CN1866023B - 一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法 - Google Patents

一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1866023B
CN1866023B CN2006100269009A CN200610026900A CN1866023B CN 1866023 B CN1866023 B CN 1866023B CN 2006100269009 A CN2006100269009 A CN 2006100269009A CN 200610026900 A CN200610026900 A CN 200610026900A CN 1866023 B CN1866023 B CN 1866023B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ala
thr
gly
val
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2006100269009A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1866023A (zh
Inventor
胡忠义
丁元生
杨华
王洁
秦莲花
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHANGHAI LONGMEI INDUSTRIAL Co Ltd
Shanghai Pulmonary Hospital
Original Assignee
SHANGHAI LONGMEI INDUSTRIAL Co Ltd
Shanghai Pulmonary Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANGHAI LONGMEI INDUSTRIAL Co Ltd, Shanghai Pulmonary Hospital filed Critical SHANGHAI LONGMEI INDUSTRIAL Co Ltd
Priority to CN2006100269009A priority Critical patent/CN1866023B/zh
Publication of CN1866023A publication Critical patent/CN1866023A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1866023B publication Critical patent/CN1866023B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明属医学检验领域,涉及一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法。本发明针对目前结核杆菌的检测及抗结核疗效评估的方法的敏感性和特异性不高的缺陷,通过培养或生物工程方法获得结核杆菌特异性分泌抗原ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63和MPT70,制备相应的抗体,通过免疫学检测方法实现5种分泌抗原的同步检测,本方法能显著提高结核检出率,用于人及动物结核病的辅助诊断。能提高检测试剂的敏感性,为结核杆菌感染实验室诊断及抗结核疗效评估提供有利依据。

Description

一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法
技术领域
本发明属医学检验领域,涉及一种结核杆菌的感染诊断及抗结核疗效评估的方法,特别涉及一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法。
背景技术:
结核病仍是严重危害人和动物的公共卫生问题,人类结核是WHO重点控制的传染性疾病。目前全球约有1/3的人口感染结核菌,现有结核病人约2000万,每年新发病800万~1000万人。每年约有200万人死于结核病,是其它所有传染病死亡人数的总和。我国的结核病疫情极其严峻,全球1/4的结核病人在中国。我国现有结核感染者5亿,每年有13万死于结核,为其它各类传染病和寄生虫病死亡总和的2倍。动物方面,牛结核的传播也是严重威胁奶制品工业生产的主要问题之一。
结核病控制存在的最主要问题是结核病人或感染动物的发现率低。现有的结核病实验室诊断主要依靠涂片、培养法、PCR分子生物学诊断、血清特异性抗体检测等方法。涂片法尽管快速简便但敏感性特异性差;培养法需要4-8周,不利于早期快速诊断;Bactec快速培养仪检测系统虽然可缩短培养时间,但也需2-4周,而且需特殊仪器设备,费用昂贵,无法在基层推广应用;噬菌体检测技术虽然快速、简便,但特异性差,只能用于结核病人初筛;PCR分子生物学诊断技术快速、灵敏,是很有前途的诊断方法,但其依靠特异性DNA序列的存在进行检测,操作烦琐、费用较贵,不能区分死菌与活菌;血清特异性抗体检测方法简便、实用,但目前所用抗原多为PPD、LAM、38KD、16KD、81KD等,这些抗原多数是分枝杆菌属所共有的,因此特异性不强,检测结果存在假阳性且BCG接种者也可出现阳性结果,因此,其临床应用存在一定问题。
抗原检测一直是确认或评估病原体感染及感染状况较为可靠的方法,且有早期诊断价值,在其它许多疾病如HBV、HCV、HIV、SYPHILIS诊断方面获得广泛应用。特异性抗原检测最重要的特征在于通过检测相关病原体的特异性抗原(标志物)实现。使用这一方法检测结核杆菌,必须寻找到结核杆菌特异性抗原(标志物)。
为了寻找结核杆菌特异性抗原(标志物),过去,研究人员多从结核杆菌菌体蛋白中寻找,结果多数菌体抗原并非结核杆菌特有,而是分枝杆菌属菌共有。后来研究结核杆菌的生长,从结核杆菌培养滤液中发现了大量分泌抗原,其中一些抗原是菌体中所没有的,且为有毒株结核杆菌所特有。理论上讲,由于分泌性抗原是由活的结核杆菌产生并释放到周围环境介质中,因此,检测上述多种结核杆菌的分泌性抗原能显著提高结核病诊断的阳性率,也可以通过检测分泌性抗原的存在与含量可确定结核杆菌尤其是活菌存在及其生长情况。
人和动物结核杆菌在感染过程中,不同的生长环境、生长阶段,不同的感染方式,结核杆菌能启动表达不同的蛋白系统。研究发现,结核杆菌早期感染阶段会分泌一些小分子量抗原如ESAT-6、CFP-10、10.4等,生长阶段会释放或分泌Ag85A、Ag85B、Ag85C、MPT53、MPT63、MPT64、MPT70、Mtb81(88kd)、MTC28、Mtb48、Rv2430c、MPT32、38kd、19kd。因此,仅依靠检测一两种结核杆菌分泌抗原很难达到诊断目的。现有的专利鲍朗等“结核分枝杆菌诊断试剂盒”专利(02113890.7)描述了结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP-10抗体、抗原的检测方法。由于ESAT-6、CFP-10仅为结核分枝杆菌早期分泌蛋白,而结核分枝杆菌生长过程中不能持续分泌这两种分子,因此,试剂不能提供足够的敏感性。必须同时监测多种特异性蛋白才能提高结核病的检出率。
发明内容
本发明的目的是针对目前结核杆菌的检测及抗结核疗效评估的方法的敏感性和特异性不高的缺陷,提供一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法。
本发明方法采用免疫学方法一次能同步检测5种结核杆菌特异性分泌抗原,能提高结核病感染阳性检出的敏感性,为结核杆菌感染实验室诊断及抗结核疗效评估提供有利依据。
本发明通过细菌培养或生物工程方法获得结核杆菌特异性分泌抗原ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63和MPT70,制备分泌抗原ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63和MPT70相应的抗体,通过免疫学检测方法实现5种分泌抗原ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63和MPT70的同步检测,本方法能显著提高结核病人阳性检出率,能用于人及动物结核病的辅助诊断。
