CN117757759A - 一种针对nk细胞的慢病毒纯化的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物技术领域，特别涉及一种针对NK细胞的慢病毒纯化的方法及其应用。本申请提供一种慢病毒纯化的方法，包括以下步骤：1）将慢病毒收获液和核酸酶孵育，浓缩换液后继续加入核酸酶孵育，得到慢病毒澄清收获液；2）对慢病毒澄清收获液采用复合模式层析，获得粗纯样品；3）对粗纯样品进行阴离子层析，无菌过滤后得到纯化样品。本申请的纯化方法可以提高慢病毒纯化的回收率和杂质的去除能力。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，特别涉及一种针对NK细胞的慢病毒纯化的方法及其应用。
背景技术
慢病毒是由人类免疫缺陷病毒（HIV），通过去除env、vif、vpr、vpu、nef等毒性基因改造而来。NK使用的复制缺陷型HIV载体通常用狒狒内源性病毒（baboon endogenousvirus）的包膜来代替HIV-1的包膜进行包装，从而更安全，宿主范围更广，还能增加病毒的滴度。目前，基因治疗已经被广泛用于治疗囊性纤维化、血友病、肌营养不良症和镰状细胞贫血等基因遗传性疾病、血液病，以及肿瘤疾病当中。
慢病毒上游的生产工艺一般采用HEK293细胞进行瞬时转染或构建稳定生产细胞系的方式进行生产，细胞的培养方式可以分为贴壁培养和悬浮培养。慢病毒下游的生产工艺路线一般先通过澄清（离心或过滤）去除大的细胞、细胞碎片及部分杂质，然后通过超滤系统对病毒进行浓缩、溶液置换及部分杂质的去除，再经过核酸酶（一般为Benzonase）的消化去除部分残留核酸，最后通过二次超滤、层析等技术对慢病毒进一步进行纯化。不过传统纯化方法对杂质去除能力较差，整体的回收率较低。
因此，为解决这个难题，需要开发一种针对NK细胞的慢病毒纯化的方法及其应用，为解决未来基因治疗中所需的病毒载体提供了一种高效率的生产方案。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本申请的目的在于提供一种针对NK细胞的慢病毒纯化的方法及其应用，提高针对NK细胞慢病毒纯化的回收率和杂质的去除能力。
为实现上述目的及其他相关目的，本申请第一方面提供一种针对NK细胞的慢病毒纯化的方法，包括以下步骤：
1）将慢病毒收获液和核酸酶孵育，浓缩换液后继续加入核酸酶孵育，得到慢病毒澄清收获液；
2）对慢病毒澄清收获液采用复合模式层析，获得粗纯样品；
3）对粗纯样品进行阴离子层析，无菌过滤后得到纯化样品。
在一些实施方式中，步骤1）中，慢病毒收获液和核酸酶孵育前先进行慢病毒收获液的过滤，所述过滤采用囊氏过滤器进行。
在一些实施方式中，步骤1）中，所述浓缩采用TFF浓缩系统进行。
在一些实施方式中，步骤1）中，所述换液的缓冲液为PBS；所述换液的缓冲液中还包括1~2M MgCl2。
在一些实施方式中，步骤2）中，所述复合模式层析的填料选自Capto core 700或Capto core 400。
在一些实施方式中，步骤3）中，所述阴离子层析选自DEAE层析。
在一些实施方式中，DEAE层析时，粗纯样品的上样量不超过0.5CV。
在一些实施方式中，DEAE层析包括以下步骤：
1）平衡：用4~6CV的缓冲液A冲洗DEAE层析柱；
2）上样：将粗纯样品上样；
3）清洗：用2~4CV的缓冲液A冲洗DEAE层析柱；
4）洗杂：用2~4CV的第一混合缓冲液冲洗DEAE层析柱，所述第一混合缓冲液包括缓冲液A和缓冲液B；以第一混合缓冲液的总体积为基准，缓冲液B的体积分数为0~30%；
5）洗脱：用2~4CV的第二混合缓冲液冲洗DEAE层析柱，获得层析后的样品；所述第二混合缓冲液包括缓冲液A和缓冲液B；以第二混合缓冲液的总体积为基准，缓冲液B的体积分数为30~100%。
