DE2818739A1 - Immunologisches analysenverfahren - Google Patents

Immunologisches analysenverfahren

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DE2818739A1 DE19782818739 DE2818739A DE2818739A1 DE 2818739 A1 DE2818739 A1 DE 2818739A1 DE 19782818739 DE19782818739 DE 19782818739 DE 2818739 A DE2818739 A DE 2818739A DE 2818739 A1 DE2818739 A1 DE 2818739A1
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Description

  • Immunologisches Analysenverfahren
  • Die Erfindung betrifft ein immunologisches Analysenverfahren zur Bestimmung von Fc-Reaktanten in wässrigen Lösungen vor allem in Körperflüssigkeiten wie Plasma oder Serum.
  • Sie betrifft insbesondere die Bestimmung der Pc-Reaktanten Rheumafaktor und der Komplementfaktoren C1q q und C3d.
  • Es ist bekannt, daß der Rheumafaktor von Autoantikörpern repräsentiert wird, die gegen die homologen Bmmnglobuline gerichtet sind. Der Nachweis ist von großer Bedeutung für die Diagnose und Prognose von rheumatischen Erkrankungen.
  • Die Bestimmung von Komlementfaktoren, vor allem von CI q und C3d haben ihre Bedeutung bei entzündlichen Erkrankungen insbesondere bei Autoimmun- und lmmunkomplexerkrankungen.
  • Eine Verringerung ist durch erhöhten Verbrauch, eine Erhöhung durch verstärkte Bildung der Faktoren bedingt.
  • Es war nun bekannt, daß die Rheumafaktoren den unterschiedlichen Immunglobulinklassen zugehören können. Der Nachweis wurde bisher durchgeführt mit denaturierten, immunkomplexgebundenen oder an Flächen adsorptiv gebundenen Immunglobulinen in Agglutinationsverfahren oder in der sogenannten Doppelantikörperbindungstechnik unter Verwendung eines gegen den Rheumafaktor als Erstantikörper gerichteten, mit einem Markierungsmittel versehenen Zweitantikörpers (vgl. Knes, Reimer, J.Immunol.Methods 1977, 18, 105-121; Hettenkofer u. Müller, Ärztl Lab., 1975, 21, 174-181; Johnson u. Faulk, Clin.Inm.Immunpathol. 1976, 6, 414-430).
  • Der Nachteil dieser Agglutinationsmethoden ist, daß mit ihnen nur Rheumafaktpren der IgM-Klasse nachgewiesen werden können, und daß eine Differenzierung zwischen Rheumafaktoren, die sowohl mit dem Fab2-Teil von Immunglobulinen und solche, die mit dem Fc-Teil zu reagieren vermögen nicht möglich war und daß falsch positive Ergebnisse durch solche Serumproteine auftraten, die mit dem Fc-Teil von Immunglobulinen zu reagieren vermögen. Dies ist beispielsweise von C1 des Komplementsystems bekannt.
  • Der Nachteil der bislang durchgeführten Doppelantikörperbindungsmethoden ist, daß sie aufgrund von Kreuzreaktionen entweder auf den Nachweis von Rheumafaktoren der Klasse IgM oder IgA beschränkt sind, wenn menschliches IgG als Antigen an den Träger gebunden ist oder daß, wenn anstelle von menschlichem IgG als Antigen Immunglobuline einer anderen Spezies, z.B. vom Kaninchen, verwendet werden, nur kreuzreagierende Rheumafaktoren nachzuweisen sind.
  • Es ist weiter beschrieben, daß für die Diagnose der rheumatischen Arthritis der mit dem Fc-Teil von Immunglobulinen reagierende Anteil des Rheumafaktors von Bedeutung ist.
  • Es ist auch schon beschrieben, daß die Reaktion des Rheumafaktors mit dem Fc-Teil des Immunglobulins nur dann stattfindet, wenn das betreffende Immunglobulin im Fc-Teil zur Bindung an das Antigen oder durch Adsorption an einen Träger oder durch Denaturierung eine sterische Veränderung erfahren hat (Gell, Coombs, Lachmann, Clinical Aspects of Immunology, 3. Auflage, Blackwell 1975).
