CN116574753A - 纯化制备抗新型冠状病毒感染的疫苗原液的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及疫苗原液制备技术领域，特别涉及纯化制备抗新型冠状病毒感染的疫苗原液的方法，步骤如下：利用载体pPIC9K将密码子优化后的新型冠状病毒Spike蛋白RBD基因整合到毕赤酵母重组菌株中，通过发酵培养获得新型冠状病毒重组亚单位疫苗发酵液；获得的发酵液仅需离心即可获得发酵上清液，去除菌体；除盐层析获得疫苗。本发明纯化重组亚单位疫苗原液工艺稳定，批间差小，简化了制备工艺，降低了制备成本，有效提高疫苗的效力，还有助于提高疫苗的纯度，降低疫苗内杂质的含量；对获得的新型冠状病毒重组亚单位疫苗发酵液进行灭活；有助于降低生物安全风险，确保疫苗的生物安全。

Description

纯化制备抗新型冠状病毒感染的疫苗原液的方法
技术领域
本发明涉及疫苗原液制备技术领域，特别涉及纯化制备抗新型冠状病毒感染的疫苗原液的方法。
背景技术
全球医药和生物领域的专家都在致力于寻找、研发治疗和预防新型冠状病毒的方案，当下新型冠状病毒主要以对症治疗为主，疫苗防御为辅；目前市面是存在的主要疫苗尚存在保护率不高，无法应对病毒突变株的缺陷。
新型冠状病毒疫苗研发技术路线几乎涵盖了现有疫苗研发的绝大多数技术类型，总体可分为3类：第1类是经典的技术路线，基本以病毒的完整形态呈现，主要是灭活疫苗；第2大类是以病毒遗传物质为主的病毒载体疫苗(腺病毒疫苗)；第3大类是是通过基因工程的手段表达出的病毒蛋白抗原，包括亚单位疫苗和病毒样颗粒疫苗；亚单位疫苗：通过特定手段，提取细菌、病毒的特殊蛋白质结构，筛选出的具有免疫活性的片段制成的疫苗。
目前前两类疫苗在全球范围内均有疫苗产品获批上市，而重组亚单位疫苗尚未有获批使用的产品问世。重组亚单位疫苗能够有效避免利用全病原体生产疫苗而导致的生物安全风险，并且有利于提高疫苗中有效成分的浓度、纯度。
目前重组亚单位疫苗和VLPs疫苗主要选择的表达载体为Vero细胞，存在相对较高的培养成本、易被微生物污染、杂蛋白种类多分离困难、目的蛋白含量较低的缺点。
为了降低制备成本，有效提高疫苗的效力，提高疫苗的纯度，降低疫苗内杂质的含量，提出一种纯化制备抗新型冠状病毒感染的疫苗原液的方法具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了纯化制备抗新型冠状病毒感染的疫苗原液的方法，以降低制备成本、有效提高疫苗的效力、提高疫苗的纯度、降低疫苗内杂质的含量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了纯化制备抗新型冠状病毒感染的疫苗原液的方法，包括如下步骤：
步骤(1)：利用载体pPIC9将新型冠状病毒的基因与γ信号肽序列整合到毕赤酵母重组菌株中，发酵，获得发酵液；
步骤(2)：将步骤(1)所述发酵液加热至50～70℃灭活10～30min，离心收集上清，获得含有新型冠状病毒S-RBD蛋白的发酵清液；
步骤(3)：将步骤(2)所述发酵清液与硫酸铵以质量体积比150～250g/L混合，上样于疏水层析介质，然后进行盐浓度梯度洗脱，获得洗脱液；
步骤(4)：对步骤(3)所述洗脱液进行除盐，洗滤体积为3～5倍，收集浓缩液，上样于离子交换层析介质，用浓度为0.1～0.2mol/L的缓冲液淋洗，再用高盐缓冲溶液洗脱，收集洗脱液，获得中度纯化的新型冠状病毒蛋白；
步骤(5)：取步骤(4)所述中度纯化的新型冠状病毒蛋白上样于精细纯化的介质，收集洗脱液，获得所述抗新型冠状病毒感染的疫苗原液。
在本发明的一些具体实施方案中，上述方法中步骤(2)所述离心的转速包括5000rpm或7000g以上。
在本发明的一些具体实施方案中，上述方法中所述新型冠状病毒的基因包括新型冠状病毒S-RBD蛋白基因；和/或
所述新型冠状病毒蛋白包括新型冠状病毒S-RBD蛋白。
在本发明的一些具体实施方案中，上述新型冠状病毒S-RBD蛋白基因包括经密码子优化的所述新型冠状病毒S-RBD蛋白基因。
