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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von immuno-
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logisch verändertem Immunglobulin, insbesondere von sogenannten Immunkomplexen.
Das sind Komplexe, die durch Reaktion eines Antigens mit einem Antikörper entstehen.
Sie betrifft in erster Linie ein Verfahren zur Bestimmung der Immunkomplexe in Körperflüssigkeiten.
Da sich Antikörperaggregate und Antikörperspaltprodukte infolge der Veränderung
des Immunglobulins ähnlich wie Immunkomplexe verhalten, kann das Verfahren auf deren
Bestimmung ausgedehnt werden.
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Es ist bekannt, daß die Bestimmung von Antikörpern, Antikörper-Antigen-Komplexen
und Antigenen in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere Körperflüssigkeiten wie
Harn oder Serum wichtige Hinweise für die Diagnose und für die Therapie von verschiedenen
Erkrankungen, insbesondere von Infektionserkrankungen, Tumorerkrankungen oder immunologischen
Entgleisungen liefert. Es besteht deshalb ein Bedarf an einem genauen und einfach
durchzuführenden Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Immunkomplexen, Antikörperaggregaten
und Antikörperspaltprodukten.
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Verfahren zum Nachweis von Antikörper-Antigenkomplexen oder von Antikörperaggregaten
sind bereits bekannt. Den Verfahren liegt die Erkenntnis zugrunde, daß sowohl der
Rheuma-Faktor (RF) als auch die Clq-Komponente des Komplementsystems (sog. Fc-Reaktanten)
die Eigenschaft haben, sich an Fc-Teile von Immunglobulinen, die mit einem Antigen
oder die miteinander verbunden sind, anzulagern. Es wurden deshalb entweder Clq
oder RF mit einem Markierungsmittel versehen oder die Präzipitation von Antigen-Antikörperkomplexen
mit einem der fraglichen Testproteine oder die Agglutination von Immunglobulin-beschichteten
Latexpartikeln oder von Immunglobulin-beschichteten Erythrozyten durch RF oder Clq
und deren Inhibition durch Antigen-Antikörperkomplexe für die Bestimmung eingesetzt.
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Es wurde nun überraschend gefunden, daß Fc-Reaktanten sich nicht nur
an Antigen- oder trägergebundenes Immunglobulin binden, sondern auch an Spaltprodukte
von Immunglobulinen. Weiterhin wurde gefunden, daß mit Hilfe von trägergebundenen
Spaltprodukten von
Immunglobulinen eine hoch empfindliche Methode
zur Bestimmung von Antigen-Antikörper-Immunkomplexen, Antikörper-Aggregaten und
Antikörperspaltprodukten aufgebaut werden kann. Es hat sich schließlich gezeigt,
daß für die Analyse von Antigen-Antikörper-Immunkomplexen, Antikörperaggregaten
und Antikörperspaltprodukten anstelle des bisher hierfür in der Regel verwendeten
RF auch Antikörper gegen immunologisch verändertes Immunglobulin benutzt werden
können. Die Spezifität der Antikörper muß gerichtet sein gegen das Immunglobulin,
das durch Bindung an einen Träger, an ein Antigen oder durch Reaktion mit sich selber
eine immunologische Veränderung aufweist. Sie kann auch gerichtet sein gegen Spaltprodukte
des Immunglobulins, die den Fc-Teil des Immunglobulins enthalten oder die Fragmente
des Fc-Teils darstellen.
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Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Bestimmung
von immunologisch verändertem Immunglobulin, vor allem von Antigen-Antikörperkomplexen,
Antikörperaggregaten oder Antikörperspaltprodukten in Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet,
daß man zu einer Flüssigkeit, die den zu bestimmenden Stoff enthält, einen Fc-Reaktanten
im Uberschuß hinzufügt, das Reaktionsgemisch in Kontakt bringt mit einem Träger,
an welchen ein Spaltprodukt des Immunglobulins mit immunologisch intaktem Fc-Teil
adhäsiv oder chemisch gebunden ist, danach den Träger abtrennt und schließlich den
freien oder gebundenen Fc-Reaktanten bestimmt.
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Wird der Fc-Reaktant selbst markiert, kann über die Bestimmung des
Markierungsmittels zunächst der Schluß auf die Menge des Fc-Reaktanten und daraus
auf das immunologisch veränderte Immunglobulin gezogen werden. Obwohl dieses Verfahren
sehr einfach durchzuführen ist, erfordert es die Reindarstellung der Fc-Reaktanten
mit den damit verbundenen Schwierigkeiten.
