CN114966041A - 精确定量检测生物医药制品中残留大肠杆菌宿主细胞蛋白的方法及elisa检测试剂盒 - Google Patents

精确定量检测生物医药制品中残留大肠杆菌宿主细胞蛋白的方法及elisa检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种精确定量检测生物医药制品中残留大肠杆菌宿主细胞蛋白的方法，其步骤包括：选取目标大肠杆菌宿主菌，进行培养表达，获取大肠杆菌宿主细胞蛋白；用大肠杆菌宿主细胞蛋白免疫动物，获得抗大肠杆菌宿主细胞蛋白多克隆抗体；利用准确的覆盖率检测方法对纯化后的抗大肠杆菌宿主细胞蛋白多克隆抗体进检测；选择其中覆盖率最高的多克隆抗体，采用ELISA法检测样本中残留的大肠杆菌宿主细胞蛋白。还公开了相应的ELISA检测试剂盒。本发明利用含有高覆盖率的大肠杆菌HCP抗体的ELISA试剂盒来定量检测生物医药制品中残留的大肠杆菌HCP蛋白，检测结果可信度高，效率高，能够同时对多个样本进行检测，检测灵敏度高。

Description

精确定量检测生物医药制品中残留大肠杆菌宿主细胞蛋白的 方法及ELISA检测试剂盒
技术领域
本发明专利涉及一种精确定量检测生物医药制品中残留大肠杆菌宿主细胞蛋白的方法及 ELISA检测试剂盒。
背景技术
大肠杆菌是最早用于重组蛋白表达的宿主菌，大肠杆菌表达系统较其它表达系统具有多种优势，其在生物制品产业化应用价值如下：1)结构简单，生理生化和遗传背景知识，尤其是对基因表达调控机制有清楚的了解；2)易于大规模培养，培养周期短，成本低廉；3)抗污染能力强；4)经过一系列遗传改造，已发展为一种安全的基因工程实验系统，拥有了各种不同的菌株和载体系统；目前为止，大肠杆菌在蛋白质表达领域仍被认为是主要的工具。
大肠杆菌中重组表达是一种相对简单和经济有效的生产某些蛋白质和DNA的方法。这些产品中有许多是用于人类和动物的治疗剂，因此，必须高度提纯。这些产品的制造和纯化过程中，存在来自大肠杆菌宿主细胞蛋白(HCP)杂质的可能性。这些杂质会降低治疗药物的疗效，并导致不良的毒性或免疫反应，因此需要将HCP杂质降至最低水平。
HCP又称宿主细胞蛋白，是生物制品的关键质量属性，影响着生物制品的质量、安全性与有效性。夹心法ELISA检测试剂盒是检测HCP残留的金标准。然而，这种方法高度依赖于试剂盒中HCP抗体对于总宿主细胞蛋白的覆盖率。若ELISA检测中使用的抗体覆盖率不足，可能在最终产品中漏检某些残留的HCP，进而可能在用药患者中引起免疫反应和其他药物安全性问题。美国药典UPS 1132对HCP抗体覆盖率检测提出了新的要求，建议使用 2D-SDS-PAGE/Western或DIGE方案对ELISA检测试剂盒中HCP抗体进行覆盖率验证。
本试剂盒采用微量滴度板免疫酶联免疫测定(ELISA)方法。该方法使用的抗体是经过 DIGE法检测过的高覆盖率抗体，平台特异性的HCP抗体覆盖率越高，对HCP的定量越准确，因此，本发明是针对大肠杆菌宿主细胞蛋白(HCP)残留进行更加精确的快速评估。发明内容
本发明的目的是提供一种精确定量检测生物医药制品中残留大肠杆菌宿主细胞蛋白的方法。
一种精确定量检测生物医药制品中残留大肠杆菌宿主细胞蛋白的方法，其特征在于其步骤包括：
(1)选取目标大肠杆菌宿主菌，进行培养表达，获取大肠杆菌宿主细胞蛋白；
(2)用大肠杆菌宿主细胞蛋白免疫动物，获得抗大肠杆菌宿主细胞蛋白多克隆抗体；
(3)利用准确的覆盖率检测方法对纯化后的抗大肠杆菌宿主细胞蛋白多克隆抗体进检测；
