WO2007114337A1 - 免疫凝集反応試薬キット及び抗原の測定方法 - Google Patents

免疫凝集反応試薬キット及び抗原の測定方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2007114337A1
WO2007114337A1 PCT/JP2007/057100 JP2007057100W WO2007114337A1 WO 2007114337 A1 WO2007114337 A1 WO 2007114337A1 JP 2007057100 W JP2007057100 W JP 2007057100W WO 2007114337 A1 WO2007114337 A1 WO 2007114337A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cdt
reagent
antigen
antibody
monoclonal antibody
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/057100
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tadashi Natsubayashi
Ikuo Terunuma
Akinori Takano
Original Assignee
Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., filed Critical Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.,
Priority to JP2008508654A priority Critical patent/JP5199067B2/ja
Priority to EP07740536A priority patent/EP2006685A1/en
Priority to US12/225,546 priority patent/US20090117668A1/en
Publication of WO2007114337A1 publication Critical patent/WO2007114337A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the reaction principle of the competition method may be used to provide the measurement reagent, the competition generally has poor reproducibility on the low concentration side and the high concentration side where the measurement range is narrow. It is not preferable as a reagent to measure with high accuracy.
  • CDT carbohydrate (carbohydrate) -deleted transferrin
  • the mouth of the mouth monosialo and dysarotransferrin are referred to as carbohydrate (carbohydrate) -deleted transferrin (abbreviation: CDT). It is being beaten.
  • CDT has been found to be an effective marker for detecting and monitoring alcohol consumption, particularly chronic alcohol consumption.
  • Patent Document 5 describes an antibody which is selectively bound to CDT in an aqueous solution and in which the CDT does not need to be bound to a solid phase.
  • This antibody is an antibody obtained by using recombinant non-glycated transferrin obtained by genetic recombination as an immunogen, or using as an unglycated transferrin as an immunogen a deglycosylation reaction with an enzyme. It is. That is, they are antibodies obtained by using artificially produced CDT as an immunogen.
  • CDT assay reagent currently marketed uses a polyclonal rabbit antibody in the column method, iron saturation to the sample and separation of the CDT by the column are necessary for CDT measurement. It was necessary and operation was complicated. In addition, CDT measurement by high performance liquid chromatography was not suitable for multi-sample processing, which takes a long time per sample.
  • the above-mentioned CDT measurement reagent is limited to an analyzer which can be applied because it is a dedicated reagent, and it is difficult to apply it to a general-purpose automatic analyzer.
  • Patent Document 1 Japanese Examined Patent Publication No. 3-40341
  • Patent Document 2 W096Z26444
  • Patent Document 3 W 95 95Z04932
  • Patent Document 4 W 93 93/06133
  • Patent Document 5 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-051633
  • Nonpatent literature 3 D. Kraul et al, Clinical Chemistry, vol. 51, No. 6 96 B-149 (2005) (Summary of the 2005 AACC Annual meeting)
  • the present inventors prepared native CDT and obtained multiple kinds of monoclonal anti-CDT antibodies that recognize the structure of the CDT. It was confirmed that the agglutination reaction did not work well when the conventional immunoagglutination reagent measurement method was applied. That is, each monoclonal anti-CDT antibody is sensitized to a separate carrier, and the sensitized carriers are mixed at an appropriate ratio and used as one immunoagglutination reaction reagent to perform an immunoagglutination reaction on the sample. Even when it is done, the agglutination reaction does not go well.
  • the present invention does not require pretreatment of the sample, which leads to a reduction in economic cost.
  • the method of measuring an antigen by an immunoagglutination reaction which can be measured by an automatic analyzer for measurement and aiming at the improvement of measurement accuracy and the expansion of a measurement range, and the problem of providing an immunoagglutination reagent kit used for the measurement method Do.
  • the present invention is used for an immunoagglutination reagent kit capable of measuring CDT amount by an efficient immunoagglutination reaction for CDT in a sample, and the immunoagglutination reagent kit. It is an object of the present invention to provide a monoclonal anti-CDT antibody, and a method of measuring CDT using the immunoagglutination reagent kit.
  • CDT artificially produced as an immunizing antigen is significantly different from natural CDT.
  • the tertiary structure of the protein is likely to be incomplete because it contains a disulfide bond, and in the case of enzymatic deglycosylation, modification treatment is required during preparation.
  • genetically modified products and deglycated products cause amino acid substitution.
  • affinity chromatography using a column to which an anti-transferrin antibody is bound is generally used.
  • this method after transferrin is bound to the anti-transferrin antibody in the column, there is a method for eluting and purifying CDT-containing transferrin by denaturing this antigen-antibody complex under acidic conditions. . While the C DT obtained by this method is denatured, it has a high possibility of becoming a leat, so it is preferable as an immunogen.
  • the present invention has made it possible to produce an antibody that does not react to CDT in body fluid, and to use naturally produced CDT as an immunogen with artificially produced CDT.
  • Anti-CDT antibody that selectively binds and is applicable to measurement using immunoagglutination Intended to provide.
  • the immunoagglutination reagent kit of the present invention for solving the above-mentioned problems is formed by sensitizing two types of monoclonal antibodies different in recognition mode to carrier particles divided according to the type of the antibody.
  • An immunoagglutination reagent comprising two kinds of carrier particles, wherein the two kinds of sensitized carrier particles are selected from specific ones that weaken the agglutination reaction when they are simultaneously reacted with a sample containing the target antigen.
  • the reaction sequence of carrier particles sensitized with different types of monoclonal antibodies is specified, the agglutination reaction is enhanced, and the two types of sensitized carrier particles are stored independently of each other. It is characterized by
  • the above-mentioned immunoagglutination reaction reagent kit is prepared, one type of reagent is reacted to a sample suspected of containing the antigen, and the other reaction solution is
  • the present invention is characterized in that aggregation is caused by reacting the following types of reagents, and the amount of change in aggregation is measured.
  • the monoclonal antibody used in the immune agglutination reagent kit of the present invention can be of mouse origin.
  • the kit of the present invention can use two or more different monoclonal antibodies of different epitope to be recognized regardless of animal species.
  • two or more types of monoclonal antibodies that recognize different epitope can be used S, and one reagent can be different in carrier particles or two or more types of monoclonal antibodies sensitized, or different in epitope.
  • Two types of monoclonal antibody power A mixture of two types of carrier particles sensitized to carrier particles divided according to the type of the antibody is used, and the other reagent is sensitive to another epitope monoclonal antibody. Those containing carrier particles produced may be used.
  • the method for measuring an antigen of the present invention is CDT.
  • a particularly preferred immunoagglutination reagent kit for use in the method of measuring CDT is the hybridoma NCDT 503 (accession date: March 14, 2006, accession number: FE RM P-20844) deposited at the Patent Organism Depositary (IPOD).
  • the method of measuring an antigen using the kit comprises: for a sample suspected of containing CDT, an anti-CDT mouse monoclonal antibody 1 produced by NO, ibidoma NCDT 503 (Accession number: FERM P-20844). After reacting a reagent containing sensitized carrier particles, the reaction solution is reacted with a reagent containing carrier particles sensitized with an anti-CDT mouse monoclonal antibody produced by hybridoma NCDT 077 (Accession number: FERM P-20843). It is characterized by causing aggregation and measuring the amount of change in aggregation.
  • the pH in the reaction solution is preferably 6.8 or more and 8.5 or less.
  • the method of measuring an antigen of the present invention can be performed by either an automatic analyzer or a method.
  • this reagent kit can be applied as long as it is an analyzer capable of three-reagent system analysis.
  • the 7070 and 7170 automatic analyzers manufactured by Hitachi are capable of analyzing three reagent systems.
  • a carrier that can be suitably used as a reagent constituting the immune agglutination reaction reagent kit of the present invention may be any insoluble carrier fine particle used for a conventional immune agglutination reaction reagent.
  • the latex particles are artificial carriers, and are particularly preferably used in view of the fact that the surface of the carrier can be chemically treated depending on the purpose and that nonspecific reaction hardly occurs.
  • various modified latexes, magnetic latexes and the like can be used as needed.
  • the particle size of the above carrier is also not particularly limited, but the occurrence of aggregation after antigen-antibody reaction is also possible. From the viewpoint of ease of determination of ease of aggregation and aggregation, the average particle size is preferably 0 ⁇ 05 ⁇ m or more and less than 1 ⁇ m, preferably 0. 1/1 111 or more and 0.5 / im or less, most preferably ⁇ In addition, it is preferable to use a carrier particle of less than 0 ⁇ 1 ⁇ ] ⁇ 0. 2 / im.
  • the amount of the carrier to be used may be appropriately determined according to the type of antibody or antigen, but from the viewpoint of the loading efficiency and operability, the concentration of the carrier particles in the solution at the time of measurement is not less than 0.20 mass%. 2 5 mass% or less, preferably 0.02 mass% or more and 0.17 mass% or less, most preferably 0.04 mass% or more and 0.13 mass% or less.