在一些实施方式中，粗纯样品的上样体积为80%动态结合载量；所述动态结合载量通过将粗纯样品通过UV检测池计算得到。
在一些实施方式中，缓冲液B的组分包括15~25mM Tris-HCl和0.8~1.2M NaCl；所述缓冲液A的组分包括15~25mM Tris-HCl和140~150mM NaCl。
在一些实施方式中，以第一混合缓冲液的总体积为基准，缓冲液B的体积分数为15%，缓冲液A的体积分数为85%。
在一些实施方式中，以第二混合缓冲液的总体积为基准，缓冲液B的体积分数为60%，缓冲液A的体积分数为40%。
在一些实施方式中，洗脱后进行最后的清洗，包括用2CV的清洗液冲洗DEAE层析柱，所述清洗液包括0.8~1.2M NaOH和0.8~1.2M NaCl。
与现有技术相比，本申请的有益效果为：
本申请的纯化方法通过选择两种层析方式，包括复合模式层析和阴离子层析，并优化阴离子层析时所用的缓冲液配方，从而提高慢病毒纯化的回收率和杂质的去除能力。
附图说明
图1为DEAE离子交换层析图。0-30%B即为Buffer A+Buffer B，其中Buffer B的比例从0%逐步提高至30%，相应的Buffer A的比例从100%对应降低至70%；30-100%B即为Buffer A+Buffer B，其中Buffer B的比例从30%逐步提高至100%。
具体实施方式
为了使本申请的发明目的、技术方案和有益效果更加清晰，下面结合实施例对本申请作进一步说明。应理解，所述实施例只用于解释本申请，并非用于限定申请的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，熟悉此技术的人士可由本说明所揭露的内容容易地了解本申请的其他优点及功效。
本申请的发明人经过大量探索研究，发现了一种针对NK细胞的慢病毒纯化的方法及其应用，在此基础上完成了本申请。
本申请提供一种针对NK细胞的慢病毒纯化的方法，包括以下步骤：
1）将慢病毒收获液和核酸酶孵育，浓缩换液后继续加入核酸酶孵育，得到慢病毒澄清收获液；
2）对慢病毒澄清收获液采用复合模式层析，获得粗纯样品；
3）对粗纯样品进行阴离子层析，无菌过滤后得到纯化样品。
本申请提供的方法中，步骤1）是指将慢病毒收获液和核酸酶孵育，浓缩换液后继续加入核酸酶孵育，得到慢病毒澄清收获液。其中，慢病毒收获液和核酸酶孵育前先进行慢病毒收获液的过滤，在一些实施方式中，过滤采用囊氏过滤器进行。浓缩采用TFF浓缩系统进行。换液的缓冲液为PBS；进一步地，换液的缓冲液中还包括1~2M MgCl2。在本申请一优选实施例中，换液的缓冲液为PBS和2M MgCl2。核酸酶的浓度可以是5U-10U/ml、10U-15U/ml、15U-20U/ml、20U-25U/ml、25U-30U/ml、30U-35U/ml、35U-40U/ml、40-45U/ml和45U-50U/ml。为了提高核酸酶的活性，还加入Mg2+或Mn2+至0 .5~20 mM、优选至0 .5~15 mM、更优选至1~10 mM。Mg2+的提供物质优选为MgCl2或MgSO4，Mn2+的提供物质优选为MnCl2或MnSO4。孵育条件可根据核酸酶产品推荐的条件进行，例如可以是低温长时的孵育，也可以是生理温度下孵育合适的时间。
慢病毒收获液由包括如下步骤的方法制得：使用不同质粒系统和相应的培养方法包装生产慢病毒，其中可使用三质粒或四质粒，培养基可以是无血清或有血清培养基，培养方式可以是悬浮或贴壁培养，培养容器根据需要可采用培养瓶、细胞工厂或生物反应器。前述步骤为慢病毒载体包装和培养过程，慢病毒载体的培养可参考《Productionof cGMP-Grade Lentiviral Vectors》或《Optimization of lentiviral vector production forscale-up in fixed-bed bioreactor》等文献。