(4)选择其中覆盖率最高的多克隆抗体，采用ELISA法检测样本中残留的大肠杆菌宿主细胞蛋白。
优选的，步骤(1)中所述的目标大肠杆菌宿主菌为ATCC35218和/或ATCC25922。
优选的，步骤(2)中的动物选择家兔。
优选的，步骤(2)中免疫次数为5次，分别为在第0、14、28、42、56天进行，其中最后一次免疫为冲击免疫。
优选的，步骤(3)中的检测方法为蛋白质荧光差异双向电泳法
本发明还公开了一种精确定量检测生物医药制品中残留大肠杆菌宿主细胞蛋白的ELISA 检测试剂盒，其特征在于含有上述筛选出的抗大肠杆菌宿主细胞蛋白多克隆抗体。
优选的，所述试剂盒包括：
包被有上述筛选出的抗大肠杆菌宿主细胞蛋白多克隆抗体的ELISA微孔板；
上述步骤(1)得到的大肠杆菌宿主菌蛋白抗原液；
生物素标记的上述筛选出的抗大肠杆菌宿主细胞蛋白多克隆抗体；
标记物HRP偶联链霉素；
ELISA洗液浓缩液；
ELISA稀释液；
ELISA显色底物TMB；
终止液。
本发明利用含有高覆盖率的大肠杆菌HCP抗体的ELISA试剂盒来定量检测生物医药制品中残留的大肠杆菌HCP蛋白，检测结果可信度高，效率高，能够同时对多个样本进行检测，检测灵敏度高。
附图说明
图1.大肠杆菌全蛋白2D DIGE技术凝胶图。
图2.用Cy3标记的大肠杆菌宿主细胞全蛋白DIGE凝胶图。
图3.Cy5检测抗大肠杆菌HCP抗体(A组-2)DIBE凝胶图。
图4.Cy5检测抗大肠杆菌HCP抗体(B组-1)DIBE凝胶图。
图5.本发明检测试剂盒的大肠杆菌全蛋白标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例及对比例对本发明作进一步详细、完整地说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。
以下实施例的实验中所用到的动物、仪器设备、试剂及其配制等均来自市售。
大肠杆菌菌株：ATCC35218、ATCC25922
LB培养基：自配，1％蛋白胨、0.5％酵母粉、0.5％NaCl。
高压均质机：ATS AH-1500
高速冷冻离心机：Thermo Heraeus Mutifuge X1R
弗氏完全佐剂：Sigma公司
弗氏不完全佐剂：Sigma公司
亲和层析Protein G介质：SEPLIFE公司
IEF等电聚焦电泳仪；Cytiva EttanTM IPGphorTM 3
多功能激光成像仪：Cytiva Amersham Typhoon
本发明中所使用的其它生物试剂和化学试剂，如无特别说明，均为分析纯或分析纯以上级别。
实施例1兔抗大肠杆菌宿主菌全蛋白抗体的制备
1.大肠杆菌宿主菌全蛋白的制备
将上述两种菌株分别接种至LB培养基，37℃培养，2-3小时后检测OD600到达诱导条件后， IPTG诱导基因表达，表达2-3小时后，10000rpm离心15min收集菌体。上述菌体培养诱导过程完全模拟含有外源基因的大肠杆菌工程菌株生产时的培养诱导条件。
将上述培养获得菌株的菌体各取30g混合，以提高试剂盒的广适性，加入4℃预冷的0.01M PBS缓冲溶液(PH：7.4)500mL，于磁力搅拌器上搅拌至完全混匀。采用高压均质机(ATS AH-1500)高压破碎以上菌体混悬液，调节均质阀，控制破菌压力为1000bar。重复以上高压破碎过程3-4遍。高速冷冻离心机(Thermo Heraeus Mutifuge X1R)离心澄清破菌液，设定条件10000rpm，20min，8℃，离心分离，收集离心后的上清液。用0.01M PBS缓冲溶液将上清液稀释至蛋白浓度1mg/mL，用0.22um滤膜过滤除菌，分装后-80℃保存；制得大肠杆菌宿主菌全蛋白。