在本发明的一些具体实施方案中，上述方法中所述毕赤酵母重组菌株的构建方法包括：将新型冠状病毒S-RBD蛋白基因克隆到表达质粒上，获得重组质粒；将所述重组质粒导入毕赤酵母中，筛选，获得毕赤酵母重组菌株。
在本发明的一些具体实施方案中，上述方法中所述步骤(2)中在加热所述发酵液前，还包括调节所述发酵液的pH值的步骤，所述调节包括将所述发酵液与碳酸钠或氢氧化钠混合调节pH，所述加热为加热至50～70℃。
在本发明的一些具体实施方案中，上述方法中所述步骤(3)中所述盐浓度梯度洗脱包括使用0～0.5mol/L的NaCl缓冲溶液、0～0.5mol/L的KCl缓冲溶液或0～100g/L的硫酸铵溶液进行洗脱。
在本发明的一些具体实施方案中，上述方法中所述步骤(4)中所述除盐包括使用5kDa切向流超滤的膜包或中空纤维除去所述洗脱液中的盐。
在本发明的一些具体实施方案中，上述除盐包括使用5KDa切向流超滤的膜包(Millipore，PALL)或中空纤维(Millipore，PALL)除去所述洗脱液中的盐。
在本发明的一些具体实施方案中，上述方法中所述步骤(4)中所述层析介质包括SP SepharoseFF、SP Sepharose XL、HeparinSepharose6 FF或Cellufine Sulfate。
在本发明的一些具体实施方案中，上述方法中所述步骤(4)中所述高盐缓冲溶液包括0.3～0.5mol/L的NaCl缓冲溶液或0.3～0.5mol/L的KCl缓冲溶液。
在本发明的一些具体实施方案中，上述方法中所述步骤(5)中所述精细纯化的介质包括Sepharose 6FF或Sepharose 4F。
本发明的方法有具降低制备成本、有效提高疫苗的效力、提高疫苗的纯度、降低疫苗内杂质的含量的效果。本发明纯化重组亚单位疫苗原液工艺稳定，批间差小，简化了制备工艺，降低了制备成本，有效提高疫苗的效力，还有助于提高疫苗的纯度，降低疫苗内杂质的含量；对获得的新型冠状病毒重组亚单位疫苗发酵液进行灭活；有助于降低生物安全风险，确保疫苗的生物安全。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明的方法流程图；
图2示质粒图谱；
图3示实施例1电泳图；
图4示实施例2电泳图；
图5示实施例3电泳图。
具体实施方式
本发明公开了纯化制备抗新型冠状病毒感染的疫苗原液的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的目的在于提供一种纯化制备抗新型冠状病毒感染的疫苗原液的方法，降低制备成本，有效提高疫苗的效力，提高疫苗的纯度，降低疫苗内杂质的含量。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种纯化制备抗新型冠状病毒感染的疫苗原液的方法，所述方法如下：
步骤一：利用载体pPIC9K将密码子优化后的新型冠状病毒S蛋白RBD基因整合到重组毕赤酵母基因工程组中，通过发酵培养获得新型冠状病毒重组亚单位疫苗发酵液；
步骤二：将获得的新型冠状病毒重组亚单位疫苗发酵液加热灭活，并离心收集发酵上清液；
步骤三：向灭活的新型冠状病毒重组亚单位疫苗发酵液中添加硫酸铵至质量体积比为15～25％；上样于可吸附新型冠状病毒spike RBD蛋白的疏水层析介质(Butyl或Phentyl)；新型冠状病毒spike RBD蛋白结合于上述层析介质上，将目的蛋白捕获，并通过低盐浓度梯度洗脱，收集洗脱的初步纯化的新型冠状病毒spike RBD蛋白；
步骤四：使用5KDa切向流超滤的膜包(Millipore，PALL)或中空纤维(Millipore，PALL)除去洗脱液中浓度较高的盐，洗滤体积控制在3～5倍，收集浓缩液用于后期纯化；上样于可吸附目的蛋白的阳离子交换层析介质上，上样pH 5.0～7.0，用浓度范围在0.1～0.2mol/L的盐溶液洗脱，将杂质与目的蛋白分离，用含高盐(0.3mol/L以上)的缓冲溶液洗脱结合的目的蛋白，收集洗脱的中度纯化的新型冠状病毒RBD蛋白；
步骤五：经过中度纯化的样品上样与精细纯化的介质，通过凝胶分离将杂质与目的蛋白分离，通过精细纯化后收集洗脱的新型冠状病毒spike RBD蛋白，即为最后纯化的样品。
作为本发明的一种优选的技术方案，所述重组毕赤酵母基因工程组构建方法如下：