  • Bestimmungen von Cl oder C3d erfolgten bislang in Präq zipitationsmethoden unter Verwendung von spezifisch gegen Cl der Cjd gerichteten Antikörpern. o C1q und C3d ist q der C3d gerichteten Antikörpern. Von C1q bekannt, daß sich beide an das Fc-Teil von Immunglobulin binden, wenn das betreffende Immunglobulin durch Bindung an sich Antigen, an einem Träger oder durch Denaturierung (z.B. Hitzeaggregation) eine sterische Veränderung erfahren hat.
  • Es wurde nun überraschend gefunden, daß sowohl Rheumafaktoren als auch Komplementfaktoren wie z.B. Cl sich an das q isolierte Spaltprodukt des Immunglobulinmoleküls, das sogenannte Fc-Fragment von IgG binden, wonach die oben erwähnten Nachteile, wie sie bei der Verwendung von Immunglobuline auftreten, überwunden werden können.
  • Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Bestimmung von Fc-Reaktanten, insbesondere des Rheumafaktors sowie des Cl - und des C3d-Faktors des Komplements, dadurch q gekennzeichnet, daß man eine wässrige Lösung, die den zu bestimmenden Stoff enthält, in Kontakt bringt mit einem Träger, an welchem ein Spaltprodukt eines ImmungloDuAins mit immunologisch intaktem Fc-Teil adhäsiv oder chemisch gebunden ist, danach den Träger abtrennt und den am Träger gebundenen Fc-Reaktanten mit einem Antikörper, der mit dem Fc-Reaktanten reagiert, ohne mit dem Spaltprodukt des Immunglobulins kreuzzureagieren, in Kontakt bringt und danach die Menge des Antikörpers bestimmt.
  • Diese Bestimmung kann mit litereaturbekannten Methoden erfolgen, wie beispielsweise durch Verwendung eines ein Markierungsmittel tragenden Antikörpers, gerichtet gegen den Fc-Reaktanten und Bestimmung des trägergebundenen oder freien Markierungsmittels oder durch Messung der Komplementbindung des mit den Fc-Reaktanten reagierenden Antikörpers.
  • Als Markierungsmittel sind Enzyme wie Peroxydase, fluoreszierende Substanzen wie Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) oder radioaktive Substanzen wie Jod 131 bekannt.
  • Die Komplementbindung kann durch die dem Fachmann bekannte Komplementbindungsreaktion KBR) nachgewiesen werden. Sie ist z.B. beschrieben in Kurzes Lehrbuch der Immunologie, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 1971, von J. Humphrey, R.G.
  • White.
  • Gegenstand der Erfindung ist weiter ein Diagnostikum, bei welchem das Fc-Fragment von Immunglobulin G adhäsiv oder kovalent an einen Träger gebunden ist. Dieses Diagnostikum wird entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren mit der zu prüfenden wässrigen Lösung, vorzugsweise einer Serumprobe eines Probanden, in Kontakt gebracht, danach ausgeibig gewaschen und nachfolgend beispielsweise mit einem markierten Antikörper, der gegen den Rheumafaktor gerichtet ist und mit dem Fc-Fragment nicht reagiert, zusammengebracht.
  • Geeignete Antikörper sind vorzugsweise solche, die gegen die L-Ketten Fab- oder F(ab)2-Fragmente menschlicher.lmmunglobuline gerichtet sind oder deren Fab2- oder Fab-Spaltstücke.
  • Geeignete Markierungsmittel sind Fluoreszenzfarbstoffe, Enzyme oder radioaktive Moleküle, die nach beschriebenen Verfahren zur Antikörpermarkierung eingesetzt werden, z.B.
  • nach Wick et al., Immunfluoreszenz, Med. Verlagsgesellschaft Marburg, 1976; Nakane et al., J. Histochem.Cytochem.
  • 22, 1977, 1048.
  • Der Nachweis und die Bestimmung des gebundenen oder des nicht gebundenen Markierungsmittel gibt Auskunft über das Vorhandensein und die Menge des gebundenen und somit einen Rückschluß auf die Menge des vorhandenen Rheumafaktors in der Lösung.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet, wie erwähnt, auch andere Fc-Reaktanten, z.B. C1q~ und C3d-Komponenten des Komplementsystems, nachzuweisen. Dann müssen an Stelle der Verwendung von Anti-Rheumafaktor-Antikörpern gegen C1q oder gegen C3d gerichtete Antikörper verwendet werden.
  • Spaltprodukte des Immunglobulins im Sinne der Erfindung, die den Fc-Teil des Immunglobulins oder dessen Fragmente enthalten, sind beispielsweise die nach dem bekannten Verfahren von Franek, F. (1961), Biochem. Biophys. Res. Comm.