2.动物免疫程序
取4只兔进行动物免疫，分别进行5次免疫，采用抗原与佐剂等体积混合，乳化采用注射器混合法：将等量的弗氏佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内，两注射器之间以一细胶管相连，注意排净空气，然后交替推动针管，直至形成粘稠的乳剂为止，即为乳化充分。乳化充分后，免疫动物。初免采用弗氏完全佐剂，随后的免疫都采用弗氏不完全佐剂。免疫剂量为A组2只(0.4mg/兔子)，B组2只(0.8mg/兔子)采用背部皮下多点注射。
具体免疫程序为：初免(0天，弗氏完全佐剂)，抗原为大肠杆菌宿主菌全蛋白；二免至五免(14/28/42天，弗氏不完全佐剂)，抗原为大肠杆菌宿主菌全蛋白；三免之后，每只兔子都需要进行效价检测，实时监控血清效价；
表1免疫兔终血清效价
Figure BDA0003594481040000041
五免(56天，对倍体积生理盐水冲击免疫)，抗原为大肠杆菌宿主菌全蛋白。59天处死、采血，血清纯化，具体步骤为将血清加0.01M PBS缓冲溶液(PH：7.4)稀释十倍，过亲和层析柱Protein G，用0.1M pH2.8的甘氨酸缓冲液洗脱获得。后分别得到不同免疫量的兔子抗大肠杆菌宿主蛋白多克隆抗体。
表2纯化后获得抗体蛋白含量
Figure BDA0003594481040000042
实施例2抗大肠杆菌宿主菌蛋白抗体效价测定
采用ELISA法检测抗体效价，具体为：
包被：采用包被液(0.01M PBS缓冲液，pH7.4)将大肠杆菌宿主菌全蛋白稀释至5ug/mL， 100ul/孔，37℃包被2h。除去包被液，用PBS溶液洗涤3次。
封闭：每孔加入0.3mL封闭液(5％脱脂奶粉+PBS)于37℃保温2小时；再除去封闭液，PBS溶液洗涤三次。
加样：将上述纯化获得的兔抗大肠杆菌宿主蛋白抗体分别稀释至1mg/mL，再依次梯度10 倍稀释，稀释缓冲液为0.1M PBS。每孔加入100uL，于37℃保温1小时，除去抗体溶液， PBS溶液洗涤3次。
比色及结果计算：然后向每孔加入用稀释缓冲液以1：5000稀释的酶标二抗(HRP标记的羊抗兔)100ul，37℃保温0.5小时后除去酶标液，PBS溶液洗涤3次。然后向每孔中加入100ul TMB显色液，室温避光作用15分钟后加2M H2SO4 0.05mL终止液终止反应，并用酶标比色仪测定OD450值，并计算抗体效价，抗体效价值如表3所示。
表3动物抗体效价值
Figure BDA0003594481040000051
实施例3抗大肠杆菌宿主菌全蛋白抗体覆盖率的检测
3.1第一向等电聚焦
1)从-20℃冰箱取出2条13cm胶条，放置IPG泡胀盘，室温平衡20min。
2)将大肠杆菌HCP样品处理，先转移至5KDa超滤管,12000rpm离心30min/次，离心三次，每次离心结束后用水化液补足，使用超微量分光光度计，280nm初步定量。
3)计算样本蛋白的上样体积，移至1.5ml离心管，利用1M NaOH,冰上调节蛋白溶液PH 为8.5左右，13cm胶条用4ul 0.1nM染料标记，涡旋离心，冰上避光孵育30min,然后用1ul,10mmol/L赖氨酸，涡旋瞬离，冰上15min,终止标记，然后按照13cm胶条的优化上样量用水化液补至250ul，用枪将混合好的溶液小心加入胶条槽中。
4)用镊子夹住IPG胶条碱性端将胶条的保护膜撕下，胶面朝下，先将IPG胶条酸性端朝胶条槽的尖端(正极)方向放入胶条槽中慢慢下压胶条，避免产生气泡，最后放下IPG胶条碱性端，使水化液浸湿整个胶条，放置过夜(胶条标记+为酸性端，标记—为碱性端)。
