DE3852683T2

DE3852683T2 - Agglutinationstest.

Info

Publication number: DE3852683T2
Application number: DE3852683T
Authority: DE
Inventors: Peter Gregory Bundesen; Carmel J Hillyard; Bruce E Kemp; Dennis B Rylatt
Original assignee: Agen Ltd
Current assignee: Agen Ltd
Priority date: 1987-09-17
Filing date: 1988-09-16
Publication date: 1995-05-11
Anticipated expiration: 2008-09-17
Also published as: NO884131D0; EP0308242A3; JPH01153960A; NO884131L; JP2553159B2; NZ226202A; EP0308242B1; EP0308242A2; NO175024B; ES2070129T3; OA08953A; ATE116740T1; NO175024C; DE3852683D1; DK519388A; DK519388D0; IL87768A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Reagenz und ein Verfahren, um ein Antigen, einen Antikörper oder einen anderen Stoff in menschlichem oder tierischem Blut durch Erythrocyten-Agglutination nachzuweisen. Die Erfindung betrifft gleichzeitig einen Kit, der das Reagenz und die Arbeitsanleitung enthält.

Stand der Technik

Das Testen von Blutproben auf bestimmte Antigene oder Antikörper beinhaltet normalerweise einen Trennungsschritt, bei dem zelluläre Bestandteile vom Blutserum durch Zentrifugation und/oder Gerinnung abgetrennt werden.
Dies bringt einige gewichtige Probleme mit sich. Zum Ersten eignet sich ein solcher Test nicht für die Anwendung außerhalb der Praxis. In vielen Situationen ist für einen Tierarzt ein schneller Test an Ort und Stelle wünschenswerter als die Alternative, Proben in ein Labor zum Auftrennen und Testen zu transportieren. Oft müssen Veterinärchirurgen, die keine Möglichkeit haben eine Zentrifuge zu nutzen, Blutproben auch auf infektiöse Erreger wie z. B. Dirofilaria immitis testen. Fern er stellen Tests, die in der Dritten Welt zum Nachweisen von Krankheiten genutzt werden, ein Situation dar, bei der es besonders auf Einfachheit und niedrige Kosten ankommt.
Zum Zweiten ist, unter bestimmten pathologischen Umständen, die Auftrennung von Blutproben schwierig. Bei Patienten, die z. B. an Makroglobulinämia Waldenström leiden, ist es schwierig das Blut in Serum und Zellfraktion aufzutrennen, was ein für Gesamtblut einsetzbares Testsystem sehr wünschenswert macht.
Zum Dritten werden Blutproben oft herangezogen, um das Vorhandensein hoch infektiöser und potentiell gefährlicher Krankheitszustände zu testen. In solchen Fällen ist es wünschenswert, die Proben so wenig wie möglich handzuhaben und zu bearbeiten, um das Risiko für das den Test durchführende Personal herabzusetzen. Weiterhin sind Situationen denkbar, in denen ein frei verkäuflicher Finger-pick-Test, der dann notwendigerweise mit Gesamtblut durchführbar ist, eingesetzt werden kann.
Revolutionär in der medizinische Diagnostik und der Tiermedizin war die Einführung von Immuntests wie z. B. des Radioimmuntests, erstmals von Yalo and Berson (1959) in Nature 184, 1648 vorgestellt, oder des Enzym- Immuntests, auch EIA, veröffentlicht von Engvall und Perlman (1971) in Immunochem 8, 871 und von Van Weeman und Schuurs (1971) FEBS Letters 15, 232.
Während solche Tests auf Antikörper-Antigen Wechselwirkungen aufgebaut sind, sind die verwendeten Nachweissysteme meist komplex. Die verwendeten Reagenzien sind gewöhnliche Enzyme oder radioaktiv markierte Antigene, Antikörper oder Komplexe der Art, so daß sie, um das zu testende Substrat nachzuweisen, mit bestimmten Stoffen inkubiert werden müssen, um anschließend entweder mittels einer optischen Farbreaktion oder mittels eines Colorimeters oder durch Auszählen des radioaktiven Zerfalls mittels eines Strahlungsdetektors ausgewertet zu werden. Solche Testsysteme beinhalten immer auch mehrere Waschschritte. Zur Zeit sind die meisten Immuntests zum Nachweis von Stoffen im Blut solcher Art. Diese Testsysteme sind zwar sensitiv, jedoch auch zeitraubend und oft erfordern sie für Einzelschritte zum Nachweis des gesuchten Stoffes teure Instrumente.
Eine Alternative zu diesen Testsystemen stellen Immuntests nach Gupta et al, (1985) Journal of Immunological Methods 30, 177-187 dar. Es handelt sich dabei um Immuntests, bei denen Erythrozyten zusammen mit Anti-Erythrozyten-Antikörper als Indikatorsystem verwendet werden. Es werden in diesen Systemen exogene Erythrozyten z. B. vom Schaf verwendet.
In den letzten Jahren ist es gelungen, Antikörper an Latexperlen anzuheften, und so einen schnellen Agglutinationstest zu erhalten. Hierbei ist jedoch noch die Trennung von Serum/Plasmaphase von der zellulären Phase erforderlich, und folglich ist die Benutzung einer Zentrifuge oder eines Filtrationssystems nötig. Latex-Agglutinationstests sind beschrieben bei Merskey et al, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (1969), 131, 871; Castelon et al, J. Clin. Pathol. (1968), 21, 638; und Singer & Plotz AM. J. Med. (12/1986), 888.
Sowohl direkte als auch indirekte Agglutinations-Immuntest sind etablierte Techniken. Bei diesen Verfahren wird die Agglutination von Teilchen, an die Antigene oder Antikörper gebunden sind, als Nachweis für die An- oder Abwesenheit der entsprechenden Antikörper oder Antigene genutzt. Eine Vielzahl von Teilchen z. B. aus Latex, Aktivkohle, Kaolinit oder aus Bentonit aber auch Bakterien und rote Blutkörperchen sind als agglutinationsfähige Träger verwendet worden; vergleiche Mochida, US-PS 4308026. Die Verwendung von Erythrozyten als Indikator wurde von Patel, US-PS 3882225, heftig kritisiert, indem er sagte, es sei schwierig Indikator-Erythrozyten zu standardisieren.
Molinaro, US-PS 4130634, beschreibt ein Verfahren, bei dem mit Antikörpern bedeckte rote Blutzellen verwendet werden. Molinaro betont, daß die Methode, den Antikörper an den Erythrozyten anzukoppeln, nicht die Reaktionsfreudigkeit des Antikörpers zerstören darf. Er hebt hervor, daß Antikörper, die für Erythrozyten spezifisch sind, für dieses Verfahren ungeeignet sind. Er erwähnt auch die Möglichkeit der Verwendung hybrider Antikörper, bei denen eine Bindungsstelle spezifisch für das Antigen und die andere Bindungsstelle spezifisch für die roten Blutkörperchen ist.
Chang, US-PS 4433059, machte ein Immuntest-Agglutinationsreagenz bekannt, in dem zwei Antikörper kovalent "Schwanz-an-Schwanz" gebunden sind, um ihre Spezifität nicht zu verändern. Der eine Antikörper ist spezifisch für den Indikatorstoff als Antigen, z. B. einen Erythrozyten. Dieser Antikörper ist vorzugsweise einwertig, um unspezifische Agglutination zu vermeiden. Der andere Antikörper ist zweiwertig und ist spezifisch für die Testsubstanz. Bei der Verfahrensdurchführung werden frische Erythrozyten mit dem Konjugat bedeckt. Diese mit zwei verbundenen Antikörpern bedeckten roten Blutzellen (rBZ) werden dann mit dem Testserum inkubiert. Das Testen von Blutproben unter Verwendung eines nicht-selbst-agglutinierenden Anti-rBZ-Antikörpers und endogener Erythrozyten wurde von Chang nicht in Erwägung gezogen.
Chu, US-PS 4493793, veröffentlichte die Entwicklung eines Konjugates aus kovalent gebundenem Lektin-Antikörper oder Lektin-Antigen. Seine Tabelle 1 gibt für mehrere Lektine die Kohlenhydrat-Spezifität an. Er verbindet aber keines dieser Konjugate mit einem Erythrozyten weder über das Lektin noch über Antikörperrezeptoren.
Man kennt noch andere immunologische "Schwanz-an-Schwanz" Paarungen. Segla, US-PS 4676980 machte die Entwicklung eines "Schwanz-an- Schwanz"-Konjugates, aus einem spezifischen Antikörper gegen ein Oberflächen-Antigen der Zielzelle und aus einem spezifischen Antikörper gegen zytotoxische Effektorzellrezeptoren bekannt. Mehrere Vernetzungsmethoden wurden beschrieben. Mit dem eben erwähnten Konjugat wird eine Immuntherapie angestrebt, indem das zelluläre Immunsystem eines Patienten veranlaßt wird, die Zielzelle zu lysieren. Selbstverständlich ist die Zielzelle kein endogener Erythrozyt.
Li, US-PS 4661444, schlägt die Produktion eines "Schwanz-an-Schwanz"- Konjugates eines eine Testsubstanz bindenden Antikörpers und eines Antikörpers vor, der spezifisch für den Idiotyp des ersten Antikörpers ist. Diese Paarung sollte in Verbindung mit einem unlöslichen, Teststoff bindenden Antikörper in einem Immuntest Verwendung finden.
Wardlaw, US-PS 4695553, lehrt den Gebrauch von monoklonalen Antikörpern gegen allgemeine Erythrozyten Antigene als Agglutinationsreagenz für rBZ, um die Plasmagrenzfläche zwischen roten und weißen Blutzellen in zentrifugiertem Blut zu klären. Er bevorzugt Antikörper gegen Glycophorin oder Antigen H, erwähnt aber auch die Möglichkeit eine Mischung aus Lektinen zu verwenden.
Guesdon, US-PS 4668637, diskutiert die Verwendung von Anti-rBZ Antikörpern oder von Lektinen zur Erythroadsorption.
Bigbee, (Molecular Immunology, A2; 1353-1362, 1983) beschreibt die Produktion und das Austesten von vier monoklonalen Antikörpern gegen Glykophorin A.
Das grundlegende Prinzip für die Benutzung eines Antikörpers, der in einem Immuntest mit einer antigenen Determinante aus der Gesamtpalette der interessierenden Teststoffe (Mikroorganismen) reagiert, wurde von McLaughlin, US-PS 4683196, veröffentlicht.
Eine Reihe von Patenten befaßt sich mit Antikörpern, die zur Blutbestimmung dienen, z. B. Lloyd, US-PS 4678747; Graham, Jr., US-PS 4358463; Liu, US-PS 4550017; Steplewski, US-PS 4607009; Lennox, W083/03477. Diese Antikörper sind zur Blutbestimmung geeignet, da sie nur Antigene binden, die in bestimmten Blutzellpopulationen zu finden sind. Im Gegensatz dazu ist es für diese Erfindung wünschenswert, Antikörper (oder Mischungen davon) zu verwenden, die mehr oder weniger alle Erythrozyten binden.
Zuk, US-PS 4594327, erkennt den Bedarf für einen mit Gesamtblutproben durchführbaren Immuntest. In seiner Methode wird die Probe sowohl mit dem ungelösten, substratspezifischen Immunreagenz als auch mit dem rBZ- bindenden Agenz, wie z. B. rBZ-spezifische Antikörper oder ein Lektin, zusammengebracht. Das substratspezifische Immunreagenz und der rBZ- spezifische Antikörper sind nicht aneinander gekoppelt, und es handelt sich bei dem offenbarten Testverfahren auch nicht um einen Agglutinationstest.
Das Problem der unspezifischen Agglutination von Erythrozyten durch im Blut vorkommende Anti-Erythrozyten-Antikörper in immunologischen Agglutinationstests wurde von Czimas, US-PS 3639558, abgehandelt. Er schlug vor, alle natürlich auf den Teilchen vorkommenden Antikörperbindestellen durch Absättigen mit Protein zu eliminieren.
Die Patente von Theofilopoulos, US-PS 4342566; Duermeyer, US-PS 4292403, und Goldenberg, US-PS 4331647, sind interessant, da sie den Gebrauch von spezifisch bindenden Antikörperfragmenten als Ersatz für ganze Antikörper in Testsystemen demonstrieren. Die Konstruktion von heterobifunktionalen Antikörpern wird bei Auditore- Hargreaves, US-PS 4446233, Paulus, US-PS 4444878, und Reading, US-PS 4474893, erläutert. Mochida, US-PS 4200436, offenbart die Verwendung von einwertigen Antikörpern oder bindenden Fragmenten dieser für bestimmte Immuntests. Forrest, US-PS 4659878, erwähnt, daß einwertige Antikörper keine Dimere oder größerausladende Komplexe mit Antigenen bilden können; von diesen Zusammenschlüssen sagt man, daß sie in der Lage wären, die Antigen-Antikörperbindung an einem Fest-Phasen Träger zu beeinflussen.