本发明方法包括下述步骤:
(1)分析结核杆菌抗原基因,确定候选基因。
确定特异性强的结核杆菌的分泌抗原:ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63、和MPT70。
采用本领域已知技术及不同的融合方式进行载体构建、表达,获得上述抗原的纯品作为免疫原。
所涉及的载体采用pET21a,表达后C端含6×His或pProEX-HTa,表达后N端含6×His。所涉及的载体为本领域已知技术(市购)。
本发明所采用的技术措施可避免生物工程方法中因基因构建拼接等原因导致所述蛋白的表达水平低下,或表达的蛋白复性折叠后不能与结核杆菌分泌的原始蛋白构像保持一致或接近,直接影响检测用抗体的亲和力和质量等问题。
按常规方法,将所要表达蛋白的基因序列分别克隆到载体中,转染到E.coli(市购),诱导、表达、纯化。将纯化的蛋白进行SDS-PAGE分析、定量。
上述分泌抗原ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63利MPT70,从结核杆菌培养滤液中提取、分离、纯化获得,或通过生物工程方法在大肠杆菌、昆虫、酵母等系统表达纯化获得。
(2)抗体制备及纯化、标记
以上述抗原或其融合抗原通过生物工程方法制备单抗或多抗,
所述的生物工程方法包含对每一个抗原单独构建,或以两个、三个、四个或五个一组融合构建,或选择它们的主要抗原决定族融合构建。
优选融合抗原是序列3的MPT63-MPT70或序列5的ESAT-6-MPT53或序列6的ESAT-6-MPT53-MPT64。
所述的抗体纯化采用正辛酸结合DEAE层析方法;抗体标记采用酶、金溶胶、化学发光、同位素或时间延迟标记法。
(3)同步检测:采用双抗体夹心法同步检测待测标本的结核杆菌特异性分泌抗原ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63和MPT70。
采用正常人血清为阴性对照,感染病人临床分离结核菌进行常规培养。
涉及的标本来源于需要筛查的、可疑的或在疾病状态的人或动物的体液或介质,包括痰液、血清、尿液、脑脊液等,或细菌培养液。
本发明方法,经实践证实,能显著提高结核病人阳性检出率,用于人及动物结核病的辅助诊断,且快速,简便。可进一步制成检测结核杆菌的试剂,并提高检测试剂的敏感性,为结核杆菌感染实验室诊断及抗结核疗效评估提供有利依据。
附图说明
图1是融合蛋白纯化后的SDS-PAGE图,
其中:1、2是mpt63-70,3、4是east-6-mpt53-mpt64。
具体实施方式:
实施例1
1)通过对结核杆菌特异性强的抗原的基因序列进行分析,确定以ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63、MPT70几个主要分泌的抗原作为候选基因。
采用不同的融合方法进行载体构建、表达。载体采用pET21a,表达后C端含6×His,pProEX-HTa,表达后N端含6×His,表1是采用不同的融合方式及载体构建、表达的结果。
表1
载体 表达产物 推断的产物序列 表达水平
pET21apET21apET21apProEX-HTapProEX-HTapProEX-HTa MPT63-6×HisMPT70-6×HisMPT63-MPT70-6×His6×His-MPT646×His-ESAT-6-MPT536×His-ESAT-6-MPT53-MPT64 SEQ1SEQ2SEQ3SEQ4SEQ5SEQ6 表达水平低、无法纯化表达水平低、无法纯化高表达高表达表达水平低、无法纯化高表达
将以上所要表达蛋白的基因序列分别克隆到载体中,转染到E.coli,诱导、表达、纯化。将纯化的蛋白进行SDS-PAGE分析、定量,获得上述抗原的纯品作为免疫原。
2)抗体制备:按相关常规免疫学方法以MPT63-MPT70、ESAT-6-MPT53-MPT64制备多抗,免疫兔。
抗原剂量,首次剂量为300~500μg,加强免疫的剂量为首次剂量为1/4左右。每2~3周加强免疫一次。加强免疫时用不完全佐剂,首次免疫时皮下注射百日咳疫苗0.5ml,加强免疫时不必注射百日咳疫苗。
在第2次加强免疫后2周,从耳缘静脉取2~3ml血,制备血清,检测抗体效价。如未达到预期效价,需再进行加强免疫。当抗体效价达到预期水平时,放血制备抗血清。
3)抗体纯化:采用正辛酸结合DEAE层析方法
正辛酸沉淀:用烧杯加20ml 0.06mol/L醋酸钠缓冲液(pH4.0)到10ml血清中;用1N HCl调节pH到4.8,后滴加辛酸750ul,室温下搅拌30分;5,000×g室温离心30分,保留上清;用1N NaOH调节pH到5.7;含行IgG的上清对PBS透析后,分装,置-20℃保存。
DEAE层析:
缓冲液A:25mmol/L Tris-HCl pH 8.8+35mmol/L NaCl,
缓冲液B:25mmol/L Tris-HCl pH 8.8+70mmol/L NaCl,
缓冲液C:25mmol/L Tris-HCl pH 8.8+500mmol/L NaCl,
缓冲液D:25mmol/L Tris-HCl pH 8.8,
抗体样品对缓冲液B透析过夜(4℃);按常规方法处理DEAE离子交换剂。然后用缓冲液A平衡。用20倍体积缓冲液A洗交换剂,可用过滤或离心法冲洗至所流出的液体其电导率等于缓冲液A;将处理好的DEAE离子交换剂悬浮在缓冲液A中,装入层析柱;用等体积的缓冲液D稀释透析过的抗体样品,使之与缓冲液A的离子强度一致;稀释后的样品10000g离心10min,4℃,除去沉淀变性的蛋白质;层析柱与蠕动泵、部分收集器及紫外检测仪连接;抗体样品以1ml/min流速上柱,然后用缓冲液A洗柱1ml/min,将未吸附的蛋白质洗出,至流出液在280nm的吸光度小于0.05;吸附的蛋白质,用连续增加NaCl的浓度来洗脱,用线性梯度缓冲液(35-500mmol/LNaCl)或分段缓冲液(35、70、140、280、500mmol/LNaCl)洗脱,流速1ml/min,分部收集洗脱液2ml/管;根椐紫外检测结果,将抗体峰部分合并。装入透析袋对PBS(含0.2g/L叠氮钠)4℃透析或冷冻。
4)过碘酸钠法抗体标记:
称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中,于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液,室温下避光搅拌20分钟,将上述溶液装入透析袋中,对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4℃过夜,加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液,使以上醛化HRP的pH升高到9.0~9.5,然后立即加入10mg IgG(纯化抗体5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2小时,加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液,混匀,再置4℃2小时。将上述液装入透析袋中,对0.15M pH7.4 PBS透析,4℃过夜,在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1小时,3000rpm离心半小时,弃上清,沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,沉淀物溶于0.15M pH7.4的PBS中,将上述溶液装入透析袋中,对0.15M pH7.4的PB缓冲盐水透析,去除铵离子后(用萘氏试剂检测),10,000rpm离心30分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,加入甘油冰冻保存。
5)标本:
正常人血清为阴性对照,H37Rv培养液,为H37Rv菌经2周培养(80℃1h处理后)的过滤液。
分离株培养液为确认TB感染病人临床分离结核菌经2周培养(80℃1h处理后)的过滤液,肺TB痰液:为TB阳性病人痰液经1%NaOH处理后PBS中和液,TB血清:TB阳性病人血清,牛结核血清:为结核阳性牛血清,1ng/ml标准,10ng/ml标准的配置:将重组蛋白ESAT-6-MPT53-MPT64经Ni-SEPHAROSE纯化后,复性,BRADFORD蛋白定量,以PBS(含10%正常兔血清)做为稀释液配成1ng/ml标准,10ng/ml标准。
