CN102426232B - 一种检测结核菌蛋白抗原的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
一种检测结核菌蛋白抗原的试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102426232B CN102426232B CN201110262154.4A CN201110262154A CN102426232B CN 102426232 B CN102426232 B CN 102426232B CN 201110262154 A CN201110262154 A CN 201110262154A CN 102426232 B CN102426232 B CN 102426232B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bottle
- antibody
- kit
- esat6
- cfp10
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
一种检测结核菌蛋白抗原的试剂盒及其制备方法，涉及两种结核菌蛋白抗原。试剂盒设有盒体、PBST洗液瓶、四甲基联苯胺显色液瓶、CFP10-ESAT6蛋白标准样品瓶、PPD蛋白标准样品瓶、样品稀释液瓶、聚苯乙烯酶联检测板、终止液瓶、酶标二抗瓶和上层检测抗体瓶；配制实验试剂；捕获抗体的包被；酶标板的封闭与保存；制备试剂盒其它试剂样品。采用的双抗体夹心法检测结核菌蛋白抗原的ELISA试剂盒及制备方法具有快速、简易、较好的灵敏度和特异性，建立无疑为检测结核病菌的特异蛋白抗原，提供结核病辅助诊断，保护人群健康开辟了新的思路和方法。试剂盒可成为结核病的诊断手段之一，为结核病的防治提供技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及两种结核菌蛋白抗原，尤其是涉及一种检测结核菌蛋白抗原的酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒及其制备方法。
背景技术
结核病已被列为我国重大传染病之一，有近一半的人是结核病带菌者，估计病人数为450万，年发病人数约为130万，约占全球发病的16％。疫情严峻的原因与临床诊断技术和新药研制滞后、防治不力、结核杆菌与人类免疫缺陷病毒(HIV)双重感染以及耐药结核病人数的急剧增加等有关。
目前，已有的结核菌ELISA检测试剂盒主要用于检测人血清中由结核菌感染所产生的抗体的存在来诊断结核病，例如吴雪琼等人在申请号为200810224021.6的中国专利申请中，公开了一种结核抗体多抗原ELISA检测试剂盒及其制备方法。但由于这类诊断方法是建立在正常人体对结核菌入侵能够产生正常免疫反应并导致血清中出现抗体的基础上，它对免疫缺陷、免疫力低下的老人与儿童的感染以及结核菌与艾滋病双重感染等常常造成误诊或漏诊，尤其对肺外感染，如结核性脑膜炎、骨结核和肾结核等更加困难，特别对儿童结核性脑膜炎早期的脑脊液中的结核阳性检出率很低。因此，建立一种简易可行，敏感特异，可以直接检测结核病菌蛋白抗原的诊断方法，对于防治结核病将具有重大的经济和社会效益。
抗原检测一直是确认或评估病原体感染及感染状况较为可靠的方法，且有早期诊断价值，在其他许多疾病诊断方面获得广泛应用。使用此方法检测结核杆菌，必须获得结核杆菌特异性抗原。张彩勤等(张彩勤，张海，赵勇，等.结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B Hsp16.3和ESAT6在血清学检测中的初步应用，现代生物医学进展，2011，3(11)：401-404)探讨了结核分枝杆菌分泌蛋白Hsp16.3 Ag85B以及融合蛋白ESAT6-CFP10 Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6用于TB病人血清学检测的意义。高源等(高源，万康林.对结核分支杆菌蛋白抗原研究进展的综述，中国媒介生物学及控制杂志，2005：16(1)，74-77)对结核分支杆菌蛋白抗原研究进展进行了综述。李红霞(李红霞，结核分枝杆菌特异性抗原/抗体ELlSA检测试剂盒的初步研究，四川大学博士学位论文，2007年5月30日，1-125页)建立了以多克隆抗体作为包被抗体检测结核病人血清中特异性抗原的双抗体夹心ELlSA检测方法，在我们发明试剂盒过程中结核杆菌特异性抗原的选择方面具有一定的参考价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测结核菌蛋白抗原的酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)试剂盒(简称为检测结核菌蛋白抗原的试剂盒)及其制备方法。
本发明采用双抗体夹心法。
所述检测结核菌蛋白抗原的试剂盒设有盒体、PBST洗液瓶、四甲基联苯胺(TMB)显色液瓶、CFP10-ESAT6蛋白标准样品瓶、PPD蛋白标准样品瓶、样品稀释液瓶、聚苯乙烯酶联检测板、终止液瓶、酶标二抗瓶和上层检测抗体瓶；所述PBST洗液瓶、四甲基联苯胺显色液瓶、CFP10-ESAT6蛋白标准样品瓶、PPD蛋白标准样品瓶、样品稀释液瓶、聚苯乙烯酶联检测板、终止液瓶、酶标二抗瓶和上层检测抗体瓶设在盒体内；所述四甲基联苯胺显色液瓶包括显色A液瓶和显色B液瓶；所述上层检测抗体瓶包括CFP10-ESAT6多克隆抗体瓶和阳性抗结核菌体多克隆抗体瓶；所述显色A液的组成为：液醋酸钠(CH3COONa)0.272g，柠檬酸(C6H8O7·H2O)0.032g，双氧水(H2O2 30％)6μl，蒸馏水加至10ml；所述显色B液的组成为：乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)0.004g，柠檬酸(C6H8O7·H2O)0.019g，甘油(C3H8O3)1ml，四甲基联苯胺(TMB)0.004g，蒸馏水加至10ml；所述终止液为2M H2SO4终止液。
