CN113985023A - 一种划膜稀释液、免疫层析检测试纸条和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种划膜稀释液、免疫层析检测试纸条和试剂盒，涉及医学检测技术领域，本发明提供了一种特定的划膜稀释液，该划膜稀释液能够解决传统侧向层析试纸条稳定性不佳的技术问题，通过特定的缓冲液的选择，和其他组分协同增效，将其应用于划膜液的制备，能够消除或抑制抗体分子结构的舒展，避免了抗体间的相互作用，保证了抗体在层析膜上的稳定性，提高检测的稳定性，改善了免疫层析试剂的变异系数。

Description

一种划膜稀释液、免疫层析检测试纸条和试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体而言，涉及一种划膜稀释液、免疫层析检测试纸条和试剂盒。
背景技术
心肌细胞受到刺激后，会产生含134个氨基酸的脑钠肽前体原(pre-proBNP)，随后形成含108个氨基酸的脑钠肽前体(proBNP)，后者在内切酶的作用下裂解为含有76个氨基酸、无生物活性的氨基末端脑利钠肽前体(NT-proBNP)和含有32个氨基酸、有活性的B型钠尿肽(BNP)。BNP和NT-proBNP检测近年来已经为各级医院和医师广泛用于临床实践，成为心血管病尤其是心力衰竭诊断十分有用的生物标志物。NT-proBNP和BNP都可以单独地预示心室压力增高情况，对于充血性心力衰竭及其引发的呼吸困难并发症，原发性高血压、及其评价左心室功能障碍等心血管相关疾病的辅助诊断及治疗评估检测中具有重要价值。
BNP在体内的半衰期约为20min，而NT-proBNP的半衰期约为120min，相比较来说，NT-proBNP半衰期更长，也更加稳定，标本可以存放，既可以中心实验室检测，也可以在床旁检测。目前定量检测NT-proBNP的方法有放射免疫法、酶联免疫法、化学发光法，但是这些方法对于仪器、场地和人员的专业化要求高，而且检测时间一般都在18-30min，NT-proBNP作为一个心衰的辅助指标物，在《胸痛中心建设与管理指导原则》中建议从抽血到获取报告的时间能够快速，一般医院规定的TAT(TURN-AROUND TIME，检测周转时间)在20min内，如何有效实现NT-proBNP免疫荧光定量检测成为如今亟待解决的问题之一。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种划膜稀释液、免疫层析检测试纸条和试剂盒。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种划膜稀释液，其包括如下质量分数计的组分：1％～5％糖类，0.1～2％蛋白，0.01～0.05％防腐剂，余量为缓冲液；所述缓冲液选自：双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷缓冲液、1,3-双((三羟甲基)甲基氨基)丙烷缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液和4-吗啉丙磺酸缓冲液中的至少一种。
第二方面，本发明实施例提供了一种划膜液，其包括抗体以及如前述实施例所述的划膜稀释液。
第三方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的划膜稀释液在制备免疫层析检测试纸条中的应用，制备免疫层析检测试纸条的步骤包括：采用所述划膜稀释液对检测线抗体和/或质控线抗体进行稀释，获得检测线划膜液和/或质控线划膜液，基于获得的检测线划膜液和/或质控线划膜液进行检测线和质控线的制备。
第四方面，本发明实施例提供了一种免疫层析检测试纸条，其包括：底板以及依次搭接并承载于所述底板上的样品垫、结合垫、层析膜以及吸水垫；所述层析膜上固定由检测线和质控线；所述检测线和/或所述质控线采用的划膜稀释液为如前述实施例所述的划膜稀释液。
第五方面，本发明实施例提供了一种免疫层析检测方法，其包括：采用如前述实施例所述的免疫层析检测试纸条对待测样本进行检测，所述检测方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
第六方面，本发明实施例提供了一种免疫层析检测试剂盒，其包括如前述实施例所述的划膜稀释液，或如前述实施例所述的划膜液，或如前述实施例所述的免疫层析检测试纸条。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种特定的划膜稀释液，该划膜稀释液能够解决传统侧向层析试纸条稳定性不佳的技术问题，通过特定的缓冲液的选择，和其他组分协同增效，将其应用于划膜液的制备，能够消除或抑制抗体分子结构的舒展，避免了抗体间的相互作用，保证了抗体在层析膜上的稳定性，提高检测的稳定性，改善了免疫层析试剂的变异系数，尤其适用于NT-proBNP的检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为试验例1中100pg/mL抗原溶液测试结果；
