CN108398566A

CN108398566A - 一种基于量子点微球的荧光免疫层析检测卡及其制备方法

Info

Publication number: CN108398566A
Application number: CN201810189415.6A
Authority: CN
Inventors: 李婧; 徐琳; 王锐
Original assignee: Jiangsu Ruian Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Yunao Biotechnology (Changzhou) Co., Ltd
Priority date: 2018-03-08
Filing date: 2018-03-08
Publication date: 2018-08-14

Abstract

本发明涉及一种基于量子点微球的荧光免疫层析检测卡及其制备方法，所述基于量子点微球的荧光免疫层析检测卡包括：检测壳和装载于该检测壳内的试纸条；其中所述试纸条包括：底板，该底板的相对两端分别覆盖样品垫和吸水纸以及该底板的中间覆盖NC膜；其中所述样品垫和吸水纸靠近NC膜的一侧均搭接在NC膜两边沿上；所述NC膜上设置有互不相交的质控线和检测线；以及样品垫上包被有量子点荧光微球标记的兔抗及AMH单克隆抗体；本发明的基于量子点微球的荧光免疫层析检测卡及其制备方法灵敏度高、操作简便、价格低廉，且适于应用广泛。

Description

一种基于量子点微球的荧光免疫层析检测卡及其制备方法

技术领域

本发明属于免疫诊断技术领域，具体涉及一种基于量子点微球的荧光免疫层析检测卡及其制备方法。

背景技术

抗苗勒管激素(anti－Mullerian hormone，AMH)是一种二聚体糖蛋白，最初发现AMH是由睾丸支持细胞产生的，其生理功能是抑制雄性苗勒管的发育，参与睾丸的分化和发育。人类AMH是由两个相同的70×103Da亚基组成的二聚糖蛋白，相对分子质量为140×103Da，属蛋白质激素转化生长因子B(TGF－β)超家族成员之一。AMH基因定位于第19号染色体短臂(19p13.3)，大小2.4－2.8kb，含有5个外显子，编码560个氨基酸的蛋白前体，其羧基端为活性作用端。在男性，一旦睾丸形成，其间质细胞就开始表达AMH。而在女性，需至孕36ws，胎儿卵巢颗粒细胞才开始分泌AMH。在雄性胎儿的性分化过程中，AMH可以抑制苗勒管的发育。在雌性体内，AMH抑制始基卵泡向初级卵泡的转化，维持始基卵泡持续处于静止状态。

健康女性AMH与年龄成负相关作用，如表1：

表1健康女性参考值

健康男性AMH与年龄的相关作用，如表2：

表2健康男性参考值

年龄(岁)	20～60	＞60
			AMH值(ng/mL)	1.45～18.77	0.34～9.38

在过去十几年，医学工作者对AMH进行了大量的研究，发现AMH值可以准确地反映卵巢卵泡储备水平，具体数据如表3，随着研究的深入，人们发现，AMH不仅仅只是一个预测卵巢储备能力的指标，在临床中还有许多应用。

表3 AMH与卵巢相关疾病

近年来随着辅助生殖技术的迅速发展，AMH在该领域的应用也越来越广泛。在体外受精前对患者进行卵巢储备功能和卵巢刺激反应性进行准确评估，制定理想的促排卵方案，在一定程度上可以提高受精卵的数量、胚胎质量和活产率，具体数据如表4。AMH不仅是预测卵巢储备功能的指标,而且是卵巢反应性的重要标志物。此外，AMH水平还可以用来研究和评价体外受精结局。

表4 AMH预测卵巢反应性

AMH不仅调控生殖器官的性别分化，而且是卵巢颗粒细胞肿瘤诊断的重要指标，研究表明AMH对卵巢癌等肿瘤的生长和转移具有显著的抑制作用，AMH在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。MacLaughlin等认为AMH促进了已知抗癌药物的活性，对表达AMH受体的肿瘤具有高度特异性，且能够抑制耐药肿瘤的增殖，对人体则未见毒性，是卵巢癌和其它癌症潜在的治疗剂。

