的实施方式中，步骤（3）中，对所述慢病毒澄清液进行切向流超滤装置TFF浓缩换液获得超滤浓缩液的具体步骤包括：使用100~750 KD膜包切向流超滤装置TFF浓缩换液，超滤浓缩过程控制跨膜压小于0.5 bar，将所述慢病毒澄清液浓缩10~20倍。
优选地，使用300KD膜包切向流超滤装置TFF浓缩换液。优选地，换液采用的缓冲体系Buffer为pH 8.0 50 mM Tris、130 mM NaCl、10%蔗糖。
在一种具体的实施方式中，步骤（4）中，使用的复合模式层析填料为Capto Core700，纯化缓冲体系采用pH 8.0 50 mM Tris、130 mM NaCl、10%蔗糖缓冲体系，上样体积小于0.3 CV，流速设置为200 cm/h。
在一种具体的实施方式中，步骤（4）中，使用离子交换填料为Capto Q Impres，Buffer A为pH 8.0 50 mM Tris、130 mM NaCl、10%蔗糖，Buffer B为pH 8.0 50 mM Tris、1M NaCl、10%蔗糖，使用Buffer B进行等度洗脱。
在一种具体的实施方式中，步骤（5）中，超滤换液使用100~750 KD膜包，超滤浓缩过程控制跨膜压小于0.5 bar，优选地，超滤换液使用300KD膜包。
在一种具体的实施方式中，步骤（6）中，使用孔径0.22 μm的无菌滤器进行过滤除菌。
在一种具体的实施方式中，步骤（6）之后还包括：将所述纯化后的慢病毒按照1ml/管进行分装，-80℃进行保存。
在本发明的第二方面，提供一种第一方面所述慢病毒大规模纯化方法在病毒纯化领域中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明中的慢病毒大规模纯化方法通过优化含保护剂的慢病毒纯化缓冲体系，结合切向流超滤装置（TFF）及层析工艺进行慢病毒纯化，层析过程采用Capto Core 700和Capto Q Impres两种类型层析填料相结合，保证了慢病毒在纯化过程中保持最大活性，提高了回收效率和滴度，同时方便纯化工艺的放大，解决了慢病毒规模化生产制备问题。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明实施例1中慢病毒在不同纯化缓冲体系下的稳定性对比图。
图2是本发明实施例1中进行切向流超滤装置TFF浓缩后Capto Core 700柱纯化色谱图。
图3是本发明实施例1中使用不同比例缓冲体系Buffer B洗脱慢病毒的Capto QImpres柱纯化色谱图。
图4是本发明实施例2中进行切向流超滤装置TFF浓缩换液后的Capto Core 700柱纯化色谱图。
图5是本发明实施例2中使用不同比例缓冲体系Buffer B洗脱慢病毒的Capto QImpres柱纯化色谱图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但是本发明并不仅限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1
一种慢病毒大规模纯化方法，具体操作步骤如下：
S1、使用293T细胞进行慢病毒包装。
细胞培养所用培养基和质粒转染体系并不做具体限定。本发明中选用含10%胎牛血清的DMEM培养基对293T细胞进行贴壁培养。
1）复苏293T细胞，依次使用T25、T75、T125和T225细胞培养瓶进行细胞传代培养，培养温度设置为37℃，CO2浓度为5%。
2）慢病毒包装系统为四质粒系统，质粒用量为35 μg/cm2，转染试剂使用PEI，PEI与质粒用量比例为3:1。
3）转染时先将质粒和PEI放置室温孵育5 min，然后将PEI加入到质粒培养基混合物中混匀，室温孵育30~60 min后加入至293T细胞培养瓶中继续培养。
4）慢病毒收获前2 h，按照25~30 U/ml加入核酸酶处理。
S2、慢病毒澄清；收集经步骤S1包装的慢病毒上清液，使用0.45 μm澄清滤器进行过滤，去除细胞碎片和部分杂质。
S3、切向流超滤装置TFF浓缩；收集经步骤S2过滤后的慢病毒澄清液，使用300KD膜包切向流超滤装置TFF浓缩，超滤浓缩过程控制跨膜压小于0.5 bar，浓缩倍数为10倍。
