CN112505321B - 一种抗体标记的载体的复溶液 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医疗检测领域，具体公开了一种抗体标记物复溶液，通过调整复溶液的配方，达到封闭NC膜所在位置，不需要提前划封闭线，只需一次划线便能实现标记物的固定，工艺简单，节约干燥时间且能显著的提高试剂卡精密度，对于临床检测具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及医疗检测领域，具体涉及种标记物固定于硝酸纤维素膜上的方法。
背景技术
目前常规的免疫层析试纸条由吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫组成。以双抗体夹心方法为例，标记的抗体放置于结合垫位置，硝酸纤维素膜上的检测线位置固定抗体，当含有待测物质的样本加入到试纸条上，在结合垫处会先与抗体标记物发生结合，随着层析作用，在液体流过检测线时，进一步与包被到硝酸纤维素膜上的抗体发生结合，形成抗体标记物-抗原-抗体的双抗夹心物。但结合垫的材质难以保证完全均一，会影响到试纸条测试的整体性能，导致精密度差。
而通过对上述检测试纸条进行改变，将结合垫中的抗体标记物包被到硝酸纤维素膜，可提高精密度，但制备上需要多道工序，封闭蛋白液先划于硝酸纤维素膜25℃干燥4h后再于同一位置上划标记物进行二次干燥，即进行两步划线的工序和干燥工艺，需要保证两次划线的位置一模一样，增加了工艺的难度，而每次划线都需要进行干燥后，才能进行检测，多一次划线就需要更长的干燥时间，增加了生产的时间成本。
发明内容
本发明提供一种标记物固定于硝酸纤维素膜上的方法，以解决上述工艺困难、干燥时间长的问题。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术手段：
本发明的一方面公开了一种抗体标记物复溶液，一种抗体标记的载体的复溶液，其特征在于，所述复溶液包括10～50mmol/L的缓冲液、5％～15％的糖类、1％～5％的蛋白、1％～18％的表面活性剂和0.01％～3％的水溶性聚合物。
优选地，所述载体为微球或胶体金，所述微球的复溶液包括10～50mmol/L的缓冲液、2％～5％的蛋白、6％-15％的表面活性剂、10％～15％的糖类、0.05％～0.1％的防腐剂和0.01％～0.1％的水溶性聚合物；所述胶体金的复溶液包括10～50mmol/L的缓冲液、1％-3％的蛋白、1％～5％的表面活性剂，5-10％的糖类和0.5％～3％的水溶性聚合物。
优选地，所述复溶液中蛋白和表面活性剂的比值为：0.1∶1～3∶1，更优选为：0.28∶1或0.4∶1。
优选地，所述的载体的复溶液包括10～50mmol/L的Tris缓冲液、5％～15％的蔗糖或海藻糖、1％～5％的酪蛋白、1％～18％的吐温和0.01％～3％的PVP40或PEG。
优选地，所述微球为荧光微球或彩色微球。
优选地，所述荧光微球的复溶液包括10％～15％的表面活性剂；所述彩色微球的复溶液中包括6％～10％的表面活性剂。
优选地，所述荧光微球的复溶液包括10～50mmol/L的缓冲液、2％～5％的蛋白、10～15％的表面活性剂、10％～15％的糖类、0.05％～0.1％的防腐剂和0.01％～0.1％的水溶性聚合物；所述彩色微球的复溶液包括：10～50mmol/L的缓冲液、2％～5％的蛋白、6％～10％的表面活性剂、10％～15％的糖类、0.05％～0.1％的防腐剂和0.01％～0.1％的水溶性聚合物。
优选地，所述荧光微球的复溶液包括10-50mmol/L的Tris缓冲液、2％～5％的酪蛋白、10-15％的Tween 20、10％～15％的蔗糖、0.05％～0.1％的Proclin300和0.01％～0.1％的PVP40。所述彩色微球的复溶液包括：10-50mmol/L的Tris缓冲液、2％～5％的酪蛋白、6％-10％的Tween 20、10％～15％的蔗糖、0.05％～0.1％的叠氮钠和0.01％～0.1％的PEG。
