WO2024038863A1 - 免疫分析方法及び試薬 - Google Patents

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ether
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surfactant
aqueous solution
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智代 柳田
研人 赤尾
隆明 神田
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デンカ株式会社
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
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    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/545—Synthetic resin

Definitions

  • the present invention relates to an immunoassay method, a reagent for the same, and a method using the reagent.
  • Immunoassay is applied to clinical tests as a method for quantifying antigenic substances or antibodies contained in body fluids such as serum, plasma, urine, and cerebrospinal fluid.
  • body fluids such as serum, plasma, urine, and cerebrospinal fluid.
  • methods adapted to automatic analyzers for biochemical tests are widely used. are doing.
  • high sensitivity has been achieved in immunoassay methods for clinical testing by using insoluble carriers, and measurement accuracy has significantly improved.
  • many reagents that enable highly sensitive measurements have been developed using techniques such as using two or more types of insoluble carrier particles with different particle sizes (see Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide an immunoassay method and a reagent for an immunoassay method that can suppress the influence of interfering substances and improve the accuracy of the immunoassay method.
  • the inventors of the present application have discovered that by adding at least one type of surfactant to the reaction solution at a concentration such that the surface tension in the aqueous solution is 50 mN/m or more, the interference substances present in serum can be removed.
  • the present invention has been completed based on the discovery that the accuracy of immunoassays can be improved by suppressing the effects of
  • the present invention is as follows.
  • At least one type of surfactant whose surface tension in a 1.0w/v% aqueous solution is 50mN/m or more is added to the reaction solution at a concentration such that the surface tension in the aqueous solution is 50mN/m or more.
  • Characteristic immunoassay method [2] The measurement method of [1], which is an immunoagglutination method. [3] The measurement method of [2] is a latex agglutination method. [4] The measurement method according to any one of [1] to [3], wherein the surfactant is a nonionic surfactant.
  • the surfactant is polyoxyethylene myristyl ether, polyoxyethylene distyrenated phenyl ether, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene cetyl ether, polyoxyethylene stearyl ether, polyoxyethylene oleyl ether, polyoxyethylene alkyl selected from the group consisting of ether, polyoxyethylene octyl dodecyl ether, polyoxyethylene alkylene alkyl ether, polyoxyethylene tribenzyl phenyl ether, polyoxyethylene polyoxypropylene glycol, polyoxyethylene glyceryl ether, and polyoxyethylene diglyceryl ether.
  • the measuring method according to any one of [1] to [3], which is at least one type of measuring method.
  • At least one type of surfactant having a surface tension of 50 mN/m or more in a 1.0 w/v% aqueous solution is added to the reaction solution at a concentration such that the surface tension in the aqueous solution is 50 mN/m or more.
  • Characteristic measurement reagents [7] The measurement reagent of [6], which is composed of a first reagent and a second reagent. [8] The measurement reagent of [6] or [7], which is an immunoagglutination reagent. [9] The measurement reagent of [8], which is a latex agglutination method reagent.
  • the surfactant is polyoxyethylene myristyl ether, polyoxyethylene distyrenated phenyl ether, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene cetyl ether, polyoxyethylene stearyl ether, polyoxyethylene oleyl ether, polyoxyethylene alkyl selected from the group consisting of ether, polyoxyethylene octyl dodecyl ether, polyoxyethylene alkylene alkyl ether, polyoxyethylene tribenzyl phenyl ether, polyoxyethylene polyoxypropylene glycol, polyoxyethylene glyceryl ether, and polyoxyethylene diglyceryl ether.
  • the measurement reagent according to any one of [6] to [9] which is at least one type of measurement reagent.
  • a method for recovering performance degradation during storage of an immunoassay reagent in an immunoassay comprising at least one type of interface in which the surface tension of a 1.0 w/v% aqueous solution is 50 mN/m or more in a reaction solution.
  • a method comprising adding an activator at a concentration such that the surface tension in an aqueous solution is 50 mN/m or more.
  • the method of [12] which is an immunoagglutination method.
  • the surfactant is polyoxyethylene myristyl ether, polyoxyethylene distyrenated phenyl ether, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene cetyl ether, polyoxyethylene stearyl ether, polyoxyethylene oleyl ether, polyoxyethylene alkyl selected from the group consisting of ether, polyoxyethylene octyl dodecyl ether, polyoxyethylene alkylene alkyl ether, polyoxyethylene tribenzyl phenyl ether, polyoxyethylene polyoxypropylene glycol, polyoxyethylene glyceryl ether, and polyoxyethylene diglyceryl ether.
  • the method according to any one of [12] to [14], which is at least one type of method.
  • This specification includes the disclosure content of Japanese Patent Application No. 2022-130544, which is the basis of the priority of this application.
  • test substances can be measured stably and accurately over a long period of time. Furthermore, by using the immunoassay reagent of the present invention, the storage stability of the reagent over a long period of time can be improved.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of measuring a specimen using a first reagent to which polyoxyethylene distyrenated phenyl ether was added and a second reagent before and after storage.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of measuring a specimen using a first reagent to which polyoxyethylene alkylene alkyl ether and polyoxyethylene distyrenated phenyl ether were added, and a second reagent before and after storage.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of measuring a specimen using a first reagent to which polyoxyethylene alkylene alkyl ether and polyoxyethylene myristyl ether were added, and a second reagent before and after storage.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of measuring a specimen using a first reagent to which polyoxyethylene alkylene alkyl ether was added and a second reagent before and after storage.
