CN113533736B - 肺炎支原体IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

肺炎支原体IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫层析领域，具体而言，提供了一种肺炎支原体IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂盒及其制备方法。本发明的肺炎支原体IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂盒，其包括检测试纸条和待检测样本稀释液，其中，检测试纸条包括底板和依次设置于底板上的样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫，该试剂盒利用免疫层析原理对待测样本进行检测，成本低、耗时短，同时采用包括10‑100mM Tris‑HCl，0.1‑0.5(w/v)％S9，0.1‑0.5(w/v)％S17和10‑100mM NaCl的稀释液对待测样本进行稀释，可以显著提高检测的灵敏度和特异性，从而改善肺炎支原体的检测准确性。

Description

肺炎支原体IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂盒及其制备 方法
技术领域
本发明涉及免疫层析领域，具体而言，涉及一种肺炎支原体IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)是一种无细胞壁的原核细胞微生物，属于柔膜体纲，是引起社区获得性肺炎的主要病原体。
目前肺炎支原体诊断的方法有：分离培养、胶体金法、被动凝集法、酶联免疫吸附法、补体结合实验、荧光定量PCR等。其中，分离培养的病原体培养周期较长；被动凝集法和补体结合试验无法区分IgM和IgG；酶联免疫法和荧光定量PCR虽然具有灵敏度高，特异性强等优点，但也有着操作复杂、对实验室条件和操作人员的技术要求较高等缺点，限制了其在临床上的应用。胶体金法可以便捷的进行检测，成本低，同时，检测结果直观、肉眼可见，不需要特殊仪器设备。然而，现有技术中的肺炎支原体胶体金检测技术依然存在批间差大，灵敏度低，金标物质不稳定的问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种肺炎支原体IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂盒。
本发明的第二目的在于提供上述检测试剂盒的制备方法。
一种肺炎支原体IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂盒，包括检测试纸条和待测样本稀释液；
所述检测试纸条包括底板和依次设置于底板上的样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫；
所述待测样本稀释液包括：10-100mM Tris-HCl，0.1-0.5(w/v)％S9，0.1-0.5(w/v)％S17和10-100mM NaCl。
进一步地，所述样品垫的处理液包括：10-100mM Tris-HCl，0.2-3(w/v)％BSA，0.1-2(w/v)％酪蛋白，100-200μg/mL鼠抗人RBC抗体，10-100mg/mL植物凝集素和0.05-0.5(w/v)％吐温-20。
进一步地，结合垫包被有胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体，胶体金的粒径为25-35nm；
优选地，胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体的稀释液包括：10-100mM Tris-HCl，3-10(w/v)％蔗糖，1-5(w/v)％海藻糖，0.5-3(w/v)％BSA，0.05-0.5(w/v)％PVP40，0.5-3.0(w/v)％酪蛋白和0.1-1.0(w/v)％吐温-20。
进一步地，检测垫包被有平行设置的检测线和质控线，检测线包被有包被浓度为1-1.3mg/mL肺炎支原体抗原，质控线包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体；
优选地，肺炎支原体抗原的稀释液包括：10-20mM PBS，1-5(w/v)％海藻糖，0.2-1.0mM EDTA二钠，0.1-0.5(w/v)％Triton X-100和0.05-0.2(w/v)％BSA；
优选地，羊抗鼠IgG多克隆抗体的稀释液包括：10-20mM PBS，1-5(w/v)％海藻糖和0.2-1.0mM EDTA二钠。
进一步地，样本垫与结合垫交错重叠1-1.5mm；
优选地，结合垫与检测垫交错重叠1-1.5mm；
