CN1866023B - 一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属医学检验领域，涉及一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法。本发明针对目前结核杆菌的检测及抗结核疗效评估的方法的敏感性和特异性不高的缺陷，通过培养或生物工程方法获得结核杆菌特异性分泌抗原ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63和MPT70，制备相应的抗体，通过免疫学检测方法实现5种分泌抗原的同步检测，本方法能显著提高结核检出率，用于人及动物结核病的辅助诊断。能提高检测试剂的敏感性，为结核杆菌感染实验室诊断及抗结核疗效评估提供有利依据。
Description
技术领域
本发明属医学检验领域，涉及一种结核杆菌的感染诊断及抗结核疗效评估的方法，特别涉及一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法。
背景技术：
结核病仍是严重危害人和动物的公共卫生问题，人类结核是WHO重点控制的传染性疾病。目前全球约有1/3的人口感染结核菌，现有结核病人约2000万，每年新发病800万～1000万人。每年约有200万人死于结核病，是其它所有传染病死亡人数的总和。我国的结核病疫情极其严峻，全球1/4的结核病人在中国。我国现有结核感染者5亿，每年有13万死于结核，为其它各类传染病和寄生虫病死亡总和的2倍。动物方面，牛结核的传播也是严重威胁奶制品工业生产的主要问题之一。
结核病控制存在的最主要问题是结核病人或感染动物的发现率低。现有的结核病实验室诊断主要依靠涂片、培养法、PCR分子生物学诊断、血清特异性抗体检测等方法。涂片法尽管快速简便但敏感性特异性差；培养法需要4-8周，不利于早期快速诊断；Bactec快速培养仪检测系统虽然可缩短培养时间，但也需2-4周，而且需特殊仪器设备，费用昂贵，无法在基层推广应用；噬菌体检测技术虽然快速、简便，但特异性差，只能用于结核病人初筛；PCR分子生物学诊断技术快速、灵敏，是很有前途的诊断方法，但其依靠特异性DNA序列的存在进行检测，操作烦琐、费用较贵，不能区分死菌与活菌；血清特异性抗体检测方法简便、实用，但目前所用抗原多为PPD、LAM、38KD、16KD、81KD等，这些抗原多数是分枝杆菌属所共有的，因此特异性不强，检测结果存在假阳性且BCG接种者也可出现阳性结果，因此，其临床应用存在一定问题。
抗原检测一直是确认或评估病原体感染及感染状况较为可靠的方法，且有早期诊断价值，在其它许多疾病如HBV、HCV、HIV、SYPHILIS诊断方面获得广泛应用。特异性抗原检测最重要的特征在于通过检测相关病原体的特异性抗原(标志物)实现。使用这一方法检测结核杆菌，必须寻找到结核杆菌特异性抗原(标志物)。
为了寻找结核杆菌特异性抗原(标志物)，过去，研究人员多从结核杆菌菌体蛋白中寻找，结果多数菌体抗原并非结核杆菌特有，而是分枝杆菌属菌共有。后来研究结核杆菌的生长，从结核杆菌培养滤液中发现了大量分泌抗原，其中一些抗原是菌体中所没有的，且为有毒株结核杆菌所特有。理论上讲，由于分泌性抗原是由活的结核杆菌产生并释放到周围环境介质中，因此，检测上述多种结核杆菌的分泌性抗原能显著提高结核病诊断的阳性率，也可以通过检测分泌性抗原的存在与含量可确定结核杆菌尤其是活菌存在及其生长情况。
人和动物结核杆菌在感染过程中，不同的生长环境、生长阶段，不同的感染方式，结核杆菌能启动表达不同的蛋白系统。研究发现，结核杆菌早期感染阶段会分泌一些小分子量抗原如ESAT-6、CFP-10、10.4等，生长阶段会释放或分泌Ag85A、Ag85B、Ag85C、MPT53、MPT63、MPT64、MPT70、Mtb81(88kd)、MTC28、Mtb48、Rv2430c、MPT32、38kd、19kd。因此，仅依靠检测一两种结核杆菌分泌抗原很难达到诊断目的。现有的专利鲍朗等“结核分枝杆菌诊断试剂盒”专利(02113890.7)描述了结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP-10抗体、抗原的检测方法。由于ESAT-6、CFP-10仅为结核分枝杆菌早期分泌蛋白，而结核分枝杆菌生长过程中不能持续分泌这两种分子，因此，试剂不能提供足够的敏感性。必须同时监测多种特异性蛋白才能提高结核病的检出率。
发明内容
本发明的目的是针对目前结核杆菌的检测及抗结核疗效评估的方法的敏感性和特异性不高的缺陷，提供一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法。
本发明方法采用免疫学方法一次能同步检测5种结核杆菌特异性分泌抗原，能提高结核病感染阳性检出的敏感性，为结核杆菌感染实验室诊断及抗结核疗效评估提供有利依据。