  • the present invention is a method for suppressing the influence of interfering substances on measurements in immunoassays and improving the accuracy of immunoassays.
  • the present invention can be applied to any immunoassay method that utilizes antigen-antibody reactions. That is, for example, it can be applied to immunodiffusion method, immunoturbidimetry, immunonephelometry, hemagglutination method, latex method, enzyme immunoassay (EIA method), radioimmunoassay (RIA method), immunochromatography method, etc. Can be done.
  • immunodiffusion method immunoturbidimetry
  • immunonephelometry hemagglutination method
  • latex method enzyme immunoassay (EIA method), radioimmunoassay (RIA method), immunochromatography method, etc.
  • EIA method enzyme immunoassay
  • RIA method radioimmunoassay
  • immunochromatography method etc.
  • agglutination methods such as immunonephelometry, immunonephelometry, red blood cell agglutination method, and latex agglutination method are highly effective.
  • the agglutination method is an immunoassay method using an agglutination method using an insoluble carrier such as latex particles, bentonite, collodion, kaolin, fixed sheep red blood cells, etc.
  • Latex is preferred as the insoluble carrier, and examples of latex particles that can be used include polystyrene latex particles, styrene-butadiene copolymer latex particles, and polyvinyltoluene latex particles.
  • the insoluble carrier can be sensitized with an antibody, that is, by binding the antibody to the carrier surface, and if the target to be measured is an antibody, it can be sensitized with an antigen.
  • the automatic analyzer is an automatic analyzer for biochemical tests that can be applied to immunoassays, and employs a mechanism for dispensing reagents into reaction vessels via tubes using a continuous dispensing method. That is, the device is equipped with a means for installing a reagent inside or outside the device, and the reagent is continuously dispensed into a reaction tank provided in the device through a tube. The reagent is dispensed through the tube using a combination of a pump such as a peristaltic pump and a switching valve.
  • a pump such as a peristaltic pump and a switching valve.
  • There are various commercially available devices such as Hitachi Automatic Analyzer 7180, Hitachi Automatic Analyzer 7250, Automatic Analyzer 7450, Automatic Analyzer 7350, etc. manufactured by Hitachi, Ltd. .
  • the antigen or antibody is measured by optically capturing the aggregate formed by binding of the antigen or antibody-sensitized carrier and the antibody to be measured or the antigen to be measured in a reaction tank. do. That is, the degree of aggregation of carrier particles is measured by irradiating the aggregate with light in the range from visible light to near-infrared light and detecting changes in absorbance or intensity changes in scattered light.
  • measurement methods include the One Point method, Two Point method, Three Point method, Rate method, etc., and the method of the present invention can be applied to any of the measurement methods.
  • measurements in the test sample can be made using the degree of agglutination as an indicator.
  • a target antigen or a target antibody can be quantified.
  • the order of addition of the first reagent and the second reagent is not limited, but preferably the first reagent is dispensed before the second reagent, or the first reagent and the second reagent are dispensed simultaneously.
  • the concentration of the measurement target in the test sample can be calculated based on the standard curve. It is possible to calculate the concentration of a substance.
  • the first reagent includes a buffer solution, and may also contain other stabilizing reagents, protective reagents, etc.
  • the second reagent include the above-mentioned particles sensitized with an antibody or antigen that specifically binds to the antigen or antibody to be measured, and may also contain other stabilizing reagents, protective reagents, and the like.
  • the method of sensitizing the antibody or antigen to the carrier is not particularly limited, and any known method may be followed.
  • the carrier may be physically adsorbed or chemically bonded to the carrier.
  • the antibody or antigen can be mixed with the carrier and then heated and shaken at 30 to 37°C for 1 to 2 hours to sensitize the antibody to the carrier.
  • the amount of antibody or antigen that sensitizes the carrier can be appropriately set depending on the particle size of the carrier used.
  • the carrier sensitized with the antibody or antigen is preferably retained as a medium dispersion until it is reacted with the test sample.
  • a medium for example, a phosphate buffer, a glycine buffer, etc. can be used. Bovine serum albumin, gelatin, gum arabic, etc. may be added to the medium as necessary.
  • the antibody or antigen-sensitized carrier thus prepared is reacted with a test sample, and the reactivity of the sensitized antibody or antigen with the antigen or antibody in the test sample is determined based on the presence or absence of agglutination or its degree; Antigens or antibodies in test samples can be detected.
  • Detection in the agglutination method using sensitized particles involves adding several tens to several hundred ⁇ L of physiological saline or an appropriate buffer solution to several ⁇ L to several tens of ⁇ L of the test sample in an appropriate reaction container, mixing the Incubation is performed for several minutes, then several tens to several hundred ⁇ L of sensitized particles bound to antibodies or antigens are added, and incubation is performed for several minutes.
  • the concentration of sensitized particles at this time is about 0.01 to 0.5 w/v%.
  • an appropriate measurement wavelength for example, 570 nm
  • tens to hundreds of ⁇ L of a sensitized particle solution suspended in a buffer solution may be added to several ⁇ L of the reaction sample.
  • the buffer include appropriate buffers having a pH of 5.0 to 10, such as phosphate buffer, borate buffer, Tris buffer, and the like.