  • the concentration of the monoclonal antibody used in the present invention is not less than 0.03 mg ZmL and not more than 0.09 mg / mL, preferably not less than 0.03 mg / mL and not more than 07 mg ZmL and most preferably not less than 0.05 mg and not less than 0.5 mg ZmL. I assume.
  • the buffer used for the measurement may be any buffer having pH range of 6.8 other than Tris, such as 8.5, and BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPS ⁇ , H EPPSO, EPPS, Tricine, Bicine, TAPS, etc. can also be used.
  • a conventional antibody having different type of epitope to be recognized is sensitized to a separate carrier for each type, and an immunoagglutination reagent prepared by mixing the respective sensitized carriers in an appropriate ratio is used. Even if the immune agglutination reaction is carried out, the amount of latex aggregates is sufficient due to steric hindrance, etc. because the number of antigens in the antigen is small, the number of epitopes in the antigen is small, and different epitopes are close to each other.
  • the two sensitized carrier particles of the present invention are suspected of containing an antigen using a kit stored independently of each other, even if they do not form, and thus the desired absorbance can not be obtained. After reacting one type of reagent to the sample, it is possible to cause aggregation by reacting the other type of reagent with the reaction solution, and a large change in absorbance can be obtained. Measurement of antigens of It made.
  • FIG. 1 is a graph showing the elution profile of CDT fraction by anion exchange chromatography.
  • FIG. 2 A photograph of SDS-PAGE and isoelectric focusing of each fraction shown in the elution profile of FIG.
  • FIG. 3 is a graph showing a correlation test by sandwich ELISA combined with anti-transferrin polyclonal antibody.
  • FIG. 4 (i) When two latex reagents are mixed and used, when the latex reagent 1 is reacted at the mouth and then the latex reagent 2 is reacted, c) the latex reagent 2 is reacted. Then, it is a graph showing the relationship of the absorbance to the CDT concentration when the latex reagent 1 is reacted.
  • the antibody-producing hybridoma of the present invention was used for the hybridoma obtained in Example 2 above.
  • Ma selection was performed by sandwich ELISA.
  • 50 ⁇ l of each anti-mouse antibody prepared at 10 ⁇ g / mL with PBS was added per 1 well, and allowed to react overnight at 4 ° C. Thereafter, the plate was washed once with PBS, blocked with 0.5% BSA-PBS, and used as a screening plate.
  • the culture supernatant of the well in which the growth of the hybridoma was recognized 50 z L was added to the well and reacted at room temperature for 1 hour. Subsequently, after washing with a washing solution (0.
  • Example 1 05% Tween-PBS
  • the CDT fraction described in Example 1 is reacted at room temperature for 1 hour, and after washing, alkaline phosphatase-labeled anti-transferrin polyclonal antibody 50 z L And allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • the alkaline phosphatase-labeled anti-transferrin polyclonal antibody used was prepared by binding alkaline phosphatase (manufactured by Roche) to an anti-transferrin polyclonal antibody (manufactured by Shiba Goat Co., Ltd.) by the periodic acid method.
  • Example 3 Each hybridoma selected in Example 3 was cloned twice by the limiting dilution method to obtain an established strain.
  • the obtained hybridoma NCDT 077 is deposited at the International Patent Organism Depositary (IPOD) (Accession Date: March 14, 2006, Accession No .: FERM P-20843), and the hybridoma NCDT 503 is International Patent Organism Depositary (IPOD) (Accession date: March 14, 2006, Accession No .: FERM P-20844).
  • the established strains obtained in Example 4 above, and monoclonal antibody-producing hybridomas having antibody activity against the CDT fraction were grown in the peritoneal cavity of mice for mass production of monoclonal antibodies.
  • the monoclonal antibody in mouse ascites fluid thus obtained was purified by column chromatography using a protein G column (manufactured by GE).
  • the subclass of the monoclonal anti-C DT antibody produced by the hybridoma NCDT 077 obtained in Example 3 above was Isostrip (registered trademark, manufactured by Roche), and was used with IgG2a (/ c). Were determined. Similarly, the subclass of monoclonal anti-CDT antibody produced by hybridoma NCDT 503 was determined to be IgG1 (().
  • the monoclonal antibodies prepared in Example 5 above were used to confirm the specificity to the transferrin isoform prepared in Example 1 above.
  • the antibody prepared to 10 ⁇ g ZmL with PBS was added to a 96-well microplate each at 1 ⁇ l per well, and allowed to react at 4 ° C. overnight. Thereafter, the cells were washed once with PBS and blocked with 0.5% BSA-PBS. Thereafter, 50.times.L of transferrinase isoform prepared in Example 1 was added to the well and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • the hybridoma NCDT 077 producing antibody and the hybridoma NCDT 50 3 producing antibody specifically react with the natural CDT fractions (asialotransferrin and gyallotransferrin) in the solution. It did not react to Sharlotrans phosphorus.
  • Example 8 Compatibility test with sandwich ELISA combined with anti-transferrin polyclonal antibody
  • Example 5 The reactivity of each of the monoclonal antibodies prepared in Example 5 (novelidoma NCDT 077 producing antibody and hybridoma NCDT 503 producing antibody) was examined as follows. After binding peptides of the six amino acid sequences shown in P1 to P6 below to the ELISA plate Each antibody prepared to 10 ⁇ g / mL was reacted with 50 ⁇ L per well, and allowed to react at room temperature for 1 hour. Subsequently, after washing with a washing solution (0.
  • alkaline phosphatase-labeled anti-mouse IgG antibody Goat F (ab ') Anti-Mouse Ig's, Alkaline Phosphatase Conjugate AMI 4405: trade name, manufactured by BIOSOURCE 50 ⁇ L was added and allowed to react at room temperature for 1 hour. After washing again, the alkaline phosphatase activity was developed by the Kind- King method, and the absorbance at 490 nm was measured with a microplate reader.
  • each monoclonal antibody (no, ibridoma NCDT 077-producing antibody and hybridoma e NCDT 503-producing antibody) is different from P1-P6 (a peptide including the recognition site of the antibody of Patent Document 3 or Patent Document 4). I understand that I do not recognize.
  • the reactivity to the primary structure of the antigen protein was first confirmed as follows. That is, after CDT antigen was covalently linked to an ELISA plate (Immobilizeramino: trade name, manufactured by Nunc), it was adjusted to 10 z g ZmL in a gel which was denatured by 4 M urea, reduced by 0.1 M DTT. The prepared antibodies were added to each well at a volume of 50 z L and reacted at room temperature for 1 hour. Continued After washing with a washing solution (0.
  • the hybridoma NCDT 077 producing antibody and the hybridoma NCDT 50 3 producing antibody do not react to the primary structure in which the CDT antigen has been denatured and reduced.
  • these antibodies do not recognize the primary structure of the CDT antigen but recognize the three-dimensional structure.
  • a 10% latex solution with a particle size of 0 ⁇ 13 / im is aliquoted into a 1.5 mL centrifuge tube and diluted with 825 / i L of a sensitization buffer, and then diluted to 10 mg / mL.
  • 75 ⁇ L of Noclonal Antibody 1 (Hybridoma NCDT 503-producing antibody) was added, immediately mixed with stirring, and sensitization was performed by inverting and mixing for 2 hours in a cold place. After sensitization, 100 / i L of blocking buffer was added, and the mixture was subjected to 2 minutes of sonication to disperse the latex, and allowed to react at 37 ° C. for 1 hour to perform blocking.
  • Latex reagent 1 was prepared.
  • a latex reagent 2 sensitized with an anti-CDT mouse monoclonal antibody 2 (hybridoma NCDT 07-producing antibody) was prepared.
  • Hitachi 7 can measure with a reagent system consisting of the first reagent, the second reagent, and the third reagent.
  • Anti-CDT mouse monoclonal antibody 2 (hybrid NGDT 077 produced antibody) was prepared by the same sensitization method as in Example 11 above, to a particle size of 0.99 ⁇ 0.0.15 xm, 0.20 ⁇ m, Latex reagents of different particle sizes were prepared by sensitization to a latex of 0.43 ⁇ m / 0.46 ⁇ m.
  • the dilution factor of the reagent was the same as that in the case of the particle size of 0.13 / m in Example 11, and the same dilution factor was applied to other particle sizes.
  • the sample to be measured was a CDT solution diluted with saline, 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 mg / dL, and different prepared particle size latex reagents were used in the mouth of Example 12). It measured on condition of.
  • the measurement results are shown in FIG. 5 as a graph showing the relationship of absorbance to CDT concentration. According to FIG. 5, according to the particle diameter between 0.09 and 111, and 0.46 zm, the increase of the absorbance depending on the CDT concentration is confirmed, and it can be seen that the particle diameter range can be used.
  • the other in different buffers of ⁇ the first reagent prepared in Example 12 was prepared, conditions and [rho Eta and the absorbance in the reaction solution in the evaluation sample of Example 13 of the mouth of the actual ⁇ 12) It was measured.
  • the measurement results are shown in FIG. 8 as a graph showing the relationship of absorbance to CDT concentration. According to Fig. 8, the blank reaction is abnormal when ⁇ ⁇ 6.5 or less, and depending on the CDT concentration in the range of pH 6.8 to pH 8.5 where S S ⁇ 9. 6 did not obtain sufficient sensitivity for measurement. An increase in the existing absorbance is confirmed, and it can be understood that it can be used in this pH range.
  • Example 17 ⁇ I Fixed-Line Test Function
  • the absorbance of 20 consecutive measurements of saline was converted to the CDT concentration of a 5 mg / dL CDT solution, and the minimum detection limit was calculated from the average of 0 concentrations + 3 SD.
  • the results are shown in Table 5 and the simultaneous reproducibility when 10 samples of 4 concentrations are measured is shown in Table 6.
  • the measurement result of the antigen excess up to 120 mg / dL by the purified CDT fraction is the relationship of the absorbance to the CDT concentration.
  • the minimum detection limit calculated by this method is a numerical value sufficiently smaller than the CDT concentration contained in the assumed healthy human sample, and the simultaneous reproducibility, measurement range, etc. also have sufficient performance as a measurement reagent. It can be said.