本发明通过细菌培养或生物工程方法获得结核杆菌特异性分泌抗原ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63和MPT70，制备分泌抗原ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63和MPT70相应的抗体，通过免疫学检测方法实现5种分泌抗原ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63和MPT70的同步检测，本方法能显著提高结核病人阳性检出率，能用于人及动物结核病的辅助诊断。
本发明方法包括下述步骤：
(1)分析结核杆菌抗原基因，确定候选基因。
确定特异性强的结核杆菌的分泌抗原：ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63、和MPT70。
采用本领域已知技术及不同的融合方式进行载体构建、表达，获得上述抗原的纯品作为免疫原。
所涉及的载体采用pET21a，表达后C端含6×His或pProEX-HTa，表达后N端含6×His。所涉及的载体为本领域已知技术(市购)。
本发明所采用的技术措施可避免生物工程方法中因基因构建拼接等原因导致所述蛋白的表达水平低下，或表达的蛋白复性折叠后不能与结核杆菌分泌的原始蛋白构像保持一致或接近，直接影响检测用抗体的亲和力和质量等问题。
按常规方法，将所要表达蛋白的基因序列分别克隆到载体中，转染到E.coli(市购)，诱导、表达、纯化。将纯化的蛋白进行SDS-PAGE分析、定量。
上述分泌抗原ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63利MPT70，从结核杆菌培养滤液中提取、分离、纯化获得，或通过生物工程方法在大肠杆菌、昆虫、酵母等系统表达纯化获得。
(2)抗体制备及纯化、标记
以上述抗原或其融合抗原通过生物工程方法制备单抗或多抗，
所述的生物工程方法包含对每一个抗原单独构建，或以两个、三个、四个或五个一组融合构建，或选择它们的主要抗原决定族融合构建。
优选融合抗原是序列3的MPT63-MPT70或序列5的ESAT-6-MPT53或序列6的ESAT-6-MPT53-MPT64。
所述的抗体纯化采用正辛酸结合DEAE层析方法；抗体标记采用酶、金溶胶、化学发光、同位素或时间延迟标记法。
(3)同步检测：采用双抗体夹心法同步检测待测标本的结核杆菌特异性分泌抗原ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63和MPT70。
采用正常人血清为阴性对照，感染病人临床分离结核菌进行常规培养。
涉及的标本来源于需要筛查的、可疑的或在疾病状态的人或动物的体液或介质，包括痰液、血清、尿液、脑脊液等，或细菌培养液。
本发明方法，经实践证实，能显著提高结核病人阳性检出率，用于人及动物结核病的辅助诊断，且快速，简便。可进一步制成检测结核杆菌的试剂，并提高检测试剂的敏感性，为结核杆菌感染实验室诊断及抗结核疗效评估提供有利依据。
附图说明
图1是融合蛋白纯化后的SDS-PAGE图，
其中：1、2是mpt63-70，3、4是east-6-mpt53-mpt64。
具体实施方式：
实施例1
1)通过对结核杆菌特异性强的抗原的基因序列进行分析，确定以ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63、MPT70几个主要分泌的抗原作为候选基因。
采用不同的融合方法进行载体构建、表达。载体采用pET21a，表达后C端含6×His，pProEX-HTa，表达后N端含6×His，表1是采用不同的融合方式及载体构建、表达的结果。
表1
| 载体 | 表达产物 | 推断的产物序列 | 表达水平 |
| pET21apET21apET21apProEX-HTapProEX-HTapProEX-HTa | MPT63-6×HisMPT70-6×HisMPT63-MPT70-6×His6×His-MPT646×His-ESAT-6-MPT536×His-ESAT-6-MPT53-MPT64 | SEQ1SEQ2SEQ3SEQ4SEQ5SEQ6 | 表达水平低、无法纯化表达水平低、无法纯化高表达高表达表达水平低、无法纯化高表达 |
将以上所要表达蛋白的基因序列分别克隆到载体中，转染到E.coli，诱导、表达、纯化。将纯化的蛋白进行SDS-PAGE分析、定量，获得上述抗原的纯品作为免疫原。
2)抗体制备：按相关常规免疫学方法以MPT63-MPT70、ESAT-6-MPT53-MPT64制备多抗，免疫兔。
抗原剂量，首次剂量为300～500μg，加强免疫的剂量为首次剂量为1/4左右。每2～3周加强免疫一次。加强免疫时用不完全佐剂，首次免疫时皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加强免疫时不必注射百日咳疫苗。
在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取2～3ml血，制备血清，检测抗体效价。如未达到预期效价，需再进行加强免疫。当抗体效价达到预期水平时，放血制备抗血清。
3)抗体纯化：采用正辛酸结合DEAE层析方法
正辛酸沉淀：用烧杯加20ml 0.06mol/L醋酸钠缓冲液(pH4.0)到10ml血清中；用1N HCl调节pH到4.8，后滴加辛酸750ul，室温下搅拌30分；5,000×g室温离心30分，保留上清；用1N NaOH调节pH到5.7；含行IgG的上清对PBS透析后，分装，置-20℃保存。