所述聚苯乙烯酶联检测板可采用真空包装的聚苯乙烯酶联检测板；
所述2M H2SO4终止液瓶可采用20ml/支。
所述酶标二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠抗体20μl/支分装。
所述一种检测结核菌蛋白抗原的试剂盒的制备方法包括以下步骤：
1)配制实验试剂
(1)包被液(0.1M碳酸盐缓冲液)pH 9.6
碳酸钠(Na2CO3) 0.0318g
碳酸氢钠(NaHCO3) 0.0586g
蒸馏水加至 20ml
(2)磷酸盐缓冲液(PBS)(10×浓缩)
用HCL/NaOH调pH至7.4
(3)封闭液(2％BSA/PBS)
正常牛血清白蛋白(BSA) 0.5g
1×PBS 25ml
(4)0.2％BSA/PBS(样品稀释液)
2％BSA/PBS 2ml
蒸馏水加置 20ml
(5)PBST洗液
10×PBS 100ml
吐温-20 0.5ml
蒸馏水加至 1000ml
(6)辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(已商品化)，20μl/支分装。
(7)显色A液
(8)显色B液
(9)2MH2SO4终止液
取H2SO4 1.105ml，加入到18.92ml的水中，混匀即可。
2)捕获抗体(CFP10-ESAT6单克隆抗体)的包被
将捕获抗体用包被液稀释至2～4μg/ml，按50～100μl/孔的体积加入聚苯乙烯酶联检测板(以下简称酶标板)中，4℃过夜或37℃孵育2～4h后，用PBST洗液洗涤3～5次，拍干；
在步骤2)中，所述包被液可采用pH 9.6的碳酸盐溶液；所述过夜前可用保鲜膜包裹防止蒸发，过夜的温度可为4℃；所述PBST洗液可采用含有0.05％吐温-20的PBS缓冲溶液，所述洗涤可洗涤3～5次。
3)酶标板的封闭与保存
将步骤2)中拍干后的酶标板上的每孔加200μl或加满封闭液，37℃孵育1～2h后，用PBST洗液洗涤3～5次，拍干，真空包装后保存于4℃冰箱(经此步骤操作得到的酶标板为检测试剂盒的组成部分之一)；
在步骤3)中，所述每孔加封闭液的量可为每孔加200μl或加满，所述封闭液可采用1％～2％BSA，所述孵育的时间可为1～2h，所述PBST洗液可采用含有0.05％吐温-20的PBS缓冲溶液，所述洗涤可洗涤3～5次。
4)制备试剂盒其它试剂样品
(1)制备CFP10-ESAT6蛋白标准样品和PPD蛋白标准样品：将CFP10-ESAT6蛋白用PBS稀释成2000～4000ng/ml，PPD蛋白用PBS稀释成2000～4000ng/ml，300μl/支分装。
(2)制备上层检测抗体：上层检测抗体包括CFP10-ESAT6多克隆抗体和阳性抗结核菌体多克隆抗体，20μl/支分装。
本发明针对目前所广泛采用的结核病免疫学检测方法的局限，选定以检测结核病菌蛋白抗原为主攻方向，提供了一种能够快速，敏感特异地鉴定结核菌蛋白抗原的ELISA检测试剂盒。
本发明所述的双抗体夹心法检测结核菌蛋白抗原的ELISA试剂盒及制备方法具有快速、简易、较好的灵敏度和特异性，尽管尚需对不同结核病人样品加以进一步研究与确定，但这一试剂盒及其制备方法的建立无疑为检测结核病菌的特异蛋白抗原，提供结核病辅助诊断，保护人群健康开辟了新的思路和方法。本试剂盒可成为结核病的诊断手段之一，为结核病的防治提供技术支持。
附图说明
图1为ELISA法筛选能识别结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)的多克隆抗体。在图1中，横坐标为抗体稀释度，纵坐标为吸光值(450nm)；标记▲为HspX多抗，◆为CE6多抗，■为阳性兔血清，●为阴性兔血清。
图2为ELISA法筛选能识别结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)的单克隆抗体。在图2中，横坐标为抗体稀释度，纵坐标为吸光值(450nm)；标记■为mAg85b，▲为mCE6，
为mET6，◆为mHspX，●为p阴性多抗。
图3为ELISA法筛选能识别结核菌特异融合蛋白CFP10-ESAT6的多克隆抗体。在图3中，横坐标为抗体稀释度，纵坐标为吸光值(450nm)；标记■为CE6多抗，◆为Ag85b多抗，▲为阳性兔血清，●为阴性兔血清，■为HspX多抗。
图4为ELISA法筛选能识别结核菌特异融合蛋白CFP10-ESAT6的单克隆抗体。在图4中，横坐标为抗体稀释度，纵坐标为吸光值(450nm)；标记◆为HspX单抗，■为ET6单抗，▲为CE6单抗，●为Ag85b单抗。
图5为CFP10-ESAT6单克隆抗体(mCE6)与阳性抗结核菌体多克隆抗体组合配对检测结核菌素蛋白(PPD)。在图5中，横坐标为抗原浓度(ng/ml)，纵坐标为吸光值(450nm)；标记◆为1实验组，●为2阴性对照组，▲为3阴性对照组。
图6为CFP10-ESAT6多克隆抗体作为捕获抗体与其单克隆抗体配对检测结核菌特异蛋白CFP10-ESAT6。在图6中，横坐标为抗原浓度(ng/ml)，纵坐标为吸光值(450nm)；标记◆为1实验组，■为2阴性对照组，▲为3阴性对照组，●为4阴性对照组。
图7为CFP10-ESAT6单克隆抗体作为捕获抗体与其多克隆抗体配对检测结核菌特异蛋白(抗原)CFP10-ESAT6。在图7中，横坐标为抗原浓度(ng/ml)，纵坐标为吸光值(450nm)；标记◆为1实验组，●为2阴性对照组，▲为3阴性对照组，■为4阴性对照组。
图8为本发明所述检测结核菌蛋白抗原的试剂盒实施例的结构组成示意图。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