Abstract

　エピトープの数が少ない場合や異なるエピトープが近接し立体障害等で抗体との反応効率が悪いときに、検体中の抗原を効率的に検体の前処理無しで直接測定できる方法を提供する。 　認識するエピトープが異なる二種類のモノクローナル抗体を一種類ずつ別々のラテックスに感作し、検体と一つのモノクローナル抗体感作ラテックス試薬を反応させた後、その反応液中にさらにもう一つのモノクローナル抗体感作ラテックス試薬を反応させることにより、抗原を検体前処理なしに、直接効率よく高感度に測定することができる。

Description

明 細 書
免疫凝集反応試薬キット及び抗原の測定方法
技術分野
[0001] 本発明は、認識するェピトープが異なる二種類のモノクローナル抗体を利用し、検 体中の目的とする抗原を簡単な操作で、感度よく測定することのできる免疫凝集反応 試薬キット、及び抗原の測定方法に関する。
背景技術
[0002] 抗原抗体反応を利用する免疫測定法は、各種内分泌疾患の臨床診断等において 極めて重要であり、従来種々の免疫測定法が知られている。
[0003] その中でも、抗体を感作させた担体からなる免疫凝集反応試薬を用いた検体中の 抗原の測定方法として、被検物質中の抗原と該免疫凝集反応試薬を反応させ、この 抗原 抗体反応により生成した凝集塊について、該試薬添加後の吸光度変化量とし て測定し、同様に操作した既知濃度の標準血清の吸光度変化量と比較して目的の 抗原濃度を求める測定方法が知られている。
[0004] 抗体をラテックス等の担体に感作する場合、それぞれの抗体を別々の担体に感作 し、この感作したそれぞれの担体を適当な割合で混合し一つの免疫凝集反応試薬と していた (特許文献 1：特公平 3— 40341号公報)。
[0005] しかし、前記の混合した免疫凝集反応試薬では、抗原中においてェピトープの数 が少ない場合や、抗原中に異なるェピトープが近接しているため立体障害等で抗体 との反応効率が悪い場合は、十分量のラテックス凝集塊を生成せず、そのため目的 とする吸光度が得られず再現性が悪く精度よく測定できない場合があった。
[0006] このような場合、競合法の反応原理を利用し測定試薬を提供する場合があるが、競 合法は一般的に測定範囲が狭ぐ低濃度側及び高濃度側での再現性が悪く精度よ く測定する試薬として好ましくはない。
[0007] 一方、アルコール中毒患者を同定するための方法として、炭水化物 (糖鎖）欠失トラ ンスフヱリン（略語： CDT)を測定する方法が注目されている。ァシァ口、モノシァロ及 びジシァロトランスフェリンは、炭水化物（糖鎖)欠失トランスフェリン（略語: CDT)と呼 ばれている。 CDTは、アルコール消費、特に慢性アルコール消費を検出およびモニ ターするための有効なマーカーであることが見出されている。
[0008] CDTの免疫学的検査法として W096/26444 (特許文献 2)および Heil et al, An aesthesist, 43, 447-453, (1994) (非特許文献 1)等が報告されている。これらの手法 では、希釈血清サンプルをァニオン性イオン交換樹脂に通し、正常なトランスフェリン イソ型を樹脂に保持させる一方、 CDT分画の通過を可能にしている。この溶出液の CDT含量は、免疫比濁法（immunoturbidimetric assay)等によって測定される。その 他、高速液体クロマト法により CDTを定量する方法も WO95Z04932 (特許文献 3) により知られている。
[0009] 前記アルコール中毒患者の従来の検查手法の全ては、イオン交換樹脂或いは高 速液体クロマト法を適用する等比較的複雑な手順に基づくものであった。
[0010] 一方、 Makhloufらは、 CDTのみを直接測定するために、 CDTに対するモノクロ一 ナル抗体の作製を試みた。彼らは、トランスフェリンの糖鎖が結合している 413番目と 611番目のァスパラギンを中心として前後 6個のアミノ酸の合成ペプチドを免疫原とし て抗体を作製し、その抗体を CDT測定のための免疫測定法に応用することを考えた (WO93/06133 :特許文献 4)。
[0011] これに対して、 ER.Trimbleらは、 Makhlouf¾の手法による、合成ペプチドを免疫原と して作製したモノクローナル抗体は CDTには反応しな力 たことからそのェピトープ はトランスフェリン分子内に隠匿されており検出に応用できないと述べた（Biochem So c Trans, 26(1)， S48(1998)：非特許文献 2)。
[0012] 一方、特開 2004— 051633 (特許文献 5)には、 CDTと水溶液中で選択的に結合 し、 CDTを固相に結合させる必要がない抗体に関して記載されている。該抗体は、 遺伝子組み換え手法により得たリコンビナント非糖化トランスフェリンを免疫原に使用 し、或いは、酵素による脱糖ィ匕反応して非糖化トランスフェリンとしたものを免疫原とし て使用して、得た抗体である。即ち、人為的に作製した CDTを免疫原に使用して得 られた抗体である。
[0013] 現在市販されている CDT測定試薬には、カラム法ではゥサギポリクローナル抗体が 使用されているため、 CDTの測定には検体への鉄飽和とカラムによる CDTの分離が 必要であり、操作が煩雑であった。また、高速液体クロマト法による CDTの測定は 1 検体あたりに要する時間が長ぐ多検体処理には不向きであった。
[0014] 近年、 CDT (糖鎖欠損トランスフェリン)を測定するために、検体の前処理 (検体の 鉄飽和及びカラム分離)を必要としない試薬が提供されたが（非特許文献: D.Kraul e t al, Clinical Chemistry, vol.51, No.6 96 B-149 (2005) (2005 AACC Annual meeting 要旨集））、測定原理が競合法で、測定範囲が狭ぐ低濃度側及び高濃度側での再 現性が悪く精度よく測定する試薬としては好ましくはない。
[0015] また、上記の CDT測定試薬は、専用試薬のため適用可能な分析装置が限られて おり、汎用の自動分析装置に適用し難い。
[0016] 特許文献 1 :特公平 3— 40341号公報
特許文献 2： W096Z26444
特許文献 3 : W〇95Z04932
特許文献 4 : W〇93/06133
特許文献 5 :特開 2004— 051633
非特許文献 l : Heil et al, Anaesthesist, 43, 447-453, (1994)
非特許文献 2 : Biochem Soc Trans, 26(1), S48(1998)
非特許文献 3 : D.Kraul et al, Clinical Chemistry, vol.51, No.6 96 B-149 (2005) (200 5 AACC Annual meeting要旨集）
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0017] 本発明者らは、鋭意研究の結果、未変性で天然の CDTを調製し、該 CDTの構造 を認識するモノクローナル抗 CDT抗体を複数種類取得した。し力しながら、前記従 来の免疫凝集試薬による測定法を適用した場合には、凝集反応はうまく行われない ことを確認した。即ち、それぞれのモノクローナル抗 CDT抗体を別々の担体に感作 し、この感作したそれぞれの担体を適当な割合で混合し一つの免疫凝集反応試薬と して用いて、検体に対して免疫凝集反応を行わせても、凝集反応はうまく行われなか つに。
[0018] そこで、本発明は、検体の前処理を必要とせず、経済的コストの低下につながる汎 用の自動分析装置でも測定可能であり、測定精度の向上や測定範囲の拡大を目指 した免疫凝集反応による抗原の測定方法と該測定方法に用いた免疫凝集反応試薬 キットを提供することを課題とする。さらに本発明は、前記課題に加えて、検体中の C DTに対して、効率のよい免疫凝集反応により CDT量の測定を行うことができる免疫 凝集反応試薬キット、該免疫凝集反応試薬キットに用いられるモノクローナル抗 CDT 抗体、該免疫凝集反応試薬キットを用いた CDTの測定方法を提供することを課題と する。
[0019] また、免疫凝集反応試薬キットに用いられる抗体として、体液中の CDTを前処理す ることなく測定できることが望ましぐそのためには天然の CDTの構造を認識する抗 体を取得する必要がある。
[0020] 一方、上述したように糖鎖欠失部位の近傍の領域は、 ER.Trimbleらの報告（非特許 文献 7)力、らも理解されるように、 CDT分子内に隠匿されている可能性があり、トランス フェリン分子内のジスルフイド結合数の多さからも強固な立体構造を形成しており、糖 鎖欠失部位の近傍のェピトープを認識する抗体の取得は困難であると想定される。
[0021] また、免疫抗原として人為的に作製した CDTは、天然の CDTとは大きく異なるとい う問題がある。例えば、前記特許文献 4の遺伝子組換え体の場合、ジスルフイド結合 を含むためタンパク質の立体構造が不完全になり易ぐまた、酵素による脱糖化物の 場合、調製の際に変性処理が必要である。さらに遺伝子組換え体と脱糖ィヒ物はアミ ノ酸の置換を生じるという問題がある。
[0022] また、体液中から天然の CDTを精製するための方法として、一般的には抗トランス フェリン抗体が結合したカラムを用いたァフィ二ティークロマトグラフィーが使用される 。し力、しながら、この方法はカラム中の抗トランスフェリン抗体にトランスフェリンを結合 させた後に、この抗原抗体複合体を酸性条件で変性させることにより CDTを含むトラ ンスフヱリンを溶出させて精製する方法がある。し力、しながら、該方法により得られる C DTは変性してレ、る可能性が高レ、ので、免疫原としては好ましくなレ、。
[0023] 本発明はかかる問題点を鑑みて、体液中の CDTに対して反応しないような抗体を 生ずる恐れのある、人為的に作製した CDTを免疫原に使用することなぐ天然の CD Tと選択的に結合し、しかも免疫凝集反応を利用した測定に適用できる抗 CDT抗体 を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0024] 前記した課題を解決するための本発明の免疫凝集反応試薬キットは、認識するェ ピトープが異なる二種類のモノクローナル抗体が該抗体の種類毎に分けられた担体 粒子に感作されてなる二種類の担体粒子を含む免疫凝集反応試薬であって、該ニ 種類の感作された担体粒子は、 目的の抗原を含む検体に対して同時に反応させた 場合には凝集反応が弱ぐ特定の種類のモノクローナル抗体が感作された担体粒子 の反応順序を特定した場合、凝集反応が増大する性質を有し、該ニ種類の感作され た担体粒子は互いに独立した状態で保存されていることを特徴とする。
[0025] 本発明の抗原の測定方法は、前記の免疫凝集反応試薬キットを用意し、抗原を含 むと疑われる検体に対して、一方の種類の試薬を反応させた後、その反応液に他方 の種類の試薬を反応させることにより、凝集を生じさせ、凝集の変化量を測定すること を特徴とする。
[0026] 本発明の免疫凝集反応試薬キットに使用されるモノクローナル抗体はマウス由来の ものを用いることができる。本発明のキットは動物種に関係なぐ認識するェピトープ の異なる二種類以上のモノクローナル抗体を用いることができる。
[0027] また、認識するェピトープが異なるモノクローナル抗体は、二種類以上でも使用す ること力 Sでき、一方の試薬に、二種類以上のモノクローナル抗体が感作された担体粒 子、或いはェピトープが異なる二種類のモノクローナル抗体力 該抗体の種類毎に 分けられた担体粒子に感作されてなる二種類の担体粒子を混合されたものを使用し 、他方の試薬にさらに別のェピトープのモノクローナル抗体が感作されてなる担体粒 子を含むものを使用してもよい。