S4、层析纯化；超滤浓缩后的慢病毒料液采用复合模式层析填料Capto Core 700纯化，再进行离子交换填料Capto Q Impres层析纯化。
1）先使用复合模式层析填料Capto Core 700进行纯化，层析柱规格为HiScale26/40。
2）为确定合适的纯化缓冲体系Buffer A，进行缓冲液筛选实验，以获得慢病毒稳定性最优的缓冲体系。设置a、b、c、d、e、f、g、h、i共九组缓冲体系。其中，各组组分具体为：
a组：pH 7.5，20 mM PB、150 mM NaCl。
b组：pH 8.0，50 mM Tris、130 mM NaCl。
c组：pH 8.0，50 mM Tris、130 mM NaCl、5%蔗糖。
d组：pH 8.0，50 mM Tris、130 mM NaCl、10%蔗糖。
e组：pH 8.0，50 mM Tris、130 mM NaCl、20%蔗糖。
f组：pH 8.0，50 mM Tris、130 mM NaCl、5%蔗糖、2 mM MgCl2。
g组：pH 8.0，50 mM Tris、130 mM NaCl、10%乳糖、2 mM MgCl2。
h组：pH 7.5，50 mM Tris、130 mM NaCl、10%乳糖、2 mM MgCl2。
i组：pH 7.5，50 mM HEPES，130 mM NaCl。
将感染滴度为1.00E+10TU/ml的慢病毒置换于以上缓冲体系，在4℃下静置，分别对静置后2h、4h、6h和24h的慢病毒进行感染滴度检测，以筛选得到稳定性最优的慢病毒纯化缓冲体系。
图1是本发明实施例1中慢病毒在不同纯化缓冲体系下的稳定性对比图。从图1中可以看出，随时间变化，各组慢病毒滴度均有不同程度的下降，加入10%蔗糖作为保护剂，可提高慢病毒的稳定性。其中d组缓冲条件下，慢病毒随时间变化稳定性最好。故优选层析纯化缓冲体系Buffer A的具体组分为：pH 8.0 50 mM Tris、130 mM NaCl、10%蔗糖。
3）Capto Core 700柱上样体积小于0.3CV。
4）流速设置为200 cm/h，收集流穿峰，图2是本发明实施例1中进行切向流超滤装置TFF浓缩后Capto Core 700柱纯化色谱图。从图2中可以看出：慢病毒浓缩液经CaptoCore 700纯化后，慢病毒峰和杂质峰完全分开，实现了较好的纯化分离效果，但杂质峰含量较多，纯化分离压力较大。
5）经Capto Core 700收集的流穿峰进行第二步层析纯化，使用填料为Capto QImpres，层析柱规格为HiScale 26/40。
6）所用缓冲体系Buffer A为pH 8.0 50 mM Tris、130 mM NaCl、10%蔗糖，缓冲体系Buffer B为pH 8.0 50 mM Tris、1 M NaCl、10%蔗糖。
7）Capto Core 700纯化后的慢病毒进行Capto Q Impres纯化，流速设置为155cm/h，分别设置缓冲体系Buffer B比例为0、10%、50%和100%进行等度洗脱，图3是本发明实施例1中使用不同比例缓冲体系Buffer B洗脱慢病毒的Capto Q Impres柱纯化色谱图。从图3中可以看出：10% 缓冲体系Buffer B洗脱后，慢病毒结合在层析柱中未被洗脱下来。缓冲体系Buffer B的比例达到50%时可将大部分结合在填料上的慢病毒洗脱下来，但缓冲体系Buffer B比例为100%时仍可见部分慢病毒。
S5、超滤换液；经Capto Q Impres纯化后获得的慢病毒溶液进行超滤换液处理。超滤时使用300KD膜包，超滤浓缩过程控制跨膜压小于0.5 bar。
S6、过滤除菌；经S5超滤换液后病毒溶液使用孔径0.22 μm滤器过滤除菌，终产品按照1 ml/管进行分装，最后放入-80℃冰箱进行保存。
本实施例中，慢病毒在纯化过程中保持了较高的回收效率，在Capto Core 700柱和Capto Q Impres柱两步纯化过程中的回收率分别达到50.38%和41.8%。
实施例2
一种慢病毒大规模纯化方法，具体操作步骤如下：