图8给出本发明所述检测结核菌蛋白抗原的试剂盒实施例的结构组成示意图。所述检测结核菌蛋白(抗原)的试剂盒实施例设有盒体P、PBST洗液瓶1、显色A液瓶21、显色B液瓶22、CFP10-ESAT6蛋白标准样品瓶3、PPD蛋白标准样品瓶4、样品稀释液瓶5、聚苯乙烯酶联检测板6、2M H2SO4终止液瓶7、酶标二抗瓶8、CFP10-ESAT6多克隆抗体瓶91和阳性抗结核菌体多克隆抗体瓶92；所述PBST洗液瓶1、显色A液瓶21、显色B液瓶22、CFP10-ESAT6蛋白标准样品瓶3、PPD蛋白标准样品瓶4、样品稀释液瓶5、聚苯乙烯酶联检测板6、2M H28O4终止液瓶7、酶标二抗瓶8、CFP10-ESAT6多克隆抗体瓶91和阳性抗结核菌体多克隆抗体瓶92设在盒体P内。
所述聚苯乙烯酶联检测板6可采用真空包装的聚苯乙烯酶联检测板。
所述2M H2SO4终止液瓶采用12ml/支。
所述酶标二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠抗体20μl/支分装。
以下给出所述一种检测结核菌蛋白抗原的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1)配制实验试剂
(1)包被液(0.1M碳酸盐缓冲液)pH 9.6
碳酸钠(Na2CO3) 0.0318g
碳酸氢钠(NaHCO3) 0.0586g
蒸馏水加至 20ml
(2)磷酸盐缓冲液(PBS)(10×浓缩)
用HCL/NaOH调pH至7.4
(3)封闭液(2％BSA/PBS)
正常牛血清白蛋白(BSA) 0.5g
1×PBS 25ml
(4)0.2％BSA/PBS(样品稀释液)
2％BSA/PBS 2ml
蒸馏水加置 20ml
(5)PBST洗液
10×PBS 100ml
吐温-20 0.5ml
蒸馏水加至 1000ml
(6)辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(商品化)，20μl/支分装。
(7)显色A液
(8)显色B液
(9)2M H2SO4终止液
取H2SO4 1.105ml，加入到18.92ml的水中，混匀即可。
2)捕获抗体(CFP10-ESAT6单克隆抗体)的包被
将捕获抗体用包被液稀释至2～4μg/ml，按50～100μl/孔的体积加入酶标板中，4℃过夜或37℃孵育2～4h后，用PBST洗液洗涤3～5次，拍干；
在步骤2)中，所述包被液可采用pH 9.6的碳酸盐溶液；所述过夜前可用保鲜膜包裹防止蒸发，过夜的温度可为4℃；所述PBST洗液可采用含有0.05％吐温-20的PBS缓冲溶液，所述洗涤可洗涤3～5次。
3)酶标板的封闭与保存
将步骤2)中拍干后的酶标板上的每孔加200μl或加满封闭液，37℃孵育1～2h后，用PBST洗液洗涤3～5次，拍干，真空包装后保存于4℃冰箱(经此步骤操作得到的酶标板为检测试剂盒的组成部分之一)；
在步骤3)中，所述每孔加封闭液的量可为每孔加200μl或加满，所述封闭液可采用1～2％BSA，所述孵育的时间可为1～2h，所述PBST洗液可采用含有0.05％吐温-20的PBS缓冲溶液，所述洗涤可洗涤3～5次。
4)制备试剂盒其他实际样品
(1)制备CFP10-ESAT6蛋白标准样品和PPD蛋白标准样品：将CFP10-ESAT6蛋白用PBS稀释成2000～4000ng/ml，PPD蛋白用PBS稀释成2000～4000ng/ml，300μl/支分装。
(2)制备上层检测抗体：上层检测抗体包括CFP10-ESAT6多克隆抗体和阳性抗结核菌体多克隆抗体，20μl/支分装。
图1给出ELISA法筛选能识别结核菌素蛋白(PPD)的多克隆抗体。利用所获得和纯化的，针对CFP10-ESAT6(CE6)、HspX抗原的多克隆抗体，以及抗结核菌体蛋白阳性兔多克隆抗体(阳性兔血清)进行识别结核菌素蛋白(PPD)的测试，以阴性兔血清为阴性对照，用2μg/ml的PPD包被，每个抗体采用梯度稀释法进行测试(稀释范围从1∶400至1∶51200)。结果显示这些多克隆抗体都可以识别人结核菌素蛋白PPD，其中以抗结核菌阳性多克隆抗体识别PPD的效价最高。
图2给出ELISA法筛选能识别结核菌素蛋白(PPD)的单克隆抗体。利用所获得的抗Ag85b，CFP10-ESAT6(CE6)，ESAT6(ET6)和抗HspX结核菌蛋白的单克隆抗体进行识别人结核菌素蛋白PPD的测试。用2μg/m1的PPD包被酶标板，各个抗体做梯度稀释(稀释范围从1∶1600至1∶51200)检测，阴性多克隆抗体为对照。结果显示，CFP10-ESAT6(CE6)单克隆抗体识别结核菌素蛋白(PPD)的效果最好。
图3给出ELISA法筛选能识别结核菌特异融合蛋白CFP10-ESAT6的多克隆抗体。用2μg/ml纯化好的结核菌特异融合蛋白CFP10-ESAT6包被酶标板，对各个采用梯度稀释法(稀释范围从1∶400至1∶51200)稀释的多克隆抗体如CFP10-ESAT6(CE6)，Ag85b，HspX，结核菌体蛋白阳性兔多克隆抗体进行检测，用阴性兔血清为对照。结果显示，CFP10-ESAT6多克隆抗体识别CFP10-ESAT6融合蛋白的效价最高，其次为结核菌体蛋白阳性兔多克隆抗体，其余为阴性。
图4给出ELISA法筛选能识别结核菌特异融合蛋白CFP10-ESAT6的单克隆抗体。用2μg/ml纯化了的结核菌特异融合蛋白CFP10-ESAT6包被酶标板，将抗融合蛋白CFP10-ESAT6，HspX，ESAT6，Ag85b的单克隆抗体分别梯度稀释后检测(稀释范围从1∶400至1∶51200)，结果显示CFP10-ESAT6单克隆抗体识别CFP10-ESAT6融合蛋白的效价最高，其余单克隆抗体识别该融合蛋白的效价都比较低。
图5给出CFP10-ESAT6单克隆抗体(mCE6)与阳性抗结核菌体多克隆抗体组合配对检测结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)。
