CN113817689B - 慢病毒纯化工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的慢病毒纯化工艺，其包括以下步骤：（1）在慢病毒收获前，加入核酸酶进行消化，得到细胞培养液；（2）对细胞培养液进行澄清，得到澄清液；（3）对澄清液进行浓缩，得到浓缩液；（4）对浓缩液进行洗滤，得到纯化的慢病毒。本发明的慢病毒纯化工艺缩短了工艺步骤和工艺时间，提高了慢病毒滴度的回收率。

Description

慢病毒纯化工艺
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种慢病毒纯化工艺。
背景技术
慢病毒是由HIV-1（人类免疫缺陷病毒1型）改造而来的一种病毒载体。近年来，基因治疗和细胞治疗兴起，慢病毒由于其自身特性——既能感染分裂细胞又能感染非分裂细胞，能够容纳外源性大的基因片段，表达的持久性、免疫反应小等优点，在其中具有非常广阔的应用前景。慢病毒上游的生产工艺一般采用HEK293细胞进行瞬时转染或构建稳定生产细胞系的方式进行生产，细胞的培养方式可以分为贴壁培养和悬浮培养。慢病毒下游的生产工艺路线一般先通过澄清（离心或过滤）去除大的细胞、细胞碎片及部分杂质，然后通过超滤系统对病毒进行浓缩、溶液置换及部分杂质的去除，再经过核酸酶（一般为Benzonase）的消化去除部分残留核酸，最后通过二次超滤、层析等技术对慢病毒进一步进行纯化。已报道的病毒总回收率约为36%（参见例如专利文献1：CN112899242A）。目前慢病毒生产和纯化工艺仍面临一系列挑战，例如工艺流程复杂，工艺放大困难，病毒收获率低；生产稳定性差，批次间差异大，病毒感染能力不稳定；核酸、HCP（host cell protein，宿主蛋白）等杂质残留引起的免疫问题等。
发明内容
本申请发明人发现，现有慢病毒生产工艺依次包括收获、澄清、浓缩、洗滤、消化、进一步纯化，步骤繁琐，操作时间过长，容易导致慢病毒失活。如果为了避免失活而在低温下进行全部操作，则消化步骤中核酸酶活性降低，因而消化效果降低，只能通过延长消化时间或增加酶量的方式进行补偿，但这种方式在增加生产成本的同时还会对慢病毒活性和颗粒数造成损害。另一方面，如果选择在更适合核酸酶消化的37℃进行消化，则需要使病毒经历降温、升温、降温的三次温度升降转换，这样也会降低慢病毒的活性和颗粒数。且现有技术中层析压力较大，增加层析步骤会减少病毒回收，减少层析步骤会导致慢病毒质量不合格。
有鉴于此，本发明的目的是提供一种新的慢病毒纯化工艺，与现有工艺相比，本发明将慢病毒消化工艺与慢病毒上游生产工艺结合，在慢病毒收获的温度37℃下直接加入核酸酶进行消化，在保证核酸酶活性的同时，还减少了整个操作过程中的温度转换次数；并且，由于消化的提前，只需要一次洗滤就能够去除核酸酶及消化后的核酸片段，缩短了工艺步骤和工艺时间，进一步提高了慢病毒滴度的回收。
基于上述目的，本发明提供了一种慢病毒纯化工艺，其包括以下步骤：
（1）在慢病毒收获前，加入核酸酶进行消化，得到细胞培养液；
（2）对细胞培养液进行澄清，得到澄清液；
（3）对澄清液进行浓缩，得到浓缩液；
（4）对浓缩液进行洗滤，得到纯化的慢病毒。
在本发明的优选的实施方案中，在慢病毒收获前0.2-6 h、优选0.2-4 h、更优选0.5-2 h时，加入核酸酶。如果距离收获前的时间太短，则反应不充分，导致核酸残留；如果距离收获前的时间过长，核酸酶可能会过度反应，影响慢病毒的活性和滴度。
在本发明的优选的实施方案中，加入核酸酶至5-200 U/mL、优选至5-150 U/mL、更优选至10-100 U/mL。
在本发明的优选的实施方案中，在步骤（1）的消化处理中，为了提高核酸酶的活性，还加入Mg2+或Mn2+至0.5-20 mM、优选至0.5-15 mM、更优选至1-10 mM。
Mg2+的提供物质优选为MgCl2或MgSO4，Mn2+的提供物质优选为MnCl2或MnSO4。
在本发明的优选的实施方案中，所述步骤（2）-（4）在大于0℃至室温的温度范围进行，优选在4℃至室温的温度范围进行，更优选在室温或4℃进行。
在本发明的优选的实施方案中，所述步骤（3）中，采用100 KD-750 KD膜包或中空纤维对澄清液进行浓缩。
在本发明的优选的实施方案中，所述步骤（4）中，采用100 KD-750 KD膜包或中空纤维对浓缩液进行洗滤。
在本发明的优选的实施方案中，所述步骤（3）中，浓缩至澄清液的1/10-1/5倍体积。
在本发明的优选的实施方案中，所述步骤（4）中，洗滤的倍数为10-20倍。
在本发明的优选的实施方案中，所述步骤（2）中，采用过滤和/或离心的方式对细胞培养液进行澄清。
具体实施方式
以下实施例中采用的试剂耗材和仪器设备如非特别说明，均为本领域常规选择；未注明具体条件的实验方法，均为本领域的常规方法。常规选择和方法包括但不限于相关文献、书籍中报道或厂家推荐的条件和方法。
以下的实施例中所用核酸酶为默克（Merck）所售的核酸酶Benzonase，加入的MgCl2为市售的Sigma的MgCl2.6H2O配制的200 mM MgCl2溶液，“室温”指的是（25±2）℃。
实施例1
