EA020412B1 - Иммунологический мониторинг на основе ip-10 - Google Patents

Иммунологический мониторинг на основе ip-10 Download PDF

Info

Publication number
EA020412B1
EA020412B1 EA200970246A EA200970246A EA020412B1 EA 020412 B1 EA020412 B1 EA 020412B1 EA 200970246 A EA200970246 A EA 200970246A EA 200970246 A EA200970246 A EA 200970246A EA 020412 B1 EA020412 B1 EA 020412B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
level
antigen
sample
test
infection
Prior art date
Application number
EA200970246A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200970246A1 (ru
Inventor
Мортен Рювальд
Пернилле Равн
Джеспер Эуген-Олсен
Original Assignee
Видовре Хоспитал
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Видовре Хоспитал filed Critical Видовре Хоспитал
Publication of EA200970246A1 publication Critical patent/EA200970246A1/ru
Publication of EA020412B1 publication Critical patent/EA020412B1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56927—Chlamydia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/32—Mycobacterium
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • G01N2333/16—HIV-1, HIV-2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/295—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Chlamydiales (o)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/35—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/44—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from protozoa
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Jellies, Jams, And Syrups (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Данное изобретение касается иммунологического способа, в частности способа диагностирования инфекции, вызванной микроорганизмом, включающего этапы, на которых а) инкубируют образец, включающий Т-клетки, полученные у субъекта, по меньшей мере с одним специфическим пептидным тест-антигеном микроорганизма, b) определяют специфический опосредованный Т-клетками иммунный ответ на тест-антиген путем измерения IP-10 уровня в указанном образце, с) сравнивают определенный IP-10 уровень с контрольным уровнем, и d) определяют, что указанный субъект инфицирован указанным микроорганизмом, если определенный IP-10 уровень равен или выше контрольного уровня, и/или определяют, что указанный субъект не инфицирован указанным микроорганизмом, если указанный определенный IP-10 уровень ниже контрольного уровня, где указанный микроорганизм выбран из группы, включающей грамположительные бактерии, грамотрицательные бактерии, Listeria, энтерококки, Neisseria, вибрион, трепонема, Borrelia, лептоспира, Chlamydia, ретровирусы (ВИО, ВИЧ-1 и ВИЧ-2), цитомегаловирус, поксвирусы, вирус Эпштейна-Барра, энтеровирус, морбилливирус, рабдовирусы, рубивирус, флавивирусы, вирусы герпеса, вирус Варицелла-Зостер, гепатит С и В, лейшманию, Toxoplasma gondii, трипаносому, плазмодий, Pneumocystis cariini, коронавирус, вирус Эбола или марбургский вирус и различные нематоды, трематоды. Способы по данному изобретению применяются в терапевтических и диагностических протоколах для человека и в ветеринарии для домашнего скота и диких животных, таким образом, данное изобретение дополнительно касается способа диагностирования инфекции у млекопитающего.

Description

(57) Данное изобретение касается иммунологического способа, в частности способа диагностирования инфекции, вызванной микроорганизмом, включающего этапы, на которых а) инкубируют образец, включающий Т-клетки, полученные у субъекта, по меньшей мере с одним специфическим пептидным тест-антигеном микроорганизма, Ь) определяют специфический опосредованный Т-клетками иммунный ответ на тест-антиген путем измерения №-10 уровня в указанном образце, с) сравнивают определенный №-10 уровень с контрольным уровнем, и Н) определяют, что указанный субъект инфицирован указанным микроорганизмом, если определенный ΙΡ-10 уровень равен или выше контрольного уровня, и/или определяют, что указанный субъект не инфицирован указанным микроорганизмом, если указанный определенный ΙΡ-10 уровень ниже контрольного уровня, где указанный микроорганизм выбран из группы, включающей грамположительные бактерии, грамотрицательные бактерии, Ыз1епа, энтерококки, №1ззепа, вибрион, трепонема, ВоггеНа, лептоспира, СЫатуЛа, ретровирусы (ВИО, ВИЧ-1 и ВИЧ-2), цитомегаловирус, поксвирусы, вирус ЭпштейнаБарра, энтеровирус, морбилливирус, рабдовирусы, рубивирус, флавивирусы, вирусы герпеса, вирус Варицелла-Зостер, гепатит С и В, лейшманию, Тохор1азта допНН, трипаносому, плазмодий, РпеитосузНз сагит, коронавирус, вирус Эбола или марбургский вирус и различные нематоды, трематоды. Способы по данному изобретению применяются в терапевтических и диагностических протоколах для человека и в ветеринарии для домашнего скота и диких животных, таким образом, данное изобретение дополнительно касается способа диагностирования инфекции у млекопитающего.
Область изобретения
Данное изобретение в целом касается иммунологического анализа, а конкретнее анализа по измерению опосредованной клетками иммунной реактивности (СМД. Еще конкретнее данное изобретение предусматривает анализ и набор для измерения опосредованного клетками ответа на антиген с помощью цельной крови или других приемлемых биологических образцов. Анализ используют в терапевтических и диагностических протоколах для человека и в ветеринарии для домашнего скота и диких животных.
Измерение опосредованных клетками иммунных ответов важно для иммунного диагноза многих инфекционных и аутоиммунных болезней в качестве маркера иммунокомпетентности и для выявления Т-клеточных ответов на эндогенные и экзогенные антигены (а именно инфекции и вакцины).
Данное изобретение предусматривает способ измерения СМ1 у млекопитающего путем инкубации образца от млекопитающего, который включает Т-клетки или другие клетки иммунной системы, с антигеном. Затем выявляют продуцирование ΙΡ-10. Присутствие или уровень иммунного эффектора тогда указывает на уровень опосредованной клетками отвечаемости субъекта.
Предпосылки изобретения
Туберкулез
Открытие МусоЬас1етшт 1иЬетси1о818 (МТВ) - специфических иммунодоминантных антигенов привело к новому подходу для диагноза туберкулеза (ТВ). Ранняя работа показала возможность замены туберкулиновой кожной пробы (Т8Т) тестом, который оценивает ίη νίίτο продуцирование интерферона гамма (ΙΡΝ-γ) Т-клетками при ответе на определенные МТВ антигены. В то же время, главным успехом было открытие высоко иммуногенных антигенов, ранней секреторной антигенной мишени 6 (Е8АТ-6) и белка культурального фильтрата 10 (СРР-10) и ТВ7.7, который значительно улучшил специфичность. Эти антигены закодированы в области различия 1 (КП1) патогена и, следовательно, отсутствуют у всех штаммов вакцины Кальметта и Герена (ВСО) и у большинства нетуберкулезных микобактерий (исключение составляют МусоЬас1етшт капзазй, МусоЬасЮгшт таппит и МусоЬасЮпит δ/υίβαί). ΙΡΝ-γ ответы на перекрывающиеся пептиды кодированных КП1 антигенов Е8АТ-6, СРР-10, ТВ7.7 служат основанием для выявления МТВ инфекции в двух лицензированных и коммерчески доступных тестах.
ОиапЕРЕРОХ-ТВ Оо16 (Се11е8Й8 Птйеб, Сагпеще, Виктория, Австралия), связанный с ферментами цельной крови иммуноанализ (ЕЬРЗА), имеет знак соответствия европейским директивам качества и недавно получил одобрение Управлением по контролю за продуктами и лекарственными средствами (РИА) для выявления и латентной ТВ инфекции, и болезни.
Т-8РОТ.ТВ (ОхРотб ПпншпоЮс. Оксфорд, Великобритания), иммуноферментный спот-анализ (ЕЬРЗРОТ), при котором применяют мононуклеарные клетки периферической крови, имеет знак соответствия европейским директивам качества и одобрен для применения в Канаде в 2005 г. При Т-8РОТ.ТВ применяют только Е8АТ-6 и СРР10.
Однако доступные в настоящее время тесты имеют следующие недостатки:
1) чувствительность может быть ослаблена у иммуносупрессированных индивидуумов (таких как ВИЧ положительные или пациенты, получающие иммуносупрессирующее лечение);
2) в некоторых ситуациях необходим относительно большой объем крови (3 мл для ^иаηΐ^ΡЕΚОN теста и 8 мл для Т-8РОТ.ТВ), что может ограничить его применение для младенцев, тяжело больных и анемичных детей;
3) тесты не различают активную, латентную и свежую инфекцию;
4) тесты не показали способность прогнозировать, у кого будет развиваться свежий или латентный ТВ в активный ТВ.
Большинство недостатков теста происходят из-за измерения параметра эффекта ΙΡΝ-γ на очень низких уровнях, близких к пределу даже самого чувствительного способа (в ^иаηΐ^ΡЕΚОN тесте вплоть до 0,35 МЕ/мл (17,5 пг/мл), а в Т-8РОТ.ТВ 5 пятен/поле). Уменьшение порогового значения для усиления чувствительности в конечном счете приведет к уменьшению специфичности тестов. Недавняя публикация по ^иаηί^ΡЕΚОN тесту показала, что повторное тестирование людей с результатами теста в более низком диапазоне ΙΡΝ-γ меняется около порогового уровня, который подчеркивает возможный риск ложных положительных и ложных отрицательных результатов ОиапЕРЕРОХ ЮРТ) теста (Рак М. е! а1.).
Для преодоления очевидной слабости тестов чувствительность можно улучшить с помощью дополнительных М. 1иЬетси1о818 специфических антигенов, что и выполнили в третьем поколении ОнапЕРЕРОХ тестов (ОРТ). Тест ОнапЕРЕРОХ в пробирке ЮРТЧТ) теперь включает дополнительный антиген под названием ТВ7.7(р4), и потенциальная чувствительность улучшена, но он все еще зависит от измерений при очень низких ΙΗΝ-γ уровнях.
Этот подход был опробован другими, а именно недавно показали, что монокин, индуцированный ΙΕΝ-γ, (МЮ/СХСБ9) был специфически экспрессирован ίη νίΙΐΌ после стимуляции с М. 1нЬетси1о818 специфическими антигенами (Е8АТ-6/СРР10) и РРИ. Чувствительность СХСБ9, однако, была очень низкой, ниже, чем у ШЛ-у. Провели другое меньшее исследование на основе цитометрии внутриклеточных цитокинов в СЭ4+ Т-клетках после Е8АТ-6 стимуляции, если экспрессия ΙΕΝ-γ, ΙΕ-2, ΙΕ-4, ΙΠ-10 или активационного маркера СО40Б могла отличить ТВ от не ТВ болезни. Ни один из этих маркеров, как выяснили,
- 1 020412 не был сопоставим или превосходил ΙΡΝ-γ (ЛЪгато С, с1 а1.) (Нидйек, А. с1 а1.).
Еще не были идентифицированы чувствительные и специфические маркеры для замещения ΙΡΝ-γ для диагноза ТВ инфекции в опубликованной в настоящее время литературе. Многие упоминают ΙΡ-10 в связи с инфекциями, но не в качестве маркера в диагнозе инфекции с предварительной стимуляцией антигена.