[0028] 本発明の抗原の測定方法、特に好適な抗原は CDTである。 CDTを測定する方法 に用いられる特に好ましい免疫凝集試薬キットは、特許生物寄託センター（IPOD) に寄託したハイプリドーマ NCDT503 (受託日：平成 18年 3月 14日、受託番号： FE RM P— 20844)の産生する抗 CDTマウスモノクローナル抗体を感作した担体粒子 を含む試薬を最初に反応させる試薬とし、特許生物寄託センター (IPOD)に寄託し たハイブリドーマ NCDT077 (受託日：平成 18年 3月 14日、受託番号： FERM P— 20843)の産生する抗 CDTマウスモノクローナル抗体を感作した担体粒子を含む試 薬を次に反応させる試薬として組み合わせたキットである。
[0029] 該キットを用いた抗原の測定方法は、 CDTを含むと疑われる検体に対して、ノ、イブ リドーマ NCDT503 (受託番号： FERM P— 20844)の産生する抗 CDTマウスモノ クローナル抗体 1を感作した担体粒子を含む試薬を反応させた後、その反応液にハ イブリドーマ NCDT077 (受託番号： FERM P - 20843)の産生する抗 CDTマウス モノクローナル抗体を感作した担体粒子を含む試薬を反応させることにより、凝集を 生じさせ、凝集の変化量を測定することを特徴とする。前記反応液中の pHが 6. 8以 上 8. 5以下であることが好ましい。
[0030] 本発明の抗原の測定方法は、 自動分析装置又は用手法の何れでも行うことができ る。汎用の自動分析装置として、三試薬系の分析が可能な分析装置であれば本試 薬キットの適用は可能である。例えば、 日立製の自動分析装置の 7070形や 7170形 等は三試薬系の分析が可能である。
[0031] 本発明の免疫凝集反応試薬キットを構成する試薬に好適に使用できる担体は、通 常の免疫凝集反応試薬に用いられる不溶性担体微粒子であればいずれも使用可能 であるが、例示すれば、ポリスチレン、スチレンーメタクリル酸共重合体、スチレンーグ リシジル (メタ）アタリレート共重合体、スチレン一スチレンスルホン酸塩共重合体、メタ クリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、塩 化ビニルーアクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビエルアタリレートなどのラテックス 等の有機高分子物質の微粒子、物理吸着用やカルボキシル基を介した化学結合用 といった処理加工を施したラテックス、あるいはシリカ、シリカ アルミナ、アルミナの 様な無機酸化物又は該無機酸化物等にシランカップリング処理等を施し、官能基を 導入した無機粒子、金属コロイド粒子、ヒト〇型血球、ヒッジ赤血球等の生物由来の 粒子、リボソーム等が挙げられる力 これらに限定するものではない。なかでもラテツ タス粒子は人工担体であり、 目的に応じて担体表面を化学的処理しやすいこと、また 非特異反応が起こりにくいことなどの点から特に好ましく用いられる。そのなかで、種 々の変性ラテックスや磁性ラテックス等も必要に応じて使用できる。
[0032] 上記担体の粒径も特に限定されるものではないが、抗原抗体反応後の凝集の起こ り易さや凝集の判別のし易さ等の観点から平均粒径が 0· 05 μ m以上 1 μ m未満、 好ましく ίま、 0. 1 /1 111以上0. 5 /i m未満、最も好ましく ίま、 0· 1 μ τη]^ 0. 2 /i m未 満である担体粒子を用いることが好適である。
[0033] また担体の使用量は、抗体や抗原の種類によって適宜決定すればよいが、担持効 率や操作性の観点から、測定時の溶液中の担体粒子濃度が 0. 02質量％以上 0. 2 5質量％以下、好ましくは 0. 02質量％以上 0. 17質量％以下、最も好ましくは 0. 04 質量％以上 0. 13質量％以下であることが好適である。本発明で使用するモノクロ一 ナル抗体の濃度は 0. 03mgZmL以上 0. 09mg/mL以下、好ましくは 0. 03mg/ mL以上 0. 07mgZmL以下、最も好ましくは 0. 05mgZmL以上 0. 07mg/mL以 下とする。
[0034] 測定に用いる緩衝液は、 Trisの他 pH範囲が 6. 8力、ら 8. 5である緩衝剤であれば 用いることができ、 BES、 MOPS, TES、 HEPES、 DIPSO、 TAPSO、 POPS〇、 H EPPSO、 EPPS、 Tricine、 Bicine、 TAPS等も使用することができる。
発明の効果
[0035] 従来法である、認識するェピトープの種類の異なる抗体を種類毎に別々の担体に 感作し、この感作したそれぞれの担体を適当な割合で混合した免疫凝集反応試薬を 用レ、て免疫凝集反応を行わせても、抗原中におレ、てェピトープの数が少なレ、場合や 、異なるェピトープが近接しているため立体障害等の原因で、十分量のラテックス凝 集塊を生成せず、そのため目的とする吸光度が得られないような場合でも、本発明の 二種類の感作された担体粒子は互いに独立した状態で保存されているキットを用い 、抗原を含むと疑われる検体に対して、一方の種類の試薬を反応させた後、その反 応液に他方の種類の試薬を反応させることにより凝集を生じることができ、大きな吸 光度変化を得ることができるので検体中の抗原の測定が可能となる。
図面の簡単な説明
[0036] [図 1]陰イオン交換クロマトグラフィーによる CDT分画溶出プロファイルを示すグラフ である。
[図 2]図 1の溶出プロファイルに示した各分画の SDS-PAGE及び等電点電気泳動の 写真である。 [図 3]抗トランスフェリンポリクローナル抗体と組み合わせたサンドイッチ ELISAによる 相関性試験を示すグラフである。
[図 4]ィ） 2種のラテックス試薬を混合して用いた場合、口）先にラテックス試薬 1を反応 させ、次いでラテックス試薬 2を反応させた場合、ハ）先にラテックス試薬 2を反応させ 、次いでラテックス試薬 1を反応させた場合の CDT濃度に対する吸光度の関係を表 すグラフである。
[図 5]ラテックスの粒径を変えた場合の CDT濃度に対する吸光度の関係を表すダラ フである。
[図 6]反応液中のラテックス濃度を変えた場合の CDT濃度に対する吸光度の関係を 表すグラフである。
[図 7]反応液中のモノクローナル抗体濃度を変えた場合の CDT濃度に対する吸光度 の関係を表すグラフである。
[図 8]使用可能な pHの範囲について CDT濃度に対する吸光度の関係を表すグラフ である。
[図 9]精製 CDT分画による 120mg/dLまでの抗原過剰の測定結果について CDT 濃度に対する吸光度の関係を表すグラフである。
実施例
[0037] 次の実施例により本発明を更に詳細且つ具体的に説明する。但し、本発明は下記 実施例に限定されるものではない。
以下の実施例は、認識するェピトープが異なる二種類の抗 CDTマウスモノクローナ ル抗体を別々のラテックスにそれぞれ感作し、カラム等の検体の前処理が不要な汎 用自動分析装置に適用可能な三試薬系の CDT測定試薬を構築して免疫測定を実 施したものである。
[0038] 「実施例 1Ί：未栾件で天然の CDT分画の調製
CDT高値ヒト血清 10mLに鉄飽和溶液（0. 5M NaHCO 250 /i Lと 10mM F
3
eCl 180 i L)を加え、 4°Cで一時間インキュベート後、脱脂溶液（lOOg/1 デキス
3
トラン硫酸 100 /i Lと 1M CaCl 500 μ L)を加えた溶液の上清を回収した。さら
2
にブルーセファロースカラム（Blue Sepharose 6 Fast Flow:商品名、 GEヘルスケアバ ィォサイエンス株式会社製）を用いてアルブミンを除去し、次いで、 Protein Gカラム (Hi Trap Protein G HP:商品名： GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用 いてグロブリンを除去することにより、トランスフェリン以外のタンパク質を除去した後、 陰イオン交換カラム（MonoQ HR 5 5：商品名、 GEヘルスケアバイオサイエンス 株式会社製）を用いて未変性のジシァロトランスフェリンとァシァロトランスフェリンを 含む CDT分画を調製した。
[0039] 図 1は陰イオン交換クロマトグラフィーによる CDT分画溶出プロファイルを示すダラ フである。図 1における矢印 Aは波長 280nmの吸光度曲線を示す。矢印 Bは波長 46 Onmの吸光度曲線を示す。図 1の溶出プロファイルに示した各分画の SDS— PAG E (NuPAGE gel :商品名、インビトロジヱン株式会社製)及び等電点電気泳動につい ての銀染色とウェスタンブロットの写真を図 2に示す。図 2に示すようにトランスフェリン の糖鎖の量に応じた 5種のアイソフォームとしてテトラシァロ、トリシア口、ジシァ口、モ ノシァ口およびァシァロトランスフェリンを未変性で高純度に調製することができたこと 力 sわ力る。
[0040] 「実施例 2Ί：ハイブリドーマの調製
前記実施例 1で得られたジシァロトランスフェリンとァシァロトランスフェリンを含む分 画を CDT抗原として用いた。該抗原を濃度 0. 5mg/mLの抗原溶液に調製した。 該抗原溶液 500 /i Lにアジュバンド 500 /i L (TiterMax Gold :商品名、 TiterMa x Co.製）を混和して乳化させ、 5週齢の BALB/cマウスの皮下に免疫した。追加 免疫として同様に調製したものを 2週おきに 3回繰り返した。その間免疫時に採血を して抗原に対する血中の抗体活性を測定した。最終免疫から 14日後に 100 μ Lの抗 原溶液を腹腔内に投与し、 3日後、脾臓を摘出した。脾細胞はマウスミエローマ細胞 (P3x63Ag8. 653)とポリエチレングリコール 4000 (商品名、メルク社製）の存在下 で 2分間反応させることにより融合させた。融合後、 HAT選択培地に懸濁して 96ゥェ ルの培養プレートに分注し、 37°Cの C〇 インキュベーターで培養し、ハイプリドーマ
2
を調製した。
[0041] [実施例 3]： CDT分画に対する抗体産牛ハイプリドーマの潠抜
前記実施例 2で得られたハイプリドーマについて、本発明の抗体産生ハイブリドー マの選抜はサンドイッチ ELISAにより行った。 96ゥエルのマイクロプレートに PBSで 1 0 μ g/mLに調製した抗マウス抗体を 1ゥエル当たりそれぞれ 50 μ L加え、 4°Cで一 昼夜反応させた。その後 PBSで 1回洗浄し、 0. 5%BSA—PBSでブロッキングを行 いスクリーニング用のプレートとした。ハイプリドーマの増殖の認められたゥエルの培 養上清 50 z Lをゥエルに加え、室温で 1時間反応させた。引き続き洗浄液（0. 05% Tween-PBS)で洗浄後、前記実施例 1に記載した CDT分画を室温で 1時間反応 させ、同様に洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗トランスフェリンポリクローナル 抗体 50 z Lをカロえ、室温で 1時間反応させた。なお、該アルカリフォスファターゼ標識 抗トランスフェリンポリクローナル抗体は、抗トランスフェリンポリクローナル抗体 (株式 会社シバヤギ製）にアルカリフォスファターゼ（ロシュ社製）を過ヨウ素酸法で結合させ ることにより調製したものを使用した。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性を K ind_King法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで 490nmの吸光度を測定し、 該 CDT分画に対する抗体活性を持つモノクローナル抗体産生ハイプリドーマ NCD T077及び NCDT503を選抜した。