（1）在慢病毒收获前2 h时，加入核酸酶至20 U/mL、加入MgCl2至2 mM。
（2）室温条件下，采用0.45 μm滤器对细胞培养液进行过滤澄清，去除细胞、细胞碎片及部分杂质。
（3）室温条件下，采用100 KD膜包对澄清液进行浓缩，浓缩至澄清液的1/7倍体积。
（4）室温条件下，采用100 KD膜包进行洗滤，洗滤倍数为10倍。
（5）取步骤（1）消化前后和（2）-（4）各步骤之后的样品用慢病毒感染细胞法进行慢病毒滴度（TU）检测；取步骤（4）之后的样品用PicoGreen的方法检测核酸残留、用qPCR（实时荧光定量核酸扩增检测系统）的方法检测核酸酶残留，检测结果见表1和表2。
实施例2
（1）在慢病毒收获前1.5 h时，加入核酸酶至20 U/mL、加入MgCl2至2 mM。
（2）室温条件下，采用0.45 μm滤器对细胞培养液进行过滤澄清，去除细胞、细胞碎片及部分杂质。
（3）室温条件下，采用100 KD膜包对澄清液进行浓缩，浓缩至澄清液的1/7倍体积。
（4）室温条件下，采用100 KD膜包进行洗滤，洗滤倍数为10倍。
（5）取步骤（1）消化前后和（2）-（4）各步骤之后的样品用慢病毒感染细胞法进行慢病毒滴度（TU）检测；取步骤（4）之后的样品用PicoGreen的方法检测核酸残留、用qPCR（实时荧光定量核酸扩增检测系统）的方法检测核酸酶残留，检测结果见表1和表2。
实施例3
（1）在慢病毒收获前0.5 h时，加入核酸酶至20 U/mL、加入MgCl2至2 mM。
（2）室温条件下，采用0.45 μm滤器对细胞培养液进行过滤澄清，去除细胞、细胞碎片及部分杂质。
（3）室温条件下，采用100 KD膜包对澄清液进行浓缩，浓缩至澄清液的1/7倍体积。
（4）室温条件下，采用100 KD膜包进行洗滤，洗滤倍数为10倍。
（5）取步骤（1）消化前后和（2）-（4）各步骤之后的样品用慢病毒感染细胞法进行慢病毒滴度（TU）检测；取步骤（4）之后的样品用PicoGreen的方法检测核酸残留、用qPCR（实时荧光定量核酸扩增检测系统）的方法检测核酸酶残留，检测结果见表1和表2。
实施例4
（1）在慢病毒收获前0.5 h时，加入核酸酶至40 U/mL、加入MgCl2至2 mM。
（2）4℃条件下，采用3000 g，离心10 min，对细胞培养液进行澄清，去除细胞、细胞碎片及部分杂质。
（3）室温条件下，采用100 KD膜包对澄清液进行浓缩，浓缩至澄清液的1/7倍体积。
（4）室温条件下，采用100 KD膜包进行洗滤，洗滤倍数为10倍。
（5）取步骤（1）消化前后和（2）-（4）各步骤之后样品用慢病毒感染细胞法进行慢病毒滴度（TU）检测；取步骤（4）之后的样品用PicoGreen的方法检测核酸残留、用qPCR（实时荧光定量核酸扩增检测系统）的方法检测核酸酶残留，检测结果见表1和表2。
实施例5
（1）在慢病毒收获前2 h时，加入核酸酶至20 U/mL、加入MgCl2至2 mM。
（2）室温条件下，采用0.45 μm滤器对细胞培养液进行过滤澄清，去除细胞、细胞碎片及部分杂质。
（3）室温条件下，采用750 KD中空纤维对澄清液进行浓缩，浓缩至澄清液的1/7倍体积。
（4）室温条件下，采用750 KD中空纤维进行洗滤，洗滤倍数为10倍。
（5）取步骤（1）消化前后和（2）-（4）各步骤之后样品用慢病毒感染细胞法进行慢病毒滴度（TU）检测；取步骤（4）之后的样品用PicoGreen的方法检测核酸残留、用qPCR（实时荧光定量核酸扩增检测系统）的方法检测核酸酶残留，检测结果见表1和表2。
表1 核酸和核酸酶残留
实施例 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
核酸残留（ng/107TU） 3.13 19.56 6.85 21.59 10.38
核酸酶残留（ng/mL） ＜0.2 ＜0.2 ＜0.2 ＜0.2 0.42
注：检测限为0.2。
表2 慢病毒滴度（TU）回收
由上可知，通过本发明提供的新的慢病毒纯化工艺，通过在收获前直接在收获温度37℃下加入核酸酶进行消化，不仅缩短了工艺步骤和工艺时间，还减少了整个纯化过程中的高低温转化次数，更好地控制了病毒失活，进而大幅提高了慢病毒滴度的回收率。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种慢病毒纯化工艺，其包括以下步骤：
(1)在慢病毒收获前0.5-2h时，加入核酸酶进行消化，得到细胞培养液；
(2)对细胞培养液进行澄清，得到澄清液；
(3)对澄清液进行浓缩，得到浓缩液；
(4)对浓缩液进行洗滤，得到纯化的慢病毒。
2.根据权利要求1所述的慢病毒纯化工艺，其中，加入核酸酶至10-100U/mL。
3.根据权利要求1所述的慢病毒纯化工艺，其中，在步骤(1)的消化中，还加入Mg2+或Mn2+至1-10mM。
4.根据权利要求3所述的慢病毒纯化工艺，其中，Mg2+的提供物质为MgCl2或MgSO4，Mn2+的提供物质为MnCl2或MnSO4。
5.根据权利要求1所述的慢病毒纯化工艺，其中，所述步骤(2)-(4)在大于0℃至室温的温度下进行。
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