S1、使用293T细胞进行慢病毒包装。
细胞培养所用培养基和质粒转染体系并不做具体限定。本发明中选用含10%胎牛血清的DMEM培养基对293T细胞进行贴壁培养。
1）复苏293T细胞，依次使用T25、T75、T125和T225细胞培养瓶进行细胞传代培养，培养温度设置为37℃，CO2浓度为5%。
2）慢病毒包装系统为四质粒系统，质粒用量为35 μg/cm2，转染试剂使用PEI，PEI与质粒用量比例为3:1。
3）转染时先将质粒和PEI放置室温孵育5 min，然后将PEI加入到质粒培养基混合物中混匀，室温孵育30~60 min后加入至293T细胞培养瓶中继续培养。
4）慢病毒收获前2 h，按照25~30 U/ml加入核酸酶处理。
S2、慢病毒澄清：收集经步骤S1包装的慢病毒上清液，使用0.45 μm澄清滤器进行过滤，去除细胞碎片和部分杂质。
S3、切向流超滤装置TFF浓缩换液：收集经步骤S2过滤后的慢病毒澄清液，使用300KD膜包进行切向流超滤装置TFF浓缩换液（换液缓冲体系Buffer为pH 8.0 50 mM Tris、130mM NaCl、10%蔗糖）处理，超滤浓缩过程控制跨膜压小于0.5bar，浓缩倍数为10倍。
S4、层析纯化：超滤浓缩后的得到的慢病毒料液采用复合模式层析填料CaptoCore 700纯化，再进行离子交换填料Capto Q Impres层析纯化，得到慢病毒溶液。
1）使用复合模式层析填料Capto Core 700进行纯化时所用缓冲体系为：pH 8.050 mM Tris、130 mM NaCl、10%蔗糖。
2）Capto Core 700柱上样体积小于0.3 CV。
3）流速设置为200 cm/h，收集流穿峰。图4是本发明实施例2中进行切向流超滤装置TFF浓缩换液后的Capto Core 700柱纯化色谱图。从图4中可以看出：与实施例1（图2）相比，切向流超滤装置TFF浓缩后增加换液步骤，使用缓冲体系Buffer A进行置换，可去除大部分杂质，大幅度降低杂质峰面积占比，减轻下游层析步骤压力。
4）经Capto Core 700收集的流穿峰进行第二步层析纯化，使用填料为Capto QImpres。
5）所用缓冲体系Buffer A为pH 8.0 50 mM Tris、130 mM NaCl、10%蔗糖，缓冲体系Buffer B为pH 8.0 50 mM Tris、1 M NaCl、10%蔗糖。
6）分别设置缓冲体系Buffer B比例为0、10%、50%、60%、70%和100%进行等度洗脱，图5是本发明实施例2中使用不同比例缓冲体系Buffer B洗脱慢病毒的Capto Q Impres柱纯化色谱图。从图5中可以看出：在该实施例中，慢病毒洗脱分布较为集中，10% 缓冲体系Buffer B洗脱后，慢病毒结合在层析柱中未被洗脱下来，缓冲体系Buffer B的比例达到50%时即可将大部分结合在填料上的慢病毒洗脱下来，提高缓冲体系Buffer B比例至60%以及更高后，仅有少量慢病毒被洗脱，因此，使用50% 缓冲体系Buffer B是最优洗脱条件，可实现慢病毒在较低盐浓度下洗脱。
S5、超滤换液：经Capto Q Impres纯化后获得的慢病毒溶液进行超滤换液处理。超滤时使用300 KD膜包，超滤浓缩过程控制跨膜压小于0.5 bar。
S6、过滤除菌：经S5超滤换液后病毒溶液使用孔径0.22 μm滤器过滤除菌，终产品按照1 ml/管进行分装，最后放入-80℃冰箱进行保存。
本实施例中，慢病毒在纯化过程中保持了较高的回收效率，在Capto Core 700柱和Capto Q Impres柱两步纯化过程中的回收率分别达到63.91%和50.67%。
本实施例中，经过切向流超滤装置TFF浓缩换液后，不仅大幅缩小了料液体积，同时也降低了澄清液中核酸和蛋白等杂质的含量，减轻了下游纯化工艺的压力，避免了慢病毒在大规模纯化过程中因料液体积大和处理时间长导致的慢病毒大量失活。在使用CaptoQ Impres进行离子交换层析时，从图5中可以看出，缓冲体系Buffer B的比例达到50%时即可将大部分结合在填料上的慢病毒洗脱下来。Capto Q Impres柱是阴离子交换层析柱，缓冲体系Buffer B中含有1M NaCl。高盐环境会导致慢病毒活性降低，使用的缓冲体系BufferB比例越高，盐离子浓度越高。本实施例通过优化层析纯化条件，简化了洗脱步骤，降低了缓冲体系Buffer B比例，使用较低盐浓度的缓冲体系进行洗脱，尽量减少了纯化过程中因高盐环境导致的慢病毒活性损失。