Beschreibung der Erfindung

Der Erfinder erkannte den Bedarf an einer Methode, die sowohl für den Laborbedarf wie für den Einsatz in der Praxis, insbesondere in Dritte- Welt-Ländern geeignet ist, in denen es an Einrichtungen fehlt, um Blut auf verschiedene Substrate hin medizinisch zu testen. Wie oben aufgeführt, erfordern frühere Methoden das Trennen von Blutzellen und Serum und sind deswegen schwieriger und in vielen Fällen gar nicht direkt in der Feldpraxis einsetzbar.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, daß, wenn Erythrozyten-bindende-Moleküle (EbM) an spezifische Substrate-bindende-Moleküle gekoppelt sind, das daraus entstehende Konjugat dazu verwendet werden kann, beides, endogene Erythrozyten und das Substrat im Blut, zu binden. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, daß, wenn ein solcher Komplex dem Blut zugesetzt wird, die Agglutination von endogenen Erythrozyten durch Wechselwirkungen von Erythrozyten und Substrat als Zeichen für die Anwesenheit des gesuchten Substrates (normalerweise ein Antigen oder Antikörper) genutzt werden kann.
Gemäß einer Maßnahme der Erfindung sind Agglutinationsreagenzien für den direkten Substratnachweis in Blutproben vorgesehen. Diese Reagenzien enthalten ein Erythrozyten-bindendes-Molekül (EbM) gekoppelt an ein Substrat-bindendes-Molekül (SbM), wobei die Kopplung die Bindeeigenschaften der Moleküle nicht verändert und das EbM nur in Anwesenheit des Substrates endogene Erythrozyten binden kann, nicht aber in Abwesenheit des Substrates agglutiniert.
Solch Agglutinationsreagenzien sind für den direkten Nachweis eines Substrates in Blutproben, die Erythrozyten enthalten, geeignet. Der Test beinhaltet das Mischen der Probe mit dem oben beschriebenen Agglutinationsreagenz für einen Zeitraum der lang genug ist, um eine Agglutination zwischen Erythrozyten und Substrat zu ermöglichen. Der Test beinhaltet weiterhin die Feststellung, ob eine Agglutination der Erythrozyten stattgefunden hat, sowie ein Inbeziehungsetzen der Agglutination mit der in den Proben enthaltenen Substratmenge.
Des weiteren beinhaltet die Erfindung Agglutinationsreagenzien für den indirekten Substratnachweis in einer Blutprobe. Diese Reagenzien enthalten ein an ein Substratanalogon gekoppeltes EbM, wobei die Ankopplung die Bindeeigenschaften des EbM nicht verändert und das EbM endogene Erytrozyten binden kann, diese jedoch nicht in Abwesenheit des Substrates bindet.
Dieses Agglutinationsreagenz kann für einen indirekten Agglutinationsnachweis zur Bestimmung des Vorhandenseins und der Konzentration des Substrates im Blut verwendet werden. Dazu wird die Probe, wie auch oben beschrieben, mit dem Agglutinationsreagenz und mit dem löslichen Substrat-bindenden Reagenz vermischt. Das Agglutinationsreagenz konkurriert mit dem Probensubstrat um die Substratbindestelle des Substrat-bindenden Reagenzes, wobei bei ausreichender Reaktionszeit das Substrat die Bindung des Substratanalogons mit dem Substrat-bindenden Reagenz und damit die Agglutination verhindert. Das Vorhandensein und die Menge des Substrates kann über die umgekehrte Abhängigkeit des Agglutinationsumfanges bestimmt werden. Die Anmeldung umfaßt den Testsatz mit dem zuvor erwähnten Agglutinationreagenz und zusätzlich eine Referenzlösung mit bekannter Substratkonzentration.
Die Vorteile der Reagenzien, des Testsystems und des Kits sind im folgenden zusammengefaßt.

