DE69724292T2 - Reagenzien zum gebrauch als kalibratoren und kontrollen - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Verwendung von Reagenzien als Kalibratoren (Standards) und/oder Kontrollen in Diagnose-Assays und Kits. Konkret können ein oder mehrere dieser Reagenzien statt seropositivem Plasma oder Serum verwendet werden, in der Produktion von Kalibratoren und/oder Kontrollen für Diagnose-Assays und Kits, die für die qualitative und quantitative Messung von für einen erwünschten Ligand spezifischen Antikörpern entworfen sind. Die Reagenzien selber binden spezifisch an einen vorbestimmten Liganden, enthalten eine oder mehrere Epitope der konstanten Region von Antikörpern und sind, bezüglich ihrer Spezifität und Affinität, konstant. Die Reagenzien können mit Hilfe von Hybridoma- und/oder rekombinanter DNA-Technologien hergestellt werden.
  • Hintergrundinformationen
  • Die Antikörper sind Multidomänen-Proteine, die aus zwei identischen leichten (L) und zwei identischen schweren (H) Polypeptidketten bestehen, die durch Disulfidbrücken verbunden sind (1). Die aminoterminale Domäne, sowohl der L als auch der H Ketten, zeigen eine beträchtliche Diversität der Aminosäure-Sequenz und der Konformation und wird als die variable (V) Region bezeichnet. Drei Segmente von außergewöhnlicher Variabilität befinden sich innerhalb jeder V Region, die als hypervariable Regionen oder Komplementaritätsbestimmende Regionen-(CDRs) bezeichnet werden, die die Ligandenbindende Tasche bilden. Die anderen Domänen, sowohl der L als auch der H Ketten, stellen die konstanten Regionen dar. Die konstanten Regionen beteiligen sich nicht am Binden des Liganden und weisen eine limitiertere Variation auf. Die konstanten Regionen sind Spezies-spezifisch und können in verschiedene Klassen und Unterklassen unterteilt werden, basierend auf Unterschiede in der konstanten Region der schweren Kette, einschließlich Größe, Ladung, Aminosäuren-Zusammensetzung, Glykosylierung und biologische Funktion (Carayannopoulos, L. and Capra, J. D. Structure and Function of Immunoglobulins, In Fundamental Immunology, 3rd edition, Paul W. E. ed., Raven Press Ltd., New York, pgs. 283–314 (1993)).
  • Das Immunsystem generiert ein bemerkenswert diverses Repertoire an Antikörper-Molekülen, die in der Lage sind eigentlich jede Substanz zu erkennen. Die primäre Antikörperantwort, die durch die Herausforderung eines Antigens (d. h. jede Substanz die in der Lage ist eine Immunantwort auszulösen, zum Beispiel Proteine, Kohlenhydrate, Nucleinsäuren, Lipide, oder an einen Träger konjugierte Haptene) hervorgerufen wird, hat die Produktion eines Antikörpers, vorwiegend der IgM Klasse, als Folge. Die Antwort ist polyklonaler Natur, weil eine heterogene Mischung Antikörper gegen verschiedene Epitope des Antigens erzeugt werden. Die darauf folgende oder verlängerte Herausforderung seitens des gleichen Antigens führt zu einer sekundären Antwort, die durch wesentlich höhere Titer an Antikörpern charakterisiert ist, als in der primären Antwort festgestellt wird, die im Allgemeinen eine höhere Affinität haben (Maß der Bindungsstärke zwischen einem Epitop und der Antikörper-Bindungsstelle) und die fast gänzlich aus Vertretern der IgG Klasse bestehen. Im Allgemeinen nimmt der spezifische IgM Titer schneller ab als der spezifische IgG Titer. Demzufolge stellt die Überwachung der Klasse der im Serum oder anderen biologischen Fluiden vorhandenen spezifischen Antikörpern einen Indikator dar, für den Immunstatus eines Individuums gegenüber einem spezifischen Antigen (z. B. Infektionserreger). Die Antikörper-Klasse kann auch in Fällen von Autoimmunität und zur Überwachung der Hypersensitivität vom Typ I (allergische Antworten), die mit der Erzeugung von Antikörpern der IgE Klasse assoziiert ist, von klinischer Relevanz sein (Roitt, I. Ed., Immunology, Gower Medical Publishing Ltd., London, England (1985); Paul W. E. ed., Fundamental Immunology, 3rd edition. Raven Press Ltd., New York (1993)).
  • Unabhängig von der Klasse binden die Antikörper-Moleküle an Liganden mit hoher Affinität und Spezifität (die Fähigkeit zwischen dem Epitop, gegen das er gerichtet ist, und jedem anderen Epitop zu unterscheiden), was sie zu idealen Reagenzien für die Immunodiagnose macht. Die Immunoassays stellen ein schnelles und empfindliches Verfahren dar, zum Überwachen von Infektionserregern, physiologischen Funktionen, Allergie, Autoimmunität, Krebs, Pharmaka und Missbrauchs-Drogen. Es wurden manuelle und automatisierte Immunoassays entworfen, um die Immunantwort im Allgemeinen, die Antikörper gegen ein spezifisches Antigen und diagnostisch relevante Antigene oder Haptene zu messen. Im Allgemeinen bestehen heterologe Immunoassays aus mehreren Reaktionsschritten und benötigen schließlich die Trennung des immun-komplexierten Reaktanten von den freien Reaktanten, um das Testergebnis zu erhalten. Im Gegensatz dazu sind homogene Immunoassays Lösungs-Phase Systeme, bei denen die Trennung des komplexierten Reaktanten von den freien Reaktanten nicht notwendig ist. Die Immunoassays wurden in vielen verschiedenen Formaten entworfen, können aber in zwei Hauptklassen unterteilt werden: (1) kompetitive Assays und (2) nicht-kompetitive Assays (z. B. immunometrisch, Sandwich). Für die heterologen Immunoassays beider Klassen erwies sich die Festphasen-Biochemie zur Trennung von gebundenen und freien Reaktanten als revolutionär. Die Antikörper- oder Antigen-Reaktanten können kovalent oder nicht-kovalent (z. B. ionisch, hydrophob) an die feste Phase gebunden werden. Die Bindungs-Agenzien für kovalente Bindung sind bekannt und können Teil der Festphase sein oder vor der Beschichtung an diese derivatisiert werden. Die porösen und nicht-porösen Materialien, Latexpartikel, magnetische Partikel, Mikropartikel, Kügelchen, Membranen, Mikrotiter-„wells" und Plastikröhrohen sind Beispiele von Festphasen, die in Immunoassays verwendet werden. Die Wahl des Festphasen-Materials und des Markierungsverfahrens für das Antikörper- oder Antigen-Reagens wird basierend auf den Leistungscharakteristika des gewünschten Assayformats bestimmt.
  • Für manche Immunoassays wird keine Markierung benötigt. Zum Beispiel, befindet sich das Antigen auf einem detektierbaren Partikel, wie ein rotes Blutkörperchen, dann kann die Reaktivität basierend auf die Agglutination festgestellt werden. Alternativ kann die Antigen-Antikörper-Reaktion eine sichtbare Änderung zur Folge haben (z. B. radiale Immunodiffusion). In den meisten Fällen ist entweder das Antikörper- oder das Antigen-Reagens, das in einem Immunoassay verwendet wird, an eine signalgenerierende Verbindung oder einen „Marker" gebunden. Diese signalgenerierende Verbindung oder der "Marker" ist an sich detektierbar oder kann mit einem oder mehreren zusätzlichen Verbindungen reagieren um ein detektierbares Produkt zu erzeugen. Die Beispiele von signalgenerierenden Verbindungen beinhalten Chromogene, Radioisotopen (z. B., 125I, 131I, 32P, 3H, 35S und 14C), fluoreszierende Verbindungen (z. B. Fluorescein, Rhodamin), chemilumineszente Verbindungen, Partikel (sichtbar oder fluoreszent), Nucleinsäuren, komplexierende Agenzien oder Katalysatoren, wie Enzyme (z. B. Alkalische Phosphatase, Saure Phosphatase, Meerrettichperoxidase, Beta-Galaktosidase und Ribonuclease). Falls Enzyme verwendet werden, hat die Zugabe von chromo-, fluoro- oder lumogenen Substraten die Generierung eines detektierbaren Signals zur Folge. Andere Detektionssysteme, wie Zeit-aufgelöste Fluoreszenz, innen-Reflektions-Fluoreszenz, Amplifizierung (z. B. Polymerase-Ketten-Reaktion, PCR) und Raman Spektroskopie sind ebenfalls von Nutzen.
  • Es wurden Immunoassays entwickelt, um in biologischen Fluiden (z. B. Plasma, Serum, cerebrospinale Flüssigkeit, Speichel, Tränen, Nasenwaschungen oder wässrige Extrakte von Geweben oder Zellen) das Vorhandensein eines für ein Antigen von Interesse (z. B. Infektionserreger, Autoantigen, Allergen) spezifischen Antikörpers zu überwachen. In vielen Fällen sind diese Immunoassays mit spezifischen Antikörpern so entworfen worden, dass sie Antikörper Klassen- oder Unterklassenspezifisch sind. Es gibt zwei allgemeine Formate die üblicherweise dazu verwendet werden, spezifische Antikörper bei Menschen zu überwachen: (1) das Antigen ist an einer Festphase präsentiert; das humane biologische Fluid, das spezifische Antikörper enthält, wird mit dem Antigen reagieren gelassen, dann wird der an das Antigen gebundene Antikörper mit einem anti-Humanantikörper detektiert, der an eine signalgenerierende Verbindung gekoppelt ist und (2) ein anti-Humanantikörper wird an eine Festphase gebunden; das humane biologische Fluid, das spezifische Antikörper enthält, wird mit dem Antikörper reagieren gelassen, und dann wird Antigen hinzugefügt, das an eine signalgenerierende Verbindung gekoppelt ist, um den spezifischen Antikörper zu detektieren. In beiden Formaten kann das anti-Human-Antikörper-Reagens polyklonal oder monoklonal sein. Außerdem kann das anti-Human-Antikörper-Reagens alle Antikörperklassen erkennen oder alternativ, für eine bestimmte Antikörperklasse oder -Unterklasse spezifisch sein, abhängig von dem beabsichtigten Zweck des Assays. Die Reaktivität dieses Reagens reflektiert das Spektrum an Antikörpern aus denen es besteht und die besonderen Epitope der konstanten Region von Antikörpern an die sie binden. Die -Epitope der konstanten Region sind antigene Determinanten, gegen die eine Antikörperantwort generiert werden kann. Die Beispiele von Epitopen der konstanten Region schließen ein: Spezies-invariante Epitope (Klassen- oder Unterklassen-spezifische Epitope) und allotypische Epitope (die bei einigen, nicht aber bei allen Mitgliedern einer Spezies vorhanden sind). Die Verfahren zur Herstellung und zum Testen von anti-Human-Antikörper-Reagens, die an Epitope der konstanten Region binden, sind im Fachgebiet wohl bekannt. Von jemandem mit Erfahrung im Fachgebiet könnten in analoger Art und Weise Assays für die Überwachung von spezifischer Antikörperantwort in anderen Spezies entworfen werden.
  • Die Immunoassays, die für die Detektion spezifischer Antikörper entworfen wurden, stellen ein Maß der Antikörper-Aktivität zur Verfügung. Dieses kann als Antikörper-Titer bezeichnet werden, z. B. Mittelpunkt- oder Endpunkt-Titer, oder in Einheiten (Aktivität oder gravimetrisch) ausgedrückt werden, bezogen auf einen Referenz-Standard. Die Immunoassays und Kits schließen üblicherweise eine oder mehrere Komponenten ein, die den spezifischen Antikörper, der gemessen wird, enthalten, und die als Kalibratoren (Standards) und/oder Positivkontrolle funktionieren. Die Kalibratoren (Standards) werden zur Erstellung der Kalibrierungs-(Standard-) Kurven verwendet, für die Interpolation der Antikörper-Konzentration, oder alternativ kann ein einziger Kalibrator verwendet werden, in der Nähe des positiven/negativen Grenzwerts. Die Positivkontrolle wird dazu verwendet, die Leistungscharakteristika des Assays zu ermitteln und stellt einen nützlichen Indikator für die Unversehrtheit der Reagenzien dar. Zusätzlich schließen die Immunoassays und Kits für die Detektion spezifischer Antikörper im Allgemeinen eine Negativkontrolle ein, wie Serum oder Plasma, die keinen Antikörper enthält, der mit dem Antigen von Interesse reagieren kann. Vorzugsweise werden die Kalibratoren und Positivkontrollen mit dem zu messenden spezifischen Antikörper präpariert, oder mit einem Material das ihm chemisch ähnlich ist. Idealer Weise sind der/die Kalibrator (en) und Kontrollen so hergestellt, dass sie mit den anderen Komponenten des Assays in ähnlicher Weise wie der zu testende Analyt (spezifischer Antikörper) interagieren. Die Kalibratoren und Positivkontrollen werden im Allgemeinen hergestellt, indem man bekannte Mengen an spezifischem Antikörper, der aus seropositivem Plasma oder Serum (polyklonaler Antikörper) abgeleitet wurde, in das Negativkontrolle-Reagens einführt. Des öfteren werden multiple Kalibratoren eingeschlossen, die verschiedene Konzentrationen an spezifischem Antikörper enthalten, so dass sie den Bereich an Konzentration umfassen, für den die Messung im Assay entworfen wurde. Die quantitativen Immunoassays können bis zu 8 Kalibratoren (Standards) umfassen, um eine Kalibrierungs-(Standard-) Kurve zu erstellen, aus der Ergebnisse interpoliert werden können. Die Menge an spezifischem Antikörper, die dem(r/n) Kalibrator(en) und Kontrolle(n) zugeordnet ist, wird gegen die primären Referenz-Standards standardisiert. Im Falle der Antikörper-Aktivität wird der Referenz-Standard oft bestimmt, indem einzelne oder gepoolte Sera verwendet werden, die empirisch charakterisiert wurden, nach Eigenschaften wie Menge, Qualität und Spezifität. Dem Referenz-Standard können relative Einheiten der Aktivität zugeordnet werden oder eine gravimetrische Menge an Antikörper sein. Für qualitative Immunoassays kann ein einziger Kalibrator (Standard) verwendet werden, der in die Nähe des positiven/negativen Grenzwerts festgesetzt wird. Einige Hersteller bezeichnen den einzelnen Kalibrator (Standard) als einen Index-Kalibrator (Voller, A. et al., Immunoassays for the 80s, University-Park Press, Baltimore (1981); Albertini, A. and Ekins, R., eds., Monoclonal Antibodies- and Developments in Immunoassay, Elsevier/Notrth-Holland Biomedical Press, New York (1981); Butler, J., ed., Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay, CRC Press, Boca Raton (1991)).
  • Zwei Beispiele von Immunoassays, die auf immunometrisches Antikörper-Einfangen basieren, sind die IMx Toxo IgM und Toxo IgG (2) Antikörper-Assays die von Abbott Laboratories hergestellt werden. Beide Assays sind automatische Mikropartikel Enzym Immunoassays (MEIA), die Antikörper gegen Toxoplasma gondii (T. gondii) in Humanserum oder Plasma messen (Safford, J. W. et al., J. Clin. Pathol. 44: 238–242 (1991)). Ein Assay misst qualitativ IgM Antikörper, die ein kürzlich erfolgtes Ausgesetztsein oder eine akute Infektion anzeigen und der andere Assay misst qualitativ IgG Antikörper, die eine chronische oder eine vergangene Infektion anzeigen. T. gondii, ein obligat intrazellularer Parasit, der Erwachsene oft asymptomatisch infiziert, kann zu ernsthaften Folgen für den Fetus führen, wegen der transplazentaren Übertragung die während der akut erworbenen mütterlichen Infektion vorkommt (Remington, J. S. and Krahenbuhl J. L., Comprehensive Immunology (A. J. Nahmias and O'Reilly. Eds.) pgs. 327–371. Plenum, New York/London (1982); Remington, J. S., Intrauterine Infections: Birth defects Origin. Ser 4: 47–56. The National Foundation of the March of Dimes, New York (1968)). Die Bestimmung des mütterlichen Immunstatus durch das Testen auf das Vorhandensein von T. gondii spezifischen IgM oder IgG Antikörpern kann zur Feststellung einer Risikoschwangerschaft beitragen und sie ermöglicht, im Falle von seronegativen Individuen, das Überwachen zur Detektion einer Serokonversion, die eine akute Infektion anzeigen würde (Desmonts, G. and Couvreur J., New Engl. J. Med. 290: 1110–1116 (1974); McCabe, R. and Remington, J. S., New Engl. J. Med. 318: 313–317 (1988); Sibalic, D. et al., Gynecol. Obstet. Invest. 36: 91–95 (1993)). Diese Assays verwenden als Festphase mit T. gondii Antigenen beschichtete Mikropartikel. Dann wird die Untersuchungsprobe zu den beschichteten Mikropartikeln hinzugefügt, um den für T. gondii spezifischen Antikörpern die Bindung zu ermöglichen. Anschließend wird ein mit alkalischer Phosphatase konjugiertes anti-Human IgM (oder anti-Human IgG) hinzugefügt, das spezifisch an Antikörper der IgM (oder IgG) Klasse bindet, die mit den T. gondi Antigenen komplexiert sind. Nach der Zugabe eines geeigneten Substrats wird die Rate des Enzym katalysierten Turnovers mit Hilfe von Fluoreszenz überwacht.
  • Die Kalibratoren und Positivkontrollen für die IgM und IgG anti- T. gondii Assays werden aus Plasma präpariert, das von Human-Spendern gesammelt wird, die auf T. gondii reaktiv sind. Das Plasma oder das Serum mit hohem Titer hat traditionsgemäß als Quelle für Kontrollen und/oder Kalibratoren (Standards) gedient, in diagnostischen Assays und Kits die zur Überwachung des Vorhandenseins von gegen ein gegebenes Antigen spezifischen Human- Antikörpern entworfen wurden. Diese schließen -Tests ein, zum Nachweis von Antikörpern gegen das Human-Immunodefizienz Virus-1, das Human-Immunodefizienz Virus-2, das Human-T-Zellen Leukämie Virus-1, das Human-T-Zellen Leukämie Virus-2, das Zytomegalovirus, das Hepatitis A Virus, das Hepatitis B Virus, das Hepatitis C Virus, das Hepatitis D Virus, das Hepatitis E Virus, das Respiratory-syncytial-Virus, das Röteln-Virus, Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Helicobacter pylori und Streptococcus pyogenes. Die Verwendung von humanem seropositivem Plasma oder Serum zur Herstellung von Kalibratoren (Standards) und/oder Kontrollen hat verschiedene wesentlichen Nachteile, einschließlich: (1) steigende Schwierigkeiten beim Ausfindigmachen von -Quellen für große Volumina an Plasma oder Serum mit hohem Titer, hoher Spezifität und bei denen Antikörper gegen andere Infektionserreger fehlen, (2) eine erhebliche Los-zu-Los Variabilität im Laufe der Zeit, bezüglich des Titers und der Spezifität, was sich auf die Leistung des Assay auswirkt, (3) inhärente Limitierungen bezüglich der Charakterisierung eines Antiserums, aufgrund seiner polyklonalen Natur (Heterogenität der Antikörperklasse, der Spezifität und der Affinität) und (4) Kosten. Eigentlich ist es denkbar, dass es in manchen Fällen unmöglich sein könnte die Herstellung der Kalibratoren und/oder Kontrollen, die auf seropositives humanes Plasma- basieren, wegen Ausgang der Quellen beizubehalten. Es kann besonders schwierig sein Quellen mit hohem Titer an IgM Antikörper ausfindig zu machen, weil diese im Allgemeinen. von akut infizierten Individuen erhalten werden. So zum Beispiel ist das Ausfindigmachen von gegen Röteln reaktives IgM in den U. S. schwierig, wegen dem erfolgreichen Impfungsprogramm. In dem Maße in dem das Ausfindigmachen von Quellen an geeignetem seropositiven Plasma oder Serum schwieriger wird, steigen die Kosten, die die Herstellung von Kalibratoren und Kontrollen betreffen und diese ökonomische Last wird letztendlich auf den Patienten übertragen. Ein alternatives Verfahren für die Herstellung von Kalibratoren (Standards) und/oder Positivkontrollen für diagnostische Assays und Kits, die dazu entworfen sind, die Niveaus an spezifischem Antikörper zu überwachen, würde ein wesentlicher Fortschritt bedeuten.
  • Gentechnisch erzeugte Antikörper, so wie Maus : Human schimäre Antikörper, können als Reagenzien für die Qualitätskontrolle verwendet werden, für das Testen der Spezifität von anti-Human-Antikörper-Konjugate und für die Qualitätskontrolle von Immunoassays für humanes Gesamtimmunoglobulin. Es wurde außerdem vorgeschlagen, dass diese schimären Antikörper nützliche Reagenzien sein könnten, für die quantitative Bestimmung von spezifischen Antikörper in Referenz-Standards. Die schimären Antikörper würden zur Erstellung einer heterologen Dosis-Antwort-Kurve verwendet werden, um die Menge an Antikörper in einem Referenz-Standard, der für ein anderes Antigen spezifisch ist, zu interpolieren (Hamilton R. G., Ann. Biol. Clin. 48: 473–477 (1990); Butler J. E. and Hamilton R. G., In Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay; Butler J. E. ed., CRC Press, Bota Raton, pgs 173–198 (1991)). Der Ausdruck „heterolog" zeigt an, dass das Antigen, für das die schimären Antikörper spezifisch sind, definiert ist, aber nicht mit dem Antigen verwandt, für das der spezifische Antikörper überwacht wird.
  • Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich von der vorher erwähnten in zwei wichtigen Merkmalen: (1) es wird beabsichtigt die vorgeschlagenen Reagenzien in der Herstellung von Kalibratoren (Standards) und/oder Positivkontrollen zu verwenden, in Immunoassays und Kits die zur Überwachung Antigen spezifischer Antikörper-Antworten entworfen wurden, als ein Ersatz für seropositives Plasma oder Serum, und (2) die vorgeschlagenen Reagenzien binden an das gleiche oder das „homologe" Antigen, an das der gemessene spezifische Antikörper bindet. Die Verwendung von Reagenzien, die an das homologe Antigen binden, sind insoweit vorzuziehen, als dass der Kalibrator, die Positivkontrolle und die Testprobe mit dem gleichen Antigen reagieren, unter identischen Bedingungen, was ein realistischeres Maß an Aktivität des spezifischen Antikörpers zur Verfügung stellt und den zusätzlichen Vorteil hat, die Überwachung der Integrität des Test-Antigens zu ermöglichen, während der Assay läuft.
  • Eine alternative Quelle an Material für die Herstellung von Positivkontrollen für Immunoassays, die zur Detektion spezifischer Human-Antikörper entworfen wurden, ist nicht-Human-Immun-Antikörper der mit einem anti-Human-Antikörper reagiert (U. S. Patent 5.008.183). Die Verwendung von nicht-Human-Immun-(polyklonalen)-Sera hat verschiedene Nachteile, einschließlich (a) eine Los-zu-Los Variabilität im Laufe der Zeit, bezüglich der Antikörper-Klassen-Zusammensetzung., des Titers, der Spezifität und Affinität, was sich auf die Leistung des Assay auswirken kann; (b) Schwierigkeiten bezüglich der Charakterisierung, aufgrund seiner polyklonalen Zusammensetzung (z. B. heterogene Affinität und Spezifität); (c) limitierte Versorgung; und (d) im Falle von Infektionserregern, biologisches Risiko, wenn lebende Organismen zur Immunisierung verwendet werden.
  • Eine alternative Quelle an Material für die Herstellung von Kalibratoren und Kontrollen für IgM Assays ist ein zusammengesetzter Antikörper, aus einem nicht-spezifischen IgM-Immunoglobulin-Anteil, der an einen spezifischen nicht-IgM-Antikörper-Anteil gebunden ist (U. S. Patent 5.478.753). Die Verwendung von Immunsera zur Produktion des zusammengesetzten Antikörpers hat all die oben skizzierten inhärenten Nachteile. Außerdem muss man sowohl für die Immun- als auch für die nicht-Immunanteile, die zur Konstruktion des zusammengesetzten Antikörpers verwendet werden, Quellen ausfindig machen und die Anteile reinigen. Zusätzlich würden die chemisch quervernetzten Produkte heterogen sein, bezüglich der Anzahl und der Lokalisation der gebundenen nicht-immunen Antikörper-Anteile. Eigentlich kann die Bindung in der Nähe der Bindungsstelle eine Beeinträchtigung der Antigen-Bindung durch den spezifischen Antikörper zur Folge haben.