优选地，所述胶体金的复溶液为：10-50mmol/L的HEPES缓冲液、1％-3％的牛血清白蛋白、1％～5％的B66、5-10％的海藻糖和0.5％～3％的PVP40
所述缓冲液为MES缓冲液、MOPS缓冲液、MOPSO缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液，所述蛋白为牛血清白蛋白、酪蛋白钠或鱼明胶，所述表面活性剂为吐温、曲拉通、B66或Brij，所述水溶性聚合物为PEG或PVP，所述糖类为蔗糖或海藻糖，所述防腐剂为Proclin300或叠氮钠。
本发明发另一方面公开了一种标记物固定于硝酸纤维素膜(NC膜)上的方法，包括：
A：抗体标记物和上述任意一种复溶液混合；
B：将步骤A中的混合液划到NC膜上。
优选地，所述步骤B划线一次。根据复溶液配方的调整，只需要划线一次，不需要再划封闭线。
优选地，所述复溶液包括10～50mmol/L的缓冲液、5％～15％的糖类、1％～5％的蛋白、1％～18％的表面活性剂和0.01％～3％的水溶性聚合物。
优选地，所述载体为微球或胶体金，所述微球的复溶液包括10～50mmol/L的缓冲液、2％～5％的蛋白、6％-15％的表面活性剂、10％～15％的糖类、0.05％～0.1％的防腐剂和0.01％～0.1％的水溶性聚合物；所述胶体金的复溶液包括10-50mmol/L的缓冲液、1％-3％的蛋白、1％～5％的表面活性剂，5-10％的糖类和0.5％～3％的水溶性聚合物。
所述复溶液中蛋白和表面活性剂的比值为：0.1∶1～3∶1，更优选为：0.28∶1或0.4∶1。
更优选地，所述微球为荧光微球或彩色微球。
优选地，所述荧光微球的复溶液包括10～15％的表面活性剂；所述彩色微球的复溶液中包括6～10％的表面活性剂。
优选地，所述荧光微球的复溶液包括10～50mmol/L的缓冲液、2％～5％的蛋白、10～15％的表面活性剂、10％～15％的糖类、0.05％～0.1％的防腐剂和0.01％～0.1％的水溶性聚合物；所述彩色微球的复溶液包括：10～50mmol/L的缓冲液、2％～5％的蛋白、6％～10％的表面活性剂、10％～15％的糖类、0.05％～0.1％的防腐剂和0.01％～0.1％的水溶性聚合物。
所述缓冲液为MES缓冲液、MOPS缓冲液、MOPSO缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液，所述蛋白为牛血清白蛋白、酪蛋白钠或鱼明胶，所述表面活性剂为吐温、曲拉通、B66或Brij，所述水溶性聚合物为PEG或PVP，所述糖类为蔗糖或海藻糖，所述防腐剂为Proclin300或叠氮钠。
优选地，所述荧光微球的复溶液包括10-50mmol/L的Tris缓冲液、2％～5％的酪蛋白、10-15％的Tween 20、10％～15％的蔗糖、0.05％～0.1％的Proclin300和0.01％～0.1％的PVP40。所述彩色微球的复溶液包括：10-50mmol/L的Tris缓冲液、2％～5％的酪蛋白、6％-10％的Tween 20、10％～15％的蔗糖、0.05％～0.1％的叠氮钠和0.01％～0.1％的PEG。
优选地，所述胶体金的复溶液为：10-50mmol/L的HEPES缓冲液、1％-3％的牛血清白蛋白、1％～5％的B66、5-10％的海藻糖和0.5％～3％的PVP40。
所述缓冲液为MES缓冲液、MOPS缓冲液、MOPSO缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液，所述蛋白为牛血清白蛋白、酪蛋白钠或鱼明胶，所述表面活性剂为吐温、曲拉通、B66或Brij，所述水溶性聚合物为PEG或PVP，所述糖类为蔗糖或海藻糖。
上述蛋白也可以用肽类和氨基酸代替。
本发明中“％”表示：g/100mL。