Vorteile mit körpereigenen rBZs

i) Vereinfachung des Arbeitsablaufes gegenwärtiger Testsysteme
- Es besteht kein Bedarf die Proben zu zentrifugieren. Es wird Gesamtblut, das unter Verwendung eines geeigneten Antikoagulants gezogen wurde, anstelle von Serum oder Plasma verwendet.
- Bei Proben von Patienten mit infektiösen Krankheiten, wie z. B. Aids oder Hepatitis, müssen die Proben nur minimalst gehandhabt werden.
- Das Testsystem ist geeignet für Massenuntersuchungsprogramme, wie sie die Weltgesundheitsorganisation in Ländern der Dritten Welt, deren Kapazitäten beschränkt sind, durchführt.
- Das Testsystem ist sehr widerstandsfähig. Es gibt nur ein einziges Reagenz, das auch in Anwesenheit eines Bakteriostatikums, wie z. B. 0.01% (w/v) Natriumazid stabil ist.
- Das Testsystem kann von praktizierenden Tierärzten im Feldtest an Ort und Stelle verwendet werden, wenn die geeigneten tierischen roten Blutzellen (rBZ) für die Immunisierung bei der Produktion artspezifischer MAb benutzt worden sind.
- Der Test liefert sehr schnell ein Ergebnis; die Agglutination erfolgt in weniger als drei Minuten.
- Die Methode kann zum Überwachen von therapeutischen Arzneimitteldosen bzw. zur Kontrolle des Patientenverhaltens bei Arzneimitteleinnahme herangezogen werden.
Die Methode kann auch als Selbsttestsystem von Patienten benutzt werden.
- Die einzige benötigte Ausrüstung ist ein Mixstab, ein Glas- oder Plastikobjektträger, ein Schnäpper und möglicherweise eine Mikrokapillare.
ii) Vorteile gegenüber körperfremden Erythrozyten
- Die Erythrozyten müssen nicht vorbehandelt werden. Das US-PS 4433059 verwendet Blutzellen Gruppe 0 negativ, die abzentrifugiert werden, für 15-30 min mit Antikörperkonjugaten reagiert haben und 3· in PBS gewaschen wurden. Das US-PS 4668647 verwendet rote Blutkörperchen von Schafen, die in PBS gewaschen und wiederaufgenommen wurden. Nach der Reaktion, die auf einem festen Untergrund abläuft, werden die Zellen fixiert.
Die Proben müssen nicht vorbehandelt werden. Das US-PS 4433059 gibt an, daß die Proben hitzeinaktiviert werden müssen, um Wechselwirkungen mit anderen Inhaltsstoffen zu vermeiden. Außerdem muß Kaninchenserum und Rinderalbumin zugegeben werden, um unspezifische Reaktionen herabzusetzen. Nichts von alledem ist für das vorliegende Testsystem, in dem unverdünntes Gesamtblut von Patienten direkt mit dem Reagenz reagiert nötig. Dieses Reagenz enthält artverwandte monoklonale Antikörper, um jede eventuell auftretende Anti-Maus-reaktion zu verhindern.
Dadurch ist es möglich auf das lästige Trennen von Zellen und Serum und auf Aktivierung und Anheftung der körperfremden Erythrozyten, die als Indikator im Agglutinationstest verwendet werden, zu verzichten. Die körpereigenen Erythrozyten werden durch das Reagenz sensibilisiert.
Ein weiterer neuer Gesichtspunkt dieses Agglutinationsreagenzes und des Testsystems ist die Auswahl eines Erythrozyten-bindenden-Moleküls (EbM), das so beschaffen ist, daß es ausschließlich in Anwesenheit des zu testenden Substrates mit den körpereigenen Erythrozyten Agglutination verursacht. Ein solches EbM wird im weiteren als "nicht selbst agglutinierend" bezeichnet.
Das EbM ist vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper und speziell beim für den Menschen gedachten System ein Anti-Glycophorin Antikörper. Es wird angenommen, daß dieser Antikörper aus sterischen Gründen nicht selbst agglutiniert. Entweder können die Anbindesstellen eines intakten Antikörpers nur benachbarte Epitope ein und desselben Erythrozyten binden, oder es kann gleichzeitig nur eine der beiden Bindestellen Glycophorin binden.
Das vorliegende Testsystem kann kleine Antigene ohne sich wiederholende Determinanten nachweisen, indem zwei Konjugate verwendet werden. Das eine trägt ein Substrat-spezifisches-Molekül, das andere trägt ein Molekül mit einer spezifischen Bindestelle für ein neues Epitop, das durch die Bindung des Substrates mit dem 1. Konjugat entstanden ist, so daß Wechselwirkungen in Anwesenheit des zu messenden Antigens möglich sind.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung von Erythrozyten bei positiven und negativen Agglutinationsergebnissen mit Antikörperkomplexen in An- und Abwesenheit des entsprechenden Antigens.
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung von Erythrozyten bei positiven und negativen Agglutinationsergebnissen mit einem Antikörperkomplex und einem an- oder abwesenden Antigen bzw. Anti-Antigen-Antiköper.
Fig. 3 ist eine schematische Darstellung
(a) einer Erythrozyten-Agglutination
(b) einer Erythrozyten-Agglutination durch die Anwesenheit eines Substrates oder Antigens.
Fig. 4 ist die schematische Darstellung des Agglutinations- bzw. Nichtagglutinationsmechanismusses in Verbindung mit einem übergreifenden Antigentest.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Das Agglutinationstestsystem gemäß der Erfindung besteht aus einem Reagenz, welches einen Erythrozyten-bindenden Abschnitt aus EbM neben einem Substrat-bindenden Abschnitt aus SbM oder neben einem Substratanalogon hat, ohne dadurch die Bindeeigenschaften der bindenden Abschnitte zu verändern. Das Reagenz agglutiniert nicht mit körpereigenen Antikörpern, wenn das Substrat nicht ebenfalls vorliegt.

Erythrozyten-bindende-Moleküle

Die Membranen von Erythrozyten beinhalten verschiedene antigenische Oberflächenbestandteile, einschließlich Proteine, Glycoproteine, Glycolipide und Lipoproteine. Antikörper, die diese Bestandteile erkennen, können mit konventionellen Techniken hergestellt werden, indem Membranen oder gereinigte Bestandteile derselben als Immunogen verwendet werden. Diese Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein. Desweiteren kann entweder der gesamte Antikörper oder spezifische Bindefragmente desselben als EbM verwendet werden, wobei der Antikörper oder die Antikörperfragmente ein-, zwei- oder mehrwertig sein können.
Zusätzlich werden Glycoproteine, Glycolipide und andere Kohlenhydratstrukturen der Erythrozytenoberfläche von chemischen Verbindungen, wie z. B. Lektinen, die eine hohe Affinität zu Kohlenhydraten haben, erkannt. Diese Lektine können ebenso als EbM verwendet werden.
Auch andere Moleküle mit spezifischer Affinität zur Erythrozytenoberfläche können verwendet werden. Hierzu gehören z. B. Moleküle, die eine Affinität zur Lipiddoppelmembran haben, wie z. B. Protamine oder der membranbindende Anteil des Bienengiftes, Melittin, und andere sehr einfache Peptide.
Das bevorzugte EbM der vorliegenden Erfindung erkennt Erythrozytenmembranbestandteile, die auf allen oder fast allen Erythrozyten gefunden werden, so daß die in Blutproben enthaltenen Erythrozyten als Agglutinationsbestandteil Verwendung finden können. Zu diesen Bestandteilen gehören auch die sog. "ubiquitären Antigene".
Erythrozytenmembranen sind Lipiddoppelschichten mit einer Vielzahl von Proteinen, die entweder an der Oberfläche oder über einen hydrophoben Anteil in der Membran verankert sind, so daß unter Umständen Teile des Moleküls im Zellinneren liegen.
Glycophorin A ist ein Bespiel für ein Molekül das die Zellwand durchspannt. Die Blutgruppen sind durch Kohlenhydrate oder Glycolipidanteile, die an Membranproteine gebunden sind, festgelegt. Aus diesem Grund ist es wichtig, daß ein EbM den Proteinanteil des Membranglycoproteinbestandteiles, der allen Erythrozyten gemeinsam ist, oder eine andere gemeinsame Struktur erkennt. Die Fähigkeit eines zweiwertigen EbM mit roten Blutzellen (rBZ) zu agglutinieren hängt von sterischen Faktoren ab, wie z. B. der Molekülbeweglichkeit und der Lage der Bindestellen über der Lipiddoppelschicht.
Proteine der Erythrozytenmembran schließen ein:
- Glycophorin A (MN, Ena, Wrb), Glycophorin B (Ss, "N", U) und kleinere Bestandteile, integrales Membranprotein 1 (Resus), membrangebundenes Glycoprotein C4 (Chido & Rodgers), membrandurchspannende Glycoproteine (Jonenkanäle), Glycolipide (Lewis), Glycosphingolipide (ABH, li, P, Tk), Ankyrine, Spektrine, Protein 4-1, F-Aktin. (Die entsprechenden Blutgruppenfaktoren sind in den Klammern wiedergegeben).
Die nachfolgenden Veröffentlichungen finden ebenso Beachtung:
1. The red cell membran. S.B. Shohet & Erythrozyten Beutler, aus Hematology, 3. Auflage Williams, Beutler, Erslev & Lichtman, 1983. (Review aller Erythrozytenmembranantigene)
2. A.T. Marchesi, The red cell membran skeleton. Blood, 61, 1-11, 1983. (Review über Stützproteine)
Ein besonders zu bevorzugendes EbM ist eines, das Glycophorin erkennt. Bei der Extraktion von Erythrozyten Sialoglycopeptiden ist der Hauptanteil (nahezu 75%) Glycophorin. Dieses Molekül besteht aus 131 Aminosäuren mit 16 Oligosaccharidketten. Es bietet damit eine Fülle von Strukturen, die Antikörperbindung ohne Agglutination der rBZ erlauben. Es kann außerdem weitgehend rein von Herstellern, wie Sigma Chemical Company, bezogen werden. (Vergl. "Fractionation of the Major Sialoglycopeptides of Human Red Blood Cell Membran" H. Furthmayr, M. Tomita & V.T. Marchesi. BBRC 65, 1975, 113-122).
Wenn ein EbM mehrwertig ist, wie es bei einem normalen Antikörper der Fall ist, ist es wünschenswert, daß das Molekül einen Bestandteil der Erythrozytenmembran erkennt, der häufig und gut verteilt ist. Die Bindestellen sollten so angeordnet sein, daß durch sterische Behinderungen Wechselwirkungen zwischen den Zellen unterbunden werden, um dadurch Agglutination von unreifen rBZ zu verhindern.
Vorzugsweise, aber nicht zwingend, sollte ein einziges EbM zur Erkennung mehr oder weniger aller Erythrozyten verwendet werden. Es können aber auch verschiedene EbM verwendet werden, die entweder am gleichen oder an verschiedenen Konjugaten anhaften und von denen jedes eine bestimmte Erythrozytengruppe erkennt, vorausgesetzt zusammen erkennen sie mehr oder weniger alle Erythrozyten. Obwohl es zu bevorzugen ist, daß die EbM eine natürliche Oberflächenstruktur des Erythrozyten erkennen, ist es möglich die Erythrozyten mit einem Ligand zu ummanteln, der von den EbM erkannt wird, oder auch die Erythrozyten so zu behandeln, daß ein normalerweise verborgener Ligand exponiert wird.

