CN217033966U - 一种联合检测样品中catestatin和NT-proBNP的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本实用新型涉及一种联合检测样品中catestatin和NT‑proBNP的试剂盒。该试剂盒包括外盒、测试板、分析膜、结合膜、吸收膜。采用荧光免疫层析技术,在临床上用于同时检测catestatin和NT‑proBNP水平,为临床疾病的诊断、预后判断提供依据。
Description
技术领域
本实用新型涉及一种联合检测样品中catestatin和NT-proBNP的试剂盒。
背景技术
心力衰竭(heart failure,HF)是人类的主要死亡原因。美国有心力衰竭患者500多万,每年新发生55万,以每天1506例的速度递增。有效地降低心力衰竭的发病率和病死率一直是临床科学要实现的梦想。实现这一梦想的关键在于早期诊断、早期预防和早期干预。目前临床心力衰竭的诊断主要根据临床特点、超声心动图和生物标志物,尚无一种特异性高、易于检测的方法用于心力衰竭的早期诊断。因此各种不同类型的心力衰竭标志物的联合并行检测已成为必然,联合试剂盒的存在对于疾病的诊断至关重要。
儿茶酚胺抑素(Catestatin,CST)是一种具有心血管活性的多肽,来源于嗜铬蛋白A,由21个氨基酸构成。在动物试验及体外研究均证实:Catestatin通过自分泌的方式作用于神经元烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR),抑制儿茶酚胺释放,通过旁分泌的方式作用于G蛋白促进肥大细胞中组胺的释放。儿茶酚胺抑素可以抑制儿茶酚胺的释放,能够反应交感神经系统的活性。
脑利钠尿肽原(ProBNP)在心室扩张和容量负荷过重时分泌增多,于体内降解后产生含32个氨基酸的C端BNP,76个氨基酸的脑利钠尿肽原N端片段(NT-ProBNP)。BNP具有利钠利尿和扩张血管的生物活性,NT-ProBNP的半衰期教BNP约长15倍,且清除时间长。
Catestatin和NT-ProBNP对心血管疾病的发生发展均有一定的预测价值,但各有侧重点,有研究证实catestatin可以在心功能不全的早期阶段就出现水平的改变,这一变化出现早于NT-ProBNP,而NT-ProBNP被认为是能够指示临床心力衰竭,也就是心功能不全较为晚期阶段的最为敏感的指标。因此catestatin和NT-ProBNP的联合对于心力衰竭的诊断,尤其是早期诊断,显得尤为重要。目前还没有能够同时检测catestatin和NT-ProBNP的试剂盒,两个标志物分开检测需要两份血样,贻误患者诊治时间,因此急需一种联合试剂盒能够简便、快速的得到检测结果。我们拟建立一种联合检测样品中catestatin和NT-proBNP的试剂盒,从而更好的解决临床的需要。
发明内容
为了更好的在临床实现联合检测样品中catestatin和NT-proBNP的目的,本实用新型提供一种联合试剂盒,在临床上用于同时检测catestatin和NT-proBNP水平,为临床疾病的诊断、预后判断提供依据。
1.联合试剂盒检测原理
所有样本的检测均采用荧光免疫层析技术,该技术基于抗原抗体特异性免疫反应,以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相,测试液为流动相。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原,通常采用“三明治”型双抗夹心免疫层析方法,即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合,当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗夹心的“三明治”型。
2.试剂盒特征
1)一种联合检测样品中catestatin和NT-proBNP的试剂盒,其特征在于:该试剂盒包括外盒,所述外盒内包括:测试板、测试板上依次设置有分析膜、结合膜、吸收膜。
2)所述分析膜上有两条检测线和一条质控线,两条检测线分别是NT-proBNP检测线、catestatin 检测线。所述NT-proBNP检测线包被有NT-proBNP检测抗体、所述catestatin检测线包被有catestatin 检测抗体。
3)所述结合膜上有NT-proBNP抗体标记物,catestatin抗体标记物。
4)所述NT-proBNP检测抗体和NT-proBNP抗体标记物的NT-proBNP抗体具有不同的抗原结合位点;所述catestatin检测抗体和catestatin抗体标记物的catestatin抗体具有不同的抗原结合位点。
5)其中所检测样品是人的血液样品。
3.试剂盒组成
该试剂盒包括外盒(图1)。外盒内包括:测试板、测试板上依次设置有分析膜、结合膜、吸收膜。
本实用新型专利优选通过如下步骤制备而成:
第一步:抗体标记:
利用抗体标记技术,分别将NT-proBNP、catestatin抗体与标记物标记,形成抗体标记物复合物溶液或混悬液,抗体浓度为0.05mg/mL~5mg/L;