Хламидии
Диагностирование половых хламидальных инфекций быстро развивалось с 1990-х. Тесты амплификации нуклеиновых кислот (ΝΑΑΤ), такие как полимеразная цепная реакция (РСР), амплификация, опосредованная транскрипцией, (ТМА) и анализ ДНК со смещением цепочки (8ΌΑ), теперь являются основными. Наиболее часто используемыми и широко рассматриваемыми ΝΑΑΤ для хламидии в США и многих других индустриализированных странах являются ΑρΙίιηα (Сеи-РтоЪе), РгоЪе-Тес (ВееЮпОюкшкои) и ΑιηρΙΚοΓ (Росйе). Аналитические тесты Αрΐ^та СотЪо II одновременно проводят для С. 1гасйотаЙ8 и №155епа доиоггйоеае, причины гонореи. ΝΑΑΤ для хламидии можно выполнить на образцах мазков, отобранных из шейки (у женщин) или уретры (у мужчин).
В настоящее время ΝΑΑΤ официально разрешены только для тестирования урогенитальных образцов. ΝΑΑΤ в значительной степени заменили культуру, исторический золотой стандарт для диагноза хламидии, и тесты неамплифицированной пробы, такие как Расе II (Сеи-РтоЪе). Последний тест относительно нечувствителен, успешно выявляет только 60-80% случаев инфекции у асимптоматических женщин и случайно дает ложно положительные результаты. Культуру продолжают использовать в отдельных случаях, и в настоящее время она является единственным анализом, одобренным для тестирования неполовых образцов.
Диагностирование хламидий, таким образом, основано на сложной и материалоемкой технологии, такой как РСР (полимеразная цепная реакция), мало доступной для развивающихся стран. Быстрая и легкая технология улучшила бы диагностические оценки этой важной болезни.
Патент Канады СА 2478138 раскрывает, что повышенные уровни в крови полипептида хемокина СХСЬ10 связаны с респираторными болезнями (например, 8ΑΡ8, грипп и внебольничная пневмония) и используются при диагностировании пациентов. Способы предусмотрены для диагностирования и лечения пациентов, страдающих от респираторных заболеваний.
\νϋ 05/091969 раскрывает маркеры для Τ8Ε (трансмиссивные губчатые энцефалопатии), которые присутствуют до формирования обнаруживаемого патологического прионового белка, используемые для обнаружения этой инфекции до появления клинических признаков. ГР-10 является только одним из нескольких раскрытых маркеров, но эта заявка не раскрывает какую-либо антигенную стимуляцию.
Патентный документ И8 2004-038201 раскрывает программу экспрессии отдельных генов, активированных в ответ на различные патогены в макрофагах. ТР-10 снова является одним из многих упомянутых маркеров, но эта заявка не раскрывает какую-либо антигенную стимуляцию.
Αηη;·ι1ί5;·ι ΑζζιΐΓΠ е1 а1. раскрывают уровни в плазме ΣΡΝ-γ-индуцируемого белка 10 и пентраксина 3, что являются инструментами для мониторинга воспаления и активности болезни при инфекции МусоЪас1етшт 1иЪегси1о818. Статья показывает, что уровень !Р-10 в плазме спонтанно повышается у пациентов с ТВ, в этой ссылке снова не раскрывается какая-либо антигенная стимуляция.
νθ 03/063759 раскрывает способ идентификации белка теплового шока (Нкр), производного пептида, используемого для диагностирования или терапии. Эффект соединений этого изобретения протестировали на моноцитах периферической крови с помощью измерения уровня ТР-10 в ответ на последующую стимуляцию с ЬР8. Непосредственная стимуляция с тестируемыми соединениями без последующей стимуляции с ЬР8 не приводила к повышению уровня ЕР-10.
νθ 07/039400 раскрывает способ и набор для диагноза синдрома иммунного восстановления, который связан с туберкулезом, (ΤΒ4Ρ8) у пациентов, инфицированных туберкулезом, а также инфицированных ВИЧ/ТВ пациентов. Для того чтобы диагностировать ΤΒ4Ρ8, изобретатели определили уровень ΤΗ1 ответа против РРЭ и/или белка в 16 кДа по сравнению с ΤΗ1 ответом против Ε8ΑΤ-6, СРР-10, 85В (отрицательный контроль) и использовали подъем ΤΗ1 ответа как показатель ΤΒ4Ρ8.
Чтобы преодолеть проблемы ослабленной чувствительности и низкие уровни обнаруживаемого ΣΡΝ-γ доступными в настоящее время тестами с помощью антигенной стимуляции, данное изобретение предполагает применение альтернативного к ΣΡΝ-γ биомаркера.
Краткое описание изобретения
Данное изобретение предлагает новый принцип диагностики. Тестовая система, которая может обнаруживать инфекцию, например, туберкулез, лейшманию или хламидию, основана на измерении хемокина №-10 после стимуляции иммунных клеток антигенными белками/пептидами.
Описанная тестовая система №-10 более чувствительна, чем тесты на основе ΞΕΝ-γ как параметра эффекта, она улучшает тестирование и диагностирование. Тест можно выполнить с помощью меньших количеств крови, поскольку образцы можно разбавлять во время инкубации или перед анализом. Тест можно выполнить за меньшее время инкубации. Кроме того, тестовая система может позволить отличие между различными стадиями инфекции, такой как, например, активная, свежая и латентная ТВ инфек- 2 020412 ция.
Кратко данное изобретение может быть описано как иммунологический способ, включающий этапы инкубирования образца, включающего Т-клетки, полученные от субъекта по меньшей мере с одним специфическим пептидным тест-антигеном микроорганизма, определения специфического опосредованного Т-клетками иммунного ответа на тест-антиген путем измерения ΙΡ-10 уровня в указанном образце и сравнения указанного определенного ΙΡ-10 уровня с контрольным уровнем, тем самым, определяют, сталкивался ли ранее субъект с антигеном, производящим иммунологическую реактивность к антигену, или ранее сталкивался с другими антигенами, производящими иммунологическую перекрестную реактивность к антигену.
Детальное описание изобретения
Данное изобретение предусматривает анализ возможности или способности субъекта установить СМ1 ответ. Анализ основан на измерении продуцирования молекул иммунных эффекторов клетками иммунной системы в ответ на антигенную стимуляцию. Иммунные эффекторы можно обнаружить с помощью лигандов, таких как антитела, специфических для эффекторов, или измерением уровня экспрессии генов, кодирующих эффекторы.
Следовательно, данное изобретение предусматривает средства для определения отвечаемости СМ1 у субъекта и, в свою очередь, предусматривает средства для диагностирования инфекционных болезней, патологических состояний, уровня иммунокомпетентности и маркер Т-клеточной отвечаемости на эндогенные или экзогенные антигены.
Один аспект данного изобретения касается анализа возможности или способности субъекта установить ΙΡ-10 ответ. Анализ основан на измерении ΙΡ-10 продуцирования клетками иммунной системы в ответ на антигенную стимуляцию. Продуцирование ΙΡ-10 можно обнаружить с помощью лигандов, таких как антитела, специфические к ΙΡ-10, или измерением уровня экспрессии генов, кодирующих ΙΡ-10. Данное изобретение продемонстрировало принцип теста с помощью двух различных типов инфекции: туберкулез и хламидии. В случае туберкулеза тест, основанный на специфической к М. 1иЬегси1о818 стимуляции и последующем определении ΙΡ-10, может идентифицировать людей, инфицированных М. 1иЬетсиΙοδΐδ. В случае хламидии тест, основанный на стимуляции экстрактом С. 1гасйотаЙ8, может идентифицировать людей, инфицированных хламидиями.
Описанная тестовая система оценивает более высокие уровни биомаркера ΙΡ-10, чем уровни ΙΡΝ-γ маркера, на котором в настоящее время основаны доступные анализы. Тестовая система на основе ΙΡ-10 является столь же специфической и более чувствительной, чем тесты на основе, например, ΙΡΝ-γ как параметра эффекта, это улучшает тестирование и диагностирование иммуноскомпрометированных индивидуумов (пример 10). Тест можно выполнить с помощью меньших количеств крови, потому что образцы можно разбавить во время инкубации или перед анализом (примеры 9 и 13). Это также улучшает скорость диагноза, поскольку ΙΡ-10 продуцируется в существенных количествах после нескольких часов инкубации, как показано в примере 11. В случае туберкулеза тестовая система позволяет различать активную, свежую и латентную ТВ инфекцию и, кроме того, тестовая система потенциально способна идентифицировать людей с риском развития активной формы ТВ. Тестовая система основана на выявлении ΙΡ-10 с помощью иммуноанализа (а именно, ЕЬРЗА или Ьипппех) и потенциально может быть разработана как удобный внелабораторный иммунохроматографический тест, применимый в учреждениях с низкими возможностями, где результат теста представлен цветной реакцией, видимой невооруженным глазом.
Анализ, описанный в данном изобретении, решает ряд проблем. В настоящее время доступные анализы оценивают параметр эффекта ΙΡΝ-γ на очень низких уровнях, близких к пределу даже самого чувствительного способа выявления (в случае тестов туберкулеза тест ΟιιαηΙίΡΕΒΘΝ имеет пороговый уровень для положительного теста при 0,35 международных ед./мл (17,5 пг/мл), а в Τ-δΡΘΤ.ΤΒ тесте 5 формирующих пятна ед./поле). Снижение порога для усиления чувствительности, в конечном счете, приведет к уменьшенной специфичности тестов. Публикации на основе теста ОиапйГегоп показали, что повторное тестирование людей дает более низкий диапазон вариантов ΙΡΝ-γ около порогового уровня, который подчеркивает возможность риска ложных положительных и ложных отрицательных результатов теста ОиапйГегоп (ЦРТ). Кроме того, нынешний тест может дать ложные отрицательные результаты у иммуносупрессированных индивидуумов, которые не способны к ΙΡΝ-γ ответу выше порогового уровня. Поскольку высвобождение ΙΡ-10 намного выше после антигенной стимуляции по сравнению с ΙΡΝ-γ: чувствительность выше, меньше тестов считают ложными отрицательными, результаты теста более воспроизводимы, и ожидается меньше неопределенных результатов теста у иммуносупрессированных индивидуумов.
Кроме того, поскольку индуцированный антигеном ΙΡ-10 выделен в таких высоких концентрациях, можно разбавить образец до или после этапа инкубации. Это значит, что количество материала образца (например, цельная кровь), необходимое для выполнения теста, можно снизить, например, в случае с цельной кровью, вплоть до или даже ниже 0,25 мл, такого как 0,20 мл, например, 0,15 мл, такого как 0,1 мл, например, 0,05 мл. В предпочтительном варианте осуществления тест можно выполнить с количест- 3 020412 вом вплоть до или даже ниже 0,1 мл. Таким образом, можно разработать минианализ, приемлемый для пациентов с низким объемом крови (например, дети/младенцы или анемики). Кроме того, с помощью, например, отбора крови из пальца минианализ можно выполнить еще более удобно для пользователя, поскольку избегается прокол вены.