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Bevorzugt wird das Verfahren durch die indirekte Bestimmung des Fc-Reaktanten
durchgeführt. Dazu gibt man den Fc-Reaktanten im Uberschuß zu der Flüssigkeit, die
das zu bestimmende, immunologisch veränderte Immunglobulin enthält. Das Reaktionsgemisch
wird in Kontakt gebracht mit einem Träger, an welchem ein Spaltprodukt des Immunglobulins
adhäsiv oder chemisch gebunden ist. Danach wird der Träger abgetrennt, mehrfach
gewaschen und schließlich mit einem ein
Harkierungsmittel tragenden
AntikörPer, welcher gegen antigene Determinanten des Fc-Reaktanten gerichtet ist,
in Kontakt gebracht und nach abermaligem Waschen das trägergebundene oder freie
Markierungsmittel bestimmt.
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Das auf diese Weise durchgeführte Bestimmungsverfahren zeichnet sich
darüber hinaus durch eine besonders hohe Empfindlichkeit des Nachweises aus.
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Fc-Reaktanten im Sinne der Erfindung sind solche Verbindungen, welche
den sogenannten Fc-Teil eines immunologisch veränderten Immunglobulinmoleküls zu
binden vermögen. Bevorzugt sind es der Rheuma-Faktor (RF), der Komplementfaktor
(Clq) und Antikörper gegen immunologisch im Fc-Teil verändertes Immunglobulin.
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Das Spaltprodukt des Immunglobulins, welches an den Träger gebunden
ist, muß den Fc-Teil oder noch immunologisch aktive Fragmente des Fc-Teils enthalten.
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Der das Markierungsmerkmal tragende Antikörper wird so ausgewählt,
daß er immunologisch nicht kreuzreaqieren darf mit dem auf dem Träger befindlichen
Spaltprodukt des Immunglobulins.
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Die nachfolgende Messung des Markierungsmerkmals erlaubt über eine
Mengenbestimmung des an den Träger gebundenen bzw. des in der zu analysierenden
Flüssigkeit verbrauchten Fc-Reaktanten eine Rückbeziehung auf die vorliegende Menge
von Antigen-Antikörperkomplexen, Antikörperaqgregaten und Antikörperspaltprodukten.
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Antikörper gegen immunologisch im Fc-Teil verändertes Immunglobulin
werden durch Immunisicrung von Tieren mit einem immunologisch veränderten Immunglobulin
oder dem isolierten Fc-Teil gewonnen.
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Die immunologische Veränderung im Fc-Teil kann beispielsweise bewirkt
werden durch Bindung des Immunglobulins an einen Träger, an ein Antigen oder durch
Reaktion mit sich selbst, (I.h. durch Aggregatbildung Im Sinne der Erfindung geeignete
Trj:Jer, an welche Spaltprodukte des Immunglobuline gebunden zind und die mit Fc-Reaktanten
in Form
einer Agglutination reagieren können, sind insbesondere
anorganische und organische Formkörper. Die anorganischen Formkörper bestehen z.B.
aus Glas, die organischen Formkörper z.B. aus Ilomo- oder Copolymeren von Vinylverbindungen,
wie Olefinen, Vinylacetat, Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Tetrafluoräthylen, Styrol,
Acrylsäure oder Methacrylsäure, ferner aus Polymeren von Formaldehyd und cyclischen
Acetalen sowie aus Polykondensaten, wie Polyestern, Polycarbonaten oder Polyamiden.
Auch vernetzte Kohlenhydrate und vernetzte Proteine sind geeignet. Die Formkörper
sind vorzugsweise Kugeln oder ElliDsoide. Es kommen ferner planparallele und auch
anders qestaltete Formkörper, vorzugsweise optisch klare Körper wie Objektträger,
nicht zuletzt Reagenzgläser in Frage.
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Die organischen Formkörper können auch bioloqischen Ursprungs sein.
Als solche werden die roten Blutkörperchen des Menschen oder von Tieren bevorzugt.
Auch amorphe Materialien sind als Träger einsetzbar.
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Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein Mittel zur Bestimmung
von immunoloqisch verändertem Immunglobulin, welches den Fc-Teil des Immunglobulins,
gebunden an einen optisch klaren Formkörper, enthält.
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Spaltprodukte des Immunglobulins im Sinne der Erfindung, die den Fc-Teil
des Immunglobulin oder dessen Fragmente enthalten, sind beispielsweise die nach
dem bekannten Verfahren von Franek, F.