[0042] [実施例 4]： CDT分画に対する抗体産生ハイプリドーマのクローニング
前記実施例 3で選抜した各ハイプリドーマを限界希釈法により、クローニングを二回 実施し、樹立株を得た。得られたハイプリドーマ NCDT077は特許生物寄託センタ 一（IPOD)に寄託し（受託日：平成 18年 3月 14日、受託番号： FERM P— 20843) 、ハイプリドーマ NCDT503は特許生物寄託センター（IPOD)に寄託した（受託日： 平成 18年 3月 14日、受託番号： FERM P— 20844)。
[0043] 「実施例 5Ί :抗体の調製
前記実施例 4で得られた各樹立株にっレ、て、 CDT分画に対する抗体活性を持つ モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、モノクローナル抗体の大量産生のためマ ウス腹腔内にて増殖させた。こうして得られたマウス腹水中のモノクローナル抗体は、 プロテイン Gカラム（GE社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製した。
[0044] [実施例 6] : 抗体のサブクラスの決定
前記実施例 3で得られたハイプリドーマ NCDT077の産生するモノクローナル抗 C DT抗体のサブクラスは Isostrip (登録商標、ロシュ社製）を使用して、 IgG2a ( /c )と 決定した。同様にしてハイプリドーマ NCDT503の産生するモノクローナル抗 CDT 抗体のサブクラスは、 IgGl ( κ )と決定した。
[0045] [実施例 7]：サンドイッチ ELISAを用いた抗体の特異件の確認
前記実施例 5で調製したモノクローナル抗体 (ノヽイブリドーマ NCDT077産生抗体 及びハイプリドーマ NCDT503産生抗体）についてサンドイッチ ELISAを用いて、前 記実施例 1で調製したトランスフェリンァイソフォームに対する特異性の確認を行った 。 96ゥエルのマイクロプレートに PBSで 10 μ gZmLに調製した抗体を 1ゥエル当たり それぞれ 加え、 4°Cで一昼夜反応させた。その後 PBSで 1回洗浄し、 0. 5%B SA—PBSでブロッキングを行った。その後、前記実施例 1で調製したトランスフェリン ァイソフォーム 50 x Lをゥエルに加え、室温で 1時間反応させた。引き続き洗浄液（0 . 05%Tween_ PBS)で洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗トランスフェリンポ リクローナル抗体（前記実施例 3で調製したものと同じ） 50 μ Lをカロえ、室温で 1時間 反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性を Kind— King法にて発色 させ、マイクロプレートリーダーで 490nmの吸光度を測定し、トランスフェリンアイソフ オームに対する反応の強さを比較することで抗体の特異性を確認した。その結果を 下記の表 1に示す。
[0046] [表 1]
Figure imgf000013_0001
表 1に示すようにハイプリドーマ NCDT077産生抗体及びハイプリドーマ NCDT50 3産生抗体は溶液中の天然の CDT分画（ァシァロトランスフェリンとジシァロトランス フェリン）に特異的に反応した力 CDT以外のトランスフェリンであるテトラシァロトラン スフヱリンに対して反応しな力、つた。 [0048] [実施例 8]：抗トランスフェリンポリクローナル抗体と組み合わせたサンドイッチ ELI SAを用いた相閗性試験
前記実施例 5で調製したモノクローナル抗体 (ハイプリドーマ NCDT077産生抗体 及びハイプリドーマ NCDT503産生抗体）を用レ、、サンドイッチ ELISA法で、健常者 とアルコール中毒患者の血清合計 32検体を測定した。対照試験としてバイオラッド 社製の試薬を用いて測定した。該対照試験は、カラムを用いたトランスフェリン中の %CDTを測定する方法であり、カラムでの分離前の総トランスフェリンの量と、分離後 の CDTの量を測定し、検体中の CDT濃度と％CDT (総トランスフェリンに対する CD Tの割合)を算出した。
[0049] 前記サンドイッチ ELISAによる測定は 96ゥエルのマイクロプレートに PBSで 10 μ g /mLに調製した抗体を 1ゥエル当たりそれぞれ 50 μ Lカ卩え、 4°Cで一昼夜反応させ た。その後 PBSで 1回洗浄し、 0. 5%BSA_PBSでブロッキングを行った。その後、 健常者とアルコール中毒患者の各血清 50 μ Lをゥエルに加え、室温で 1時間反応さ せた。引き続き洗浄液（0. 05%Tween— PBS)で洗浄後、アルカリフォスファターゼ 標識抗トランスフェリンポリクローナル抗体（前記実施例 3で調製したものと同じ） 50 μ Lをカロえ、室温で 1時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性を Ki nd— King法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで 490nmの吸光度を測定し、 対照試験測定値との相関性を確認した。その結果を図 3に示す。
[0050] 図 3に示したように未変性で天然の CDT分画を免疫原にして得られた、ハイブリド 一マ NCDT077産生抗体及びハイプリドーマ NCDT503産生抗体は対照試験 CD T濃度と良好な相関を示した。したがって、ノ、イブリドーマ NCDT077産生抗体及び ハイプリドーマ NCDT503産生抗体は、検体中の CDT濃度に応じて吸光度が相関 しているので、吸光度の値を測定することにより、検体中の CDT濃度を定量すること ができる。
[0051] [実施例 9]：抗体の抗原認識部位の確認
前記実施例 5で調製した各モノクローナル抗体 (ノヽイブリドーマ NCDT077産生抗 体及びハイプリドーマ NCDT503産生抗体）の反応性を次のようにして調べた。下記 の P1—P6に示す 6種類のアミノ酸配列のペプチドを ELISAプレートに結合させた後 、 10 μ g/mLに調製した抗体を 1ゥエル当たりそれぞれ 50 β Lカロえ、室温で 1時間 反応させた。引き続き洗浄液（0. 05%Tween— PBS)で洗浄後、アルカリフォスファ ターゼ標識抗マウス IgG抗体（Goat F(ab') Anti-Mouse Ig' s, Alkaline Phosphatase C onjugate AMI4405:商品名、 BIOSOURCE社製） 50 μ Lを加え、室温で 1時間反応さ せた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性を Kind— King法にて発色させ、 マイクロプレートリーダーで 490nmの吸光度を測定した。
[0052] P1— P6のペプチド配列において下線部は、特許文献 3又は特許文献 4の抗体認 識部位を示す。その結果を下記の表 2に示す。
PI VLAENYNKSDNCE (配列番号 1)
P2 QHLFGSNVTDCSG (配列番号 2)
P3 WARSMGGKEDLIWELL (配列番号 3)
P4 IAKIMNGEADAMSL (配列番号 4)
P5 YEKYLGEEYVKAV (配列番号 5)
P6 SKLSMGSGLNLSEPN (配列番号 6)
[0053] [表 2]
Figure imgf000015_0001
[0054] 表 2によれば、各モノクローナル抗体（ノ、イブリドーマ NCDT077産生抗体及びハ イブリドーマ NCDT503産生抗体）は、 P1— P6 (特許文献 3又は特許文献 4の抗体 の認識部位を含むペプチド）に対して認識しなレ、ことがわかる。
[0055] 次に前記実施例 5で調製した抗体の抗原認識部位を調べるために、最初に抗原タ ンパク質の一次構造への反応性について次のようにして確認した。即ち、 CDT抗原 を ELISAプレート (ィモビライザーァミノ：商品名、ヌンク社製）に共有結合させた後、 4M尿素による変性、 0. 1M DTTで還元処理を行ったゥエルに 10 z gZmLに調 製した抗体を 1ゥヱル当たりそれぞれ 50 z Lカ卩え、室温で 1時間反応させた。引き続 き洗浄液（0. 05%Tween— PBS)で洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗トラン スフエリンポリクローナル抗体（前記実施例 3で調製したものと同じ） 50 μ Lをカロえ、室 温で 1時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性を Kind— King 法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで 490nmの吸光度を測定し、タンパク質 の一次構造を認識するかを確認した。その結果を下記の表 3に示す。
[表 3]
Figure imgf000016_0001
[0057] 表 3に示すようにハイプリドーマ NCDT077産生抗体及びハイプリドーマ NCDT50 3産生抗体は、 CDT抗原を変性'還元処理した一次構造に対して反応しないことが わかる。また、これらの抗体は CDT抗原の一次構造を認識しておらず、立体構造を 認識していることがわかる。
[0058] [実施例 10] 各モノクローナル抗体が認識するェピトープ相違の確認
前記実施例 5で調製したモノクローナル抗体 (ハイプリドーマ NCDT077産生抗体 及びハイプリドーマ NCDT503産生抗体）の抗原認識部位の違いを調べるために、 各抗体を組み合わせたサンドイッチ ELISAにより確認した。最初に 96ゥエルのマイク 口プレートに PBSで 10 μ g/mLに調製した一方の抗体を 1ゥエル当たりそれぞれ 50 /i Lカロえ， 4°Cで一昼夜反応させた。その後 PBSで 1回洗浄し、 0. 5%BSA-PBS でブロッキングを行った。その後、 50倍に希釈したアルコール中毒者の血清 50 をゥエルに加え，室温で 1時間反応させた。引き続き洗浄液（0. 05%Tween-PBS )で洗浄後、他方の抗体をピオチン標識したものを 50 x Lカ卩え、室温で 1時間反応さ せた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン 50 を加え、 室温で 30分反応させ、洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性を Kind— King法にて 発色させ、マイクロプレートリーダーで 490nmの ODを測定した。その結果を表 4に示 す。
[0059] [表 4]
Figure imgf000017_0001
[0060] 表 4に示したモノクローナル抗体の組合せパターンによる反応結果によれば、同じ モノクローナル抗体の組み合わせでは反応せず、異なるモノクローナル抗体の組み 合わせでは反応がみられることが判る。
[0061] 「実施例 11Ί :ラテックス試薬 1、 2の調製