Кроме того, в случае туберкулеза ни один из ныне доступных тестов не может различить активную и латентную инфекцию. В данном изобретении показано, что концентрация ΙΡ-10 в нестимулированном, но инкубированном образце материала, а именно в нулевом образце (например, цельная кровь), выше у пациентов с активной болезнью по сравнению со здоровыми индивидуумами с латентной болезнью. Данное изобретение предлагает ΙΡ-10 концентрацию в образце материала, инкубированного с неактивным раствором (нулевой) в комбинации с антиген-специфическим тестом, использовать как маркер для активной инфекции (например, туберкулез) в сравнении с латентной инфекцией (например, туберкулез).
Анализ
Таким образом, один аспект данного изобретения касается иммунологического способа диагностирования инфекции, вызванной микроорганизмом, включающего этапы, на которых
a) инкубируют образец, включающий Т-клетки, полученные у субъекта, по меньшей мере с одним специфическим пептидным тест-антигеном микроорганизма;
b) определяют специфический опосредованный Т-клетками иммунный ответ на тест-антиген путем измерения ΙΡ-10 уровня в указанном образце;
c) сравнивают указанный определенный ΙΡ-10 уровень с контрольным уровнем;
ά) определяют, что указанный субъект инфицирован указанным микроорганизмом, если определенный ΙΡ-10 уровень равен или выше контрольного уровня, и/или определяют, что указанный субъект не инфицирован указанным микроорганизмом, если указанный определенный ΙΡ-10 уровень ниже контрольного уровня.
Следует понимать, что любой из способов, описанных в данном изобретении, является независимой платформой. Следовательно, в данном изобретении можно применять любой иммунологический способ, такой как, без ограничения, ЕЬ18А, Ьиштех, Μυΐΐίρίοχ. иммуноблоттинг, ТКЕ-анализ, иммунохроматографические анализы латерального потока, методики иммуноферментного анализа, КЛ8Т (радиоаллергосорбентный тест), радиоиммуноанализы, иммунофлуоресцентные и различные иммунологические анализы с использованием сухих тест-полосок (например, хроматографический тест с полосками).
Во втором аспекте данное изобретение касается способа диагностирования инфекции, вызванной микроорганизмом, причем указанный способ включает этапы, на которых
a) инкубируют образец, включающий Т-клетки, полученные у субъекта, по меньшей мере с одним специфическим пептидным тест-антигеном микроорганизма, при условии, что указанный тест-антиген не является ΡΡΌ или ΕΡ8;
b) определяют специфический опосредованный Т-клетками иммунный ответ на тест-антиген путем измерения ΙΡ-10 уровня в указанном образце;
c) сравнивают определенный ΙΡ-10 уровень с контрольным уровнем;
ά) определяют, что указанный субъект инфицирован указанным микроорганизмом, если определенный ΙΡ-10 уровень выше контрольного уровня.
Данное изобретение показало, что прямой стимуляции выбранным тест-антигеном (антигенами) или антигеном (антигенами) для оценивания достаточно для получения считывания, которое позволяет квалифицированному специалисту заключить, сталкивался ли образец с тест-антигеном (антигенами), производя иммунологическую реактивность к тест-антигену (антигенам), или сталкивался ранее с другими тест-антигенами, производя иммунологическую перекрестную реактивность к выбранному тестантигену (антигенам).
Таким образом, в одном варианте осуществления данное изобретение также касается иммунологических способов, как описано здесь, где исключается любая дополнительная или последующая стимуляция.
Последующая или дополнительная стимуляция может предусматривать любой тип стимуляции, например, примирование или стимулирование образца биологически неактивным веществом или веществом с биологическим эффектом, связанным с воспалительным ответом, таким как, без ограничения, митогены, бактериальные продукты или биологически активные белки.
Таким образом, в одном варианте осуществления данное изобретение касается иммунологических способов, как описано здесь, где исключается любая дополнительная или последующая стимуляция с ΕΡ8.
Следовательно, указанный способ применяют для выявления инфекции, например, у людей с высоким риском развития инфекционных болезней, таких как, без ограничения, туберкулез, хламидиоз, лейшманиоз, трипаносомозы и шистосомозы.
Данное изобретение также касается способа диагностирования инфекции, вызванной микроорганизмом, где образец, включающий Т-клетки, делят по меньшей мере на две фракции и
а) инкубируют первую фракцию образца с одним специфическим пептидным тест-антигеном (антигенами) для получения образца с ответом;
- 4 020412
b) инкубируют вторую фракцию образца с неактивным раствором для получения нулевого образца;
c) определяют ΣΡ-10 уровень в двух фракциях;
Д) определяют зависимое от специфического тест-антигена микроорганизма опосредованное Тклетками значение иммунного ответа образца, вычитая ΙΡ-10 уровень, определенный в нулевом образце, из ΙΡ-10, определенного в образце с ответом;
е) сравнивают зависимое от специфического тест-антигена микроорганизма опосредованное Тклетками значение иммунного ответа с контрольным уровнем;
ί) определяют, что указанный субъект инфицирован указанным микроорганизмом, если указанное значение специфического опосредованного Т-клетками иммунного ответа на тест-антиген равно или выше контрольного уровня, и/или определяют, что указанный субъект не инфицирован указанным микроорганизмом, если указанное значение специфического опосредованного Т-клетками иммунного ответа на тест-антиген ниже контрольного уровня.
В одном варианте осуществления выполнение анализа можно потенцировать с помощью сопутствующего добавления иммуностимуляторной молекулы с антигеном, выбранным для оценивания, причем указанная иммуностимуляторная молекула является цитокином, выбранным из неограниченной группы, включающей 1Ь-2, 1Ь-12, ΤΝΡ-α и ΙΡΝ-γ.
В другом варианте осуществления иммуностимуляторная молекула является растворимым рецептором (например, ди- или полимером В7 молекул (СИ80/СП86)) или антителом (например, СИ28связывающее антитело).
В другом варианте осуществления иммуностимуляторная молекула обладает свойством обеспечения Т-клеток костимуляторным сигналом (известным специалисту в данной области как сигнал 2), указанный костимуляторный сигнал отдельно не способен индуцировать ΙΡ-10 ответ, но усиливает ΙΡ-10 ответ, если клетки производят СМ1 ответ к антигену, выбранному для оценивания.
В другом варианте осуществления потенцирующий анализ можно осуществить ингибированием противовоспалительных процессов, происходящих во время этапа инкубации. В одном варианте осуществления анализ можно потенцировать с ингибированием антител или растворимых рецепторов, которые связывают противовоспалительные молекулы, такие как, без ограничения, 1Ь-4, 1Ь-10 и ΤΟΡ-β.
В другом варианте осуществления потенцирующий анализ можно осуществить ингибированием противовоспаления, опосредованного через ингибирование или элиминирование клеточных популяций, действующих как ингибиторы на СМ1 ответ, такие как регулирующие Т-клетки.
Конкретно, как используется здесь, выражение очищенное белковое производное (ΡΡΌ или туберкулин) является осадком невидовых специфических молекул. ΡΡΌ или туберкулин получают с помощью экстракции белков из смеси М. 1иЬегси1о818 или других микобактерий, таких как М. аущт. ΡΡΌ обычно используют при тестировании присутствия клеточного иммунитета или ТЫ ответа, произведенного либо против ВСО, либо против М. 1иЬегси1о818. Например, его можно получить из ТиЬет8о1В СоппаидЫ ЬаЬота1опе5 ЫтйеД, приготовленного большой Ма§1ет Ва1сН. СоппаидЫ ТиЬегсийи (СТ68), или в форме К.Т23, полученной от §1а1еи8 8егит 1п8Йи1е (88Ι, Копенгаген, Дания).
Белок Е8ЛТ-6 (ранний секреторный антиген 6) является главным секреторным антигеном, который очистили из кратковременных культуральных фильтратов М. 1иЬегси1о818. Как упоминалось здесь, Е8АТ6, СΡΡ-10 (белок культурального фильтрата 10) и 85В можно получить из клеточного лизата и очистки с помощью рекомбинантных методик или получить как синтетические пептиды. Например, Е8АТ6 можно получить как рекомбинаный белок из 81а1еп5 8егит 1п8Й1и1е.
Туберкулин или ΡΡΌ (очищенное белковое производное) отличается от Е8АТ-6 (ранний секреторный антиген 6), СΡΡ-10 (белок культурального фильтрата 10) и ТВ7.7, которые закодированы генами (в КГО-1 области), которые расположены только в геноме М. 1иЬегси1о818 и не содержатся в ВСО (бацилла Кальметта и Герена). Он отличается от ΡΡΌ, так как ΡΡΌ также содержит другие антигены, которые разделены, например, на подштаммы ВСО и несколько нетуберкулезных видов микобактерий с низкой патогенностью или с ее отсутствием.
Факультативно, способ может дополнительно включать разделение образца на 3 фракции и инкубацию третьей фракции образца с Т-клеточным активатором для получения положительного контроля. Здесь иммунные клетки можно инкубировать, например, в трех отдельных популяциях: нулевой контроль (например, солевой раствор), Ад стимулированный (например, специфические для хламидии или туберкулеза белки или их производное) и положительный контроль (например, фитогемагглютинин). Иммунные клетки могут быть в форме цельной крови, разбавленной цельной крови или различных очищенных продуктов клеточных популяций, подобных мононуклеарным клеткам периферической крови, моноцитам или Т-клеткам. Клетки можно получить из крови, мочи, плевральной жидкости, бронхиальной жидкости, смывов ротовой полости, тканевых биопсий, асцитов, гноя, цереброспинальной жидкости, аспирата и/или фоликулярной жидкости. Иммунные клетки инкубируют в течение, например, 4-24 ч при 37°С.
В одном варианте осуществления образец делят по меньшей мере на 2 фракции и
а) инкубируют первую фракцию образца по меньшей мере с одним специфическим пептидным
- 5 020412 тест-антигеном микроорганизма для получения образца с ответом;
b) инкубируют вторую фракцию образца с неактивным раствором для получения нулевого образца;
c) определяют ΙΡ-10 уровень в двух фракциях;
б) определяют зависимое от специфического тест-антигена микроорганизма опосредованное Тклетками значение иммунного ответа образца, вычитая ΙΡ-10 уровень, определенный в нулевом образце, из ΙΡ-10, определенного в образце с ответом;
е) сравнивают зависимое от специфического тест-антигена микроорганизма опосредованное Тклетками значение иммунного ответа с контрольным уровнем;
ί) сравнивают антиген спонтанный ΙΡ-10 ответ или значение, полученное от него, с контрольным уровнем или значением, полученным от него;
д) определяют, что указанный субъект инфицирован указанным микроорганизмом, если указанное значение специфического опосредованного Т-клетками иммунного ответа на тест-антиген равно или выше контрольного уровня, и/или определяют, что указанный субъект не инфицирован указанным микроорганизмом, если указанное значение специфического опосредованного Т-клетками иммунного ответа на тест-антиген ниже контрольного уровня.