  • test sample to be subjected to the immunoassay method of the present invention is not particularly limited, but biological samples that can greatly exhibit the effect of the present invention of suppressing the influence of interfering substances are preferred, particularly blood, serum, plasma, and urine. , feces, saliva, tissue fluid, cerebrospinal fluid, body fluids such as swabs, or diluted products thereof are preferred, and blood, serum, plasma, or diluted products thereof are more preferred.
  • test substance is not limited to a specific one, and may be any substance such as proteins, sugars, or other compounds present in the biological sample that is the test sample, and may be any substance of biological origin. There may be. Further, these complexes may be, for example, pathogenic microorganisms such as bacteria or viruses, biological substances in living organisms, or substances in the environment.
  • a surfactant is present in the reaction system during the antigen-antibody reaction.
  • the surfactant is used at a concentration such that the surface tension in the aqueous solution is 50 mN/m or more.
  • a surfactant having a surface tension of 50 mN/m or more in a 1.0 w/v % aqueous solution is used. That is, a surfactant having a surface tension of 50 mN/m or more in a 1.0 w/v% aqueous solution may be used at a concentration such that the surface tension in the aqueous solution is 50 mN/m or more.
  • the surfactant is also one that has a surface tension of 50 mN/m or more at a concentration above the critical micelle concentration (cmc).
  • concentration of the surfactant solution As the concentration of the surfactant solution is increased, the surface tension of the surfactant solution gradually decreases, and eventually the surface tension remains constant even when the concentration is increased. At this time, the adsorption of the surfactant to the interface becomes saturated and forms aggregates called micelles.
  • the concentration that forms micelles is called the critical micelle concentration.
  • the critical micelle concentration and surface tension have specific values depending on the surfactant. For example, a surfactant with a critical micelle concentration of 0.5 w/v% and a surface tension of 50 mN/m in a 0.5 w/v% aqueous solution is The tension will be 50mN/m.
  • the surfactant used in the present invention may be any of anionic surfactants, cationic surfactants, nonionic surfactants, and amphoteric surfactants, but nonionic surfactants are preferred. .
  • nonionic surfactants used in the method of the present invention include polyoxyethylene myristyl ether, polyoxyethylene distyrenated phenyl ether, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene cetyl ether, polyoxyethylene Stearyl ether, polyoxyethylene oleyl ether, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene octyl dodecyl ether, polyoxyethylene alkylene alkyl ether, polyoxyethylene tribenzyl phenyl ether, polyoxyethylene polyoxypropylene glycol, polyoxyethylene glyceryl ether , and polyoxyethylene diglyceryl ether, but is not limited thereto.
  • polyoxyethylene myristyl ether or polyoxyethylene distyrenated phenyl ether is preferred.
  • the concentration of the surfactant used in the present invention in the reaction solution during the reaction is preferably such that the surface tension in the aqueous solution is 50 mN/m, specifically, about 0.001 to 10 w/v%, and It is preferably 0.01 to 1 w/v%, but is not particularly limited to these values.
  • the surface tension of the surfactant solution can be measured, for example, by the Young-Laplace method (curve fitting method).
  • the Young-Laplace method calculates surface tension by fitting the Young-Laplace equation using image processing based on the contour shape of a droplet formed from a needle tip and the density difference value. Measurement by the Young-Laplace method can be performed using a contact angle meter.
  • a contact angle meter for example, DropMaster DMo-902, DMo-702, Mo-602, DMo-502, DMo-901, DMo-701, DMo-601, DMo-501 (trade name, commercially available from Kyowa Interface Science Co., Ltd.) ) etc. may be used.
  • the surfactant may be included in any of the reagent solutions used in the immunoassay, or may be added to the reaction solution during measurement. When one type of reagent solution is used, it is sufficient to include a surfactant at the above concentration in the reagent solution, and when multiple reagent solutions are used, the surfactant in the reaction solution during antigen-antibody reaction is at the above concentration. It is sufficient to include it in the reagent solution so that For example, in the above agglutination method using the first reagent and the second reagent, 110 ⁇ L of the first reagent containing a buffer solution and 8.8 ⁇ L of the test sample are mixed, incubated for several minutes, and then incubated with the antigen.
  • the first reagent contains a surfactant of 0.05 w/v% or more, preferably 0.1 w/v%. What is necessary is just to add it so that it becomes above. The amount added can be appropriately determined for each surfactant.
  • the stability of the immunoassay reagent can be improved and the measured value can be stabilized without fluctuation.
  • Improving the stability of the immunoreagent means adding the above-mentioned surfactant to the immunoassay reagent to suppress the decline in performance of the immunoreagent and improve stability, and also to improve the stability of the immunoassay reagent by adding the surfactant to the reaction solution during the reaction. It also includes restoring the performance of an immunoassay reagent whose performance has decreased during storage after preparation by adding an active agent to the same level as immediately after preparation.
  • the immunoassay reagent whose performance has decreased during storage after preparation refers to a reagent such as latex particles to which an antigen or antibody is bound, and whose reactivity has decreased during storage.
  • a reagent such as latex particles to which an antigen or antibody is bound
  • the reactivity of the latex particles may decrease and the measured value may decrease.
  • the measured value can be recovered and stable measured values equivalent to those obtained when using the reagent immediately after preparation can be obtained. That is, it is possible to recover from a decrease in the performance of the measurement reagent.