  • 4, 28, isolierten H-Ketten von Immunglobulinen oder die nach enzymatischer Behandlung, beispielsweise mit Papain, Plasmin oder Pepsin aus Immunglobulinen nach bekannten Verfahren gewinnbaren Fc-Fragmente oder deren Subfragmente (Bennich, H., Turner, M.W., Biochem. Biophys. Acta 175, 388, 1969; Reid, K.B.M., Immunology, 1971, 20, 649; Porter R.R., The Biochemical Journal, 1959, 73, 119; Haupt, H., Heide, K., 1969, Klin. Wschr. 47, 270).
  • Das Verfahren zur Herstellung des trägergebundenen Fc-Fragmentes ist wie folgt allgemein zu beschreiben: Ein Spaltprodukt des Immunglobulins mit immunologisch intaktem Fc. z.B. das aus IgG isolierte Fc-Fragment wie von Haupt und Heide (Klin. Wschr. 1969, 47, 270) oder Porter (The Biochemical Journal, 1959, 73, 119) beschrieben, wird an eine feste Phase adhäsiv oder kovalent gebunden. Als Träger sind Formkörper, beispielsweise amorphe Partikel, Kugeln, Plättchen, Folien oder Reagenzgefäße aus anorganischem (z.B. Glas) oder organischem Material (z.B. Homo-oder Copolymere von Vinylverbindungen wie Olefinen, Vinylacetat, Vinylchlorid,. Vinylidenchlorid, Tetrafluoräthylen, Styrol, Acrylsäure oder Methacrylsäure, ferner Polymere von Formaldehyd und cyclischen Acetalen sowie aus Polykondensaten wie Polyestern, Polycarbonaten oder Polyamiden oder vernetzte Kohlenhydrate und vernetzte Proteine), weiterhin biologische Träger wie Zellen (z.B. Erythrozyten) geeignet.
  • Zur adhäsiven Beschichtung kann der Träger in Anlehnung an die Methodik von Deelder et al., Exp. Parasitology, 1977, 41, 133, mit dem Fc-Fragment behandelt werden. Es wird z.B.
  • in einer Verdünnung von 1 g bis 1 Fg/ml, vorzugsweise 20g/mI in wässriger Lösung (z.B. phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 8,4) 1 Minute bis 5 Tage, vorzugsweise 24 Stunden lang, in Kontakt gebracht und anschlie-Bend das überschüssige Fc-Fragment durch Waschen mit Puffer (z.B. PBS, pH 7,2) entfernt.
  • Kovalente Bindungen des Fc-Fragmentes können mit den unterschiedlichen Trägern nach in der Literatur beschriebenen Verfahren durchgeführt werden (z.B. Orth et al., Angew.
  • Chemie, 1972, 84, 319 ff.; Silman et al., Am.Rev. Biochem.
  • 1966, 35, 873 ff; Howard and Weetall, Immobilized Enzymes Antigens, Antibodies and Peptides, Marcel Dekker, Inc., New York 1975; Becht et al., J. Immunology, 1968, 101, 18 ff).
  • Das Bestimmungsverfahren wird wie folgt durchgeführt: Der mit dem Fc-Fragment entweder-adhäsiv oder kovalent beschichtete Träger wird 10 sec. bis 48 Stunden, vorzugsweise 1 Stunde, mit der Testprobe, in der Regel Blutserum, in einer Verdünnungsreihe, vorzugsweise 1:1, 1:4, 1:16, 1:32 usw., bei 40C bis 370C, vorzugsweise bei 200C, inkubiert und nachfolgend zur Entfernung nicht gebundener Serumbestandteile gewaschen.
  • Anschließend wird der so behandelte Träger mit einer Lösung eines mit einem Markierungsmittel versehenen Antikörpers, der gerichtet ist gegen L-Ketten, Fab- oder F(ab)2-Fragmente von Immunglobulinen oder gegen Cl oder gegen C3d, q in Kontakt gebracht. Eine geeignete Verdünnung wird in Vorversuchen in einem Testansatz ermittelt, welcher den gesuchten Fc-Reaktanten nicht enthält. Es ist die geringste Verdünnung, bei welcher der markierte Antikörper nicht mit dem Träger, beschichtet mit dem Fc-Fragment, reagiert.
