CN111141917A

CN111141917A - 孕酮和β-hCG的二联层析检测卡及其制备方法和检测方法

Info

Publication number: CN111141917A
Application number: CN201911317885.7A
Authority: CN
Inventors: 王锐
Original assignee: Yunao Biotechnology Changzhou Co Ltd
Current assignee: Yunao Biotechnology Changzhou Co Ltd
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2020-05-12

Abstract

本发明公开了一种孕酮和β‑hCG的二联层析检测卡，包括监测壳和装载于监控壳内的试纸条；所述试纸条包括：底板、样品垫、NC膜和吸水纸；所述底板的相对两端分别覆盖样品垫和吸水纸，中间覆盖NC膜；所述样品垫和吸水纸靠近NC膜的一侧均搭接在NC膜两边沿上；所述NC膜上由样品垫方向向吸水纸方向依次设有平行的第一检测线、第二检测线和质控线；所述第一检测线为孕酮单克隆抗体，第二检测线为β‑hCG单克隆包被抗体，质控线为羊抗兔抗体。本发明通过使用量子点微球技术解决了普通荧光检测技术存在的易光漂白和光解的缺陷，将孕酮和β‑hCG进行联检，确保灵敏度和准确度的同时，更加方便快捷。

Description

孕酮和β-hCG的二联层析检测卡及其制备方法和检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种孕酮和β-hCG的二联层析检测卡及其制备方法和检测方法。

背景技术

孕酮(英文Progesterone，简称Prog，中文亦称为黄体酮、孕甾酮、黄体甾酮、黄体激素、助孕激素、助孕素或助孕酮)是一种涉及雌性月经周期、妊娠和对人类或动物的胚胎有影响的类固醇，是最重要的孕激素。孕酮检查主要用于了解黄体的功能及卵巢有无排卵。未怀孕的雌性，其孕酮只在每次月经周期的后半段才由卵巢黄体大量分泌。脑、肝与肾上腺也会分泌。怀孕时(第三个月开始)，胎盘可大量分泌。孕酮与生育有着密切的关系。如果在怀孕初期出现孕酮低的情况建议及时检查治疗，这样才能有效的改善情况。如果是由于黄体功能不全，而导致分泌的孕酮量不足，可以采取补充黄体酮来治疗；或者由于卵巢早衰而引发孕酮低的情况，需要根据具体情况治疗。

因此，孕酮检查对于孕期的女性或动物尤为重要。然而，孕酮为类固醇类小分子物质，有抗原性无免疫原性，因此要获得高特异性孕酮抗体难度很大。在血液样本中通常存在很多与孕酮结构类似的类固醇类小分子物质，这些物质对孕酮的检测会形成干扰，同时小分子物质在检测过程中容易受空间位阻和基质效应的影响。在小分子类物质免疫层析检测中普遍存在灵敏度不高、线性范围窄、准确度不足的问题。

人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)是妊娠期期间由胎盘滋养层细胞分泌产生的一种糖蛋白激素，由两个不同的亚基，α、β以非共价键连接组成。在激素的产生、分泌、代谢等过程中，hCG分子会发现断裂、离解等多种变化，从而在血、尿中以多种分子形式存在。hCG是唯一不随胎盘重量增加而分泌增多的胎盘激素，《全国临床检验操作规程》中记载了怀孕妇女的hCG参考值，妊娠0.2～1周，hCG参考值为5～50IU/ml；妊娠1～2周，hCG参考值为50～500IU/ml；妊娠2～3周，hCG参考值为100～5000IU/ml；妊娠3～4周，hCG参考值为500～10000IU/ml；妊娠4～5周，hCG参考值为1000～50000IU/ml；妊娠5～6周，hCG参考值为10000～100000IU/ml；妊娠6～8周，hCG参考值为15000～200000IU/ml；妊娠8～12周，hCG参考值为10000～100000IU/ml。妊娠1周后血液hCG为5-50mmIU/ml，尿液hCG＞25mIU/ml，第8-10周左右达到高峰，持续1-2周后迅速减低，以后逐渐下降并以1/5-1/10左右峰值水平维持至分娩。因此，可以通过检测血、尿中的hCG浓度以检测早孕。目前，一般的早孕检测试纸是采用双抗体夹心一步法，以胶体金为指示标记，检测尿液中hCG浓度，但是其只能用以判断是否怀孕，而不能检测出怀孕天数。怀孕天数依照传统的方法计算，是在早孕期间，怀孕天数从上一次月经结束后的第一天开始算起，然而这种计算方法较为不精确。目前，较为精确的怀孕天数检测方法是通过抽血检验、超声检测、HCG检测与超声检测结合的方法来检测，但是这些方法需要专业人员经过较长时间的检测才能得到检测结果，操作较为复杂。