6)双抗体夹心法同步测定ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63、MPT70:
兔抗体MPT63-MPT70、ESAT-6-MPT53-MPT64各2ug/ml用250mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS pH8.0)稀释的100ul包被微孔板,4℃16h,(0.1%Tween-20的PBS)洗板5次,加200ul%BSA-PBS溶液20℃封闭6h,0.1%Tween-20的PBS液洗板,甩干,备用。检测:每孔加样本100ul,20℃4h;0.1%Tween-20-PBS液洗板5次。加100μl HRP-兔抗MPT63-MPT70、ESAT-6-MPT53-MPT64IgG(0.1%Tweem-20,0.1%BSA in50mmol/LPBS,pH7.3),20℃1h;0.1%Tween-20-PBS液洗板5次,以滴瓶分别滴加1滴(约50μl)底物液A和B(每升100mmol/L柠檬酸缓冲溶液pH7.0分别含TMB 100mg或H2O21ml)37℃反应10-15分钟,以1滴2mol/L H2SO1终止反应。在酶标仪上以波长450nm测量A值。同时做阳性标准和阴性对照。阴性对照A≤0.05,cut-off值为阴性对照血清平均值×2.1。
表2为不同来源的标本检测结果。
表2:
阴性对照 H37Rv培养液 分离株培养液 肺TB痰液 TB脑脊液 TB血清 牛结核血清 1ng/ml标准 10ng/ml标准
OD 0.046 2.658 2.955 0.422 0.196 1.322 1.546 0.185 0.889
实施例2对结核杆菌感染病人血清检测
同实施例1步骤6方法,对30份结核杆菌感染病人血清及10份其它病例血清进行检测,30例TB阳性病人血清24例检测结果判断为阳性(80%),10例TB阴性血清样品均为阴性(cutoff值为0.261)。
表3为30份结核杆菌感染病人血清检测结果。
表3:
  TB阳性血清样品     OD值    TB阳性血清样品     OD值    TB阳性血清样品     OD值    TB阴性血清样品     OD值
    1   0.041     11     1.221     21   0.332     1     0.075
    2   0.756     12     0.562     22   0.246     2     0.039
    3   0.864     13     0.769     23   0.842     3     0.046
    4   1.256     14     0.043     24   0.043     4     0.053
    5   0.986     15     0.067     25   0.052     5     0.047
    6   0.543     16     0.326     26   1.262     6     0.051
    7   0.952     17     0.498     27   0.038     7     0.037
    8   1.975     18     0.623     28   0.958     8     0.044
    9   2.458     19     0.582     29   0.044     9     0.063
  TB阳性血清样品     OD值    TB阳性血清样品     OD值    TB阳性血清样品     OD值    TB阴性血清样品     OD值
    10   0.056     20     1.254     30   1.022     10     0.056
采用本发明方法与已知技术单一抗原检测方法对30份结核杆菌感染病人血清及30常其它病例血清进行两种不同方法检测,检测结果显示,本发明方法能一次同步检测5种结核杆菌特异性分泌抗原抗原,对结核病人阳性检出的敏感性为80%,明显高于已知技术。
表4是本发明方法与已知技术对结核杆菌感染病人血清检测结果。
表4
检测方法  阳性例数(30例) 敏感性  阴性例数(例)    特异性(%)
  ESAT-6     14   46%     30     100
  CFP-10     12   40.7%     30     100
  ESAT-6CFP-10 17 56.7% 30 100
本发明方法   MPT63MPT70ESAT-6MPT53MPT64 24 80% 30 100
SEQUENCE LISTING
<110>上海市肺科医院
上海龙美实业有限公司
<120>一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法
<130>11
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>185
<212>PRT
<213>细菌
<400>1
Met Trp Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser
1                 5                      10                     15
Glu Phe Met Lys Leu Thr Thr Met Ile Lys Thr Ala Val Ala Val Val
             20                      25                       30
Ala Met Ala Ala Ile Ala Thr Phe Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Ala
         35                       40                      45
Tyr Pro Ile Thr Gly Lys Leu Gly Ser Glu Leu Thr Met Thr Asp Thr
     50                      55                     60
Val Gly Gln Val Val Leu Gly Trp Lys Val Ser Asp Leu Lys Ser Ser
65                      70                      75                   80
Thr Ala Val Ile Pro Gly Tyr Pro Val Ala Gly Gln Val Trp Glu Ala
                    85                      90                    95
Thr Ala Thr Val Asn Ala Ile Arg Gly Ser Val Thr Pro Ala Val Ser
               100                     105                     110
Gln Phe Asn Ala Arg Thr Ala Asp Gly Ile Asn Tyr Arg Val Leu Trp
         115                    120                      125
Gln Ala Ala Gly Pro Asp Thr Ile Ser Gly Ala Thr Ile Pro Gln Gly
     130                     135                      140
Glu Gln Ser Thr Gly Lys Ile Tyr Phe Asp Val Thr Gly Pro Ser Pro
145                     150                     155                   160
Thr Ile Val Ala Met Asn Asn Gly Met Glu Asp Leu Leu Ile Trp Glu