图2为试验例1中5000pg/mL抗原溶液测试结果；
图3为试验例2中100pg/mL抗原溶液测试结果；
图4为试验例2中5000pg/mL抗原溶液测试结果；
图5为试验例4中100pg/mL抗原溶液测试结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种划膜稀释液，其包括如下质量分数计的组分：1％～5％糖类，0.1～2％蛋白，0.01～0.05％防腐剂，余量为缓冲液。所述缓冲液选自：双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷缓冲液、1,3-双((三羟甲基)甲基氨基)丙烷缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液和4-吗啉丙磺酸缓冲液中的至少一种。
经一系列创造性劳动，本发明公开了上述划膜稀释液，将其应用于免疫层析试纸条的制备，能够显著提高试纸条的保存期和精密度，尤其适用于N端脑钠肽前体(NT-proBNP)、B型利钠肽(BNP)、C反应蛋白(CRP)和降钙素原(PCT)的免疫层析试纸条。
具体地，糖类的质量分数可以为1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2.0％、2.2％、2.4％、2.6％、2.8％、3.0％、3.2％、3.4％、3.6％、3.8％、4.0％、4.2％、4.4％、4.6％、4.8％或5.0％。蛋白的质量分数可以为0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％或2.0％。防腐剂的质量分数可以为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％或0.05％。糖类作为保护剂，不仅是保护抗体干燥过程中因离子浓度增加，pH值的改变和相分离、干燥过程产生的干燥应力等情况对蛋白质活性产生影响，减小干燥过程中引起的抗体聚集，不同含量的糖类物质对稳定性影响也较大。
在优选的实施方式中，所述缓冲液包括双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷。
优选地，所述缓冲液的浓度为5～15mM，具体为5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM或15mM。
在可选的实施方式中，所述糖类选自：蔗糖、海藻糖、葡聚糖、乳糖、葡萄糖和麦芽糖中的至少一种。优选地，所述糖类包括蔗糖和海藻糖。优选地，所述蔗糖和所述海藻糖的质量比为(1～3)：(2～4)，在此质量比的配制下，能够更显著的提高试纸条的保存期和稳定性，质量比具体可以为1：2、1：3、1：4、2：2、2：3或3：2，优选为2：3。
在可选的实施方式中，所述蛋白选自酪蛋白钠、牛血清白蛋白BSA和凝胶中的至少一种；优选地，所述蛋白包括牛血清白蛋白。
在优选的实施方式中，所述防腐剂包括Proclin150、Proclin300和叠氮钠中的任意一种。
本发明实施例提供了一种划膜液，其包括抗体以及如前述任意实施例所述的划膜稀释液。优选地，所述抗体包括N端脑钠肽前体抗体、B型利钠肽抗体、C反应蛋白抗体和降钙素原抗体中的至少一种。
本发明实施例提供了如前述任意实施例所述的划膜稀释液在制备免疫层析检测试纸条中的应用，制备免疫层析检测试纸条的步骤包括：采用所述划膜稀释液对检测线抗体和/或质控线抗体进行稀释，获得检测线划膜液和/或质控线划膜液，基于获得的检测线划膜液和/或质控线划膜液进行检测线和质控线的制备。
优选地，所述检测线抗体包括N端脑钠肽前体抗体、B型利钠肽抗体、C反应蛋白抗体和降钙素原抗体中的至少一种。
本发明实施例提供了一种免疫层析检测试纸条，其包括：底板以及依次搭接并承载于所述底板上的样品垫、结合垫、层析膜以及吸水垫；所述层析膜上固定由检测线和质控线；所述检测线和/或所述质控线采用的划膜稀释液为如前述任意实施例所述的划膜稀释液。
优选地，所述免疫层析检测试纸条的检测目标包括N端脑钠肽前体NT-proBNP、B型利钠肽、C反应蛋白和降钙素原中的至少一种，所述检测线上固定的抗体为检测目标对应的抗体。
在可选的实施方式中，所述层析膜可以为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