近几年来，基于量子点(quantum dots，QDs)的免疫荧光检测技术在生物医学领域得到了一定的应用。相比于量子点，传统的荧光染料有着不可逾越的缺陷：激发光谱窄，发射光谱较宽，有时还有很长的拖尾，造成谱峰之间的重叠，限制了可同时应用的荧光探针数目，此外，传统的荧光染料还存在易光漂白和光解等缺陷。而量子点却能克服这些缺陷，成为传统荧光染料的替代物。不同粒径的量子点能被从紫外区到红外区的任一波长激发，且具有狭窄对称的荧光谱峰，可调的发射光谱，发射波长可以使单一的，也可以是多重的。可通过改变核心物质的数目而改变，也能通过改变核心物质某成分的数量调整其荧光强度。相对于传统有机荧光染料，量子点对化学物质和生理代谢的降解有很强的抵抗力，其光漂白阈值也很高。因此，量子点具有成为分子检测和医学诊断的先天条件，经过近20多年的发展，逐步从细胞及组织标记成像、细胞示踪、活体成像等应用研究开始向临床检测、疾病控制、食品安全检测等领域发展。

目前，单一的检测孕酮或者单一检测β-hCG，并不能满足现阶段医学检验的需求，且普通荧光检测技术往往存在着易光漂白和光解等缺陷。因此，需要一种结合量子点技术的孕酮和β-hCG的检测方法，在检测孕酮和β-hCG的同时还能确保灵敏度，且方便快捷。

发明内容

本发明的目的是克服现有孕酮和β-hCG联检不够灵敏，方法复杂的问题，提供一种基于量子点微球联合检测孕酮和β-hCG的检测卡及其制备方法和检测方法。

实现本发明目的的技术方案是一种孕酮和β-hCG的二联层析检测卡，包括监测壳和装载于监控壳内的试纸条；所述试纸条包括：底板、样品垫、NC膜和吸水纸；所述底板的相对两端分别覆盖样品垫和吸水纸，中间覆盖NC膜；所述样品垫和吸水纸靠近NC膜的一侧均搭接在NC膜两边沿上；所述NC膜上由样品垫方向向吸水纸方向依次设有平行的第一检测线、第二检测线和质控线；所述第一检测线为孕酮单克隆抗体，第二检测线为β-hCG单克隆包被抗体，质控线为羊抗兔抗体。

所述NC膜制备方法包括：分别将孕酮单克隆包被抗体、β-hCG单克隆包被抗体以及所述羊抗兔抗体用包被液调节浓度为0.1～1mg/mL，将孕酮单克隆抗体喷到NC膜的第一检测线，将β-hCG单克隆包被抗体喷到NC膜的第二检测线，将羊抗兔抗体喷到NC膜的质控线，检测线和质控线间隔3～8mm，置于恒温恒湿烘箱，干燥恒温密封保存，备用。

所述烘箱湿度＜30％、温度为30～60℃，干燥18～72h后于2～30℃密封保存，备用。

所述样品垫需进行处理，处理步骤如下：

步骤一、样品垫用缓冲液浸泡后，置于恒温恒湿的烘箱，干燥后密封保存；

步骤二、将量子点荧光微球标记的孕酮及β-hCG单克隆抗体和量子点荧光微球标记的兔IgG抗体分别用标记处理液喷涂在干燥后的样品垫上，喷量为2～8ul/cm；

步骤三、将制备好的样品垫置于湿度＜30％、温度为30～60℃的烘箱，干燥18～48h后于2～30℃密封保存。

所述步骤一中缓冲液包含10mM～200mM的PB缓冲液，0.2％～10％的BSA，0.2％～10％的蔗糖，0.05mg/mL～1.5mg/mL的RBC抗体。

所述步骤一控制烘箱湿度＜30％、温度为30～60℃，干燥18～48h后于2～30℃密封保存。

所述步骤二中量子点荧光微球标记的孕酮及、β-hCG单克隆抗体及兔IgG抗体制备方式相同，制备步骤如下：

a、取量子点荧光微球，用30～150mM、pH5.0～6.5MES缓冲液调节浓度为30mM～230mM；

b、混匀后加入终浓度为20mM～250mM的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)及终浓度为20mM～250mM的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)混匀；