  • the first reagent containing the above surfactant and the second reagent containing latex particles may be mixed. Moreover, when mixing the first reagent that does not contain a surfactant and the second reagent that contains latex particles, the above-mentioned surfactant may be added as a third reagent.
  • At least 1 month preferably at least 2 months, more preferably 3 months, even more preferably 4 months, even more preferably 5 months, even more preferably at least 6 months after preparation. Even if the reagent is stored for at least 12 months, more preferably for at least 24 months, and even more preferably for at least 36 months, it is possible to obtain measurements equivalent to those immediately after preparation.
  • the present invention also provides a measurement reagent containing at least one type of surfactant whose surface tension in a 1.0 w/v% aqueous solution is 50 mN/m or more.
  • the present invention also includes an immunoassay kit containing the above-mentioned measurement reagent. If the buffer composition does not contain particles sensitized with an antigen or antibody, the immunoassay kit separately contains particles sensitized with an antigen or antibody, and further includes a positive control, a negative control, instructions, etc. May contain.
  • Emulgen A-500 and Emulgen 4085 reached their critical micelle concentration at a concentration of approximately 0.05 w/v%, and the surface tension of both of them when they reached the critical micelle concentration was 50 mN/m or more.
  • the surface tension of Emulgen LS-110 is approximately 35 mN/m, which is smaller than 50 mN/m, at a concentration of 0.05 w/v%, which is estimated to have reached the critical micelle concentration.
  • reagent for measurement by immunoagglutination method was prepared as follows using an antigen against Treponema pallidum pallidum. Sensitized particles containing 3.9 mg of Treponema pallidum antigen per 1 mL of polystyrene latex suspension were suspended in a buffer solution (Bis-Tris, pH 6.0) to a concentration of 0.095 w/v%, and Prepared reagents.
  • the agglutination reaction for about 5 minutes was measured as the change in absorbance, and the anti-Treponemal analysis of each sample was determined using a standard curve created using a standard solution (HEPES buffer, bovine serum albumin, sodium chloride, anti-Treponemal pallidum antibody, pH 7.4). ⁇ The pallidum antibody concentration was calculated.
  • the second reagent described above was stored at 37°C. Twenty-one days after the start of storage at 37°C, a calibration curve was created using the standard solution, and the anti-Treponemal pallidum antibody concentration of each sample was calculated.
  • FIG. 1 showing the results of Example 1, there was little variation between the sample measurement value immediately after the preparation of the second reagent and the sample measurement value after 21 days at 37°C, indicating that the reagent was highly stable.
  • FIG. 4 showing the results of Comparative Example 1, a decrease in measured values was observed in some samples after 21 days at 37°C.