本申请提供的方法中，步骤2）是指对慢病毒澄清收获液采用复合模式层析，获得粗纯样品。其中，复合模式层析的填料选自Capto core 700或Capto core 400。
在一些实施方式中，复合模式层析的填料为Capto core 700。Capto core 700为具有凝胶过滤层析和阴离子交换层析作用的复合模式层析材料。其微粒具有核心辛胺配基和惰性壳层，其惰性壳层可以排阻大分子进入微粒内部，而较小的杂质可以通过壳层上的小孔(排阻分子量为700KD)进入核心与配基结合，因此在慢病毒载体纯化中采用流穿模式。优所述复合模式层析的上样量为2-10CV，实施人员，可根据需要选择上样量，上样量可以是2-3CV、3-4CV、4-5CV、5-6CV、6-7CV、7-8CV、8-9CV和9-10CV，优选的上样量为2-5CV。
本申请提供的方法中，步骤3）是指对粗纯样品进行阴离子层析，无菌过滤后得到纯化样品。其中，阴离子层析选自DEAE层析。本申请通过增加DEAE层析并探究最优的纯化的体系，对HCP（HostCell Protein，宿主细胞产生的蛋白）的去除有较好的效果，显著提高慢病毒纯化的回收率和杂质的去除能力。
在一些实施方式中，DEAE层析时，粗纯样品的上样量不超过0.5CV。
在一些实施方式中，DEAE层析包括以下步骤：
1）平衡：用4~6CV的缓冲液A冲洗DEAE层析柱；
2）上样：将粗纯样品上样；
3）清洗：用2~4CV的缓冲液A冲洗DEAE层析柱；
4）洗杂：用2~4CV的第一混合缓冲液冲洗DEAE层析柱，所述第一混合缓冲液包括缓冲液A和缓冲液B；以第一混合缓冲液的总体积为基准，缓冲液B的体积分数为0~30%；
5）洗脱：用2~4CV的第二混合缓冲液冲洗DEAE层析柱，获得层析后的样品；
DEAE层析过程中，步骤1）中冲洗的流速为10-15ml/min；具体地，可以为10-12ml/min、12-13ml/min、或13-15ml/min等。
DEAE层析过程中，步骤2）中上样流速为8-10ml/min；具体地，可以为8-9ml/min、9-9.5ml/min、或9.5-10ml/min等。粗纯样品的上样体积为80%动态结合载量；进一步地，动态结合载量通过将粗纯样品通过UV检测池计算得到。
DEAE层析过程中，步骤3）清洗时的流速为8-10ml/min；具体地，可以为8-9ml/min、9-9.5ml/min、或9.5-10ml/min等。步骤4）或步骤5）中洗杂或洗脱过柱时的流速为10-15ml/min；具体地，可以为10-12ml/min、12-13ml/min、或13-15ml/min等。
DEAE层析过程中，步骤4）或步骤5）中，缓冲液B的组分包括15~25mM Tris-HCl和0.8~1.2M NaCl；缓冲液B的pH为7.5。缓冲液A的组分包括15~25mM Tris-HCl和140~150mMNaCl。缓冲液A的pH为7.5。
DEAE层析过程中，当步骤4）中的第一混合缓冲液为85%缓冲液A+15%缓冲液B，步骤5）中的第二混合缓冲液为40%缓冲液A+60%缓冲液B时，可以较纯地获得目的样品的洗杂峰和洗脱峰，从而提高针对慢病毒纯化的回收率和杂质的去除能力。
DEAE层析过程中，洗脱后进行最后的清洗，包括用2-4CV的清洗液冲洗DEAE层析柱，所述清洗液包括0.8-1.2M NaOH和0.8-1.2M NaCl。在一些实施方式中，最后的清洗过程还包括用水冲洗柱子，例如可以为在清洗液之前和/或清洗液之后用水冲洗柱子。清洗时过柱的流速为10-15ml/min。
下面通过实施例对本申请予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。
实施例1
本实施例提供具体的慢病毒纯化方法，包括以下步骤：
1）将慢病毒收获液按4000 g、22℃、5 min进行离心获得慢病毒上清液，使用1.0 μm-囊式滤器进行过滤，按60 U/mL向慢病毒过滤液中添加核酸酶，于37.0±1.0℃条件下静置孵育2.0±0.1小时。通过500 KD中空纤维柱进行浓缩20倍，并用PBS+2M MgCl2进行换液；