                    165                   170                     175    
Pro Leu Glu His His His His His His
              180                    185
<210>2
<211>193
<212>PRT
<213>细菌
<400>2
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu Phe
1                 5                      10                     15
Ala Gly Asp Leu Val Gly Pro Gly Cys Ala Glu Tyr Ala Ala Ala Asn
             20                      25                      30
Pro Thr Gly Pro Ala Ser Val Gln Gly Met Ser Gln Asp Pro Val Ala
         35                      40                      45
Val Ala Ala Ser Asn Asn Pro Glu Leu Thr Thr Leu Thr Ala Ala Leu
     50                     55                      60
Ser Gly Gln Leu Asn Pro Gln Val Asn Leu Val Asp Thr Leu Asn Ser
65                     70                     75                     80
Gly Gln Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Ala Ala Phe Ser Lys Leu
                   85                      90                    95
Pro Ala Ser Thr Ile Asp Glu Leu Lys Thr Asn Ser Ser Leu Leu Thr
               100                     105                    110
Ser Ile Leu Thr Tyr His Val Val Ala Gly Gln Thr Ser Pro Ala Asn
          115                      120                     125
Val Val Gly Thr Arg Gln Thr Leu Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Thr
     130                    135                     140
Gly Gln Gly Asn Ser Leu Lys Val Gly Asn Ala Asp Val Val Cys Gly
145                    150                    155                    160
Gly Val Ser Thr Ala Asn Ala Thr Val Tyr Met Ile Asp Ser Val Leu
                    165                     170                  175
Met Pro Pro Ala Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His
              180                    185                     190
His
<210>3
<211>357
<212>PRT
<213>细菌
<400>3
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu Phe
1                 5                      10                     15
Met Lys Leu Thr Thr Met Ile Lys Thr Ala Val Ala Val Val Ala Met
             20                      25                       30
Ala Ala Ile Ala Thr Phe Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Ala Tyr Pro
          35                      40                      45
Ile Thr Gly Lys Leu Gly Ser Glu Leu Thr Met Thr Asp Thr Val Gly
     50                      55                    60
Gln Val Val Leu Gly Trp Lys Val Ser Asp Leu Lys Ser Ser Thr Ala
65                      70                     75                    80
Val Ile Pro Gly Tyr Pro Val Ala Gly Gln Val Trp Glu Ala Thr Ala
                     85                     90                    95
Thr Val Asn Ala Ile Arg Gly Ser Val Thr Pro Ala Val Ser Gln Phe
              100                      105                     110
Asn Ala Arg Thr Ala Asp Gly Ile Asn Tyr Arg Val Leu Trp Gln Ala
         115                     120                     125
Ala Gly Pro Asp Thr Ile Ser Gly Ala Thr Ile Pro Gln Gly Glu Gln
     130                     135                      140
Ser Thr Gly Lys Ile Tyr Phe Asp Val Thr Gly Pro Ser Pro Thr Ile
145                      150                     155                 160
Val Ala Met Asn Asn Gly Met Glu Asp Leu Leu Ile Trp Glu Pro Gly
                  165                    170                    175
Gly Gly Gly Gly Ala Gly Asp Leu Val Gly Pro Gly Cys Ala Glu Tyr
              180                    185                    190
Ala Ala Ala Asn Pro Thr Gly Pro Ala Ser Val Gln Gly Met Ser Gln
     195                         200                     205
Asp Pro Val Ala Val Ala Ala Ser Asn Asn Pro Glu Leu Thr Thr Leu