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(1961) Biochem. Biophys. Res. Comm. 4, 28, isolierten H-Ketten von
immunglobulinen oder die nach enzymatischer Behandlung, beispielsweise mit Papain,
Plasmin oder Pepsin aus Immunglobulien nach bekannten Verfahren gewinnbaren Fc-Fragmente
oder deren Subfragmente (Bennich, fl.,Turner, M.W., Biochem. Biophys. Acta 175,
388, 1969; Reid, K.B.M., Immunoloy, 1971, 20, 619; R.R.
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Porter, The Biochemical Journal 1959, 73, 119; haupt, H., Heide, K.,
1969, Klin. Wschr. 47, 270).
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Die Herkunft der zur Herstellung dieser Spaltprodukte notwendigen
Immunglobuline richtet sich nach der Spezies, bei welcher immunologisch verändertes
Immunglobulin machgewiesen werden soll.
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Als optimal hat sich das homologe System erwiesen, d.h. die trägergebundenen
Spaltprodukte stammen von der gleichen Spezies
wie die zu bestimmenden
immunologisch veränderten Immunglobuline.
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In dem erfindungsgemäßen Verfahren sind jedoch auch Spaltprodukte
von anderen Spezies einsetzbar, sofern bei ihnen eine immunologische Kreuzreaktion
zu dem Fc-Teil der zu bestimmenden Antikörperverbindungen oder Antikörperfragmente
besteht. Ein Beispiel solcher zu Kreuzreaktionen befähigten Spezies-Paare ist die
Kombination Raninchen/Mensch.
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Die Spaltprodukte der Immunglobuline können adhäsiv oder kovalent
an den Träger gebunden werden. Die kovalente Bindung wird vorzugsweise verwendet.
Als mögliche kovalente Bindungsarten kommen die in der Literatur beschriebenen in
Betracht (Orth et al., Angew.
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Chem. 1972, 84, S. 319 ff, Silman et al., Am. Rev. Biochem.
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1966, 35, S. 873 ff, Becht et al,*1968, 101, S. 18 ff).
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J. Immunol.
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Der Komplementfaktor Clq kommt in der Natur vor. Er kann beispielsweise
aus Blutserum isoliert werden. Seine Isolierung aus dem Serum des Menschen, des
Kaninchens oder des Rindes sind beschrieben.
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Der Rheuma-Faktor RF ist ein Protein, das im Serum von Menschen, seltener
im Serum anderer Spezies, bei bestimmten rheumatoiden Erkrankungen vorkommt. RF
kann "künstlich" durch Immunisierung mit Antigen-Antikörperkomplexen oder Antikörperaggregaten
gebildet werden. Derartige Antikörperaggregate sind beispielsweise durch Erhitzen
gereinigter Immunglobuline für einige Minuten bei Temperaturen um 600 zu erhalten.
RF wird auch gebildet durch Immunisierung mit Fc-haltigen Antikörperfragmenten wie
H-Ketten von Immunglobulinen oder mit Fc-Fragmenten, erhalten durch Papain-, Plasmin-oder
Pepsin-Behandlung von Immunglobulinen oder von Fragmenten des Fc-Teiles von Immunglobulinen.
Nach Ausbildung der betreffenden Antikörper wird aus dem Serum der immunisierten
Tiere die antikörperhaltige Fraktion nach bekannten Verfahren isoliert und gewünschtenfalls
angereichert.
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Selbstverständlich ist für die Erfindung nur derjenige RF geeignet,
welcher eine immunologische Spezifität sowohl gegen das in der zu prüfenden Flüssigkeit
nachzuweisende immunologisch veränderte Immunglobulin als auch gegen die an Träger
gebundenen Spaltprodukte von Immunglobulinen besitzt. Ein ggf. zu verwendender,
ein
Markierungsmittel tragender Antikörper gegen den Fc-Reaktanten darf nicht mit den
am Träger gebundenen Spaltprodukten von Immunglobulinen reagieren. Das wird entweder
dadurch gewährleistet, daß das trägergebundene Spaltprodukt und der RF von unterschiedlichen
Spezies stammen und/oder daß ihre antigene Determinanten immunologisch nicht kreuzreagieren.
So wählt man beispielsweise einen Antikörper aus, der gegen die L-Ketten von RF
gerichtet ist, und ein Spaltprodukt des Immunglobulins für die Bindung an einen
Träger, welches keine L-Ketten enthält.