优选地，检测垫和吸水垫交错重叠2-3mm。
进一步地，样品垫或结合垫均独立地为玻璃纤维；
优选地，检测垫为硝酸纤维素膜。
进一步地，待测样本包括全血、血清或血浆。
进一步地，所述检测试剂盒还包括用于包装检测试纸条的卡盒。
上述检测试剂盒的制备方法，样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫依次粘贴于底板上，得到检测试纸条；
按配方量配置得到待测样本稀释液。
进一步地，结合垫的制备包括：采用胶体金溶液标记鼠抗人IgM单克隆抗体，再包被于玻璃纤维，经干燥后得到所述结合垫，胶体金溶液的制备方法为柠檬酸三钠还原法，胶体金溶液的制备采用球形瓶、悬臂式磁力搅拌桨和数显夹套式磁力搅拌器；
优选地，标记条件包括：在pH7.5±0.5条件下，胶体金溶液与鼠抗人IgM单克隆抗体按照比例1ml：(0.008-0.012)mg反应；
优选地，胶体金溶液的分光光度计检测最高峰在523±3nm，OD值在1.0±0.1；
优选地，干燥为-100kPa真空冷冻干燥过夜。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种肺炎支原体IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂盒，其包括检测试纸条和待检测样本稀释液，其中，检测试纸条包括底板和依次设置于底板上的样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫，该试剂盒利用免疫层析原理对待测样本进行检测，成本低、耗时短，同时采用包括10-100mM Tris-HCl，0.1-0.5(w/v)％S9，0.1-0.5(w/v)％S17和10-100mMNaCl的稀释液对待测样本进行稀释，可以显著提高检测的灵敏度和特异性，从而改善肺炎支原体的检测准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的检测试纸条结构示意图；
图2为本发明提供的带有卡盒包装的检测试纸条。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
本发明提供了一种肺炎支原体IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂盒，其包括检测试纸条和待检测样本稀释液，其中，检测试纸条(如图1所示)包括底板6和依次设置于底板上的样品垫1、结合垫2、检测垫7和吸水垫5，其中，检测垫7上设有检测线3和质控线4，该试剂盒利用免疫层析原理对待测样本进行检测，成本低、耗时短，同时，通过对大量表面活性剂进行筛选和比对，发明人在待测样本稀释液中独创加入了S9和S17，使得待测样本在检测试纸条上的层析效果更好，采用包括10-100mM Tris-HCl，0.1-0.5(w/v)％S9，0.1-0.5(w/v)％S17和10-100mM NaCl的稀释液对待测样本进行稀释，可以显著提高检测的灵敏度和特异性，从而改善肺炎支原体的检测准确性。
需要说明的是，Tris-HCl的浓度可以但不限于为10mM、30mM、50mM、70mM、90mM或100mM；S9的浓度可以但不限于为0.1(w/v)％、0.2(w/v)％、0.3(w/v)％、0.4(w/v)％或0.5(w/v)％；S17的浓度可以但不限于为0.1(w/v)％、0.2(w/v)％、0.3(w/v)％、0.4(w/v)％或0.5(w/v)％；NaCl的浓度可以但不限于为10mM、30mM、50mM、70mM、90mM或100mM。
在优选的实施方式中，待测样本稀释液包括：20mM Tris-HCl，0.1(w/v)％S9，0.3(w/v)％S17和50mM NaCl。
为了进一步提高检测试剂盒的检测准性和适用性，可以对全血样本进行检测，发明人对样品垫的处理液进行了优化，具体包括：10-100mM Tris-HCl，0.2-3(w/v)％BSA，0.1-2(w/v)％酪蛋白，100-200μg/mL鼠抗人RBC抗体，10-100mg/mL植物凝集素和0.05-0.5(w/v)％吐温-20。其中，鼠抗人RBC抗体和植物凝集素可以共同作用截留待测样本中的红细胞，使得红细胞凝结成团结合在样品垫上，彻底避免了红细胞的向上层析。
Tris-HCl的浓度可以但不限于为10mM、30mM、50mM、70mM、90mM或100mM；BSA的浓度可以但不限于为0.2(w/v)％、0.5(w/v)％、1(w/v)％、1.5(w/v)％、2(w/v)％、2.5(w/v)％或3(w/v)％；酪蛋白的浓度可以但不限于为0.1(w/v)％、0.3(w/v)％、0.5(w/v)％、0.7(w/v)％、0.9(w/v)％或1(w/v)％；鼠抗人RBC抗体的浓度可以但不限于为100μg/mL、120μg/mL、140μg/mL、160μg/mL、180μg/mL或200μg/mL；植物凝集素的浓度可以但不限于为10mg/mL、30mg/mL、50mg/mL、70mg/mL、90mg/mL或100mg/mL；吐温-20的浓度可以但不限于为0.05(w/v)％、0.1(w/v)％、0.2(w/v)％、0.3(w/v)％、0.4(w/v)％或0.5(w/v)％。