因此，AMH在临床应用的前景十分广阔，是预测卵巢储备和卵巢反应性的可靠指标，在辅助生殖过程中，准确评价卵巢储备功能，进一步预测卵巢的反应性，可以指导临床医生选择恰当的促排卵用药方案，使患者减少不必要的损失，AMH仍是今后研究的重点，而结合其它指标预测卵巢储备功能和卵巢的反应性将是未来进一步研究的热点。

目前临床上AMH的检测方法有酶联免疫(Elisa)、化学发光法等。这些方法都存在着各自的优点和不足。Elisa法检测步骤较繁琐、耗时长，操作过程中存在较多的影响因素，易造成假阳性和假阴性结果。因此目前逐步被化学发光法替代，但是这类方法为全封闭系统，价格昂贵，需要专门培训仪器使用人员，维修及检测成本高，并且不适合单人份和小批量检测用，因而不利于在国内进行AMH检测的广泛开展。

而荧光层析免疫分析方法是近年来发展起来的一种微量分析方法，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量分析，具有灵敏度高、选择性强、样本量需求少和操作简便等优点。但目前绝大多数的荧光免疫层析技术产品主要是基于胶体金技术而开发的，该技术由于存在颗粒粒径均一性差、免疫标记物不稳定、无法实现准确定量检测、灵敏度低等不足，无法满足人们的需求。因此开发高灵敏度、多指标同时检测、简便、直观、价格低廉的免疫层析检测方法十分必要。

近年来，基于量子点(quantum dots，QDs)的免疫荧光检测技术在生物医学领域得到了一定的应用。量子点粒径不同，发光颜色不同，并且可以用单一光源激发多种不同颜色的量子点，其发射谱狭窄对称，同时激发的多种量子点不易出现重叠，因此能够对多重分子实现同时检测。同时量子点的产率高、荧光强，光化学稳定性好，不易猝灭，可以接受长时间反复激发。因此，量子点具有成为分子检测和医学诊断的先天条件，经过近20多年的发展，逐步从细胞及组织标记成像、细胞示踪、活体成像等应用研究开始向临床检测、疾病控制、食品安全检测等领域发展。

目前，市场上AMH的检测方法绝大部分为酶联免疫(Elisa)、化学发光(CLIA)，仅有深圳亚辉龙生物一家能提供免疫荧光层析试剂盒。该试剂盒采用普通荧光微球标记，较量子点荧光微球标记而言，存在稳定性差，灵敏度低、荧光强度弱且检测时间较长等问题。本专利提供的AMH检测试剂卡在提高AMH检测灵敏度的同时又将检测时间缩短，更适用于各医疗机构广泛开展。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于量子点微球的荧光免疫层析检测卡及其制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于量子点微球的荧光免疫层析检测卡，包括：检测壳和装载于该检测壳内的试纸条；其中所述试纸条包括：底板，该底板的相对两端分别覆盖样品垫和吸水纸以及该底板的中间覆盖NC膜；所述样品垫和吸水纸靠近NC膜的一侧均搭接在NC膜两边沿上；以及所述NC膜上设置有互不相交的质控线和检测线。

又一方面，本发明还提供了一种基于量子点微球检测AMH的荧光免疫层析检测卡的制备方法，包括：

步骤S1，制备量子点荧光微球标记抗体；

步骤S2，对样品垫进行预处理；

步骤S3，对样品垫进行处理；

步骤S4，NC膜的制备；

步骤S5，制备样品稀释液；以及

步骤S6，制备试纸条，并将试纸条装载于一检测壳内，以得到基于量子点微球检测AMH的荧光免疫层析检测卡。

进一步，所述步骤S1中制备量子点荧光微球标记蛋白液的方法包括：取量子点荧光微球，用10～100mM、pH 6.0～7.0MES缓冲液调节浓度为10mM～200mM，混匀后加入终浓度为50mM～200mM的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)及终浓度为50mM～200mM的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)混匀，室温孵育10～30min后10000～15000rpm离心5～50min，去除上清液分离得到沉淀物，用10～100mM、pH 6.0～7.0MES缓冲液溶解，将复溶后的量子点荧光微球超声分散，按照0.3～1mg/mL量子点荧光微球的比例加入AMH单克隆抗体，混匀后室温反应1～3h，然后加入10％～20％的BSA溶液混匀，室温反应0.5～1h后，10000～15000rpm离心5～20min，去除上清液分离得到沉淀物用微球复溶液液复溶，2～8℃保存。