DEAE层析：
缓冲液A：25mmol/L Tris-HCl pH 8.8+35mmol/L NaCl，
缓冲液B：25mmol/L Tris-HCl pH 8.8+70mmol/L NaCl，
缓冲液C：25mmol/L Tris-HCl pH 8.8+500mmol/L NaCl，
缓冲液D：25mmol/L Tris-HCl pH 8.8，
抗体样品对缓冲液B透析过夜(4℃)；按常规方法处理DEAE离子交换剂。然后用缓冲液A平衡。用20倍体积缓冲液A洗交换剂，可用过滤或离心法冲洗至所流出的液体其电导率等于缓冲液A；将处理好的DEAE离子交换剂悬浮在缓冲液A中，装入层析柱；用等体积的缓冲液D稀释透析过的抗体样品，使之与缓冲液A的离子强度一致；稀释后的样品10000g离心10min，4℃，除去沉淀变性的蛋白质；层析柱与蠕动泵、部分收集器及紫外检测仪连接；抗体样品以1ml/min流速上柱，然后用缓冲液A洗柱1ml/min，将未吸附的蛋白质洗出，至流出液在280nm的吸光度小于0.05；吸附的蛋白质，用连续增加NaCl的浓度来洗脱，用线性梯度缓冲液(35-500mmol/LNaCl)或分段缓冲液(35、70、140、280、500mmol/LNaCl)洗脱，流速1ml/min，分部收集洗脱液2ml/管；根椐紫外检测结果，将抗体峰部分合并。装入透析袋对PBS(含0.2g/L叠氮钠)4℃透析或冷冻。
4)过碘酸钠法抗体标记：
称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中，于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟，将上述溶液装入透析袋中，对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg IgG(纯化抗体5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时，加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，再置4℃2小时。将上述液装入透析袋中，对0.15M pH7.4 PBS透析，4℃过夜，在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时，3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，沉淀物溶于0.15M pH7.4的PBS中，将上述溶液装入透析袋中，对0.15M pH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，加入甘油冰冻保存。
5)标本：
正常人血清为阴性对照，H37Rv培养液，为H37Rv菌经2周培养(80℃1h处理后)的过滤液。
分离株培养液为确认TB感染病人临床分离结核菌经2周培养(80℃1h处理后)的过滤液，肺TB痰液：为TB阳性病人痰液经1％NaOH处理后PBS中和液，TB血清：TB阳性病人血清，牛结核血清：为结核阳性牛血清，1ng/ml标准，10ng/ml标准的配置：将重组蛋白ESAT-6-MPT53-MPT64经Ni-SEPHAROSE纯化后，复性，BRADFORD蛋白定量，以PBS(含10％正常兔血清)做为稀释液配成1ng/ml标准，10ng/ml标准。
6)双抗体夹心法同步测定ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63、MPT70：
兔抗体MPT63-MPT70、ESAT-6-MPT53-MPT64各2ug/ml用250mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS pH8.0)稀释的100ul包被微孔板，4℃16h，(0.1％Tween-20的PBS)洗板5次，加200ul％BSA-PBS溶液20℃封闭6h，0.1％Tween-20的PBS液洗板，甩干，备用。检测：每孔加样本100ul，20℃4h；0.1％Tween-20-PBS液洗板5次。加100μl HRP-兔抗MPT63-MPT70、ESAT-6-MPT53-MPT64IgG(0.1％Tweem-20，0.1％BSA in50mmol/LPBS，pH7.3)，20℃1h；0.1％Tween-20-PBS液洗板5次，以滴瓶分别滴加1滴(约50μl)底物液A和B(每升100mmol/L柠檬酸缓冲溶液pH7.0分别含TMB 100mg或H2O21ml)37℃反应10-15分钟，以1滴2mol/L H2SO1终止反应。在酶标仪上以波长450nm测量A值。同时做阳性标准和阴性对照。阴性对照A≤0.05，cut-off值为阴性对照血清平均值×2.1。
表2为不同来源的标本检测结果。
表2：
| 阴性对照 | H37Rv培养液 | 分离株培养液 | 肺TB痰液 | TB脑脊液 | TB血清 | 牛结核血清 | 1ng/ml标准 | 10ng/ml标准 | |