在优选的实施方式中，样品垫的处理液包括：50mM Tris-HCl，1(w/v)％BSA，0.5(w/v)％酪蛋白，100μg/mL鼠抗人RBC抗体，50mg/mL植物凝集素和0.1(w/v)％吐温-20。
在一些实施方式中，结合垫包被有胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体，通过采用竞争法对肺炎支原体进行检测。为了提高金标物的稳定性，将胶体金的粒径限定为25-35nm，优选为30nm。此外，胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体的稀释液包括：10-100mMTris-HCl，3-10(w/v)％蔗糖，1-5(w/v)％海藻糖，0.5-3(w/v)％BSA，0.05-0.5(w/v)％PVP40，0.5-3.0(w/v)％酪蛋白和0.1-1.0(w/v)％吐温-20。Tris-HCl的浓度可以但不限于为10mM、30mM、50mM、70mM、90mM或100mM；蔗糖的浓度可以但不限于为3(w/v)％、4(w/v)％、5(w/v)％、6(w/v)％、7(w/v)％、8(w/v)％、9(w/v)％或10(w/v)％；海藻糖的浓度可以但不限于为1(w/v)％、2(w/v)％、3(w/v)％、4(w/v)％或5(w/v)％；BSA的浓度可以但不限于为0.5(w/v)％、1(w/v)％、1.5(w/v)％、2(w/v)％、2.5(w/v)％或3(w/v)％；PVP40的浓度可以但不限于为0.05(w/v)％、0.1(w/v)％、0.2(w/v)％、0.3(w/v)％、0.4(w/v)％或0.5(w/v)％；酪蛋白的浓度可以但不限于为0.5(w/v)％、1(w/v)％、1.5(w/v)％、2(w/v)％、2.5(w/v)％或3(w/v)％；吐温-20的浓度可以但不限于为0.1(w/v)％、0.3(w/v)％、0.5(w/v)％、0.7(w/v)％或1(w/v)％。
在优选的实施方式中，胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体的稀释液包括：50mMTris-HCl，3(w/v)％蔗糖，3(w/v)％海藻糖，1(w/v)％BSA，0.2(w/v)％PVP40，1(w/v)％酪蛋白和0.7(w/v)％吐温-20。
在一些实施方式中，检测垫包被有平行设置的检测线和质控线，检测线包被有包被浓度为1-1.3mg/mL肺炎支原体抗原，质控线包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。发明人对肺炎支原体抗原的浓度进行优化，提高检测试纸条的灵敏度和特异性，包被浓度可以但不限于为1mg/mL、1.1mg/mL、1.2mg/mL或1.3mg/mL，优选为1.2mg/mL。
在一些实施方式中，肺炎支原体抗原的稀释液包括：10-20mM PBS，1-5(w/v)％海藻糖，0.2-1.0mM EDTA二钠，0.1-0.5(w/v)％Triton X-100和0.05-0.2(w/v)％BSA。PBS的浓度可以但不限于为10mM、15mM或20mM；海藻糖的浓度可以但不限于为1(w/v)％、2(w/v)％、3(w/v)％、4(w/v)％或5(w/v)％；EDTA二钠的浓度可以但不限于为0.2mM、0.5mM或1mM；Triton X-100的浓度可以但不限于为0.1(w/v)％、0.2(w/v)％、0.3(w/v)％、0.4(w/v)％或0.5(w/v)％；BSA的浓度可以但不限于为0.05(w/v)％、0.1(w/v)％或0.2(w/v)％。
在优选的实施方式中，肺炎支原体抗原的稀释液：10mM PBS，2(w/v)％海藻糖，0.5mM EDTA二钠，0.1(w/v)％Triton X-100和0.1(w/v)％BSA。
在一些实施方式中，羊抗鼠IgG多克隆抗体的稀释液包括：10-20mM PBS，1-5(w/v)％海藻糖和0.2-1.0mM EDTA二钠。PBS的浓度可以但不限于为10mM、15mM或20mM；海藻糖的浓度可以但不限于为1(w/v)％、2(w/v)％、3(w/v)％、4(w/v)％或5(w/v)％；EDTA二钠的浓度可以但不限于为0.2mM、0.5mM或1mM。
在优选的实施方式中，羊抗鼠IgG多克隆抗体的稀释液：10mM PBS，3(w/v)％海藻糖和0.5mM EDTA二钠。