2）对慢病毒澄清收获液采用复合模式层析，获得粗纯样品；
3）对粗纯样品进行阴离子层析，无菌过滤后得到纯化样品。
关于步骤1），慢病毒收获液通过以下方式获得：配制PEI溶液和DNA溶液，DNA即pMD2.G、pMDLg-pRRE、pRSV-rev、载体质粒。两种溶液室温静置5分钟后，将PEI 溶液缓慢加入至 DNA 溶液中，加入过程中DNA溶液保持晃动，室温静置15分钟，静置后缓慢加入至293T细胞培养瓶中，完成转染。转染后6~8 h，加入补料培养基，其中包括20%（OPM-CHO PFF06）和2%包装体积的200 mM谷氨酰胺溶液。转染48±2 h后进行收毒，将慢病毒收获液4000 g离心5 min，得到慢病毒上清液。浓缩采用TFF浓缩系统进行。
关于步骤2），复合模式层析的填料选自Capto core 700。
关于步骤3），具体包括以下过程：
1、DEAE 动态载量（DBC）载量测定：
装填DEAE 层析填料10 ml，将得到的料液进行上样，样品浓度为 X ng/ml，先不通过柱子（Bypass）直接将样品通过UV检测池，检测值UV280的mAU 为Y，将柱位阀切换为过层析柱，上样后待mAU值为Y/10时记录上样病毒的总体积，通过检测确认总的慢病毒量。最后根据上样慢病毒的体积确定DEAE层析填料的载量。本次实验重复三次，取平均值计算载量公式为：
。
上样数据见表1：
表1 上样数据表
| 上样液单位物理滴度（p24，ng/ml） | 流穿10%时上样体积（ml） | DEAE 动态载量测试填料体积（ml） | DEAE 动态载量（ng/ml） |
| 13789600 | 6.41 | 8.6 | 10278062.33 |
由于后续样品上样前不能测算样品的物理滴度，为了尽可能多上样并避免样品超载流穿，暂定控制上样量不超过0.5CV。
2、DEAE离子交换层析条件优化：
使用LCC26/40层析柱（江苏汉邦科技股份有限公司） 装填130ml填料，进行梯度优化，线性流速设置为90~150 cm/h之间，冲洗流速设置为10ml/min，上样流速为8ml/min。按照80% DBC上样体积，进行梯度洗脱优化。梯度优化内容见表2，其中表中的流速是根据线性流速和柱子型号计算得到：
表2 DEAE离子交换层析条件优化表
洗脱时观察UV280的变化，待紫外值上升至50 mAU左右时开始收集病毒洗脱液，至紫外达到最高值并下降至约100mAU左右时停止收样。
结果如图1所示，DEAE上样后，用Buffer A进行后平衡，有较小洗脱峰；用100%~70%Buffer A、0~30%Buffer B进行2CV梯度洗杂，出现洗杂峰，接着用30~100%Buffer B进行2CV的梯度洗脱，样品被洗脱下来；继续保持100%Buffer B 2CV无洗脱峰；用CIP溶液进行清洁，未被洗脱的样品杂质均被清洗下来。
对梯度洗脱的两个洗脱峰分别进行检测（如表3），第一个峰的p24（Elisa方法）和TU（FACS方法）滴度都较低，主要为杂质峰；第二个峰的p24和TU滴度都较高，为目的样品洗脱峰。根据两个峰拐点处对应的Buffer A和Buffer B的比例，确定后续的洗杂溶液：85%Buffer A+15%Buffer B，洗脱溶液：40%Buffer A+60%Buffer B。
表3 洗脱峰检测表
| 检测项 | DEAE洗杂峰（ng/ml） | DEAE洗脱峰（ng/ml） |
| 单位物理滴度（p24） | 5535.2 | 1676200 |
| 转导滴度（TU） | 2.40E+04 | 7.43E+06 |
| 宿主细胞蛋白残留（HCP） | 1315.46 | 1361.84 |
3、分别对增加了DEAE层析和原工艺进行对比：