| OD | 0.046 | 2.658 | 2.955 | 0.422 | 0.196 | 1.322 | 1.546 | 0.185 | 0.889 |
实施例2对结核杆菌感染病人血清检测
同实施例1步骤6方法，对30份结核杆菌感染病人血清及10份其它病例血清进行检测，30例TB阳性病人血清24例检测结果判断为阳性(80％)，10例TB阴性血清样品均为阴性(cutoff值为0.261)。
表3为30份结核杆菌感染病人血清检测结果。
表3：
| TB阳性血清样品 | OD值 | TB阳性血清样品 | OD值 | TB阳性血清样品 | OD值 | TB阴性血清样品 | OD值 |
| 1 | 0.041 | 11 | 1.221 | 21 | 0.332 | 1 | 0.075 |
| 2 | 0.756 | 12 | 0.562 | 22 | 0.246 | 2 | 0.039 |
| 3 | 0.864 | 13 | 0.769 | 23 | 0.842 | 3 | 0.046 |
| 4 | 1.256 | 14 | 0.043 | 24 | 0.043 | 4 | 0.053 |
| 5 | 0.986 | 15 | 0.067 | 25 | 0.052 | 5 | 0.047 |
| 6 | 0.543 | 16 | 0.326 | 26 | 1.262 | 6 | 0.051 |
| 7 | 0.952 | 17 | 0.498 | 27 | 0.038 | 7 | 0.037 |
| 8 | 1.975 | 18 | 0.623 | 28 | 0.958 | 8 | 0.044 |
| 9 | 2.458 | 19 | 0.582 | 29 | 0.044 | 9 | 0.063 |
| TB阳性血清样品 | OD值 | TB阳性血清样品 | OD值 | TB阳性血清样品 | OD值 | TB阴性血清样品 | OD值 |
| 10 | 0.056 | 20 | 1.254 | 30 | 1.022 | 10 | 0.056 |
采用本发明方法与已知技术单一抗原检测方法对30份结核杆菌感染病人血清及30常其它病例血清进行两种不同方法检测，检测结果显示，本发明方法能一次同步检测5种结核杆菌特异性分泌抗原抗原，对结核病人阳性检出的敏感性为80％，明显高于已知技术。
表4是本发明方法与已知技术对结核杆菌感染病人血清检测结果。
表4
| 检测方法 | 阳性例数(30例) | 敏感性 | 阴性例数(例) | 特异性(％) | |
| ESAT-6 | 14 | 46％ | 30 | 100 | |
| CFP-10 | 12 | 40.7％ | 30 | 100 | |
| ESAT-6CFP-10 | 17 | 56.7％ | 30 | 100 | |
| 本发明方法 | MPT63MPT70ESAT-6MPT53MPT64 | 24 | 80％ | 30 | 100 |
SEQUENCE LISTING
<110>上海市肺科医院
上海龙美实业有限公司
<120>一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法
<130>11
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>185
<212>PRT
<213>细菌
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Ala Met Ala Ala Ile Ala Thr Phe Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Ala
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Tyr Pro Ile Thr Gly Lys Leu Gly Ser Glu Leu Thr Met Thr Asp Thr
50 55 60
Val Gly Gln Val Val Leu Gly Trp Lys Val Ser Asp Leu Lys Ser Ser
65 70 75 80
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Thr Ala Thr Val Asn Ala Ile Arg Gly Ser Val Thr Pro Ala Val Ser
100 105 110
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115 120 125
Gln Ala Ala Gly Pro Asp Thr Ile Ser Gly Ala Thr Ile Pro Gln Gly
130 135 140
Glu Gln Ser Thr Gly Lys Ile Tyr Phe Asp Val Thr Gly Pro Ser Pro
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Thr Ile Val Ala Met Asn Asn Gly Met Glu Asp Leu Leu Ile Trp Glu