Более конкретно, образец делят по меньшей мере на 3 фракции и
a) инкубируют первую фракцию образца с антигеном для получения образца с ответом;
b) инкубируют вторую фракцию образца с неактивным раствором для получения нулевого образца;
c) инкубируют третью фракцию образца со стимулирующим раствором (например, РНА) для получения образца митогена;
с) определяют ΙΡ-10 уровень в трех фракциях;
б) определяют зависимый от антигена ΙΡ-10 ответ образца, вычитая ΙΡ-10 уровень, определенный в нулевом образце, от ΙΡ-10, определенного в образце с ответом;
е) сравнивают зависимый от антигена ΙΡ-10 ответ или значение, полученное от него, с контрольным уровнем или значением, полученным от него;
ί) определяют зависимый от митогена ΙΡ-10 ответ образца, вычитая ΙΡ-10 уровень, определенный в нулевом образце, от ΙΡ-10, определенного в митогеном образце;
д) сравнивают зависимый от митогена ΙΡ-10 ответ или значение, полученное от него, с контрольным уровнем или значением, полученным от него;
1ι) сравнивают антиген спонтанный ΙΡ-10 ответ или значение, полученное от него, с контрольным уровнем или значением, полученным от него, тем самым, определяют, сталкивалось ли ранее млекопитающее с антигеном и, таким образом, производит ли иммунологическую реактивность к антигену, или сталкивалось ранее с другими антигенами, производя иммунологическую перекрестную реактивность к антигену, и, тем самым, определяют, имеет млекопитающее активную, свежую или латентную инфекцию, или если млекопитающее отзывается на лечение, инфекция собирается развиться, или является иммуносупрессированным.
Выражение митоген относится к любому химическому препарату или химической композиции, содействующей клеточному делению. Митогены могут действовать и на Т-клетки, и на В-клетки, или отдельно, или одновременно. Следовательно, выражение митоген также охватывает выражения Тклеточный активатор и В-клеточный активатор и, таким образом, используется здесь равнозначно. Митогены по данному изобретению охватывают все митогены, известные специалисту, такие как, без ограничения, фитогемагглютинин (РНА), конканавалинА (сопА), липополисахарид (ΕΡδ) и митоген лаконоса (Ρ^Μ). В предпочтительном варианте осуществления по данному изобретению митогеном является Тклеточный активатор, еще более предпочтительно митогеном является РНА. В другом предпочтительном варианте осуществления по данному изобретению митогеном является моноцитный/макрофаговый активатор. Затем определяют продуцирование ΙΡ-10 с помощью любого способа выявления цитокина или хемокина, известного квалифицированному специалисту, такого как, без ограничения, методики на основе антитела, например, хМАР, мультиплексирование, Бипипех. ЕП8А, ΕΠ8ΡΟΤ, анализ латерального потока с использованием тест-полосок или методики на основе мРНК, подобные полимеразной цепной реакции реального времени (ΡΒ-ΡΟΡ), или цитометрии внутриклеточного потока ОС-РАСЗ).
Количество ΙΡ-10 в ответ на антигены (например, антигены хламидиевого экстракта или специфические для туберкулеза белки или их производные) можно определить, вычитая фоновое продуцирование ΙΡ-10, и возможная инфекция с, например, М. 1иЬегси1о818, интерпретируется на основе этого антиген-специфического ΙΡ-10 ответа.
Данные туберкулеза в данной заявке получают с помощью существующей технологии: фиапίίΡΕΡΟΝ® ТВ-Со1б в пробирочном тесте (Се11е8Й8, Сатпед1е, Австралия), при котором цельную кровь отбирают прямо в пробирки с вакуумом, предварительно покрытые или солевым раствором (нулевой контроль), специфическими для ТВ пептидными антигенами (Ад), или митогеном (РНА). Пробирки сразу же инкубировали в предпочтительном варианте осуществления в течение 18 ч при 37°С, где затем оценивали концентрацию цитокина с помощью технологии хМАР на платформе Бипипех (Бипипех Согротайоп, США), с помощью реагентов Вюкоитсе (Вюкоитсе СататШо, США), и, таким образом, можно
- 6 020412 было изменить параметр эффекта от традиционного параметра ΙΡΝ-γ на ΙΡ-10, который экспрессирован при более высоких концентрациях и лучше выполняется.
Высокая чувствительность данного изобретения делает этот способ превосходным инструментом для дифференциации между активной инфекцией, латентной инфекцией, свежей инфекцией, инфекцией у ребенка/новорожденного и/или длительной латентной инфекцией. Таким образом, в одном варианте осуществления данное изобретение касается способа, где зависимый от антигена ΙΡ-10 ответ выше контрольного уровня вместе с нулевым показывает, что млекопитающее имеет активную инфекцию, латентную инфекцию, свежую инфекцию и/или длительную латентную инфекцию.
В другом варианте осуществления данное изобретение касается способа, где количество материала образца (например, цельная кровь), используемого в тесте, уменьшено. В случае с цельной кровью вплоть до диапазона 3-0,1 мл, а в случае с РВМС число клеток находится в диапазоне 1х106-0,05х106. Такой минианализ, приемлемый для пациентов с низким объемом крови (особенно для детей/младенцев или пациентов с анемией), является инновационным, так как он может диагностировать болезнь (например, туберкулез) без гемодинамических последствий для донора, или выполняться на очень малом количестве материала образца, например, клетки из спинальной жидкости, плевральной жидкости или крови из пуповины.
Комбинация с другими маркерами
Измерение ΙΡ-10 в комбинации с одним или более из следующих маркеров может сократить число ложных положительных и увеличить избирательную способность. Таким образом, в одном варианте осуществления при способе дополнительно
a) определяют уровень ΙΡ-10 и МСР-1 в ответ на антигенную стимуляцию;
b) объединяют определенный уровень ΙΡ-10 и МСР-1 и
c) сравнивают указанный объединенный уровень с объединенным контрольным уровнем.
Как понятно квалифицированному специалисту, объединенный контрольный уровень определяют с помощью измерения ΙΡ-10 уровня и любого из предложенных комбинаторных маркеров, такой как, без ограничения, МСР-1 уровень в здоровой популяции, и объединяют указанный определенный ΙΡ-10 и МСР-1 уровень посредством арифметического действия, такого как, без ограничения, сложение. Объединенный контрольный уровень определяют при выбранной пороговой точке, связанной с распределением объединенного контрольного уровня, например, среднее + 2 стандартных отклонений в здоровой популяции, или с помощью других средств, известных квалифицированному специалисту.
Дополнительно комбинаторные маркеры включают Ш-2 и ΙΝΡ-γ.
В одном варианте осуществления данное изобретение раскрывает способ, при котором дополнительно
a) определяют уровень ΙΝΡ-γ и факультативно МСР-1 и/или Ш-2 в ответ на антигенную стимуляцию;
b) объединяют определенный уровень ΙΡ-10 и ΙΝΡ-γ и факультативно МСР-1 и/или ΙΡ-2 и
c) сравнивают указанный объединенный уровень с объединенным контрольным уровнем.
В одном варианте осуществления способ включает этапы, при которых
a) определяют уровень ΙΡ-10 в ответ на антигенную стимуляцию;
b) сравнивают уровень ΙΡ-10 с контрольным уровнем или значением, полученным от него;
c) определяют, сталкивалось ли ранее указанное млекопитающее с указанным антигеном и, таким образом, производит ли ΙΡ-10 реактивность на антиген;
б) определяют уровень МСР-1 в ответ на антигенную стимуляцию;
е) сравнивают уровень МСР-1 с контрольным уровнем или значением, полученным от него; ί) определяют, сталкивалось ли ранее указанное млекопитающее с указанным антигеном и, таким образом, производит ли МСР-1 реактивность на антиген;
д) объединяют определенную ΙΡ-10 реактивность и МСР-1 реактивность, тем самым определяют, сталкивалось ли ранее млекопитающее с антигеном и, таким образом, производит ли иммунологическую реактивность на антиген по меньшей мере с одним биомаркером.
В одном варианте осуществления способ включает этапы, на которых
a) определяют уровень ΙΡ-10 в ответ на антигенную стимуляцию;
b) сравнивают уровень ΙΡ-10 с контрольным уровнем или значением, полученным от него;
c) определяют, сталкивалось ли ранее указанное млекопитающее с указанным антигеном и, таким образом, производит ли ΙΡ-10 реактивность на антиген,
б) определяют уровень ΙΡ-2 в ответ на антигенную стимуляцию;
е) сравнивают уровень ΙΡ-2 с контрольным уровнем или значением, полученным от него;
ί) определяют, сталкивалось ли ранее указанное млекопитающее с указанным антигеном и, таким образом, производит ли ΙΡ-2 реактивность на антиген;
д) объединяют определенную ΙΡ-10 реактивность и ΙΡ-2 реактивность, тем самым определяют, сталкивалось ли ранее млекопитающее с антигеном и, таким образом, производит ли иммунологическую реактивность на антиген по меньшей мере с одним биомаркером.
- 7 020412
В одном варианте осуществления способ включает этапы, на которых
a) определяют уровень ΣΡ-10 в ответ на антигенную стимуляцию;
b) сравнивают уровень ΙΡ-10 с контрольным уровнем или значением, полученным от него;
c) определяют, сталкивалось ли ранее указанное млекопитающее с указанным антигеном и, таким образом, производит ли ΙΡ-10 реактивность на антиген;
б) определяют уровень ΙΡΝ-γ в ответ на антигенную стимуляцию;
е) сравнивают уровень ΙΡΝ-γ с контрольным уровнем или значением, полученным от него; ί) определяют, сталкивалось ли ранее указанное млекопитающее с указанным антигеном и, таким образом, производит ли ΙΡΝ-γ реактивность на антиген;
д) объединяют определенную ΙΡ-10 реактивность и ΙΡΝ-γ реактивность, тем самым определяют, сталкивалось ли ранее млекопитающее с антигеном и, таким образом, производит ли иммунологическую реактивность на антиген по меньшей мере с одним биомаркером.