Substrat

Die Erfindung ist nicht auf den Nachweis von bestimmten Substraten begrenzt. Das Substrat kann eine im normalen Blut vorkommende Substanz sein, wie z. B. Blutproteine oder ein Hormon, eine Fremdsubstanz wie z. B. Drogen (therapeutische Drogen oder Mißbrauchdrogen), ein Organismus, Viren (an ihren Hüllproteinen erkennbar), Bakterien, Protozoen, Pilze oder mehrzellige Parasiten (z. B. Fadenwurm - Dirofilaria immitis).
Das Substrat kann sich wiederholende Epitope haben, die von einem SbM erkannt werden, oder es kann ein einziges Epitop haben, für dessen Erkennung eine Mischung aus SbM nötig ist. Trotzdem können auch Substrate nachgewiesen werden, die gleichzeitig nur an ein SbM binden.

Substrat bindendes Molekül

Das SbM kann jede Substanz sein, die eine deutliche Affinität für das Substrat hat, einschließlich monoklonale oder polyklonale Antikörper, Lektine, Enzyme oder andere bindungsaktive Eiweißstoffe oder Substanzen (oder bindungsaktive Teilstücke solcher). Wenn das Substrat ein Antigen ist, ist das SbM normalerweise ein Antikörper. Wenn das Substrat ein Antikörper ist, ist das SbM normalerweise ein Antigen, das von diesem Antikörper erkannt wird. Wenn das nachzuweisende Substrat keine sich wiederholenden Epitope hat, sind zwei oder mehr SbM mit verschiedenen Erkennungsspezifitäten für das Substrat erforderlich. Das Reagenz ist in einem solchen Fall entweder eine Mischung aus EbM gebunden an SbM1 und EbM gebunden an SbM2, oder ein EbM das beide SbM trägt.
Das SbM muß das Substrat direkt binden. In einem Thyroxintest kann z. B. ein SbM gegen ein Thyroxin-bindendes Protein gerichtet sein, wenn bekannt ist, daß dieses in der Probe vorhanden ist oder getrennt zugeführt wird.

Kopplung von EbM und SbM

Das EbM und das SbM können direkt oder indirekt miteinander verschmelzen, wobei die Bindung kovalent oder nicht kovalent sein kann (oder eine Kombination beider Varianten). In Fällen in denen viele EbM und SbM verwendet werden, können EbM und SbM verbunden sein, indem ein oder mehrere SbM direkt an ein EbM gebunden sind.
Die folgende Tabelle faßt einige der gängigen kovalenten Verbindungstypen zusammen.

Heterobifunktional

1. SPDP (N-Succinimidyl-3,2-(pyridyldithio)Propionat) Neurath et al., 1981, J. Virol., Meth., 3, 155-165.
2. MBS (m-Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimid Ester) Kitagaw et al., 1976, J. Biochem., 17, 223-236.
3. SIAB (n-Succinimidyl-4-lodoacetlyaminobenzonat) Weltman et al., 1983, Bio. Techniques, 1, 148-152.

Wahlweise Bifunktional

P-Isothiocyanatobenzoylchlorid US-PS 4680338

Bifunktional

1. BSOCOES Bis[2-(Succinimidooxycarbonyloxy)ethyl]Sulphon Zarling et al., 1980, J. Immunol., 124, 913-920
2. BS Bis(Sulphosuccinimidyl)Suberat Staros, 1982, Biochemistry, 21, 3950-3955.

Weitere

1. Glutaraldehyd Avrameas, 1969, Immunochem., 6, 43.
2. Periodat Oxidation Nakane and Kawoi, 1974, J. Histochem. Cytochem., 22, 1084-1091.
3. Carbodiimid
Von den oben erwähnten kovalenten Bindungsmethoden, ist die SPDP die bevorzugte Methode.
EbM und SbM können aber auch nichtkovalent verbunden werden, z. B.
a) indem an das eine ein Biotin, an das andere ein Avidin (oder Streptavidin) gekoppelt ist,
b) indem ein Antikörper, der das andere Molekül bindet, an das eine gebunden wird,
c) indem ein Protein A, das dann den Fc-Teil des anderen bindet, an das eine gebunden ist und
d) indem das eine an ein Zucker geheftet ist und das entsprechende Lektin an das andere.
Es versteht sich, daß beim Verschmelzen der EbM und der SbM die Bindeeigenschaften so wenig wie möglich verändert werden sollten. Es kann vorteilhaft sein, ein Abstandsteil zwischen EbM und SbM einzuführen, um so die sterische Behinderung zu reduzieren.
Das EbM/SbM-Konjugat kann ein chimerer Antikörper sein. Eine der Herstellungsmethoden eines solchen Konjugates wird im folgenden beschrieben.
a) Herstellen der F(ab)&sub2;-Fragmente eines ausgewählten Antikörpers durch Pepsinverdau.
b) Reduktion und Behandlung der Fragmente mit Ellmans Reagenz, um Fab'-Fragmente des ausgewählten Antikörpers herzustellen.
c) Thiolyse des ausgewählten spezifischen Antikörpers oder eines Erythrozyten-Antikörpers und
d) Vereinigen des thiolysierten Fab'-Fragments mit dem Fab'-Fragment, das mit Ellmans Reagenz behandelt wurde, um ein chimeres Anti- Erythrozyten-Antikörper-Antigenspezifisches Antikörper-Konjugat herzustellen.
Eine andere Methode ist folgende:
a) Behandlung einer Hybridomzelle, die monoklonale Anti-Erythrozyten- Antikörper produziert und einer Hybridomzelle, die monoklonale antigenspezifische Antikörper produziert, mit einem ausgeprägten strukturspezifischen irreversiblen Biosynthesehemmer.
b) Fusionierung der beiden verschiedenen monoklonalen Antikörper produzierenden Hybridomzellen mit Polyethylenglycol.
c) Klonieren der fusionierten Zellen entweder in flüssiger Agarose oder durch beschränkte Verdünnung.
d) Aussortieren der geklonten, chimeren Anti-Erythrozyten-Antikörper- Antigenspezifischen, Antikörper-sezernierenden Heterohybridomzellen mit einem für diese Antikörper geeigneten Screeningtest.
Vorzugsweise werden die Inhibitoren aus folgenden Stoffen ausgewählt: Emetin, Actionmycin D, Hydroxyurea, Ouabain, Cycloheximide, Edine und Sparsomycin.
Der chimere Antikörper kann aus zwei Halbmolekülen bestehen, eines mit Spezifität für Erythrozyten (das EbM) und das andere mit Spezifität für das Substrat (das SbM). In diesem Fall verbinden Disulfidbrücken der Antikörper das SbM und das EbM, um das Konjugat zu binden. Eine weitere Möglichkeit ist, daß die beiden Halbmoleküle spezifisch für dieselben oder auch verschiedene Oberflächenstrukturen des Substrates sind. In diesem zweiten Fall besteht der chimere Antikörper aus tatsächlich zwei SbM und muß an ein EbM gebunden werden, um so ein Dreifachkonjugat zu bilden. Diese Dreifachkonjugate können auch anders gebildet werden, z. B. durch Anheften eines EbM und zweier SbM an makromolekulare Abstandshalter.
Das einfachste vorstellbare Agglutinationsreagenz ist eines das ein einziges Konjugat aus einem EbM und einem SbM beinhaltet. Dieses Reagenz ist für den Nachweis von Antigenen mit sich wiederholenden Oberflächenstrukturen geeignet.
Man kennt auch antigenische Substrate ohne sich wiederholende Oberflächenstrukturen, die groß genug sind, um gleichzeitig die Bindung von zwei Antikörpermolekülen zu erlauben. Hierzu gehören viele Peptide und Proteinhormone. Um das Agglutinieren zu bewirken, muß das Antigen mit dem Reagenz Wechselwirkungen eingehen, so daß wenigstens einige Moleküle des Substrates eine Brücke zwischen benachbarten Erythrozyten bilden. Um ein solches Antigen als Substrat nachzuweisen, verwendet man vorzugsweise ein Reagenz, das aus zwei oder mehreren unterschiedlichen Konjugaten besteht, z. B. SbM1/EbM und SbM2/EbM, wobei SbM1 und SbM2 an zwei verschiedene, sich nicht überlappende Oberflächenstrukturen des Substrates binden. Man könnte aber auch ein einziges komplexes Konjugat aus SbM1/Sbm2/Ebm verwenden, wobei es aus stereochemischen Gründen unwahrscheinlich ist, daß sich die beiden SbM eines Konjugates an dasselbe Substratmolekül binden.