本发明的有益效果：本发明将抗体标记物直接划在硝酸纤维素膜上，通过标记物复溶液配方的调整，达到封闭NC膜所在位置，降低NC膜对标记物本身的吸附作用，同时保障标记物在NC膜上的释放层析状态，从试剂性能上标记物固定在NC上提高精密度的同时，制备工艺上更加简化，干燥时间更短。
附图说明
图1是检测试剂卡示意图。
图中标号分别表示：
1-检测线、2-质控线、3-标记物划线、4-样本垫、5-NC膜、6-吸水垫、7-背衬卡
具体实施例
本发明提供一种标记物固定于硝酸纤维素膜上的方法，在保证灵敏度的条件下解决无结合垫试纸条制备工艺困难、干燥时间长的问题。
本实施例以降钙素原(PCT)为例，具体说明本发明方法的实际应用
实施例所有检测均通过重庆中元生物技术有限公司的Q8 pro系列免疫定量分析仪读取信号
实施例1
PCT荧光微球检测试纸的制备及性能验证
(1)荧光-抗体复合物的制备
按60μgPCT单抗/300μg荧光微球的量将抗体加入荧光微球中，加入6μgEDC，常温搅拌反应120分钟，加入5％BSA，封闭搅拌60分钟，14000r/min离心20分钟，弃上清，沉淀以荧光抗体保存液恢复体积，4℃保存。
(2)荧光微球复溶液的制备
复溶液配方a：10mmol/L的PBS缓冲液、3％的酪蛋白、10％的Tw-80、10％的海藻糖、0.1％的PEG、0.1％的proclin-300。
按照配方配置复溶液，充分搅拌，放于2-8℃保存。
将步骤(1)中制备的荧光-抗体复合物重悬于复溶液中制成荧光微球复溶液。
(3)试纸条的组装
a、样品垫
本实施例所用样品垫为玻璃纤维膜，将样品垫剪成20*30cm每条
b、NC膜的处理
检测线的制备：将鼠抗人PCT单克隆抗体用10mmol/L PH7.2的PBS缓冲液稀释到0.5mg/mL的浓度，0.6μL/cm在离硝酸纤维素膜的右端合适处划线得到检测线。
质控线的制备：将羊抗鸡IgG抗体按0.5mg/mL的浓度，0.6μL/cm的硝酸纤维素膜在NC膜右端合适处划质控线，该线与检测线平行，并有一定间隔，干燥密封保存。
标记物划线：将荧光微球复合液划线于硝酸纤维素膜左端合适处，包被量为0.6μL/cm，干燥密封保存。
c、吸水纸的制备：吸水纸裁剪成2*0.1cm
d、组装
塑料底衬，样品垫和吸水纸为本领域通用的部件。将上述硝酸纤维素膜、吸水纸、样品垫按照图1所示粘贴在塑料底衬上，将贴好的中间物切成3.72mm宽度的试纸条。
(4)组装好的检测试纸精密度和灵敏度试验
检测方法：吸取60μl样本，滴加到检测卡的加样口上，将检测卡插入荧光免疫检测仪器，按仪器显屏上的标准检测。
精密度：批内精密度，取同一批的检测卡和缓冲液，用同一个已知浓度的血液平行检测10个检测卡，计算出CV＝2.27％。批间精密度，取3个批次的检测卡和缓冲液，用同一个已知浓度的血液平行检测10个检测卡，计算出CV＝3.44％。测试结果如表1和表2
表1批内精密度
表2批间精密度
灵敏度：如表3所示，保留两位有效数字，检测范围在0.1-200ng/mL，最小检出限＜0.1ng/mL。说明本发明的试剂卡具有良好的灵敏度。
表3灵敏度计算
实施例2：
本实施例与实施例1的区别在于，保留小数点后两位，复溶液配方不同，不在本发明调整的范围内，复溶液配方：
表4不同配方的荧光试剂卡批内精密度
实验结果表明，更改配方会影响划线的效果，从而影响检测精密度，其中蛋白和表面活性剂的改变对精密度影响最为明显，其他要素的改变影响相对较小。
实施例3
(1)胶体金-抗体复合物的制备
按30μg SAA单抗/1ml胶体金的量将抗体加入胶体金中，常温搅拌反应10分钟，加入5％BSA，封闭搅拌10分钟，12000r/min离心8分钟，弃上清，沉淀以胶体金保存液恢复体积，4℃保存。(2)SAA胶体金检测试纸的制备
复溶液配方：
10mmol/L的PBS缓冲液、2％的酪蛋白钠、2％的Tw-20，5％的海藻糖和1％的PVP40。
按照配方配置复溶液，充分搅拌，放于2-8℃保存。
将步骤(1)中制备的胶体金-抗体复合物重悬于复溶液中制成胶体金复溶液。
(3)试纸条的组装
标记物划线：将胶体金复合液划线于硝酸纤维素膜左端合适处，包被量为0.5μL/cm，干燥密封保存。