进一步，所述步骤S2中对样品垫进行预处理的方法包括：将样品垫用缓冲液浸泡后，置于湿度＜20％、温度为30～50℃的烘箱，干燥12～24h后于2～30℃密封保存，所述缓冲液含10mM～100mM的Tris，0.5％～5％的BSA，0.5％～5％的蔗糖，0.05mg/mL～1.5mg/mL的RBC抗体。

进一步，所述步骤S3中对样品垫进行处理的方法包括：将量子点荧光微球标记的AMH单克隆抗体和量子点荧光微球标记的兔抗分别用标记处理液喷涂在样品垫上，喷量为3～6ul/cm；所述标记处理液中含有0.5％～5％的BSA，5％～25％的蔗糖，10mM～100mM的Tris缓冲液；将制备好的样品垫置于湿度＜20％、温度为30～50℃的烘箱，干燥12～24h后于2～30℃密封保存。

进一步，所述步骤S4中NC膜的制备方法包括：分别将另一AMH单克隆抗体以及所述羊抗兔抗体用包被液调节浓度为0.5～2mg/mL，将AMH单克隆抗体喷到NC膜的检测线，将羊抗兔抗体喷到NC膜的质控线，检测线和质控线间隔3～8mm，置于湿度＜20％、温度为30～50℃的烘箱，干燥12～72h后于2～30℃密封保存，备用。

进一步，所述步骤S5中制备样品稀释液的方法包括：所述样品稀释液包含0.5％～5％氯化钠、0.5％～5％表面活性剂、0.5％～5％BSA、0.01％～1％防腐剂的10～100mM、pH7.0～8.0PBS缓冲液。

进一步，所述步骤S6中制备试纸条，并将试纸条装载于一检测壳内，以得到基于量子点微球检测AMH的荧光免疫层析检测卡的方法包括：所述试纸条如权利要求1所述，即在一PVC底板上相互搭接粘贴样品垫、NC膜和吸水纸，然后切割成3～4mm宽度的若干试纸条。

本发明的有益效果是，本发明的基于量子点微球检测AMH的荧光免疫层析检测卡及其制备方法灵敏度高、操作简便、价格低廉，且适于应用广泛。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是本发明的基于量子点微球检测AMH的荧光免疫层析检测卡中试纸条的结构示意图；

图2是本发明的基于量子点微球检测AMH的荧光免疫层析检测卡的结构示意图；

图3是采用本发明的基于量子点微球检测AMH的荧光免疫层析检测卡进行定量检测样本中AMH浓度的线性、检测限和精密度的验证结果关系图；

图4是采用本发明的基于量子点微球检测AMH的荧光免疫层析检测卡进行定量检测样本中AMH浓度的线性范围的验证结果关系图。

其中：

底板1、样品垫2、NC膜3、检测线31、质控线32、吸水纸4、检测壳5、加样孔6、防滑区7。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细阐述。

以下对本发明的实施例作详细说明：本实施例以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程。下列实施例中未注明的具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1

图2是本发明的基于量子点微球检测AMH的荧光免疫层析检测卡的结构示意图。

如图1和图2所述，本实施例1提供了一种基于量子点微球检测AMH的荧光免疫层析检测卡，包括：检测壳5和装载于该检测壳5内的试纸条；其中所述试纸条包括：底板1，该底板1的相对两端分别覆盖样品垫2和吸水纸4以及该底板1的中间覆盖NC膜3；其中所述样品垫2和吸水纸4靠近NC膜3的一侧均搭接在NC膜3两边沿上；以及所述NC膜3上设置有互不相交的质控线32和检测线31。