Erythrozytenagglutinationstest

Es sind sowohl direkte wie indirekte Agglutinationstests veröffentlicht.
Im konventionellen direkten Nachweis eines Antigens werden Antikörper, die mit einer Probe reagieren, an rBZ geheftet. Mehrwertige Antigene wirken als Brücke zwischen ummantelten rBZ, wodurch die Agglutination hervorgerufen wird. Im konventionellen indirekten Nachweis werden rBZ mit Antigenen ummantelt und sowohl mit einem lösbaren Antikörper als auch mit der zu testenden Probe in Kontakt gebracht. Die Antigene aus der Probe hemmen kompetitiv die Bindung zwischen sensibilisierten rBZ und Antikörpern und damit auch die Agglutination. Weiterhin ist es möglich, zusätzlich antikörperaktivierte rBZ zu verwenden; vergleiche Mochida, US-PS 4308026.
Das Reagenz gemäß der Erfindung kann sowohl in einem direkten als auch in einem indirekten Agglutinationstest verwendet werden. Im Gegensatz zu konventionellen Nachweistests ist es nicht nötig, Erythrozyten mit Antikörper oder Antigen zu ummanteln. Das Reagenz kann zu der Blutprobe, die die endogenen Erythrozyten enthält, zugegeben werden, wonach es die Zellen aktiviert und sie dadurch befähigt, das Probenantigen zu binden, (= direkter Nachweis) oder sie befähigt, mit dem in der Probe vorhandenen Substrat um das lösliche SbM zu konkurrieren (= indirekter Nachweis).
Bei einigen kleinen, zirkulierenden Molekülen, z. B. synthetischen oder natürlichen Steroiden (Digoxin, Theophyllin usw.) oder Drogen (Phenobarbital, Cannabinoide, Opiate usw.), kann das nachzuweisende Substrat zu klein sein, um die erforderlichen zwei antigenischen Epitope zur Antikörperbindung zu haben, so daß Wechselwirkungen und eine nachfolgende Agglutination möglich wären.
Deshalb ist zum Nachweis von kleinen Molekülen, wie beim "drugmonitoring", aber auch für jedes andere kleine Antigen ein Agglutinations-Hemmungstest zu bevorzugen. In diesem Fall würde man einen 2-Phasentest erwarten. Unter der 1. Phase verstände man die Zugabe des Reagenz, bestehend aus dem Substrat oder dem Substratanalogon verbunden mit einem nicht agglutinierenden EbM. Die 2. Phase wäre gekennzeichnet durch die Zugabe des ungebundenen SbM. (Die beiden Schritte können umgekehrt werden.) Wenn Substrat in der Blutprobe vorhanden ist, wird die spezifische Bindung zwischen SbM und dem Konjugat aus EbM und Substratanalogon verhindert, was ein Ausbleiben der Agglutination zu Folge hat. Wenn kein Substrat in der Probe vorhanden ist, erfolgt die Agglutination.
Der Begriff "Substratanalogon" ist zutreffend für das Substrat, aber gleichzeitig auch für jede Substanz, die auch dann spezifisch von einem SbM gebunden wird, wenn eine solche Bindung kompetitiv von dem Substrat gehemmt wird. Das Substratanalogon kann auch ein gegen die Antigenbindestelle des substratbindenden Antikörpers gezogener antiidiotypischer Antikörper sein.
Für den Nachweis solch kleiner Moleküle durch direkte Agglutinationstests sollten wenigstens zwei spezifische monoklonale Antikörper verwendet werden. Der eine monoklonale Antikörper, der direkt das kleine freischwimmende Antigen binden kann, wäre an das EbM gekoppelt. Zusammengebracht mit diesem Konjugat und dem Substrat würde der 2. monoklonale Antikörper das nur bei Bindung des 1. Antikörper mit dem Substrat aus der überlappenden Region des 1. monoklonalen Antikörper und dem Substrat entstandene, spezifische Antigen binden. In diesem Fall wirkt der 2. monoklonale Antikörper als Erythrozyten-"Brücke" und verursacht schließlich Wechselwirkungen zwischen rBZ, die dann zur Agglutination führen. Diese Methode ist natürlich nicht auf monoepitopische Strukturen beschränkt.
Für ein einzelnes 2. Antikörpermolekül könnte es aus stereochemischen Gründen schwierig sein, gleichzeitig zwei Konjugate zu binden. Deshalb ist es zu bevorzugen, den 2. Antikörper mit einem EbM zu verbinden. Beim Einwirken einer Vielzahl von Reagenzien auf eine Probe ist es selbstverständlich, daß der Kontakt gleichzeitig oder nacheinander ohne genaue Vorgabe der Reihenfolge oder der Einwirkungsdauer erfolgt.

Beispiel 1

Herstellung des EbM (Anti-glycophorin-Antikörper) Ablauf der Immunisierung und des Screenincis

Zunächst werden Mäuse mit menschlichen rBZ immunisiert, dann werden monoklonale Antikörper durch Fusion von Milzzellen der immunisierten Tiere mit Maus-Myelomzellen produziert. Die Antikörper werden sowohl mit dem "Spin-Agglutinationstest" wie auch einem Enzym-Immuntest (EIA), bei dem Glycophorin an eine Mikrotiterplatte gebunden ist, gescreent. Die Spin-Agglutination wird mit einer Abänderung gemäß Wyatt & Street, Aust. J. Med. Lab. Sci., 4, 48-50 durchgeführt.
Dazu werden 50 ul des Zellkulturüberstandes mit 50 ul einer 1% rBZ- Suspension in einer Mikrotiterplatte vermischt. Für dieses Beispiel werden Antikörper ausgewählt, die Glycophorin binden aber nicht agglutinieren. Die Reaktionsfreudigkeit der monoklonalen Antikörper mit Glycophorin wird in einem EIA bestimmt. Dazu werden Mikrotiterplatten mit 10 mg/ml menschlichem Glycophorin [Sigma Cat.No. G 7389] beschichtet, gewaschen und mit verschiedenen Verdünnungen des monoklonalen Antikörpers inkubiert. Nach erneutem Waschen wird die gebundene Antikörpermenge durch Zugabe eines enzymgebundenen Anti- Maus-Antikörper und anschließender Zugabe des Enzymsubstrates bestimmt. Der Titer wird bestimmt, bezogen auf die größte Verdünnung der monoklonalen Antikörper, die einen Absorptionswert bei A 420 nm von größer 0,1 OD über dem Rauschen ergibt.
Aus den 384 Vertiefungen der Mikrotiterplatte werden 40 primär Klone ausgewählt, die entweder im Spin-Agglutinationstest oder im Glycophorin-EIA oder auch in beidem positiv reagierten. EIA Spin-Agglutinationstest Zahl der Klone negativ positiv
Im Anschluß daran wurden Absorptionsstudien durchgeführt, um zu bestätigen, daß die Antikörper Glycophorindomänen an der rBZ Oberfläche erkennen konnten.
Die Ergebnisse dieser Durchmusterungsteste in Ascitic-Fluid sind im folgenden aufgelistet: Ascitic-Fluid Titer Klone Spin-Agglutination Glycophorin EIA rBZ Absorption positiv schwach
Der Klon RAT 1C3/83 wurde gemäß dem Budapester Abkommen mit der Kennummer G 26.4.IC3/86, ATCC HB9893 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville MD, 20852, USA am 7. September 1988 hinterlegt.

Reinigung des Klons RAT 1C3/86

Durch Reinigung über eine Hydroxyapatit-Chromatographie werden die monoklonalen Antikörper aus den Ascitic-Fluids bis zur Homogenität gereinigt (Stanker et al, 1985, J. Immunol. Methods 76, 157).

Beispiel 2

Herstellung eines HlV-Peptid Ab-Konjugates

Die Verbreitung des "menschlichen Immunschwäche Virus" (HIV-1) weitet sich zu einem globalen Gesundheitsproblem aus. Im Moment gibt es keine anerkannte Therapie und auch keinen Impfstoff. Die Hauptanstrengung, beim Versuch die Virusverbreitung einzuschränken, wird auf die Diagnose von infizierten Individuen gelegt. Zusätzlich hat der Wunsch Blutprodukte vor Verseuchung zu bewahren und Pflegepersonal zu schützen, den Bedarf nach einem einfachen, schnellen, billigen aber spezifischen Test für Anti- HIV-Antikörper vergrößert.
Wir haben mit rBZ von Patienten ein aussagekräftiges Nachweissystem für Anti-HIV-Antikörper entwickelt. Dazu werden nicht agglutinierende monoklonale Antikörper gegen menschliche rBZ selektioniert. Chemisches Koppeln dieser Antikörper mit synthetischen HIV-Peptid-Antigenen erlaubt eine spezifische Agglutination der rBZ eines Patienten bei Anwesenheit der entsprechenden Antikörper zu diesem Antigen. Das synthetische Peptid-Antigen kommt vom gp41 des HIV1 (Baustein 579-609) und wird nach den Gesichtspunkten der Welling Prozedur ausgewählt, FEBS LETT, 188, 215 (1985). Es entspricht der als Hauptepitop identifizierten Region, die schätzungsweise zu 98% von Antikörpern aller Aidspatienten erkannt wird [Wang et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83, 6259 (1986)].
Die synthetischen Peptide werden gemäß dem Merrifield-Verfahren synthetisiert [RS. Hodges und RB. Merrifield, Amal. Biochem., 65, 241 (1975)] unterstützt durch einen vom Hersteller zur Verfügung gestellten Synthesizer "Model 430 Applied Biosystems", der doppelte Anbindezyklen verwendet. Die N-t-butyloxycarbonyl-Aminosäurederivate werden bei Protein Research Foundation (Osaka, Japan) bestellt. Als Seitenkettenschutz werden die von Applied Biosystems mitgelieferten verwendet, mit dem Unterschied, daß anstelle des Arginins ein omega- NO&sub2; Derivat verwendet wird. Die Kettenverlängerung wird mit Ninhydrin überwacht [V.Sarin et al, Anal. Biochem., 117, 147 (1981)]. Die entstandenen Peptide werden durch die Verwendung von entwässertem HF mit 10% Anisole (v/v) gleichzeitig gespalten und so die Schutzwirkung aufgehoben [JM Stewart und JD Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Seite 44 und 66, WH Freeman, San Franzisko (1966)]. Das Rohpeptid wird mit Dietyläther ausgefällt, mit Ethlyacetat gewaschen und mit 60%igem Acetonitril in 0,1% Triflouressigsäure (v/v) extrahiert. Synthetische Peptide werden mittels Umkehrphasenchromatographie gereinigt (Amicon C18 resin, 250A, Porengröße 25·400 mm) und in 1.000 ml einer 0,1%igen Triflouressigsäure mit einem 0-60%igem Acetonitrilgradienten ausgewaschen. Das synthetische Peptid wurde nach einer analytischen Umkehrphase-HPLC und nach einer auf eine Säurehydrolyse folgenden quantitativen Aminosäurebestimmung zu annähernd 95% als rein beurteilt.