样品垫、吸水垫及组装过程同实施例1
NC膜制备过程中的检测线和质控线的划线与实施例1一样。
(5)组装好的检测试纸精密度和灵敏度试验
检测方法：吸取5μl样本与995ul样本稀释液混合，滴加80ul到检测卡的加样口上，将检测卡插入胶体金免疫检测仪器，按仪器显屏上的标准检测。
精密度：批内精密度，取同一批的检测卡和缓冲液，用同一个已知浓度的血液平行检测20个检测卡，计算出CV＝5.4％
实施例4
本实施例与实施例3的区别在于，复溶液配方不同，不在本发明调整的范围内，复溶液配方：
表4不同配方的胶体金试剂卡批内精密度
实验结果表明，更改配方会影响划线的效果，且对精密度会产生影响，其中蛋白和表面活性剂的改变最为明显，其他要素的改变影响相对较小。
综上所述，本发明的划线方法在保证精密度的前提下，实现了精密度高、操作简单的目的，而这一切是通过调整复溶液的配方实现的，因为良好的配方使得一次划线便能达到现有技术两次划线的效果，若更改配方会影响划线效果，从而影响检测精密度。不合理的配方很难一次划线就能达到效果。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (6)
1.一种抗体标记的载体的复溶液，其特征在于，
所述复溶液为10-50mmol/L的缓冲液、5％～15％的糖类、1％～5％的蛋白、1％～18％的表面活性剂和0.01％～3％的水溶性聚合物；
所述载体为微球或胶体金，所述微球的复溶液为10-50mmol/L的缓冲液、2％～5％的蛋白、6％-15％的表面活性剂、10％～15％的糖类、0.05％～0.1％的防腐剂和0.01％～0.1％的水溶性聚合物；所述胶体金的复溶液为10-50mmol/L的缓冲液、1％-3％的蛋白、1％～5％的表面活性剂、5-10％的糖类和0.5％～3％的水溶性聚合物；
所述蛋白为牛血清白蛋白、酪蛋白钠或鱼明胶，所述表面活性剂为吐温、曲拉通、B66或Brij。
2.如权利要求1所述的载体的复溶液，其特征在于，
所述复溶液中蛋白和表面活性剂的比值为：0.28：1或0.4：1。
3.如权利要求1或2所述的载体的复溶液，其特征在于，
所述缓冲液为MES缓冲液、MOPS缓冲液、MOPSO缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液，所述水溶性聚合物为PEG或PVP，所述糖类为蔗糖或海藻糖。
4.一种标记物固定于NC膜上的方法，其特征在于，
包括：
A：抗体标记的载体和复溶液混合；
B：将步骤A中的混合液划到NC膜上；
所述步骤B划线一次；
所述复溶液为10-50mmol/L的缓冲液、5％～15％的糖类、1％～5％的蛋白、1％～18％的表面活性剂和0.01％～3％的水溶性聚合物；
所述载体为微球或胶体金，所述微球的复溶液为10-50mmol/L的缓冲液、2％～5％的蛋白、6％-15％的表面活性剂、10％～15％的糖类、0.05％～0.1％的防腐剂和0.01％～0.1％的水溶性聚合物；所述胶体金的复溶液为10-50mmol/L的缓冲液、1％-3％的蛋白、1％～5％的表面活性剂、5-10％的糖类和0.5％～3％的水溶性聚合物；
所述蛋白为牛血清白蛋白、酪蛋白钠或鱼明胶，所述表面活性剂为吐温、曲拉通、B66或Brij。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，
所述复溶液中蛋白和表面活性剂的比值为：0.28：1或0.4：1。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，
所述缓冲液为MES缓冲液、MOPS缓冲液、MOPSO缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液，所述水溶性聚合物为PEG或PVP，所述糖类为蔗糖或海藻糖。
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