粒径が 0· 13 /i mの 10%ラテックス溶液 lOO Lを 1. 5mL遠心チューブに分注し 、感作緩衝液 825 /i Lを加えて希釈した後、 10mg/mLに調整した抗 CDTマウスモ ノクローナル抗体 1 (ハイブリドーマ NCDT503産生抗体）を 75 μ L添加して直ちに 撹拌混合し、冷所で 2時間転倒混和して感作を行った。感作の後ブロッキング緩衝 液を 100 /i L添加して 2分間のソニケーシヨンを行ってラテックスを分散させ、 37°Cで 1時間反応させてブロッキングを行った。ブロッキング終了後、遠心して上清の未反 応成分を除去し、沈渣に保存緩衝液 lmLをカ卩えてソニケーシヨンを行ってラテックス を分散させ、 700nmの吸光度が 0. 8Absとなるように希釈してラテックス試薬 1を調 製した。同様の操作で抗 CDTマウスモノクローナル抗体 2 (ハイブリドーマ NCDT07 7産生抗体）を感作させたラテックス試薬 2を調製した。
[0062] <感作緩衝液組成 >
10mM TES pH7. 5
150mM 塩化ナトリウム
0. 095質量％ アジ化ナトリウム [0063] <ブロッキング緩衝液組成 >
10mM TES pH7. 5
10% ゥシ血清アルブミン
0. 095質量％ アジ化ナトリウム
[0064] ぐ保存緩衝液組成 >
10mM Tris pH8. 0
20質量0 /0 グリセローノレ
0. 1質量％ ゥシ血清アルブミン
0. 095質量％ アジ化ナトリウム
[実施例 12]：ラテックス試薬の反応性
測定には、第 1試薬、第 2試薬、第 3試薬からなる試薬系による測定が可能な日立 7
170型自動分析装置を使用し、第 1試薬として下記組成の緩衝液を用い、第 2試薬、 第 3試薬として前記実施例 11で調製したラテックス試薬 1、 2を下記のィ）口）ハ）の 3 種類の条件で使用して測定を行った。
[0065] 具体的な操作方法としては、 自動分析装置の反応セルに検体 5 μ Lが分注され、そ の後下記組成の第 1試薬 100 μ Lが分注され、さらに第 2試薬 50 μ Lが分注されて 検体中の CDTと第 2試薬のラテックス試薬が反応した。その後、下記組成の第 3試薬
50 / Lが分注されると、 CDTとラテックス試薬の凝集塊が成長するため吸光度が増 加するので、第 3試薬添加直後からの吸光度の変化量を測定した。
[0066] 下記のィ）の条件では第 2試薬を用いずにラテックス試薬 1および 2を等量混合した ものを第 3試薬として 100 / L添加した。第 1試薬および測定試料は共に共通で、出 力は K— factor法による吸光度で行った。測定結果を CDT濃度に対する吸光度の 関係を示すグラフとして図 4に示す。図 4によれば、今回使用した抗体の組み合わせ では、下記の口）の条件が最も感度良く測定できることが判る。
[0067] <第 1試薬組成 >
10mM TES pH7. 5
150mM 塩化ナトリウム
0. 095% アジ化ナトリウム [0068] <測定試料 >
ヒト血清力 イオン交換カラムにより精製した CDT分画を生理食塩水で希釈した 0、 3、 6、 12および 18mg/dLの溶液。
ぐ測定条件 >
ィ） 2種のラテックス試薬を混合して用いた場合
検体量 5 μ L
第 1試薬 100
第 2試薬 0 μ L
第 3試薬 100 xL ラテックス試薬 1および 2を等量混合したもの
測定波長 主波長 570nm、副波長 800nm
測光ポイント 19— 34
[0069] 口）先にラテックス試薬 1を反応させ、次いでラテックス試薬 2を反応させた場合
検体量 5 /i L
第 1試薬 100 し
第 2試薬 50 / L ラテックス試薬 1
第 3試薬 50 /iL ラテックス試薬 2
測定波長 主波長 570nm、副波長 800nm
測光ポイント 19 34
[0070] ハ）先にラテックス試薬 2を反応させ、次いでラテックス試薬 1を反応させた場合
検体量 5 /i L
第 1試薬 100 し
第 2試薬 50 zL ラテックス試薬 2
第 3試薬 50 zL ラテックス試薬 1
測定波長 主波長 570nm、副波長 800nm
測光ポイント 19— 34
[0071] 「実施例 13Ί:使用可能なラテックスの粒择の節两
前記実施例 11と同様の感作方法で抗 CDTマウスモノクローナル抗体 2 (ハイブリド 一マ NGDT077産生抗体）を粒径 0. 09μηι 0. 0. 15 xm、0. 20 μ m、 0. 34 /i m、0. 46 μ ΐηのラテックスに感作することにより粒径の異なるラテックス試薬 を調製した。試薬の希釈倍率は前記実施例 11における粒径 0. 13 / mの場合と同じ 希釈倍率を他の粒径にも適用した。測定試料は生理食塩水で希釈した 0、 5、 10、 1 5、 20、 25、 30、 35、 40mg/dLの CDT溶液とし、調製した粒径の異なるラテックス 試薬を前記実施例 12の口）の条件で測定した。測定結果を CDT濃度に対する吸光 度の関係を示すグラフとして図 5に示す。図 5によれば 0. 09〃111カら0. 46 z mの間 の粒径は CDT濃度に依存した吸光度の上昇が確認され、該粒径範囲で使用可能 であることが判る。
[0072] [実施例 14]：使用可能なラテックス濃度の範囲
前記実施例 11で調製したラテックス試薬 2の濃度を変化させ、反応液中のラテック ス濃度を 0. 01 %、 0. 02%、 0. 04%、 0. 07%、 0. 13%、 0. 17%、 0. 25%、 0. 5 %とした場合の吸光度を前記実施例 12の口）の条件および前記実施例 13の評価試 料で測定した。測定結果を CDT濃度に対する吸光度の関係を示すグラフとして図 6 に示す。図 6は反応液中のラテックス濃度を変えた場合の感度を示すグラフである。 図 6によれば、吸反応液中のラテックス濃度が 0. 01%では測定に十分な感度が得ら れず、 0. 5%では吸光度が減少した力 0. 02%力ら 0. 25%の間では CDT濃度に 依存した吸光度の上昇が確認され、使用可能であることが判る。 0. 5%の吸光度の 低下の理由は強い凝集のため主波長は 0濃度で頭打ちし、副波長が濃度に応じて 上昇するためと考えられる。
[0073] 「実施例 15Ί :使用可能なモノクローナル抗体濃度の節两
前記実施例 11と同様の感作方法で抗 CDTマウスモノクローナル抗体 2 (ハイブリド 一マ NCDT077産生抗体）の感作時濃度を変化させ、溶液中の抗体濃度として 0. 0 2mgZmL、 0. 03mg/mL, 0. 05mg/mL、 0. 06mgZmL、 0. 07mg/mL, 0 . 08mg/mL、 0. 09mgZmLとした場合の吸光度を前記実施例 12の口）の条件お よび前記実施例 13の評価試料で測定した。測定結果を CDT濃度に対する吸光度 の関係を示すグラフとして図 7に示す。図 7によれば、反応液中の抗体濃度が 0. 02 mgZmLでは測定に十分な感度が得られなかった力 0. 03mg/mLから 0. 09mg /mLの間では CDT濃度に依存した吸光度の上昇が確認され、使用可能であること が判る。
[0074] [実施例 16]：使用可能な ΌΗの節两
前記実施例 12で調製した第 1試薬のほかに ρΗの異なる緩衝液を調製し、前記実 施例 12の口）の条件および前記実施例 13の評価試料で反応液中の ΡΗと吸光度を 測定した。測定結果を CDT濃度に対する吸光度の関係を示すグラフとして図 8に示 す。図 8によれば、 ρΗ6. 5以下ではブランク反応の異常が見られ、 ρΗ9. 6では測定 に十分な感度が得られなかった力 S、 pH6. 8から pH8. 5の範囲では CDT濃度に依 存した吸光度の上昇が確認され、該 pH範囲で使用可能であることが判る。
[0075] 「実施例 17Ί :洵 I定試藝件能
前記実施例 12の口）の条件で、 20回連続測定した生理食塩水の吸光度を、 5mg /dLの CDT溶液力も CDT濃度に換算し、 0濃度の平均値 + 3SDにより最小検出限 界を算出した結果を表 5に、 4濃度の試料を 10回測定した場合の同時再現性を表 6 に、精製 CDT分画による 120mg/dLまでの抗原過剰の測定結果を CDT濃度に対 する吸光度の関係を示すグラフとして図 9にそれぞれ示す。この方法により算出され た最小検出限界は、想定される健常人検体に含まれる CDT濃度よりも十分に小さい 数値であり、同時再現性、測定範囲等も測定試薬として十分な性能を有しているとい える。
[0076] [表 5]
No. 生理食塩水測定値
1 0.0
2 -0.1
3 -0.4
4 0.0
5 0.4
6 0.2
7 -0.1
8 0. 1
9 -0.2
1 0 -0.1
1 1 0.4
1 2 0.2
1 3 -0.2
1 4 -0.4
1 5 0. 1
1 6 -0.5
1 7 -0.1
1 8 -0.1
1 9 0.2
2 0 -0.4 平均値 -0.05
S D 0.25 平均値 + 3 SD 0. 715
[0077] [表 6]
No. 試料 1 S式料 2 試料 3 試料 4
1 1.6 6.3 15.6 27.6
2 1.5 6.5 15.8 27.9
3 1.9 6. 1 15.6 27.9
4 1.6 6.2 15.6 27.6
5 1.6 6.2 15.8 27.8
6 1.7 6. 1 15.3 27.8
7 1.6 6.2 15.4 27.6
8 o 1.5 6.3 15.0 27.8
1 0 1.5 6. 1 15. 1 27.9 平均値 1.6 6.22 27.75
S D 0.123 0.274 0. 135
C V 7.8% 2.0% 1.8% 0.5%
産業上の利用可能性
本発明によりェピトープが近接し立体障害等で抗体との反応効率が悪い場合でも、 目的物を効率的に測定することができる。同時に特異的な反応が行われるため、検 体の前処理を必要としない簡便で高感度な免疫測定法に利用できる。本発明の測 定方法は、 CDTの測定に特に適している。
1/1
PCT
紙面による写し（注意 電子データが原本となります）
[この用紙は、国際出願の一部を構成せず、国際出願の用紙の枚数に算入しない]
Figure imgf000024_0001
1 下記の表示は発明の詳細な説明中に記載
された微生物又は生物材料に関速して ヽる
1-1 段落番号 0028
1-3 寄託の表示 '
1-3-1 寄託機関の名称 I P0D (独)産業技術総合研究所特許生物寄託センタ 一 (I P0D)
1-3-2 寄託機関のあて名 曰本国 〒305-8566茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6
1-3-3 寄託の曰付 2006年 03月 14日 （14. 03. 2006)
1-3-4 受託番 4 I POD FERM P- 20844
1-5 この表示を行うための指定国 すべての指定国
2 下記の表示は発明の詳細な説明中に記載
された微生物又は生物材料に関速して 、る
2-1 段落番号 0028
2-3 寄 Kの表示
2-3-1 寄託機関の名称 I P0D (独)産業技術総合研究所特許生物寄託センタ 一 (I P0D)
2-3-2 寄託機関のあて名 曰本国 T305-8566茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6
2-3-3 寄託の'日付 2006年 03月 14日 (14. 03. 2006)
2-3-4 受託番号 I POD FERM P-20843
2-5 この表 を行うための指定国 すべての指定国 受理官庁記入欄
0-4 この用紙は国際出願とともに受理した
(はい/いいえ）
0-4-1 権限のある職負 国際事務局記入欄
0-5 この用紙が国際事務局に受理された日
0-5-1 権限のある職員 差替え用紙 （規則 26)