在优选的实施方式中，样本垫与结合垫交错重叠1-1.5mm；结合垫与检测垫交错重叠1-1.5mm；检测垫和吸水垫交错重叠2-3mm。样品垫或结合垫均独立地为玻璃纤维；检测垫为硝酸纤维素膜。待测样本包括全血、血清或血浆。此外，该试剂盒中还有用于包装检测试纸条的卡盒，如图2所示。
本发明还提供了上述检测试剂盒的制备方法，样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫依次粘贴于底板上，得到检测试纸条；按配方量配置得到待测样本稀释液。
为了减少检测试纸条的批间差，提高试剂盒的特异性，发明人对结合垫的制备工艺进行了优化，一方面胶体金的制备工艺采用柠檬酸三钠还原法，制备过程通过采用球形瓶、悬臂式磁力搅拌桨和数显夹套式磁力搅拌器，使得胶体金溶液温度保持抑制，烧制的金颗粒大小一致性好；另一方面，优化胶体金标记鼠抗人IgM单克隆抗体的实验条件，确保胶体金溶液的分光光度计检测最高峰在523±3nm，OD值在1.0±0.1，在pH7.5±0.5条件下，胶体金溶液与鼠抗人IgM单克隆抗体按照比例1ml：(0.008-0.012)mg反应，使得金标物稳定性好。此外，干燥采用真空干燥的方式，有效保护蛋白活性，提高检测灵敏度。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1肺炎支原体IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂盒
1、缓冲体系配置：
胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体的稀释液：50mM Tris-HCl，3(w/v)％蔗糖，3(w/v)％海藻糖，1(w/v)％BSA，0.2(w/v)％PVP40，1(w/v)％酪蛋白和0.7(w/v)％吐温-20。
肺炎支原体抗原的稀释液：10mM PBS，2(w/v)％海藻糖，0.5mM EDTA二钠，0.1(w/v)％Triton X-100和0.1(w/v)％BSA。
羊抗鼠IgG多克隆抗体的稀释液：10mM PBS，3(w/v)％海藻糖和0.5mM EDTA二钠。
样品垫的处理液：50mM Tris-HCl，1(w/v)％BSA，0.5(w/v)％酪蛋白，100μg/mL鼠抗人RBC抗体，50mg/mL植物凝集素和0.1(w/v)％吐温-20。
待测样本稀释液：20mMTris-HCl，0.1(w/v)％S9，0.3(w/v)％S17和50mM NaCl。
2、30nm左右胶体金溶液的烧制：
(1)于球形瓶中加入1000ml用超纯水配制的0.01％的氯金酸溶液，使用数显夹套式磁力搅拌器、悬臂式磁力搅拌器带搅拌桨250r/min搅拌加热至沸腾；
(2)保持沸腾1-5min；
(3)快速加入20％柠檬酸三钠0.6-0.9ml；
(4)继续沸腾15min，停止加热，静置冷却；
(5)使用超纯水定容至1000ml；
(6)利用分光光度计测量，最高吸收峰在523±3nm，OD值在1.0±0.1。
3、胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体的制备：
(1)取20ml制备好的30nm左右的胶体金溶液于玻璃小烧杯中，加入0.1M碳酸钾溶液140μL；
(2)逐滴缓慢加入利用纯化水稀释好的鼠抗人IgM单抗200μg，搅拌20-30min；
(3)加入10％牛血清白蛋白(BSA)400μL，使其终浓度为0.2％，继续搅拌20-30min；
(4)4℃，7500r/min，离心35±5min，弃上清，用0.2％BSA收集沉淀至200μL，使用紫外分光光度计测量其OD值。
4、结合垫的制备
(1)利用胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体的稀释液重悬沉淀，使其OD值为4OD；
(2)将稀释好的胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体均匀的铺在玻璃纤维垫上，-100kPa真空冷冻干燥过夜；
(3)将整张干燥的结合垫切割为宽5mm的金标鼠抗人IgM单抗结合物垫，于铝箔袋干燥密封保存备用。
5、包被硝酸纤维素膜
将肺炎支原体抗原、羊抗鼠IgG多克隆抗体分别用肺炎支原体抗原的稀释液、羊抗鼠IgG多克隆抗体的稀释液稀释，使用划膜仪以1.0μl/cm的喷量，分别划于硝酸纤维素膜上，检测线和质控线相距4-8mm；其中肺炎支原体抗原的包被浓度为1.2mg/ml，羊抗鼠IgG多克隆抗体的包被浓度为1.0mg/ml；37℃烘箱干燥16h，密封于铝箔袋干燥保存备用。
6、样品垫的处理
(1)利用样品垫处理液以40ml/张的量处理整张玻璃纤维(玻纤规格为30cm×25cm)；
(2)在室温、湿度＜20％的条件下过夜干燥，将整张玻纤切割为宽19mm，密封于铝箔袋中干燥备用。
7、试纸条的组装、切割