  • Die Verwendung der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Reagenzien, die an einen Liganden binden, enthalten einen oder mehrere Epitope der konstanten Region und sind bezüglich ihrer Spezifität und Affinität homogen (d. h. alle Moleküle sind uniform bezüglich der Eigenschaften Spezifität und Affinität) und umgehen alle Probleme, die mit der Verwendung eines Immunserums in der Herstellung von Kalibratoren und Positivkontrollen verbunden sind. Außerdem wird eine uniformere Zusammensetzung erhalten, weil die Epitope der konstanten Region ein Integralteil des Reagens sind (d. h. direkt an die Liganden bindende Domäne fusioniert sind). Zusätzlich können die vorliegenden Reagenzien mit Leichtigkeit und reproduzierbar in eigentlich unlimitierten Mengen erzeugt werden und sind auch für die Quantifizierung und die Überwachung der Integrität des im Assay verwendeten Antigens nützlich.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Traditionsgemäß haben Diagnose-Assays und Kits, die zum Nachweis von Human-Antikörpern entworfen wurden, die für ein bestimmtes Antigen spezifisch sind (z. B. Human-Immunodefizienz Virus-1, Human-Immunodefizienz Virus-2, Human-T-Zellen Leukämie Virus-1, Human-T-Zellen Leukämie Virus-2, Zytomegalovirus, Hepatitis A Virus, Hepatitis B Virus, Hepatitis C Virus, Hepatitis D Virus, Hepatitis E Virus, Hepatitis GB Virus, Respiratory-syncytial-Virus, Röteln-Virus, Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Helicobacter pylori und Streptococcus pyogenes), humanes seropositives Plasma (polyklanaler Antikörper) verwendet oder Serum, um Kalibratoren (Standards) und Kontrollen herzustellen. Im Gegensatz dazu bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Verwendung von Reagenzien als Kalibratoren (Standards) und/oder Kontrollen in solchen Diagnose-Assays und Kits, statt Plasma oder Serum. Konkreter, es können eines oder mehrere dieser Reagenzien statt seropositivem Plasma oder Serum als Kalibratoren (Standards) und/oder Kontrollen in Diagnose-Assays und Kits verwendet werden, die zur quantitativen oder qualitativen Messung von für einen gewünschten Liganden spezifischen Antikörper entworfen wurden. Die Reagenzien selber binden spezifisch an einen vorbestimmten Liganden, enthalten ein oder mehrere Epitope der konstanten Region von Antikörpern und sind homogen oder uniform in Spezifität und Affinität. Die Agenzien können durch die Verwendung von Hybridoma- und/oder rekombinanter DNA-Technologie produziert werden.
  • Konkreter enthält die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Antikörpers der in einer Testprobe vorhanden sein kann, worin dieses Verfahren folgendes umfasst (a) in Kontakt bringen der Testprobe, von der vermutet wird, dass sie den Antikörper enthält, mit einem für den Antikörper spezifischen Antigen, für einen Zeitraum und unter Bedingungen die ausreichend sind, die Bildung von Antigen/Antikörper Komplexen zu erlauben, (b) Nachweis des Antikörpers, der in der Testprobe vorhanden sein kann und (c) Verwendung eines Reagens, als Kontrolle oder Kalibrator, das an das Antigen bindet, wobei die Verbesserung folgendes umfasst: die Verwendung, als Kontrolle oder Kalibrator, eines Reagens, das ein oder mehrere Epitope der konstanten Region von Antikörpern umfasst, worin das Reagens an das Antigen bindet und bezüglich der Spezifität und Affinität homogen ist.
  • Die Erfindung schließt auch ein Verfahren zum Nachweis eines Antikörpers ein, der in einer Testprobe vorhanden sein kann, worin dieses Verfahren folgendes umfasst (a) in Kontakt bringen der Testprobe, von der vermutet wird, dass sie den Antikörper enthält, mit einem für den Antikörper spezifischen Antigen, für einen Zeitraum und unter Bedingungen die ausreichend sind, die Bildung von Antigen/Antikörper – Komplexen zu erlauben, (b) Nachweis des Antikörpers der in der Testprobe vorhanden sein kann und (c) Verwendung von zwei oder mehreren Reagenzien, als Kontrolle oder Kalibrator, die das Antigen binden, wobei die Verbesserung folgendes umfasst: die Verwendung, als Kontrolle oder Kalibrator, von zwei oder mehreren Reagenzien von denen jedes eine oder mehrere Epitope der konstanten Region von Antikörpern umfasst, worin jedes der beiden oder mehreren Reagenzien an verschiedene Epitope auf dem besagten Antigen bindet und bezüglich der Spezifität und Affinität homogen ist.
  • Außerdem umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Antikörpers der in einer Testprobe vorhanden sein kann, worin dieses Verfahren folgendes umfasst (a) in Kontakt bringen der Testprobe, von der vermutet wird, dass sie den Antikörper enthält, mit einem für den Antikörper spezifischen Antigen, für einen Zeitraum und unter Bedingungen die ausreichend sind, die Bildung von Antigen/Antikörper – Komplexen zu erlauben, (b) Hinzufügen eines direkten oder indirekten Konjugats zu den resultierenden Antigen/Antikörper – Komplexen für einen Zeitraum und unter Bedingungen die ausreichend sind, um dem Konjugat zu erlauben an den gebundenen Antikörper zu binden, worin das Konjugat einen Antikörper umfasst, der an eine signalerzeugende Verbindung gebunden ist, die in der Lage ist ein detektierbares Signal zu erzeugen, (c) Nachweis des Antikörpers, der in der Testprobe vorhanden sein kann, durch detektieren des Signals, das von der signalerzeugenden Verbindung erzeugt wird und (d) Verwendung eines Reagens, als Kontrolle oder Kalibrator, das an das Antigen bindet, wobei die Verbesserung folgendes umfasst: die Verwendung, als Kontrolle oder Kalibrator, eines Reagens, das ein oder mehrere Epitope der konstanten Region von Antikörpern umfasst, worin das Reagens an das Antigen bindet und bezüglich der Spezifität und Affinität homogen ist.
  • Die vorliegende Erfindung enthält zusätzlich ein Verfahren zum Nachweis eines Antikörpers der in einer Testprobe vorhanden sein kann, worin dieses Verfahren folgendes umfasst (a) in Kontakt bringen der Testprobe, von der vermutet wird, dass sie den Antikörper enthält, mit einem für den Antikörper spezifischen Antigen, für einen Zeitraum und unter Bedingungen die ausreichend sind, die Bildung von Antigen/Antikörper Komplexen zu erlauben, (b) Hinzufügen eines direkten oder indirekten Konjugats zu den resultierenden Antigen/Antikörper Komplexen für einen Zeitraum und unter Bedingungen die ausreichend sind, um dem Konjugat zu erlauben an den gebundenen Antikörper zu binden, worin das besagte Konjugat einen Antikörper umfasst, der an eine signalerzeugende Verbindung gebunden ist, die in der Lage ist ein detektierbares Signal zu erzeugen, (c) Nachweis des Antikörpers, der in der Testprobe vorhanden sein kann, durch detektieren des Signals, das von der signalerzeugenden Verbindung erzeugt wird und (d) Verwendung, als Kontrolle oder Kalibrator, von zwei oder mehreren Reagenzien die das Antigen binden, wobei die Verbesserung folgendes umfasst: die Verwendung, als Kontrolle oder Kalibrator, von zwei oder mehreren Reagenzien von denen jedes eine oder mehrere Epitope der konstanten Region von Antikörpern umfasst, worin jedes der beiden oder mehreren Reagenzien an verschiedene Epitope auf dem Antigen bindet und bezüglich der Spezifität und Affinität homogen ist.
  • In all den obigen Verfahren kann das Reagens ausgewählt werden aus der Gruppe die folgendes umfasst: einen schimären monoklonalen Antikörper, der variable Regionen der H und L Kette von einer Wirtsspezies umfasst, fusioniert an Gene der konstanten Region, die von derselben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, abgeleitet sind, einen monoklonalen Antikörper, der von derselben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, abgeleitet ist, einen monoklonalen Antikörper, der von einer Spezies abgeleitet ist, die auf der Basis von immunologischer Kreuzreaktivität mit dem Antikörper, der gemessen wird, verwandt ist und ein Polypeptid, das an eine konstante Region des Antikörpers fusioniert ist, oder an ein Fragment davon, die von derselben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, abgeleitet ist oder auf der Basis von immunologischer Kreuzreaktivität mit der Wirtsspezies verwandt ist. Der schimäre monoklonale Antikörper kann variable Regionen der H und L Kette, die von einem Nagetier abgeleitet wurden und Gene der konstanten Region der H und L Kette, die von einem Menschen abgeleitet sind, enthalten. Zusätzlich kann der schimäre monoklonale Antikörper spezifisch an Toxoplasma gondii und noch spezifischer an deren Proteine P30 oder P66 binden.
  • In den Verfahren die ein Reagens involvieren, kann die variable Region der H Kette des schimären monoklonalen Antikörpers, falls das Reagens so gestaltet ist, von der in 6 gezeigten Nucleotid-Sequenz codiert werden, oder von allelen Variationen davon und die variable Region der L Kette des schimären monoklonalen Antikörpers kann von der in 7 gezeigten Nucleotid-Sequenz codiert werden, oder von allelen Variationen davon. Die variable Region der H Kette des schimären monoklonalen Antikörpers kann die in 6 gezeigte Aminosäure-Sequenz haben und die variable Region der L. Kette des schimären monoklonalen Antikörpers kann die in 7 gezeigte Aminosäure-Sequenz haben.
  • Alternativ kann die variable Region der H Kette des schimären monoklonalen Antikörpers von der in 8 gezeigten Nucleotid-Sequenz codiert werden, oder von allelen Variationen davon und die variable Region der L Kette des schimären monoklonalen Antikörpers kann von der in 9 gezeigten Nucleotid-Sequenz codiert werden, oder von allelen Variationen davon. Die variable Region der H Kette des schimären monoklonalen Antikörpers kann die in 8 gezeigte-Aminosäure-Sequenz haben und die variable Region der L Kette des schimären monoklonalen Antikörpers kann die in 9 gezeigte Aminosäure-Sequenz haben.
  • In den obigen Verfahren, die mehr als ein Reagens involvieren, worin jedes ein schimärer monoklonaler Antikörper ist, kann die variable Region der H Kette, die eines der beiden oder mehreren Reagenzien darstellt, von der in 6 gezeigten Nucleotid-Sequenz codiert werden, oder von allelen Variationen davon und die variable Region der L Kette des schimären monoklonalen Antikörpers, der den gleichen einen der beiden oder mehreren Reagenzien darstellt, kann von der in 7 gezeigten Nucleotid-Sequenz codiert werden, oder von allelen Variationen davon und die. variable Region der H Kette des schimären monoklonalen Antikörpers, der einen der zwei oder mehreren Reagenzien darstellt, kann von der in 8 gezeigten Nucleotid-Sequenz codiert werden und die variable Region der L Kette von dem anderen der beiden oder mehreren Reagenzien, kann von der in 9 gezeigten Nucleotid-Sequenz, oder von allelen Variationen davon, codiert werden.
  • Die variable Region der H Kette des schimären monoklonalen Antikörpers, der einen der beiden oder mehreren Reagenzien darstellt, kann die in 6 gezeigte Aminosäure-Sequenz haben und die variable Region der L Kette des schimären monoklonalen Antikörpers, der einen der beiden oder mehreren Reagenzien darstellt, kann die in 7 gezeigte Aminosäure-Sequenz haben, und die variable Region der H Kette des schimären monoklonalen Antikörpers, der einen anderen der beiden oder mehreren Reagenzien darstellt, kann die in 8 gezeigte Aminosäure-Sequenz haben und die variable Region der L Kette dieses anderen der beiden oder mehreren Reagenzien, kann die in 9 gezeigte Aminosäure-Sequenz haben.
  • In den obigen Verfahren wird der Antikörper, der in der Testprobe detektiert werden soll, aus der Gruppe selektiert, die folgendes umfasst: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM. Das Antigen kann aus der Gruppe selektiert werden, die folgendes umfasst: einen Infektionserreger, ein Autoantigen, ein Allergen und eine pharmazeutische Verbindung. Der Infektionserreger kann aus der Gruppe selektiert werden, die folgendes umfasst: einen Parasiten, ein Bakterium, einen Fungus, eine Hefe und ein Virus. Konkreter kann das Virus aus der Gruppe selektiert werden, die folgendes umfasst: Human-Immunodefizienz Virus-1, Human-Immunodefizienz Virus-2, Human-T-Zellen Leukämie Virus-1, Human-T-Zellen Leukämie Virus-2, Zytomegalovirus, Hepatitis A Virus, Hepatitis B Virus, Hepatitis C Virus, Hepatitis D Virus, Hepatitis E Virus, Hepatitis GB Virus, Respiratory-syncytial-Virus und Röteln-Virus. Der Parasit kann aus der Gruppe selektiert werden, die folgendes umfasst: Toxoplasma gondii und Trypanosoma cruzi. Der Fungus kann aus der Gruppe selektiert werden, die folgendes umfasst: Histoplasma capsulatum und Cryptococcus neoformans und das Bakterium kann aus der Gruppe selektiert werden, die folgendes umfasst Helicobacter pylori und Streptococcus pyogenes.
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Kit zum Nachweis von Antikörpern in einer Testprobe, das folgendes umfasst: a) ein für den Antikörper spezifisches Antigen; und b) eine Kontrolle oder einen Kalibrator, der ein Reagens umfasst, worin das Reagens ein oder mehrere Epitope der konstanten Region des Antikörpers umfasst, an das Antigen bindet und bezüglich der Spezifität und Affinität homogen ist.
  • Die Erfindung schließt auch ein Kit zum Nachweis von Antikörpern in einer Testprobe ein, das folgendes umfasst: a) ein für den Antikörper spezifisches Antigen; und b) eine Kontrolle oder einen Kalibrator, der zwei oder mehrere Reagenzien umfasst, worin jedes der beiden oder mehreren Reagenzien ein oder mehrere Epitope der konstanten Region des Antikörpers umfasst, an das Antigen bindet und bezüglich der Spezifität und Affinität homogen ist.
  • Zusätzlich schließt die Erfindung auch ein Kit ein, zum Nachweis von Antikörpern in einer Testprobe, das folgendes umfasst: a) ein für den Antikörper spezifisches Antigen; und b) ein direktes oder indirektes Konjugat, das einen an ein signalerzeugende Verbindung gebundenen Antikörper umfasst, die in der Lage ist ein detektierbares Signal zu erzeugen; und c) eine Kontrolle oder einen Kalibrator, der ein Reagens umfasst, worin das Reagens ein oder mehrere Epitope der konstanten Region des Antikörpers umfasst, an das Antigen bindet und bezüglich der Spezifität und Affinität homogen ist.
  • Außerdem schließt die Erfindung ein Kit ein, zum Nachweis von Antikörpern in einer Testprobe, das folgendes umfasst: a) ein für den Antikörper spezifisches Antigen; b) ein direktes oder indirektes Konjugat, das einen an ein signalerzeugende Verbindung gebundenen Antikörper umfasst, die in der Lage ist, ein detektierbares Signal zu erzeugen; und c) eine Kontrolle oder einen Kalibrator, der zwei oder mehrere Reagenzien umfasst, worin jedes der beiden oder mehreren Reagenzien ein oder mehrere Epitope der konstanten Region des Antikörpers umfasst, an verschiedene Epitope auf dem Antigen bindet und bezüglich der Spezifität und Affinität homogen ist.
  • In all den obigen Kits kann das Reagens selektiert werden aus der Gruppe die folgendes umfasst: einen schimären monoklonalen Antikörper, der variable Regionen der H und L Kette von einer Wirtsspezies umfasst, fusioniert an Gene der konstanten Region, die von derselben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, abgeleitet sind, ein monoklonaler Antikörper, der von derselben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, abgeleitet ist, ein monoklonaler Antikörper, der von einer Spezies abgeleitet ist, die auf der Basis von immunologischer Kreuzreaktivität mit dem Antikörper, der gemessen wird, verwandt ist und ein Polypeptid, das an eine konstante Region des Antikörpers fusioniert ist, oder an ein Fragment davon, die von derselben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, abgeleitet ist oder auf der Basis von immunologischer Kreuzreaktivität mit der Wirtsspezies verwandt ist.
  • Wenn das Reagens ein schimärer monoklonaler Antikörper ist, umfasst es variable Regionen der H und L Kette, die von einem Nagetier abgeleitet wurden und Gene der konstanten Region der H und L Kette, die von einem Menschen abgeleitet wurden.
  • Außerdem kann der zu detektierende Antikörper aus der Gruppe selektiert werden, die folgendes umfasst: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM. Das Antigen der Kits kann aus der Gruppe selektiert werden, die folgendes umfasst: einen Infektionserreger, ein Autoantigen, ein Allergen und eine pharmazeutische Verbindung. Der Infektionserreger kann aus der Gruppe selektiert werden, die folgendes umfasst: einen Parasiten, ein Bakterium, einen Fungus, eine Hefe und ein Virus. Konkreter kann das Virus aus der Gruppe selektiert werden, die folgendes umfasst: Human-Immunodefizienz Virus-1, Human-Immunodefizienz Virus-2, Human-T-Zellen Leukämie Virus-1, Human-T-Zellen Leukämie Virus-2, Zytomegalovirus, Hepatitis A Virus, Hepatitis B Virus, Hepatitis C Virus, Hepatitis D Virus, Hepatitis E Virus, Hepatitis GB Virus, Respiratory-syncytial-Virus und Röteln-Virus. Der Parasit kann aus der Gruppe selektiert werden, die folgendes umfasst: Toxoplasma gondii und Trypanosoma cruzi. Der Fungus kann aus der Gruppe- selektiert werden, die folgendes umfasst: Histoplasma capsulatum und Cryptococcus neoformans und das Bakterium kann aus der Gruppe selektiert werden, die folgendes umfasst Welicobacter pylori und Streptococcus pyogenes.
  • Zusätzlich schließt die vorliegende Erfindung ein Verfahren ein, zum Nachweis eines Antikörpers der in einer Testprobe vorhanden sein kann, worin das Verfahren folgendes umfasst (a) in Kontakt bringen der Testprobe, von der vermutet wird, dass sie den Antikörper enthält, mit einem für den Antikörper spezifischen anti-Antikörper, für einen Zeitraum und unter Bedingungen die ausreichend sind, die Bildung von anti-Antikörper /Antikörper – Komplexen zu erlauben, (b) Nachweis des Antikörpers, der in der Testprobe vorhanden sein kann und (c) Verwendung eines Reagens, als Kontrolle oder Kalibrator, das an den anti-Antikörper bindet, wobei die Verbesserung folgendes umfasst: die Verwendung, als Kontrolle oder Kalibrator, eines Reagens, das ein oder mehrere Epitope der konstanten Region von Antikörpern umfasst, worin das Reagens an ein Antigen bindet, das für den besagten Antikörper spezifisch ist und bezüglich der Spezifität und Affinität homogen ist.
  • Die Erfindung schließt auch ein Verfahren ein, zum Nachweis eines Antikörpers der in einer Testprobe vorhanden sein kann, worin das Verfahren folgendes umfasst (a) in Kontakt bringen der Testprobe, von der vermutet wird, dass sie den Antikörper enthält, mit einem für den Antikörper spezifischen anti-Antikörper, für einen Zeitraum und unter Bedingungen die ausreichend sind, die Bildung von anti-Antikörper /Antikörper – Komplexen zu erlauben, (b) Nachweis des Antikörpers, der in der Testprobe vorhanden sein kann und (c) Verwendung von zwei oder mehreren Reagenzien, als Kontrolle oder Kalibrator, die den anti-Antikörper binden, wobei die Verbesserung folgendes umfasst: die Verwendung, als Kontrolle oder Kalibrator, von zwei oder mehreren Reagenzien, von denen jedes ein oder mehrere Epitope der konstanten Region von Antikörpern umfasst, worin jedes der beiden oder mehreren Reagenzien an verschiedene Epitope auf dem besagten Antigen bindet und bezüglich der Spezifität und Affinität homogen ist.
  • Außerdem schließt die vorliegende Erfindung ein. Verfahren ein, zum Nachweis von Antikörpern die in einer Testprobe vorhanden sein können, worin dieses Verfahren folgendes umfasst (a) in Kontakt bringen der Testprobe, von der vermutet wird, dass sie den Antikörper enthält, mit einem für den Antikörper spezifischen anti-Antikörper, für einen Zeitraum und unter Bedingungen die ausreichend sind, die Bildung von anti-Antikörper /Antikörper – Komplexen zu erlauben, (b) Hinzufügen eines Konjugats zu den resultierenden anti-Antikörper /Antikörper – Komplexen für einen Zeitraum und unter Bedingungen die ausreichend sind, um dem Konjugat zu erlauben an den gebundenen Antikörper zu binden, worin das Konjugat einen Antikörper umfasst, der an eine signalerzeugende Verbindung gebunden ist, die in der Lage ist ein detektierbares Signal zu erzeugen, (c) Nachweis des Antikörpers, der in der Testprobe vorhanden sein kann, durch detektieren des Signals, das von der signalerzeugenden Verbindung erzeugt wird und (d) Verwendung eines Reagens, als Kontrolle oder Kalibrator, das Antikörper gegen den anti-Antikörper enthält, wobei die Verbesserung folgendes umfasst: die Verwendung, als Kontrolle oder Kalibrator, eines Reagens, das ein oder mehrere Epitope der konstanten Region von Antikörpern umfasst, worin das Reagens an das Antigen bindet und bezüglich der Spezifität und Affinität homogen ist.
  • Außerdem umfasst ein anderes Verfahren der Erfindung, zum Nachweis eines Antikörpers der in einer Testprobe vorhanden sein kann, (a) in Kontakt bringen der Testprobe, von der vermutet wird, dass sie den Antikörper enthält, mit einem für den Antikörper spezifischen anti-Antikörper, für einen Zeitraum und unter Bedingungen die ausreichend sind, die Bildung von anti-Antikörper /Antikörper – Komplexen zu erlauben, (b) Hinzufügen eines Konjugats zu den resultierenden anti-Antikörper/Antikörper – Komplexen für einen Zeitraum und unter Bedingungen die ausreichend sind, um dem Konjugat zu erlauben an den gebundenen Antikörper zu binden, worin das Konjugat ein Antigen umfasst, das an eine signalerzeugende Verbindung gebunden ist, die in der Lage ist ein detektierbares Signal zu erzeugen, (c) Nachweis des Antikörpers, der in der Testprobe vorhanden sein kann, durch detektieren des Signals, das von der signalerzeugenden Verbindung erzeugt wird und (d) Verwendung, als Kontrolle oder Kalibrator, von zwei oder mehreren Reagenzien die an den anti-Antikörper binden, wobei die Verbesserung folgendes umfasst: die Verwendung, als Kontrolle oder Kalibrator, von zwei oder mehreren Reagenzien von denen jedes ein oder mehrere Epitope der konstanten Region von Antikörpern umfasst, worin jedes der beiden oder mehreren Reagenzien an verschiedene Epitope auf dem Antigen bindet und eine einzigartige Spezifität und Affinität besitzt.
  • In all den gleich oben vorgestellten Verfahren kann das Reagens selektiert werden aus der Gruppe die folgendes umfasst: einen schimären monoklonalen Antikörper, der variable Regionen der H und L Kette von einer Wirtsspezies umfasst, fusioniert an Gene der konstanten Region, die von derselben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, abgeleitet sind, einen monoklonalen Antikörper, der von derselben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, abgeleitet ist, ein monoklonaler Antikörper, der von einer Spezies abgeleitet ist, die auf der Basis von immunologischer Kreuzreaktivität mit dem Antikörper, der gemessen wird, verwandt ist und ein Polypeptid, das an eine konstante Region des Antikörpers, oder an ein Fragment davon, fusioniert ist, die von derselben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, abgeleitet ist oder auf der Basis von immunologischer Kreuzreaktivität mit der Wirtsspezies verwandt ist.
  • Falls das Reagens ein schimärer monoklonaler Antikörper ist, umfasst es variable Regionen der H und L Kette, die von einem Nagetier abgeleitet wurden und Gene der konstanten Region der H und L Kette, die von einem Menschen abgeleitet sind. Der schimäre monoklonale Antikörper kann spezifisch an Toxoplasma gondii binden. Noch spezifischer kann der schimäre monoklonale Antikörper an das Protein P30 oder das Protein P66 von Toxoplasma gondii binden.
  • In den Verfahren in die ein Reagens involviert ist, wo das Reagens ein schimärer monoklonaler Antikörper ist, kann die variable Region der H Kette des schimären monoklonalen Antikörpers von der in 6 gezeigten Nucleotid-Sequenz codiert werden, oder von allelen Variationen davon und die variable Region der L Kette des schimären monoklonalen Antikörpers kann von der in 7 gezeigten Nucleotid-Sequenz codiert werden, oder von allelen Variationen davon. Die variable Region der H Kette des schimären monoklonalen Antikörpers kann die in 6 gezeigte Aminosäure-Sequenz haben und die variable Region der L Kette des schimären monoklonalen Antikörpers kann die in 7 gezeigte Aminosäure-Sequenz haben.