  • FIGS. 2 and 3 showing the results of Examples 2 and 3, the decrease in the sample measurement value was smaller than in FIG. 4, and the stability of the reagent was better than in Comparative Example 1.
  • Table 3 shows the average rate of variation of 30 samples measured using the first reagents A to D, the second reagent immediately after preparation, and the first reagents A to D and the second reagent stored at 37°C for 21 days. show.
  • Examples 1 to 3 showed that the sample measurement values were stable. Therefore, by adding a surfactant whose surface tension in a 1.0w/v% aqueous solution is 50mN/m or more at a concentration such that the surface tension in the aqueous solution is 50mN/m or more, the stability of the immunoassay reagent can be improved. It was shown that

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Abstract

生体物質の測定値の長期安定性が向上する測定方法及び試薬を提供すること。　反応液中に、臨界ミセル濃度以上の濃度において表面張力が50mN/mである非イオン性界面活性剤を添加することを特徴とする測定方法及び試薬。

Description

免疫分析方法及び試薬
　本発明は、免疫分析方法及びそのための試薬及び該試薬を用いた方法に関する。
　免疫測定法は、血清および血漿、尿、髄液などの体液に含まれる抗原性物質又は抗体の定量方法として臨床検査に応用され、現在は生化学検査用自動分析装置に適応した方法が広く普及している。近年、臨床検査を目的とした免疫学的測定法は、不溶性担体を用いるなどして高感度化が実現されており、測定精度の向上は著しい。例えば、粒子径の異なる不溶性担体粒子を２種類以上使用する技術（特許文献１を参照）などを用いて高感度な測定を可能とする試薬が多く開発されている。
　しかしながら、高感度化により測定精度が向上されている試薬では、高感度であるが故に外的または内的な要因の微かな変動が測定に影響を与えてしまうことがある。特に、長期の安定性が不安定な状態では測定値に変動を与えてしまう問題があった。
特許第２５８８１７４号公報
　本発明の目的は、妨害物質による影響を抑制して免疫測定法の正確性を向上させることができる、免疫測定法及び免疫測定法用試薬を提供することである。 
　本願発明者らは、鋭意研究の結果、反応液中に、少なくとも1種類の界面活性剤を水溶液中における表面張力が50mN/m以上となる濃度で添加することにより、血清中に存在する妨害物質による影響を抑制して免疫測定法の正確性を向上させることができることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　反応液中に、1.0w/v％水溶液の表面張力が50mN/m以上である少なくとも1種類の界面活性剤を水溶液中における表面張力が50mN/m以上となる濃度で添加することを特徴とする免疫測定方法。
[２]　免疫凝集法である、[１]の測定方法。
[３]　ラテックス凝集法である、[２]の測定方法。
[４]　界面活性剤が非イオン性界面活性剤である[１]～[３]のいずれかの測定方法。
[５]　界面活性剤がポリオキシエチレンミリスチルエーテル、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル、ポリオキシエチレンアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレングリセリルエーテル、及びポリオキシエチレンジグリセリルエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１種である、[１]～[３]のいずれかの測定方法。
[６]　反応液中に、1.0w/v％水溶液の表面張力が50mN/m以上である少なくとも1種類の界面活性剤を水溶液中における表面張力が50mN/m以上となる濃度で添加することを特徴とする測定試薬。
[７]　第一試薬と第二試薬から構成される、[６]の測定試薬。
[８]　免疫凝集法試薬である、[６]又は[７]の測定試薬。
[９]　ラテックス凝集法試薬である、[８]の測定試薬。
[１０]　界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、[６]～[９]のいずれかの測定試薬。
[１１]　界面活性剤がポリオキシエチレンミリスチルエーテル、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル、ポリオキシエチレンアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレングリセリルエーテル、及びポリオキシエチレンジグリセリルエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１種である、[６]～[９]のいずれかの測定試薬。
[１２]　免疫測定法における免疫測定試薬の保存中の性能低下を回復させる方法であって、反応液中に、1.0w/v％水溶液の表面張力が50mN/m以上である少なくとも1種類の界面活性剤を水溶液中における表面張力が50mN/m以上となる濃度で添加することを含む方法。
[１３]　免疫凝集法である、[１２]の方法。
[１４]　ラテックス凝集法である、[１３]の方法。
[１５]　界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、[１２]～[１４]のいずれかの方法。
[１６]　界面活性剤がポリオキシエチレンミリスチルエーテル、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル、ポリオキシエチレンアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレングリセリルエーテル、及びポリオキシエチレンジグリセリルエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１種である、[１２]～[１４]のいずれかの方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2022-130544号の開示内容を包含する。
　本発明の免疫測定方法を利用することにより、長期間安定して正確に被検物質の測定をすることができる。また本発明の免疫測定試薬を用いることにより、長期間にわたる試薬の保存安定性を向上させることができる。
ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルを添加した第一試薬と、保存前後の第二試薬を用いて検体を測定した結果を示す図である。 ポリオキシエチレンアルキレンアルキルエーテルとポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルを添加した第一試薬と、保存前後の第二試薬を用いて検体を測定した結果を示す図である。 ポリオキシエチレンアルキレンアルキルエーテルとポリオキシエチレンミリスチルエーテルを添加した第一試薬と、保存前後の第二試薬を用いて検体を測定した結果を示す図である。 ポリオキシエチレンアルキレンアルキルエーテルを添加した第一試薬と、保存前後の第二試薬を用いて検体を測定した結果を示す図である。
　以下、本発明の方法について説明する。なお、本明細書中の「％」は特に断りがない限り質量基準（w/v％）を意味する。
　本発明は、免疫測定法において、妨害物質の測定への影響を抑制し、免疫測定法の正確性を向上させる方法である。
　本発明は、あらゆる抗原抗体反応を利用した免疫学的測定方法に適用することができる。すなわち、例えば、免疫拡散法、免疫比濁法、免疫比朧法、赤血球凝集法、ラテックス法、酵素免疫測定法(EIA法)、放射免疫測定法(RIA法)、イムノクロマト法等に適用することができる。これらのうち、免疫比濁法及び免疫比朧法並びに赤血球凝集法及びラテックス凝集法のような凝集法で大きな効果を発揮する。
　凝集法は、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等などの不溶性担体を利用した凝集法による免疫測定法である。不溶性担体としては、ラテックスが好ましく、ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン-ブタジエン共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができる。凝集法による免疫測定において、不溶性担体は測定対象が抗原である場合には抗体で感作、すなわち担体表面に抗体を結合させ、測定対象が抗体である場合には、抗原で感作すればよい。
　本発明の免疫測定法においては、好ましくは自動分析装置を用いて測定する。自動分析装置は、免疫測定法に適用可能な生化学検査用自動分析装置であり、連続分注方式によりチューブを介して試薬を反応槽へ分注する機構を採用しているものである。すなわち、装置内又は装置外に試薬を設置する手段を備え、チューブを通って試薬が装置に備えられた反応槽内に連続的に分注される装置である。チューブを通しての試薬の分注は、例えばぺリスタポンプ等のポンプと切替弁との組み合わせにより行われる。このような装置として、市販のものが種々挙げられるが、例えば株式会社日立製作所の日立自動分析装置7180形、日立自動分析装置7250形、自動分析装置7450形、自動分析装置7350形等が挙げられる。
　測定を自動分析装置を用いて行う方法において、反応槽内で抗原又は抗体感作担体と測定対象抗体又は測定対象抗原が結合し形成された凝集塊を光学的に捉えることにより抗原又は抗体を測定する。すなわち凝集塊に可視光から近赤外域の光を照射し、吸光度変化又は散乱光の強度変化を検出して担体粒子の凝集の程度を測定する。この際、測定方式として、One Point法、Two Point法、Three Point法、Rate法等があるが、本発明の方法はいずれの測定方式にも適用することができる。反応槽にあらかじめ被検試料を分注しておき、そこに第一試薬及び第二試薬を分注し反応を行わせ凝集度を測定することにより、凝集度を指標に被検試料中の測定対象抗原又は測定対象抗体を定量することができる。第一試薬及び第二試薬の添加の順序は限定されないが、好ましくは第一試薬を第二試薬に先んじて分注するか、又は第一試薬と第二試薬を同時に分注する。この際、あらかじめ、測定対象の濃度がわかっている複数の試料を用いて測定対象濃度と凝集度を関連付けた標準曲線を作成しておくことにより、標準曲線に基づいて被検試料中の測定対象物の濃度を算出することができる。
　第一試薬としては緩衝液が挙げられる、他の安定化試薬、保護試薬等を含んでいてもよい。第二試薬としては測定対象である抗原又は抗体に特異的に結合する抗体又は抗原を感作させた上述の粒子が挙げられ、他の安定化試薬、保護試薬等を含んでいてもよい。
　抗体又は抗原を担体に感作する方法は、特に限定されず公知の方法に従えばよい。例えば、担体に物理的に吸着させてもよいし、化学的に結合させてもよい。より具体的には、例えば、抗体又は抗原と担体とを混和した後、30～37℃で1～2時間加温振盪することにより、抗体を担体に感作させることができる。担体に感作する抗体又は抗原の量は、使用する担体の粒径に応じて適宜設定することができる。抗体又は抗原を担体に感作した後、担体表面上の未感作部分をウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、卵白アルブミン等でブロッキングするのが好ましい。抗体又は抗原を感作した担体は被検試料と反応させる時まで媒体分散液として保持しておくのが好ましい。この際、媒体としては、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液等を使用することができる。媒体中には、必要に応じてウシ血清アルブミン、ゼラチン、アラビアゴム等を添加してもよい。このように調製した抗体又は抗原感作担体を被検試料と反応させ、凝集の有無又はその程度により感作させた抗体又は抗原と被検試料中の抗原又は抗体との反応性を判別し、被検試料中の抗原又は抗体を検出することができる。
　感作粒子を用いた凝集法における検出は、適当な反応容器中で被検試料数μL～数十μLに生理食塩水又は適当な緩衝液数十μL～数百μLを添加し混和し、数分間インキュベーションを行い、次いで抗体又は抗原を結合させた感作粒子を数十μL～数百μL添加し、数分間インキュベーションを行う。このときの感作粒子の濃度は、0.01～0.5w/v％程度である。次いで、適当な測定波長（例えば、570nm）で吸光度を測定することにより、抗原抗体反応により生じた感作粒子の凝集による濁度を測定することができる。また、反応試料数μLに緩衝液に浮遊させた感作粒子溶液数十μL～数百μLを添加してもよい。緩衝液としては、pH5.0～10の適当な緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液等が挙げられる。
　本発明の免疫測定法に付される被検試料は、特に限定されないが、妨害物質の影響を抑制するという本発明の効果を大いに発揮できる生体試料が好ましく、特に、血液、血清、血漿、尿、便、唾液、組織液、髄液、ぬぐい液等の体液等又はその希釈物が好ましく、さらには血液、血清及び血漿又はこれらの希釈物が好ましい。
　本発明の免疫測定法における測定対象、すなわち被検物質は特定のものに限定されず、被検試料である生体試料中に存在するタンパク質、糖、その他の化合物など何でもよく、生物由来の物質であってもよい。また、これらの複合体、たとえば細菌やウィルスなどの病原性微生物、あるいは生体中の生体物質あるいは環境中の物質などであってもよい。