В одном варианте осуществления способ включает этапы, на которых
a) определяют уровень ΙΡ-10 в ответ на антигенную стимуляцию;
b) сравнивают уровень ΙΡ-10 с контрольным уровнем или значением, полученным от него;
c) определяют, сталкивалось ли ранее указанное млекопитающее с указанным антигеном и, таким образом, производит ли ΙΡ-10 реактивность на антиген;
б) определяют уровень ΙΝΡ-γ и/или МСР-1 и/или ГЛ-2 в ответ на антигенную стимуляцию;
е) сравнивают уровень ΙΝΡ-γ и/или МСР-1 и/или Ш-2 с контрольными уровнями для каждого биомаркера или значениями, полученными от него;
ί) определяют, сталкивалось ли ранее указанное млекопитающее с указанным антигеном и, таким образом, производит ли ΙΝΡ-γ, и/или МСР-1, и/или ΙΡ-2 реактивность на антиген;
б) объединяют определенную ΙΡ-10 реактивность, и/или ΙΝΡ-γ, и/или МСР-1, и/или ΙΡ-2 реактивность, тем самым определяют, сталкивалось ли ранее млекопитающее с антигеном и, таким образом, производит ли иммунологическую реактивность на антиген по меньшей мере с одним из рассматриваемых биомаркеров.
Диагностирование
В одном варианте осуществления, и как утверждалось ранее, ΙΡ-10 можно использовать для диагностирования субъектов с подозрением на различные иммунологические состояния, такие как инфекции. При использовании в диагностировании способ по данному изобретению может помочь определить наличие иммунологических состояний, таких как инфекции, обычно с помощью оценивания клинических симптомов и дополнительных лабораторных тестов. Тест может диагностировать различные стадии инфекции, а именно инфекцию, с которой индивидуум без каких-либо симптомов столкнулся недавно, инфекцию, с которой индивидуум без каких-либо симптомом этой инфекции столкнулся много лет назад, активную инфекцию у пациента, имеющего симптомы этой инфекции.
В другом варианте осуществления ΙΡ-10 можно использовать для диагностирования субъектов с подозрением на туберкулез (например, активная, латентная или свежая ТВ инфекция) и отдельных пациентов с повышенным риском развития латентного туберкулеза в активный, а именно пациентов, получающих иммуносупрессивное лечение (а именно, лечение моноклональными антителами (анти-СИ20 антитела (например, КйихшаЬ®) или блокирующее ΤΝΡ-α лечение (например, Кетюабе®, ЕиЬге1®, НитЛа®)) или стероиды или противораковую хемотерапию; или пациентов, страдающих иммуносупрессивным состоянием (например, ВИЧ инфекция, рак, ΙΌΌΜ (инсулинзависимый сахарный диабет) или независимый от инсулина сахарный диабет (ΝΙΌΌΜ), аутоиммунные состояния, неполноценное питание, старческий возраст, внутривенное употребление наркотиков ДУИИ) или наследственные иммунные нарушения), и индивидуумов, которые были инфицированы недавно. Фактически после стандартных рекомендаций этих пациентов следует проверить на активную, латентную или свежую ТВ перед началом лечения.
В настоящее время строго рекомендовано обследовать пациентов, которые являются кандидатами на лечение блокатором ΤΝΡ-α, или ВИЧ положительные или при Τ8Τ. или при специфическом к М. ΙιιЬегси1о818 антигену ΙΡΝ-γ тесте. Поскольку исследования показали, что эти тесты могут быть ненадежными у пациентов выше упомянутых категорий, ΙΡ-10 является лучшим кандидатом из-за более высокой чувствительности.
В другом варианте осуществления ΙΡ-10 можно использовать для обследования индивидуумов с подозрением на хламидиевую инфекцию (например, урогенитальную инфекцию, тазовую инфекцию и/или инфекцию глаза).
Данное изобретение позволяет объединить антигены от различных инфекционных агентов, которые либо колонизируют в одном органе или анатомической области, либо дают общую группу симптомов. С помощью объединения различных специфических антигенов возможно обследовать пациентов с риском или исключить общие патогены, которые приводят к клинически неотличимым состояниям, таким как урогенитальная инфекция; или восприимчивы к одинаковому лечению, например, антибиотиками.
- 8 020412
Таким образом, в одном варианте осуществления данное изобретение касается способа одновременного обследования по меньшей мере двух инфекционных болезней, включающего этапы, на которых
a) получают один образец от пациента, нуждающегося в этом, и делят указанный образец по меньшей мере на фракции;
b) стимулируют одну фракцию антигенами, где указанные антигены связаны со специфическим инфекционным агентом (агентами), выбранным для оценивания (фракция с ответом) инкубации второй фракции образца с неактивным раствором (нулевая фракция);
c) измерение ΙΡ-10 уровня в обеих фракциях;
б) определяют зависимый от антигена ΙΡ-10 уровень образца, вычитая ΙΡ-10 уровень, определенный в нулевой фракции, из ΙΡ-10, определенного во фракции с ответом;
е) сравнивают указанный определенный зависимый от антигена ΙΡ-10 уровень с контрольным уровнем по меньшей мере по одному из выбранных инфекционных агентов и
1) отмечают указанного пациента, нуждающегося в этом, как инфицированного по меньшей мере одним из выбранных инфекционных агентов, если зависимый от антигена ΙΡ-10 уровень выше, чем ΙΡ-10 уровень в контрольной фракции.
Следовательно, способы по данному изобретению можно применять для обследования людей с высоким риском инфекционных болезней, например, людей, останавливающихся или путешествующих в зонах эндемических болезней.
Таким образом, в варианте осуществления по данному изобретению инфекционные болезни выбраны из группы, включающей малярию, туберкулез, менингит, японский энцефалит, холеру, лейшманию, денге и полиомиелит.
В другом варианте осуществления данного изобретения инфекционные болезни выбраны из болезней, передающихся половым путем, включающих шанкроид, хламидиевую инфекцию, гонорею, венерическую лимфогранулему, игеар1а8ша цтеа1уйсит, Мусор1акта Ьош1П18, Тгеропета раШбит, гепатит В, Негрек 5ипр1е\ νίπΐδ, вирус иммунодефицита человека, Нитап рарШотау1ти8, моллюск, Ρΐιΐΐιίπιΐδ риЫк, 8атсор1ек 8саЫе1 и Тйсйотопак уащпаПк.
В еще одном варианте осуществления данного изобретения инфекционные болезни выбраны из группы, включающей поддающиеся лечению болезни, вызванные желудочно-кишечными инфекционными агентами, например, 8Ыде11а, Е. сой, Сатру1оЬас1от, УЛтю сйо1етае бактерии, СгурЮкропбшт рагуцт, 8а1топе11а Ьас1ег1 и 8а1топе11а 1ур1и бактерии.
В еще одном варианте осуществления данного изобретения инфекционные болезни выбраны из группы, включающей вызванные желудочно-кишечными инфекционными агентами, не поддающиеся лечению антибиотиками, например, ротавирусами, норовирусами, аденовирусами, саповирусами и астровирусами.
В следующем варианте осуществления данного изобретения инфекционные болезни выбраны из группы, включающей связанные с кровью болезни, которые являются предметом обследования, например, в банках крови: гепатит А, гепатит Е, малярия, болезнь Шагаса, бабезиоз, лейшмания, вирус пенистости обезьян, болезнь Кройфельда-Якобса (уСГО), болезнь Кройфельда-Якобса (СТО), цитомегаловирус (СМУ) и вирус Эпштейна-Барра.
В одном варианте осуществления данного изобретения инфекционные болезни выбраны из группы, включающей бактериальные менингиты, вызываемые бактериями №188епа тешпдШбек, 81тер1ососси8 рпеитошае, ЫЧепа топосу1одепе§, Ρ8еиботоηа8 аегидшока, 81арйу1ососси8 аитеик, 81тер1ососси8 ада1асйае и НаеторЫ1и8 тЛиеп/а.
Следовательно, целью данного изобретения является создание видоспецифической диагностики, поскольку выбор специфического антигена позволяет квалифицированному специалисту дифференцировать различные виды, например, микобактерий.
Прогноз
В одном варианте осуществления можно использовать ΙΡ-10 для прогнозирования субъектов с диагнозами различных иммунологических состояний, таких как инфекции. При использовании в прогнозах для пациентов способ по данному изобретению может помочь предсказать ход и возможный результат иммунологических состояний, таких как инфекции, таким образом, помочь специалисту выбрать адекватный способ лечения и предсказать эффект определенного лечения для состояния.
Мониторинг
В одном варианте осуществления ΙΡ-10 можно использовать для мониторинга субъектов с инфекционным диагнозом. При мониторинге пациента способ по данному изобретению может помочь оценить эффективность во время лечения и после окончания лечения, например, мониторинг и предсказание возможного рецидива инфекции.
Возможность мониторинга терапевтической эффективности в соответствии с данным изобретением является особенно релевантной, так как (с помощью инфекции М. 1иЬегси1о818 в качестве примера)
a) легко выполнить простым забором крови вместо ныне доступных способов, подобных микроскопии слюны, микобактериальной культуре, рентгеновским лучам или другим способам;
b) он более воспроизводим по сравнению с микроскопией слюны, микобактериальной культурой,
- 9 020412 рентгеновскими лучами или другими способами;
с) он является недорогим по сравнению с микроскопией слюны, микобактериальной культурой, рентгеновскими лучами или другими способами, инвазивными хирургическими процедурами, предусмотренными в биопсии, например, если подозревается экстрапульмональный туберкулез, или бронхоскопией, если пациент отрицательный по слюне;
й) он является более чувствительным по сравнению с ΙΡΝ-γ анализами на туберкулез на основе ΚΌ1 перекрывающихся пептидов;
е) он может различать активный и латентный туберкулез, в то время как другие иммунные анализы различают только наличие инфекции или ее отсутствие.
Обследование
В одном варианте осуществления способ по данному изобретению используют с целью обследования. А именно его используют для определения субъектов без предварительного диагноза инфекций с помощью измерения уровня ΙΡ-10 по данному изобретению и корреляции оцененного уровня к предварительно установленному уровню, показывая присутствие или отсутствие различных инфекций (например, инфекция М. 1иЬегси1о818). В другом варианте осуществления способ по данному изобретению используют с целью обследования. А именно его используют для определения субъекта без предварительного диагноза инфекций, но с риском возобновления латентной болезни, с помощью измерения уровня ΙΡ-10 согласно предварительно установленному уровню по данному изобретению и корреляции оцененного уровня к присутствию или отсутствию различных инфекций (например, инфекция М. 1иЬегси1о818).
Как утверждалось ранее, данное изобретение раскрывает способ одновременного обследования по меньшей мере двух инфекционных болезней.
В другом варианте осуществления по данному изобретению способ можно использовать для обследования крови от доноров крови на различные болезни, такие как, без ограничения, инфекция (инфекции), вызванная, например, паразитами или вирусами.
Контактное мечение
В предпочтительных вариантах осуществления ΙΡ-10 можно использовать для диагноза субъектов, подвергнувшихся различным инфекциям, таким как М. 1иЬегси1о818. При использовании контактного мечения способ по данному изобретению может помочь определить присутствие инфекций, таких как инфекция М. 1иЬегси1о818.