  • Alternativ, kann die variable Region der H Kette des schimären monoklonalen Antikörpers von der in 8 gezeigten Nucleotid-Sequenz codiert werden, oder von allelen Variationen davon und die variable Region der L Kette des schimären monoklonalen Antikörpers kann von der in 9 gezeigten Nucleotid-Sequenz codiert werden, oder von allelen Variationen davon. Die variable Region der H Kette des schimären monoklonalen Antikörpers kann die in 8 gezeigte Aminosäure-Sequenz haben und die variable Region der L Kette des schimären monoklonalen Antikörpers kann die in 9 gezeigte Aminosäure-Sequenz haben.
  • In den Verfahren, die mehr als ein Reagens involvieren, kann die variable Region der H Kette des schimären monoklonalen Antikörpers, die eines der beiden oder mehreren Reagenzien darstellt, von der in 6 gezeigten Nucleotid-Sequenz codiert werden, oder von allelen Variationen davon und die variable Region der L Kette des schimären monoklonalen Antikörpers, der das gleiche eine der beiden oder mehreren Reagenzien darstellt, kann von der in 7 gezeigten Nucleotid-Sequenz codiert werden, oder von allelen Variationen davon und die variable Region der H Kette des schimären monoklonalen Antikörpers, der das andere der zwei oder mehreren Reagenzien darstellt, kann von der in 8 gezeigten Nucleotid-Sequenz codiert werden und die variable Region der L Kette dieses anderen der beiden oder mehreren Reagenzien, kann von der in 9 gezeigten Nucleotid-Sequenz, oder von allelen Variationen davon, codiert werden. Die variable Region der H Kette des schimären monoklonalen Antikörpers, der eines der beiden oder mehreren Reagenzien darstellt, kann die in 6 gezeigte Aminosäure-Sequenz haben und die variable Region der L Kette des schimären monoklonalen Antikörpers, der dieses eine der beiden oder mehreren Reagenzien darstellt, kann die in 7 gezeigte Aminosäure-Sequenz haben, und die variable Region der H Kette des schimären monoklonalen Antikörpers, der einen anderen der beiden oder mehreren Reagenzien darstellt, kann die in 8 gezeigte Aminosäure-Sequenz haben und die variable Region der L Kette dieses andern der beiden oder mehrerer Reagenzien, kann die in 9 gezeigte Aminosäure-Sequenz haben.
  • Der Antikörper, der in besagter Testprobe detektiert werden soll, kann aus der Gruppe selektiert, die folgendes umfasst: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM. Das Antigen kann aus der Gruppe selektiert werden, die folgendes umfasst: einen Infektionserreger, ein Autoantigen, ein Allergen und eine pharmazeutische Verbindung. Der Infektionserreger kann aus der Gruppe selektiert werden, die folgendes umfasst: einen Parasiten, ein Bakterium, einen Fungus, eine Hefe und einen Virus. Konkreter kann das Virus aus der Gruppe selektiert werden, die folgendes umfasst: Human-Immunodefizienz Virus-1, Human-Immunodefizienz Virus-2, Human-T-Zellen Leukämie Virus-1, Human-T-Zellen Leukämie Virus-2, Zytomegalovirus, Hepatitis A Virus, Hepatitis B Virus, Hepatitis C Virus, Hepatitis D Virus, Hepatitis E Virus, Hepatitis GB Virus, Respiratory-syncytial-Virus und Röteln-Virus. Der Parasit kann aus der Gruppe selektiert werden, die folgendes umfasst: Toxoplasma gondii und Trypanosoma cruzi. Der Fungus kann aus der Gruppe selektiert werden, die folgendes umfasst: Histoplasma capsulatum und Cryptococcus neoformans und das Bakterium kann aus der Gruppe selektiert werden, die folgendes umfasst Helicobacter pylori und Streptococcus pyogenes.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Kit zum Nachweis von Antikörpern in einer Testprobe, das folgendes umfasst: a) einen für den Antikörper spezifischen anti-Antikörper; b) ein für den Antikörper spezifisches Antigen; und c) eine Kontrolle oder einen Kalibrator, der ein Reagens umfasst, worin das Reagens ein oder mehrere Epitope der konstanten Region des Antikörpers umfasst, an das Antigen bindet und bezüglich der Spezifität und Affinität homogen ist.
  • Zusätzlich schließt die Erfindung auch ein Kit ein, zum Nachweis von Antikörpern in einer Testprobe, das folgendes umfasst: a) einen für den Antikörper spezifischen anti-Antikörper; b) ein für den Antikörper spezifisches Antigen und c) eine Kontrolle oder einen Kalibrator, der zwei oder mehrere Reagenzien umfasst, worin jedes der beiden oder mehreren Reagenzien ein oder mehrere Epitope der konstanten Region des Antikörpers umfasst, an verschiedene Epitope auf besagtem Antigen bindet und bezüglich der Spezifität und Affinität homogen ist.
  • Außerdem schließt die Erfindung auch ein Kit ein, zum Nachweis von Antikörpern in einer Testprobe, das folgendes umfasst: a) einen für den Antikörper spezifischen anti-Antikörper; b) ein direktes oder indirektes Konjugat, das ein Antigen umfasst, welches an eine Signal erzeugende Verbindung gebunden ist, die in der Lage ist ein detektierbares Signal zu erzeugen; und c) eine Kontrolle oder einen Kalibrator, der ein Reagens umfasst, worin das Reagens ein oder mehrere Epitope der konstanten Region des Antikörpers umfasst, an das Antigen bindet und bezüglich der Spezifität und Affinität homogen ist.
  • Die Erfindung schließt auch ein Kit ein, zum Nachweis von Antikörpern in einer Testprobe, das folgendes- umfasst: a) einen für den Antikörper spezifischen anti-Antikörper; b) ein direktes oder indirektes Konjugat, das ein Antigen umfasst, welches an eine Signal erzeugende Verbindung gebunden ist, die in der Lage ist ein detektierbares Signal zu erzeugen; und c) eine Kontrolle oder einen Kalibrator, der zwei oder mehrere Reagenzien umfasst, worin jedes der beiden oder mehreren Reagenzien ein oder mehrere Epitope der konstanten Region des Antikörpers umfasst, an verschiedene Epitope auf besagtem Antigen bindet und bezüglich der Spezifität und Affinität homogen ist.
  • In den unmittelbar oben vorgestellten Kits kann das Reagens selektiert werden aus der Gruppe die folgendes umfasst: einen schimären monoklonalen Antikörper, der variable Regionen der H und L Kette von einer Wirtsspezies umfasst, fusioniert an Gene der konstanten Region, die von derselben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, abgeleitet sind, einen monoklonalen Antikörper, der von derselben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, abgeleitet ist, einen monoklonalen Antikörper, der von einer Spezies abgeleitet ist, die auf der Basis von immunologischer Kreuzreaktivität mit dem Antikörper, der gemessen wird, verwandt ist und ein Polypeptid, das an eine konstante Region des Antikörpers fusioniert ist, oder an ein Fragment davon, die von derselben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, abgeleitet ist oder auf der Basis von immunologischer Kreuzreaktivität mit der Wirtsspezies verwandt ist.
  • Falls ein schimärer monoklonaler Antikörper das Reagens in jedem der Kits ist, kann er variable Regionen der H und L Kette, die von einem Nagetier abgeleitet wurden, enthalten und Gene der konstanten Region der H und L Kette, die von einem Menschen abgeleitet sind.
  • Der Antikörper, der in der Testprobe detektiert werden soll, kann aus der Gruppe selektiert sein, die folgendes umfasst: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM. Das Antigen wird aus der Gruppe selektiert, die folgendes umfasst: einen Infektionserreger, ein Autoantigen, ein Allergen und eine pharmazeutische Verbindung. Der Infektionserreger kann aus der Gruppe selektiert werden, die folgendes- umfasst: einen Parasiten, ein Bakterium, einen Fungus, eine Hefe und ein Virus. Konkreter kann das Virus aus der Gruppe selektiert werden, die folgendes umfasst: Human-Immunodefizienz Virus-1, Human-Immunodefizienz Virus-2, Human-T-Zellen Leukämie Virus-1, Human- T-Zellen Leukämie Virus-2, Zytomegalovirus, Hepatitis A Virus, Hepatitis B Virus, Hepatitis C Virus, Hepatitis D Virus Hepatitis E Virus, Hepatitis GB Virus, Respiratory-syncytial-Virus und Röteln-Virus. Der Parasit kann aus der Gruppe selektiert werden, die folgendes umfasst: Toxoplasma gondii und Trypanosoma cruzi. Der Fungus kann aus der Gruppe selektiert werden; die folgendes umfasst: Histoplasma capsulatum und Cryptococcus neoformans und das Bakterium kann aus der Gruppe selektiert werden, die folgendes umfasst Helicobacter pylori und Streptococcus pyogenes.
  • Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern, die gegen mehr als ein Antigen entwickelt worden sind, die in einer Testprobe vorhanden sein können, worin das Verfahren folgendes umfasst (a) in Kontakt bringen der Testprobe, von der vermutet wird, dass sie die Antikörper enthält, mit für die Antikörper spezifischen Antigenen, beziehungsweise für einen Zeitraum und unter Bedingungen die ausreichend sind, die Bildung von Antigen/Antikörper – Komplexen zu erlauben, (b) Hinzufügen von direkten oder indirekten Konjugaten zu den resultierenden Antigen/Antikörper Komplexen, für einen Zeitraum und unter Bedingungen die ausreichend sind, um es den Konjugaten zu erlauben an die gebundenen Antikörper zu binden, worin die Konjugate einen Antikörper umfassen, der an eine signalerzeugende Verbindung gebunden ist, die in der Lage ist ein detektierbares Signal zu erzeugen, (c) Nachweis der Antikörpers, die in der Testprobe vorhanden sein können, durch detektieren des Signals, das von der signalerzeugenden Verbindung erzeugt wird und (d) Verwendung von Reagenzien, als Kontrollen oder Kalibratoren, die an das Antigen binden, wobei die Verbesserung folgendes umfasst: die Verwendung, als. Kontrollen oder Kalibratoren, von Reagenzien, die ein oder mehrere Epitope der konstanten Region von Antikörpern umfassen, worin jedes der Reagenzien an die besagten Antigenebindet und bezüglich der Spezifität und Affinität homogen ist.
  • Jedes der Reagenzien kann ausgewählt werden aus der Gruppe, die folgendes umfasst: einen schimären monoklonalen Antikörper, der variable Regionen der H und L Kette von einer Wirtsspezies umfasst, fusioniert an Gene der konstanten Region, die von derselben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, abgeleitet sind, einen monoklonalen Antikörper, der von derselben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, abgeleitet ist, einen monoklonalen Antikörper, der von einer Spezies abgeleitet ist, die auf der Basis von immunologischer Kreuzreaktivität mit dem Antikörper, der gemessen wind, verwandt ist und ein Polypeptid, das an eine konstante Region des Antikörpers fusioniert ist, oder an ein Fragment davon, die von derselben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, abgeleitet ist oder auf der Basis von immunologischer Kreuzreaktivität mit der Wirtsspezies verwandt ist.
  • Die oben aufgezeichneten Merkmale, die sich auf alle anderen Verfahren beziehen, treffen auch auf dieses Verfahren zu.
  • Die Erfindung enthält auch ein Kit zum Nachweis von Antikörpern, die gegen mehr als einen Antigen entwickelt worden sind, die in einer Testprobe vorhanden sein können, worin es folgendes umfasst: a) für die Antikörper spezifische Antigene, beziehungsweise; b) direkte oder indirekte Konjugate, von denen jedes einen Antikörper umfasst, der an eine signalerzeugende Verbindung gebundenen ist, die in der Lage ist ein detektierbares Signal zu erzeugen; und c) Kontrollen oder Kalibratoren, die Reagenzien umfassen, worin jedes der Reagenzien ein oder mehrere Epitope der konstanten Region des Antikörpers umfasst, an die betreffenden Antigene binden und bezüglich der Spezifität und Affinität homogen sind.
  • In diesem Kit kann jedes der Reagenzien ausgewählt werden aus der Gruppe, die folgendes umfasst: einen schimären monoklonalen Antikörper, der variable Regionen der H und L Kette von einer Wirtsspezies umfasst, fusioniert an Gene der konstanten Region, die von derselben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, abgeleitet sind, einen monoklonalen Antikörper, der von derselben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, abgeleitet ist, einen monoklonalen Antikörper, der von einer Spezies abgeleitet ist, die auf der Basis von immunologischer Kreuzreaktivität mit dem Antikörper, der gemessen wird, verwandt ist und ein Polypeptid, das an eine konstante Region des Antikörpers fusioniert ist, oder an ein Fragment davon, das von derselben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, abgeleitet ist oder auf der Basis von immunologischer Kreuzreaktivität mit der Wirtsspezies verwandt ist.
  • Die oben aufgezeichneten Merkmale, die sich auf alle anderen Kits beziehen, treffen auch auf dieses Kit zu.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • In 1 wird die grundlegende Struktur eines Antikörper-Moleküls erläutert. Die zwei identischen schweren (H) Ketten sind aus entweder vier oder fünf Domänen (abhängig von der Klasse des Antikörpers) und einer Drehdomäne zusammengesetzt, während die leichten (L) Ketten aus zwei Domänen zusammengesetzt sind. Die aminoterminale Domäne der H und L Ketten wird als die variable (V) Region bezeichnet und ist für die Bindungsaktivität an das Antigen verantwortlich. Die anderen in der H und L Kette vorhandenen Domänen bilden die konstante Region. Dieses ist eine Darstellung eines Maus-Human schimären Antikörpers, weil Maus V-Regionen mit Human- konstanten Regionen verbunden sind.
  • In 2 werden die Schritte dargestellt, die im IMx Toxo IgG automatischen Antikörper-Einfang-Typ Immunoassay von Abbott involviert sind.
  • Die 3 stellt den Expressionsvektor pdHL2 für Antikörper dar, der humane IgG1 (hu Cγ1) und Gene für die Humankonstante Region kappa (hu Cγ) in ihrer genomischen Konfiguration enthält. Beide Transkriptionseinheiten enthalten einstromaufwärts gelegenes Enhancerelement (EH,) der Immunoglobulin H Kette und einen Maus-Metallothionein I-Promoter (PMT). Die Insertion von VK Region (Xba I – Bam HI) und VH Region (Xho I – Hind III) Kassetten hat die Expression des vollständigen Antikörpers zur Folge. Der Vektor enthält auch einen bakteriellen Replikationsursprung (ori) und ein β-Lactamase (amp) Gen, das vom Plasmid pBR322 abgeleitet wurde und ein verändertes Dihydrofolatreductase (DHFR) – Gen der Maus, unter der Kontrolle des SV40 Früh-Region-Enhancer, des Promotors und der Polyadeylierungs (poly(A)) – Signalsequenzen. Das DHFR Marker-Gen erlaubt die Selektion und Amplifikation mit Methotrexat in Säugerzellen. Das schimäre IgM Konstrukt pJH2-24-95B1 ist eine modifizierte Version von pdHL2. In pJH2-24-95B1 wurde das Stauchfragment, das zwischen der Xba I und der Bam HI Stelle angeordnet ist, mit der 5-465-210 VK Kassette (7) ersetzt. Die 5-465-210 VH Kassette (6) wurde mit dem Stauchfragment, das zwischen der Xho I und der Hind III Stelle angeordnet ist, ersetzt. Zusätzlich ist das humane IgG1 durch einen genomischen Klon der Human- Gene der konstanten Region von IgM (hu Cu) ersetzt worden. Der hu Cu Klon erstreckt sich von der Spe I bis zur Eco RV/Pvu II Verbindungsstelle. Die Abkürzungen für die Restriktionsstellen sind: B, Bam HI; H. E, Eag I; EV, Eco RV; Hind III; P, Pvu II; SII, Sac II; S, Sal I; Sp, Spe I; Xb, Xba I; und Xh, Xho I.
  • Die 4 zeigt eine diagrammartige Darstellung der Schlüsselschritte, die in der Erzeugung des Expressionskonstrukts pJH2-24-95B1 involviert sind. Dieser Expressionsvektor codiert einen Maus- Human-Schimären-IgM-Antikörper, der zusammengesetzt ist aus V Regionen der H und L Ketten des Maus Hybridoms 5-465-210 und Gene der konstanten Regionen vom Mensch. Der schimäre Antikörper ist spezifisch für P30 von T. gondii.
  • Die 5 stellt eine Zusammenfassung der Strategie dar, die zur Konstruktion des Expressionsvektors pJH3-19-95A-verwendet wurde. Dieses Expressionskonstrukt codiert einen Maus-Human-schimären IgM Antikörper, mit V Regionen der H und L Ketten die vom Maus Hybridom 1-706-139 abgeleitet wurden und Genen den konstanten Regionen vom Mensch. Dieser schimäre Antikörper bindet selektiv an P66 von T. gondii.
  • Die 6 illustriert die Nucleotid-Sequenz der VH Kassette, welche die vom Hybridom 5-465-210 (siehe SEQ ID NO: 2) klonierte VH cDNA enthält. Die abgeleitete Aminosäure-Sequenz wird von einem Ein-Buchstaben-Symbol, darunter, (siehe SEQ ID NO: 1) angezeigt. Die erste Aminosäure des reifen Proteins wird (+1) bezeichnet, die Spleißstelle des JH2 an die konstante Region wird durch einen Pfeil angezeigt und es werden die Komplementarität bestimmenden Regionen (CDRs) angezeigt, wie von Kabat E. A. et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, U. S. Department of Health and Human Services, Bethesda, MD (1991)) definiert. Der degenerierte sense-Primer, der in der PCR zur Amplifizierung dieses VH Fragmentes von der cDNA verwendet wurde, erstreckt sich bis zu Nucleotid 41. Andere zu vermerkende Merkmale: (1–39), sense-Transfer-Primer mit Klonierungsstelle (Xho I); (16–72), Leitsequenz; (73–366), V-Gen der H Kette; (367–384), D Segment der H Kette; (385–429), JH2 – Minigen der H Kette; (430–447), Sequenz der Spleißstelle und Hind III Klonierungsstelle, die vom antisense-Transfer-Primer abgeleitet ist.
  • Die 7 stellt die Nucleotid-Sequenz der VL Kassette dar, welche die vom Hybridom 5-465-210 (siehe SEQ ID NO: 4) klonierte Vκ cDNA enthält. Die abgeleitete Aminosäure-Sequenz wird von einem Ein-Buchstaben-Symbol (siehe SEQ ID NO: 3) angezeigt. Die erste Aminosäure des reifen Proteins wird (+1) bezeichnet, die Spleißstelle des Jκ2 und das Cκ – Gen werden durch den Pfeil angezeigt und es werden CDRs, die wie in der 6 bezeichnet sind, angezeigt. Der sense-Primer, der in der PCR zur Amplifizierung der Vκ Region von der cDNA verwendet wurde, erstreckte sich bis zur Position 45. Zusätzliche zu vermerkende Sequenzen: (1–40), sense-Transfer-Primer-Sequenzen, die die Klonierungsstelle Xba I einschließen; (17–76), Leitsequenz; (77–373), V-Gen, der κ Kette; (374–409), Jκ – Minigen; (410–428), Sequenz der Spleißstelle und der Bam HI Klonierungsstelle, die im antisense-Transfer-Primer inkorporiert sind.
  • In 8 wird die Nucleotid-Sequenz der VH Kassette gezeigt, welche die vom Hybridom 1-706-139 (siehe SEQ ID NO: 6) klonierte VH cDNA enthält. Die abgeleitete Aminosäure-Sequenz wird von einem Ein-Buchstaben-Symbol (siehe SEQ ID NO: 5) angezeigt. Die erste Aminosäure des reifen Proteins wird (+1) bezeichnet, die Spleißverbindung zwischen JH4 und der konstanten Region wird durch einen Pfeil angezeigt und es werden CDRs, die wie in der 6 bestimmt sind, angezeigt. Der degenerierte Primer (sense), der in der PCR zur Amplifizierung der VH cDNA verwendet wurde, erstreckte sich bis zur Position 41. Zusätzliche bemerkenswerte Merkmale schließen ein: (1–35), Sense-Transfer-Primer, der die Xho I Klonierungsstelle und das 5'-Ende der Leitsequenz einschließt; (12–68), Leitsequenz; (69– 362), V-Gen der H Kette; (363–380), mutmaßliche Sequenz* des D– Minigens, (381–434), JH4 – Minigen; (434–452), Spleiß- und Hind III Klonierungsstellen, die im antisense-Transfer-Primer inkorporiert sind.
  • *Die genaue Grenze zwischen den D- und J-Minigenen konnte nicht bestimmt werden.
  • Die 9 stellt die Nucleotid-Sequenz der VL Kassette dar, welche die vom Hybridom 1-706-139 (siehe SEQ ID NO: 8) klonierte Vκ Region enthält. Die abgeleitete Aminosäure-Sequenz wird von im ein-Buchstaben-Format (siehe SEQ ID NO: 7) angegeben. Die erste Aminosäure des reifen Proteins wird (+1) bezeichnet, die Spleißstelle zwischen dem Jκ1 – Minigen und dem Cκ – Gen wird durch einen Pfeil angezeigt und es werden CDRs, die wie in der 6 bezeichnet sind, bestimmt. Der 3'-Terminus des degenerierten sense-Primers, der in der PCR zur Amplifizierung der Vκ Region von der cDNA verwendet wurde, befindet sich in Position 42. Andere Merkmale schließen ein: (1–39), sense-Transfer-Primer-Sequenz, die die Xba I Klonierungsstelle und die 5'Leitsequenz einschließen; (13–69), Leitsequenzen; (70–368),κ V-Gen; (369–405), Jκ1- Minigen; (406–424), Sequenz der Spleißstelle und der Bam HI Klonierungsstelle, die im antisense-Transfer-Primer inkorporiert sind.
  • Die 10 zeigt eine Kalibrierungskurve für das schimäre anti-P66 IgG im Vergleich zu dem Kalibrator im IMx Toxo IgG Assay, der von positivem Humanserum abgeleitet wurde. Rate-Zählimpulse (Zählimpulse/Sek/Sek) werden auf der Y-Achse angezeigt.
  • Die 11 zeigt eine Kalibrierungskurve, die für den schimären anti-P66 IgM Antikörper erhalten wurde, im Vergleich zu dem Kalibrator im IMx Toxo IgM Assay, der von positivem Humanserum abgeleitet wurde. Der Index-Kalibrator von 710 Rate-Einheiten (Rate-Zählimpulse = Zählimpulse/Sek/Sek) wurde vom schimären anti-P66 IgM bei einer Konzentration von 12,3 μg/ml erreicht.
  • Die 12 stellt eine Kalibrierungskurve dar, für das schimäre anti-P30 IgG im Vergleich zum positivem Humanserum, das üblicherweise im IMx Toxo IgG Assay als Kalibrator verwendet wird. Rate-Zählimpulse (Zählimpulse/Sek/Sek) werden auf der Y-Achse angezeigt.
  • Die 13 illustriert eine Verdünnungskurve, die auf dem IMx für den schimären anti-P30 IgM Antikörper laufen gelassen wurde, zusammen mit positivem Humanserum als Kalibratoren. Der Index-Kalibrator von 560 Rate-Einheiten (Rate-Zählimpulse = Zählimpulse/Sek/Sek) wurde vom schimären anti-P30 IgM bei einer Konzentration von 8,4 μg/ml erfolgreich erreicht.
  • Die 14 stellt eine beschleunigte Stabilitäts-Analyse dar, die für alle Reagenzien bei 45°C laufen gelassen wurde, auf dem B Kalibrator Niveau (0,0036 mg/ml anti-P30 + 0,010 mg/ml anti-P66). Für die schimären rekombinanten IgG Antikörper wurde kein Unterschied beobachtet, im Vergleich zum Kalibrator. Um den zwölften Tag jedoch, wurden 40% des P30 Epitops auf den Mikropartikeln nicht mehr vom schimären anti-P30 Antikörper erkannt. r = Assay Reagenzien; c = Kalibrator Die 15 zeigt eine beschleunigte Stabilitäts-Analyse von Reagenzien dar, die bei 45°C gelagert worden waren, mit Hilfe von Verdünnungen des F Kalibrators (0,11 mg/ml anti-P30 + 0,305 mg/ml anti-P30). Für die schimären rekombinanten IgG Antikörper wurde kein Unterschied beobachtet, im Vergleich zum Humanserum-Kalibrator. Um den zwölften Tag jedoch, wurden 40% des P30 Epitops auf den Mikropartikeln nicht mehr vom schimären anti-P30 Antikörper erkannt. r = Assay Reagenzien; c = Kalibrator
  • Die 16 illustriert einen Vergleich einer Mischung aus monoklonalen Antikörpern, die dem Kalibrator B (0,0037 mg/ml anti-P30 IgG1 + 0,020 mg/ml anti-P66 IgG1) oder dem Kalibrator F (0,11 mg/ml anti-P30 IgG1 + 0,61 mg/ml schimäres anti-P66 IgG1) äquivalent sind mit Kalibratoren (cals) die mit positivem Humanserum hergestellt sind, gegen 7 unabhängige Antigen (Ag) – Lose. r = Assay Reagenzien; c = Kalibrator
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Verwendung von Reagenzien als Kalibratoren (Standards) und/oder Kontrollen in Diagnose -Kits und -Assays. Konkret können ein oder mehrere dieser Reagenzien statt Plasma oder Serum verwendet werden, in der Produktion von Kalibratoren und/oder Kontrollen für in Diagnose – Kits und – Assays, die für die qualitative und quantitative Messung von für einen erwünschten Ligand spezifischen Antikörpern entworfen sind, Die Reagenzien selber binden spezifisch an einen vorbestimmten Liganden, enthalten ein oder mehrere Epitope der konstanten Region von Antikörpern und sind bezüglich ihrer Spezifität und Affinität uniform. Die Reagenzien können kontinuierlich mit Hilfe von Hybridoma- und/oder rekombinanter DNA- Technologien hergestellt werden.