如表4，经过增加了DEAE层析，成品的转导滴度TU达到1.81E+08 TU/ml的较高水平，成品的HCP（即宿主细胞293T细胞）控制在34.33 ng/ml的极低水平，比优化前的工艺有了巨大提升。
表4 DEAE层析和原工艺对比表
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本申请。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本申请的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本申请的权利要求所涵盖。
Claims (8)
1.一种针对NK细胞的慢病毒纯化的方法，包括以下步骤：
1）将慢病毒收获液和核酸酶孵育，浓缩换液后继续加入核酸酶孵育，得到慢病毒澄清收获液；
2）对慢病毒澄清收获液采用复合模式层析，获得粗纯样品；
3）对粗纯样品进行阴离子层析，无菌过滤后得到纯化样品；所述阴离子层析选自DEAE层析；
DEAE层析包括以下步骤：
a1）平衡：用4~6CV的缓冲液A冲洗DEAE层析柱；
a2）上样：将粗纯样品上样；
a3）清洗：用2~4CV的缓冲液A冲洗DEAE层析柱；
a4）洗杂：用2~4CV的第一混合缓冲液冲洗DEAE层析柱，所述第一混合缓冲液包括缓冲液A和缓冲液B；以第一混合缓冲液的总体积为基准，缓冲液B的体积分数为15%，缓冲液A的体积分数为85%；
a5）洗脱：用2~4CV的第二混合缓冲液冲洗DEAE层析柱，获得层析后的样品；
所述第二混合缓冲液包括缓冲液A和缓冲液B；以第二混合缓冲液的总体积为基准，缓冲液B的体积分数为60%，缓冲液A的体积分数为40%；
所述缓冲液B的组分包括15~25mM Tris-HCl和0.8~1.2M NaCl；所述缓冲液A的组分包括15~25mM Tris-HCl和140~150mM NaCl。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，慢病毒收获液和核酸酶孵育前先进行慢病毒收获液的过滤，所述过滤采用囊氏过滤器进行。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述浓缩采用TFF浓缩系统进行。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述换液的缓冲液为PBS；所述换液的缓冲液中还包括1~2M MgCl2。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中，所述复合模式层析的填料选自Capto core 700或Capto core 400。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，DEAE层析时，粗纯样品的上样量不超过0.5CV。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述粗纯样品的上样体积为80%动态结合载量；所述动态结合载量通过将粗纯样品通过UV检测池计算得到。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，洗脱后进行最后的清洗，包括用2CV的清洗液冲洗DEAE层析柱，所述清洗液包括0.8~1.2M NaOH和0.8~1.2M NaCl。
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| CN202311788365.0A CN117757759A (zh) | 2023-12-25 | 2023-12-25 | 一种针对nk细胞的慢病毒纯化的方法及其应用 |
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