以3μg/ml的CFP10-ESAT6单克隆抗体做捕获抗体，阳性抗结核菌体多克隆抗体为上层检测抗体，其稀释度为1∶2500。用该组合配对检测结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)的效果比用阳性多克隆抗体做捕获抗体和用CFP10-ESAT6单克隆抗体做检测抗体要好，可以分辨出结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)的最低浓度约为125ng/ml。图中1号为实验组，用3μg/ml的CFP10-ESAT6单克隆抗体包被，检测抗原为经梯度稀释的人结核菌素PPD(稀释范围从4000ng/ml到0ng/ml)，上层检测抗体为阳性抗结核菌体多克隆抗体(稀释度为1∶2500)。2号为阴性对照组，用3μg/ml的CFP10-ESAT6单克隆抗体包被；检测抗原为经梯度稀释的结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)(稀释范围从4000ng/ml到0ng/ml)；上层检测抗体为阴性多克隆抗体(稀释度为1∶2500)。3号为阴性对照组，用3μg/ml的CFP10-ESAT6单克隆抗体包被，检测抗原为经梯度稀释的Ag85b蛋白(稀释范围从4000ng/ml到0ng/ml)，上层检测抗体为阳性多克隆抗体(稀释度为1∶2500)。
图6和图7给出以CFP10-ESAT6多克隆抗体和CFP10-ESAT6单克隆抗体配对组合检测结核菌特异蛋白CFP10-ESAT6。其中图6给出以CFP10-ESAT6多克隆抗体为捕获抗体，CFP10-ESAT6单克隆抗体为检测抗体配对检测结核菌特异蛋白CFP10-ESAT6。
以稀释2500倍的CFP10-ESAT6多克隆抗体做捕获抗体，3μg/ml的CFP10-ESAT6单克隆抗体为上层检测抗体检测结核菌融合蛋白CFP10-ESAT6，测出其最低浓度可达约15ng/ml。图中1号为实验组，以稀释2500倍的CFP10-ESAT6多克隆抗体包被，检测抗原为CFP10-ESAT6蛋白(稀释范围从1000ng/ml到0ng/ml)，上层检测抗体为CFP10-ESAT6单克隆抗体(稀释浓度为3μg/ml)。2号为阴性对照组，以稀释2500倍的CFP10-ESAT6多克隆抗体包被，检测抗原为结核菌特异蛋白Ag85b(稀释范围从1000ng/ml到0ng/ml)，上层检测抗体为CFP10-ESAT6单克隆抗体(稀释浓度为3μg/ml)。3号为阴性对照组，以稀释2500倍的CFP10-ESAT6多克隆抗体包被，检测抗原为CFP10-ESAT6(稀释范围从1000ng/ml到0ng/ml)；上层检测抗体为Ag85b单克隆抗体(稀释浓度为3μg/ml)。4号为阴性对照组，以稀释2500倍的阴性多克隆抗体包被，检测抗原为CFP10-ESAT6(稀释范围从1000ng/ml到0ng/ml)；上层检测抗体为CFP10-ESAT6单克隆抗体(稀释浓度为3μg/ml)。
图7给出以CFP10-ESAT6单克隆抗体为捕获抗体，CFP10-ESAT6多克隆抗体为检测抗体配对检测结核菌特异蛋白CFP10-ESAT6。
以3μg/ml的CFP10-ESAT6单克隆抗体做捕获抗体，稀释2500倍的CFP10-ESAT6多克隆抗体做为上层检测抗体检测结核菌融合蛋白CFP10-ESAT6比以CFP10-ESAT6多克隆抗体做为捕获抗体的效果更好，可以分辨出结核菌素蛋白(PPD)的最低浓度可达约10ng/ml。图中1号为实验组，用3μg/ml的CFP10-ESAT6单克隆抗体包被，检测抗原为CFP10-ESAT6(稀释范围从2000ng/ml到0ng/ml)，上层检测抗体为CFP10-ESAT6多克隆抗体(稀释度为1∶2500)。2号为阴性对照组，用3μg/ml的CFP10-ESAT6单克隆抗体包被，检测抗原为CFP10-ESAT6(稀释范围从2000ng/ml到0ng/ml)，上层检测抗体为阴性多克隆抗体(稀释度为1∶2500)。3号为阴性对照组，用3μg/ml的CFP10-ESAT6单克隆抗体包被，检测抗原为结核菌特异抗原Ag85b(稀释范围从2000ng/ml到0ng/ml)；上层检测抗体为CFP10-ESAT6多克隆抗体(稀释度为1∶2500)。4号为阴性对照组，用3μg/ml的Ag85b单克隆抗体包被；检测抗原为CFP10-ESAT6(稀释范围从2000ng/ml到0ng/ml)，上层检测抗体为CFP10-ESAT6多克隆抗体(稀释度为1∶2500)。
经过大量的实验测试，筛选出了两对适合用夹心ELISA配对检测结核菌蛋白(抗原)的抗体，它们分别为CFP10-ESAT6单克隆抗体和CFP10-ESAT6多克隆抗体配对，用于检测CFP10-ESAT6结核菌融合蛋白(图7)；CFP10-ESAT6单克隆抗体和阳性抗结核菌体多克隆抗体配对，用于检测结核菌素蛋白(PPD)(图5)。并对抗体配对条件，结核菌蛋白(抗原)包被浓度，捕获抗体和检测抗体的稀释比例，结核菌特异蛋白的检测浓度，抗体位置，标准曲线的制备等条件进行摸索和优化。发明了这个检测结核菌蛋白(抗原)的ELISA试剂盒。
本发明中所检测的两种结核杆菌特异性抗原标志物为结核菌素蛋白(PPD)和CFP10-ESAT6结核菌融合蛋白。其中，结核菌素蛋白(PPD)是从结核杆菌培养滤液中获得的复合蛋白质，含有多种抗原成分，是较早就被用于建立ELISA方法检测结核病的混合抗原，虽然用作为检测抗原存在特异性低的缺点，但是目前还没有发现在检测效果上可以完全取代PPD的其他抗原。CEP10和ESAT6都是结核杆菌早期分泌的蛋白，用于检测结核杆菌的特异性较强，而且据文献报道，以CFP10-ESAT6结核菌融合蛋白作为检测抗原的灵敏度可达到77.3％。因此，我们的试剂盒采用双抗体ELISA夹心法对结核菌素蛋白(PPD)和CFP10-ESAT6结核菌融合蛋白进行联合检测，能有效地提高对结核杆菌检测的特异性和灵敏度。