实施例2与实施例1相比，实施例1进行慢病毒澄清液切向流超滤装置TFF浓缩，实施例2先进行慢病毒澄清液切向流超滤装置TFF浓缩，然后对浓缩液进行缓冲体系Buffer置换。将实施例1和实施例2对比，说明缓冲体系Buffer置换过程可去除部分杂质，减轻下游层析步骤压力。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种慢病毒大规模纯化方法在病毒纯化领域中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
（1）慢病毒包装：使用293T细胞进行慢病毒包装；
（2）慢病毒澄清：收集经步骤（1）包装的慢病毒上清液，对所述慢病毒上清液进行过滤处理，去除细胞杂质获得慢病毒澄清液；
（3）切向流超滤装置浓缩换液：对所述慢病毒澄清液进行切向流超滤装置浓缩换液获得超滤浓缩液；
（4）层析纯化：先采用复合模式层析填料Capto Core 700对所述超滤浓缩液进行纯化，得到慢病毒料液，再对所述慢病毒料液进行离子交换填料Capto Q Impres层析纯化，得到慢病毒溶液；
（5）超滤换液：对步骤（4）得到的所述慢病毒溶液进行超滤换液处理；
（6）过滤除菌：经超滤换液后的慢病毒溶液使用孔径0.22 μm的滤器过滤除菌，得到纯化后的慢病毒；
步骤（1）中，所述使用293T细胞进行慢病毒包装，包括：
1）复苏293T细胞，依次使用T25、T75、T125和T225细胞培养瓶进行细胞传代培养，培养温度设置为37℃，CO2浓度为5~6%；
2）慢病毒包装系统为四质粒系统，质粒用量为34~36 μg/cm2，转染试剂使用PEI，PEI与质粒用量比例为2~4：1；
3）转染时先将质粒和PEI放置室温孵育4~6 min，然后将PEI加入到质粒培养基混合物中混匀，室温孵育30~60 min后加入至293T细胞培养瓶中继续培养；
4）慢病毒收获前1.5~2.5 h，按照25~30 U/ml加入核酸酶进行消化处理；
步骤（3）中，超滤浓缩过程控制跨膜压小于0.5 bar，将所述慢病毒澄清液浓缩10~20倍；换液采用的缓冲体系为pH 8.0 50 mM Tris、130 mM NaCl、10%蔗糖；
步骤（4）中，纯化缓冲体系采用pH 8.0 50 mM Tris、130 mM NaCl、10%蔗糖缓冲体系；
步骤（5）中，超滤换液使用100~750 KD膜包，超滤浓缩过程控制跨膜压小于0.5 bar。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，所述对所述慢病毒上清液进行过滤处理，去除细胞杂质获得慢病毒澄清液，包括：使用0.45 μm滤器过滤所述慢病毒上清液，去除细胞、细胞碎片及其他杂质，得到慢病毒澄清液。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，对所述慢病毒澄清液进行切向流超滤装置浓缩换液获得超滤浓缩液的过程中，使用100~750 KD膜包切向流超滤装置浓缩。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，使用的复合模式层析填料为Capto Core 700，上样体积小于0.3 CV，流速设置为200 cm/h。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，使用离子交换填料为Capto QImpres，缓冲体系A为pH 8.0 50 mM Tris、130 mM NaCl、10%蔗糖，缓冲体系B为pH 8.0 50mM Tris、1M NaCl、10%蔗糖，使用缓冲液B进行等度洗脱。
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