Claims

請求の範囲
[1] 認識するェピトープが異なる二種類のモノクローナル抗体が該抗体の種類毎に分 けられた担体粒子に感作されてなる二種類の担体粒子を含む免疫凝集反応試薬キ ットであって、
該ニ種類の感作された担体粒子は、目的の抗原を含む検体に対して同時に反応 させた場合には凝集反応が弱ぐ特定の種類のモノクローナル抗体が感作された担 体粒子の反応順序を特定した場合、凝集反応が増大する性質を有し、
該ニ種類の感作された担体粒子は互いに独立した状態で保存されてレヽることを特 徴とする免疫凝集反応試薬キット。
[2] 前記モノクローナル抗体が感作された担体粒子カ^テックス粒子である請求項 1記 載の免疫凝集反応試薬キット。
[3] 前記担体粒子の粒径が 0. 05 μ m以上 1 μ m未満である請求項 1記載の免疫凝集 反応試薬キット。
[4] 前記モノクローナル抗体が認識する抗原は、 CDTである請求項 1記載の免疫凝集 反応試薬キット。
[5] ノヽィプリドーマ NCDT503 (FERM P— 20844)の産生する抗 CDTマウスモノクロ ーナル抗体を感作した担体粒子を含む試薬を最初に反応させる試薬とし、ハイプリド 一マ NCDT077 (FERM P- 20843)の産生する抗 CDTマウスモノクローナル抗 体を感作した担体粒子を含む試薬を次に反応させる試薬として組み合わせたことを 特徴とする請求項 1記載の免疫凝集反応試薬キット。
[6] 前記担体粒子は、ラテックス粒子である請求項 1に記載の免疫凝集反応試薬キット
[7] '請求項 1乃至 5の何れか 1項に記載の免疫凝集反応試薬キットを用意し、
抗原を含むと疑われる検体に対して、一方の種類の試薬を反応させた後、その反 応液【'こ他方の種類の試薬を反応させることにより凝集を生じさせ、凝集の変化量を測 定することを特徴とする抗原の測定方法。 '
[8] 自動分析装置又は用手法により行う請求項 7記載の抗原の測定方法。
[9] 前記反応液の担体粒子濃度が 0. 02質量％以上 0. 25質量％以下である請求項 7
差替え用紙 （規則 26) 記載の抗原の測定方法
[10] 前記反応液のモノクローナル抗体濃度が 0. 03mg mL以上 0. 09mg/mL以下 である請求項 7記載の抗原の測定方法。
[11] 前記反応液の pHが 6. 8以上 8. 5以下である請求項 7記載の抗原の測定方法。
[12] 前記抗原力 SCDTである請求項 7記載の抗原の測定方法。
[13] CDTを含むと疑われる検体に対して、ハイプリドーマ NCDT503 (FERM P— 20 844)の産生する抗 CDTマウスモノクローナル抗体 1を感作した担体粒子を含む試 薬を反応させた後、その反応液にハイプリドーマ NCDT077 (FERM P— 20843) の産生する抗 CDTマウスモノクローナル抗体を感作した担体粒子を含む試薬を反応 させることにより凝集を生 させ、凝集の変化量を測定することを特徴とする抗原の測 定方法。
[14] 前記凝集の変化量は、吸光度の変化量である請求項 7又は 13記載の抗原の測定 方法。
[15] 請求項 13に記載の抗原の測定方法に用いられるハイプリドーマ NCDT077 (FER M P— 20843)の産生する抗 CDTマウスモノクローナル抗体。
[16] 前記モノクローナル抗体が次の P1— P6のペプチド領域に対して反応性を有しな いか又は実質的に反応性を有しない請求項 15記載の抗 CDTマウスモノクローナル 抗体。
PI : VLAENYNKSDNCE
P2: QHLFGSNVTDCSG
P3 : WARSMGGKEDLIWELL
P4: IAKIMNGEADAMSL
P5 : YEKYLGEEYVKAV
P6 : SKLSMGSGLNLSEPN
[17] ハイプリドーマ NCDT077(FERM P— 20843)。
差替え用紙 （規則 26)
PCT/JP2007/057100 2006-03-31 2007-03-30 免疫凝集反応試薬キット及び抗原の測定方法 WO2007114337A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008508654A JP5199067B2 (ja) 2006-03-31 2007-03-30 免疫凝集反応試薬キット及び抗原の測定方法
EP07740536A EP2006685A1 (en) 2006-03-31 2007-03-30 Immune agglutination reaction reagent kit and method of assaying antigen
US12/225,546 US20090117668A1 (en) 2006-03-31 2007-03-30 Immune Agglutination Reagent Kit and Method of Measuring Antigen