  • Es gibt mehrere Ausführungsformen des oben identifizierten Reagens. Diese Ausführungsformen sind, beispielsweise, wie folgt:
    • 1) ein schimärer monoklonaler Antikörper, der variable Regionen der H und L Kette von einer Wirtsspezies umfasst, fusioniert an Gene der konstanten Region, die von derselben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, abgeleitet sind;
    • 2) ein monoklonaler Antikörper, der von derselben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, abgeleitet ist;
    • 3) ein monoklonaler Antikörper, der von einer Spezies abgeleitet ist, die auf der Basis von immunologischer Kreuzreaktivität mit dem Antikörper, der gemessen wird, verwandt ist; und
    • 4) ein Polypeptid, das spezifisch an einen vorbestimmten Liganden bindet, der an eine konstante Region des Antikörpers fusioniert ist, oder an irgend ein Teil der konstanten Region davon der erwünschten Wirtsspezies.
  • Die oben aufgelisteten Ausführungsformen werden weiter unten im Detail beschrieben:
  • 1) SCHIMÄRE MONOKLONALE ANTIKÖRPER:
  • In dieser Ausführungsform der Erfindung ist (sind) das(die) Reagens(Reagenzien), das(die) als Kalibrator und/oder Kontrolle im Diagnose – Assay oder -Kit verwendet wird, ein schimärer monoklonaler Antikörper, der variable Regionen der H und L Kette von einer Wirtsspezies umfasst, fusioniert an Gene der konstanten Region der H und L Kette von einer anderen Wirtsspezies. Die V Regionen der H und L Kette können von jedem Wirbeltier, das Antikörper produziert, abgeleitet werden, einschließlich, ohne darauf limitiert zu sein: Nagetier (z. B., Maus, Hamster, Ratte), Huhn, Kaninchen, Hund, Katze, Rind, Pferd, Schwein, Affe (z. B. Schimpansen) und Mensch. Die Quelle für die V Regionen der Antikörper und das Verfahren, nach dem sie abgeleitet werden, basiert hauptsächlich auf Komfort und Technologie, die jenen mit gewöhnlicher Erfahrung im Fachgebiet bekannt sind. So zum Beispiel können die V Regionen (die jenen Teil des Antikörper – Moleküls umfassen, die für die Aktivität der Bindung an Liganden verantwortlich ist) der H und L Kette isoliert werden aus: einzelnen B Zellen, B Zellen Hybridoma, in vitro propagierte B Zellen oder in vivo propagierte B Zellen, zum Beispiel Human- B Zellen in SCID Mäusen (Simonsson, A. C. et al., Bio/Techniques 18(5): 862–869 (1995); Banchereau, J. et al., Science 251: 70–72 (1991); Amoroso, K. and Lipsky, P. E., J. Immunol. 145: 3155–3161 (1990); Duchosal, M. A. et al., Nature 355: 258–262 (1992)). Die V Regionen der Antikörper können mit Hilfe von im Fachgebiet bekannten Standardprozeduren kloniert werden, oder mit Hilfe von Modifikationen dieser Prozeduren. So zum Beispiel können V Regionen entsprechend dem im Beispiel III, darunter, beschriebenen Prozess kloniert werden.
  • Alternativ kann nach V Regionen – Sets der H Und L Kette von Antikörpern, mit der erwünschten Bindungs-Aktivität, gescreent werden, bei Expression, von zum Beispiel, Fab Fragmenten (Heterodimere von VH und der ersten Domäne der konstanten Region der schweren Kette und der vollständigen leichten Kette), Fv Fragmenten (Heterodimere von Domänen der V Region der H und L Kette) oder Einzel-Ketten Fv (Heterodimere von Domänen von VH und VL, die durch einen Peptidlinker verbunden werden), in Bakterien, z. B. E. coli oder selektiert durch die Verwendung von kombinatorischen Bibliotheken, ausgedrückt in lambda Phage, an der Oberfläche von Bakteriophagen, an der Oberfläche von Bakterien oder gescreent durch Display auf jedem anderen biologischen (z. B. Retrovirus oder Polysom) oder nicht-biologischen System (Better, M. et. al., Science, 240: 1041–1043 (1988); Skerra, A. and Pluckthun, A., Science, 240: 1038–1041 (1988); Huse, W. D. et al Science 246: 1275–1281 (1989); McCafferty, J. et al, Nature 348: 552–554 (1990); Fuchs, P. et al, Bio/Technology 9: 1369–1372 (1991); Francisco, J. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10444–10448 (1993); Mattheakis, L. C. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9022–9026 (1994)). Diese Biblitheken können zusammengesetzt sein aus: nativen V Regionen, die von einem immunisierten oder nicht-immunisiertem Wirt isoliert wurden, synthetische oder semi-synthetische V Regionen oder modifizierte V Regionen (Marks, J. D. et al., J. Mol. Biol 222: 581–597 (1991); Barbas, C. F. III et al., Proc.
  • Natl. Acad. Sci. USA 89: 4457–4461 (1992)). Die Beispiele für die Letzteren schließen die Feinregulierung der Spezifität und/oder Affinität durch in vitro Mutagenese ein.
  • Die kritischste Eigenschaft der Kombination (H und L) von V Regionen der Antikörper ist diejenige, dass sie eine Bindungsstelle mit den erwünschten Eigenschaften der Spezifität und Affinität für den Liganden bildet. Die erforderliche Spezifität und Affinität wird von dem beabsichtigten Verwendungszweck diktiert sein und abhängig von solchen Charakteristika wie Assay-Format und erwünschte Leistungscharakteristika (z. B. Empfindlichkeit, Spezifität, Präzision und Parallelismus). Zum Beispiel, falls ein Kalibrator oder ein Kontrollantikörper benötigt wird, der für ein bestimmtes immunodominantes Epitop (Ligand) auf einem Antigen spezifisch ist, um die serologische Antwort in vivo nachzuahmen, kann das Set der V Region von H und L Kette, die zur Erzeugung des schimären Antikörpers verwendet wird, auf dieser Basis gewählt werden.
  • Die Gene der konstanten Region von Antikörpern können von jeder Wirbeltier-Spezies abgeleitet werden, einschließlich, ohne darauf limitiert zu sein: Nagetier (z. B., Maus, Hamster, Ratte), Huhn, Kaninchen, Hund, Katze, Rinde, Pferd, Schwein, Affe (z. B. Schimpanse) und Mensch. Die Wahl der Wirtsspezies wird von dem beabsichtigten Zweck diktiert. Die konstante Region von Antikörpern wird von den gleichen Wirtsspezies abgeleitet, oder von einer die mit dem Antikörper, der gemessen werden soll, nahe verwandt ist.
  • Die schimären monoklonalen Antikörper können mit Hilfe von rekombinanten DNA- Technologien hergestellt werden. So zum Beispiel können schimäre Antikörper durch gezielte homologe-Rekombination (Pell, H. P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8507–8511 (1989)) erzeugt werden. Alternativ können Gene der V Regionen der K und L Kette von Antikörpern in (meinen) Säugetier-Expressionsvektor(en) kloniert werden, die Gene der konstanten Regionen der H und L Kette von Antikörpern, die von einer anderen Wirtsspezies abgeleitet wurden, enthalten. Das Ergebnis der Einführung des(der) Expressionskonstrukts(e) in eine geeignete Wirtszelle ist die Produktion von vollständigen schimären Antikörpern von definierter Spezifität (Morrison, S. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851–6855 (1984)). Für Antikörper wurden viele eukaryotische Expressionsvektoren, die entweder stabil integriert sind oder als extrachromosomale Elemente existieren, beschrieben und diese sind denjenigen, mit gewöhnlicher Erfahrung im Fachgebiet bekannt. Die Transkriptionseinheiten der H und L Ketten können einzeln in die Wirtszelle auf separaten Plasmiden eingeführt werden, oder zusammen auf demselben Vektor.
  • Ein Beispiel eines Expressionsvektors für Antikörper ist das Plasmid pdHL2 (3), das Gene des Human-IgG1 (hu Cγ1) und der Human- konstanten Region kappa (hu Cκ) in ihrer genomischen Konfiguration enthält (Gilles, S. D. et al., Immunol. Methods 125: 191–202 (1989)). Beide Transkriptionseinheiten enthalten ein stromaufwärts gelegenes Enhancerelement (EH) der Immunoglobulin H Kette und den Metallothionein I Promoter der Maus. Das Ergebnis der Insertion von Vκ Region und VH Region Kassetten ist die Expression eines vollständigen Antikörpers. Jede V Gen Kassette schließt eine 5'Immunoglobulin Leitsequenz und eine Spleiß-Donor-Stelle 3'des V Gens. Der Vektor enthält auch einen bakteriellen Replikationsursprung und ein β-Lactamase Gen, das vom Plasmid pBR322 abgeleitet wurde und ein verändertes Dihydrofolatreductase (DHFR) – Gen der Maus, unter der Kontrolle des SV40 Früh-Region-Enhancers, des Promotors und der Polyadenylierungs-Signalsequenzen. Das DHFR Marker-Gen erlaubt die Selektion und Amplifikation mit Methotrexat in Säugerzellen.
  • Die für die Produktion von schimären Antikörpern verwendeten Expressionsvektoren können so modifiziert werden, dass sie (ein) Gen e) von jeder konstanten Region enthalten (zum Beispiel bei Menschen: κ, λ, IgM, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE), die von jeder Wirbel-tier-Spezies-, die Antikörper produziert, isoliert werden, einschließlich, aber ohne darauf limitiert zu sein: Nagetier (z. B., Maus, Hamster, Ratte), Huhn, Kaninchen, Hund, Katze, Rind, Pferd, Schwein, Affe (z. B. Schimpanse) und Mensch. Definitionsgemäß werden die Wirtsspezies, von denen die V Regionen der H und L Kette abgeleitet werden, andere sein als diejenigen, von denen die konstanten Regionen des Antikörpers abgeleitet werden.
  • Abhängig von dem verwendeten Vektoren-System können viele verschiedene immortalisierte Zelllinien als geeignete Wirte dienen, wobei diese folgendes einschließen, ohne darauf limitiert zu sein: Myelom (z. B. X63-Ag8.653), Hybridom (Sp2/0-Ag14), Lymphom und China-Hamster-Ovarium (CHO) Zellen. Die Expressionskonstrukte können mit Hilfe einer Vielfalt von Techniken eingeführt werden, einschließlich, aber ohne darauf limitiert zu sein: Calciumphosphat-Ausfällung, Protoplastenfusion, Lipofection, Retrovirus-abgeleitete Shuttle-Vektoren und Elektroporation. Eine echte Expression führt zur Sekretion des rekombinanten Antikörpers in das Medium. Alternativ können die Zellen lysiert werden und der Antikörper anschließend gereinigt werden.
  • Die schimären Antikörper-Moleküle oder Fragmente davon könnten auch in anderen Systemen produziert werden, einschließlich, aber ohne darauf limitiert zu sein: Baculovirus, Hefe, Bakterien, wie E. coli und. in vitro in Zell-freien Systemen, wie das Kaninchen Retikulozyten-Lysat (Hasemann, C. and Capra, J. D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3942–3946 (1990); Horwitz, A. H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8678–8682 (1988); Pluckthun, A., Bio/Technology 9: 545–551 (1991); Nicholls et al., J. Biol. Chem 268(7): 5302–5308(1993)).
  • Zusammenfassend, ein schimärer monoklonaler Antikörper enthält mindestens zwei (z. B. IgG) und bis zu 10 (z. B. pentameres IgM) identische Bindungsstellen, die von den V Regionen der H und L Kette einer Wirtsspezies abgeleitet wurden, verbunden mit den konstanten Regionen der H und L Kette des Antikörpers einer anderen Wirtsspezies. Die V Regionen der H und L Kette sind für die Spezifität und Affinität der Bindung an den gewünschten Liganden verantwortlich. Die Quelle der konstanten Regionen der H und L Kette wird von der Wirtsspezies des Antikörpers bestimmt, der gemessen werden soll, wobei sie vorzugsweise mit ihr identisch ist. Die konstanten Regionen haben keine Liganden-Bindungs-Aktivität, stellen aber serologisch identifizierbare Epitope (Liganden) zur Verfügung, die für die bestimmte konstante Region spezifisch sind, womit ein Mittel zur Verfügung gestellt wird, sie von anderen konstanten Regionen zu unterscheiden. Das Ergebnis der Expression der Gene der H und L Kette, die die schimären Antikörper codieren, in beispielsweise einer immortalisierten Wirtszelle wie Sp2/0-Ag14, ist die Produktion eines monoklonalen schimären Antikörpers von vorbestimmter und uniformer Spezifität und Affinität. Somit wird eine kontinuierliche Quelle zur Verfügung gestellt, von schimären Antikörpern mit V Regionen mit einer einzigen definierten Bindungs-Spezifität und von Epitopen der konstanten Region der H und L Kette. Eines oder mehrere dieser Reagenzien würden als Kalibratoren und/oder Kontrollen nützlich sein, in diagnostischen Assays und Kits, die für die qualitative oder quantitative Messung der Niveaus an spezifischem Antikörper entworfen sind.
  • Ein besonderes Beispiel dieser Ausführungsform ist ein rekombinanter schimärer Antikörper, der V Regionen der H und L Kette von Ratten enthält, fusioniert an Human- konstanten Regionen der H und L Kette, zur Verwendung als Kalibrator und/oder Kontrolle. Diese Ausführungsform der Erfindung wird im Detail in den Beispielen veranschaulicht, die der Beschreibung der Ausführungsform (4) folgen.
  • 2) MONOKLONRLE ANTIKÖRPER, DIE VON DER GLEICHEN WIRTSSPEZIES ABGELEITET WURDEN, WIE DIE ANTIKÖRPER, DIE GEMESSEN WERDEN:
  • In dieser Ausführungsform der Erfindung können die monoklonalen Antikörper von jedem Wirbeltier, Säugetier oder anderes, das Antikörper herstellt, abgeleitet werden, wie: Nagetier (z. B., Maus, Hamster, Ratte), Huhn, Kaninchen, Hund, Katze, Rind, Pferd, Schwein, Affe und Mensch. Die gewählte Wirtsspezies wird in Übereinstimmung mit dem beabsichtigten Zweck und dem Assay oder Kit gewählt.
  • Zum Beispiel, falls Human-Antikörper gemessen werden, können die monoklonalen Antikörper aus Human-B Zellen hergestellt werden, mit Hilfe von traditioneller Hybridom-Technologie, wie Maus: Human Heterohybridoma, Human : Human Hybridoma oder mit Hilfe von anderen Mitteln zum immortalisieren, wie durch die Infektion mit dem Epstein-Barr Virus (Nowinski, R. et al., Science 210: 537–539 (1980); Olsson, L. and Kaplan, H. S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5429–5431 (1988); Rosen, A. M. et al., Nature 267: 52–54 (1977)). Die neuere Erschaffung von transgenen Mäusen, die genomische Klone von Teilen der Human- Immunoglobulin Loci der H und L Kette tragen, stellt die Gelegenheit zur Verfügung, auch Maus : Maus Hybridoma herzustellen, die monoklonale Antikörper mit den erwünschten Spezifitäten sezernieren (Lonberg, N. et al., Nature 368 : 856–859 (1994); Green, L. L. et al., Nature Genetics 7: 13–21 (1994)).
  • Die Human-Antikörper können auch durch Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie geschaffen werden. Zum Beispiel können die V Regionen (die den Teil des Antikörpers beinhalten, der für die Aktivität der Bindung von Liganden verantwortlich ist) der H und L Kette aus einzelnen Human- B Zellen, aus in vitro propagierten B Zellen oder Human- B Zellen die in SCID Mäusen propagiert wurden (Simonsson, A. C. et al., Bio/Techniques 18(5): 862–869 (1995); Banchereau, J. et al., Science 251: 70–72 (1991); Amoroso, K. and Lipsky, P. E., J. Immunol. 145: 3155–3161 (1990); Duchosal, M. A. et al., Nature 355: 258–262 (1992)) isoliert werden. Antikörper V Regionen können durch Standardverfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, kloniert werden oder durch Modifikationen dieser Verfahren. Zum Beispiel können die V Regionen gemäß dem Verfahren, wie es in Beispiel III unten beschrieben ist, kloniert werden.
  • Alternativ kann für Sets von Human- V Regionen der H und L Kette, mit der gewünschten Bindungsaktivität, ein Screening durchgeführt werden, für beispielsweise Fab Fragmente, Fv Fragmente oder Einzel-Ketten Fv durch die Expression in Bakterien, z. B. E. coli oder selektiert durch die Verwendung von kombinatorischen Bibliotheken, exprimiert in lambda Phage, an der Oberfläche von Bakteriophage, an der Oberfläche von Bakterien oder gescreent durch Display auf jedem anderen biologischen (z. B. Retrovirus oder Polysom) oder nicht-biologischen System (Better, M. et al., Science, 240: 1041–1043 (1988); Skerra, A. and Pluckthun, A., Science, 240: 1038–1041 (1988); Huse, W. D. et al., Science, 246: 1275–1281 (1989); McCafferty, J. et al, Nature 348: 552–554 (1990); Kang, A. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4363–4366 (1991); Fuchs, P. et al, Bio/Technology 9: 1369–1372 (1991); Francisco, J. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10444–10448 (1993); Mattheakis, L. C. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9022–9026 (1994)). Diese Antikörper-Bibliotheken können zusammengesetztsein aus: nativen V Regionen, von einem immunisierten oder nicht-immunisierten Mensch, synthetische oder semi-synthetische V Regionen oder modifizierte V Regionen (Marks, J. D. et al., J. Mol. Biol 222: 581–597 (1991); Barbas, C. F. III et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4457–4461 (1992)). Die Beispiele für die Letzteren schließen die Feinregulierung der Spezifität und/oder Affinität durch in vitro Mutagenese ein. Die Primärbasis für die Selektion der V Regionen gründet auf ihren Ligand-bindenden Charakteristika.
  • Wenn Human-Antikörper gemessen werden, dann werden die Human-Gene der V Regionen der H und L Kette in einen Säugetier-Expressionsvektor kloniert, der Human- Gene der konstanten Regionen der H und L Kette enthält. Das Ergebnis der Einführung des(der) Expressionskonstrukts(e) in geeignete Wirtszellen ist die Produktion von vollständigen Human- Antikörpern von definierter Spezifität (Dorai, H. et al., Hybridoma 11(5): 667– 675 (1992)). Für Antikörper wurden viele eukaryotische Expressionsvektoren beschrieben, die entweder stabil integriert sind oder als extrachromosomale Elemente existieren, und diese sind denjenigen mit gewöhnlicher Erfahrung im Fachgebiet bekannt. Die Transkriptionseinheiten der H und L Ketten können einzeln in die Wirtszelle auf separaten Plasmiden eingeführt werden, oder zusammen auf demselben Vektor.
  • Ein Beispiel für einen geeigneten Expressionsvektor ist das Plasmid pdHL2 (3), das Gene des Human- IgG1 (hu Cγ1) und der Human- konstanten Region kappa (hu Cκ) in ihrer genomischen Konfiguration enthält (Gilles, S. D. et al., Immunol. Methods 125: 191–202 (1989)). Beide Transkriptionseinheiten enthalten ein stromaufwärts gelegenes Enhancerelement (EH) der Immunoglobulin H Kette und den Metallothionein I Promoter der Maus. Das Ergebnis der Insertion von Vκ Region und VH Region Kassetten ist die Expression eines vollständigen Antikörpers. Jede V Gen Kassette schließt eine 5'Immunoglobulin Leitsequenz und eine Spleiß-Donor-Stelle 3'des V Gens ein. Der Vektor enthält auch einen bakteriellen Replikationsursprung und ein β-Lactamase Gen, das vom Plasmid pBR322 abgeleitet wurde und ein verändertes Dihydrofolatreductase (DHFR) – Gen der Maus, unter der Kontrolle des SV40 Früh-Region-Enhancers, des Promotors und der Polyadenylierungs- Signalsequenzen. Das DHFR Marker-Gen erlaubt die Selektion und Amplifikation mit Methotrexat in Säugerzellen.
  • Die Expressionsvektoren für Antikörper können so modifiziert werden, dass sie jedes der Gene der konstanten Region enthalten (im Falle der Menschen: κ, λ, IgM, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE), die von jeder Wirbeltier-Spezies, die Antikörper produziert, isoliert werden, einschließlich, aber ohne darauf limitiert zu sein: Nagetier (z. B., Maus, Hamster, Ratte), Huhn, Kaninchen, Hund, Katze, Rind, Pferd, Schwein, Affe (z. B. Schimpanse) und Mensch. Ähnlich können V Regionen von H und L Kette der Antikörper von jeder Wirbeltier-Spezies, die Antikörper produziert, isoliert werden, einschließlich, aber ohne darauf limitiert zu sein: Nagetier (z. B., Maus, Hamster, Ratte), Huhn, Kaninchen, Hund, Katze, Rind, Pferd, Schwein, Affe (z. B. Schimpanse) und Mensch. Das Ergebnis der Einführung von V Regionen der H und L Kette in einen Expressionsvektor für Antikörper, der konstante Regionen der H und L Kette enthält, die von der gleichen Wirtsspezies abgeleitet wurde, ist die Bildung von rekombinanten monoklonalen Antikörpern. Somit können monoklonale Antikörper jeder Klasse oder Unterklasse produziert werden, von jeder Wirbeltier-Spezies die Antikörper herstellt, durch die Verwendung von rekombinanten DNA, Hybridom – Technologien oder einer Kombination dieser Technologien Die gewählte Wirtsspezies ist in Übereinstimmung mit dem beabsichtigten Zweck des Assays.
  • Abhängig von dem(n) Expressionsvektor(en) können viele verschiedene immortalisierte Zelllinien als geeignete Wirte dienen, wobei diese folgendes einschließen, ohne darauf limitiert zu sein: Myelom (z. B. X63-Ag8.653), Hybridom (Sp2/0-Ag14), Lymphom und China-Hamster-Ovarium (CHO) Zellen. Die Expressionskonstrukte können mit Hilfe einer Vielfalt von Techniken eingeführt werden, einschließlich, aber ohne darauf limitiert zu sein: Calciumphosphat-Ausfällung, Protoplastenfusion, Lipofection, Retrovirus-abgeleitete Shuttle-Vektoren und Elektroporation. Eine echte Expression führt zur Sekretion des rekombinanten Antikörpers in das Medium. Alternativ können die Zellen lysiert werden und der Antikörper anschließend gereinigt werden.
  • Die Antikörper-Moleküle oder Fragmente davon könnten auch in anderen Systemen produziert werden, einschließlich, aber ohne darauf limitiert zu sein: Baculovirus, Hefe, Bakterien, wie E. coli und in vitro in Zell-freien Systemen, wie das Kaninchen Retikulozyten-Lysat (Hasemann, C. and Capra, J. D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3942–3946 (1990); Horwitz, A. H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8678–8682 (1988); Pluckthun, A., Bio/Technology 9: 545–551 (1991); Nicholls et al., J. Biol. Chem 268(7): 5302–5308(1993)).
  • Die monoklonalen Antikörper, die durch Hybridoma, rekombinante DNA oder einer Kombination dieser Technologien produziert wurden, können mindestens zwei (z. B. IgG) und bis zu 10 (z. B. pentameres IgM) identische Bindungsstellen enthalten, mit Spezifität und Affinität zum gewünschten Liganden, die von den V Regionen der H und L Kette bestimmt werden. Die vollständigen Antikörper enthalten die gesamten konstanten Regionen der H und L Kette und somit all die assoziierten antigenen Epitope. Außerdem sind die Antikörper monoklonal und somit von einzig-definierter Spezifität und Affinität und können in unbegrenzten Quantitäten produziert werden. Eines oder mehrere dieser Reagenzien können als Kalibratoren und/oder Kontrollen verwendet werden, in diagnostischen Assays und Kits, die für die qualitative oder quantitative Messung der Niveaus an spezifischem Antikörper entworfen sind.