本发明利用基因工程和蛋白重组技术，获得了一些重组的结核菌特异蛋白如结核分枝杆菌培养滤过蛋白10(Culture filtrate protein 10，简写为CFP10)和早期分泌性抗原靶6(Earlysecretory antigen target 6，简写为ESAT6)的融合蛋白(简写为CFP10-ESAT6)；抗原85复合蛋白质b(简写为Ag85b)和热休克蛋白X(Heat shock protein X，简写为HspX)，结核菌素蛋白(PPD)等，并利用这些结核菌特异蛋白以及灭活的结核菌株免疫动物制备了相应的多克隆和单克隆抗体，分别获得了针对Ag85b、CFP10-ESAT6、ESAT6、HspX抗原的单克隆抗体和多克隆抗体，以及阳性抗结核菌体兔多克隆抗体(阳性兔血清)，和阴性抗结核菌体兔多克隆抗体(阴性兔血清)并对这些单克隆和多克隆抗体进行了纯化。将纯化后的这些单克隆和多克隆抗体进行各种优化组合配对并测试不同抗体的灵敏度和效价，旨在寻找一对能识别同一结核菌蛋白的抗体并配制检测试剂盒。经反复筛选，根据图1～4的结果，本发明筛出了两对适合用夹心ELISA配对检测结核菌蛋白的抗体，分别为CFP10-ESAT6单克隆抗体和CFP10-ESAT6多克隆抗体配对可用于检测CFP10-ESAT6结核菌融合蛋白；CFP10-ESAT6单克隆抗体和阳性抗结核菌体多克隆抗体配对可用于检测结核菌素蛋白(PPD)。
本发明针对这两对抗体组合进行了结核菌蛋白抗原包被浓度，捕获抗体和检测抗体的稀释比例，结核菌特异蛋白的检测浓度，抗体位置等条件的摸索和优化。结果表明，CFP10-ESAT6单克隆抗体和CFP10-ESAT6多克隆抗体配对可以达到检测结核菌融合蛋白CFP10-ESAT6的效果(图6，7)，而以CFP10-ESAT6单克隆抗体做捕获抗体，CFP10-ESAT6多克隆抗体做检测抗体的组合检测效果更好，最微量的CFP10-ESAT6蛋白检测浓度可达10ng/ml(图7)；CFP10-ESAT6单克隆抗体和阳性抗结核菌体多克隆抗体配对可以达到检测人结核菌素蛋白(PPD)的效果，而以CFP10-ESAT6单克隆抗体做捕获抗体，阳性抗结核菌体多克隆抗体做检测抗体的检测效果更好，最微量的结核菌素蛋白(PPD)检测浓度可达125ng/ml(图5)。我们采用配对效果最好的两对抗体组合，发明了这个检测结核菌蛋白(抗原)的ELISA试剂盒。它的特点是采用双抗体ELISA夹心法同时进行联合检测两种结核菌蛋白(抗原)，能有效地提高对结核杆菌检测的特异性和灵敏度。
以下给出所述检测结核菌蛋白抗原的试剂盒的使用方法
1)加入标准样品及待测样品：
取出制作的已封闭的酶标板，前4列每孔预先加入100μl样品稀释液，取100μlCFP10-ESAT6蛋白标准样品加入第1列的第1孔，在第1孔混匀后取100μl加入第2孔，依次向下倍比稀释，第2列操作重复第1列；取100μl PPD蛋白标准样品加入第3列的第1孔，在第1孔混匀后取100μl加入第2孔，依次向下倍比稀释，第4列操作重复第3列；其余各孔可用于加待测样品(如病人血清，痰液等)，每孔加50～100μl，每个待测样品加样2次。37℃孵育1～2h，用PBST洗液洗涤3～5次，拍干。
2)加上层检测抗体：
将上层检测抗体(抗体A：CFP10-ESAT6多克隆抗体；抗体B：抗阳性结核菌体多克隆抗体)分别用样品稀释液稀释2500倍。向上述用CFP10-ESAT6蛋白标准样品孵育过的第1、2列中按100μl/孔的量加入稀释的CFP10-ESAT6多克隆抗体；向用PPD蛋白标准样品孵育过的第3、4列中按100μl/孔的量加入稀释的阳性抗结核菌体多克隆抗体；用同一待测样品孵育的两个孔，其中一个加100μl稀释后的CFP10-ESAT6多克隆抗体，另一孔加阳性抗结核菌体多克隆抗体。37℃孵育1～1.5h，用PBST洗液洗涤3～5次，拍干。
3)加入酶标二抗：
将试剂盒中的二抗用样品稀释液稀释5000～8000倍，
按100μl/孔的量加入上一步的酶标板中，37℃孵育45～60分钟，用PBST洗液洗涤4～5次，拍干；
4)显色反应：
将含显色A液和显色B液等体积混合，按100μl/孔的体积加入酶标板，避光显色5～10min；
5)终止反应：
将终止液，按100μl/孔的体积加入酶标板以终止显色反应；
6)读数：
用酶标仪以450nm单波长测定各孔吸光值，作图分析。将酶标板第1、2两排的读值取平均值，绘制吸光值随CFP10-ESAT6蛋白浓度变化的标准曲线；同理将第3、4两排的读值取平均值，绘制吸光值随PPD蛋白浓度变化的标准曲线；根据读取的待测样品吸光值分别带入在所对应的标准曲线，计算出样品中CFP10-ESAT6蛋白和PPD蛋白的含量，以此作为诊断结核病的参考值。
Claims (7)
1.一种检测结核菌蛋白抗原的试剂盒，其特征在于设有盒体、PBST洗液瓶、四甲基联苯胺显色液瓶、CFP10-ESAT6蛋白标准样品瓶、PPD蛋白标准样品瓶、样品稀释液瓶、聚苯乙烯酶联检测板、终止液瓶、酶标二抗瓶和上层检测抗体瓶；所述PBST洗液瓶、四甲基联苯胺显色液瓶、CFP10-ESAT6蛋白标准样品瓶、PPD蛋白标准样品瓶、样品稀释液瓶、聚苯乙烯酶联检测板、终止液瓶、酶标二抗瓶和上层检测抗体瓶设在盒体内；所述四甲基联苯胺显色液瓶包括显色A液瓶和显色B液瓶；所述显色A液的组成为：液醋酸钠0.272g，柠檬酸0.032g，双氧水6μl，蒸馏水加至10ml；所述显色B液的组成为：乙二胺四乙酸二钠0.004g，柠檬酸0.019g，甘油1ml，四甲基联苯胺0.004g，蒸馏水加至10ml；所述上层检测抗体瓶包括CFP10-ESAT6多克隆抗体瓶和阳性抗结核菌体多克隆抗体瓶；所述终止液为2M H2SO4终止液。
2.如权利要求1所述的一种检测结核菌蛋白抗原的试剂盒，其特征在于所述聚苯乙烯酶联检测板采用真空包装的聚苯乙烯酶联检测板。
3.如权利要求1所述的一种检测结核菌蛋白抗原的试剂盒，其特征在于所述2M H2SO4终止液瓶采用20ml/支。
4.如权利要求1所述的一种检测结核菌蛋白抗原的试剂盒，其特征在于所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体，20μl/支分装。
5.如权利要求1所述的一种检测结核菌蛋白抗原的试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）配制实验试剂