本发明实施例提供了一种免疫层析检测方法，其包括：采用如前述实施例所述的免疫层析检测试纸条对待测样本进行检测，所述检测方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
优选地，所述免疫层析检测方法应用于N端脑钠肽前体NT-proBNP、B型利钠肽、C反应蛋白和降钙素原中的至少一种的检测。
优选地，所述待测样本为生物样本或环境样本。
此外，本发明实施例提供了一种免疫层析检测试剂盒，其包括如前述实施例所述的划膜稀释液，或如前述实施例所述的划膜液，或如前述实施例所述的免疫层析检测试纸条。
本发明经过多次验证，将膜包被工艺应用于免疫层析检测试剂盒，热稳定性和室温稳定性良好，批内变异系数<10％。本发明提供的划膜稀释液配方，改善了抗体在层析膜上的稳定性，并且同时改善侧向流层析试剂的变异系数即精密度。
优选地，所述免疫层析检测试剂盒应用于N端脑钠肽前体NT-proBNP、B型利钠肽、C反应蛋白和降钙素原中的至少一种的检测。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
NT-proBNP荧光定量试纸条的制备过程如下：
(1)划膜稀释液：终浓度为10mM的Bis-Tris，质量百分浓度为1％的蔗糖，质量百分浓度为1.5％的海藻糖，质量百分浓度为0.5％的BSA，质量百分浓度为0.02％的Proclin300。按上述配方配制混匀后备用。
(2)样品垫的制备：用样品垫处理液浸泡玻璃纤维膜，置于真空干燥箱中，干燥2h，备用。
(3)结合垫的制备：用包含NT-proBNP检测抗体的荧光微球的结合垫处理液浸泡玻璃纤维膜，置于真空干燥箱中，干燥2h，备用。干燥方式选择控制湿度和温度，湿度范围为10％～30％，温度范围为25～45℃。
(4)采用如步骤(1)中获得的划膜稀释液对NT-proBNP捕获抗体和羊抗鼠多克隆抗体进行稀释，获得终浓度为1.5mg/mLNT-proBNP捕获抗体溶液作为检测线划膜液，2mg/mL羊抗鼠多克隆抗体溶液作为质控线划膜液，并以0.75μL/cm的出液量固定于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线，37℃干燥2h，备用。
(5)在PVC底板上依次粘贴：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫，并用斩切机切成3.2mm宽的试纸条。
(6)将切好的试纸条装进塑料卡里，通过压壳机，完成试纸条。
实施例2
一种NT-proBNP荧光定量试纸条的制备方法，步骤大致与实施例1相同，区别在于划膜稀释液，区别如下：缓冲液为Bis-Tris丙烷，Bis-Tris丙烷在稀释液中的终浓度为10mM。
实施例3
一种NT-proBNP荧光定量试纸条的制备方法，步骤大致与实施例1相同，区别在于划膜稀释液，区别如下：缓冲液为HEPES，HEPES在稀释液中的终浓度为10mM。
实施例4
一种NT-proBNP荧光定量试纸条的制备方法，步骤大致与实施例1相同，区别在于划膜稀释液，区别如下：缓冲液为MOPS，MOPS在稀释液中的终浓度为10mM。
实施例5
一种NT-proBNP荧光定量试纸条的制备方法，步骤大致与实施例1相同，区别在于划膜稀释液中的糖类，本实施例中，划膜稀释液中糖类为：质量百分浓度为2.5％的蔗糖。
对照例1
一种NT-proBNP荧光定量试纸条的制备方法，步骤大致与实施例1相同，区别在于划膜稀释液的不同，其划膜稀释液包括：终浓度为10mM的PBS(缓冲液)，质量百分浓度为2.5％的蔗糖，质量百分浓度为0.5％的BSA，质量百分浓度为0.02％的Proclin300。
对照例2
一种NT-proBNP荧光定量试纸条的制备方法，步骤大致与对照例1相同，区别在于划膜稀释液的组分的不同，该对照例的划膜稀释液中不包含BSA。
试验例1
将实施例1、2、3、4以及对照例1制备的NT-proBNP荧光定量试纸条分别建立标准曲线后，各取实施例1、2、3、4以及对照例1的36个试纸条放置于37℃生化培养箱中进行检测，取实施例1和对照例1的42个试纸条放置于室温进行不同时间点的检测，具体如下：
(1)建立标准曲线：用制备好的试纸条测试35000、25000、12500、6400、5000、3600、1800、1000、450、300、100、30、0pg/mL13个浓度，每个浓度重复三次取平均值。
(2)将放置于37℃里的试纸条(实施例1、2、3、4以及对照例1)在1周、2周、3周、4周、5周的时间点拿出来测试100、5000pg/mL的抗原溶液。