  • 3) EIN MONOKLONALER ANTIKÖRPER, DER VON EINER SPEZIES ABGELEITET IST DIE AUF DER BASIS VON IMMUNOLOGISCHER KREUZREAKTIVITÄT MIT DER, DIE UNTERSUCHT WIRD, VERWANDT IST:
  • Eine zusätzliche Ausführungsform der Erfindung schließt einen monoklonalen Antikörper ein, der von einer Spezies abgeleitet ist, die mit jener die getestet wird eng verwandt ist. Die Verwandtschaft von Spezies wird auf der Basis von immunologischer Kreuzreaktivität der Epitope der konstanten Region definiert. Wenigstens ein Epitop der konstanten Region ist das gleiche oder größtenteils das gleiche mit dem der Spezies die getestet wird. Das(die) gemeinsame(n) Epitop (e) müssen nicht chemisch identisch sein, aber in der 3-dimensionalen Struktur eine chemische Ähnlichkeit aufweisen. Die monoklonalen Antikörper können von jedem Wirbeltier, Säugetier oder anderes, das Antikörper herstellt, abgeleitet werden, wie: Nagetier (z. B., Maus, Hamster, Ratte), Huhn, Kaninchen, Hund, Katze, Rind, Pferd, Schwein, Affe und Mensch. Die Wirtsspezies wird in Übereinstimmung mit dem beabsichtigten Zweck des Assays gewählt und auf der Basis der Reaktivität mit dem Reagens, das spezifisch an ein oder mehrere Epitope der konstanten Region der Antikörperspezies, die getestet wird, bindet.
  • Zum Beispiel, wird ein Human-Antikörper gemessen, könnte ein monoklonaler Antikörper der von einem anderen Primaten, wie einem Schimpansen, erzeugt wurde, als Kalibrator oder Kontrolle ausreichen. Die Unterschiede auf molekularem Niveau, zwischen Sequenzen der konstanten Region von Antikörpern von Schimpansen und Menschen sind ungefähr jenen äquivalent, die zwischen Allotypen von Menschen existieren (Ehrlich, P. H. et al., Hum. Antibody Hybridomas 1: 23–26 (1990); Ehrlich, P. H. et al.,Mol. Immunol. 28: 319–322 (1991)). Die monoklonalen Antikörper können von Schimpansen abgeleitet werden, mit Hilfe von Hybridom oder rekombinanter DNA Technologie. In letzterem Fall können V Regionen der H und L Kette (die jenen Teil des Antikörper Moleküls umfassen, der für die Aktivität der Bindung an Liganden verantwortlich ist) aus einzelnen Schimpansen-B Zellen, aus in vitro oder in vivo (z. B. in SCID Mäuse) propagierten Schimpansen-B Zellen isoliert werden. Die V Regionen, der Antikörper können mit Hilfe von im Fachgebiet bekannten Methoden, oder Modifikationen dieser Prozeduren, kloniert werden. Zum Beispiel können die V Regionen entsprechend dem in Beispiel III, darunter, beschriebenen Prozess kloniert werden.
  • Alternativ kann für Sets von Schimpansen V Regionen der H und L Kette, mit der gewünschten Bindungsaktivität, ein Screening durchgeführt werden, für beispielsweise Fab Fragmente, Fv Fragmente oder Einzel-Ketten Fv, durch die Expression in Bakterien, z. B. E. coli oder selektiert durch die Verwendung von kombinatorischen Bibliotheken, die exprimiert sind in lambda Phage, an der Oberfläche von Bakteriophage, an der Oberfläche von Bakterien oder gescreent Display auf jedem anderen biologischen (z. B. Retrovirus oder Polysom) oder nicht-biologischen System (Better, M. et al., Science, 240: 1041–1043 (1988); Skerra, A. and Pluckthun, A., Science, 240: 1038–1041 (1988); Huse, W. D. et al., Science 246: 1275–1281 (1989); McCafferty, J. et al., Nature 348: 552–554 (1990); Kang, A. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4363–4366 (1991); Fuchs, P. et al., Bio/Technology 9: 1369–1372 (1991); Francisco, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10444–10448 (1993); Mattheakis, L. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9022–9026 (1994)). Die Antikörper-Bibliotheken können zusammengesetzt sein aus: nativen V Regionen, von einem immunisierten oder nicht-immunisierten Schimpansen, synthetischen oder semi-synthetischen V Regionen oder modifizierten Schimpansen V Regionen. Die Beispiele für die Letzteren schließen die Feinregulierung der Spezifität und/oder Affinität durch in vitro Mutagenese ein. Die Primärbasis für die Selektion der V Regionen gründet auf ihren Ligand-bindenden Charakteristika.
  • Die Schimpansen-Gene der V Regionen der H und L können in einen Säugetier-Expressionsvektor kloniert werden, der Schimpansen-Gene der konstanten Regionen enthält. Das Ergebnis der Einführung des(der) Expressionskonstrukts(e) in geeignete Wirtszellen ist die Produktion von vollständigen Schimpansen-Antikörpern von definierter Spezifität. Für Antikörper sind viele eukaryotische Expressionsvektoren beschrieben worden, die entweder stabil integriert sind oder als extrachromosomale Elemente existieren, und diese sind denjenigen mit gewöhnlicher Erfahrung im Fachgebiet bekannt. Die Transkriptionseinheiten der H und L Ketten können einzeln in die Wirtszelle auf separaten Plasmiden eingeführt werden, oder zusammen, auf demselben Vektor.
  • Ein Beispiel eines Expressionsvektors, der modifiziert werden kann um Schimpansen-Antikörper zu exprimieren, ist das Plasmid pdHL2 (3). Dieser Vektor enthält Human-IgG1 (hu Cγ1) und die Human-konstante Region kappa (hu Cκ) in ihrer genomischen Konfiguration (Gilles, S. D. et al., Immunol. Methods 125: 191–202 (1989)). Beide Transkriptionseinheiten enthalten ein stromaufwärts gelegenes Enhancerelement (EH) der Immunoglobulin H Kette und den Metallothionein I Promoter der Maus. Das Ergebnis der Insertion von Vκ Region und VH Region Kassetten ist die Expression eines vollständigen Antikörpers. Jede V Gen Kassette schließt eine 5'Immunoglobulin Leitsequenz und eine Spleiß-Donor-Stelle 3'des V Gens ein. Der Vektor enthält auch einen bakteriellen Replikationsursprung und ein β-Lactamase Gen, das vom Plasmid pBR322 abgeleitet wurde und ein verändertes Dihydrofolatreductase (DHFR) – Gen der Maus, unter der Kontrolle des SV40 Früh-Region-Enhancers, des Promotors und der Polyadenylierungs – Signalsequenzen. Das DHFR Marker-Gen erlaubt die Selektion und Amplifikation mit Methotrexat in Säugerzellen.
  • Die für die Produktion von Antikörpern verwendeten Expressionsvektoren können so modifiziert werden, dass sie jedes der Gene der konstanten Region enthalten (im Falle der Menschen: κ, λ, IgM, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE), die von jeder Wirbeltier-Spezies, die Antikörper produziert, isoliert werden, einschließlich, aber ohne darauf limitiert zu sein: Nagetier (z. B., Maus, Hamster, Ratte), Huhn, Kaninchen, Hund, Katze, Rind, Pferd, Schwein, Affe (z. B. Schimpanse) und Mensch. Ähnlich können Antikörper-V Regionen der H und L Kette von jeder Wirbeltier-Spezies isoliert werden, die Antikörper produziert, einschließlich, aber ohne darauf limitiert zu sein: Nagetier (z. B., Maus, Hamster, Ratte), Huhn, Kaninchen, Hund, Katze, Rind, Pferd, Schwein, Affe (z. B. Schimpanse) und Mensch. Das Ergebnis der Einführung von V Regionen der H und L Kette in einen Expressionsvektor für Antikörper, der konstante Regionen der H und L Kette enthält, die von der gleichen Wirtsspezies abgeleitet wurde, ist die Bildung eines rekombinanten monoklonalen Antikörpers. Somit können monoklonale Antikörper jeder Klasse oder Unterklasse produziert werden, von jeder Wirbeltier-Spezies die Antikörper herstellt, durch die Verwendung von rekombinanten DNA-, Hybridom-Technologien oder einer Kombination dieser Technologien. Die gewählte Wirtsspezies ist in Übereinstimmung mit dem beabsichtigten Zweck des Assays.
  • Abhängig vom Vektoren-System können viele verschiedene immortalisierte Zelllinien als geeignete Wirte dienen. Diese schließen Folgendes ein, ohne darauf limitiert zu sein: Myelom (z. B. X63-Ag8.653), Hybridom (Sp2/0-Ag14), Lymphom und China-Hamster-Ovarium (CHO) Zellen. Die Expressionskonstrukte können mit Hilfe einer Vielfalt von Techniken eingeführt werden, einschließlich, aber ohne darauf limitiert zu sein: Calciumphosphat-Ausfällung, Protoplastenfusion, Lipofection, Retrovirus-abgeleitete Shuttle-Vektoren und Elektroporation. Eine echte Expression führt zur Sekretion des rekombinanten Schimpansen-Antikörpers in das Medium. Alternativ können die Zellen lysiert werden und der Antikörper anschließend gereinigt werden.
  • Die Antikörper-Moleküle oder Fragmente davon könnten auch in anderen Systemen produziert werden, einschließlich, aber ohne darauf limitiert zu sein: Baculovirus, Hefe, Bakterien, wie E. coli und in vitro in Zell-freien Systemen, wie das Kaninchen Retikulozyten-Lysat (Hasemann, C. and Capra, J. D., Proc. Natl.
  • Acad. Sci. USA 87: 3942–3946 (1990); Horwitz, A. H. et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8678–8682 (1988); Pluckthun, A., Bio/Technology 9: 545–551 (1991); Nicholls et al., J. Biol. Chem 268 (7): 5302–5308 (1993)).
  • Die durch Techniken der rekombinanten DNA, Hybridom oder einer Kombination dieser Techniken produzierten monoklonalen Antikörper enthalten mindestens zwei (z. B. IgG) und bis zu 10 (z. B. pentameres IgM) identische Bindungsstellen, mit Spezifität und Affinität zu den gewünschten Liganden, die von den V Regionen der H und L Kette bestimmt sind. Die vollständigen Antikörper enthalten die gesamten konstanten Regionen der H und L Kette und somit all ihre assoziierten antigenen Epitope. Außerdem sind die Antikörper monoklonal und somit von einzigdefinierter Spezifität und Affinität und können in unbegrenzten Quantitäten produziert werden. Eines oder mehrere dieser Reagenzien können als Kalibratoren und/oder Kontrollen verwendet werden; in diagnostischen Assays und – Kits, die für die qualitative oder quantitative Messung der Niveaus an spezifischem Antikörper entworfen sind.
  • 4) EIN POLYPEPTID, DAS AN EINEN VORBETIMMTEN LIGANDEN BINDET, DER AN EINE KONSTANTE REGION VON ANTIKÖRPERN DER GEWÜNSCHTEN WIRTSSPEZIES FUSIONIERT IST:
  • Eine vierte Ausführungsform bezieht sich auf ein Polypeptid, das in der Lage ist, spezifisch an einen vorbestimmten Liganden zu binden, der an die konstante Region eines Antikörpers oder an irgend einen Teil einer konstanten Region eines Antikörpers (eine oder mehrere Domänen der konstanten Region oder ein oder mehrere einzelne Epitope, die von der konstanten Region des Antikörpers abgeleitet sind) der gewünschten Wirtsspezies fusioniert ist. Dieses schließt jede der folgenden Spezies ein, die an die vollständigen konstanten Regionen, oder an Teile davon, fusioniert sind: (1) kurze Polypeptide, wie eines das von einem CDR eines Antikörper-Moleküls abgeleitet ist, oder diejenigen, die auf der Basis der Liganden-Spezifität selektiert werden, durch die Verwendung von, beispielsweise, Phagedisplay – Technologie; (2) eine Antikörper Domäne oder ein Derivat davon, wie ein Minibody; (3) Fv Fragmente; und (4) Einzelketten Fv Fragmente (Levi, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4374–4378 (1993); Smith, G. P, Science 228: 1315–1317 (1985); Martin, F. et al., EMBO J. 13(22): 5303–5309 (1994)). Dieses Molekül kann aus einer oder mehreren Polypeptidketten bestehen. Diese Ausführungsform kann mit Leichtigkeit produziert werden, mit Hilfe einer großen Vielfalt an bakteriellen Vektoren, die im Fachgebiet wohl bekannt sind. Die Antikörper Fragmente und Derivate davon können auch in anderen Wirtssystemen produziert werden, welche nicht darauf limitiert sind, aber eukaryotische Zellen einschließen (Shu, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7995–7999 (1993)).
  • Die von dieser Ausführungsform abgeleiteten Reagenzien enthalten ein Polypeptid, das an den gewählten Liganden mit der gewünschten Spezifität und Affinität bindet. Dieses Polypeptid ist an eine vollständige konstante Region meines Antikörpers oder an eine oder mehrere Domänen der konstanten Region oder an ein oder mehrere Epitope der gewählten konstanten Region fusioniert. Die Wahl von konstanten Regionen eines Antikörpers oder von Fragmenten davon wird von der beabsichtigten Verwendung diktiert. Diese Reagenzien stellen, egal ob sie in eukaryontischen oder prokaryotischen Expressionssystemen produziert werden, eine andauernde Quelle für ein Reagens zur Verfügung, das an einen vorbestimmtem Liganden bindet, „monoklonaler" Natur ist, weil es bezüglich der Spezifität und Affinität uniform ist und es enthält mindestens ein Epitop der konstanten Region. Eines oder mehrere dieser Reagenzien können als Kalibratoren und/oder Kontrollen verwendet werden, in diagnostischen Assays und Kits, die für die qualitative oder quantitative Messung der Niveaus an spezifischem Antikörper entworfen sind.
  • Jedes dieser in den Ausführungsformen 1–4 beschriebenen Reagenzien kann individuell verwendet werden, oder es können, als Alternative, mehr als eins dieser Reagenzien für die Herstellung von Kalibratoren (Standards) und/oder Kontrollen für ein Immunoassay verwendet werden. Man kann sich vorstellen, dass ein Kalibrator und/oder eine Kontrolle aus einer Mischung von zwei oder mehreren Reagenzien bestehen kann: (a) die verschiedene Epitope auf einem gegebenen Antigen erkennen, (b) ein oder mehrere verschiedene Epitope auf mehr als einem Antigen (z. B. die Proteine P30 und P66 von T. gondii), oder ein oder mehrere Epitope auf Antigenen die von mehr als einer Quelle abgeleitet wurden (z. B. Antigen gp41 von HIV-1 und Antigen gp36 von HIV-2, um im selben Assay sowohl die Antikörper gegen HIV-1 als auch die gegen HIV-2 zu überwachen). Die Entscheidung über die Anzahl dieser, Reagenzien, die für die Produktion eines Kalibrators (Standards) und/oder einer Kontrolle verwendet werden soll, hängt vom Format des Assays und den gewünschten Leistungscharakteristika (z. B. Spezifität, Empfindlichkeit, Präzision, Parallelismus) ab, basiert auf empirische Beobachtungen und kann mittels im Fachgebiet bekannter Methoden bestimmt werden.
  • Die Verwendung jedes der vorhin erwähnten Reagenzien als Alternative zur Verwendung von positivem Human-Plasma oder Serum mit hohem Titer für die Produktion von Kalibratoren (Standards) und/oder Kontrollen in Diagnose-Assays und Kits ergibt mehrere wichtige Vorteile:
    • (1) Verfügbarkeit: Diese Reagenzien können mit Leichtigkeit und reproduzierbar in großen Mengen produziert werden. Der Produktionsmaßstab kann ohne Weiteres auf die Nachfrage zugeschnitten werden, wodurch eine erneuerbare betriebseigene Versorgung zur Verfügung gestellt wird.
    • (2) Homogenität: All diese Reagenzien sind „monoklonaler" Natur, dadurch dass sie bezüglich der Spezifität und Affinität uniform sind. Dieses verringert die Los-zu-Los Variation auf dramatische Weise. Dieses steht im Gegensatz zu Pools von Human-Plasma, deren Konzentration an Antikörpern, Titer des spezifischen Antikörpers und Spezifität variiert, wodurch die Leistung des Immunoassays beeinträchtigt wird.
    • (3) Kontrolle der Epitop – Spezifität: Die Spezifität und Affinität des Reagens kann ohne weiteres diktiert werden. Dieses stellt ein höheres Niveau an Kontrolle über die Leistung und die „Herstellbarkeit" des Immunoassay zur Verfügung.
    • (4) Toleranz für eine vollständigere Charakterisierung der Kalibratoren und Kontrollen, womit die Qualität des Reagens gewährleistet ist und auch Reagenzien zur Verfügung gestellt werden, die für die Überwachung der Beschichtung des Antigens auf die Festphase nützlich sind, womit die Los-zu-Los Variation bei der Konzentration an Antigen vermindert wird. Für manche Assays wird die Festphase mit mehr als einem Protein-Antigen beschichtet. Falls, zum Beispiel, Mikropartikel mit Proteinen beschichtet werden, wäre es notwendig, falls die Überwachung der Beschichtung mit einem Polyklonalen durchgeführt wird, sie einzeln zu beschichten und die Mikropartikel anschließend zu mischen. Im Gegensatz dazu, könnten, mit diesen Reagenzien, die Kügelchen mit allen Proteinen co-beschichtet werden und die Dichte eines jeden könnte bestimmt werden. Diese Reagenzien stellen auch ein Werkzeug zur Verfügung, um die Stabilität und/oder Los-zu-Los Konsistenz von spezifischen Epitopen auf dem Antigen zu bewerten.
    • (5) verminderte Produktionskosten: Die unbegrenzte Verfügbarkeit, verbunden mit der homogenen Natur des Reagens, unterstützt die Optimierung der Aufreinigungs-Methodologie, wobei beide dazu beitragen, die Herstellungs-, Test- und Durchführungs-bezogene Kosten zu reduzieren, und
    • (6) Sicherheit: Die Verwendung von biologischen Fluiden (z. B. Plasma, Serum) zur Herstellung von Kalibratoren und Kontrollen stellt eine potentielle biologische Gefährdung dar. In der Herstellung von Kalibratoren und Kontrollen sollte die Substitution der biologischen Fluide mit diesen Reagenzien die Risiken der biologischen Gefährdung, die mit diesen Produkten verbunden sind, wesentlich reduzieren.
  • Zusätzlich zur Verwendung in Assays und Kits, die Antikörper gegen Infektionserreger (das Human-Immunodefizienz Virus-1, das Human-Immunodefizienz Virus-2, das Human-T-Zellen Leukämie Virus-1, das h Human-T-Zellen Leukämie Virus-2, das Zytomegalovirus, das Hepatitis A Virus, das Hepatitis B Virus, das Hepatitis C Virus, das Hepatitis D Virus, das Hepatitis E Virus, das Hepatitis GB Virus, das Respiratory syncytial Virus, das Röteln-Virus, Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Helicobacter pylori und Streptococcus pyogenes) detektieren oder überwachen, können die in vorliegender Erfindung beschriebenen Reagenzien auch zur Überwachung der Antikörper – Antworten auf jedes andere Antigen verwendet werden. Konkret können die Reagenzien in Kits und Assays verwendet werden, die Antikörper gegen Autoantigene, Allergene, Pharmazeutika und andere Antigene der Umwelt überwachen. Diese Assays können für die Überwachung/Messung aller reaktiven Antikörper, oder alternativ, spezifischer Klassen oder Unterklassen reaktiver Antikörper entworfen werden
  • Die beschriebenen Agenzien sind als Kalibratoren und/oder Kontrollen nützlich, für die Überwachung von Antikörper Antworten im Menschen, wie auch in jeder anderen Wirbeltier-Spezies, die in der Lage ist eine Antikörper – Antwort zu erzeugen, womit sie sowohl humanmedizinische als auch veterinäre Anwendungen haben.
  • Die vorliegende Erfindung kann durch die Verwendung folgender, nicht-limitierender Beispiele erläutert werden:
  • BEISPIEL 1
  • PRÄPARATION VON ZELLLINIEN
  • Die Hybridoma 1-706-139 (IgG2b/κ) und 5-465-210 (IgG2a/κ), die jeweils für die Toxoplasma Proteine P66 und P30 spezifisch sind, wurden durch die Fusion von immunisierten Swiss Webster Milzzellen an das nicht-sezernierende Hybridom Sp2/0-Ag14 bei den Abbott Laboratories etabliert (Abbott Park, IL). Die Hybridoma wurden durch IMDM (550 mg Glucose/l,) mit Zusatz von 10% Fetalrinderserum (FBS), 8 mM L-Glutamin, 100 U Penicillin/ml und 100 g/ml Streptomycin (komplettes IMDM) durchfließen gelassen. Die für die Elektroporation verwendeten Sp2/0-Ag14 Zellen (Abbott Laboratories; American Type Culture Collection, Rockville, MD) wurden durch hohe Glucose D-MEM enthaltendes L-Glutamin, mit Zusatz von 10% FBS, 1 mM Natriumpyruvat, 10 mM HEPES und 10 μg/ml Gentamycin (komplettes D-MEM), durchlaufen gelassen. Die für die Transfektion durch Protoplastenfusion verwendeten Sp2/0-Ag14 Zellen (Abbott Laboratories) wurden durch D-MEM (Katalog-Nr. 11995) mit Zusatz von 20% FBS, 0,8 μg/ml 8-Azaguanin (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin durchfließen gelassen.
  • Die Transfektanten, die schimäre Antikörper sezernierten, wurden durch komplettes IMDM mit Zusatz von 0,1 μM Methotrexat (MTX), das von Sigma, Adria Laboratories (Columbus, OH) oder Lederele Laboratories (Carolina, Puerto Rico) bezogen "wurde, durchfließen gelassen. Falls nicht anders angegeben wurden alle Medien für Gewebekulturen und Zusätze von BRL Life Technologies (Gaithersburg, MD) bezogen. Die Zellen wurden bei 37°C in 5% CO2 kultiviert.
  • BEISPIEL II KLONIERUNG
  • Die Primer für die Klonierung und Sequenzierung wurden von Operon Technologies, Inc (Alameda, CA) bezogen, falls nicht anders angegeben. Die für die Isolierung der variablen (V) Regionen von Immunoglobulin und für den Transfer von Fragmenten verwendeten Primer wurden über HPLC gereinigt. Die Reagenzien der Perkin-Elmer GeneRmp Kits (Perkin-Elmer Corporation, Folter City, CA), einschließlich AmpliTaq DNA-Polymerase, wurden entsprechend den Vorschriften des Herstellers für Amplifizierungen über die Polymerase Kettenreaktion (PCR) verwendet. Die umgekehrte Transkription und die PCR-Reaktionen wurden in einem GeneRmp 9600 Thermal Cycler (Perkin Eimer) durchgeführt. Die Restriktionsenzyme wurden von BRL Life Technologies oder von New England BioLabs (Beverly, MA) bezogen und die Verdaus wurden nach den Empfehlungen der Hersteller durchgeführt. Falls nicht anders angegeben, wurden die für die Klonierung verwendeten DNA Fragmente aus low-melting point (LMP mit niedriger Schmelztemperatur) Agarose (FMC Corporation, Rockland, ME) isoliert. Kurz gesagt, die gewünschten Fragmente wurden aus dem Gel ausgeschnitten, in kleine würfelförmige Stücke geschnitten und zu 400 μl TE [1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; pH 8,0; BRL Life Technologies), 10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan-hydrochlorid (Tris-HCl; pH 8,0; BRL Life Technologies)] in ein Eppendorf Microfuge-Röhrchen hinzugefügt. Die Agarose wurde bei 68°C geschmolzen und mit 800 μl Puffer-gesättigtem Phenol (BRL Life Technologies) extrahiert, durch eine Minute verwirbeln und Zentrifugation bei 14.000 × g in einer Mikrozentrifuge. Die wässrige Phase wurde in ein neues Röhrchen überführt und ein Zehntel Volumen 10 mM LiCl2 (Sigma Chemical Company, St. Louis; MO) wurden hinzugefügt. Das Röhrchen wurde wie oben. 5 Minuten lang zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde in ein neues Röhrchen überführt und mit 2,5 Volumina absolutem Ethanol (– 20°C, McCornick Distilling Co., Weston, MO) ausgefällt. Die DNA wurde wie oben 15 Minuten lang pelletiert und 2X mit 70%igem Ethanol gewaschen (–20°C). Die DNA wurde in H2O oder in TE wieder suspendiert. Für die Durchführung der Ligationen wurde ein Stratagene DNA ligation kit (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) verwendet, nach den Anleitungen des Herstellers. Mit Ausnahme der Protoplastenfusions-Studien wurden die bakteriellen Transformationen mit Hilfe von kompetenten Zellen von MAX EFFICIENCY DH5α (BRL Life Technologies) durchgeführt, nach dem Protokoll des Herstellers. Das Screening der Transformanten, zur Identifikation der gewünschten Klone, wurde mit Hilfe von Restriktionsanalyse von Miniprep DNA und/oder mit Hilfe von Colony-PCR ausgeführt. Die Miniprep-DNA wurde mit dem Magic Miniprep Purification System (Promega Corporation, Madison, WI) oder mit dem EasyPrep Plasmid Prep Kit (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) nach den Anleitungen der Hersteller präpariert. Für das Screening mittels Colony-PCR wurden einzelne Kolonien von den Transformationsplatten gepickt und in ein „well" einer sterilen 96 „well" Platte mit flachem Boden (Costar, Cambridge, MA), die 100 μl steriles Wasser enthielt, überführt. Ein Drittel des Volumens wurde in eine zweite Platte überführt und bei 4°C gelagert. Die 96-„well" Originalplatte wurde 5 Minuten lang mit Mikrowellen behandelt, um die Zellen aufzubrechen. Dann wurde ein Volumen von einem μl als Template in ein PCR-Röhrchen überführt. Neun μl einer PCR Stammmischung, die 1 μl 10X PCR Puffer, 1 μl 2 mM dNTPs, 1 μl (10 pmol) sense-Primer, 1 μl (10 pmol) antisense-Primer, 0,08 μl AmpliTaq DNA Polymerase (0,4 Einheiten) und 4,2 μl H2O enthielt, wurden in das PCR-Röhrchen hinzugefügt. Alle PCR-Reagenzien wurden von Perkin-Elmer Corporation bezogen. Die Reaktionen wurden im Allgemeinen in 20–25 Zyklen amplifiziert, 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 50–60°C (abhängig von der Annealing-Temperatur des Primers) und 60 Sekunden bei 72°C. Die Primer waren von dem Insert abhängig und die Bedingungen der Zyklen wurden, basierend auf die Annealing-Temperatur und die Länge des erwarteten Produkts, modifiziert. Nach dem Cycling wurde ungefähr 1/3 des Reaktionsvolumens für die Analyse auf ein Agarosegel geladen. Die Kolonien, welche die gewünschten Klone enthielten, wurden von der Transfer-Platte aus vermehrt.