（1）包被液：0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6，所述碳酸盐缓冲液的组成为：碳酸钠0.0318g，碳酸氢钠0.0586g，蒸馏水加至20ml；
（2）磷酸盐缓冲液：10×浓缩，所述磷酸盐缓冲液的组成为：氯化钠16g，氯化钾0.4g，磷酸二氢钾0.48g，磷酸氢二钠7.16g，蒸馏水加至200ml，用HCL/NaOH调pH至7.4；
（3）封闭液：2%BSA/PBS，所述封闭液的组成为：正常牛血清白蛋白0.5g，1×PBS25ml；
（4）样品稀释液：0.2%BSA/PBS，所述样品稀释液的组成为：2%BSA/PBS2ml，蒸馏水加至20ml；
（5）PBST洗液：所述PBST洗液的组成为：10×PBS100ml，吐温-200.5ml，蒸馏水加至1000ml；
（6）辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，20μl/支分装；
（7）显色A液：所述显色A液的组成为：液醋酸钠0.272g，柠檬酸0.032g，双氧水6μl，蒸馏水加至10ml；
（8）显色B液：所述显色B液的组成为：乙二胺四乙酸二钠0.004g，柠檬酸0.019g，甘油1ml，四甲基联苯胺0.004g，蒸馏水加至10ml；
（9）2M H2SO4终止液：取H2SO41.105ml，加入到18.92ml的水中，混匀即可；
2）捕获抗体：CFP10-ESAT6单克隆抗体的包被
将捕获抗体用包被液稀释至2～4μg/ml，按50～100μl/孔的体积加入聚苯乙烯酶联检测板中，4℃过夜或37℃孵育2～4h后，用PBST洗液洗涤3～5次，拍干；
3）聚苯乙烯酶联检测板的封闭与保存
将步骤2）中拍干后的聚苯乙烯酶联检测板上的每孔加200μl或加满封闭液，37℃孵育1～2h后，用PBST洗液洗涤3～5次，拍干，真空包装后保存于4℃冰箱；
4）制备试剂盒其它试剂样品
（1）制备CFP10-ESAT6蛋白标准样品和PPD蛋白标准样品：将CFP10-ESAT6蛋白用PBS稀释成2000～4000ng/ml，PPD蛋白用PBS稀释成2000～4000ng/ml，300μl/支分装；
（2）制备上层检测抗体：上层检测抗体包括CFP10-ESAT6多克隆抗体和阳性抗结核菌体多克隆抗体，20μl/支分装。
6.如权利要求5所述的一种检测结核菌蛋白抗原的试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤2）中，所述包被液采用pH9.6的碳酸盐溶液；所述过夜前用保鲜膜包裹防止蒸发，过夜的温度为4℃。
7.如权利要求5所述的一种检测结核菌蛋白抗原的试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤3）中，所述每孔加封闭液的量为每孔加200μl或加满。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110262154.4A CN102426232B (zh) | 2011-09-06 | 2011-09-06 | 一种检测结核菌蛋白抗原的试剂盒及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110262154.4A CN102426232B (zh) | 2011-09-06 | 2011-09-06 | 一种检测结核菌蛋白抗原的试剂盒及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102426232A CN102426232A (zh) | 2012-04-25 |
| CN102426232B true CN102426232B (zh) | 2014-02-26 |
Family
ID=45960237
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110262154.4A Expired - Fee Related CN102426232B (zh) | 2011-09-06 | 2011-09-06 | 一种检测结核菌蛋白抗原的试剂盒及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102426232B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104101716A (zh) * | 2014-07-22 | 2014-10-15 | 重庆澳龙生物制品有限公司 | 一种羊棘球蚴elisa抗体检测试剂盒 |
| CN105486860A (zh) * | 2014-10-09 | 2016-04-13 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 基于特异性多抗的结核分枝杆菌抗原检测方法 |
| CN107589250B (zh) * | 2017-09-28 | 2020-08-25 | 国家食品安全风险评估中心 | Tmb双组份显色液及具有其的试剂盒 |
| CN110133263A (zh) * | 2019-05-22 | 2019-08-16 | 广州爱康生物技术有限公司 | 一种毛孢子菌的检测试剂盒及其制备方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5597735A (en) * | 1992-05-11 | 1997-01-28 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Health And Welfare | Glycolipids for serodiagnosis of tuberculosis and leprosy |