　本発明の方法においては、抗原抗体反応の際に反応系に界面活性剤を存在させる。本発明の方法においては、界面活性剤を水溶液中における表面張力が50mN/m以上となる濃度で用いる。好ましくは、1.0w/v％水溶液の表面張力が50mN/m以上である界面活性剤を用いる。すなわち、1.0w/v％水溶液の表面張力が50mN/m以上である界面活性剤を水溶液中における表面張力が50mN/m以上となる濃度で用いればよい。該界面活性剤は、臨界ミセル濃度（cmc）以上の濃度において表面張力が50mN/m以上である界面活性剤でもある。界面活性剤溶液の濃度を増加させると、界面活性剤溶液の表面張力は徐々に減少し、やがて濃度を増加させても表面張力は一定に保持される。このとき、界面活性剤は界面への吸着が飽和し、ミセルと呼ばれる集合体を形成する。ミセルを形成する濃度を臨界ミセル濃度と呼ぶ。臨界ミセル濃度及び表面張力は、界面活性剤により固有の値を有している。例えば、臨界ミセル濃度が0.5w/v％であり、0.5w/v％水溶液中の表面張力が50mN/mである界面活性剤はこの濃度以上の溶液、例えば1.0w/v％の溶液の表面張力は50mN/mとなる。
　本発明に使用される界面活性剤としては、陰イオン系界面活性剤、陽イオン系界面活性剤、非イオン系界面活性剤、両性界面活性剤のいずれでもよいが非イオン系界面活性剤が好ましい。
　本発明の方法において使用される非イオン系界面活性剤として、具体的にはポリオキシエチレンミリスチルエーテル、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル、ポリオキシエチレンアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレングリセリルエーテル、及びポリオキシエチレンジグリセリルエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１種であるが、これらに限定されるものではない。この中でも、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル又はポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルが好ましい。
　本発明に使用される界面活性剤の反応時の反応液中における濃度は水溶液中における表面張力が50mN/mとなる濃度が好ましく、具体的には、約0.001～10w/v％が好ましく、さらに好ましくは0.01～１w/v％であるが、これらの値には特に限定されない。
　界面活性剤溶液の表面張力は、例えば、Young-Laplace法（カーブフィッティング法）により測定することができる。Young-Laplace法は、針先より形成された液滴の輪郭形状及び密度差の値から画像処理によりYoung-Laplaceの式をフィッティングさせて表面張力を算出する。Young-Laplace法による測定は、接触角計を用いて行うことができる。接触角計として、例えば、DropMaster DMo-902、DMo-702、Mo-602、DMo-502、DMo-901、DMo-701、DMo-601、DMo-501（商品名、協和界面科学株式会社より市販）等を用いればよい。
　界面活性剤は、免疫測定法で用いる試薬溶液のいずれかに含ませてもよいし、測定の際に反応液に添加してもよい。用いる試薬溶液が１種類の場合は、該試薬溶液に上記濃度で界面活性剤を含ませればよく、複数の試薬溶液を用いる場合は、抗原抗体反応時の反応液中の界面活性剤が上記濃度になるように試薬溶液に含ませればよい。例えば、第一試薬及び第二試薬を用いる上記の凝集法であって、緩衝液を含む第一試薬110μLと被検試料である検体8.8μLを混合し、数分間インキュベーションし、その後、抗原で感作したラテックス粒子55μLを添加し混合した後に、凝集反応を吸光度変化量として測定するラテックス凝集法において、例えば、第一試薬に界面活性剤を0.05w/v％以上、好ましくは0.1w/v％以上となるように添加すればよい。添加量は界面活性剤ごとに適宜決定することができる。
　免疫測定の際に上記の界面活性剤を反応液に添加することにより、免疫測定試薬の安定性を向上させ、測定値が変動することなく安定化させることができる。ここで免疫試薬の安定性を向上させるとは、免疫測定試薬に上記の界面活性剤を添加することにより該免疫試薬の性能低下を抑制し安定性を向上させることも、反応時に反応液に界面活性剤を含ませ調製後の保存中に性能が低下した免疫測定試薬の性能を調製直後と同等に回復させることも含む。ここで、調製後の保存中に性能が低下した免疫測定試薬とは、抗原又は抗体を結合させたラテックス粒子等の試薬であって、保存中に反応性が低下した試薬をいう。例えば、ラテックス凝集法において、抗原又は抗体で感作したラテックス粒子を含む試薬を保存しておくとラテックス粒子の反応性が低下し、測定値が低下することがある。そのような場合でも、反応時に反応液に界面活性剤を添加することにより、測定値が回復し、調製直後の試薬を用いた場合と同等の安定した測定値を得ることができる。すなわち、測定試薬の性能低下を回復させることができる。
　凝集法においては、上記の界面活性剤を含む第一試薬とラテックス粒子を含む第二試薬を混合すればよい。また、界面活性剤を含まない第一試薬とラテックス粒子を含む第二試薬を混合する際に、第三試薬として上記の界面活性剤を添加してもよい。
　本発明の方法によれば、調製後少なくとも１か月、好ましくは少なくとも２か月、さらに好ましくは３か月、さらに好ましくは４か月、さらに好ましくは５か月、さらに好ましくは少なくとも６か月、さらに好ましくは少なくとも１２か月、さらに好ましくは少なくとも２４か月、さらに好ましくは少なくとも３６か月保存した試薬でも、調製直後と同等の測定値を得ることができる。
　本発明は、また、1.0w/v％水溶液の表面張力が50mN/m以上である少なくとも1種類の界面活性剤を少なくとも1種類以上含む測定試薬を提供する。
　さらに、本発明は前記測定試薬を含む免疫測定キットをも包含する。該免疫測定キットは、前記緩衝液組成物に抗原又は抗体を感作した粒子が含まれない場合は、抗原又は抗体を感作した粒子を別途含む、さらに陽性対照、陰性対照、説明書等を含んでいてもよい。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
（１）界面活性剤の表面張力測定
　各種界面活性剤（ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル（「エマルゲンA-500」（商品名、花王株式会社より市販））、ポリオキシエチレンアルキレンアルキルエーテル（「エマルゲンLS-110」(商品名、花王株式会社より市販)）、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル（「エマルゲン4085」（商品名、花王株式会社より市販）））の水溶液を調製した。DropMaster DMo-501（商品名、協和界面科学株式会社より市販）を用いて、Young-Laplace法により表面張力を測定した。各濃度につき測定を１０回行い、算出した平均値を表１に示す。エマルゲンA-500とエマルゲン4085は、およそ0.05w/v％の濃度で臨界ミセル濃度に達したと推定され、臨界ミセル濃度に達したときの表面張力はどちらも50mN/m以上であった。一方、エマルゲンLS-110は、臨界ミセル濃度に達したと推定される0.05w/v％の濃度において、表面張力はおよそ35mN/mであり、50mN/mより小さい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（２）第一試薬の調製