    210                      215                    220
Thr Ala Ala Leu Ser Gly Gln Leu Asn Pro Gln Val Asn Leu Val Asp
225                    230                     235                   240
Thr Leu Asn Ser Gly Gln Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Ala Ala
                  245                     250                    255
Phe Ser Lys Leu Pro Ala Ser Thr Ile Asp Glu Leu Lys Thr Asn Ser
              260                     265                     270
Ser Leu Leu Thr Ser Ile Leu Thr Tyr His Val Val Ala Gly Gln Thr
         275                      280                     285
Ser Pro Ala Asn Val Val Gly Thr Arg Gln Thr Leu Gln Gly Ala Ser
     290                     295                    300
Val Thr Val Thr Gly Gln Gly Asn Ser Leu Lys Val Gly Asn Ala Asp
305                     310                     315                 320
Val Val Cys Gly Gly Val Ser Thr Ala Asn Ala Thr Val Tyr Met Ile
                   325                    330                    335
Asp Ser Val Leu Met Pro Pro Ala Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His
              340                    345                     350
His His His His His
          355
<210>4
<211>260
<212>PRT
<213>细菌
<400>4
Met Trp Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile
1                 5                        10                    15
Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Met Pro Glu Phe
              20                     25                     30
Met Arg Ile Lys Ile Phe Met Leu Val Thr Ala Val Val Leu Leu Cys
          35                      40                     45
Cys Ser Gly Val Ala Thr Ala Ala Pro Lys Thr Tyr Cys Glu Glu Leu
    50                       55                     60
Lys Gly Thr Asp Thr Gly Gln Ala Cys Leu Ile Gln Met Ser Asp Pro
65                     70                      75                    80
Ala Tyr Asn Thr Asn Ile Ser Leu Pro Ser Tyr Tyr Pro Asp Gln Lys
                  85                        90                   95
Ser Leu Glu Asn Tyr Ile Ala Gln Thr Arg Asp Lys Phe Leu Ser Ala
              100                     105                    110
Ala Thr Ser Ser Thr Pro Arg Glu Ala Pro Tyr Glu Leu Asn Ile Thr
          115                    120                      125
Ser Ala Thr Tyr Gln Ser Ala Ile Pro Pro Arg Gly Thr Gln Ala Val
     130                      135                     140
Val Leu Lys Val Tyr Gln Asn Ala Gly Gly Thr His Pro Thr Thr Thr
145                     150                     155                   160
Tyr Lys Ala Phe Asp Trp Asp Gln Ala Tyr Arg Lys Pro Ile Thr Tyr
                  165                     170                    175
Asp Thr Leu Trp Gln Ala Asp Thr Asp Pro Leu Pro Val Val Phe Pro
              180                    185                     190
Ile Val Gln Gly Glu Leu Ser Lys Gln Thr Gly Gln Gln Val Ser Ile
          195                     200                    205
Ala Pro Asn Ala Gly Leu Asp Pro Val Asn Tyr Gln Asn Phe Ala Val
     210                   215                     220
Thr Asn Asp Gly Val Ile Phe Phe Phe Asn Pro Gly Glu Leu Leu Pro
225                     230                    235                  240
Glu Ala Ala Gly Pro Thr Gln Val Leu Val His Arg Ser Ala Ile Asp
                   245                     250                   255
Ser Met Leu Ala
              260
<210>5
<211>278
<212>PRT
<213>细菌
<400>5
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1                  5                       10                    15
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Met Ala Ser
             20                      25                    30
Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu Phe Met Thr Glu
         35                     40                    45
Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln
    50                      55                       60
Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser
65                       70                     75                80
Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr
                  85                      90                    95
Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn
             100                     105                     110
Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met
         115                     120                     125
Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala Gly Gly Gly Gly
     130                    135                    140
Glu Arg Leu Gln Phe Thr Ala Thr Thr Leu Ser Gly Ala Pro Phe Asp
145                    150                    155                  160
Gly Ala Ser Leu Gln Gly Lys Pro Ala Val Leu Trp Phe Trp Thr Pro
                   165                    170                   175
Trp Cys Pro Phe Cys Asn Ala Glu Ala Pro Ser Leu Ser Gln Val Ala
              180                    185                     190
Ala Ala Asn Pro Ala Val Thr Phe Val Gly Ile Ala Thr Arg Ala Asp
         195                     200                      205
Val Gly Ala Met Gln Ser Phe Val Ser Lys Tyr Asn Leu Asn Phe Thr
     210                    215                     220
Asn Leu Asn Asp Ala Asp Gly Val Ile Trp Ala Arg Tyr Asn Val Pro
225                   230                      235                  240
Trp Gln Pro Ala Phe Val phe Tyr Arg Ala Asp Gly Thr Ser Thr Phe
                   245                     250                  255
Val Asn Asn Pro Thr Ala Ala Met Ser Gln Asp Glu Leu Ser Gly Arg
              260                     265                    270
Val Ala Ala Leu Thr Ser
          275
<210>6
<211>517
<212>PRT
<213>细菌
<400>6
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1                 5                        10                   15
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Met Ala Ser
              20                     25                    30
Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu Phe Met Thr Glu
         35                     40                    45
Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln
    50                      55                       60
Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser
65                       70                    75                    80
Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr
                  85                      90                     95
Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn
              100                    105                     110
Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met
         115                     120                    125
Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala Gly Gly Gly Gly
     130                    135                        140
Glu Arg Leu Gln Phe Thr Ala Thr Thr Leu Ser Gly Ala Pro Phe Asp
145                    150                    155                    160
Gly Ala Ser Leu Gln Gly Lys Pro Ala Val Leu Trp Phe Trp Thr Pro
                  165                     170                    175
Trp Cys Pro Phe Cys Asn Ala Glu Ala Pro Ser Leu Ser Gln Val Ala
              180                    185                     190
Ala Ala Asn Pro Ala Val Thr Phe Val Gly Ile Ala Thr Arg Ala Asp
         195                     200                      205