5)将等电聚焦电泳仪(IPGphor3)先调整水平，将陶瓷的聚焦槽放在等电聚焦电泳仪上，将胶条转移到聚焦槽中胶面朝上，并确定胶条位于胶条槽中央，胶条酸性端放在等电聚焦电泳仪正极，胶条碱性端放在等电聚焦电泳仪负极，将湿的电极滤纸片(用100ulddH2O润湿) 放在胶条的两端(大致滤纸片的三分之一放在胶面上)。
6)将电极夹放在胶条的两端，使电极夹的电极丝压在两个电极滤纸片的外缘约1/3处，旋转凸轮至Manifold胶条外缘下的位置，将电极安装入位，每根胶条上面覆盖足够的矿物油。
7)设置聚焦仪器13cm胶条的程序，设置如下表4：
表4聚焦程序(2gels)
Figure BDA0003594481040000052
8)聚焦开始后配置SDS-PAGE大胶，待跑第二向SDS-PAGE电泳。
3.2第二向SDS-PAGE电泳
1)根据cytiva垂直电泳系统玻璃板安装说明进行安装玻璃板。
2)制备分离胶(12.5％)，将分离胶混匀后立即灌注于玻板间隙中，上层小心覆盖一层 ddH2O，将胶板垂直放于室温下，待分离胶聚合完全后，倾去上铺ddH2O，用滤纸吸干。
3)聚焦结束将胶条用双蒸水清洗三次，用镊子夹着胶条立着控一下水，将胶条放在胶条槽中加入已加DTT的5ml/1根胶条平衡液，在摇床上摇15min，弃掉加DTT的平衡液，再加入已加入碘代乙酰胺的5ml/1根胶条平衡液，在摇床上摇16min,弃掉平衡液。(5ml平衡液母液加DTT 0.05g，5ml平衡液母液加碘代乙酰胺0.125g)
4)将平衡好的胶条从含碘代乙酰胺平衡液中取出，在滤纸上滴净平衡液，用1X电泳缓冲液冲洗一下。
5)用镊子夹住胶条两端，垂直放于三明治板中间，凝胶之上，此时支撑面应与玻璃板紧密结合。
6)将三明治玻璃板竖直放置在架子上，用注射器针头，将胶条沿着玻璃板向下推，直至与胶面紧密接触(针头用力位置在胶条的支撑面，不能接触到胶面，以免划伤胶面)，剪一小块滤纸片置于胶条+极旁边并加10μl Marker。
7)用1ml移液器将配制好的低熔点琼脂糖沿一端加入三明治胶中，低熔点琼脂糖溶液将沿着胶面向另一端移动，排除胶条与SDS-PAGE凝胶胶面之间的气泡。
8)在低熔点琼脂糖未凝固时，用针头将胶条向下推，直至与SDS-PAGE胶面紧密接触并排除气泡。
9)带低熔点琼脂糖凝固后，然后将胶板固定于电泳装置上，上下槽各加入电泳缓冲液。设置程序：10w-30min(10w每胶条)，20w-5h(20w每胶条)，开始电泳直至溴酚蓝达到胶底部，关闭电源。
10)电泳完成后拨出凝胶，两块凝胶通过双模式多光谱激光成像系统(CytivaAmersham Typhoon)检查二维电泳跑胶情况(图1)；
3.3Western Blot实验，分析大肠杆菌宿主菌全蛋白抗体的覆盖率
3.3.1western blot实验步骤如下：
1)电泳完成后小心拔出凝胶，放入已经配置好的转移液中。分别裁剪与凝胶大小一致的滤纸和PVDF膜，并放置于转移液中,PVDF膜使用前需要通过甲醇激活5s。
2)打开湿转转印仪盖，按照滤纸-膜-凝胶-滤纸的顺序，从下到上放置，消除气泡放上盖子，100V恒压转印3h。
3)取出膜在PBST中洗涤1次，在5％的脱脂奶粉(用PBST配制)中封闭1h后，使用1％脱脂奶粉(用PBST配置)稀释1：1000的兔抗大肠杆菌HCP抗体并敷上，4度孵育过夜。兔抗大肠杆菌HCP抗体来源为A组-2，B组-1，效价较高的实验兔血清。
4)次日从4℃冰箱取出膜，摇床上温育1h后倒掉一抗，在PBST中洗涤3次，每次5min。