步骤A：从NCBI数据库的Genbank上获得新冠病毒spike蛋白RBD核酸序列，委托公司进行密码子优化并合成DNA片段；
步骤B：将获得的S-RBD基因片段克隆到表达质粒pPIC9K上，得到重组质粒；
步骤C：将获得的重组质粒线性化后导入毕赤酵母组中，筛选得到重组毕赤酵母基因工程组。
作为本发明的一种优选的技术方案，所述步骤三中，盐浓度梯度洗脱用液为0.4～0.5mol/L NaCl/KCl缓冲溶液或15～20％的硫酸铵溶液。
作为本发明的一种优选的技术方案，所述步骤四中，吸附目的蛋白的层析介质为SP SepharoseFF、SP Sepharose XL(GE)、HeparinSepharose6 FF(GE)、Cellufine Sulfate(Chisso Corporation)。
作为本发明的一种优选的技术方案，所述步骤四中，高盐缓冲溶液为0.3～0.5mol/L的NaCl或KCl缓冲溶液。
作为本发明的一种优选的技术方案，所述步骤五中，精细纯化的介质为Sepharose6FF、Sepharose 4F(GE)；最后纯化的样品在2～8℃下保存。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明纯化重组亚单位疫苗原液工艺稳定，批间差小，简化了制备工艺，降低了制备成本，有效提高疫苗的效力，还有助于提高疫苗的纯度，降低疫苗内杂质的含量；
(2)对获得的新型冠状病毒重组亚单位疫苗，RBD蛋白为分泌型表达发酵液进行灭活后直接离心即可获得；有助于降低生物安全风险，确保疫苗的生物安全。
本发明涉及的质粒序列如下(质粒图谱如图2所示)：
GCGGCCGCGAATTAATTCGCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCTATCGAATCTAAATGTAAGTTAAAATCTCTAAATAATTAAATAAGTCCCAGTTTCTCCATACGAACCTTAACAGCATTGCGGTGAGCATCTAGACCTTCAACAGCAGCCAGATCCATCACTGCTTGGCCAATATGTTTCAGTCCCTCAGGAGTTACGTCTTGTGAAGTGATGAACTTCTGGAAGGTTGCAGTGTTAACTCCGCTGTATTGACGGGCATATCCGTACGTTGGCAAAGTGTGGTTGGTACCGGAGGAGTAATCTCCACAACTCTCTGGAGAGTAGGCACCAACAAACACAGATCCAGCGTGTTGTACTTGATCAACATAAGAAGAAGCATTCTCGATTTGCAGGATCAAGTGTTCAGGAGCGTACTGATTGGACATTTCCAAAGCCTGCTCGTAGGTTGCAACCGATAGGGTTGTAGAGTGTGCAATACACTTGCGTACAATTTCAACCCTTGGCAACTGCACAGCTTGGTTGTGAACAGCATCTTCAATTCTGGCAAGCTCCTTGTCTGTCATATCGACAGCCAACAGAATCACCTGGGAATCAATACCATGTTCAGCTTGAGCAGAAGGTCTGAGGCAACGAAATCTGGATCAGCGTATTTATCAGCAATAACTAGAACTTCAGAAGGCCCAGCAGGCATGTCAATACTACACAGGGCTGATGTGTCATTTTGAACCATCATCTTGGCAGCAGTAACGAACTGGTTTCCTGGACCAAATATTTTGTCACACTTAGGAACAGTTTCTGTTCCGTAAGCCATAGCAGCTACTGCCTGGGCGCCTCCTGCTAGCACGATACACTTAGCACCAACCTTGTGGGCAACGTAGATGACTTCTGGGGTAAGGGTACCATCCTTCTTAGGTGGAGATGCAAAAACAATTTCTTTGCAACCAGCAACTTTGGCAGGAACACCCAGCATCAGGGAAGTGGAAGGCAGAATTGCGGTTCCACCAGGAATATAGAGGCCAACTTTCTCAATAGGTCTTGCAAAACGAGAGCAGACTACACCAGGGCAAGTCTCAACTTGCAACGTCTCCGTTAGTTGAGCTTCATGGAATTTCCTGACGTTATCTATAGAGAGATCAATGGCTCTCTTAACGTTATCTGGCAATTGCATAAGTTCCTCTGGGAAAGGAGCTTCTAACACAGGTGTCTTCAAAGCGACTCCATCAAACTTGGCAGTTAGTTCTAAAAGGGCTTTGTCACCATTTTGACGAACATTGTCGACAATTGGTTTGACTAATTCCATAATCTGTTCCGTTTTCTGGATAGGACGACGAAGGGCATCTTCAATTTCTTGTGAGGAGGCCTTAGAAACGTCAATTTTGCACAATTCAATACGACCTTCAGAAGGGACTTCTTTAGGTTTGGATTCTTCTTTAGGTTGTTCCTTGGTGTATCCTGGCTTGGCATCTCCTTTCCTTCTAGTGACCTTTAGGGACTTCATATCCAGGTTTCTCTCCACCTCGTCCAACGTCACACCGTACTTGGCACATCTAACTAATGCAAAATAAAATAAGTCAGCACATTCCCAGGCTATATCTTCCTTGGATTTAGCTTCTGCAAGTTCATCAGCTTCCTCCCTAATTTTAGCGTTCAAACAAAACTTCGTCGTCAAATAACCGTTTGGTATAAGAACCTTCTGGAGCATTGCTCTTACGATCCCACAAGGTGCTTCCATGGCTCTAAGACCCTTTGATTGGCCAAAACAGGAAGTGCGTTCCAAGTGACAGAAACCAACACCTGTTTGTTCAACCACAAATTTCAAGCAGTCTCCATCACAATCCAATTCGATACCCAGCAACTTTTGAGTTCGTCCAGATGTAGCACCTTTATACCACAAACCGTGACGACGAGATTGGTAGACTCCAGTTTGTGTCCTTATAGCCTCCGGAATAGACTTTTTGGACGAGTACACCAGGCCCAACGAGTAATTAGAAGAGTCAGCCACCAAAGTAGTGAATAGACCATCGGGGCGGTCAGTAGTCAAAGACGCCAACAAAATTTCACTGACAGGGAACTTTTTGACATCTTCAGAAAGTTCGTATTCAGTAGTCAATTGCCGAGCATCAATAATGGGGATTATACCAGAAGCAACAGTGGAAGTCACATCTACCAACTTTGCGGTCTCAGAAAAAGCATAAACAGTTCTACTACCGCCATTAGTGAAACTTTTCAAATCGCCCAGTGGAGAAGAAAAAGGCACAGCGATACTAGCATTAGCGGGCAAGGATGCAACTTTATCAACCAGGGTCCTATAGATAACCCTAGCGCCTGGGATCATCCTTTGGACAACTCTTTCTGCCAAATCTAGGTCCAAAATCACTTCATTGATACCATTATTGTACAACTTGAGCAAGTTGTCGATCAGCTCCTCAAATTGGTCCTCTGTAACGGATGACTCAACTTGCACATTAACTTGAAGCTCAGTCGATTGAGTGAACTTGATCAGGTTGTGCAGCTGGTCAGCAGCATAGGGAAACACGGCTTTTCCTACCAAACTCAAGGAATTATCAAACTCTGCAACACTTGCGTATGCAGGTAGCAAGGGAAATGTCATACTTGAAGTCGGACAGTGAGTGTAGTCTTGAGAAATTCTGAAGCCGTATTTTTATTATCAGTGAGTCAGTCATCAGGAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGACCTGCAGGGGGGGGGGGGGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCTGCAGGTCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGAGTATCTATGATTGGAAGTATGGGAATGGTGATACCCGCATTCTTCAGTGTCTTGAGGTCTCCTATCAGATTATGCCCAACTAAAGCAACCGGAGGAGGAGATTTCATGGTAAATTTCTCTGACTTTTGGTCATCAGTAGACTCGAACTGTGAGACTATCTCGGTTATGACAGCAGAAATGTCCTTCTTGGAGACAGTAAATGAAGTCCCACCAATAAAGAAATCCTTGTTATCAGGAACAAACTTCTTGTTTCGAACTTTTTCGGTGCCTTGAACTATAAAATGTAGAGTGGATATGTCGGGTAGGAATGGAGCGGGCAAATGCTTACCTTCTGGACCTTCAAGAGGTATGTAGGGTTTGTAGATACTGATGCCAACTTCAGTGACAACGTTGCTATTTCGTTCAAACCATTCCGAATCCAGAGAAATCAAAGTTGTTTGTCTACTATTGATCCAAGCCAGTGCGGTCTTGAAACTGACAATAGTGTGCTCGTGTTTTGAGGTCATCTTTGTATGAATAAATCTAGTCTTTGATCTAAATAATCTTGACGAGCCAAGGCGATAAATACCCAAATCTAAAACTCTTTTAAAACGTTAAAAGGACAAGTATGTCTGCCTGTATTAAACCCCAAATCAGCTCGTAGTCTGATCCTCATCAACTTGAGGGGCACTATCTTGTTTTAGAGAAATTTGCGGAGATGCGATATCGAGAAAAAGGTACGCTGATTTTAAACGTGAAATTTATCTCAAGATCTCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAATTAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTGACTCATGTTGGTATTGTGAAATAGACGCAGATCGGGAACACTGAAAAATAACAGTTATTATTCGAGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAATGAAACCTTTTTGCCATCCGACATCCACAGGTCCATTCTCACACATAAGTGCCAAACGCAACAGGAGGGGATACACTAGCAGCAGACCGTTGCAAACGCAGGACCTCCACTCCTCTTCTCCTCAACACCCACTTTTGCCATCGAAAAACCAGCCCAGTTATTGGGCTTGATTGGAGCTCGCTCATTCCAATTCCTTCTATTAGGCTACTAACACCATGACTTTATTAGCCTGTCTATCCTGGCCCCCCTGGCGAGGTTCATGTTTGTTTATTTCCGAATGCAACAAGCTCCGCATTACACCCGAACATCACTCCAGATGAGGGCTTTCTGAGTGTGGGGTCAAATAGTTTCATGTTCCCCAAATGGCCCAAAACTGACAGTTTAAACGCTGTCTTGGAACCTAATATGACAAAAGCGTGATCTCATCCAAGATGAACTAAGTTTGGTTCGTTGAAATGCTAACGGCCAGTTGGTCAAAAAGAAACTTCCAAAAGTCGCCATACCGTTTGTCTTGTTTGGTATTGATTGACGAATGCTCAAAAATAATCTCATTAATGCTTAGCGCAGTCTCTCTATCGCTTCTGAACCCCGGTGCACCTGTGCCGAAACGCAAATGGGGAAACACCCGCTTTTTGGATGATTATGCATTGTCTCCACATTGTATGCTTCCAAGATTCTGGTGGGAATACTGCTGATAGCCTAACGTTCATGATCAAAATTTAACTGTTCTAACCCCTACTTGACAGCAATATATAAACAGAAGGAAGCTGCCCTGTCTTAAACCTTTTTTTTTATCATCATTATTAGCTTACTTTCATAATTGCGACTGGTTCCAATTGACAAGCTTTTGATTTTAACGACTTTTAACGACAACTTGAGAAGATCAAAAAACAACTAATTATTCGAAGGATCCAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCGAGAAAAGAATCACTAACCTTTGTCCATTCGGTGAGGTGTTCAACGCTACCAGATTCGCATCTGTGTACGCTTGGAACAGAAAGAGAATCTCCAACTGTGTTGCCGATTACTCTGTTTTGTACAACTCCGCTTCCTTCTCTACCTTCAAGTGTTATGGTGTTTCTCCAACCAAGTTGAACGACCTTTGTTTCACTAACGTTTACGCCGATTCTTTCGTTATCAGAGGTGACGAGGTCAGACAGATTGCTCCTGGTCAAACTGGTAAGATTGCTGACTACAACTACAAGTTGCCTGATGACTTCACTGGTTGCGTTATCGCTTGGAACTCTAACAACTTGGACTCTAAGGTTGGTGGTAACTACAACTACTTGTACAGATTGTTCCGTAAGTCCAACTTGAAGCCTTTCGAGAGAGACATCTCTACTGAAATCTACCAAGCTGGATCTACTCCTTGTAACGGTGTGGAAGGTTTCAACTGTTACTTCCCTTTGCAATCCTACGGTTTCCAACCAACTAACGGAGTTGGTTACCAACCTTACAGAGTTGTCGTTCTCTCTTTCGAGTTGCTTCACGCACCAGCTACCGTCTGTGGTCCTAAGAAGTCCACTAACTTGGTCAAGAACAAGTGTGTTAACTTCAACTTCAACGGTTTGACTGGTACAGGTTAAGAGGCTGAAGCTTACGTAGAATTCCCTAGG(SEQ ID NO.1)
如无特殊说明，本发明所用的试剂以及采用的仪器均为市售产品，采用的试验方法也为本领域常规方法。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种纯化制备抗新型冠状病毒感染的疫苗原液的方法，方法如下：
步骤一：利用载体pPIC9K将密码子优化后的新型冠状病毒S蛋白RBD基因整合到重组毕赤酵母基因工程组中，通过发酵培养获得新型冠状病毒重组亚单位疫苗发酵液；
步骤二：将获得的新型冠状病毒重组亚单位疫苗发酵液pH值调节至8，加热至50℃，对获得的新型冠状病毒重组亚单位疫苗发酵液进行灭活；有助于降低生物安全风险，确保疫苗的生物安全；
步骤三：向灭活的新型冠状病毒重组亚单位疫苗发酵液中添加硫酸铵至质量体积比为15％；上样于可吸附新型冠状病毒spike RBD蛋白的层析介质；新型冠状病毒spikeRBD蛋白结合于上述层析介质上，将目的蛋白捕获，并通过盐浓度梯度洗脱，收集洗脱的初步纯化的新型冠状病毒spike RBD蛋白；盐浓度梯度洗脱用液为0.1M NaCl/KCl缓冲溶液或1％的硫酸铵溶液；
步骤四：使用5KDa切向流超滤的膜包(Millipore，PALL)除去洗脱液中浓度较高的盐，洗滤体积控制在3倍，收集浓缩液用于后期纯化；上样于可吸附目的蛋白的层析介质上，用浓度范围在0.1mol/L洗脱，将杂质与目的蛋白分离，用含高盐的缓冲溶液洗脱结合的目的蛋白，收集洗脱的中度纯化的新型冠状病毒RBD蛋白；吸附目的蛋白的层析介质为SPSepharoseFF、SP Sepharose XL(GE)、HeparinSepharose6 FF(GE)、Cellufine Sulfate(Chisso Corporation)；高盐缓冲溶液为0.3mol/L的NaCl或KCl缓冲溶液；