1. SPDP-Markierung des erythrozytenbindenden Ab (RAT 1C3/86)

Zu 0,25 ml einer 13,8 mg/ml enthaltenden RAT 1C3/86 Lösung werden 1 2,5 ul SPDP in Dimethylformamid (2 mg/ml) zugegeben und für 1 Stunde bei 2500 zur Reaktion gebracht. Nicht verbrauchtes SPDP wird mittels einer Gelfiltrationschromatographie über eine Sephadex G25-Säule entfernt und nachfolgend wird die Effizienz der SPDP-Makierung (1,4 mols/mol) bestimmt.

2. Reduktion des Peptids 3.2

Das Peptid 3.2 (Sequenz RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGK, das dem Bereich 579-601 des Hauptumhüllungsproteins des HIV1 entspricht) wird in 1 ml einer 100 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8.0 gelöst und mit 10 ul eines 2-Mercaptoethanol für 45 min bei 40ºC inkubiert. Durch Zugabe von 4 Tropfen Triflouressigsäure (TFA) und 1 ml wässeriger 0,1% TFA wird die Reaktion abgestoppt. Diese Mischung wird in eine Sep-pak® 01 8 Kartusche (Waters) gefüllt, die zuvor mit 20 ml eines 60% Acetonitril in 0,1% TFA behandelt und mit 0,1% TFA equilibriert wurde. Das reduzierte Peptid wird 2· auf die Sep-pak® gegeben bevor es mit 20 ml der 0,1% TFA gewaschen und dann mit 2·20 ml des 60% Acetonitril in 0,1% TFA ausgewaschen wird. Vor der nachfolgenden Kopplung wird die Probe mittels einer Vakuumzentrifuge getrocknet.

3. Konjugation

Das Peptid wird in 0,2 ml Puffer [100 mM KCl, 100 mM NaCl, 4 M Guanidin- HCl pH 7.4] gelöst und mit 2,2 mg SPDP eines markierten Antikörpers im selben Puffer jedoch ohne Guanidin-HCl vermischt. Das Gefäß mit dem Gemisch wird bei 25ºC über Nacht inkubiert.
Das Maß des Antikörperaustausches beeinflußt die Löslichkeit des Konjugates; 20 Mol Peptid pro Mol Konjugat sind unlöslich. Eine Variationsbreite von 5-7 Mol des Peptids pro Mol Antikörper ist optimal. Die Fähigkeit des Konjugates rBZ zu binden wird mittels eines Agglutinationstest mit Anti- Maus-Antikörpern aus Hasen und HIV-positivem Blut überwacht.

4. Gelfiltrationschromatographie

Nicht reagiertes Peptid und SPDP-Randprodukte werden durch eine Gelfiltrationschromatographie über eine Superose®6 Säule (Pharmazia) mit Phosphat gepufferter Saline (PBS) entfernt. Die Antikörper enthaltenden Fraktionen werden zusammengenommen und nach Zugabe von 0,01% Natriumazid als Konservierungsmittel bei 4ºC aufbewahrt.

5. Herstellung des Testreagenz

Ein zweifaches Volumen der Konjugate wird mit einem einfachen Volumen einer 10 mg/ml eines nichtverwandten monoklonalen Antikörpers (Bruce 5) vermischt, der, wie bei Bundesen et al, Vet. Immun. Immunopath., 8, 245-260, 1985 beschrieben, präpariert wurde.

Testablauf

Für den Test werden 10 ul einer mit Heparin versetzten Blutprobe auf einen Objektträger (OT) gegeben, dann werden 30 ul der Reagenz zugegeben und vermischt. Der OT wird bis zu 3 min geschüttelt und das Auftreten oder Nichtauftreten einer Agglutination beobachtet.
Neun unabhängige Peptid/Antikörper-Konjugate wurden vorbereitet und ergaben positive Ergebnisse bei der Agglutination von rBZ von serumpositiven Patienten. Aktive Konjugate werden z. B. auch durch die Verwendung von m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester als Verbindungsreagenz vorbereitet.
Die Ergebnisse sind im schlechtesten Fall vergleichbar mit solchen, die in einem EIA bei der Verwendung eines ähnlichen Antigens beobachtet werden. (Tabelle 1)
Um die positiven und negativen Ergebnisse des Erythrozytentests zu bestätigen, werden mit denselben Blutproben ELISAs durchgeführt.
Als Kontrollen wurden ELISA-negative Blutproben und ELlSA-positive Proben von infizierten Patienten mitgeführt. HIV-positive Patienten werden vom Victorian State Reference Laboratory mittels Western-Blot als positiv bestätigt. Patienten des Fairfield Hospitals waren sowohl im Western-Blot wie im EIA (Abbot Laboratories) negativ. Blutspender wurden ebenfalls durch EIA getestet (Genetic Systems). Falsche positive oder negative Werte sind in Klammern angegeben und wurden durch EIA und Western Blot verifiziert. Tabelle 1: Autologischer rBZ Agglutinationstest Agglutinationstest EIA HIV+ve Patienten Fairfield Hospital Patienten Gesunde Blutspender
Um die Spezifität des Tests zu bewerten, wird eine Reihe von Synthetischen Peptiden, die anderen Regionen des HIV-Hüllproteins entsprechen, auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die Agglutinationsreaktion zu verhindern. Verwandte, in Vergleich gesetzte Peptide und das synthetische gp41 Fragment (Baustein 572-591), dem eine essentielle carboxyendständige Region fehlt, konnten die Agglutination nicht verhindern.
Die Hemmung der Agglutination mit freien synthetischen Antigenen war geeignet, um teilweise schwach positive Proben zu bestätigen. Wenn die Zugabe des synthetischen Peptids die Agglutination nicht verhindern konnte, wird angenommen, daß es sich um eine fälschlich als positiv bewertet Probe gemäß der Anti-rBZ-Antikörper handelt.
Synthetisches Peptid (0,1 25 mg/ml) wurde zu dem konjugierten Antikörper gegeben, bevor Blut zugesetzt wurde. Der Agglutinationstest wird, wie oben beschrieben, durchgeführt. Häufig verwendete Sequenzen sind unterstrichen. Tabelle 2 Spezifität der Peptide bei der Agglutinationshemmung Zugegebene synthetische Peptide (Sequenzen) Agglutinationshemmung keine

Beispiel 3

Herstellung von chimeren Antikörpern (Anti-Glvcophorin/Antihuman-D-Dimer) und Verwendung in einem D-Dimertest

Monoklonale Antikörper RAT 1C3/86 ( Anti-Human rBZ) und DD-1C3/108 (Anti-Human D-Dimer beschrieben von Rylatt et al, 1983 in Thrombosis Res., 31, 767-778) werden vollständig mit Pepsin verdaut, wie bei Hackman et al, 1981, Immunology, 15, 429-436 beschrieben und mittels Chromatographie über eine TSK-3000 SW Säule gereinigt. Dazu wurden 2 mg Rat 1C3/86 für 45 min mit 1% w/w Pepsin in einem Puffer aus 0,1 M Essigsäure und 70 mM NaCl pH 3,5 verdaut. Zwischenzeitlich werden 2 mg DD-1C3/108 für 2 Std. im selben Puffer mit 1% w/w Pepsin verdaut. Die Reaktionen werden durch die Zugabe von 1,5 M Tris, um den pH auf 8 anzuheben, abgestoppt. Die F(ab)&sub2;-Fragmente werden durch Gelfiltrationschromatographie über TSK-3000 Sw Säulen gereinigt.
Die Reduktion des F(ab)&sub2; und das anschließende Abblocken des Fab'- Fragments werden gemäß Brennau et al, 1985, Science, 22, 81-83 durchgeführt. Dazu werden ein 3 mg/ml F(ab)&sub2;-Päparnt mit 1 mM Mercaptoethylamin in 10 mM Natriumarsenit für 16 Std. bei 25ºC inkubiert. Die Fab'-Fragmente werden für 3 Std. bei 25ºC mit 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzol-säure) (Ellmans Reagenz) stabilisiert, danach wird das Fab'- Fragment mittels Gelfitrationschromatographie über eine TSK-3000 SW Säule gereinigt.
Zur Wiederherstellung der Thiolform des DD-1C3/108 wird es 30 min bei 25ºC mit 10 mM Mercaptoethylamid zur Reaktion gebracht. Überschüssiges Reagenz wird mittels Gelfiltrationschromatographie über eine TSK-3000 SW Säule abgetrennt. Anschließend wird eine Mischung aus DD-1C3/108 Thiolform und dem mit Ellmans Reagenz behandelten RAT 1C3/86 für 16 Std. bei 25ºC, wie bei Brennan et al beschrieben, inkubiert. Schließlich wird der chimere Antikörper mittels Gelfiltrationschromatographie über eine TSK-3000 SW Säule gereinigt.

Zubereitung des Reagenz

Es wird ein 2faches Volumen des chimeren Antikörpers (0,1 mg/ml) mit dem einfachen Volumen eines nicht verwandten monoklonalen Antikörpers (7,5 mg/ml) vermischt (Bruce 5).

Testablauf

Es werden 10 ul einer mit Heparin versetzten Blutprobe auf einen Glasträger gegeben. 30 ul des Reagenz werden zugefügt, vermischt und für 3 min geschüttelt. Ist D-Dimer in der Probe, dann ist eine Agglutination zu beobachten.