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Als Markierungsmittel im Sinne der Erfindung kommen Enzyme, radioaktive
oder fluoreszierende Substanzen in Betracht. Ihre Verbindung mit den zu markierenden
Substanzen sind mit literaturbekannten Methoden durchzuführen. Auch die Messung
der genannten Markierungsmerkmale erfolgt mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Methoden.
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Die Erfindung wird durch folgendes Beispiel näher erläutert: Beispiel
Durch Spaltung des humanen Immunglobulin G mit Papain und nachfolgende gelchromatografische
Auftrennung der Spaltprodukte gemäß dem Verfahren nach Porter, R.R., The Biochemical
Journal 73, 1959, wird das Fc-Fragment isoliert und in 1%iger phosphatgepufferter
Kochsalzlösung von pH 8,3 gelöst.
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Eine 504 dicke Folie aus Polymethylmethacrylat (80 x 250 mm) wird
15 min. bei 900 C mit Hydrazinhydrat behandelt, mit Methanol, dem etwas Essigsäure
hinzugefügt wurde, gespült und anschließend mit Wasser gewaschen. Die Folie wird
in eine Lösung von 1000 ml Eiswasser, 500 ml Salzsäure und 120 ml Natriumnitritlösung
eingebracht.Nach 15 min. wird die Folie mit Eiswasser neutral gewaschen und in einer
Gefriertrocknungsanlage getrocknet.
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Eine derart aktivierte Polymethylmethacrylat-Folie wird in die 1%ige
Lösung des Fc-Fragmentes in phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 8,3 eingetaucht
und in der Lösung für 48 Stunden bei 40 C belassen. Anschließend wird die Folie
3mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung von pH 7,2 gewaschen und in Teile
zerschnitten.
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Für die Bestimmung immunologisch veränderter Immunglobuline in Form
von Immunkomplexen wird eine Verdünnungsreihe der zu untersuchenden Lösung mit phosphatgepufferter
Kochsalzlösung hergestellt. Dazu werden jeweils oder Verdünnungen einer Verdünnungsreihe
mit je 40oil eines menschlichen Serums, das einen hohen Anteil an RF enthält (Titer
von 1:1500 in der RF-Latex-Agglutination) vermischt und das Gemisch 10 min. lang
bei Raumtemperatur belassen. Nachfolgend wird in jedes Gemisch eine wie beschrieben
mit Fc-Fragmenten kovalent beschichtete Folie eingetaucht und 2 Stunden bei 200
inkubiert. In einer Kontrollreihe wird statt des RF-haltigen Serums eine 0,9 %ige
Kochsalzlösung eingesetzt.
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Nach 3maligem Waschen der Folien in gepufferter Kochsalzlösung, pH
7,2, werden sie in eine 1%ige Lösunq des Kninchen-Anti-1Iuman-Immunglobulin-L-Ketten-Antikörpers,
der mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) markiert ist, eingetaucht und dort bei Raumtemperatur
2 Stunden belassen. Nachfolgend werden die Folien zweimal mit phosphatgepufferter
Kochsalzlösung, pH 7,2, und anschließend einmal mit destilliertem Wasser gewaschen.
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In einem Gerät für die quantitative Immunfluoreszenz-Bestimmung (Axiomat,
Carl Zeiss, Oberkochen) wird die Fluoreszenzintensität auf einem festgelegten Ausschnitt
der Folie bestimmt. Sie ist ein Maßstab für die an das Fc-Fragment gebundene Menge
von RF. Diese wiederum ist um so geringer, je mehr RF an Immunkomplexe gebunden
ist.
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Mit dem beschriebenen Verfahren lassen sich in immunkomplexhaltigen
Präparationen diese noch in einer Verdünnung von 1:8000 nachweisen.
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Eine vergleichsweise hohe Empfindlichkeit des Verfahrens ist zu erreichen,
wenn statt des Kaninchen-Anti-Human-Immunglobulin-GKetten-Antikörpers ein Antikörper
gegen Fc-Fragmente von Kaninchen~Gammaglobulin vervendet wird und/oder wenn anstelle
yon RF ein Antikörper gegen das durch Papainspaltung von Ismunglobulln erhaltene
Fc-Fragment eingesetzt wird.
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Anstelle von RF können auch humanes Clq und anstelle von FITC-markierten
Kaninchen-Anti-Human-Immunglobulin-L-Kettenantikörpern FITC-markierte Kaninchen-Anti-Clq-Antikörper
eingesetzt werden.