步骤五：经过中度纯化的样品上样与精细纯化的介质，通过凝胶分离将杂质与目的蛋白分离，通过精细纯化后收集洗脱的新型冠状病毒spike RBD蛋白，即为最后纯化的样品；精细纯化的介质为Sepharose 6FF；样品使用0.22μm滤器除菌过滤，最后纯化的样品在2℃下保存。
经过还原性SDS-PAGE(Bio-RAD)检测纯度＞90％，Western-blot(Bio-RAD)的检测电泳目的条带可与新型冠状病毒的单抗或多抗呈特异性的显色反应。实验结果见图3，从图中可见，发酵液中含有大量杂蛋白，目的蛋白(S-RBD蛋白)含量较低；经过步骤3后，目的蛋白浓度和纯度明显提高，杂蛋白被有效去除但，仍有少量残留；经过步骤4后，目的蛋白纯度继续提高，杂蛋已经基本去除；步骤3-2和步骤4-2作用为除盐或换液对杂蛋白去除无明显帮助；步骤5，虽对蛋白纯度的去除无明显作用，但是对内毒素和热源的去除，以及生物制品的安全性有帮助。
菌种构建方法：
步骤A：从NCBI数据库的Genbank上获得新冠病毒spike蛋白RBD核酸序列，委托公司进行密码子优化并合成DNA片段；
步骤B：将获得的S-RBD基因片段克隆到表达质粒pPIC9K上，得到重组质粒；
步骤C：将获得的重组质粒线性化后导入毕赤酵母组中，筛选得到重组毕赤酵母基因工程组。
实施例2
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种纯化制备抗新型冠状病毒感染的疫苗原液的方法，方法如下：
步骤一：利用载体pPIC9K将密码子优化后的新型冠状病毒S蛋白RBD基因整合到重组毕赤酵母基因工程组中，通过发酵培养获得新型冠状病毒重组亚单位疫苗发酵液；
步骤二：将获得的新型冠状病毒重组亚单位疫苗发酵液中投入破壁罐中，调节pH值至9，加热至60℃，对获得的新型冠状病毒重组亚单位疫苗发酵液进行灭活；有助于降低生物安全风险，确保疫苗的生物安全；
步骤三：向灭活的新型冠状病毒重组亚单位疫苗发酵液中添加硫酸铵至质量体积比为20％；上样于可吸附新型冠状病毒spike RBD蛋白的层析介质；新型冠状病毒spikeRBD蛋白结合于上述层析介质上，将目的蛋白捕获，并通过盐浓度梯度洗脱，收集洗脱的初步纯化的新型冠状病毒spike RBD蛋白；盐浓度梯度洗脱用液为0.3M NaCl/KCl缓冲溶液或5％的硫酸铵溶液；
步骤四：使用5KDa切向流中空纤维(Millipore，PALL)除去洗脱液中浓度较高的盐，洗滤体积控制在4倍，收集浓缩液用于后期纯化；上样于可吸附目的蛋白的层析介质上，用浓度范围在0.2mol/l洗脱，将杂质与目的蛋白分离，用含高盐的缓冲溶液洗脱结合的目的蛋白，收集洗脱的中度纯化的新型冠状病毒RBD蛋白；吸附目的蛋白的层析介质为SPSepharoseFF；高盐缓冲溶液为0.4mol/L的NaCl或KCl缓冲溶液；
步骤五：经过中度纯化的样品上样与精细纯化的介质，通过凝胶分离将杂质与目的蛋白分离，通过精细纯化后收集洗脱的新型冠状病毒spike RBD蛋白，即为最后纯化的样品；精细纯化的介质为Sepharose 6FF；最后纯化的样品在5℃下保存。
实验结果见图4，从图中可见，与案例2结果基本完全一致。
本实施例中，重组毕赤酵母基因工程组构建方法与实施例1相同。
实施例3
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种纯化制备抗新型冠状病毒感染的疫苗原液的方法，方法如下：
步骤一：利用载体pPIC9K将密码子优化后的新型冠状病毒S蛋白RBD基因整合到重组毕赤酵母基因工程组中，通过发酵培养获得新型冠状病毒重组亚单位疫苗发酵液；
步骤二：将获得的新型冠状病毒重组亚单位疫苗发酵液中投入破壁罐中，并向破壁罐中加入氢氧化钠，调节pH值至10，加热至70℃，对获得的新型冠状病毒重组亚单位疫苗发酵液进行灭活；有助于降低生物安全风险，确保疫苗的生物安全；
步骤三：向灭活的新型冠状病毒重组亚单位疫苗发酵液中添加硫酸铵至质量体积比为25％；上样于可吸附新型冠状病毒spike RBD蛋白的层析介质；新型冠状病毒spikeRBD蛋白结合于上述层析介质上，将目的蛋白捕获，并通过盐浓度梯度洗脱，收集洗脱的初步纯化的新型冠状病毒spike RBD蛋白；盐浓度梯度洗脱用液为0.5M NaCl/KCl缓冲溶液或10％的硫酸铵溶液；