c、室温孵育5～30min后，8000～15000rpm离心5～50min，去除上清液分离得到沉淀物，用10～100mM、pH6.0～7.0MES缓冲液溶解，将复溶后的量子点荧光微球超声分散，按照0.1～1.5mg/mL量子点荧光微球的比例加入孕酮或β-hCG单克隆抗体或羊抗兔抗体，混匀后室温反应0.5～2h；

d、加入5％～25％的BSA溶液混匀，室温反应0.5～2h后，8000～15000rpm离心5～30min，去除上清液分离得到沉淀物用微球复溶液液复溶，2～8℃保存。

所述的孕酮和β-hCG的二联层析检测卡的制备方法，包括以下步骤：在PVC底板上依次粘贴处理过的样品垫和NC膜以及吸水纸，然后切割成2～5mm宽度的若干试纸条。

所述的孕酮和β-hCG的二联层析检测卡的检测方法，包括对孕酮和β-hCG检测，具体包括以下步骤：

步骤S1、线性、检测限验证；

步骤S2、重复性验证；

步骤S3、准确度验证；

步骤S4、线性范围的验证；

步骤S5、相关性验证。

采用了上述技术方案，本发明具有如下技术效：本发明通过使用量子点微球技术解决了普通荧光检测技术存在的易光漂白和光解的缺陷，将孕酮和β-hCG进行联检，确保灵敏度和准确度的同时，更加方便快捷。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：

图1为孕酮信号值与浓度值线性曲线图。

图2为β-hCG信号值与浓度值线性曲线图。

图3为孕酮线性范围图。

图4为β-hCG线性范围图

图5为孕酮相关性线性示意图。

图6为β-hCG相关性线性示意图。

具体实施方式

(实施例1)

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。

本发明提供了一种孕酮和β-hCG的二联层析检测卡，包括检测壳和装载于检测壳内的试纸条，试纸条包括：底板、样品垫、NC膜和吸水纸，底板的相对两端分别覆盖样品垫和吸水纸，中间覆盖NC膜，样品垫和吸水纸靠近NC膜的一侧均搭接在NC膜两边沿上，NC膜上由样品垫方向向吸水纸方向依次设有平行的第一检测线、第二检测线和质控线。

NC膜的制备方法为：首先分别将孕酮单克隆包被抗体、β-hCG单克隆包被抗体以及所述羊抗兔抗体用包被液调节浓度为0.1～1mg/mL，然后将孕酮单克隆抗体喷到NC膜的第一检测线，将β-hCG单克隆包被抗体喷到NC膜的第二检测线，将羊抗兔抗体喷到NC膜的质控线，检测线和质控线间隔3～8mm，最后将处理后的NC膜置于湿度＜30％、温度为30～60℃的烘箱，干燥18～72h后于2～30℃密封保存，备用。

优选的，分别将孕酮单克隆包被抗体、β-hCG单克隆包被抗体以及所述羊抗兔抗体用包被液调节浓度为0.5mg/mL、1.0mg/mL、0.8mg/mL，将孕酮单克隆抗体喷到NC膜的检测线1，将β-hCG单克隆包被抗体喷到NC膜的检测线2，将羊抗兔抗体喷到NC膜的质控线，检测线和质控线间隔3～8mm，置于湿度＜30％、温度为30～60℃的烘箱，干燥18～72h后于2～30℃密封保存，备用。

样品垫的制备包括以下步骤：

步骤一、样品垫用缓冲液浸泡后，置于湿度＜30％、温度为30～60℃的烘箱，干燥18～48h后于2～30℃密封保存，其中缓冲液包含10mM～200mM的PB缓冲液、0.2％～10％的BSA，0.2％～10％的蔗糖和0.05mg/mL～1.5mg/mL的RBC抗体。

优选的，将样品垫用缓冲液浸泡后，置于湿度＜30％、温度为45℃的烘箱，干燥48h后于2～30℃密封保存，所述缓冲液含50mM的PB缓冲液，5％的BSA，5％的蔗糖，0.1mg/mL的RBC抗体。