具体的，所述检测壳5的表面设有加样孔6和防滑区7，待检测样本适于从所述加样孔6注入到试纸条上；通过所述防滑区7，便于操作人员拿取所述基于量子点微球检测AMH的荧光免疫层析检测卡。

实施例2

在实施例1的基础上，本实施例2提供了一种基于量子点微球检测AMH的荧光免疫层析检测卡的制备方法，包括如下步骤：

步骤S1，制备量子点荧光微球标记抗体；

步骤S2，对样品垫进行预处理；

步骤S3，对样品垫进行处理；

步骤S4，NC膜的制备；

步骤S5，制备样品稀释液；以及

所述步骤S1中制备量子点荧光微球标记蛋白液的方法包括：取量子点荧光微球，用10～100mM、pH 6.0～7.0MES缓冲液调节浓度为10mM～200mM，混匀后加入终浓度为50mM～200mM的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)及终浓度为50mM～200mM的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)混匀，室温孵育10～30min后10000～15000rpm离心5～50min，去除上清液分离得到沉淀物，用10～100mM、pH 6.0～7.0MES缓冲液溶解，将复溶后的量子点荧光微球超声分散，按照0.3～1mg/mL量子点荧光微球的比例加入AMH单克隆抗体，混匀后室温反应1～3h，然后加入10％～20％的BSA溶液混匀，室温反应0.5～1h后，10000～15000rpm离心5～20min，去除上清液分离得到沉淀物用微球复溶液液复溶，2～8℃保存。

优选的，取量子点荧光微球，用40mM、pH 6.5MES缓冲液调节浓度为20mM，混匀后加入终浓度为50mM的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)及终浓度为50mM的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)混匀，室温孵育20min后13000rpm离心30min，去除上清液分离得到沉淀物，用30mM、pH6.5MES缓冲液溶解，将复溶后的量子点荧光微球超声分散，按照0.5mg/mL量子点荧光微球的比例加入AMH单克隆抗体，混匀后室温反应2h，然后加入15％的BSA溶液混匀，室温反应0.5h后，15000rpm离心15min，去除上清液分离得到沉淀物用微球复溶液液复溶，2～8℃保存。

所述步骤S2中对样品垫进行预处理的方法包括：将样品垫用缓冲液浸泡后，置于湿度＜20％、温度为30～50℃的烘箱，干燥12～24h后于2～30℃密封保存，所述缓冲液含10mM～100mM的Tris，0.5％～5％的BSA，0.5％～5％的蔗糖，0.05mg/mL～1.5mg/mL的RBC抗体。

优选的，将样品垫用缓冲液浸泡后，置于湿度＜20％、温度为37℃的烘箱，干燥18h后于4～8℃密封保存，所述缓冲液含50mM的Tris，1％的BSA，1％的蔗糖，1.5mg/mL的RBC抗体。

所述步骤S3中对样品垫进行处理的方法包括：将量子点荧光微球标记的AMH单克隆抗体和量子点荧光微球标记的兔抗分别用标记处理液喷涂在样品垫上，喷量为3～6ul/cm；所述标记处理液中含有0.5％～5％的BSA，5％～25％的蔗糖，10mM～100mM的Tris缓冲液；将制备好的样品垫置于湿度＜20％、温度为30～50℃的烘箱，干燥12～24h后于2～30℃密封保存。

优选的，将量子点荧光微球标记的AMH单克隆抗体和量子点荧光微球标记的兔抗分别用标记处理液喷涂在样品垫上，喷量为5ul/cm；所述标记处理液中含有1％的BSA，5％的蔗糖，20mM的Tris缓冲液；将制备好的样品垫置于湿度＜20％、温度为37℃的烘箱，干燥124h后于4～8℃密封保存。