  • BEISPIEL III
  • ISOLIERUNG VON VARIABLEN REGIONEN VON HYBRIDOMA, KONSTRUKTION VON EXPRESSIONSVEKTOREN UND TRANSFER VON VARIABLEN REGIONEN IN DIE EXPRESSIONSVEKTOREN
  • i) ISOLIERUNG VON VARIABLEN REGIONEN-VON IMMUNGLOBULINEN:
  • Ein Pharmacia QuickPrep mRNA Purification Kit wurde entsprechend der Vorschrift des Herstellers für die Isolierung von mRNA aus 1 × 107 Hybridomzellen verwendet. Die Synthese des Stranges der komplementären DNA (cDNA) und die PCR-Amplifikation wurden mit einem Perkin Elmer GeneAmp RNA PCR Kit durchgeführt. Für die spezifische cDNA Synthese der V Regionen der schweren (H) Kette wurden 90 ng gereinigte Hybridom mRNA und 10 pmol M-IgG2b oder M-Ig2a Primer (Tabelle 1), wobei beide eine Bgl II Restriktionsstelle enthalten, jeweils für 1-706-139 und 5-465-210 verwendet. Das spezifische cDNA Priming von beiden kappa (κ) variablen (V) Regionen der leichten Kette wurde mit dem Primer MK-REV, der eine Bgl II Restriktionsstelle enthält, durchgeführt. Die Reaktionen der umgekehrten Transkription wurden 60 Minuten lang bei 42°C inkubiert, dann 5 Minuten lang bei 99°C. Die PCR Reaktionen (100 μl Volumen; 50 pmol von jedem Primer) wurden entsprechend den Vorschriften des Herstellers durchgeführt. Für die Amplifikation der 1-706-139 VH Region wurde der Hin-Primer MHV-9 und der Primer M-Ig2b verwendet. Die 1-706-139 Vκ Region wurde mit den MKV-1 (sense) und MK-REV Primern amplifiziert. Für die Amplifikation der 5-465-210 VH Region wurden die Primer MHV-7 (sense) und M-Ig2a verwendet. Die 5-465-210 Vκ Region wurde mit den MKV-2 (sense) und MK-REV Primern durchgeführt. All diese Primer enthielten eine Sal I Restriktionsstelle. Die Amplifikation bestand aus 30 Zyklen je 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 52°C und 60 Sekunden bei 72°C. Die PCR-abgeleiteten Produkte wurde mit Hilfe des Promega Magic PCR Preps DNA Purification System (Madison, WI) isoliert.
  • Die VH und Vκ Fragmente wurden mit Sal I und Bgl II verdaut und in mit Sal I und Bam HI verdautem pUC18 (BRL Life Technologies) ligiert. Die Plasmide pJH6-20-94A1 und pJH6-14-94A5 enthalten jeweils VH und Vκ Regionen, die aus dem Hybridom 5-465210 isoliert wurden.
  • Tabelle 1 Für die Isolierung von Hybridom V Regionen verwendete Primer
    Figure 00560001
  • ii) KONSTRUKTION DES EXPRESSIONSVEKTORS FÜR HUMAN-IgM:
  • Der Immunoglabulin Expressionsvektor pdHL2 (3; Gilles, S. D. et al., Immunol. Methods 125: 191–202 (1989)) wurde. für die Expression von Human-IgM (4) modifiziert, durch austauschen der konstanten Region von Human-IgG1 (Cγ1) mit einem genomischen Klon der konstanten Region von Human-IgM (Cμ). Der erste Schritt war die Einführung einer Spe I Restriktionsstelle in die Sac II Restriktionsstelle 31 by stromaufwärts vom ersten Exon von Cγ1. Das Oligonucleotid Spe-1,5'd[GGAACTAGTGGAGC]3'(SEQ ID NO: 18) des codogenen Stranges wurde an das Oligonucleotid Spe-2,5'd[TCCACTAGTTCCGC]3' (wobei Sac II überhängende Enden gelassen wurden) (SEQ ID NO: 19) „annealed" und in mit Sac II verdautem pdHL2 ligiert, wobei der Vektor pAG/SpeI entstand.
  • Das Cγ1 Gen in pAG/SpeI wird von den Spe I und Eag I (7 by stromabwärts vom Stoppcodon lokalisiert) Restriktionsstellen flankiert und wurde durch einen Doppelverdau mit diesen Enzymen entfernt. Durch PCR-Amplifizierung wurde ein Fragment erzeugt, das einen genomischen Klon des sekretorischen Teils von Cμ enthält, mit Hilfe von 1 ng der Vektor H + L Kassette #1 (8/89) Hyland (Abbott Biotech) als Template und 50 pmol der Primer 5'huM-B (Tabelle 2), der eine Spe I Restriktionsstelle enthält, und 3'-huMEag, der eine Eag I Restriktionsstelle enthält. Die Amplifikation bestand aus 24 Zyklen je 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 63°C und 90 Sekunden bei 72°C. Das 1880 by IgM Cμ Produkt (Position 219 bis 2099 in Dorai, H. and Gillies, S. D., Nucleic Acids Research 17: 6412 (1989)) wurde aus dem Gel isoliert, mit Spe I und Eag I doppelt verdaut und in pAG/SpeI (wodurch das IgG1 Gen ersetzt wird) kloniert, wobei pAG/SpeI/huM erzeugt wurde.
  • Die Plasmide pAG/huM/atoxo und pAG/huM/atoxo 5-465 wurden durch den Transfer der 1-706-139 und beziehungsweise 5-465-210 V Region-Sets in pAG/SpeI/huM (siehe unteren Abschnitt) konstruiert. Die vorläufigen Studien mit diesen Konstrukten zeigten ein niedriges Niveau der Expression von rekombinantem IgM, so dass die Konstrukte weiter modifiziert wurden. Ein genomischer Klon des sekretorischen Teils des Cu Gens, der poly A Signalsequenzen des nativen IgM enthält, wurde mittels PCR amplifiziert, unter den oben skizzierten Bedingungen, wobei 1 ng DNA des pNχ-μTNP Plasmids (erhalten von Dr. Marc Shulman, Universitiy of Toronto, Toronto, Ontario; Boulianne, G. L., et al., Nature 312: 643–646 (1984)) als Template und 50 pmol von jedem der Primer 5'huM-B und 3'amp-hoM (der eine EcoR V Restriktionsstelle enthält) verwendet wurden. Über Gel isoliertes Cμ (Position 128–2278 in Word, C. J., et al., International Immunology 1: 296–309 (1989)) PCR-Produkt wurde in den Vektor ligiert, pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI), unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen. Ein Klon, der das Cμ Insert enthielt, wurde identifiziert und als pGEM/IgM bezeichnet. Das ganze IgM-Insert wurde sequenziert, um seine Unversehrtheit zu überprüfen.
  • Das Plasmid pGEM/IgM wurde durch die Extension der nativen 5' Intron Sequenzen stromaufwärts vom Cμ Exon 1 modifiziert. Das Intron Fragment (5' Ende bei Position 17 in Word, C. J., et al., International Immunology 1: 296–309 (1989)) wurde mittels PCR amplifiziert, wobei 1 ng DNA des pNχ-μTNP Plasmids als Template und 50 pmol von jedem der Primer 5SPL/Spe, der eine Spe I Restriktionsstelle enthält, und 3-SPL (die beide bei Abbott synthetisiert wurden) verwendet wurden. Nach 24 Zyklen je 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C und 45 Sekunden bei 72°C wurde das Intron Fragment mit Phenol/Chloroform extrahiert und ausgefällt. Sowohl das Intron-Produkt als auch der pGEM/IgM Vektor wurden mit Spe I und Bsu 36I (New England Biolabs) verdaut, über Gel isoliert und ligiert um das Human-Cμ Gen Konstrukt pJH2-14-95A3 zu generieren.
  • Das Plasmid pAG/huM/atoxo 5-465 wurde durch ersetzen seines Cμ Gen-Segments mit dem Human- Cμ Gen Segment modifiziert, das native 5' Intron- und poly A Signalsequenzen enthält, die in pJH2-14-95A3 (das als komplettes Cμ bezeichnet wird) vorhanden sind. Das Plasmid pAG/huM/atoxo 5-465 wurde doppelt verdaut, mit Spe I und Pvu II (stromabwärts von der Cγ1 poly (A) Additionsstelle; Position 2137 in der GenBank accession #Z17370), und die Vektorhauptkette wurde über Gel isoliert. Das komplette Cμ Gen wurde aus pJH2-14-95A3 durch den Verdau mit Spe I und Eco RV freigesetzt. Die Ligation der über ein Gel isolierten Fragmente ergab das Plasmid pJH2-24-95B1 (3). Dieser Expressionsvektor enthält aus Hybridoma isolierte Ratten – VH und Vκ Gene, 5-465-210 und genomische Klone von Human- Cμ und Cκ Genen.
  • Eine zweite Version dieses Expressionsvektors, pJH3-19-95A, der vom Hybridom 1-706-139 klonierte Vκ und VH Gene enthält, wurde konstruiert, durch ersetzen des Xba I-Rind III Fragments in pJH2-24-95B1 (das Vκ 5-465-210, die konstante Region kappa, und VH 5-465-210 enthält) mit dem analogen Fragment Xba I-Hind III, das aus dem Plasmid pAG/huM/atoxo (5) isoliert wurde. Die endgültigen IgM Expressionsvektoren pJH2-24-95B1 und pJH3-19-95A wurden beide in E. coli C600R– (American Type Culture Collection) eingeführt, in Vorbereitung für die Transfektion mittels Protoplastenfusion.
  • iii) TRANSFER VON IMMUNOGLOBULIN V REGIONEN IN DEN IgM EXPRESSIONSVEKTOR:
  • Die von den Hybridoma klonierten Vκ und VH Regionen wurden als Kassetten in den Immunoglobulin Expressionsvektor pAG/SpeI/huM eingeführt, der Transkriptionseinheiten für humanes Cκ und Cμ enthält. Die richtige Expression der Vκ und VH Regionen erfordert die Addition eines Teils- der 5' Leitsequenzen und 3' Spleiß-Donor-Stellen. Diese Regionen wurden in Primer (Tabelle 2) inkorporiert, die für den sequentiellen PCR-vermittelten Transfer von Vκ und VH Regionen in den Expressionsvektor verwendet wurden. Für den Transfer des 1-706-139 Vκ Gens wurden der 5'-(Zeit)-Primer VKl-706-5', der eine Xba I Restriktionsstelle enthält, und der 3' Primer VKl-706-3', der eine Spleißstelle und eine Bam HI Restriktionsstelle enthält, verwendet. Für die Amplifikation der 1-706-139 VH Region wurden der 5'-(Zeit)-Primer VH1-706-5', der eine Xho I Restriktionsstelle enthält, und der 3'-Primer VH1-706-3', der eine Hind III Restriktionsstelle enthält, verwendet. Für den Transfer des 5-465-210 Vκ Gens wurden der 5'-(Leit)-Primer VK5-465-5', der eine Xba I Restriktionsstelle enthält, und der 3'-Primer VK5-465-3', der eine Bam H I Restriktionsstelle enthält, verwendet. Für den Transfer des 5-465-210 VH Gens wurden der 5' -(Leit)- Primer VH5-465-5', mit einer Xho I Restriktionsstelle, und der 3' -Primer VH5-465-3', der eine Hind III Restriktionsstelle enthält, verwendet. Die Reaktionen von 100 μl Volumen beinhalteten 50 pmol von jedem Primer und 1 ng Plasmid- Template [pJH6-14-94A5 (1-706-139 Vκ); pJH6-20-94A1(1-706-139 VH); pJH7-31-94D3 (5-465-210 Vκ); oder pJH6-30-94A1 (5-465210 VH). Die Amplifikation bestand aus 22 Zyklen je 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 62°C und 60 Sekunden bei 72°C. Die PCR-abgeleiteten Vκ Produkte wurden mit Xba I und Bam HI verdaut und in den mit Xba I und Bam HI verdauten (pAG/SpeI/huM) Vektor kloniert. Anschließend wurde das VH Produkt in den Vκ enthaltenden Vektor eingeführt, mit Hilfe von Xho I und Hind III. Die Integrität der Vκ und VH Inserts wurde durch Sequenzanalyse bestimmt. Die resultierten Expressionsvektoren pAG/huM/atoxo und pAG/huM/atoxo 5-465 enthalten jeweils die V Region-Sets (Vκ und VH) 1-706-139 und 5-465-210.
  • Tabelle 2 Primer für die Konstruktion von IgM Expressionsvektoren
    Figure 00610001
  • Tabelle 2 (Fortsetzung)
    Figure 00620001
  • iv) TRANSFER VON RATTEN-V REGION – SETS IN EINEN HUMAN- IgG1 EXPRESSIONSVEKTOR:
  • Um ein Konstrukt für die Expression der funktionellen Vκ und VH Regionen zu erzeugen, die vom Hybridom 1-706-139, wie IgG1, kloniert sind, wurde das Xba I- Hind III Fragment, das diese beiden Regionen umfasst, aus pAG/huM/atoxo ausgeschnitten und in das mit Xba I und Hind III verdaute pdHL2 eingeführt, was das als pJH9-14-94/4.1. bezeichnete Konstrukt ergab. Die gleiche Prozedur wurde für den Transfer des Vκ und VH Gen Sets, das aus dem Hybridom 5-465-210 vom Plasmid pAG/huM/atoxo 5-465 isoliert wurde, in pdHL2, um das Expressionskonstrukt pdHL-2/5-465 (Klon 1) zu erzeugen.
  • BEISPIEL IV
  • SEQUENZIERUNG VON VARIABLEN REGIONEN IN EXPRESSIONSVEKTOREN
  • Das Plasmid-Template für die Sequenzierung wurde mit dem Magic Miniprep oder Maxiprep DNA Purification Systems (Promega), dem EasyPrep Plasmid Prep Kit (Pharmacia) oder mittels CsCl-Bandenfärbung (Sambroock J. et al., Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Press (1989)) präpariert. Für die Präparation der Plasmide mit Hilfe der Kits wurden die Anleitungen der Hersteller befolgt. Die Nucleotid-Sequenzen wurden manuell, mittels Sequenase versionl. 0 mit einem Sequenase 7-deaza-dGTP DNA Sequencing Kit (Amersham Life Science, Inc., Arlington Heights, IL) bestimmt, oder durch automatische Sequenzierung mit Hilfe des Pharmacia AutoRead Sequencing Kit und des ALF DNA Sequencer. Die Vektor Primer (Tabelle 3) ALF M13 Universal (Pharmacia) und ALF M13 Reverse (Pharmacia) wurden für die Sequenzierung der VH und Vκ Inserts verwendet. Es wurden mehrere Klone der PCR-erzeugten VH und Vκ Regionen sequenziert, um die von der AmpliTaq DNA Polymerase induzierten Fehler ausfindig zu machen.
  • Die Primer für die Sequenzierung der VH und Vκ Fragmente, die in die Säugetier-Expressionsvektoren kloniert worden waren, schlossen folgende Primer ein: pdHL2-4F, pdHL2-7F, pdHL2-43, pdHL2-44, pdHL2-52 und pdHL2-53. Zusätzlich T1706H-A und T1706H-B, für 1-706-139 VH; T1706K-A und T1706K-B für 1-706-139 Vκ; T5465H-A, T5465H-B und T5465H-C für VH; und T5465K-A, T5465K-B und T5465K-C für die von 5-465-210 klonierte Vκ Region.
  • Die für die Sequenzierung der genomischen Human- IgM -Klone verwendeten Primer sind in Tabelle 4 aufgelistet.
  • Tabelle 3 Primer für die Sequenzierung von Inserts der variablen Region in Expressionsvektoren
    Figure 00640001
  • Tabelle 3 (Fortsetzung)
    Figure 00650001
  • Tabelle 4 Sequenzierungsprimer für genomische Klone der konstanten Region des IgM
    Figure 00650002
  • Tabelle 4 (Fortsetzung)
    Figure 00660001
  • BEISPIEL V
  • TRANSFEKTION DER EXPRESSIONSVEKTOREN IN WIRTSZELLEN
  • Die für die Elektroporation verwendeten Plasmide wurden mittels CsCl-Bandenfärbung (Sambroock J. et al., Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Press (1989)) gereinigt. Um die Transfektion durch Elektroporation durchzuführen, wurden Sp2/0-Ag14 Zellen in logarithmischer Wachstumsphase geerntet und zwei Mal mit 10 ml Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS, BRL Life Technologies) gewaschen und in D-PBS wieder suspendiert, auf eine Konzentration von 1 × 107 Zellen/ml. Zehn μg Plasmid DNA, mit Sal I linearisiert, wurden zu 1 × 107 Sp2/0-Ag14 Zellen in den 0,4 cm Spalt einer Bio-Rad (Melville, NY) Elektroporationsküvette hinzugefügt, in insgesamt 1 ml D-PBS. Die DNA und die Zellen wurden 10 Minuten auf Eis inkubiert. Die Küvette wurde in die Kammer eines Bio Rad Gene Pulser platziert, der auf 0,18 kv und 960 μF Kapazität gestellt war. Es wurde Strom angelegt und der Inhalt der Küvette wurde vermischt um den pH-Gradienten zu eliminieren. Vor der Plattierung wurden die Zellen 5 Minuten auf Eis platziert. Die Zellen wurden in 19 ml komplettes D-MEM Medium überführt und sanft gemischt. 100 μl Zellsuspension wurden in jedes „well" zweier 96-„well" Gewebekultur-Clusters (flacher Boden; Costar) hinzugefügt und bei 37°C in 5% CO2 inkubiert. Nach 24 Stunden wurden in jedes „well" 100 μl komplettes D-MEM, mit Zusatz von 0,1 μM MTX (Sigma), hinzugefügt und die Platten wurden wie oben inkubiert. Nach 24 Stunden wurde aus jedem „well" jeweils 100 μl Medium entfernt und 100 μl komplettes D-MEM mit 0,1 μM MTX wurde erneut hinzugefügt. Dieser Prozess wurde nach 48 Stunden wiederholt. Danach wurden die Platten 10 bis 21 Tage inkubiert, bis Kolonien zu erscheinen begannen. Aus den „wells" die MTX-resistente Kolonien enthielten wurden Überstände geerntet und mittels ELISA (siehe unten) auf das Vorhandensein von schimären Antikörpern getestet.
  • Eine zweite Methode, die zur Bestimmung von Sp2/0-Ag14 Transfektanten verwendet wurde, war eine modifizierte Version der Technik der Protoplastenfusion (Sandri-Golden, R. M., et al., Molecular and Cellular Biology 1: 743–752 (1981); Gillies, S. D., et al., Cell 33: 717–728 (1983)). Die Plasmide wurden in E. coli-C600R– propagiert, um Protoplasten zu erzeugen. Die Bakterien wurden bei 37°C bei kräftiger Belüftung in 50 ml Medium, das 10 mg/ml M9 Salze (BRL Life Technologies), 0,8% Casaminosäuren (Difco, Detroit, MI), 0,5% Glucose (BRL Life Technologies), 0,1 mM CaCl2 (Sigma), 1 mM MgSO4 (Sigma) und 50 μg/ml Ampicillin (Sigma) enthielt, bis zu einer Extinktion von 0,5–0,6 bei 600 nm gezüchtet. Es wurde Chloramphenicol (Sigma), zu 200 μg/ml, hinzugefügt und die Kultur wie oben weitere 18–22 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden bei 1100 × g 12 Minuten lang bei 4°C pelletiert und in 2,5 ml 20%iger Sucrose (Sigma) in 0,05 M Tris-HCl, pH 8,0 (BRL Life Technologies) bei 4°C wieder suspendiert. Eine 5 mg/ml Lysozym (Pharmacia) – Lösung in Tris-HCl (pH 8,0) wurde hinzugefügt und die Mischung auf Eis gelegt. Nach 5 Minuten Inkubation wurde 1,0 ml 0,25 M EDTA (pH 8,0; BRL Life Technologies) hinzugefügt und die Mischung zusätzliche 5 Minuten auf Eis gehalten. Ein ml 0,05 M Tris-HCl (pH 8,0) wurde dann langsam hinzugefügt. Die Suspension wurde 10 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 20 ml D-MEM (Katalog# 11995, BRL Life Technologies), mit Zugabe von 10 mM MgCl2 (Sigma) und 10% Sucrose (Sigma), bei Raumtemperatur für die langsame Verdünnung der Protoplastenlösung verwendet. Diese Mischung wurde 2,5 Stunden lang bei Raumtemperatur gehalten. Es wurden ungefähr 5 × 106 in der logarithmischen Wachstumsphase geerntete Sp2/0-Ag14 Zellen bei 350 × g 5 Minuten lang pelletiert. Die Zellen wurden sanft in der Protoplastensuspension wieder suspendiert. Diese Suspension wurde in ein 60 mm Gefäß überführt und 8 Minuten lang bei 650 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesogen und 1,5 ml auf 37°C vorgewärmtes, 50%iges w/v PEG (Sigma Hybri Max) in PBS wurden hinzugefügt. Das Gefäß wurde bei 110 × g zentrifugiert, bis 90 Sekunden vom Zeitpunkt der Zugabe von PEG verstrichen waren. Die Zellen wurden sanft wieder suspendiert, durch Pipettierung in zwei 5 ml und einem 10 ml Volumen vorgewärmter Waschlösung (D-MEM, mit Zusatz von 1% FBS, 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin), die in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen, das 15 ml der Waschlösung enthielt, hinzugefügt wurden. Nach 7,5 Minuten Zentrifugation bei 225 × g wurden die Zellen in Plattierungsmedium (D-MEM, mit Zusatz von 10% FBS, 50 U/ml Penicillin, 50 ug/ml Streptomycin und 100 μg/ml Kanamycin (Sigma)) wieder suspendiert und in ein 96-„well" Gefäß plattiert und bei 37°C inkubiert. Nach 24 Stunden (Tag 1) wurde selektives Medium (D-MEM, mit Zusatz von 10% FBS und 0,1 μM MTX) hinzugefügt. Am Tag 5 wurden 50 μl selektives Medium pro „well" hinzugefügt. Nach zwei Tagen wurden 100 μl/"well" entfernt und 100 μl frisches selektives Medium wurden per „well" hinzugefügt. Die MTX-resistenten Kolonien wurden mit Hilfe des ELISA-Assay auf die Sekretion von schimären Antikörpern getestet.
  • BEISPIEL VI
  • ASSAYS FÜR DIE BESTIMMUNG DER PRODUKTION VON SCHIMÄREN ANTIKÖRPERN DURCH DIE TRANSFEKTANTEN
  • Die Transfektanten wurden mittels ELISA auf die Produktion von schimären IgG1 getestet. EIA Platten (96-„well", Nunc Immulon, Naperville, IL) wurden mit 100 μl Maus anti-Human- IgG (H + L Kette; Jackson Immuno Research, West Grove, PA) bei einer Konzentration von 1,5 ug/ml beschichtet und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden 4 Mal in 1X Dulbeccos phosphate buffered saline ohne Ca oder Mg (D-PBS; BRL Life Technologies) gewaschen. Die „wells" wurden mit 200 μl 2,0%iger fettarmer Trockenmilch (Carnation Company, Los Angeles, CA) in 1 × D-PBS 1 Stunde bei 37°C blockiert. Die Platten wurden wie oben gewaschen. Gereinigtes humanes IgG (Jackson Immuno Research) oder gereinigter schimärer IgG1 Antikörper. (Abbott Laboratories), die in 1 × D-PBS mit 2,0% fettarmer Trockenmilch und 0,05% Tween-20 (Bio-Rad) verdünnt waren, wurden als Standard verwendet. Die Standards und die Überstände der Kulturen wurden der Platte, in Duplikat, hinzugefügt, 100 μl/"well", 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert, dann 4 Mal in D-PBS mit 0,1% Tween-20 gewaschen. Jedem „well" wurden 100 μl Maus anti- Human- IgG (H + L Kette), an Meerrettichperoxidase (Jackson Immuno Research) konjugiert, bei einer Konzentration von 0,45 μg/ml hinzugefügt und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden wie oben gewaschen. Der Assay wurde mit Hilfe eines OPD Reagens-Kit (Abbott Laboratories) entwickelt und auf einem Bio-Rad 96-well Plattenleser abgelesen.