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006100871 2006-03-31
JP2006-100871 2006-03-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007114337A1 true WO2007114337A1 (ja) 2007-10-11

Family

ID=38563604

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2007/057100 WO2007114337A1 (ja) 2006-03-31 2007-03-30 免疫凝集反応試薬キット及び抗原の測定方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20090117668A1 (ja)
EP (1) EP2006685A1 (ja)
JP (1) JP5199067B2 (ja)
WO (1) WO2007114337A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011158798A1 (ja) * 2010-06-14 2011-12-22 国立大学法人山口大学 乾癬治療効果の経過観察及び早期の予測方法並びにそれらに使用するキット
JP2018173334A (ja) * 2017-03-31 2018-11-08 株式会社シマ研究所 免疫学的測定方法及びそれに用いる試薬キット
JP2018173429A (ja) * 2018-08-20 2018-11-08 積水メディカル株式会社 ラテックス免疫凝集法における測定誤差低減方法
JP2022540030A (ja) * 2019-06-28 2022-09-14 シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド 粒子増強凝集検出を使用するサンドイッチイムノアッセイのための試薬ならびにそれらの作製および使用の方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103941020B (zh) * 2014-04-28 2016-01-27 西南民族大学 一种检测副猪嗜血杆菌抗体的间接elisa试剂盒
CN111239403B (zh) * 2019-02-13 2020-12-08 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种β2微球蛋白胶乳增强免疫比浊试剂盒及应用
CN110007091A (zh) * 2019-04-02 2019-07-12 杭州博谱医药科技有限公司 一种脂联素检测试剂盒及其制备方法
CN110161254A (zh) * 2019-05-16 2019-08-23 杭州博谱医药科技有限公司 一种人血清钙卫蛋白检测试剂盒及其制备方法
CN111856016B (zh) * 2020-07-29 2023-08-01 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种涎液化糖链抗原测定试剂盒及其制备方法
CN116041506B (zh) * 2023-01-05 2023-12-05 深圳上泰生物工程有限公司 糖缺失性转铁蛋白的单克隆抗体对及检测试剂盒

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0340341A (ja) 1989-07-06 1991-02-21 Toshiba Corp 電子レンジ用マグネトロン
WO1993006133A1 (en) 1991-09-25 1993-04-01 Samar Makhlouf Immunoassay for identifying alcoholics and monitoring alcohol consumption
WO1995004932A1 (en) 1993-08-06 1995-02-16 Biolin Medical Ab Quantitation of carbohydrate deficient transferrin in high alcohol consumption by hplc
WO1996026444A1 (en) 1995-02-22 1996-08-29 Axis Biochemicals Asa Carbohydrate-deficient transferrin assay
JPH1026621A (ja) * 1996-07-12 1998-01-27 Dai Ichi Pure Chem Co Ltd イムノアッセイ法
WO2002079782A1 (fr) * 2001-03-30 2002-10-10 Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. Reactif et procede pour l'immunoanalyse de l'elastase 1, et procede de detection de pathologie pancreatique
JP2004051633A (ja) 2002-07-05 2004-02-19 Dade Behring Marburg Gmbh 炭水化物欠失トランスフェリン（ｃｄｔ）特異的抗体、その製造および使用
JP2005326150A (ja) * 2004-05-12 2005-11-24 Eiken Chem Co Ltd 前立腺特異抗原の測定法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4486530A (en) * 1980-08-04 1984-12-04 Hybritech Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
DE19637418A1 (de) * 1996-09-13 1998-03-19 Boehringer Mannheim Gmbh Homogene Nachweisverfahren zur Bestimmung von Subpopulationen eines Analyten
JP4241301B2 (ja) * 2003-09-30 2009-03-18 和光純薬工業株式会社 免疫学的測定用試薬

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0340341A (ja) 1989-07-06 1991-02-21 Toshiba Corp 電子レンジ用マグネトロン
WO1993006133A1 (en) 1991-09-25 1993-04-01 Samar Makhlouf Immunoassay for identifying alcoholics and monitoring alcohol consumption
WO1995004932A1 (en) 1993-08-06 1995-02-16 Biolin Medical Ab Quantitation of carbohydrate deficient transferrin in high alcohol consumption by hplc
WO1996026444A1 (en) 1995-02-22 1996-08-29 Axis Biochemicals Asa Carbohydrate-deficient transferrin assay
JPH1026621A (ja) * 1996-07-12 1998-01-27 Dai Ichi Pure Chem Co Ltd イムノアッセイ法
WO2002079782A1 (fr) * 2001-03-30 2002-10-10 Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. Reactif et procede pour l'immunoanalyse de l'elastase 1, et procede de detection de pathologie pancreatique
JP2004051633A (ja) 2002-07-05 2004-02-19 Dade Behring Marburg Gmbh 炭水化物欠失トランスフェリン（ｃｄｔ）特異的抗体、その製造および使用
JP2005326150A (ja) * 2004-05-12 2005-11-24 Eiken Chem Co Ltd 前立腺特異抗原の測定法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHEM SOC TRANS, vol. 26, no. 1, 1998, pages 48
D. KRAUL ET AL., CLINICAL CHEMISTRY, vol. 51, no. 6 96, 2005, pages 149
HEIL ET AL., ANAESTHESIST, vol. 43, 1994, pages 447 - 453
OTSUKA T. ET AL.: "Hi-alcohol-sei Shibokan'en to Alcohol-sei Kan'en ni Okeru Kesseigakuteki narabini Men'eki Soshiki Kagakuteki Sai no Kento", JOURNAL OF KANAZAWA MEDICAL UNIVERSITY, vol. 29, no. 3, 2004, pages 139 - 146, XP003018339 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011158798A1 (ja) * 2010-06-14 2011-12-22 国立大学法人山口大学 乾癬治療効果の経過観察及び早期の予測方法並びにそれらに使用するキット
JP2018173334A (ja) * 2017-03-31 2018-11-08 株式会社シマ研究所 免疫学的測定方法及びそれに用いる試薬キット
JP2018173429A (ja) * 2018-08-20 2018-11-08 積水メディカル株式会社 ラテックス免疫凝集法における測定誤差低減方法
JP2022540030A (ja) * 2019-06-28 2022-09-14 シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド 粒子増強凝集検出を使用するサンドイッチイムノアッセイのための試薬ならびにそれらの作製および使用の方法
JP7465900B2 (ja) 2019-06-28 2024-04-11 シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド 粒子増強凝集検出を使用するサンドイッチイムノアッセイのための試薬ならびにそれらの作製および使用の方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP5199067B2 (ja) 2013-05-15
EP2006685A1 (en) 2008-12-24
JPWO2007114337A1 (ja) 2009-08-20
US20090117668A1 (en) 2009-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2007114337A1 (ja) 免疫凝集反応試薬キット及び抗原の測定方法
EP2322562B1 (en) Monoclonal antibody, and immunoassay using same
EP2754672B1 (en) Antibody capable of binding to specific region of periostin, and method of measuring periostin using the same
JP6016789B2 (ja) Ｐｉｖｋａ−ｉｉ測定試薬における非特異反応の抑制方法
WO2011078384A1 (ja) ヒトインスリン測定方法及び測定試薬
JP7382071B2 (ja) 糖化ヘモグロビン（％）の測定方法
JP5798679B2 (ja) ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１を特異的に認識するモノクローナル抗体、前記抗体を生産するハイブリドーマ細胞株及びその用途
EP3865873A1 (en) Method and assay reagent for immunoassay of leucine-rich ?2 glycoprotein
EP3988564A1 (en) Leptin immunogen, hybridoma cell, monoclonal antibody, polyclonal antibody and use thereof
EP3184634B1 (en) PROTEIN ASSAY METHOD SPECIFIC TO TRACP-5b (TARTRATE RESISTANT ACID PHOSPHATASE 5b)
CN114134123A (zh) 妊娠相关糖蛋白的单克隆抗体及其在牛早期怀孕检测中的应用
JP2009529133A (ja) 細胞膜受容体に結合した抗体を検出するための新規なアッセイ方法
EP1889060A2 (en) Monoclonal antibody reagents
CN117054657B (zh) 一种联合阻断剂及其在胶乳免疫比浊法检测中的应用
WO2021107105A1 (ja) 免疫反応を利用したアナライトの測定方法及び測定試薬
EP4130740A1 (en) Measuring method for fragment including 7s-domain of human type-iv collagen, and kit to be used therefor
WO2023191046A1 (ja) Ｈｒｇに対するモノクローナル抗体を用いたｈｒｇの測定方法
CN116041527A (zh) 一种特异性结合e2-e2抗体复合物的抗体及其应用
TW202342979A (zh) 檢測方法及檢測試劑
CN115991752A (zh) 特定组氨酸甲基化修饰的pra1蛋白免疫原、多克隆抗体及应用
WO2003080676A1 (fr) Anticorps contre un complexe immun contenant de la transferine, methode de production de l&#39;anticorps, hybridome et methode de dosage immunologique

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 07740536

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008508654

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12225546

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007740536

Country of ref document: EP