步骤二、将量子点荧光微球标记的孕酮及β-hCG单克隆抗体和量子点荧光微球标记的兔IgG抗体分别用标记处理液喷涂在干燥后的样品垫上，喷量为2～8ul/cm；标记处理液中含有0.5％～5％的BSA，5％～25％的蔗糖，10mM～100mM的Tris缓冲液。

优选的，将量子点荧光微球标记的孕酮及β-hCG单克隆抗体和量子点荧光微球标记的兔IgG抗体分别用标记处理液喷涂在样品垫上，喷量为5ul/cm；标记处理液中含有2％的BSA，10％的蔗糖，50mM的Tris缓冲液。

其中，量子点荧光微球标记的孕酮、β-hCG单克隆抗体及兔IgG抗体制备方式相同，制备步骤如下：

优选的，将制备好的样品垫置于湿度＜30％、温度为45℃的烘箱，干燥48h后于2～30℃密封保存。

将上述处理好的NC膜和样品垫以及吸水纸在PVC底板上依次粘贴，然后切割成2～5mm宽度的若干试纸条，放入检测壳内即可使用。

进一步的，该检测卡对孕酮和β-hCG检测，具体包括以下步骤：

步骤S1、线性、检测限验证。

取孕酮抗原用牛血清稀释至浓度为40ng/mL、30ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL的样本进行检测，用信号值与浓度值做线性关系，得出工作曲线如图1所示，线性的相关系数R2≥0.99，用样品稀释液作为空白样本进行检测，得出空白限≤0.7ng/mL，各浓度的检测变异系数均＜10％。

取β-hCG抗原用牛血清稀释至浓度为35000mIU/mL、20000mIU/mL、10000mIU/mL、5000mIU/mL、2500mIU/mL、1000mIU/mL、500mIU/mL、100mIU/mL、20mIU/mL、10mIU/mL、5mIU/mL、2.5mIU/mL的样本进行检测，用信号值与浓度值做线性关系，得出工作曲线如图2所示，线性的相关系数R2≥0.99；用样品稀释液作为空白样本进行检测，得出空白限≤4mIU/mL，各浓度的检测变异系数均＜10％。

上述样品稀释液包含0.5％～5％氯化钠、0.1％～6％表面活性剂、0.01％～1％防腐剂的10～100mM、pH7.0～8.0Tris缓冲液。

优选的，样品稀释液包含0.8％氯化钠、2％表面活性剂、0.05％防腐剂的50mM、pH8.0Tris缓冲液。

步骤S2、重复性验证；

取浓度为35ng/mL、8ng/mL孕酮样本进行检测，用同一批次试剂卡平行测定20次，测试结果如表1所示，计算20次测量结果的平均值M和标准差SD，根据公式得出变异系数CV，结果均＜15％。

CV＝SD/M×100％

式中：

CV—变异系数；

SD—20次测量结果的标准差；

M—20次测量结果的平均值。

表1

取浓度为18000mIU/mL、2000mIU/mLβ-hCG样本进行检测，用同一批次试剂卡平行测定20次，测定结果如表2所示，计算20次测量结果的平均值M和标准差SD，根据公式得出变异系数CV，结果均＜15％。

CV＝SD/M×100％

式中：

CV—变异系数；

SD—20次测量结果的标准差；

M—20次测量结果的平均值。

表2

步骤S3、准确度验证；

在人源样本(C0)中加入一定体积的高值纯品孕酮样本(Cs)(高值样本和人源样本的体积比1:9)，人源样本加入高值样本后的检测浓度为(C)，分别测量样本C0和C,各测试3次后计算平均值，按公式计算回收率，结果R值在85％-115％范围内。

式中：R-回收率；

V-加入待测物标准液的体积；

V0-基础样本的体积

C-样本加入待测标准物质后的检测浓度；

C0-基础样本的检测浓度；

Cs-待测物标准液的浓度。

表3

用国家参考物质对β-hCG试剂进行测试，重复检测3次，取测试结果记为(Xi)，按公式计算相对偏差(Bi)，测试结果如表4所示，相对偏差≤15％。

Bi＝(Xi－T)/T

式中：Xi—单次测试结果；

T—有证参考物质标示值或各浓度人源样本定值；

Bi—单次相对偏差。

检测值1	检测值2	检测值3
			450.65	495.98	504.76
相对偏差1	相对偏差2	相对偏差3
			-6.1％	3.3％	5.2％

表4

步骤S4、线性范围的验证；

用接近线性范围上限的高浓度样品和接近线性范围下限的低浓度样品或稀释液，混合成至少5个稀释浓度(xi)，每一浓度样本重复检测孕酮3次，计算平均值(yi)，取其测定浓度值(yi)与对应的理论浓度值(xi)进行回归分析，求出线性回归方程，按公式计算线性相关系数r，孕酮线性范围的验证结果关系如图3所示，线性的相关系数r≥0.99。