  • Das ELISA wurde modifiziert, um die Produktion von schimären IgM zu testen. Die Platten wurden mit 0,36 ug/ml Ziegen anti-Human-IgM (Fc5μ-spezifisch, Jackson Immuno Research) in D-PBS beschichtet. Als Standard wurde ChromPure humanes IgM (Myelom, ganzes Molekül, Jackson Immuno Research) verwendet. Das Peroxidase-markierte Ziegen anti-Human-IgM (Fc5μ, Jackson ImmunoResearch) wurde bei einer Konzentration von 0,8 μg/ml als das Enzym-Antikörper-Konjugat verwendet.
  • Die Konzentration der Antikörper wurde mittels Radialer Immunodiffusion (RID) bestimmt. Sieben-vierzehn Tage alte Zellkulturüberstände wurden verwirbelt und dann wurden 5 oder 10 μl Proben für IgG und beziehungsweise IgM jedem "well" der Human- IgG oder Human- IgM RID Platten (The Binding Site, San Diego, CA) aufgebracht. Ein Set Standards (25, 50, 75, 100 und 150 ug/ml) wurde auf jeder Platte laufen gelassen. Der Standard für schimäres IgG1 war Protein-A-gereinigtes anti-P66 IgG1 und der IgM Standard war Chromeure-Human-IgM (Jackson Immuno Research). Die Platten wurden bei 35–37°C 16–22 Stunden lang umgekehrt inkubiert. Der Durchmesser eines jeden Ringes wurde im Millimetern bestimmt, mit Hilfe eines RID Electronic plate reader (The Binding Site), der mit der von The Binding Sitezur Verfügung gestellten Kalibrierungsplatte kalibriert worden war.
  • BEISPIEL VII
  • AUFREINIGUNG DER REKOMBINANTEN ANTIKÖRPER
  • Um schimäre IgG1 Antikörper aufzureinigen wurden Kulturüberstände erstens über Nacht gegen 0,1 M Natriumphosphat (pH 8,2) dialysiert und mit 0,1% Natriumazid, dann über einen 0,2 um Filter filtriert. Die Präparation wurde dann über eine Säule laufen gelassen, die PerSeptive Biosystems Poros 50A Harz (Cambridge, MA) enthielt, mit Hilfe eines Niedrig-Druck-Chromatographiesystems von Bio-Rad, bei 250–500 cm/Stunde. Die Elution erfolgte mit 0,1 M Citrat, 0,15 M NaCl pH 3,0 und die gepoolten Fraktionen, die Antikörper enthielten, wurden gegen PBS (10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl) pH 7,2 dialysiert.
  • Um die schimären IgM Antikörper aufzureinigen wurden die Kulturüberstände 1 : 1 mit H2O verdünnt und die Präparation wurde auf eine Säule geladen, die 175 ml FastFlow Harz (Pharmacia) enthielt, das mit PBS bei einer Flußrate von 10 ml/min äquilibriert wurde. Die Säule mit den Antikörpern wurde mit 10 mM Natriumphosphat, 300 mM NaCl bei pH 7,2 eluiert.
  • BEISPIEL VIII
  • TOXOPLASMA GONDII ASSAY
  • i) Selektion der Hybridoma
  • Um die Durchführbarkeit der Verwendung von Maus-Humanmonoklonalen Antikörpern als Kontrollen und Kalibratoren in Immunoassays festzustellen, die für die Messung von Human-Antikörpern, die für ein immunisierendes Agens spezifisch sind, entworfen worden sind, wurde ein T. gondii Assay als Modellsystem ausgesucht, und dieses stellt eine Ausführungsform der Erfindung dar.
  • Eine Reihe von monoklonalen Antikörpern wurde von mit T. gondii immunisierten Mäusen etabliert. Diese Reihe war spezifisch für viele verschiedene T. gondii Antigene. Der erste Schritt war die Identifizierung von monoklonalen Antikörpern mit den gewünschten Eigenschaften der Affinität und Spezifität. Es wurden die monoklonalen Antikörpern gewählt, die gegen P66 und P30, zwei diagnostisch nützliche Proteine von T. gondii, reagierten. Das Screening der monoklonalen Antikörper erfolgte auf der Basis ihrer Fähigkeit die Bindung von positivem Human-Plasma an T. gondii zu inhibieren, im Versuch diejenigen zu identifizieren, die mit den immunodominanten Epitopen reagieren. Auf der Basis dieser Analyse (Daten nicht gezeigt) wurden zwei monoklonale Antikörper gewählt, 1-706-139 und 5-465-210, die für P66 und beziehungsweise P30 von T. gondii spezifisch sind.
  • ii) Klonierung und Sequenzierunq von variablen Regionen von Antikörpern:
  • Die Hybridomzellen, die die monoklonalen Antikörper produzierten, dienten als mRNA-Quelle für die Präparation von cDNA. Um die Klonierung von exprimierten V Regionen der H und L Kette zu erleichtern, wurden bei der Synthese der spezifischen cDNA Oligonukleotide als Primer verwendet, die an die 5'-Enden der konstanten Regionen hybridisierten. Für VH cDNA wurden IgG2b oder IgG2a-spezifische Primer verwendet, mit mRNA die von den Hybridoma 1-706-139 und beziehungsweise 5-465-210 isoliert worden war. Beide VL cDNAs wurden mit einem Primer der Ratten κ konstanten Region initiiert. Die PCR-Amplifikation der V Regionen von Antikörpern wurde mit degenerierten Primern durchgeführt, die an die konservierten Vκ und Vκ Gen -Leitsequenzen annealten (Jones, S. T. and Bending, M. M., Bio/Technology 9: 88–89 (1991)) in Verbindung mit den Primern der konstanten Region. Die Amplifikationssprodukte wurden in pUC18 kloniert und sequenziert. Es wurden mehrere Klone von jedem PCR-Produkt sequenziert um alle von der Taq Polymerase induzierten Fehler aufzulösen.
  • Die vom Hybridom 5-465-210 isolierten Vκ und VL cDNA – Sequenzen werden in den 6 und 7 gezeigt, in ihrem Endformat als Kassette. Die Vκ cDNA codiert ein komplettes Gen der V Region, das aus einer Leitsequenz, dem Vκ Gen und einer als JH2 umgruppierbare D Region besteht. Das Vκ Gen scheint ein Mitglied der Ratten-Unterklasse IIB zu sein (Kabat E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition; U. S. Department of Health and Human Services, Bethesda, MD (1991)). Der degenerierte Amplifikationsprimer der Leitregion erstreckte sich bis zum Nucleotid 41, so dass die authentische cDNA Sequenz mit Position 42 beginnt und sich bis auf Position 430 erstreckt. Die VL cDNA besteht aus einer Leitsequenz und einem Vκ Gen, das zu einem Jκ-Minigen umgruppiert wurde. Das Vκ Gen scheint ein Mitglied der VκIII Untergruppe zu sein. Das Jκ-Segment enthält vier Mismatches im Vergleich zur publizierten Keimlinien – Sequenz des Jκ2-Minigens, das vom BALB/c Mäuse-Stamm isoliert wurde (Sakano, H., et al., Nature 280: 288–294 (1979); Max, E. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 3450–3454 (1979); Max, E. E. et al., J. Biol. Chem. 256: 5116–5120 (1981)). Diese Mismatches könnten somatische Mutationen widerspiegeln oder Unterschiede zwischen den Sequenzen der Keimlinien – darstellen, weil in dieser Studie Swiss Webster Mäuse verwendet wurden. Der für die Isolierung der exprimierten Vκ Region verwendete degenerierte Primer der Vorregion erstreckte sich bis zum Nucleotid 45, so dass die authentische cDNA Sequenz sich von der Position 46 bis auf Position 409 erstreckt.
  • Die vom Hybridom 1-706-139 klonierte Vκ cDNA – Sequenz wird in 8 illustriert. Der degenerierte PCR-Primer der Leitregion erstreckt sich bis zum Nucleotid 41, so dass die sich authentische cDNA Sequenz von 42 bis Position 434 erstreckt. Die exprimierte VH Region umfasst Leitsequenzen, ein VH Gen, das anscheinend der Untergruppe IIA angehört (Kabat E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunologieal Interest, 5th edition, U. S. Department of Health and Human Services, Bethesda, MD (1991)), ein D Segment und ein JH4-Minigen. Die genaue Grenze zwischen dem D und dem JH4 Segment konnte nicht bestimmt werden. Die Sequenz der vom Hybridom 1-706-139 isolierten VL cDNA wird in 9 angegeben. Der für die Amplifikation des VL Fragmentes verwendete Primer endete bei Nucleotid 42, so dass sich die tatsächliche cDNA Sequenz von Position 43 bis Position 405 erstreckt. Die VL cDNA besteht aus einer Leitsequenz und einem Vκ Gen, das wahrscheinlich der VκII Untergruppe angehört und zu Jκ1 umgruppiert wurde.
  • iii) Konstruktion der Expressionsvektoren:
  • Das Ziel diese Studiums war die Produktion von schimären Maus-Human- Antikörpern, die von Ratten-Hybridoma abgeleitete V Regionen und Human-konstante Regionen enthielten. Um die Expression zu erleichtern, wurden die VH und VL Ketten cDNAs so modifiziert, dass sie eine komplette 5' Leitsequenz, eine 3' Spleiß-Donor-Stelle und flankierende Klonierungsstellen enthielten. Die VH und VL Transferkassetten (6–9) wurden mittels PCR-Amplifikation erzeugt, mit synthetischen Oligonucleotiden die die erforderlichen Elemente an ihren 5' -Enden und für jede V Region spezifische 3' -Sequenzen enthielten. Für jedes V Gen wurde eine geeignete Leitsequenz bestimmt, basierend auf seine Homologie zu anderen Sequenzen von V Regionen in der Datenbank, die ihre native Leitsequenz einschloss. In allen Fällen ist das Intron der Leit-V-Region eliminiert worden. Es wurde eine Spleiß-Donor-Stelle erneut geschaffen, in jeder V-Region-Kassette am 3' -Ende des VDJ oder VJ Exons der cDNAs, durch einbauen eines synthetischen Intron-Fragments. Die Spleiß-Stellen-Verbindung zwischen den V und den konstanten Regionen dient zum Erhalt der Integrität beider codierenden Sequenzen. Außerdem ermöglicht dieses die Platzierung der V Kassetten stromaufwärts von jeder konstanten Region, was zur Vielseitigkeit des Systems beiträgt.
  • Die modifizierten cDNAs wurden dann in Säugetier-Expressionsvektoren eingeführt, stromabwärts von regulatorischen Sequenzen die ein hohes Expressionsniveau gewährleisten. Der Vektor pdHL2 (3) enthält Transkriptionseinheiten für Gene der H und L Ketten von Antikörpern, die beide unter der Kontrolle eines Maus-Immunoglobulin – H-Ketten – Enhancers und des Metallothionein I Promoters sind. Das Plasmid pdHL2 enthält Gene der Human- kappa (Cκ) und IgG1 (Cγ1) konstanten Region, in ihrer genomischen Konfiguration (Gilles, S. D. et al., Immunol. Methods 125: 191–202 (1989)). Das Ergebnis der Einführung der Ratten – VH und Vκ Region – Kassetten ist die Expression von Maus-Human- schimären Antikörpern. Zusätzlich enthält pdHL2 ein mutiertes DHFR Gen, das die Selektion von Transfektanten basierend auf die MTX Resistenz erlaubt (Gilles, S. D. et al., Immunol. Methods 125: 191–202 (1989)). Die 5-465-210 VH und Vκ cDNA – Kassetten wurden in pdHL2 eingeführt, wodurch der Expressionsvektor pdHL-2/5-465 erzeugt wurde. Dieser Vektor codiert den für P30 spezifischen, schimären IgG1 – Antikörper. Ähnlich wurden die 1-706-139 VH und Vκ Region – Kassetten in pdHL2 kloniert, wodurch pJH9-14-94/4.1 entstand, der den für das P66 Antigen spezifischen, schimären IgG1 – Antikörper codiert.
  • Um schimäre Maus-Human – Antikörper der IgM – Klasse zu produzieren wurde pdHL2 modifiziert, durch den Ersatz des Cγ1 – Gens mit einem genomischen Klon des Human- IgM (Cμ) -Gens ( 4). Der Cμ enthaltende Expressionsvektor wurde als pAG/SpeI/huM bezeichnet. In diesem IgM Vektor der ersten Generation wurden 3' -nicht-translatierte und poly (A)- Signal -Sequenzen, die sich ursprünglich stromabwärts von Cγ1 befanden, erhalten. Durch den sequentiellen Transfer der VH und Vκ -Kassetten in diesen Vektor wurden schimäre IgM -Expressionskonstrukte erzeugt. In Vorexperimenten mit diesen Konstrukten hatten alle Transfektanten sehr niedrige Sekretionsniveaus (<1 μg/ml) an schimärem IgM (Daten nicht gezeigt).
  • In der Bemühung die Produktion von schimärem IgM zu erhöhen wurden neue Konstrukte erzeugt, in denen das Cμ Gen und die poly (A) – Signal -Sequenzen (ursprünglich stromabwärts von Cγ1) ersetzt wurden, mit einem genomischen Klon des sekretorischen Teils von Human- Cμ, einschließlich das native 5' -Intron (enthält eine Spleiß-Donor -Stelle), 3'- nicht-translatierte und poly (A) -Signal-Sequenzen (4). Die Sequenzanalyse des Cμ -Klons zeigte einen einzigen Basentausch im Vergleich – zur publizierten Keimlinien – Sequenz (Word, C. J., et al., International Immunology 1: 296–309 (1989)), die Insertion eines T zwischen die Reste 1583 und 1584 im Cμ3–Cμ4 Intron. Es wäre nicht zu erwarten, dass sich diese Änderung auf die Expression des Cμ Gens auswirkt. Das IgM Expressionskonstrukt, das die 5-465-210 VH und Vκ Regionen enthält, wurde als pJH2-24-95B1 bezeichnet (3). Der Ersatz des 5-465-210 V Region Sets mit einem Xba I-Hind III Fragment, das die 1-706-139 VH und Vκ Kassetten (5) enthält, ergab Plasmid pJH3-19-95A, das für P66 spezifisches, schimäres IgM codiert.
  • iv) Expression von schimären Antikörpern:
  • Die schimären Antikörper-Expressionskonstrukte wurden in nicht-produzierende Sp2/0-Ag 14 Zellen transfiziert. Beide schimären IgG1- Konstrukte wurden mittels Elektroporation eingeführt, während das schimäre IgM -Konstrukt über Protoplastenfusion transfiziert wurde. Die Transfektanten wurden unter Vorhandensein von 0,1 μM MTX selektiert. Von jeder Transfektion wurden mehrere MTX-resistente Kolonien auf die Produktion von schimären Antikörpern gescreent, mit Hilfe eines anti-Human-Antikörper-ELISA. Diejenigen die positiv getestet wurden, sind expandiert und kloniert worden. Durch radiale Immundiffusion (5) wurden die Sekretionsniveaus der Transfektoma bestimmt. Die Klone, die ein hohes Niveau an schimären Antikörpern sezernierten, wurden weiter subkloniert. Die beobachteten Produktionsniveaus der anti-P30 und anti-P66 schimären IgG1 -Antikörper waren 90 μg/ml oder höher. Durch Protoplastenfusion wurde ein Transfektant erhalten, das anti-P30 IgM -Antikörper bei einem Niveau von über 100 μg/ml sezernierte. Die Transfektion des anti-P66 schimären IgM Konstrukts hatte einen beschränkteren Erfolg. Es wurden Transfektanten erhalten, die schimäres IgM sezernierten, aber die Sekretionsniveaus waren ziemlich niedrig (<1 μg/ml). All diese Transfektanten wurden auf 0,1 μM MTX erhalten. Basierend auf vorherige Studien kann die Erhöhung der MTX Konzentration die Produktion von schimären Antikörpern weiter steigern (Gilles, S. D. et al., Immunol. Methods 125: 191–202 (1989); Lo, K. M. and S. D. Gillies, Biochimica et Biophysica Acta 1088: 217–224 (1991)). In drei von vier Fällen überschritten die Expressionsniveaus von rekombinanten schimären Antikörpern, die von Transfektoma produziert wurden, eigentlich die Niveaus der Antikörperproduktion der Hybridoma von denen sie abgeleitet worden waren. Die erforderlichen Sekretionsniveaus, die eine wirtschaftliche Herstellung erlaubon, sind erreicht worden. Ein anderer Vorteil des rekombinanten Systems ist, dass mit Leichtigkeit verschiedene Klassen von Antikörpern (z. B. IgG1 und IgM) erzeugt werden können, mit identischen Bindungsspezifitäten.
  • Die Tabelle 5, darunter, stellt sie Expressionsniveaus der schimären Antikörper dar, die mit Hilfe der obigen Prozeduren erzeugt wurden:
  • Tabelle 5 Expressionsniveaus der schimären Antikörper
    Figure 00760001
  • v) Leistung der schimären Antikörperin Assays:
  • Um zu bestimmen, ob die schimären Antikörper ihre native Antigen-Bindungs-Aktivität beibehalten hatten und in der Lage waren als Kontrollen/Kalibratoren zu funktionieren, wurden sie mit Hilfe von Immunoassays getestet. Die Protein A – gereinigten schimären IgG1 -Antikörper und schimäres IgM, die über DEAE fraktioniert worden waren, wurden auf ihre Immunoreaktivität gegen T. gondii geprüft, in den Abbott Laboratories IMx Toxo IgG und IgM Assays (Safford, J. W. et al., J. Clin. Pathol. 44: 238– 242 (1991)). Diese Assays sind automatisierte Mikropartikel Enzym Immunoassays (MEIA), die für die quantitative (IgG) und qualitative (IgM) Messung von Antikörpern gegen T. gondii in und Plasma entworfen sind.
  • Die Hauptschritte des IMx Toxo IgG Assays sind in 2 dargestellt. Der Assay verwendet mit T. gondii Antigenen beschichtete Mikropartikel als Festphase. Die Probe wird den beschichteten Mikropartikeln hinzugefügt, um die Bindung der gegen T. gondii spezifischen Antikörpern zu erlauben. Die Mikropartikel werden dann auf eine Glasfasermatrix übertragen und ausgiebig gewaschen, um alle nicht gebundenen Antikörper zu entfernen. Anschließend wird mit Alkalischer Phosphatase konjugierter Ziegen anti-humaner IgG Antikörper hinzugefügt, der spezifisch an die Antikörper der IgG Klasse bindet, die mit den T. gondii Antigenen auf den Mikropartikeln komplexiert sind, Nicht gebundene Antikörper werden weggewaschen und der Antigen – Patienten IgG – anti-Human IgG -Konjugat -Komplex wird durch die Zugabe des Substrats 4-Methylumbelliferyh Phosphat (MUP) detektiert. Das Entphosphoren von MUP durch die Alkalische Phosphatase kann mit Hilfe der Bildungsrate der fluoreszenten Verbindung Methylumbelliferon (MU) bewertet werden, die auf dem IMx Instrument gemessen werden kann (Fiore, M. et al., Clin.
  • Chem. 34: 1726–1732 (1988)). Dieser quantitative Assay beinhaltet ein Set von 6 Kalibratoren um die Kalibrierungskurve zu erstellen. Die Kalibratoren sind mit humanem anti- T. gondii IgG Antikörper präpariert, die mit auf sechs verschiedene Konzentrationen verdünnt wurden: 0, 10, 50, 75, 150 und 300 IU IgG Antikörper/ml. Die Kalibratoren sind auf die World Health Organization International Standard für -anti-T. gondii Serum bezogen. Die Kalibratoren werden an Stelle der Probe laufen gelassen und es wird eine Kalibrierungskurve aufgezeichnet. Die Ergebnisse werden aus der sechs-Punkt Kalibrierungskurve interpoliert, um die IgG Niveaus in den Proben quantitativ zu bestimmen. Für diesen Assay wird die anti- T. gondii IgG Positivkontrolle mit 20 IU/ml humanem anti- T. gondii IgG, das mit Humanserum verdünnt ist, vorbereitet.
  • Der von den Abbott Laboratories hergestellte IMx Toxo IgMG Assay ist ein automatisierter MEIA, der für die quantitative Messung von IgM Antikörpern gegen T. gondii entwickelt wurde. Das Assay-Format ist dem des IMx Toxo IgG Assays ähnlich, aber das Alkalische Phosphatase Konjugat ist Ziegen anti-humaner IgM Antikörper. Das Ergebnis des Assay wird als ein Indexwert ausgedrückt, der das Verhältnis von Proben-Zählimpulsen zum Indexkalibrator ist. Der Indexkalibrator ist mit Human- anti- T. gondii IgM – Antikörper in Humanserum präpariert und wird in die Nähe des Positiven/negativen Grenzwerts gesetzt. Die Positivkontrolle wird auf ähnliche Weise präpariert, und wird so festgesetzt, dass sie einen Indexwert von 1,5X dem Indexkalibrator ergibt.
  • Es wurden zweifache Reihenverdünnungen von gereinigtem anti-P66 schimären IgG1 Antikörper, mit einer Anfangskonzentration von 11,59 mg/ml und IMx Toxo Serum der Positivkontrolle in negativem Humanserum (Kalibratorenverdünner) gemacht. Die Verdünnungen wurden als Duplikate laufen gelassen und die Rate-Zählimpulse wurden bestimmt. Der anti-P66 schimäre IgG1 Antikörper hatte eine abgeflachte Kurve bei höheren Konzentrationen als 0,7 mg/ml, wobei er bei 11,59 mg/ml 2070 Rate-Zählimpulse erreichte (10). Die Rate-Zählimpulse des 300 IU/ml Kalibrators (IMx Kalibrator F) betrugen 2572. Die beim anti-P66 schimären IgG1 -Antikörper festgestellte Abflachung am oberen Ende der Kurve spiegelt wahrscheinlich die Sättigung der anti-P66 -Bindungsstellen im IMx Kit wider.
  • Um die Leistung eines monoklonalen schimären IgM Antikörpers zu prüfen wurde das anti-P66 IgM bei 0,210 mg/ml und die IMx Toxo IgM Positivkontrolle zweifach mit Index Kalibrator Verdünner seriell verdünnt. Diese Verdünnungen wurden als Duplikate laufen gelassen und mit der Positivkontrolle und dem Index-Kalibrator verglichen (11). Die vorhergesagten Werte für äquivalente Rate-Zählimpulse im Vergleich zur Positivkontrolle und dem Index-Kalibrator wurden von den Verdünnungskurven abgelesen, um die Konzentration an Antikörpern zu bestimmen. Die Index-Kalibrator-Rate von 710 und die Rate der Positivkontrolle von 1078 wurden jeweils bei 0,0123 mg/ml und 0,0209 mg/ml schimäres IgM erreicht. Diese Daten beweisen, dass das monoklonale anti-P66 schimäre IgM als akzeptabler Index-Kalibrator und Positivkontrolle in diesem Assay funktioniert. Somit kann der anti-P66 schimäre Antikörper wahrscheinlich das positive Humanplasma ersetzten, in der Herstellung von Index-Kalibrator und Positivkontrolle für diesen Assay. Im Gegensatz zum anti-P66 schimären IgG1 scheinen die Rate-Zählimpulse kein Plateau zu bilden, auch nicht bei der höchsten der getesteten Konzentrationen. Dieses könnte auf die strukturellen Unterschiede zwischen IgG1 und IgM zurückzuführen sein, weil die Dichte der Epitope in den zwei Assays erwartungsgemäß im großen äquivalent sein sollte. Das meiste IgM wurde als Pentamer sezerniert, wodurch eine größere Anzahl von Epitopen der konstanten Region zur Verfügung gestellt wird, im Vergleich zur dimeren Struktur von IgG1. Im Falle des Toxo IgM Assay bindet vermutlich mehr von dem Enzym-gebundenen sekundären Antikörper (anti-Human-IgM) an den Antigen-Antikörper Komplex, im Vergleich zum Toxo IgG Assay (anti-Human-IgG), was zu einer weiteren Amplifikation des Signals führt.