В других вариантах осуществления ΙΡ-10 можно использовать для диагноза субъектов, подвергнувшихся случаям заражения при вспышках высоко заразных инфекций, таких как, без ограничения, туберкулез, коронавирус (например, серьезный приобретенный респираторный синдром), грипп, вирус Эбола или марбургский вирус. В случае туберкулеза: при использовании в контактном мечении способ по данному изобретению может помочь определить присутствие инфекции, обычно осуществляемое с помощью оценивания ΤδΤ или ныне доступного анализа высвобождения ΙΡΝ-γ.
Улучшение выявления случая заболевания
В предпочтительных вариантах осуществления ΙΡ-10 можно использовать для диагноза различных болезней, таких как инфекции. При использовании в улучшенном выявлении случая заболевания способ по данному изобретению может помочь определить присутствие инфекций, таких как, без ограничения, отрицательный при микроскопии ТВ, который иначе трудно диагностировать из-за отсутствия микробиологического признака инфекции, но который обычно диагностируется оцениванием клинических симптомов, ответа на лечение и отсутствия альтернативных диагнозов или отнимающими много времени анализами (недели), такими как культура слюны.
Исследования распространения
В предпочтительных вариантах осуществления ΙΡ-10 можно использовать для исследования распространения различных иммунологических состояний, таких как, без ограничения, инфекций в популяциях интереса, таких как дети, ВИЧ положительные иммигранты, беженцы, работники здравоохранения, школьники, заключенные, лаборанты. При использовании в исследованиях распространения способ по данному изобретению может помочь определить присутствие инфекции, такой как латентный и активный ТВ в популяции, что обычно выполняют с помощью ΤδΤ.
Исследовательские цели
В одном варианте осуществления ΙΡ-10 может использоваться исследовательскими институтами при обследовании на возможность новых антигенов, полученных от микроорганизма, выбранного из группы, включающей микобактерии, грамположительные бактерии, грамотрицательные бактерии, Ь181епа, энтерококк, №188епа, вибрион, трепонему (сифилис), ВоггеПа, лептоспира, СЫатуФа, ретровирусы (ВИО (вирус иммунодефицита обезьян), ВИЧ-1 и ВИЧ-2), коронавирусы, такие как серьезный острый респираторный синдром (δΛΡδ) и ΝΡ-63, цитомегаловирус, ротавирусы, метапневмовирус, респираторно синтициальный вирус (К5У), поксвирусы, вирус Эпштейна-Барра, энтеровирус, морбилливирусы, рабдовирусы (бешенство). Такие агенты, как рубивирусы (краснуха), флавивирусы (денге, желтая лихорадка), вирусы герпеса, вирус Варицелла-Зостер, гепатита С и В, лейшмания, ^хор1а8та доийи, трипаносомы, плазмодий (молниеносная трехдневная малярия, трехдневная малярия, малярия овале), Рпеито- 10 020412 сукйк сашт (РСР) и различные нематоды, трематоды, могут быть, например, липидами, полисахаридными молекулами, белками и пептидами. При использовании для лабораторных исследований способ по данному изобретению может помочь определить иммунную реактивность к исследуемому антигену, белку или пептиду, применимому в разработке вакцин и диагностических тестов.
Некоторые антигенные молекулы, подобные, например, пептидам, идентифицированы как видоспецифические или болезнеспецифические, но их способность индуцировать Т-клеточную реактивность ίη νίνο трудно определить из-за отсутствия чувствительных маркеров. 1Р-10, определенный после стимуляции такими кандидатными антигенами, можно использовать для обследования и идентификации потенциально интересующих новых антигенов или молекул. Более конкретно, в случае антигенов, полученных от М. !иЬегси1о818, С. 1тасЬотаЙ8, ВИЧ-1 или НСУ, 1Р-10 может использоваться исследовательскими институтами при тестировании иммуногенности этих антигенов, а именно как оценку Т-клеточной реактивности для разработки, например, вакцин.
Лечебный эффект
Данное изобретение предполагает, что повторное тестирование спонтанного высвобождения во время инкубации (нулевой образец) и индуцированный антигеном 1Р-10 (Ад образец) во время лечения можно использовать как маркер для лечебного эффекта. Если спонтанные 1Р-10 ответы снижены во время лечения, его можно считать успешным, тогда как, если снижение не наблюдалось, лечение следует подозревать как неудачное.
Данное изобретение предлагает, что повторное тестирование спонтанного и индуцированного антигеном 1Р-10 во время, например, лечения ТВ можно использовать как маркер лечебного эффекта. Если ответы антиген-стимулированного 1Р-10 снижаются во время лечения, его можно рассматривать как успешное, тогда как, если снижение не наблюдается, лечение считают неудачным.
Следует понимать, что любой обсуждаемый здесь признак и/или аспект применительно к определению по данному изобретению применяют по аналогии к диагнозу, прогнозу, мониторингу, обследованию, целям исследования, контактному мечению, улучшенному выявлению случая заболевания и изучению распространения по данному изобретению и наоборот.
Этап инкубации
Клетки системы СМ1 утратили способность устанавливать СМ1 ответ в цельной крови после продленных периодов после забора крови у субъекта, и ответы без вмешательства часто сильно снижаются или отсутствуют 24 ч после забора крови, если не обрабатывать с целью продления жизни клеток, например, без ограничения, хранение при температуре выше 10°С.
В одном варианте осуществления снижение трудоемкости позволяет стимуляцию образца антигенами выполнить в пунктах медицинского обслуживания, таких как кабинеты врачей, клиники, места обслуживания амбулаторных больных и ветеринарные клиники или фермы. Как только выполнена стимуляция антигеном, уже не нужны свежие и активные клетки. 1Р-10 и другие биомаркеры, такие как цитокины или иммунные эффекторные молекулы, стабильны в плазме, и, таким образом, образец можно хранить, замораживать или поставлять без специальных условий или без требований срочности подобно стандартным образцам плазмы, применяемым для другой инфекционной болезни или другого диагноза болезни.
Этап инкубации может длиться от 5 до 144 ч, более предпочтительно 5-120 ч, еще более предпочтительно 12-24 ч, или промежуточный период времени. Таким образом, в одном варианте осуществления по данному изобретению время инкубации составляет 5-24, 26, 30, 36, 42, 48, 72, 96, 120 или 144 ч.
Так как 1Р-10 выделен в таких высоких концентрациях, возможно инкубировать образцы вне инкубатора, а именно на столе в лаборатории или в водяной бане со стабильной температурой или в устройстве для переноски. Это особенно полезно для развивающихся стран или поликлиник со средствами основной лаборатории.
Этап инкубации можно осуществлять при температуре в диапазоне от 20 до 43°С. Таким образом, в одном варианте осуществления по данному изобретению температура инкубации может составлять 16, 18, 20, 22, 25-33, 35, 37-40 или 41°С.
Этап инкубации можно выполнять при нефиксированной температуре, без ограничения, от 15 до 40°С, более предпочтительно от 18 до 37°С, еще более предпочтительно от 30 до 37°С.
Один вариант осуществления данного изобретения позволяет выполнить стимуляцию образца при разбавлении, с добавлением культуральной среды к клеточной культуре.
Другой вариант осуществления данного изобретения позволяет выполнить стимуляцию образца с добавлением инертной разбавляющей жидкости (например, солевой раствор) к клеточной культуре.
Образец
Один вариант осуществления по данному изобретению рассматривает способ измерения СМ1 ответа у субъекта, причем указанный способ включает сбор образца у указанного субъекта, где указанный образец включает клетки иммунной системы, которые способны продуцировать иммунные эффекторные молекулы после стимуляции антигеном, инкубацию указанного образца с антигеном, а затем измерение присутствия или увеличения уровня иммунной эффекторной молекулы, где присутствие или уровень
- 11 020412 указанной иммунной эффекторной молекулы указывает на способность указанного субъекта установить опосредованный клетками иммунный ответ.
В одном варианте осуществления образец получают из группы, включающей кровь, мочу, плевральную жидкость, бронхиальную жидкость, смывы ротовой полости, тканевые биопсии, асциты, гной, цереброспинальную жидкость, аспираторную и фолликулярную жидкость.
В предпочтительном варианте осуществления образец получен из крови.
Однако, образец также может включать клетки, выбранные из группы, включающей цельную кровь, мононуклеарные клетки из плевральной жидкости, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), Т-клетки, СЭ4 Т-клетки, СЭ8 Т-клетки, гамма-дельта Т-клетки, моноциты, макрофаги и ΝΚ клетки.
Удобно, когда образцом является цельная кровь, пробирку для отбора крови обработать антикоагулянтом (например, гепарином). Несмотря на то что цельная кровь является предпочтительным и наиболее удобным образцом, данное изобретение распространяется на другие образцы, содержащие иммунные клетки, такие как, без ограничения, плевральная жидкость, асцитная жидкость, лимфатическая жидкость, спинальная или церебральная жидкость, тканевая жидкость и респираторная жидкость, включая назальную и пульмональную жидкость.
В одном варианте осуществления данное изобретение, таким образом, касается способа, где образец получен из крови, мочи, плевральной жидкости, бронхиальной жидкости, смывов ротовой полости, тканевых биопсий, асцитной жидкости, гноя, цереброспинальной жидкости, аспираторной и/или фолликулярной жидкости.
В другом варианте осуществления данное изобретение, таким образом, касается способа, где образец включает клетки, выбранные из группы, включающей периферические мононуклеарные клетки, Тклетки, СЭ4 Т-клетки, СЭ8 Т-клетки, гамма-дельта Т-клетки, моноциты, макрофаги, дендритные клетки и ΝΚ клетки.
В одном варианте осуществления образцом является цельная кровь, которая может быть собрана в трех приемлемых контейнерах, в которых присутствует антиген, митоген или нулевой контроль. В другом варианте осуществления антигены, митоген или нулевой контроль можно добавить позже к аликвотам, содержащим образец, например, цельную кровь.
В другом варианте осуществления образцом является цельная кровь, которая может быть собрана в пробирки для сбора, содержащие антиген, митоген или нулевой контроль или аликвоты цельной крови, к которым добавляют антиген, митоген или нулевой контроль.
В целом, кровь держат в присутствии антикоагулянта (предпочтительно гепарин, альтернативно, например, цитрат или ΕΌΤΆ (этилендиаминтетраацетат)). Антикоагулянт находится в пробирке для сбора крови при добавлении крови. Применение пробирок для сбора крови предпочтительно, но не обязательно, совместимо со стандартом автоматизированных лабораторных систем, и они соответствуют анализу в большом масштабе и произвольному порядку отбора образцов. Пробирки для сбора крови также минимизируют расходы на обработку и снижают лабораторный контакт с цельной кровью и плазмой и, следовательно, снижают риск персонала лаборатории от контакта с патогенным агентом, таким как, без ограничения, вирус иммунодефицита человека.