用接近线性范围上限的高浓度样品和接近线性范围下限的低浓度样品或稀释液，混合成至少5个稀释浓度(xi)，每一浓度样本重复检测β-hCG3次，计算平均值(yi)，取其测定浓度值(yi)与对应的理论浓度值(xi)进行回归分析，求出线性回归方程，按公式计算线性相关系数R，β-hCG线性范围的验证结果关系如图4所示，线性的相关系数R≥0.99。

步骤S5、相关性验证。

选取150份不同浓度的临床样本，同一份样本分别取全血、血清和血浆样本进行孕酮检测，孕酮相关性如图5所示，与Beckman检测结果相关性较好，R＞0.98，且血清全血一致性也较好，具体检测数据结果如表5所示。

表5

选取150份不同浓度的临床样本，同一份样本分别取全血、血清和血浆样本进行β-hCG检测，β-hCG相关性如图6所示，与强生检测结果相关性较好，R＞0.98，且血清全血一致性也较好，具体检测数据结果如表6所示。

表6

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种孕酮和β-hCG的二联层析检测卡，其特征在于，包括检测壳和装载于检测壳内的试纸条；

所述试纸条包括：底板、样品垫、NC膜和吸水纸；

所述底板的相对两端分别覆盖样品垫和吸水纸，中间覆盖NC膜；

所述样品垫和吸水纸靠近NC膜的一侧均搭接在NC膜两边沿上；

所述NC膜上由样品垫方向向吸水纸方向依次设有平行的第一检测线、第二检测线和质控线；

所述第一检测线为孕酮单克隆抗体，第二检测线为β-hCG单克隆包被抗体，质控线为羊抗兔抗体。

2.根据权利要求1所述的孕酮和β-hCG的二联层析检测卡，其特征在于，所述NC膜制备方法包括：分别将孕酮单克隆包被抗体、β-hCG单克隆包被抗体以及所述羊抗兔抗体用包被液调节浓度为0.1～1mg/mL，将孕酮单克隆抗体喷到NC膜的第一检测线，将β-hCG单克隆包被抗体喷到NC膜的第二检测线，将羊抗兔抗体喷到NC膜的质控线，检测线和质控线间隔3～8mm，置于恒温恒湿烘箱，干燥恒温密封保存，备用。

3.根据权利要求1所述的孕酮和β-hCG的二联层析检测卡，其特征在于，所述烘箱湿度＜30％、温度为30～60℃，干燥18～72h后于2～30℃密封保存，备用。

4.根据权利要求1所述的一种孕酮和β-hCG的二联层析检测卡，其特征在于，所述样品垫需进行处理，处理步骤如下：

5.根据权利要求4所述的孕酮和β-hCG的二联层析检测卡，其特征在于，所述步骤一中缓冲液包含10mM～200mM的PB缓冲液，0.2％～10％的BSA，0.2％～10％的蔗糖，0.05mg/mL～1.5mg/mL的RBC抗体。

6.根据权利要求4所述的孕酮和β-hCG的二联层析检测卡，其特征在于，所述步骤一控制烘箱湿度＜30％、温度为30～60℃，干燥18～48h后于2～30℃密封保存。

7.根据权利要求4所述的一种孕酮和β-hCG的二联层析检测卡，其特征在于，所述步骤二中量子点荧光微球标记的孕酮、β-hCG单克隆抗体及兔IgG抗体制备方式相同，制备步骤如下：

8.权利要求1-7任一项所述的孕酮和β-hCG的二联层析检测卡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在PVC底板上依次粘贴处理过的样品垫和NC膜以及吸水纸，然后切割成2～5mm宽度的若干试纸条。

9.权利要求1-7任一项所述的孕酮和β-hCG的二联层析检测卡的检测方法，其特征在于，包括对孕酮和β-hCG检测，具体包括以下步骤：

步骤S1、线性、检测限验证；

步骤S2、重复性验证；

步骤S3、准确度验证；

步骤S4、线性范围的验证；

步骤S5、相关性验证。