  • Sie liegt bei 1:1 bis 1:500, vorzugsweise 1:100. Die Inkubation wird bei 40C bis 370C, vorzugsweise bei 200C, 10 sec. bis 48 Stunden, vorzugsweise 1 Stunde, durchgeführt. Nachfolgend wird der nicht gebundene Antikörper durch Waschen mit Verdünnungsflüssigkeit, z.B. PBS, pH 7,2, entfernt und das am Träger befindliche Markierungsmittel oder das freie Markierungsmittel nach an sich bekannten Verfahren bestimmt.
  • Die Erfindung wird durch nachstehende Beispiele näher erläutert.
  • Beispiel 1: Bestimmung von Rheumafaktoren In Polystyrolröhrchen (Fassungsvermögen 400 ßg) werden 100ßg einer Lösung von Fc-Fragment von humanem IgG, hergestellt nach Haupt und Heide (Klin. Wschr., 1969, 47, 270) in einer Konzentration von 20 ßg/ml in Natriumphosphatpuffer, pH 8,3, nach Sörensen eingefüllt und bei 20"C gelagert. Nach 18 Stunden wird die Lösung abgesaugt. Die Röhrchen werden dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 0,1 % (g/V) Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat (Tween 20), durch Einfüllen und Absaugen gewaschen. In die ent leerten, beschichteten Röhrchen werden jeweils 100 ßg der Rheumafaktor-haltigen Probe, 1:4, 1:8 und 1:16 verdünnt mit PBS, enthaltend 10 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), eingefüllt und bei 20"C stehen gelassen. Nach 2 Stunden wird die Lösung abgesagut, Die Röhrchen werden dreimal mit PBS, enthaltend Tween 20 (1 mq/ml), durch Einfüllen und Absauqen qewaschen. Nachfolqend wird in die Röhrchen 100 ijl eines mit Peroxydase nach dem Verfahren von Nakane und Kawave, J.Histochem.Cytochem., 1972, 22, 1084, markierten Kaninchen.Anti-Human-L-Ketten-Antikörpers eingefüllt, der verdünnt ist (1:200 entsprechend 0,05 mg Antikörperprotein/ml) mit PBS, pH 7,2, enthaltend 50 mg/ml BSA. Nach Lagerung über 1 Stunde bei 200C werden die Röhrchen wiederum dreimal mit PBS, enthaltend Tween 20, gewaschen. Anschlie-Bend werden pro Röhrchen 100 Rl einer frisch zubereiteten 0,1 %igen o-Phenylendiamin-Lösung in Zitrat-Phosphatpuffer (5 ml 0,1 M Zitronensäure + 5 ml 0,2 M Na2HPO4), versetzt mit 0,1 ml einer 1 %igen (v/v) H2O2-Lösung, einpipettiert.
  • Nach ca. 30 Min.. Lagerung der Röhrchen im Dunkeln wird die Reaktion durch Zugabe von 100 ßl einer 2N H2SO4-Lösung gestoppt und die Extinktion der in den Röhrchen befindlichen Reaktionslösung bei 490 nm mit Hilfe eines Photometers gemessen.
  • Die Ergebnisse von 48 Seren von Patienten mit rheumatischen Erkrankungen sind im Vergleich zu einem solchen, die keinen Rheumafaktor hatten, in Tabelle 1 wiedergegeben.
  • Beispiel 2: Bestimmung des Komplementfaktors Cl q Polymethylenmethacrylatfolie mit Amidgruppen, eingefügt nach dem Verfahren von Lynn (immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies and Pepetides, Howard and Weetall, Marcel Dekker, Inc., New York 1975, 32) wird in eine Lösung von 10 mg/ml Fc-Fragment von humanem IgG in PBS, pH 7,2, 24 Stunden lang bei 4"C gegeben und nachfolgend dreimal durch Eintauchen in PBS, pH 7,2, enthaltend 10 mg/ml BSA, gewaschen.