抗体标记技术采用抗体标记荧光微球:微球活化:向0.1~10mg/ml荧光微球中加入用10~ 100mM,pH 5.0~9.0MES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物)溶解的0.1~10mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和0.1~10mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺),活化10~600min,7000~15000 rpm离心5~30min,弃上清,沉淀用pH 5.0~9.0的10~100mM PBS重悬,得到0.1~10mg/ml 活化的荧光微球溶液;抗体偶联:将0.1~10.0mg NT-proBNP、catestatin标记抗体分别加入0.1~ 10mg/ml活化的荧光微球溶液中,室温混匀0.5~24h,7000~15000rpm离心5~30min,弃上清,沉淀用含0.5~50mg BSA(牛血清白蛋白)的10~100mM PBS(磷酸盐缓冲液)溶液封闭0.5~ 24h,搅拌混匀,7000~15000rpm离心5~30min,收集的沉淀保存于pH 6.0~8.0、0~100mM Tris 缓冲液中,得到NT-proBNP抗体标记荧光微球溶液、catestatin抗体标记荧光微球溶液。
第二步:分析膜制作:
分别将NT-proBNP检测抗体、catestatin检测抗体和质控线稀释至0.1~5mg/ml,在点膜仪上以0.25~4.0μL/cm的喷量喷涂在分析膜材上,形成NT-proBNP检测线、catestatin检测线和质控线,即为分析膜,干燥备用。
第三步:结合膜制作:
将步骤第一步中得到的NT-proBNP抗体标记物、catestatin抗体标记物按照体积比混合成抗体标记物混合液,NT-proBNP抗体标记物溶液的体积为0.5%~90%,catestatin抗体标记物溶液的体积为0.5%~90%;按照0.25~15μL/cm喷涂在结合膜材上,即为结合膜,干燥备用。
本发明的主要创新之处在于:
1.本试剂盒可以联合检测catestatin和NT-proBNP,同时得到NT-proBNP和catestatin 两个项目的检测结果,简化操作步骤,减少样本用量,节约时间和成本。
2.本试剂盒中的测试板,可以稳定分析膜、结合膜、吸收膜,减少运输过程损耗,提高试验准确性。
附图说明
附图1:试剂盒外形
附图2:患者catestatin和NT-proBNP水平
具体实施方式
该试剂盒包括外盒,所述外盒内包括:测试板、测试板上依次设置有分析膜、结合膜、吸收膜。
分析膜上有两条检测线和一条质控线,两条检测线分别是NT-proBNP检测线、catestatin检测线。所述NT-proBNP检测线包被有NT-proBNP检测抗体、所述catestatin检测线包被有catestatin检测抗体。结合膜上有NT-proBNP抗体标记物,catestatin抗体标记物。NT-proBNP检测抗体和 NT-proBNP抗体标记物的NT-proBNP抗体具有不同的抗原结合位点;所述catestatin检测抗体和 catestatin抗体标记物的catestatin抗体具有不同的抗原结合位点。本案的试剂条可用于血清、血浆、全血及末梢血的样本中NT-proBNP/catestatin定量检测,且无需对样本进行前处理,操作简便,方便快捷。将样本加入加样口,加入一定体积0~200μL样本稀释液(如0.09%NaCl),30min后通过配套仪器进行检测并自动计算,即可得到样本中NT-proBNP/catestatin的浓度。一份样本,一次加样,一次检测,同时得到NT-proBNP和catestatin两个项目的检测结果,简化操作步骤,减少样本用量,节约时间,节省成本。
应用该试剂盒测试样本,绘制NT-proBNP、catestatin的ROC曲线,见表1。由表1可知,联合检测的ROC曲线下面积更大,联合检测对心衰的诊断有更高的正确率。表1如下:
变量 | AUC | SE | 95%CI |
联合检测 | 0.916 | 0.0307 | 0.832-0.958 |
NT-proBNP | 0.896 | 0.0348 | 0.802-0.943 |
catestatin | 0.842 | 0.0354 | 0.801-0.927 |
本研究入选2017年7月至2018年9月间在北京大学第三医院心内科住院,符合入选标准并签署知情同意书的患者。以ACC/AHA心功能分期收集三组患者,各组患者性别构成、体重指数、血压、心率、病程无统计学差异,心血管疾病危险因素无统计学差异(P>0.05);但在心功能B期catestatin 水平下降,心功能C期NT-proBNP水平下降,提示catestatin和NT-proBNP的联合检测可以反应心功能的变化,见图2。
Claims (4)
1.一种联合检测样品中catestatin和NT-proBNP的试剂盒,其特征在于:该试剂盒包括外盒(1),所述外盒内包括:测试板(2)、测试板上依次设置有分析膜、结合膜、吸收膜,所述分析膜上有两条检测线和一条质控线,两条检测线分别是NT-proBNP检测线、catestatin检测线,所述NT-proBNP检测线包被有NT-proBNP检测抗体、所述catestatin检测线包被有catestatin检测抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述结合膜上有NT-proBNP抗体标记物,catestatin抗体标记物。
3.根据权利要求1中所述的试剂盒,其特征在于:所述NT-proBNP检测抗体和NT-proBNP抗体标记物的NT-proBNP抗体具有不同的抗原结合位点;所述catestatin检测抗体和catestatin抗体标记物的catestatin抗体具有不同的抗原结合位点。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其中所检测样品是人的血液样品。
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