100pg/mL抗原溶液测试结果见表1和图1。
表1 100pg/mL抗原溶液测试结果
37℃加速时间 第0周 第1周 第2周 第3周 第4周 第5周
对照例1 101 169 160 201 195 227
实施例1 100 101 98 102 97 101
实施例2 100 85 111 99 97 90
实施例3 101 107 96 108 94 97
实施例4 101 150 140 135 155 141
5000pg/mL抗原溶液测试结果见表2和图2。
表2 5000pg/mL抗原溶液测试结果
Figure BDA0003374064860000081
Figure BDA0003374064860000091
结果可知，37℃加速实验，对照例1不论是低浓度100pg/mL，还是高浓度5000pg/mL，均表现为不断上升。实施例4表现为加速1周后，信号开始稳定。而实施例2、3均表现出良好的稳定性。
(3)将放置在室温的试纸条(实施例1和对照例1)在1周、2周、3周、4周、2个月、3个月、9个月的时间点拿出来测试100pg/mL和5000pg/mL的抗原溶液。检测结果如表3所示。
表3室温稳定性实验结果
Figure BDA0003374064860000092
由结果可知，实施例1相比对照例1，在9个月内表现出更好的稳定性。
试验例2
按照表4所示配方配制划膜稀释液，制备相应试纸条，考察不同缓冲体系、糖的添加种类和添加量对试纸条稳定性的改善情况。
表4配方
Figure BDA0003374064860000093
Figure BDA0003374064860000101
将制备的NT-proBNP荧光定量试纸条建立标准曲线后，取36个试纸条放置于37℃生化培养箱中，并在不同时间点检测100pg/mL和5000pg/mL的抗原溶液。
37℃加速稳定性实验检测结果如下。
100pg/mL抗原溶液测试结果见表5和图3。
表5 100pg/mL抗原溶液测试结果
第0周 第1周 第2周 第3周 第4周 第5周
配方1 101 169 160 201 195 227
配方2 101 139 144 184 189 194
配方3 99 134 171 170 187 213
配方4(实施例1) 100 101 98 102 97 101
配方5 99 101 113 117 126 115
配方6 100 94 114 117 115 115
配方7 101 129 154 192 247 235
5000pg/mL抗原溶液测试结果见表6和图4。
表6 5000pg/mL抗原溶液测试结果
第0周 第1周 第2周 第3周 第4周 第5周
配方1 5003 6633 7095 7948 7989 8936
配方2 5000 6718 6975 7610 7649 7969
配方3 5001 6497 8022 8070 8937 8853
配方4(实施例1) 5020 4878 4911 5420 4604 5068
配方5 4789 4204 4437 4826 4993 5409
配方6 5020 5059 5162 6006 5405 4958
配方7 5005 7194 6746 8022 9002 8930
不同时间点测试结果与第0天测试结果的偏差比较结果表7。
表7不同时间点测试结果与第0天测试结果的偏差比较
Figure BDA0003374064860000102
Figure BDA0003374064860000111
比较配方1、2、3的结果，增加糖类物质添加量，对测试结果稳定性改善并不显著。配方4、5、6表现出较好的稳定性，尤其是配方4即实施例1，Bis-Tris体系结合蔗糖和海藻糖的组合以及在蛋白BSA的作用下，在不同时间点的测试结果与第0天的偏差小于±10％，相比其他配方表现出更好的稳定性。
试验例3
采用对照例1和实施例1制备的试纸条进行精密度对比，实施方法如下：对100和5000pg/mL的抗原溶液进行10重复的测试，计算精密度，结果见表8。
表8精密度检测结果
Figure BDA0003374064860000112
Figure BDA0003374064860000121
由结果可知，采用实施例1的划膜稀释液制备的试纸条比对照例1的试纸条的精密度更好。
试验例4
(1)采用实施例1、5以及对照例1～2的划膜稀释液进行BNP荧光定量试纸条的制备，划膜稀释液的配方可参照表9。
表9划膜稀释液
Figure BDA0003374064860000122
(2)样品垫的制备：用样品垫处理液浸泡玻璃纤维膜，置于真空干燥箱中，干燥2h，备用。
(3)结合垫的制备：用包含BNP检测抗体的荧光微球的结合垫处理液浸泡玻璃纤维膜，置于真空干燥箱中，干燥2h，备用。