Объемы аликвот цельной крови могут составлять 10-4000 мкл, например, без ограничения, 50, 1001000 мкл, 1100-2900 или 3000 мкл.
Образец можно инкубировать в пробирках, лунках тканевой культуры или в других контейнерах, а антиген, митоген и нулевой контроль можно добавлять в соответствующих концентрациях.
Пробирка для сбора крови включает вакуумную пробирку или другие подобные сосуды, но кровь можно также непосредственно собрать в открытую пробирку или капиллярную трубку.
Набор
Данное изобретение дополнительно рассматривает набор для определения способности субъекта устанавливать опосредованный клетками ответ. Набор имеет удобную блочную форму с одним или более блоком, приспособленным для получения образца от субъекта, такого как очищенные клетки цельной крови, биопсии или другой материал. Тот или иной блок может быть также приспособлен к содержанию гепарина, где образцом является цельная кровь.
В целом, набор находится в форме, которая упакована для продажи с комплектом инструкций. Инструкции, в целом, могли бы быть в форме способа измерения СМ1 ответа у субъекта, причем указанный способ включает сбор образца от указанного субъекта, где указанный образец включает клетки иммунной системы, которые способны продуцировать иммунные эффекторные молекулы после стимуляции антигеном, инкубации указанного образца с антигеном, поставляемым с набором, а затем измерение присутствия или увеличения в уровне ΙΡ-10, где присутствие или уровень указанной иммунной эффекторной молекулы указывает на способность указанного субъекта устанавливать опосредованный клетками иммунный ответ.
В одном варианте осуществления набор содержит антиген и моноклональные или поликлональные антитела, которые специфически реагируют с ΙΡ-10 в иммунном анализе, или специфически связывающие фрагменты указанных антител для применения в качестве диагностического реагента.
- 12 020412
Предполагаемый набор по данному изобретению может находиться в многокомпонентной форме, где первый компонент включает множество пробирок для сбора крови, второй компонент включает средства выявления на основе антитела для иммунной эффекторной молекулы, а третий компонент включает комплект инструкций, которые включают следующее: (ί) сбор крови в пробирки для сбора крови; (тт) смешивание пробирок; (ттт) инкубирование пробирок; (ίν) центрифугирование пробирок и сбор плазмы; и (ν) обнаружение иммунных эффекторных молекул в плазме.
Анализ также может быть автоматизирован или полуавтоматизирован, а автоматизацией можно управлять с помощью компьютерной программы.
Анализ по данному изобретению может быть автоматизирован или полуавтоматизирован для высокой пропускной способности обследования или для обследования ряда иммунных эффекторов от одного субъекта. Автоматизацией удобно управлять с помощью компьютерной программы. Данное изобретение рассматривает компьютерный программный продукт, следовательно, для определения присутствия или отсутствия или уровня ΙΡ-10 указанный продукт включает (1) код, который воспринимает как входящие значения идентичность репортерной молекулы, связанной с меченным антителом или мРНК;
(2) код, который сравнивает указанные входящие значения с контрольными значениями для определения уровня репортерных молекул и/или идентичности молекулы, к которой присоединяется репортерная молекула; и (3) считываемый компьютером носитель, который хранит коды.
Еще один аспект данного изобретения распространяется на компьютер для определения присутствия или отсутствия или уровня ΙΡ-10, причем указанный компьютер включает (1) носитель хранения считываемых компьютером данных, составляющий материал хранения данных, закодированный со считываемыми компьютером данными, где указанные считываемые компьютером данные Ι включают входящие значения, которые идентифицируют репортерную молекулу, связанную с меченным антителом или мРНК;
(2) оперативное запоминающее устройство для хранения инструкций для обработки указанных считываемых компьютером данных;
(3) центральный процессор, соединенный с указанным оперативным запоминающим устройством и с указанным носителем считываемых компьютером данных, для обработки указанных считываемых компьютером данных для сравнения указанных значений, чтобы обеспечить оценку идентичности или уровня репортерных молекул или молекул, к которым они присоединены; и (4) аппарат вывода, соединенный с указанным центральным процессором, для получения результатов сравнения.
Специфичность и чувствительность
Чувствительность любого данного диагностического теста определяет пропорцию индивидуумов с положительным ответом, которые корректно идентифицированы или диагностированы с помощью теста, например, чувствительность составляет 100%, если все индивидуумы с данным состоянием имеют положительный тест. Специфичность данного теста обследования отражает пропорцию индивидуумов без состояния, которые корректно идентифицированы или диагностированы с помощью теста, например, специфичность составляет 100%, если все индивидуумы без состояния имеют отрицательный результат теста.
Чувствительность определяют как пропорцию индивидуумов с данным состоянием (например, активная ТВ инфекция), которые корректно идентифицированы с помощью описанных способов данного изобретения (например, имеют положительный результат ΙΡ-10 теста).
Специфичность здесь определена как пропорция индивидуумов без состояния (например, активная ТВ инфекция), которые корректно идентифицированы с помощью описанных способов данного изобретения (например, имеют отрицательный результат ΙΡ-10 теста).
Рабочая характеристическая кривая
Точность диагностического теста лучше всего описана с помощью его рабочей характеристической кривой (КОС) (см. особенно Ζλνοίβ. М.Н., и СатрЪе11, С., С1ш. СЬет. 39 (1993) 561-577). График КОС представляет собой кривую всех пар чувствительности/специфичности, следующих из непрерывного изменения порогового решения по всему диапазону наблюдаемых данных.
Клиническое выполнение лабораторных тестов зависит от его диагностической точности или способности корректно классифицировать субъекты на клинически релевантные подгруппы. Диагностическая точность оценивает способность теста корректно отличать два различных состояния исследуемых субъектов. Такие состояния представляют собой, например, здоровье и болезнь, латентная или свежая инфекция по сравнению с отсутствием инфекции или доброкачественная по сравнению со злокачественной болезнью.
В каждом случае, кривая КОС изображает наложение между этими двумя распределениями с помощью построения кривой чувствительности по сравнению с 1 - специфичностью для полного диапазона порогов решения. По оси у отмечена чувствительность или истинная положительная фракция [определенная как (число истинных положительных результатов теста) (число истинных положительных + чис- 13 020412 ло ложных отрицательных результатов теста]. Она также упоминается как положительная при наличии болезни или состояния. Ее рассчитывают исключительно по пораженной подгруппе. По оси х отмечена ложная положительная фракция или 1 - специфичность [определенная как (число ложных положительных результатов) / (число истинных отрицательных + число ложных положительных результатов)]. Это индекс специфичности и рассчитан исключительно по непораженной подгруппе.
Так как истинные и ложные положительные фракции рассчитывают исключительно отдельно с помощью результатов теста двух различных подгрупп, кривая КОС не зависит от распространения болезни в образце. Каждая точка на кривой КОС представляет пару чувствительность/специфичность, отвечающую конкретному порогу решения. Тест с идеальным различением (нет наложения в двух распределениях результатов) имеет кривую КОС, которая проходит через верхний левый угол, где истинная положительная фракция представляет собой 1,0, или 100% (идеальная чувствительность), а ложная положительная фракция представляет собой 0 (идеальная специфичность). Теоретический график для теста без различения (идентичные распределения результатов для двух групп) является 45° диагональной линией из нижнего левого угла к верхнему правому углу. Большинство кривых попадает между этими двумя крайними значениями. (Если кривая КОС полностью лежит ниже 45° диагонали, это легко исправить изменением критерия положительности с более чем на менее чем или наоборот.) Характерно, чем ближе график к верхнему левому углу, тем выше общая точность теста.
Одной приемлемой задачей количественного определения диагностической точности лабораторного теста является выражение ее целым числом. Наиболее общей оценкой является площадь под кривой КОС. Обычно, эта площадь всегда составляет > 0,5 (если это не так, можно перевернуть правило решения, чтобы сделать ее такой). Значения лежат в диапазоне от 1,0 (идеальное разделение значений теста двух групп) до 0,5 (нет очевидной распределительной разницы между двумя группами значений теста). Площадь не зависит только от конкретной части кривой, такой как точка, наиболее близкая к диагонали или чувствительность при 90% специфичности, а от всей кривой. Это количественное описательное выражение того, насколько кривая КОС близка к идеальной (площадь = 1,0).
Клиническую полезность нового маркера ΙΡ-10 можно определить по сравнению с и в комбинации с другими диагностическими инструментами для данной инфекции. В случае инфекции М. !иЬегси1о818 клиническую полезность нового маркера ΙΡ-10 можно определить по сравнению с общепризнанными диагностическими инструментами - маркером ΙΕΝ-γ или Т8Т. с помощью анализа рабочей характеристической кривой (см. пример 5).
Таким образом, целью предпочтительных вариантов осуществления по данному изобретению является обеспечение иммунологического способа обнаружения, сталкивалось ли млекопитающее с антигеном, причем способ включает этапы, на которых
a) определяют уровень антиген-специфического продуцирования ΙΡ-10 в образце указанного млекопитающего;
b) строят кривую распределения ΙΡ-10 уровня, полученного в здоровой популяции;
c) строят кривую КОС (рабочая характеристическая кривая) на основе ΙΡ-10 уровня, определенного в здоровой популяции, и по ΙΡ-10 уровню, определенному в популяции, которая производит иммунологическую реактивность на рассматриваемый антиген;
ά) выбирают желаемую специфичность;
е) определяют по кривой КОС чувствительность, соответствующую желаемой специфичности; ί) определяют по кривой распределения ΙΡ-10 уровень, соответствующий определенной чувствительности; и
д) прогнозируют индивидуум, обладающий иммунологической реактивностью на антиген, если уровень ΙΡ-10 в образце равен или выше, чем указанный ΙΡ-10 уровень, соответствующий определенной специфичности, и прогнозируют индивидуум как маловероятный или не обладающий иммунологической реактивностью к антигену, если уровень ΙΡ-10 в образце ниже, чем указанный общий ΙΡ-10 уровень, соответствующий определенной специфичности.
Таким образом, другой целью предпочтительных вариантов осуществления по данному изобретению является обеспечение иммунологического способа обнаружения, сталкивалось ли млекопитающее с антигеном, причем способ включает этапы, на которых
a) определяют уровень антиген-специфического продуцирования ΙΡ-10 в образце указанного млекопитающего;
b) строят кривую распределения ΙΡ-10 уровня, полученного от здоровой популяции;
c) строят кривую КОС (рабочая характеристическая кривая) на основе ΙΡ-10 уровня, определенного в здоровой популяции, и по ΙΡ-10 уровню, определенному в популяции, которая производит иммунологическую реактивность на рассматриваемый антиген;
ά) выбирают желаемую чувствительность;
е) определяют по кривой КОС специфичность, соответствующую желаемой чувствительности;
ί) определяют по кривой распределения ΙΡ-10 уровень, соответствующий определенной чувствительности; и
- 14 020412
д) прогнозируют индивидуум как имеющий иммунологическую реактивность к антигену, если уровень ΙΡ-10 в образце равный или выше, чем указанный ГР-10 уровень, соответствующий определенной чувствительности, и прогнозируют индивидуум как маловероятный или не имеющий иммунологической реактивности к антигену, если уровень ΙΡ-10 в образце ниже, чем указанный общий ΙΡ-10 уровень, соответствующий определенной чувствительности.