Val Gly Ala Met Gln Ser Phe Val Ser Lys Tyr Asn Leu Asn Phe Thr
     210                    215                     220
Asn Leu Asn Asp Ala Asp Gly Val Ile Trp Ala Arg Tyr Asn Val Pro
225                   230                      235                  240
Trp Gln Pro Ala Phe Val Phe Tyr Arg Ala Asp Gly Thr Ser Thr Phe
                   245                    250                    255
Val Asn Asn Pro Thr Ala Ala Met Ser Gln Asp Glu Leu Ser Gly Arg
              260                    265                     270
Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly Gly Gly Gly Met Arg Ile Lys Ile Phe
          275                     280                     285
Met Leu Val Thr Ala Val Val Leu Leu Cys Cys Ser Gly Val Ala Thr
    290                      295                   300
Ala Ala Pro Lys Thr Tyr Cys Glu Glu Leu Lys Gly Thr Asp Thr Gly
305                     310                    315                  320
Gln Ala Cys Leu Ile Gln Met Ser Asp Pro Ala Tyr Asn Thr Asn lle
                   325                     330                   335
Ser Leu Pro Ser Tyr Tyr Pro Asp Gln Lys Ser Leu Glu Asn Tyr Ile
              340                     345                     350
Ala Gln Thr Arg Asp Lys Phe Leu Ser Ala Ala Thr Ser Ser Thr Pro
         355                    360                      365
Arg Glu Ala Pro Tyr Glu Leu Asn Ile Thr Ser Ala Thr Tyr Gln Ser
    370                     375                      380
Ala Ile Pro Pro Arg Gly Thr Gln Ala Val Val Leu Lys Val Tyr Gln
385                     390                      395                400
Asn Ala Gly Gly Thr His Pro Thr Thr Thr Tyr Lys Ala Phe Asp Trp
                  405                     410                     415
Asp Gln Ala Tyr Arg Lys Pro Ile Thr Tyr Asp Thr Leu Trp Gln Ala
              420                      425                    430
Asp Thr Asp Pro Leu Pro Val Val Phe Pro Ile Val Gln Gly Glu Leu
         435                     440                     445
Ser Lys Gln Thr Gly Gln Gln Val Ser Ile Ala Pro Asn Ala Gly Leu
     450                    455                      460
Asp Pro Val Asn Tyr Gln Asn Phe Ala Val Thr Asn Asp Gly Val Ile
465                    470                     475                    480
Phe Phe Phe Asn Pro Gly Glu Leu Leu Pro Glu Ala Ala Gly Pro Thr
                  485                    490                      495
Gln Val Leu Val His Arg Ser Ala Ile Asp Ser Met Leu Ala Val Asp
              500                      505                    510
Lys Leu Ala Ala Ala
         515

Claims (4)

1.一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法,其特征在于通过免疫学检测法同步检测5种结核杆菌分泌抗原ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63和MPT70,包括下述步骤:
(1)分析结核杆菌抗原基因,确定结核杆菌的分泌抗原:ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63、和MPT70为候选基因,进行载体构建、表达,获得上述抗原作为免疫原;
(2)抗体制备及纯化、标记
以步骤1的抗原或其融合抗原制备单抗或多抗后,进行抗体纯化及标记,
所述的融合抗原是序列3的MPT63-MPT70或序列5的ESAT-6-MPT53或序列6的ESAT-6-MPT53-MPT64;
(3)同步检测:采用双抗体夹心法同步检测待测标本的结核杆菌特异性分泌抗原ESAT-6、MPT53、MPT64、MPT63和MPT70。
2.根据权利要求1所述的同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法,其特征在于所述的步骤2的抗体纯化采用正辛酸结合DEAE层析方法;抗体标记采用酶、金溶胶、化学发光、同位素或时间延迟标记法。
3.根据权利要求1所述的同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法,其特征在于所述的步骤3的待测标本选自:需要筛查的、可疑的或在疾病状态的人或动物的体液或介质,包括痰液、血清、尿液、脑脊液或细菌培养液。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述的步骤1的免疫原通过结核杆菌培养滤液中提取、分离、纯化获得,或通过生物工程方法在大肠杆菌、昆虫或酵母系统表达纯化获得。
CN2006100269009A 2006-05-25 2006-05-25 一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法 Expired - Fee Related CN1866023B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2006100269009A CN1866023B (zh) 2006-05-25 2006-05-25 一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2006100269009A CN1866023B (zh) 2006-05-25 2006-05-25 一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1866023A CN1866023A (zh) 2006-11-22