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<210>2
<211>193
<212>PRT
<213>细菌
<400>2
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Ala Gly Asp Leu Val Gly Pro Gly Cys Ala Glu Tyr Ala Ala Ala Asn
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Val Ala Ala Ser Asn Asn Pro Glu Leu Thr Thr Leu Thr Ala Ala Leu
50 55 60
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His
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<210>5
<211>278
<212>PRT
<213>细菌
<400>5
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1 5 10 15
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Met Ala Ser
20 25 30
Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu Phe Met Thr Glu
35 40 45
Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln
50 55 60
Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser
65 70 75 80
Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr
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Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn
100 105 110
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<210>6
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<213>细菌
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485 490 495
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500 505 510
Lys Leu Ala Ala Ala
515
Claims (4)
1.一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法，其特征在于通过免疫学检测法同步检测5种结核杆菌分泌抗原ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63和MPT70，包括下述步骤：
(1)分析结核杆菌抗原基因，确定结核杆菌的分泌抗原：ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63、和MPT70为候选基因，进行载体构建、表达，获得上述抗原作为免疫原；
(2)抗体制备及纯化、标记
以步骤1的抗原或其融合抗原制备单抗或多抗后，进行抗体纯化及标记，
所述的融合抗原是序列3的MPT63-MPT70或序列5的ESAT-6-MPT53或序列6的ESAT-6-MPT53-MPT64；
(3)同步检测：采用双抗体夹心法同步检测待测标本的结核杆菌特异性分泌抗原ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63和MPT70。
2.根据权利要求1所述的同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法，其特征在于所述的步骤2的抗体纯化采用正辛酸结合DEAE层析方法；抗体标记采用酶、金溶胶、化学发光、同位素或时间延迟标记法。
3.根据权利要求1所述的同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法，其特征在于所述的步骤3的待测标本选自：需要筛查的、可疑的或在疾病状态的人或动物的体液或介质，包括痰液、血清、尿液、脑脊液或细菌培养液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤1的免疫原通过结核杆菌培养滤液中提取、分离、纯化获得，或通过生物工程方法在大肠杆菌、昆虫或酵母系统表达纯化获得。
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