5)使用PBST以1:4000稀释荧光二抗，并在室温避光孵育1h。
6)取出膜在PBST中避光洗涤3次，每次5min。
7)使用双模式多光谱激光成像系统(Cytiva Amersham Typhoon)在仪器上扫描PVDF膜，并拍照保存(图2-4)。
8)结果通过Melanie 9分析评估抗体的覆盖率，选择出覆盖率最高的兔抗大肠杆菌宿主细胞抗体。表7为两组抗体覆盖率数据，根据覆盖率结果选择B组-1抗体进行后续实验。
表7两组抗体覆盖率
抗体 13cm凝胶总蛋白数 覆盖率
A组-2 584 88％
B组-1 658 90％
实施例4抗大肠杆菌宿主细胞抗体标记生物素
1.取2mg抗大肠杆菌宿主细胞抗体，已经溶解在pH 7.4的0.01M PBS缓冲液中。(Tris 或其他含胺缓冲液中的蛋白质必须转换成合适的缓冲液)
2.生物素试剂溶液配制:将2.0mg NHS-Biotin试剂溶解在590μl二甲基亚砜(DMSO) 的溶剂中。
3.在蛋白溶液中加入适量的10mm生物素试剂溶液。
4.在室温下孵育30分钟。
5.蛋白质标记已经完成，之后通过透析纯化所标记的蛋白质以获得最佳的性能和稳定性，可以通过ELISA对标记的蛋白质进行初步测试确定了蛋白质的适当功能和标记；
5.ELISA对标记的蛋白质进行初步测试步骤如下
6.包被：用包被液(0.05MNaHCO3，pH9.6)将兔抗大肠杆菌宿主细胞抗体稀释至5ug/mL、 4ug/ml、3ug/ml、2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml，100ul/孔,各两列微孔反应板，4℃包被过夜。除去包被液，用PBS溶液洗涤3次。
7.封闭：每孔加入0.3mL封闭液(5％BSA+PBS)于37℃保温2小时。除去包被液，PBS溶液洗涤3次。
8.加样：将上述获得的大肠杆菌宿主细胞全蛋白样品稀释至50ng/mL，稀释缓冲液为含 2％BSA的PBS，一列各孔加入100ul稀释样品，另一列单加稀释缓冲液的孔作为阴性对照。于37℃保温1小时，除去抗体溶液，PBS溶液洗涤两次。
9.生物素标记抗大肠杆菌宿主细胞抗体加样：将生物素标记抗体稀释至8ug/ml、4ug/ml、 2ug/ml、1ug/ml,100ul/孔，37℃保温0.5小时后除去生物素标记抗体，PBST溶液洗涤3 次。
10.标记物HRP偶联链霉素(RD的Human Serum Albumin试剂盒中Streptavidin-HRP，DY1455) 加样：每孔加入用稀释缓冲液以1：5000稀释的HRP偶联的抗生物素的蛋白100ul，37℃保温0.5小时后除去酶标液，PBS溶液洗涤3次。
11.比色及结果计算：每孔中加入100ul TMB显色液，室温避光作用15分钟后加2MH2SO4 0.05mL终止液终止反应，并用酶标比色仪测定OD450值。表8为整理的检测数值，根据检测数据确定包被抗体浓度2.5ug/ml以及生物素标记的抗体的最适浓度2ug/ml。
表8大肠杆菌HCP ELISA试剂盒包被浓度及检测抗体浓度摸索结果
Figure BDA0003594481040000081
实施例5双抗体夹心法测定大肠杆菌宿主蛋白含量范围
根据上步所确定的包被抗体和检测抗体的工作浓度，本实验在保持包被抗体浓度和检测抗体浓度不变的前提下，设置不同浓度的标准品梯度，并通过双抗夹心ELISA法检测反应值，以确定最佳的标准品浓度梯度，实验结果如表9所示。本次实验每一个标准品浓度设置 3个复孔，表中OD为平均值,具体实验步骤如下：