CN1866023B true CN1866023B (zh) 2010-11-03

Family

ID=37425097

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2006100269009A Expired - Fee Related CN1866023B (zh) 2006-05-25 2006-05-25 一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN1866023B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA020412B1 (ru) * 2006-09-05 2014-11-28 Видовре Хоспитал Иммунологический мониторинг на основе ip-10
CN101216491B (zh) * 2008-01-08 2012-06-06 广州益善生物技术有限公司 结核分枝杆菌检测液相芯片及其制备方法
CN101985473B (zh) * 2010-10-12 2011-11-09 浙江大学 抗结核杆菌esat-6单克隆抗体tbef3及应用
CN102426232B (zh) * 2011-09-06 2014-02-26 厦门大学 一种检测结核菌蛋白抗原的试剂盒及其制备方法
CN105486860A (zh) * 2014-10-09 2016-04-13 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 基于特异性多抗的结核分枝杆菌抗原检测方法
CN113354719B (zh) * 2021-05-11 2023-05-30 重庆市畜牧科学院 奇异变形杆菌抗原鉴定及其在检测变形杆菌感染中应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1388378A (zh) * 2002-06-17 2003-01-01 四川大学 结核分枝杆菌诊断检测试剂
WO2004063368A1 (ja) * 2003-01-14 2004-07-29 Japan Science And Technology Agency 結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法、pcr用プライマ−ペアセット、塩基配列決定用プライマ−セット、及び薬剤耐性結核の診断用試薬キット

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1388378A (zh) * 2002-06-17 2003-01-01 四川大学 结核分枝杆菌诊断检测试剂
WO2004063368A1 (ja) * 2003-01-14 2004-07-29 Japan Science And Technology Agency 結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法、pcr用プライマ−ペアセット、塩基配列決定用プライマ−セット、及び薬剤耐性結核の診断用試薬キット

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CN 1388378 A,说明书1-2页.
朱中元.检测结核杆菌抗原的双抗体夹心间接ELISA法的建立及其应用.细胞与分子免疫学杂志 04.1991,(04),64.
朱中元.检测结核杆菌抗原的双抗体夹心间接ELISA法的建立及其应用.细胞与分子免疫学杂志 04.1991,(04),64. *
蔡宏,等.结核分枝杆菌多价核酸疫苗的构建及免疫原性.科学通报47 13.2002,47(13),966-970页.
蔡宏等.结核分枝杆菌多价核酸疫苗的构建及免疫原性.科学通报47 13.2002,47(13),966-970页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN1866023A (zh) 2006-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1866023B (zh) 一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法
CN109254155A (zh) 一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸及制备方法和应用
CN111999492B (zh) 一种联合检验covid-19n抗原和s蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡
Pohanka et al. Diagnosis of tularemia using piezoelectric biosensor technology
CN105542014A (zh) Tp重组抗原及其制备方法和应用
CN105319359A (zh) 人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用
US6458367B1 (en) Method for detecting the presence of a mycobacterium species and a kit and antibodies for use therein
Koralur et al. Scrub typhus diagnosis on acute specimens using serological and molecular assays—a 3-year prospective study
CN1880961A (zh) 一种检测b型金黄色葡萄球菌肠毒素的免疫层析试纸及其制备方法
CN102221616A (zh) 一种鸡毒支原体间接elisa诊断试剂盒
CN106404731A (zh) 一种同时检测细菌性和病毒性脑膜炎的pct与crp双标记时间分辨荧光免疫分析方法
CN113388039B (zh) Sars-cov-2冠状病毒的抗原模拟表位和免疫层析试纸条
CN109374886A (zh) 牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测试剂盒及其应用
CN109851675B (zh) 一种口蹄疫诊断试剂盒及其所用口蹄疫诊断抗原
CN109856396B (zh) 检测口蹄疫病毒感染抗体的酶联免疫试剂盒及其应用
CN204028084U (zh) 人肺炎衣原体量子点免疫层析检测卡
CN1928562B (zh) 一种检测狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒
CN101000347B (zh) 检测土拉热弗朗西斯菌的免疫层析试纸及其制备方法
JP2006234627A (ja) 体液中の結核菌抗原を検出する方法
CN113929773B (zh) 一种抗SARS-CoV-2 S1-RBD单克隆抗体及其应用
CN102095858A (zh) 梅毒心磷脂和特异性抗体IgM免疫印迹试剂盒及其制备
CN201955343U (zh) 梅毒心磷脂和特异性抗体IgM免疫印迹试剂盒
CN105319360A (zh) 人肺炎衣原体量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用
CN105585634B (zh) 抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒
CN105277694A (zh) 人a群链球菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20101103

Termination date: 20200525