(4)将2mg/mL BNP捕获抗体和2mg/mL羊抗鼠多克隆抗体分别用划膜包被液，以0.75μL/cm的出液量固定于硝酸纤维素膜上作为测试线和质控线，37℃干燥2h，备用。
(5)在PVC底板上依次粘贴：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫，并用斩切机切成3.2mm宽的试纸条。将切好的试纸条装进塑料卡里，通过压壳机，完成试纸条。
将制备的BNP荧光定量试纸条建立标准曲线，取试纸条放置于37℃生化培养箱中，并在不同时间点检测100pg/mL的抗原溶液，37℃加速稳定性实验结果见表10和图5。
表10 100pg/mL抗原溶液测试结果
37℃加速时间 第0周 第1周 第2周 第3周 第4周 第5周
配方1 97 109 92 96 110 109
配方7 94 108 115 118 120 120
配方8 108 116 92 98 106 107
配方4 98 108 97 96 107 108
结果表明：37℃加速实验，在BNP荧光定量试纸条上尝试实施例1的划膜稀释液，信号表现相对更佳稳定。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种划膜稀释液，其特征在于，其包括如下质量分数计的组分：1％～5％糖类，0.1～2％蛋白，0.01～0.05％防腐剂，余量为缓冲液；
所述缓冲液选自：双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷缓冲液、1,3-双((三羟甲基)甲基氨基)丙烷缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液和4-吗啉丙磺酸缓冲液中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的划膜稀释液，其特征在于，所述缓冲液包括双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷；
优选地，所述缓冲液的浓度为5～15mM。
3.根据权利要求1或2所述的划膜稀释液，其特征在于，所述糖类选自：蔗糖、海藻糖、葡聚糖、乳糖、葡萄糖和麦芽糖中的至少一种；
优选地，所述糖类包括蔗糖和海藻糖；
优选地，所述蔗糖和所述海藻糖的质量比为(1～3)：(2～4)。
4.根据权利要求1或2所述的划膜稀释液，其特征在于，所述蛋白选自酪蛋白钠、牛血清白蛋白和凝胶中的至少一种；
优选地，所述蛋白包括牛血清白蛋白。
5.根据权利要求1或2所述的划膜稀释液，其特征在于，所述防腐剂包括Proclin300。
6.一种划膜液，其特征在于，其包括抗体以及如权利要求1～5任一项所述的划膜稀释液；
优选地，所述抗体包括N端脑钠肽前体抗体、B型利钠肽抗体、C反应蛋白抗体和降钙素原抗体中的至少一种。
7.如权利要求1～5任一项所述的划膜稀释液在制备免疫层析检测试纸条中的应用，其特征在于，制备免疫层析检测试纸条的步骤包括：采用所述划膜稀释液对检测线抗体和/或质控线抗体进行稀释，获得检测线划膜液和/或质控线划膜液，基于获得的检测线划膜液和/或质控线划膜液进行检测线和质控线的制备；
优选地，所述检测线抗体包括N端脑钠肽前体抗体、B型利钠肽抗体、C反应蛋白抗体和降钙素原抗体中的至少一种。
8.一种免疫层析检测试纸条，其特征在于，其包括：底板以及依次搭接并承载于所述底板上的样品垫、结合垫、层析膜以及吸水垫；所述层析膜上固定由检测线和质控线；所述检测线和/或所述质控线采用的划膜稀释液为如权利要求1～5任一项所述的划膜稀释液；
优选地，所述免疫层析检测试纸条的检测目标包括N端脑钠肽前体NT-proBNP、B型利钠肽、C反应蛋白和降钙素原中的至少一种，所述检测线上固定的抗体为检测目标对应的抗体。
9.一种免疫层析检测方法，其特征在于，其包括：采用如权利要求8所述的免疫层析检测试纸条对待测样本进行检测，所述检测方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的；
优选地，所述免疫层析检测方法应用于N端脑钠肽前体NT-proBNP、B型利钠肽、C反应蛋白和降钙素原中的至少一种的检测；
优选地，所述待测样本为生物样本或环境样本。
10.一种免疫层析检测试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1～5任一项所述的划膜稀释液，或如权利要求6所述的划膜液，或如权利要求8所述的免疫层析检测试纸条。
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