| JP2001181298A (ja) * | 1999-12-22 | 2001-07-03 | Iatron Lab Inc | 抗結核菌３８ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体並びに結核菌３８ｋＤａタンパク質の免疫学的分析方法及び分析用試薬 |
| CN1388378A (zh) * | 2002-06-17 | 2003-01-01 | 四川大学 | 结核分枝杆菌诊断检测试剂 |
| RU2003123134A (ru) * | 2003-07-29 | 2005-03-10 | ООО "Фирма "БиоМедИнвест" (RU) | Способ диагностики туберкулезной инфекции, рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая синтез гибридного белка cfp10-esat6 m.tuberculosis, и способ его получения |
| CN1866023A (zh) * | 2006-05-25 | 2006-11-22 | 上海市肺科医院 | 一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法 |
| CN101419237A (zh) * | 2008-09-03 | 2009-04-29 | 深圳市东湖医院 | 结核菌感染的酶联免疫斑点诊断试剂盒及特异性抗原制取方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6545130B2 (en) * | 1997-06-04 | 2003-04-08 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Monoclonal antibodies to mycobacterium tuberculosis and a modified ELISA assay |
-
2011
- 2011-09-06 CN CN201110262154.4A patent/CN102426232B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5597735A (en) * | 1992-05-11 | 1997-01-28 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Health And Welfare | Glycolipids for serodiagnosis of tuberculosis and leprosy |
| JP2001181298A (ja) * | 1999-12-22 | 2001-07-03 | Iatron Lab Inc | 抗結核菌３８ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体並びに結核菌３８ｋＤａタンパク質の免疫学的分析方法及び分析用試薬 |
| CN1388378A (zh) * | 2002-06-17 | 2003-01-01 | 四川大学 | 结核分枝杆菌诊断检测试剂 |
| RU2003123134A (ru) * | 2003-07-29 | 2005-03-10 | ООО "Фирма "БиоМедИнвест" (RU) | Способ диагностики туберкулезной инфекции, рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая синтез гибридного белка cfp10-esat6 m.tuberculosis, и способ его получения |
| CN1866023A (zh) * | 2006-05-25 | 2006-11-22 | 上海市肺科医院 | 一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法 |
| CN101419237A (zh) * | 2008-09-03 | 2009-04-29 | 深圳市东湖医院 | 结核菌感染的酶联免疫斑点诊断试剂盒及特异性抗原制取方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 唐宇龙.重组融合蛋白CFP10-ESAT6在结核病血清学诊断中的初步应用.《西部医学》.2008,第20卷(第4期), |
| 李红霞.结核分枝杆菌特异性抗原/抗体ELISA检测试剂盒的初步研究.《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》.2008, |
| 结核分枝杆菌特异性抗原/抗体ELISA检测试剂盒的初步研究;李红霞;《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》;20080430;第E060-3页 * |
| 重组融合蛋白CFP10-ESAT6在结核病血清学诊断中的初步应用;唐宇龙;《西部医学》;20080731;第20卷(第4期);第854-856页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102426232A (zh) | 2012-04-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cavalera et al. | A multi-target lateral flow immunoassay enabling the specific and sensitive detection of total antibodies to SARS COV-2 | |