按样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺序粘附于支撑底板上组装试纸；将组装好的试纸切割为宽4mm/条的试纸条，装入塑料CT盒压紧，加干燥剂密封于铝箔袋干燥备用。
实施例2胶体金标记鼠抗人IgM单克隆抗体的鼠抗人IgM单克隆抗体用量优化
取8支小玻璃管，各加入胶体金1mL，再各加0.1mol/L的K2CO3 7μl，混合均匀后，分别加入1mg/mL抗人IgM单抗1、2、3、4、5、8、10、12μl，混合均匀，静置5min后各加入10％NaCl200μl，混合均匀，静置5min后观察颜色变化。结果见表1。
表1
Figure BDA0003164651730000111
表2是测定鼠抗人IgM量时各管的颜色变化，前5号样品在加入NaCl后颜色变为蓝色或紫色，这说明胶体金发生了团聚，这时的胶体金是不稳定的。6号样品之后的胶体金是稳定的。一般情况下蛋白量应适当过量，所以此处选择7号样品即1mL胶体金加10μl鼠抗人IgM。
实施例3检测线包被浓度的优化
按照上述确定好的标记条件进行标记，制备成金标垫；按照0.5mg/mL、1.2mg/mL、1.5mg/mL三种不同检测线抗原浓度进行划膜。将金标垫与三种浓度的硝酸纤维素膜分别组合进行测试。检测内控血清，P2、P4、P6、P8代表浓度不同的阳性质控，阳性值P2>P4>P6>P8；N1、N2、N3、N4代表阴性质控。结果见表2。
表2
划膜浓度 P2 P4 P6 P8 N1 N2 N3 N4
0.5mg/mL + + + - - - - -
1.2mg/mL ++ + + + - - - -
1.5mg/mL +++ ++ + + - + - -
表3是不同检测线抗原浓度的测试内控血清的显色结果，“-”表示结果为阴性，“+”表示结果为阳性，“+”号越多，阳性越强。从表3可知当抗原浓度过低时会影响其灵敏度，过高时会影响其特异性，最后选择居中的测试结果。确定抗原的浓度为1.2mg/ml。
实施例4待测样本稀释液的优化
利用实施例1中制备的试纸BJ、待检测样本含有不同浓度的S9和S17的试纸、待检测样本仅使用S9的试纸、待检测样本仅使用S17的试纸、待检测样本仅使用Tween-20的试纸和待检测样本仅使用Triton X-100的试纸，检测10份阳性患者血浆样本，结果如下表3。
表3
Figure BDA0003164651730000121
注：“－”表示阴性，“±”表示灰区，“+”表示弱阳性，“++”表示中阳性，“+++”表示强阳性。
此外，利用按照实施例1制备方法制备的试纸BJ，和已上市口碑较好的现有产品A对检测灵敏度作比对，使用同一份强阳样本分别用各自的稀释液进行梯度稀释后测试，结果见表4。
表4
Figure BDA0003164651730000122
结论：本发明通过对大量表面活性剂进行筛选比对，在待测样本稀释液中独创加入了S9和S17表面活性剂可大大改善样本在硝酸纤维素膜上层析效果提高检测灵敏度。
实施例5胶体金溶液制备的优化
使用实施例1中的检测试剂盒，锥形瓶和磁力加热搅拌器烧制的30nm胶体金制备的检测试剂盒分别检测20份阴性血清样本，结果见表5。
表5
Figure BDA0003164651730000131
注：“－”表示阴性，“±”表示灰区，“+”表示弱阳性，“++”表示中阳性，“+++”表示强阳性。
结论：本发明专利采用球形瓶与数显夹套式磁力搅拌器使得金烧制过程中溶液温度保持一致，烧制的金颗粒大小均一性好；且悬臂式磁力搅拌桨不与球形瓶直接接触，不存在摩擦，烧制的金溶液质量好。可以减少层析中的非特异性吸附等现象，提高了阴性检出率。
实施例6样品垫处理液的优化
利用按照实例1制备方法制备的试纸BJ、样品垫中使用不同浓度植物凝集素和鼠抗人RBC单克隆抗体制备的试纸、样品垫中单独使用植物凝集素制备的试纸和样品垫中仅使用鼠抗人RBC单克隆抗体制备的试纸，分别检测10份阳性全血样本和10份阴性全血样本，结果见表6。
表6
Figure BDA0003164651730000141
注：“正常”表示正常显色，“背景红”表示硝酸纤维素膜背景呈红色，影响结果判读。
结论：在样品垫的制备过程中加入植物凝集素与鼠抗人RBC单克隆抗体的混合物，在检测全血样本时，混合物与红细胞膜表面抗原结合，使红细胞凝集成团结合在样品垫上，不会随液体向上层析至硝酸纤维素膜影响检测线和质控线的正常显色，同时保持硝酸纤维素膜背景干净，不会影响观察结果。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (19)

1.一种肺炎支原体IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂盒，其特征在于，包括检测试纸条和待测样本稀释液；
所述检测试纸条包括底板和依次设置于底板上的样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫；