  • Der gereinigte anti-P30 schimäre IgG1 Antikörper, mit einer Konzentration von 0,87 mg/ml und IMx Toxo positives Humanserum (Kalibrator F, 300 IU/ml) wurden seriell mit Kalibrator-Verdünner verdünnt, um Antikörper-Niveaus über den dynamischen Bereich (0–300 IU/ml) des Assay bereitzustellen. Diese Verdünnungen wurden als Duplikate laufen gelassen und Rate-Zählimpulse (Zählimpulse/Sek/Sek) wurden aus den Verdünnungskurven abgelesen. Der schimäre anti-P30 IgG1 Antikörper und das Positivkontrolle-Serum hatten parallele Verdünnungskurven (12). Der Humanserum-Kalibrator (F Kalibrator) mit 300 IU/ml hatte 3015 Rate-Zählimpulse. Der anti-P30 schimäre IgG1 erreichte einen äquivalenten Wert an Rate-Zählimpulsen bei einer Konzentration von 0,11 mg/ml. Es wurde keine Abflachung der Kurve, die mit dem anti-P30 schimären Antikörper erzielt worden war, bis zu 4261 Rate-Zählimpulsen bei einer Konzentration von 0,87 mg/ml beobachtet. Auf diese Daten basierend erreichte das anti-P30 schimäre IgG1 ein akzeptables Signal für eine IMx- Kallibrierungskurve. Diese Daten demonstrieren, dass ein schimärer Antikörper, der für ein einziges Epitop auf P30 spezifisch ist, das Potential besitzt, das als Kalibratoren und Kontrollen verwendete positive Humanserum in diesem Assay zu ersetzten.
  • Um die Leistung eines schimären IgM- Antikörpers zu prüfen wurden das gereinigte anti-P30 IgM bei 0,104 mg/ml und die IMx Toxo IgM Positivkontrolle mit Index-Kalibrator -Verdünner in zweifache Verdünnungsreihen verdünnt. Diese Verdünnungen wurden als Duplikate laufen gelassen und mit der Positivkontrolle und dem Idex-Kalibrator verglichen (13). Die vorhergesagten Werte für äquivalente Rate-Zählimpulse im Vergleich zur Positivkontrolle und dem Index-Kalibrator wurden von den Verdünnungskurven abgelesen und die Antikörperkonzentrationen bestimmt. Die Index-Kalibrator-Rate von 560 und die Rate der Positivkontrolle von 1050 wurden bei 0,0084 mg/ml und beziehungsweise 0,0145 mg/ml anti-P30 schimäres IgM erreicht. Diese Daten beweisen, dass mit dem monoklonalen anti-P30 schimären IgM-Antikörper ein akzeptabler IMx Cutoff-Wert erhalten werden kann.
  • vi) Untersuchung der beschleunigten Reagens-Stabilität:
  • Eine beschleunigte Stabilitätsanalyse der schimären IgG Antikörper im Toxo IgG Assay-Format wurde durchgeführt, durch das Aussetzen der Komponenten dem Hitze-Stress bei 45°C für bis zu 12 Tage. Für das anti-P30 schimäre IgG1 und eine Mischung aus den zwei monoklonalen Antikörpern (anti-P30 + antiP66 IgG1) wurden Verdünnungen als Duplikate laufen gelassen, gegen die Kalibrierungskurve des Assay im IMx- Toxo IgG Assay. Es wurde eine Punkt zu Punkt Kurvenanpassung verwendet, um die Konzentrationen an schimären Antikörpern vorherzusagen, die notwendig sind, damit sie mit den aktuellen Human- Antikörper Kalibratoren übereinstimmen. Für die Stabilitätsanalyse wurden zwei Niveaus an Kalibratoren untersucht, der B Kalibrator mit 10 IU/ml und der F Kalibrator mit 300 IU/ml. Mit dem B Kalibrator äquivalente Rate-Zählimpulse wurden mit 0,0036 mg/ml anti-P30 IgG1 oder mit einer Mischung aus 0, 0036 mg/ml anti-P30 und 0,10 mg/ml anti-P66 IgG1 erreicht. Die Reagenzien des Kits und die Kalibratoren wurden bis zu 12 Tage bei 2–8°C oder 45°C gelagert. An den Tagen 0, 4, 8 und 12 wurden Teste laufen gelassen, mit den Reagenzien und die Leistung wurde gegen den Standard – Human- B Kalibrator (14) graphisch dargestellt. Bei 2–8°C waren alle Kit -Reagenzien und die schimären Antikörper stabil. Wurden die Kit- Reagenzien bei 45°C gelagert, war, im Gegensatz dazu, etwa am Tag 4 eine 30%ige Reduktion der Rate-Zählimpulse für das anti-P30-IgG1 zu beobachten, im Vergleich zum Standard-Human-B Kalibrator. Etwa am Tag 12 bei 45°C war das mit dem anti-P30 erhaltene Signal um ungefähr 50% reduziert. Der Verlust an Aktivität war nicht dem Mangel an Stabilität des schimären IgG1 zuzuschreiben, weil es unter diesen Bedingungen genauso stabil war wie die Standard Human-Kalibrator-Antikörper. Die Reduktion der Rate-Zählimpulse wird anscheinend vom Verlust des P30 Epitops verursacht, das von diesem monoklonalen schimären Antikörper erkannt wird. Als die schimäre Antikörper Mischung untersucht wurde, waren die Leistungs-Charakteristika ähnlich jener, die für den Human-Antikörper-Kalibrator festgestellt wurden. Anscheinend ist das vom monoklonalen anti-P66 -Antikörper erkannte P66 Epitop unter diesen Bedingungen stabiler, und es kompensiert den Hitze-induzierten Verlust des P30 Epitops.
  • Um die Niveaus des F Kalibrators zu erreichen wurden 0,110 mg/ml anti-P30 -IgG1 oder eine Mischung aus 0,110 mg/ml anti-P30 und 0,305 mg/ml anti-P66-IgG1 verwendet. Die Leistung des Assays mit den Test-Reagenzien, im Vergleich zu der mit dem Standard-Human-Kalibrator, wird in 15 gezeigt. Bei 2–8°C gelagert, waren alle Kit Reagenzien und schimären Antikörper stabil. Ähnlich den Ergebnissen, die beim B Kalibrator-Niveau beobachtet wurden; wurde bei den anti-P30 Antikörpern, wenn sie bei 45°C gelagert waren, ein progressiver Rückgang der Rate-Zählimpulse beobachtet. Die Kombination der anti-P30 und anti-P66 monoklonalen Antikörper zeigte akzeptable Stabilitäts-Eigenschaften im Vergleich zum nativen Human-F Kalibrator, auch nach Hitzestress bei 45°C. Der Verlust der Stabilität beim anti-P30 schimären Antikörper scheint vom Verlust des P30 Epitops verursacht zu werden, das von diesem monoklonalen Antikörper erkannt wird, weil der schimäre anti-P30 Antikörper, im Vergleich zu den Human- Kalibrator-Antikörpern, kein Unterschied in der Stabilität zeigte.
  • Diese Daten demonstrieren, dass schimäre Antikörper produziert werden können, die für die kommerzielle Herstellung geeignete Stabilitäts-Eigenschaften besitzen. Der langsame Verfall des P30 Epitops bei Hitze-Stress hebt hervor, wie wichtig es ist, dass vom schimären Antikörper erkannte Epitop sorgfältig auszuwählen. In diesem Fall wurde ein Vergleich gemacht, zwischen den Bindungseigenschaften eines schimären monoklonalen Antikörpers und denen eines polyklonalen Antiserums. In letzterem Fall werden mehrere Epitope auf einem bestimmten Antigen (z. B. P30) erkannt und der Verlust eines einzigen davon könnte nicht erkannt bleiben. Ein Vorteil dieser Technologie ist, dass man Kandidaten für Ratten – monoklonale Antikörper auf die gewünschten Eigenschaften screenen kann, bevor die V Regionen kloniert werden und die schimären Antikörper produziert werden. Die Eigenschaften des schimären Antikörpers wird diejenigen des ursprünglichen Donor-Antikörpers widerspiegeln. Für den IMx Toxo IgG Assay stellen die kombinierten Eigenschaften, durch die Mischung der anti-P30 und anti-P66 schimären Antikörper, ein Leistungsniveau zur Verfügung, das den Standard-Human-Antikörper-Kalibratoren äquivalent ist. Dieses stellt fest, dass schimäre Antikörperals Kontrollen und Kalibratoren verwendet werden können, anstelle von positivem Humanserum. In manchen Fällen könnte ein einziger schimärer Antikörper ausreichen. In anderen Fällen könnte es notwendig sein, mehr als einen schimären Antikörper zu poolen, um die gewünschten Leistungscharakteristika des Assay zu erreichen.
  • vii) Analyse der Los-zu-Los Antigen Variation:
  • Um zu prüfen, ob eine signifikante Los-zu-Los Variation vorhanden war, in der Expression der P30 und P66 Epitope, die von schimären Antikörpern erkannt werden, wurden Mischungen der anti-P30 und anti-P66 schimären Antikörpern getestet, auf den Niveaus des B -Kalibrators und des F -Kalibrators, mit mehreren Antigen-Losen. Die Ergebnisse dieser Analyse, mit sieben unabhängigen Antigen-Losen, werden in 16 gezeigt. Die Leistung beider Mischungen von anti-P66 und anti-P30 schimären Antikörpern waren vergleichbar (innerhalb der Variabilität des Assays) mit den aktuellen IMx Humanserum-Kalibratoren. Dieses bestätigt weiterhin das Potential der Maus-Human-schimären Antikörper als Ersatz für positive Human-Antikörper zu fungieren.
  • SEQUENZ LISTING
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Claims (31)

  1. Ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Antikörpers, der in einer Testprobe anwesend sein kann, worin das Verfahren folgenes umfasst: a) in Kontakt bringen der Testprobe, von der vermutet wird, dass sie den Antikörper enthält, mit meinem Antigen, das spezifisch ist für den Antikörper, für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um die Bildung von Antigen/Antikörper-Komplexen zu erlauben, b) Nachweisen der Anwesenheit des Antikörpers, welcher in der Testprobe anwesend sein kann, und c) Verwenden, als eine Kontrolle oder ein Kalibrator, eines oder mehrerer Reagenzien, wobei jedes an das Antigen bindet und ein chimärer monoklonaler Antikörper ist, der variable Regionen der schweren und leichten Kette von einer Wirtsspezies umfasst, kondensiert an die konstanten Regionen der schweren und leichten Kette von der selben Wirtsspezies wie der Antikörper, der Ratte wird, oder von einer Wirtsspezies, die verwandt ist mit der selben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, auf der Basis von immunologischer Kreuzreaktivität von Epitopen der konstanten Region, worin, wenn zwei oder mehr Reagenzien als Kontrolle oder Kalibrator verwendet werden, die Reagenzien an verschiedene Epitope auf dem Antigen binden.
  2. Das Verfahren von Anspruch 1, das folgende Schritte umfasst: Hinzufügen eines direkten oder indirekten Kunjugates zu den resultierenden Antigen/Antikörper-Komplexen für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um dem Konjugat zu erlauben an den gebundenen Antikörper zu binden, worin das Konjugat einen Antikörper umfasst, der an eine signalerzeugende Verbindung angeheftet ist, die in der Lage ist, ein detektierbares Signal zu erzeugen, und Nachweisen der Anwesenheit des Antikörpers, der in der Testprobe anwesend sein kann, durch detektieren des Signals, das durch die signalerzeugende Verbindung erzeugt wird.
  3. Ein Kit zur Bestimmung der Anwesenheit eines Antikörpers in einer Testprobe, der folgendes umfasst: a) ein Antigen, das spezifisch ist für den Antikörper; und b) eine Kontrolle oder einen Kalibrator, der ein oder mehrere Reagenzien umfasst, von denen jedes an das Antigen bindet und ein chimärer monokonaler Antikörper ist, der variable Regionen der schweren und leichten Kette von einer Wirtsspezies umfasst, kondensiert an die konstanten Regionen der schweren und leichten Kette von der selben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, oder von einer Wirtsspezies, die mit der selben Wirtsspezies verwandt ist wie der Antikörper, der gemessen wird, auf der Basis von immunologischer Kreuzreaktivität von Epitopen der konstanten Region, worin, wenn die Kontrolle oder der Kalibrator zwei oder mehrere Reagenzien umfasst, die Reagenzien an verschiedene Epitope auf dem Antigen binden.
  4. Der Kit von Anspruch 3, der weiterhin ein direktes oder indirektes Konjugat umfasst, das einen Antikörper umfasst, der an eine signalerzeugende Verbindung angeheftet ist, die in der Lage ist, ein detektierbares Signal zu erzeugen.
  5. Ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Antikörpers, der in einer Testprobe anwesend sein kann, worin das Verfahren folgendes umfasst: (a) in Kontakt bringen der Testprobe, von der vermutet wird, dass sie den Antikörper enthält, mit einem Anti-Antikörper, der spezifisch ist für den Antikörper, für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um die Bildung von Anti-Antikörper/Antikörper-Komplexen zu erlauben, (b) Nachweisen der Anwesenheit des Antikörpers, der in der Testprobe anwesend sein kann, und (c) Verwenden, als eine Kontrolle oder ein Kalibrator, eines oder mehrerer Reagenzien, wobei jedes an den Anti-Antikörper bindet und ein chimärer monoklonaler Antikörper ist, der variable Regionen der schweren und leichten Kette von einer Wirtsspezies umfasst, kondensiert an die konstanten Regionen der schweren und leichten Kette von der selben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, oder von einer Wirtsspezies, die mit der selben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, verwandt ist, auf der Basis von immunologischer Kreuzreaktivität von Epitopen der konstanten Region, worin das eine oder die mehreren Reagenzien an ein Antigen binden, das spezifisch ist für den Antikörper, und, wenn zwei oder mehrere Reagenzien verwendet werden, an unterschiedliche Epitope auf dem Antigen binden.
  6. Das Verfahren von Anspruch 5, das folgende Schritte umfasst: Hinzufügen eines Konjugates zu den resultierenden Anti-Antikörper/Antikörper-Komplexen für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um dem Konjugat zu erlauben, an den gebundenen Antikörper zu binden, worin das Konjugat ein Antigen umfasst, das an eine signalerzeugende Verbindung angeheftet ist, die in der Lage ist, ein detektierbares Signal zu erzeugen, und Nachweisen der Anwesenheit des Antikörpers, der in der Testprobe anwesend sein kann, durch Detektieren des Signals, das durch die signalerzeugende Verbindung erzeugt wird.
  7. Ein Kit zur Bestimmung der Anwesenheit eines Antikörpers in einer Testprobe, der folgendes umfasst: a) einen Anti-Antikörper, der spezifisch ist für den Antikörper; b) ein Antigen, das spezifisch ist für den Antikörper oder ein direktes oder indirektes Konjugat, das ein Antigen umfasst, das an eine signalerzeugende Verbindung angeheftet ist, die in der Lage ist, ein detektierbares Signal zu erzeugen; und c) eine Kontrolle oder einen Kalibrator, der ein oder mehrere Reagenzien umfasst, wobei jedes an das Antigen bindet und ein chimärer monoklonaler Antikörper ist, der variable Regionen der schweren und leichten Kette von einer Wirtsspezies umfasst, kondensiert an die konstanten Regionen der schweren und leichten Kette von der selben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, oder von einer Wirtsspezies, die mit der selben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, verwandt ist, auf der Basis von immunologischer Kreuzreaktivität von Epitopen der konstanten Region, worin, wenn die Kontrolle oder der Kalibrator zwei oder mehrere Reagenzien umfasst, die Reagenzien an unterschiedliche Epitope auf dem Antigen binden.
  8. Das Verfahren von irgendeinem der Ansprüche 1, 2, 5 und 6, worin ein Reagenz als Kalibrator oder Kontrolle verwendet wird.
  9. Das Verfahren von irgendeinem der Ansprüche 1, 2, 5 und 6, worin zwei oder mehr Reagenzien, die an unterschiedliche Epitope auf dem Antigen binden, als Kontrolle oder Kalibrator verwendet werden.
  10. Das Verfahren von irgendeinem der Ansprüche 1, 2, 5 und 6, worin jeder der chimären monoklonalen Antikörper variable Regionen der schweren und leichten Kette von einem Nager umfasst, kondensiert an die konstanten Regionen der schweren und leichten Kette von einem Menschen.
  11. Das Verfahren von Anspruch 10, worin der Nager eine Maus ist.
  12. Das Verfahren von irgendeinem der Ansprüche 1, 2, 5 und 6, worin der chimäre monoklonale Antikörper spezifisch an Toxoplasma gondii bindet, vorzugsweise an die Proteine P30 oder P66 davon.
  13. Das Verfahren von Anspruch 8, worin der chimäre monoklonale Antikörper eine variable Region der schweren Kette einer Ratte umfasst, kodiert durch die Nukleotid-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 2 oder allelen Variationen davon und eine variable Region der leichten Kette einer Ratte, kodiert durch die Nukleotid-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 4 oder allelen Variationen davon.
  14. Das Verfahren von Anspruch 8, worin der chimäre monoklonale Antikörper eine variable Region der schweren Kette einer Ratte umfasst, die die Aminosäure-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 1 hat und eine variable Region der leichten Kette. einer Ratte, die die Aminosäure-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 3 hat.
  15. Das Verfahren von Anspruch 8, worin der chimäre monoklonale Antikörper eine variable Region der schweren Kette einer Ratte umfasst, kodiert durch die Nukleotid-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 6 oder allelen Variationen davon und eine variable Region der leichten Kette einer Ratte, kodiert durch die Nukleotid-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 8 oder allelen Variationen davon.
  16. Das Verfahren von Anspruch 8, worin der chimäre monoklonale Antikörper eine variable Region der schweren Kette einer Ratte umfasst, die die Aminosäure-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 5 hat und eine variable Region der leichten Kette einer Ratte, die die Aminosäure-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 7 hat.
  17. Das Verfahren von Anspruch 9, worin einer der chimären monoklonalen Antikörper eine variable Region der schweren Kette einer Ratte umfasst, kodiert durch die Nukleotid-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 2 oder allelen Variationen davon, und eine variable Region der leichten Kette einer Ratte, kodiert durch die Nukleotid-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 4 oder allelen Variationen davon und ein anderer der chimären monoklonalen Antikörper umfasst eine variable Region der schweren Kette einer Ratte, kodiert durch die Nukleotid-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 6 oder allelen Variationen davon, und eine variable Region der leichten Kette einer Ratte, kodiert durch die Nukleotid-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 8 oder allelen Variationen davon.
  18. Das Verfahren von Anspruch 9, worin einer der chimären monoklonalen Antikörper eine variable Region der schweren Kette einer Ratte umfasst, die die Aminosäure-Sequenz von Sequenz- Identifikations-Nummer 1 hat, und eine variable Region der leichten Kette einer Ratte, die die Aminosäure-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 3 hat, und ein anderer der chimären monoklonalen Antikörper eine variable Region der schweren Kette einer Ratte umfasst, die die Aminosäure-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 5 hat, und eine variable Region der leichten Kette einer Ratte, die die Aminosäure-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 7 hat.
  19. Der Kit von irgend einem der Ansprüche 3, 4 und 7, worin der Kalibrator oder die Kontrolle ein Reagenz umfasst, welches an das Antigen bindet.
  20. Der Kit von irgend einem der Ansprüche 3, 4 und 7, worin der Kalibrator zwei oder mehrere Reagenzien umfasst, die an verschiedene Epitope auf dem Antigen binden.
  21. Der Kit von irgendeinem der Ansprüche 3, 4 und 7, worin jeder der chimären monoklonalen Antikörper variable Regionen der schweren und leichten Kette von einem Nager umfasst, kondensiert an die konstanten Regionen der schweren und leichten Kette von einem Menschen.
  22. Der Kit von Anspruch 20, worin der Nager eine Maus ist.
  23. Das Verfahren von irgend einem der Ansprüche 1, 2, 5 und 6, worin der chimäre monoklonale Antikörper spezifisch an Toxoplasma gondii bindet, vorzugsweise an die Proteine P30 oder P66 davon.
  24. Der Kit von Anspruch 19, worin der chimäre monoklonale Antikörper eine variable Region der schweren Kette einer Ratte umfasst, kodiert durch die Nukleotid-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 2 oder allelen Variationen davon, und eine variable Region der leichten Kette einer Ratte, kodiert durch die Nukleotid-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 4 oder allelen Variationen davon.
  25. Der Kit von Anspruch 19, worin der chimäre monoklonale Antikörper eine variable Region der schweren Kette einer Ratte umfasst, die die Aminosäure-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 1 hat, und eine variable Region der leichten Kette einer Ratte, die die Aminosäure-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 3 hat.
  26. Der Kit von Anspruch 19, worin der chimäre monoklonale Antikörper eine variable Region der schweren Kette einer Ratte umfasst, kodiert durch die Nukleotid-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 6 oder allelen Variationen davon, und eine variable Region der leichten Kette einer Ratte, kodiert durch die Nukleotid-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 8 oder allelen Variationen davon.
  27. Der Kit von Anspruch 19, worin der chimäre monoklonale Antikörper eine variable Region der schweren Kette einer Ratte umfasst, die die Aminosäure-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 5 hat und eine variable Region der leichten Kette einer Ratte, die die Aminosäure-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 7 hat.
  28. Der Kit von Anspruch 20, worin einer der chimären monoklonalen Antikörper eine variable Region der schweren Kette einer Ratte umfasst, kodiert durch die Nukleotid-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 2 oder allelen Variationen davon, und eine variable Region der leichten Kette einer Ratte, kodiert durch die Nukleotid-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 4 oder allelen Variationen davon und ein anderer der chimären monoklonalen Antikörper umfasst eine variable Region der schweren Kette einer Ratte, kodiert durch die Nukleotid-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 6 oder allelen Variationen davon, und eine variable Region der leichten Kette einer Ratte, kodiert durch die Nukleotid-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 8 oder allelen Variationen davon.
  29. Der Kit von Anspruch 20, worin einer der chimären monoklonalen Antikörper eine variable Region der schweren Kette einer Ratte umfasst, die die Aminosäure-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 1 hat, und eine variable Region der leichten Kette einer Ratte, die die Aminosäure-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 3 hat, und ein anderer der chimären monoklonalen Antikörper umfasst eine variable Region der schweren Kette einer Ratte, die die Aminosäure-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 5 hat, und eine variable Region der leichten Kette einer Ratte, die die Aminosäure-Sequenz von Sequenz-Identifikations-Nummer 7 hat.
  30. Ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Antikörpern, die gegen mehr als ein Antigen entwickelt wurden, welche in einer Testprobe anwesend sein können, worin das Verfahren folgendes umfasst: (a) in Kontakt bringen der Testprobe, von der vermutet wird, dass sie die Antikörper enthält, mit Antigenen, die spezifisch sind für die Antikörper für einen Zeitraum bzw. unter Bedingungen, die ausreichend sind, um die Bildung von Antigen/Antikörper-Komplexen zu erlauben, (b) Hinzufügen von direkten oder indirekten Konjugaten zu den Antigen/Antikörper-Komplexen für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um den Konjugaten zu erlauben, an die gebundenen Antikörper zu binden, worin die Konjugate einen Antikörper umfassen, der an eine signalerzeugende Verbindung angeheftet ist, die in der Lage ist, ein detektierbares Signal zu erzeugen, (c) Nachweisen der Anwesenheit der Antikörper, die in der Testprobe anwesend sein können, durch Detektieren des Signals, das durch die signalerzeugende Verbindung erzeugt wird, und (d) Verwenden, als Kontrollen oder Kalibratoren, von Reagenzien, welche an die Antigene binden, dadurch gekennzeichnet, dass jedes der Reagenzien jeweils an die Antigene bindet bzw. ein chimärer monoklonaler Antikörper ist, der variable Regionen der schweren und leichten Kette von einer Wirtsspezies umfasst, kondensiert an die konstanten Regionen der schweren und leichten Kette von der selben Wirtsspezies wie der Antikörper, der gemessen wird, oder von einer Wirtsspezies, die mit der selben Wirtsspezies verwandt ist wie der Antikörper, der gemessen wird, auf der Basis von immunologischer Kreuzreaktivität von Epitopen der konstanten Region.
  31. Ein Kit zur Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern, die gegen mehr als ein Antigen entwickelt wurden, die in einer Testprobe anwesend sein können, der folgendes umfasst: a) Antigene, die jeweils spezifisch sind für die Antikörper; b) direkte oder indirekte Konjugate, die jeweils einen Antikörper umfassen, der an eine signalerzeugende Verbindung angeheftet ist, die in der Lage ist, ein detektierbares Signal zu erzeugen; und c) Kontrollen oder Kalibratoren, die Reagenzien umfassen, die an die entsprechenden Antigene binden, worin jedes dieser Reagenzien ein chimärer monoklonaler Antikörper ist, der variable Regionen der schweren und leichten Kette von einer Wirtsspezies umfasst, kondensiert an die konstanten Regionen der schweren und leichten Kette von der selben Wirtsspezies wieder Antikörper, der gemessen wird, oder von einer Wirtsspezies, die mit der selben Wirtsspezies verwandt ist wie der Antikörper, der gemessen wird, auf der Basis von immunologischer Kreuzreaktivität von Epitopen der konstanten Region.
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