步骤四：使用5KDa切向流超滤的膜包(Millipore，PALL)除去洗脱液中浓度较高的盐，洗滤体积控制在5倍，收集浓缩液用于后期纯化；上样于可吸附目的蛋白的层析介质上，用浓度范围在0.2mol/L洗脱，将杂质与目的蛋白分离，用含高盐的缓冲溶液洗脱结合的目的蛋白，收集洗脱的中度纯化的新型冠状病毒RBD蛋白；吸附目的蛋白的层析介质为HeparinSepharose6 FF(GE)，高盐缓冲溶液为0.3mol/L的NaCl或KCl缓冲溶液；
步骤五：经过中度纯化的样品上样与精细纯化的介质，通过凝胶分离将杂质与目的蛋白分离，通过精细纯化后收集洗脱的新型冠状病毒spike RBD蛋白，即为最后纯化的样品；精细纯化的介质为Sepharose 4F(GE)；最后纯化的样品在8℃下保存。
实验结果见图5，从图中可见，与案例1和案例2结果完全一致。
本实施例中，重组毕赤酵母基因工程组构建方法与实施例1相同。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.纯化制备抗新型冠状病毒感染的疫苗原液的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)：利用载体pPIC9将新型冠状病毒的基因与γ信号肽序列整合到毕赤酵母重组菌株中，发酵，获得发酵液；
步骤(2)：将步骤(1)所述发酵液加热至50～70℃灭活10～30min，离心收集上清，获得含有新型冠状病毒S-RBD蛋白的发酵清液；
步骤(3)：将步骤(2)所述发酵清液与硫酸铵以质量体积比150g/L～250g/L混合，上样于疏水层析介质，然后进行盐浓度梯度洗脱，获得洗脱液；
步骤(4)：对步骤(3)所述洗脱液进行除盐，洗滤体积为3～5倍，收集浓缩液，上样于离子交换层析介质，用浓度为0.1～0.2mol/L的缓冲液淋洗，再用高盐缓冲溶液洗脱，收集洗脱液，获得中度纯化的新型冠状病毒蛋白；
步骤(5)：取步骤(4)所述中度纯化的新型冠状病毒蛋白上样于精细纯化的介质，收集洗脱液，获得所述抗新型冠状病毒感染的疫苗原液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述新型冠状病毒的基因包括新型冠状病毒S-RBD蛋白基因；和/或
所述新型冠状病毒蛋白包括新型冠状病毒S-RBD蛋白。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述毕赤酵母重组菌株的构建方法包括：新型冠状病毒S-RBD蛋白基因克隆到表达质粒上，获得重组质粒；将所述重组质粒导入毕赤酵母中，筛选，获得毕赤酵母重组菌株。
4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述盐浓度梯度洗脱包括使用0～0.5M的NaCl缓冲溶液、0～0.5M的KCl缓冲溶液或0～100g/L的硫酸铵溶液进行洗脱。
5.如权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述除盐包括使用5kDa切向流超滤的膜包或中空纤维除去所述洗脱液中的盐。
6.如权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述离子交换层析介质包括SP SepharoseFF、SP Sepharose XL、HeparinSepharose6FF或CellufineSulfate。
7.如权利要求1至6任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述高盐缓冲溶液包括0.3～0.5mol/L的NaCl缓冲溶液或0.3～0.5mol/L的KCl缓冲溶液。
8.如权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中所述精细纯化的介质包括Sepharose 6FF或Sepharose 4F。
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