　緩衝液（トリス、ｐＨ８．０）中に、ウシ血清アルブミンを添加した液に、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル（「エマルゲンA-500」（商品名、花王株式会社より市販））を添加し第一試薬Ａを調製した（実施例１）。実施例２～３として、ポリオキシエチレンアルキレンアルキルエーテル（「エマルゲンLS-110」(商品名、花王株式会社より市販)）とエマルゲンA-500あるいはポリオキシエチレンミリスチルエーテル（「エマルゲン4085」（商品名、花王株式会社より市販））を添加し第一試薬Ｂ～Ｃを調製した。比較例１としてエマルゲンLS-110のみを添加した第一試薬Ｄを調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（３）第二試薬の調製
　梅毒トレポネーマ・パリダムに対する抗原を用いて、以下の通りに免疫凝集法による測定試薬を調製した。
　トレポネーマ・パリダム抗原をポリスチレンラテックス懸濁液１mLに対し3.9mg担持させてなる感作粒子を、緩衝液（Bis-Tris、pH6.0）に0.095w/v％となるように懸濁し、第二試薬を調製した。
（４）自動分析装置による測定
　自動分析装置は日立社7180型自動分析装置によりエンドポイント法で自動測定を行った。
　前述の第一試薬と第二試薬を用いて、血清30検体の測定を行った。検体溶液8.8μLに第一試薬Ａ～Ｄ　110μＬを添加し、この混合液を37℃で撹拌混合した。５分間放置後、第二試薬55μＬを添加し、更に37℃で撹拌混合した。約５分間の凝集反応を吸光度変化量として測定し、標準液（HEPESバッファー、ウシ血清アルブミン、塩化ナトリウム、抗トレポネーマ・パリダム抗体、pH7.4）を用いて作成した検量線より各検体の抗トレポネーマ・パリダム抗体濃度を算出した。
　長期保存による熱負荷を再現するため、前述の第二試薬を37℃下に保存した。37℃保存開始21日後に、標準液を用いて検量線を作成し、各検体の抗トレポネーマ・パリダム抗体濃度を算出した。
（５）第一試薬の添加剤による第二試薬の保存安定性の比較
　長期保存前後の試薬の検体測定値の比較を行うため、第一試薬Ａ～Ｄと調製直後の第二試薬、第一試薬Ａ～Ｄと37℃下に21日間保存した第二試薬を用いて測定した検体の測定を行った。
　実施例１の結果を示す図１では、第二試薬調製直後の検体測定値と37℃21日後の検体測定値の変動が少なく、試薬の安定性が高いことが示された。比較例１の結果を示す図４では、37℃21日後に一部検体において測定値の低下が見られた。実施例２～３の結果を示す図２～３では、図４に比べて検体測定値の低下が少なく、比較例１よりも試薬の安定性が良好であった。表３には、第一試薬Ａ～Ｄと調製直後の第二試薬、第一試薬Ａ～Ｄと37℃下に21日間保存した第二試薬を用いて測定した30検体の変動率の平均を示す。比較例１に対し、実施例１～３では検体測定値が安定していることが示された。よって、1.0w/v％水溶液の表面張力が50mN/m以上である界面活性剤を水溶液中における表面張力が50mN/m以上となる濃度で添加することで、免疫測定試薬の安定性が向上することが示された。 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本発明の方法により、検体中の抗体および抗原を測定することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (16)

  1. 　反応液中に、1.0w/v％水溶液の表面張力が50mN/m以上である少なくとも1種類の界面活性剤を水溶液中における表面張力が50mN/m以上となる濃度で添加することを特徴とする免疫測定方法。
  2. 　免疫凝集法である、請求項１に記載の測定方法。
  3. 　ラテックス凝集法である、請求項２に記載の測定方法。
  4. 　界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項１～３のいずれか１項に記載の測定方法。
  5. 　界面活性剤がポリオキシエチレンミリスチルエーテル、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル、ポリオキシエチレンアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレングリセリルエーテル、及びポリオキシエチレンジグリセリルエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１～３のいずれか１項に記載の測定方法。
  6. 　反応液中に、1.0w/v％水溶液の表面張力が50mN/m以上である少なくとも1種類の界面活性剤を水溶液中における表面張力が50mN/m以上となる濃度で添加することを特徴とする測定試薬。
  7. 　第一試薬と第二試薬から構成される、請求項６に記載の測定試薬。
  8. 　免疫凝集法試薬である、請求項６記載の測定試薬。
  9. 　ラテックス凝集法試薬である、請求項８記載の測定試薬。
  10. 　界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項６～９のいずれか１項に記載の測定試薬。
  11. 　界面活性剤がポリオキシエチレンミリスチルエーテル、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル、ポリオキシエチレンアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレングリセリルエーテル、及びポリオキシエチレンジグリセリルエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項６～９のいずれか１項に記載の測定試薬。
  12. 　免疫測定法における免疫測定試薬の保存中の性能低下を回復させる方法であって、反応液中に、1.0w/v％水溶液の表面張力が50mN/m以上である少なくとも1種類の界面活性剤を水溶液中における表面張力が50mN/m以上となる濃度で添加することを含む方法。
  13. 　免疫凝集法である、請求項１２に記載の方法。
  14. 　ラテックス凝集法である、請求項１３に記載の方法。
  15. 　界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　界面活性剤がポリオキシエチレンミリスチルエーテル、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル、ポリオキシエチレンアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレングリセリルエーテル、及びポリオキシエチレンジグリセリルエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の方法。
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