Beispiel 4

Herstellung eines SPDP koniugierten Digoxin/Anti- Glycophorin-Antikörper-Konjugates

Herstellung des Digoxin/Ab Konjugates

1. Herstellung des mit Perjodat oxidierten Digoxin

- 2 ml 100 mM Natriumperjodat werden langsam und tropfenweise zu 40 mg Digoxin (Sigma) gegeben, dann in 2 ml 95% Ethanol suspendiert und für 30 min bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 60 ul M Ethandiol abgestoppt. Das Zwischenprodukt der Schiff'schen Base wird durch Zugabe von 2 ml 40 mM Cystein (30 min 37ºC) stabilisiert und anschließend mit 1 ml 15 mg/ml Natriumborhydrid für 16 Std. bei 25ºC inkubiert.

2. Reduktion des Cystein/Digoxin-Konjugates

- 3 ml Cystein-Digoxin-Konjugat werden durch Zugabe von 40 ul Merkaptoethanol (40 min bei 37ºC) reduziert und das Produkt mittels Chromatographie über eine Sep-Pak® C 18 Kartusche von Waters, wie auch für die Reduktion des Peptides in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt. Nach dem Eindampfen in einer Vakuumzentrifuge wird die Probe mit SPDP-markiertem RAT 1C3/86, das mit Fünf Propyldithiopyri-dingruppen/Antikörper markiert ist, 16 Std. bei 25ºC zur Reaktion gebracht. Schließlich wird das Digoxin-Antikörper- Konjugat mittels Gelfiltrationschromatographie über Superose® 12 gereinigt.

Beispiel 5

Herstellung von HIV-Peptid/Anti-Glycophohn-F(ab)&sub2;- Konjugat

Ein alternativ angewandtes Reagenz zum Nachweis von Anti-HIV-Antikörpern verwendet ein F(ab)&sub2;-Derivat des Anti-Glycophorin Antikörpers.
RAT 1C3/86 (2 mg/ml in 70 mM Acetat, 100 mM NaCl pH 3,5) wird 40 min bei 37ºC mit 10 ul/ml Pepsin (Sigma P 6887) verdaut. Zum Abstoppen der Reaktion wird 1/10 Volumen 1,5 M Tris zugegeben. Nach einer Übernacht- Dialyse mit 5 mM Natriumphosphat-Puffer pH 8,0 wird das Antikörperfragment durch Ionenaustausch-Chromatographie an DEAE Zellulose in 5-300 mM Na&sub2; PO&sub4;-Puffergradienten pH 8,0 gereinigt.
Eine Markierung des F(ab)&sub2;-Fragments mit SPDP-Reduktion des Peptides 3.2, eine Konjugation des Peptides 3.2 mit dem F(ab)&sub2; RAT 1C3/86, eine Reinigung des Peptid-Konjugates, die Herstellung des Testreagenz und die Testdurchführung werden in der schon für die ganzen Antikörper-Konjugate beschriebenen Weise ausgeführt.
F(ab)&sub2;-Konjugate anderer Erythrozyten- oder Substrat-bindender Antikörper können ähnlich hergestellt werden und können auch an andere Moleküle als HIV-Peptide gekoppelt werden.

Beispiel 6

Herstellung eines HIV-Peptid/Anti-Glycophorin-Fab'- Konjugates

Ein weiteres alternativ einsetzbares Reagenz verwendet das einwertige Fab'-Fragment als EbM.
F(ab)&sub2; RAT 1C3/86 in Phosphat gepufferter Saline (PBS) wird mit 10 mM Mercaptoethanol für 1 Std. bei Raumtemperatur inkubiert; anschließend wird 15 mM Jodacetamid zugegeben und weitere 15 min im Dunklen inkubiert. Zum Abstoppen der Reaktion wird eine Dialyse in 100fachem Volumen PBS durchgeführt.
Die SPDP-Markierung des s-Carboxymethylierten Fab', die Reduktion des Peptides 3.2, die Konjugation des Peptides 3.2 an das Fab'-TNB-(Thionitrobenzoyl) RAT-Fragment der RAT 1C3/86, die Reinigung des Peptidkonjugates, die Herstellung des Testreagenz und die Testdurchführung werden in derselben, wie schon für die ganzen Antikörper-Konjugate beschriebenen Weise, ausgeführt.

Beispiel 7

Präparieren von Mellitin als alternatives EbM

Als Alternative zum EbM-Antikörper wird ein Peptid des Bienengiftes Mellitin (CVLTTGLPALISWIKRKRQQ) verwendet. Dieses Peptid bindet an die Erythrozytenoberfläche, ohne dabei die Zellulose aufzulösen (WF deGrado, FJ Kezdy, ET Kaiser, J.Am.Chem. Soc., 103, 679-681, 1981). Das Peptid wird über die Merrifield-Prozedur (Hodges, Merrifield, Anal.Biochem., 1975, 65, 241) synthetisiert.
Ein Vorteil bei der Verwendung von Mellitin als EbM ist, daß es zusammen mit dem Peptidanteil des SbM als eine Einheit synthetisiert werden kann.

Beispiel 8

Verwendung der Avidin/Biotin-Bindung um EbM und SbM zu koppeln

Die SbM und EbM müssen nicht kovalent gebunden sein. Eine Variante ist die Avidin-Biotin-Bindung.

Herstellung des Biotin-markierten Mellitin

Das Mellitin Peptid (10 mg) wird mit Merkaptoethanol, wie in Beispiel 1 für das Peptid 3.2 beschrieben, reduziert. Nach Eindampfen in einer Vakuumzentrifuge wird die Probe in 2 ml 0,1 M Tris HCl, 5 mM EDTA pH 8,0 wiederaufgenommen und mit 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), das 4,3 mg Niodacetyl-N-biotinylhexylenediamin (Pierce) enthält zur Reaktion gebracht. Nach 15 min bei Raumtemperatur wird das biotinylierte Derivat von Randprodukten über eine Sephadex®G10 Säule getrennt.

Herstellung des Avidin markierten Peptides 3.2

Das Peptid 3.2 wird an Avidin auf dieselbe Weise gekoppelt wie an den Antikörper im Beispiel.

Test

Mengen eines Avidin-markierten Peptids, die noch zu gering zum Agglutinieren sind, werden zu den rBZ zugegeben.

Bemerkung

Selbstverständlich können avidinylierte und biotinylierte Moleküle ausgetauscht werden.

Claims

1. Agglutinationsreagenz zum direkten Nachweis eines Substrats in einer Blutprobe umfaßend: ein EbM, das an ein SbM gebunden ist, wobei das EbM an das SbM so gebunden ist, daß die Bindeeigenschaften der bindenden Moleküle durch die Verbindung nicht verändert werden, und das EbM in der Lage ist, endogene Erythrozyten der Blutprobe zu binden, jedoch nicht zu agglutinieren, wenn kein Substrat vorhanden ist.

2. Reagenz nach Anspruch 1, bei welchem das EbM aus folgender Gruppe ausgewählt ist: ein nicht-einwertiger Anti-Erythrozyten-Antikörper; ein nicht-einwertiges Fragment eines nicht-einwertigen Anti-Erythrozyten- Antikörpers; ein Fragment eines nicht-einwertigen Anti-Erythrozyten-Antikörpers; ein F(ab)&sub2;-Fragment eines Anti-Erythrozyten-Antikörpers; ein Fab'-Fragment eines Anti-Erythrozyten-Antikörpers; ein Peptid, das eine Affinität zur Erythrozytenmembran hat, diese aber nicht lysieren kann; ein Peptid, das eine Affinität zur Erythrozytenmembran hat, diese aber nicht lysieren kann und nicht von einem Antikörper oder Lektin abstammt; ein nicht lysierendes Erythrozyten bindendes Fragment eines Protamin, das nicht allein Erythrozyten agglutiniert; Mellitin; ein spezifisch bindendes Mellitinfragment; ein Lektin; ein spezifisch bindendes Lektinfragment; ein Anti-Glycophorin-Antikörper; ein spezifisch bindendes Fragment eines Anti-Glycophorin-Antikörpers; ein Anti-Glycophorin-A-Antikörper und ein spezifisch bindendes Fragment eines Anti-Glycophorin-A-Antikörpers.

3. Reagenz nach Anspruch 1, bei welchem das EbM aus einem Anti- Erythrozyten-Antikörper oder einem F(ab)&sub2;- oder Fab'-Fragment eines solchen besteht und dieser Antikörper, sein F(ab)&sub2;- oder das Fab'-Fragment speziell gegen Glycophorin A, Glycophorin B, integrales Membranprotein 1, membranständiges Glycoprotein C4, membrandurchspannendes Glycoprotein, Ankyrin, Spektrin, Glycophorin, Glycolipid, Glycosphingolipid, Protein 4-1 oder F-Aktin gezogen wird.

4. Reagenz nach Anspruch 1, bei welchem das EbM einen nicht-einwertigen Anti-Erythrozyten-Antikörper oder die entsprechenden F(ab)&sub2;- oder Fab'-Fragmente umfaßt, die von der unter Deposit No. HB9893 bei der ATCC geführten Zellinie G 26.4.IC3/86 gebildet sind.

5. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welchem das EbM aus einem einwertigen, von einem Anti-Erythrozyten-Antikörper abstammenden Fragment besteht, und das SbM aus einem einwertigen, von einem Anti-Substrat-Antikörper abstammenden Fragment besteht.

6. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welchem das Reagenz einen Antikörper gegen HIV enthält.

7. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welchem das SbM aus einem HIV1 Peptid, einem Hepatitisvirus Peptid, einem Digoxin, einem F(ab)&sub2;- Antikörper oder Fab'-Fragment besteht, welches gegen menschliche D-Dimere, Hepatitisviren oder einen Anti-idiotypischen Antikörper gezogen ist.

8. Reagenz nach Anspruch 7, bei welchem das HIV1 Peptid das gp41 Peptid beinhaltet.

9. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei welchem das EbM an das SbM über kovalente Bindungen geheftet ist.

10. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei welchem das Reagenz eine Vielzahl von verschiedenen Konjugattypen enthält, wobei das SbM jedes Konjugattypus an ein anderes Substratepitop bindet.

11. Reagenz nach Anspruch 1, bei welchem das EbM ein Peptid umfaßt, das eine Affinität zur Erythrozytenmembran hat, aber unfähig ist, Erythrozyten zu lysieren und gleichzeitig nicht von einem Antikörper oder Lektin abstammt.

12. Reagenz nach Anspruch 11, bei welchem das Peptid ein bienengiftähnliches Peptid ist.

13. Reagenz nach Anspruch 11, bei welchem das EbM aber nicht das SbM an ein Oberflächenprotein oder Glycoprotein bindet.

14. Reagenz nach Anspruch 1, bei welchem das EbM ein Peptid beinhaltet, das eine Affinität zur Erythrozytenmembrnn hat, und das SbM ein Peptid oder Protein ist, wobei das EbM und das SbM über eine einfache Peptidbindung verbunden sind.

15. Reagenz nach Anspruch 14, bei welchem das EbM einem nicht lytische Erythrozyten bindenden Fragment des Mellitin entspricht, das nicht selbst Erythrozyten agglutiniert.

16. Reagenz nach Anspruch 1, welches ein heterobifunktionaler Antikörper oder ein heterobifunktional bindendes Fragment eines Antikörpers umfaßt, wobei besagter Antikörper ein EbM, das Erythrozyten aber kein Substrat bindet, und ein Molekül, das Substrat aber keine Erythrozyten bindet, enthält, wobei das EbM über eine oder mehrere Disulfidbrücken an das SbM gekoppelt und nicht über ein heterobifunktionales Bindungsreagenz gebunden ist, und das besagte Reagenz durch Bindung eines heterobifunktionalen Hybrids aus einem homobifunktionalen Erythrozyten-bindenden Antikörper und einem homobifunktionalen Substrat-bindenden Antikörper hergestellt ist, wobei besagter homobifunktionaler Erythrozyten-bindender Antikörper nicht selbständig mit Erythrozyten agglutiniert.

17. Reagenz nach Anspruch 16, bei welchem das EbM Glycophorin bindet.

18. Reagenz nach Anspruch 17, bei welchem das EbM Glycophorin Antikörper oder ein spezifisch bindendes Fragment eines solchen umfaßt.

19. Reagenz nach Anspruch 16, bei welchem das SbM menschliche D-Dimere bindet.

20. Reagenz nach Anspruch 16, welches heterobifunktionale F(ab)&sub2; umfaßt.

21. Reagenz nach Anspruch 1, in welchem das SbM ein Antigen bindet, das vom Fadenwurm Dirofilaria immitis abgeleitet ist.

22. Reagenz nach Anspruch 1, bei welchem das Reagenz weiterhin einen zweiten Antikörper oder ein spezifisch bindendes Fragment desselben spezifisch erkennt, der ein überlappendes Epitop durch die Bindung von besagten SbM und besagtem Substrat bildet.

23. Reagenz nach Anspruch 22, bei welchem der sekundäre Antikörper an ein EbM gebunden ist.

24. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 23, bei welchem die Erythrozyten menschliche Erythrozyten sind.

25. Agglutinationsreagenz für indirekten Nachweis eines Substrats in einer Blutprobe, welches EbM verbunden mit SbM umfaßt, wobei besagtes EbM an besagtes SbM auf eine Art und Weise gebunden ist, daß Bindeeigenschaften des EbM durch die Bindung nicht verändert werden, und wobei besagtes EbM in der Lage ist endogene Erythrozyten der Probe zu binden aber endogene Erythrozyten in Abwesenheit von einem Substrat-bindenden Reagenz nicht agglutiniert.

26. Reagenz nach Anspruch 25, wobei das EbM aus folgender Gruppe ausgewählt ist: ein nicht-einwertiger Anti-Erythrozyten-Antikörper; ein nichteinwertiges Fragment eines nicht-einwertigen Anti-Erythrozyten-Antikörpers; ein Fragment eines nicht einwertiger Anti-Erythrozyten-Antikörpers; ein F(ab)&sub2;-Fragment eines Anti-Erythrozyten-Antikörpers; ein Fab'- Fragment eines Anti-Erythrozyten-Antikörpers; ein Peptid, das eine hohe Affinität zur Erythrozytenmembran hat, Erythrozyten aber nicht lysieren kann; ein Peptid, das eine hohe Affinität zur Erythrozytenmembran hat, diese aber nicht lysieren kann; ein Peptid, das eine hohe Affinität zur Erythrozytenmembran hat, diese aber nicht lysieren kann und nicht von einem Antikörper oder einem Lektin abstammt; ein nicht-lysierendes Erythrozytenbindendes Fragment eines Protamin, das allein Erythrozyten nicht agglutiniert; Mellitin; ein spezifisch bindendes Mellitinfragment; ein Lektin; ein spezifisch bindendes Lektinfragment; ein Anti-Glycophorin-Antikörper und ein spezifisch bindendes Fragment eines Anti-Glycophorin-Antikörpers; ein Anti-Glycophorin-A-Antikörper und ein spezifisch bindendes Fragment eines Anti-Glycophorin-A-Antikörpers.

27. Reagenz nach Anspruch 26, bei welchem das EbM aus einem Anti- Erythrozyten-Antikörper oder einem F(ab)&sub2;- oder Fab'-Fragments eines solchen besteht und das F(ab)&sub2;- oder Fab'-Fragment dieses Antikörpers speziell gegen Glycophorin A, Glycophorin B, integrales Membranprotein 1, membranständiges Glycoprotein C4, membrandurchspannendes Glycoprotein, Ankyrin, Spektrin, Glycophorin, Glycolipid, Glycosphingolipid, Protein 4-1 oder F-Aktin gezogen ist.

28. Reagenz nach Anspruch 25, bei welchem das EbM einen nicht einwertigen Anti-Erythrozyten-Antikörper oder das entsprechende F(ab)&sub2;- oder Fab'-Fragment umfaßt, der von der unter Deposit No. HB9893 bei der ATCC geführten Zellinie G 26.4.IC3/86 gebildet wird.

29. Reagenz nach den Ansprüchen 25 bis 28, bei welchem das Substrat einen HIV Antikörper beinhaltet.

30. Reagenz nach Anspruch 26, bei welchem das EbM ein Peptid umfaßt, das eine Affinität zu Erythrozytenmembranen hat, aber nicht in der Lage ist, Erythrozyten zu lysieren, und nicht von einem Antikörper oder Lektin abstammt.

31. Reagenz nach Anspruch 30, welches ein bienengiftähnliches Peptid umfaßt.

32. Reagenz nach den Ansprüchen 25 bis 31, bei welchem das EbM kovalent an ein Substratanalogon gebunden ist.

33. Reagenz nach Anspruch 26, bei welchem das EbM ein Peptid beinhaltet, das eine Affinität zur Erythrozytenmembran hat, und das SbM ein Peptid oder Protein ist, wobei das EbM und das SbM über eine einfache Peptidbindung verbunden sind.

34. Reagenz nach Anspruch 30 oder 33, bei welchem das EbM einem nicht lytischen Erythrozyten-bindenden Fragment des Mellitin entspricht, das nicht selbst agglutiniert.

35. Reagenz nach den Ansprüchen 25 bis 34, bei welchem es sich bei besagten Erythrozyten um menschliche Erythrozyten handelt.

36. Ein direkter Agglutinationstest für die Anwesenheit eines Substrates in Blutproben mit Erythrozyten, welcher Test das Vermischen der Probe mit einem Agglutinationsreagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24 für eine Zeitspanne umfaßt, die ausreichend ist, damit zwischen Substrat und Erythrozyten eine Bindung einsetzen kann und so Agglutination verursacht wird; ferner der Test die Beobachtung, ob Erythrozyten agglutiniert sind, sowie das Korrelieren der Agglutination mit der in der Probe vorhandenen Substratmenge umfaßt.

37. Ein indirekter Agglutinationstest für die Anwesenheit eines Substrates in Blutproben, welcher Test das Inkubieren der Probe mit einem Agglutinationsreagenz gemäß der Ansprüche 25 bis 35 und einem Substrat-bindenden Reagenz umfaßt, wobei besagtes Agglutinationsreagenz mit dem Substrat aus der Probe um die Substratbindestellen des besagten substratbindenden Reagenz konkurriert; weiterhin umfaßt der Test eine ausreichend lange Inkubationszeit, damit das Substrat die Bindung des Substratanalogons an das Substrat-bindende Reagenz verhindern kann und damit die Agglutination verhindert; und ferner umfaßt der Test das Beobachten, ob eine Agglutination auftritt, sowie das Bestimmen der Anwesenheit und der Menge des besagten Substrates aus dem umgekehrten Agglutinationsgrad.

38. Test nach Anspruch 36 oder 37, bei dem die Probe und das Konjugat ausschließlich mit endogenen Erythrozyten der Probe in Kontakt kommen.

39. Agglutinationstestkit, welcher ein Agglutinationsreagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 35 und eine Referenzlösung umfaßt, die eine definierte Menge an Substrat enthält.