| JP7260192B2 (ja) | マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出法およびキット | |
| Verkooyen et al. | Age-related interference with Chlamydia pneumoniae microimmunofluorescence serology due to circulating rheumatoid factor | |
| Steel et al. | Rapid Wuchereria bancrofti-specific antigen Wb123-based IgG4 immunoassays as tools for surveillance following mass drug administration programs on lymphatic filariasis | |
| CN102426232B (zh) | 一种检测结核菌蛋白抗原的试剂盒及其制备方法 | |
| CN107765002A (zh) | 一种胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用 | |
| Zhu et al. | A highly sensitive dual-color lateral flow immunoassay for brucellosis using one-step synthesized latex microspheres | |
| CN102081018A (zh) | 样品的预处理方法及hcv的免疫测定方法 | |
| CN111413507B (zh) | 检测s蛋白rbd抗体评价恢复期血浆抗病毒能力的方法 | |
| CN103308684A (zh) | 一种猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒 | |
| Fadeel et al. | Rapid diagnosis of typhoid fever by enzyme-linked immunosorbent assay detection of Salmonella serotype Typhi antigens in urine | |
| CN101403759A (zh) | 蓝舌病病毒抗原的elisa检测方法及试剂盒 | |
| Kimuda et al. | Humoral Responses to Rv1733c, Rv0081, Rv1735c, and Rv1737c DosR Regulon‐Encoded Proteins of Mycobacterium tuberculosis in Individuals with Latent Tuberculosis Infection | |
| CN102768276A (zh) | 脂环酸芽孢杆菌的间接elisa检测试剂盒及其应用 | |
| Lindberg et al. | Enzyme immunoassay of the antibody response to Brucella and Yersinia enterocolitica 09 infections in humans | |
| Liao et al. | Development and clinical application of a rapid SARS‐CoV‐2 antibody test strip: A multi‐center assessment across China | |
| Saile et al. | Antibody responses to a spore carbohydrate antigen as a marker of nonfatal inhalation anthrax in rhesus macaques | |
| CN113848325A (zh) | 肺炎支原体及肺炎衣原体抗体联检试剂盒、其制备方法及检测方法 | |
| CN103364552A (zh) | 猪细小病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法和其应用 | |
| CN108169475A (zh) | 一种呼吸道合胞病毒IgM抗体检测试剂盒 | |
| CN104502605A (zh) | 检测犬弓形虫IgM抗体的ELISA试剂盒及其制备方法 | |
| Lawrence et al. | Efficacy of enzyme-linked immunosorbent assay for rapid diagnosis of Bordetella pertussis infection | |
| Harinath et al. | A cocktail of affinity-purified antibodies reactive with diagnostically useful mycobacterial antigens ES-31, ES-43, and EST-6 for detecting the presence of Mycobacterium tuberculosis | |
| CN102081092A (zh) | 一种结核分枝杆菌的试剂盒及其检测方法 | |
| de Neergaard et al. | Invasive streptococcal infection can lead to the generation of cross-strain opsonic antibodies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140226 Termination date: 20190906 |