  • Derart beschichtete Folien werden in verschiedene Patientenseren für 2 Stunden bei 20"C eingetaucht. Zum Vergleich wird eine PBS-Lösung, pH 7,2 und eine zweite Lösung, enthaltend 50 ßg/ml Cl q und 10 mg/ml BSA mitgeführt. Nachfolgend wird die Folie dreimal durch Eintauchen in PBS, pH 7,2, enthaltend 10 mg/ml BSA, gewaschen und anschließend in einer Lösung von Kaninchen-Anti-C1q-Antikörpern, FITC-markiert, in einer Konzentration von 0,5 mg/ml PBS, pH 7,2, enthaltend 10 mg/ml BSA, 2 Stunden bei 20"C eingetaucht, nachfolgend zweimal mit PBS, pH 7,2, enthaltend 10 mg/ml BSA, durch Eintauchen gewaschen und anschließend in destilliertem Wasser gewaschen. Nach Lufttrocknen wird die Folie mit einem Klebstoff (Eukitt, fluoreszenzfrei) auf einen Glasobjektträger geklebt und die Fluoreszenz im Vergleich zu einem Standard (Uranylglas) in einem Fluorimeter (Axiomat, Fa. Zeiss) gemessen.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Sie zeigen deutlich den Nachweis von Cl q in Seren von Patienten mit chronischen Entzündungen im Vergleich zu jeweils einer Positiv- und Negativkontrolle.
  • Tabelle 1 Nachweis von RF mit trägergebundenem Fc RF Serum Nr. (Peroxydaseeaktion) (Verdünnung 1:4) E490 Wertung 157 0,253 + 1 0,449 + 2 0,239 + 8 0,289 + 9 0,247 + 10 0,091 11 0,255 + 12 0,432 + 14 0,128 15 0,251 + 16 0,371 + 17 0,154 18 0,322 + 19 0,380 + 20 0,523 + 21 0,281 + 22 0,187 24 0,154 25 0,137 26 0,168 27 0,375 + 28 0,435 + 29 0,194 +/-31 0,153 39 0,692 + 43 0,384 + 45 0,219 + 51 0,367 + 54 0,318 + 56 0,460 + 59 0,404 + 60 0,220 + 62 0,364 + 66 0,179 +/-68 0,241 + 72 0,448 + 73 0,407 + 75 0,256 + 77 0,201 + 103 0,311 + 105 0,209 + 120 0,163 122 0,164 123 0,335 + 130 0,170 147 0,193 + 149 0,208 + 155 0,323 + Negativ-Kontrolle 0,158 (Kein Rheumafaktor enthaltend) Tabelle 2 FOTC-Fluoreszenz im Vergleich zu Uranylglas-Standard Negativ-Kontrolle (Kein C1q) 11 Positiv-Kontrolle Cl q 50 µg/ml 49,3 + 6,0 Patienten serum (chron. Entzündungen) 1 23,9 2 17,2 3 22,6 4 23,4 5 22,1

Claims (6)

  1. Patentansprüche: 1. Verfahren zur Bestimmung von Fc-Reaktanten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Flüssigkeit, die den zu bestimmenden Stoff enthält, in Kontakt bringt mit einem Träger, an welchem ein Spaltprodukt eines Immunglobulins mit immunologisch inaktem Fc-Teil adhäsiv oder chemisch gebunden ist, danach den Träger abtrennt und den am Träger gebundenen Fc-Reaktanten mit einem Antiköuper, der mit dem Fc-Reaktanten reagiert, ohne mit dem Spaltprodukt des Immunglobulins kreuzzureagieren, in Kontakt bringt und danach den Antikörper bestimmt.
  2. 2. Verfahren zur Bestimmung von Fc-Reaktanten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der mit dem Fc-Reaktanten reagierende Antikörper ein Markierungsmittel trägt, dessen am Träger gebundene oder dessen ungebundene Menge bestimmt wird.
  3. 3. Diagnostikum zur Bestimmung von Rheumafaktor nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es als den mit dem Fc-Reaktanten reagierenden Antikörper einen Antikörper, der gegen L-Ketten oder Fab-Fragmente von Immunglobulinen gerichtet ist, enthält.
  4. 4. Diagnostikum zur Bestimmung von Clg nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es als den mit dem Ec-Reaktanten reagierenden Antikörper einen Antikörper, der gegen Cl gerichtet ist, enthält.
  5. q 5. Diagnostikum zur Bestimmung von C3d nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es als den mit dem Fc-Reaktanten reagierenden Antikörper einen Antikörper, der gegen C3d gerichtet ist, enthält.
  6. 6. Diagnostikum zur Bestimmung von Fc-Reaktanten, enthaltend das Fc-Fragment von Immunglobulin G, gebunden an einen Träger.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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DE2731992A1 (de) * 1977-07-15 1979-02-01 Behringwerke Ag Verfahren zur bestimmung von immunologisch veraendertem immunglobulin

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