所述步骤S4中NC膜的制备方法包括：分别将另一AMH单克隆抗体以及所述羊抗兔抗体用包被液调节浓度为0.5～2mg/mL，将AMH单克隆抗体喷到NC膜的检测线，将羊抗兔抗体喷到NC膜的质控线，检测线和质控线间隔3～8mm，置于湿度＜20％、温度为30～50℃的烘箱，干燥12～72h后于2～30℃密封保存，备用。

优选的，分别将AMH单克隆抗体以及羊抗兔抗体用包被液调节浓度为0.8mg/mL，将AMH单克隆抗体喷到NC膜的检测线，将羊抗兔抗体喷到NC膜的质控线，检测线和质控线间隔5mm，湿度＜20％、温度为37℃的烘箱，干燥24h后于4～8℃密封保存，备用。

所述步骤S5中制备样品稀释液的方法包括：所述样品稀释液包含0.5％～5％氯化钠、0.5％～5％表面活性剂、0.5％～5％BSA、0.01％～1％防腐剂的10～100mM、pH7.0～8.0PBS缓冲液。

优选的，配制的样品稀释液包含0.9％氯化钠、2％表面活性剂、1％BSA、0.01％防腐剂的30mM、pH7.5PBS缓冲液。

所述步骤S6中制备试纸条，并将试纸条装载于一检测壳内，以得到基于量子点微球检测AMH的荧光免疫层析检测卡的方法包括：所述试纸条如权利要求1所述，即在一PVC底板上相互搭接粘贴样品垫、NC膜和吸水纸，然后切割成3～4mm宽度的若干试纸条。

进一步，采用如实施例1所述的基于量子点微球检测AMH的荧光免疫层析检测卡进行定量检测样本中抗缪勒氏管激素(AMH)的浓度的方法如下：

样本检测

1)线性、检测限和精密度的验证

将AMH抗原用阴性血清稀释成20ng/mL、15ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.3125ng/mL、0.15625ng/mL、0ng/mL的待测样品，取50ul待测样品加入100ul样品稀释液中，混匀后取100ul加到加样孔中，10min后用荧光检测仪检测。结果表明，线性的相关系数R²≥0.99，检测限为0.2ng/mL，各浓度的检测变异系数均＜10％；其中线性、检测限和精密度的验证结果关系图参照图3所示。

2)线性范围的验证

用低值人血清和高值人血清配制浓度为20ng/mL、15ng/mL、10ng/mL、5ng/mL和1ng/mL的AMH人血清待测样品，每个样品重复4次，结果表明R²≥0.99，最高检测范围达到20ng/mL；其中线性范围的验证结果关系图参照图4所示。

3)准确度的验证

用AMH浓度为5ng/mL的人血清样本作为基础样本，加入相同体积不同浓度的AMH人血清，配制成浓度不同的AMH人血清样品，再用另一份样本加入相同体积的阴性人血清，加入体积小于原体积的10％，对回收样本和基础样本重复4次检测，并进行计算，结果表明，回收率在90％～110％范围内。如表5：

表5准确度的验证

4)临床样本的检测及数据分析

用如实施例1所述的试纸条检测年龄小于30岁健康女性及PCOS病人AMH(150例以上，表中显示部分结果)，检测数据结果如表6：

表6年龄小于30岁健康女性AMH检测结果

表7 PCOS病人AMH检测结果

根据健康女性(＜30岁)检测值，计算出平均值，标准偏差，Cut-off值。由于健康女性(＜30岁)检测值近似服从正态分布，故可按正态分布法处理。又因为血清AMH值过高或过低均属于异常，所以应计算双侧参考值范围，具体见表8：

表8

根据表7所检测的PCOS病人AMH值可以看出，实验中PCOS病人样本共计50份，罗氏电化学发光法检测阳性样本共计50份，用如实施例1所述的试纸条进行检测的检测结果阳性样本共计48份，阳性符合率高达96％。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims

1.一种基于量子点微球检测AMH的荧光免疫层析检测卡，其特征在于，包括：

检测壳和装载于该检测壳内的试纸条；其中

所述试纸条包括：

底板，该底板的相对两端分别覆盖样品垫和吸水纸以及该底板的中间覆盖NC膜；

所述样品垫和吸水纸靠近NC膜的一侧均搭接在NC膜两边沿上；以及

所述NC膜上设置有互不相交的质控线和检测线。

2.一种基于量子点微球检测AMH的荧光免疫层析检测卡的制备方法，其特征在于，包括：

步骤S1，制备量子点荧光微球标记抗体；

步骤S2，对样品垫进行预处理；

步骤S3，对样品垫进行处理；

步骤S4，NC膜的制备；

步骤S5，制备样品稀释液；以及

3.根据权利要2所述的基于量子点微球检测AMH的荧光免疫层析检测卡，其特征在于，

所述步骤S1中制备量子点荧光微球标记蛋白液的方法包括：

取量子点荧光微球，用10～100mM、pH 6.0～7.0 MES缓冲液调节浓度为10mM～200mM，混匀后加入终浓度为50mM～200mM的EDC（1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐）及终浓度为50mM～200mM的NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）混匀，室温孵育10～30min后10000～15000rpm离心5～50min，去除上清液分离得到沉淀物，用10～100mM、pH 6.0～7.0 MES缓冲液溶解，将复溶后的量子点荧光微球超声分散，按照0.3～1mg/mL量子点荧光微球的比例加入AMH单克隆抗体，混匀后室温反应1～3h，然后加入10%～20%的BSA溶液混匀，室温反应0.5～1h后，10000～15000rpm离心5～20min，去除上清液分离得到沉淀物用微球复溶液液复溶，2～8℃保存。

4.根据权利要3所述的基于量子点微球检测AMH的荧光免疫层析检测卡，其特征在于，

所述步骤S2中对样品垫进行预处理的方法包括：

将样品垫用缓冲液浸泡后，置于湿度＜20%、温度为30～50℃的烘箱，干燥12～24h后于2～30℃密封保存，所述缓冲液含10mM～100mM的Tris，0.5%～5%的BSA，0.5%～5%的蔗糖，0.05mg/mL～1.5mg/mL的RBC抗体。

5.根据权利要4所述的基于量子点微球检测AMH的荧光免疫层析检测卡，其特征在于，

所述步骤S3中对样品垫进行处理的方法包括：

将量子点荧光微球标记的AMH单克隆抗体和量子点荧光微球标记的兔抗分别用标记处理液喷涂在样品垫上，喷量为3～6ul/cm。

6.所述标记处理液中含有0.5%～5%的BSA，5%～25%的蔗糖，10mM～100mM的Tris缓冲液。

7.将制备好的样品垫置于湿度＜20%、温度为30～50℃的烘箱，干燥12～24h后于2～30℃密封保存。

8.根据权利要5所述的基于量子点微球检测AMH的荧光免疫层析检测卡，其特征在于，

所述步骤S4中NC膜的制备方法包括：

分别将另一AMH单克隆抗体以及所述羊抗兔抗体用包被液调节浓度为0.5～2mg/mL，将AMH单克隆抗体喷到NC膜的检测线，将羊抗兔抗体喷到NC膜的质控线，检测线和质控线间隔3～8mm，置于湿度＜20%、温度为30～50℃的烘箱，干燥12～72h后于2～30℃密封保存，备用。

9.根据权利要6所述的基于量子点微球检测AMH的荧光免疫层析检测卡，其特征在于，

所述步骤S5中制备样品稀释液的方法包括：

所述样品稀释液包含0.5%～5%氯化钠、0.5%～5%表面活性剂、0.5%～5%BSA、0.01%～1%防腐剂的10～100mM、pH7.0～8.0 PBS缓冲液。

10.根据权利要7所述的基于量子点微球检测AMH的荧光免疫层析检测卡，其特征在于，

所述步骤S6中制备试纸条，并将试纸条装载于一检测壳内，以得到基于量子点微球检测AMH的荧光免疫层析检测卡的方法包括：

所述试纸条如权利要求1所述，即

在一PVC底板上相互搭接粘贴样品垫、NC膜和吸水纸，然后切割成3～4mm宽度的若干试纸条。