所述待测样本稀释液包括：10-100mM Tris-HCl，0.1%-0.5%（w/v）S9，0.1%-0.5%（w/v）S17和10-100mM NaCl。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述样品垫的处理液包括：10-100mM Tris-HCl，0.2%-3%（w/v）BSA，0.1%-2%（w/v）酪蛋白，100-200µg/mL鼠抗人RBC抗体，10-100mg/mL植物凝集素和0.05%-0.5%（w/v）吐温-20。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，结合垫包被有胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体，胶体金的粒径为25-35nm。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体的稀释液包括：10-100mM Tris-HCl，3%-10%（w/v）蔗糖，1%-5%（w/v）海藻糖，0.5%-3%（w/v）BSA，0.05%-0.5%（w/v）PVP40，0.5%-3.0%（w/v）酪蛋白和0.1%-1.0%（w/v）吐温-20。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，检测垫包被有平行设置的检测线和质控线，检测线包被有包被浓度为1-1.3mg/mL肺炎支原体抗原，质控线包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，肺炎支原体抗原的稀释液包括：10-20mM PBS，1%-5%（w/v）海藻糖，0.2-1.0mM EDTA二钠，0.1%-0.5%（w/v）Triton X-100和0.05%-0.2%（w/v）BSA。
7.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，羊抗鼠IgG多克隆抗体的稀释液包括：10-20mM PBS，1%-5%（w/v）海藻糖和0.2-1.0mM EDTA二钠。
8.根据权利要求1-7任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，样本垫与结合垫交错重叠1-1.5mm。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，结合垫与检测垫交错重叠1-1.5mm。
10.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，检测垫和吸水垫交错重叠2-3mm。
11.根据权利要求1-7任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，样品垫和结合垫均独立地为玻璃纤维。
12.根据权利要求11所述的检测试剂盒，其特征在于，检测垫为硝酸纤维素膜。
13.根据权利要求1-7任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，待测样本包括全血、血清或血浆。
14.根据权利要求1-7任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括用于包装检测试纸条的卡盒。
15.权利要求1-14任一项所述的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫依次粘贴于底板上，得到检测试纸条；
所述待测样本稀释液包括：10-100mM Tris-HCl，0.1%-0.5%（w/v）S9，0.1%-0.5%（w/v）S17和10-100mM NaCl。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，结合垫的制备包括：采用胶体金溶液标记鼠抗人IgM单克隆抗体，再包被于玻璃纤维，经干燥后得到所述结合垫，胶体金溶液的制备方法为柠檬酸三钠还原法，胶体金溶液的制备采用球形瓶、悬臂式磁力搅拌桨和数显夹套式磁力搅拌器。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，标记条件包括：在pH7.5±0.5条件下，胶体金溶液与鼠抗人IgM单克隆抗体按照比例1mL：（0.008-0.012）mg反应。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，胶体金溶液的分光光度计检测最高峰在523±3nm，OD值在1.0±0.1。
19.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，干燥为-100kPa真空冷冻干燥过夜。
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