包被：用包被液(0.05MNaHCO3，pH9.6)将兔抗大肠杆菌宿主细胞抗体稀释至2.5ug/ml， 100ul/孔,4℃包被过夜。除去包被液，用PBST溶液洗涤3次。
封闭：每孔加入0.3mL封闭液(5％BSA+PBS)于37℃保温2小时。除去包被液，PBS 溶液洗涤3次。
标准品加样：将上述获得的大肠杆菌宿主细胞全蛋白样品稀释至100ng/mL、50ng/mL、 12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.5ng/mL、0.75ng/mL、0.375ng/mL，稀释缓冲液为含 2％BSA的PBS，各孔加入100ul稀释样品，单加稀释缓冲液的孔作为阴性对照。于37℃保温1小时，除去抗体溶液，PBS溶液洗涤两次。
生物素标记抗大肠杆菌宿主细胞抗体加样：每孔加入实施例4中的最适浓度的生物素标记抗体100ul,37℃保温0.5小时后除去生物素标记抗体，PBST溶液洗涤3次。
标记物HRP偶联链霉素加样：每孔加入用稀释缓冲液以1：5000稀释的HRP偶联的抗生物素的蛋白100ul，37℃保温0.5小时后除去酶标液，PBS溶液洗涤3次。
比色及结果计算：每孔中加入100ul TMB显色液，室温避光作用15分钟后加2MH2SO4 0.05mL终止液终止反应，并用酶标比色仪测定OD450值。表9为整理的检测数值，应用该方法检测大肠杆菌宿主蛋白的检测范围在100-0.78ng/mL。
表9
Figure BDA0003594481040000091
实施例6大肠杆菌HCP ELISA试剂盒标准曲线的相关性
根据前两步确定的包被抗体和检测抗体的工作浓度，以及他们所能检测的标准品浓度范围，在保持包被抗体浓度和检测抗体浓度不变的前提下，设置七个不同浓度的标准品梯度。每个浓度作一个平行样，以尽可能减少实验操作误差的干扰。采用实施例6所述试剂盒，按照实施例5所述的方法在同一块板条上ELISA检测检测反应值，并以此绘制标准曲线。标准品浓度及对应的反应值如表10所示。
表10大肠杆菌HCP标准曲线数据
Figure BDA0003594481040000101
由表数据，分析发现，数据具有明显的梯度，复孔之间差异很小，可以满足ELISA的实验需求。利用用线性拟合法绘制标准曲线，如图5所示。由图5可知，标准曲线R2为0.999，可信度较高。
以下对ELISA检测试剂盒的功能性分析作进一步的说明：
实施例7大肠杆菌HCP ELISA试剂盒回收率分析
以大肠杆菌HCP作为样本，利用0.01mol/L PBS稀释HCP，使其终浓度为30ng/ml。本次实验共重复三次，每次实验设置三个复孔。
采用实施例6所述试剂盒，按照实施例5所述的方法在同一块板条上ELISA检测，根据本试剂盒所获得的标准曲线和样本的OD计算样本浓度，并与起始浓度30ng/ml比较，计算回收率。回收率计算方法如下：
回收率＝样本计算浓度/样本实际浓度x100％。
ELISA检测后，根据本试剂盒所获得的标准曲线和样本的OD计算样本浓度和回收率结果如表11所示。本次实验共重复三次，表中OD为三次实验的平均值。
表11大肠杆菌HCP ELISA试剂盒回收率分析结果
平均OD 回算浓度(ng/ml) 回收率(％)
1.372 27.924 93％
1.427 29.406 98％
1.465 30.443 101％
回收实验结果表明，回收率在90％-105％之间，平均值为97.53％，回收率较高。说明本试剂盒具有很好的准确度。
实施例8大肠杆菌HCP ELISA试剂盒特异性分析
以纯化后的Vero、毕赤酵母和CHO的宿主细胞蛋白HCP作为检测样本，采用实施例6所述试剂盒，按照实施例5所述的方法在同一块板条上检测，以评估本试剂盒的特异性。本实验共重复三次。
分别取538ng/mL的CHO HCP、483ng/mL的vero HCP、414ng/mL的毕赤酵母HCP各200μL，每孔100μl,加到包被并封闭好的试剂盒孔内。每个样本做一个复孔，进行夹心法ELISA实验，检测各待测样本与试剂盒的交叉反应程度，结果如表12所示(表中所有 OD均为三次实验的平均值)。
表12大肠杆菌HCP ELISA试剂盒特异性分析
样本种类 平均OD 回算浓度(ng/ml) 交叉反应性(％)
Vero HCP 0.1925 0.3489 0.07
CHO HCP 0.1833 0.1583 0.03
Yeast HCP 0.1808 0.1066 0.03
实验结果表明Vero细胞、CHO细胞、毕赤酵母宿主细胞蛋白对ELISA反应的干扰程度非常小，与试剂盒之间基本无交叉反应。说明本试剂盒有很好的特异性，能特异性的与E.coli 宿主细胞蛋白反应，且不受上述细胞HCP的干扰。
实施例9.大肠杆菌HCP ELISA试剂盒精密度分析
采用实施例6所述试剂盒，按照实施例5所述的方法在同一块板条上检测50ng/ml标准品10孔的OD450，重复试验三次，计算批内变异系数(CV％),平均为5.26％。
Figure BDA0003594481040000111

Claims (7)

1.一种精确定量检测生物医药制品中残留大肠杆菌宿主细胞蛋白的方法，其特征在于其步骤包括：
(1)选取常用大肠杆菌宿主菌，进行培养表达，获取大肠杆菌宿主细胞蛋白；
(2)用大肠杆菌宿主细胞蛋白免疫动物，获得抗大肠杆菌宿主细胞蛋白多克隆抗体；
(3)利用准确的覆盖率检测方法对纯化后的抗大肠杆菌宿主细胞蛋白多克隆抗体进检测；
(4)选择其中覆盖率最高的多克隆抗体，采用ELISA法检测样本中残留的大肠杆菌宿主细胞蛋白。
2.根据权利要求1所述的精确定量检测生物医药制品中残留大肠杆菌宿主细胞蛋白的方法，其特征为：步骤(1)中所述的常用大肠杆菌宿主菌为ATCC35218和/或ATCC25922。
3.根据权利要求2所述的精确定量检测生物医药制品中残留大肠杆菌宿主细胞蛋白的方法，其特征为：步骤(2)中的动物选择家兔。
4.根据权利要求3所述的精确定量检测生物医药制品中残留大肠杆菌宿主细胞蛋白的方法，其特征在于：步骤(2)中免疫次数为5次，分别为在第0、14、28、42、56天进行，其中最后一次免疫为冲击免疫。
5.根据权利要求3所述的精确定量检测生物医药制品中残留大肠杆菌宿主细胞蛋白的方法，其特征在于：步骤(3)中的检测方法为蛋白质荧光差异双向电泳法。
6.一种精确定量检测生物医药制品中残留大肠杆菌宿主细胞蛋白的ELISA检测试剂盒，其特征在于含有权利要求1-5中任一项的方法筛选出的抗大肠杆菌宿主细胞蛋白多克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括：
包被有权利要求1-5中任一项的方法筛选出的抗大肠杆菌宿主细胞蛋白多克隆抗体的ELISA微孔板；
权利要求1-5中任一项的方法的步骤(1)获得的大肠杆菌宿主细胞蛋白；
生物素标记的权利要求1-5中任一项的方法筛选出的抗大肠杆菌宿主细胞蛋白多克隆抗体；
标记物HRP偶联链霉素；
ELISA洗液浓缩液；
ELISA稀释液；
ELISA显色底物TMB；
终止液。
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