Специфичность способа по данному изобретению может составлять от 70 до 100%, более предпочтительно 80-100%, более предпочтительно 90-100%. Таким образом, в одном варианте осуществления по данному изобретению специфичность данного изобретения составляет 80-99 или 100%.
Чувствительность способа по данному изобретению может составлять от 70 до 100%, более предпочтительно 80-100%, более предпочтительно 90-100%.
Таким образом, в одном варианте осуществления по данному изобретению чувствительность данного изобретения составляет 80-99 или 100% (см. пример 5).
Уровень ΙΡ-10 сравнивают с рядом контрольных данных или контрольным значением, таким как пороговое значение, для определения, имеет ли субъект повышенный риск или вероятность, например, инфекции.
Для увеличения эффективности выявления уровень ΙΡ-10 в крови можно сравнить с рядом контрольных данных, чтобы определить вероятность инфицирования субъекта, или имеет ли он повышенный риск развития, например, инфекции.
Для увеличения эффективности выявления индуцированный ΡΗΑ ΙΡ-10 уровень и стимулированный антигеном уровень ΙΡ-10 можно сравнить с рядом контрольных данных, чтобы определить, имеет ли субъект инфекцию или повышенный риск развития инфекции или болезни.
Чтобы определить, имеет ли пациент повышенный риск развития, например, инфекции, следует установить порог. Этот порог может быть установлен лабораторией, врачом или на индивидуальной основе каждым пациентом.
Альтернативно точку разделения можно определить как среднее, медиану или среднее геометрическое отрицательной контрольной группы ((например, неинфицированные, здоровые неподвергавшиеся пациенты без ТВ инфекции) +/-одно или более стандартное отклонение или значение, полученное от стандартного отклонения).
Следующая проблема антигена заключается в том, что некоторые индивидуумы сильно отвечают на биомаркер, тогда как не отвечают на другие. Например, некоторые индивидуумы могут не показывать или ΙΡ-10, или ΙΡΝ-γ ответы, таким образом, продуцируя низкие уровни только ΙΡ 10 или ΙΡΝ-γ. В этих случаях одновременное измерение двух, трех, четырех или более биомаркеров усилит чувствительность анализа и увеличит число положительных отвечающих. С помощью объединения ΙΡ-10 и одного или более биомаркера, такого как, без ограничения, ΙΡΝ-γ, ΙΡ-2 или МСР-1, поэтому возможно сделать диагностические прогнозирования, которые менее чувствительны к анергии на один биомаркер.
В другом предпочтительном варианте осуществления ΙΡ-10 измерения объединяют с измерениями одного или более других биомаркеров и сравнивают с объединенным контрольным уровнем. Оцененные биомаркерные уровни можно объединить с помощью арифметических действий, таких как сложение, вычитание, умножение и арифметические операции с процентами, квадратным корнем, возведением в степень и логарифмическими функциями. Различные биомаркерные комбинации и различные средства вычисления объединенного контрольного значения можно выполнить средствами, известными квалифицированному специалисту.
В другом предпочтительном варианте осуществления отдельные измерения биомаркеров (таких как, без ограничения, ΙΡ-10 в комбинации с ΙΡΝ-γ и/или ТС-2) можно объединить после того, как концентрацию отдельного биомаркера сравнили с контрольным уровнем, например, пороговой точкой. Этот подход дает результат теста, охватывающий не только отдельные антигены, но также несколько биомаркеров в одном. Различные биомаркерные комбинации и различные средства вычисления объединенного контрольного значения можно выполнить средствами, известными квалифицированному специалисту.
В одном варианте осуществления по данному изобретению комбинация биомаркера ΙΡ-10 и одного из биомаркеров, выбранных из группы, включающей МСР-1, ΙΡ-2 и ΙΝΡ-γ, предусматривает синергический эффект по отношению к чувствительности и/или специфичности.
В еще одном варианте осуществления по данному изобретению комбинация биомаркера ΙΡ-10, МСР-1 и ΙΡ-2 предусматривает синергический эффект по отношению к чувствительности и/или специфичности.
В следующем варианте осуществления по данному изобретению комбинация биомаркера ΙΡ-10, МСР-1 и ΙΡΝ-γ предусматривает синергический эффект по отношению к чувствительности и/или специфичности.
В другом варианте осуществления по данному изобретению комбинация биомаркера ΙΡ-10, ΙΡ-2 и ΙΡΝ-γ предусматривает синергический эффект по отношению к чувствительности и/или специфичности.
Специфически, как используется здесь, синергия означает явление, когда несколько биомаркеров, действуя вместе, создают объединенный биомаркерный сигнал с большей чувствительностью или спе- 15 020412 цифичностью для диагноза, чем предсказанная с помощью знания только отдельных биомаркеров чувствительность или специфичность, таким образом, снижается число ложного положительного и увеличивается разделяющая способность.
При считывании на основе антитела, таком как, без ограничения, ЕЫ8А или иммунохроматографический тест с полосками, два или более антитела, связывающих различные биомаркеры, позволят повысить связывание общего количества биомаркера, тем самым, действуя в синергии и приводя к более сильным ответам, и повышая чувствительность теста. Объединенное считывание можно выполнить согласно изложенным здесь идеям.
Оценка риска
Данное изобретение успешно идентифицирует новый маркер для измерения опосредованного клетками ответа на антиген. Концентрация маркера ΙΡ-10 повышается у субъектов с опосредованным клетками иммунным ответом на антиген. И ΙΡ-10, кажется, является эффективным маркером для выявления, например, инфекции М. 1иЬегси1о818.
Чувствительность выше, чем с любым другим установленным маркером, а специфичность сопоставима или лучше, чем с любыми другими установленными маркерами (см., например, примеры 4, 5 и 10).
Статистическое объяснение может быть основано, например, на риске наличия болезни в зависимости от возраста, занятия, воздействия, генетического фона, НЬЛ-типа.
Пороговые точки могут варьировать в зависимости от специфических состояний тестируемого индивидуума, таких как, без ограничения, риск наличия болезни, занятие, географическое место жительства или воздействие.
Пороговые точки могут варьировать в зависимости от специфических состояний тестируемого индивидуума, таких как, без ограничения, возраст, пол, генетический фон (а именно НЬЛ-тип), приобретенная или врожденная нарушенная иммунная функция (например, ВИЧ инфекция, диабет, пациенты с нарушением почек или печени, пациенты, получающие лечение модифицирующими иммунитет лекарственными средствами, такими как, без ограничения, кортикостероиды, хемотерапия, ΤΝΡ-α блокаторы, ингибиторы митоза).
Выполняя регулировку разрешающего или порогового предела, можно будет, таким образом, определить чувствительность теста по обнаружению инфекции, если она присутствует, или ее специфичность для исключения инфекции или болезни, если ниже этого предела. Поэтому принцип заключается в том, что значение выше пороговой точки показывает повышенный риск, а значение ниже пороговой точки показывает пониженный риск.
Кроме того, тестовые образцы с неопределенными результатами следует объяснять отдельно. Неопределенные результаты определены как результат с неожиданно низким уровнем ΙΡ-10 в стимулированном митогеном образце (РНА). Окончательную пороговую точку для неопределенного ΙΡ-10 результата можно определить согласно исследуемой группе, особенно у иммуносупрессированных пороговый уровень можно выбрать при более низком уровне.
Пороговые уровни
Как в целом будет понятно специалисту в данной области, способы обследования опосредованной клетками иммунной реактивности представляют собой процессы принятия решения путем сравнения. Для любого процесса принятия решения необходимы контрольные значения на основе субъектов с интересующей болезнью или состоянием и/или субъектов без интересующей болезни, инфекции или состояния.
Пороговый уровень (или пороговая точка) может быть основан на нескольких критериях, включая число субъектов, которые были привлечены для дополнительного инвазивного диагностического тестирования, средний риск наличия и/или развития, например, инфекции ко всем субъектам, привлеченным для дополнительного диагностического тестирования, решение, что любого субъекта, чей специфических для пациента риск выше, чем определенный уровень риска, такой как, например, 1 к 400 или 1:250 (как определено организацией, проводящей обследование, или отдельным субъектом), следует привлечь для дополнительного инвазивного диагностического тестирования, или другие критерии, известные специалисту в данной области.
Пороговый уровень можно регулировать на основе нескольких критериев, таких как, без ограничения, определенная группа тестированных индивидуумов. Например, пороговый уровень можно установить ниже для индивидуумов с иммунодефицитом и для пациентов с большим риском развития активной болезни, или же порог может быть более высоким в группах здоровых индивидуумов с низким риском развития активной болезни.
В одном варианте осуществления данное изобретение раскрывает способ определения, имеет ли субъект инфекцию, при котором (a) получают от субъекта образец и (b) количественно определяют концентрацию ΙΡ-10, присутствующего в образце, присутствие ΙΡ-10 полипептида в образце при концентрации, равной или выше, чем выбранный порог, показывает, что субъект может быть инфицирован.
Более специфически, один аспект данного изобретения касается иммунологического способа,
- 16 020412 включающего этапы, на которых
a) инкубируют образец, полученный от млекопитающего, по меньшей мере с одним антигеном;
b) определяют ΙΡ-10 уровень в указанном образце;
c) сравнивают указанный определенный ΙΡ-10 уровень с контрольным уровнем, тем самым определяют, сталкивалось ли ранее млекопитающее с антигеном, производящим иммунологическую реактивность к антигену, или сталкивалось ранее с другими антигенами, производящими иммунологическую перекрестную реактивность к антигену.
Более специфически, другой аспект данного изобретения касается иммунологического способа, включающего этапы, на которых
a) инкубируют образец, полученный от млекопитающего, по меньшей мере с одним антигеном без какой-либо последующей стимуляции и при условии, что антиген не является ΡΡΌ;
b) определяют ΙΡ-10 уровень в указанном образце;
c) сравнивают определенный ΙΡ-10 уровень с контрольным уровнем, тем самым определяют, сталкивалось ли ранее указанное млекопитающее по меньшей мере с одним антигеном, производя иммунологическую реактивность к указанному антигену (антигенам), или сталкивалось ранее с другими антигенами, производя иммунологическую перекрестную реактивность к антигену (антигенам).
В одном варианте осуществления данное изобретение касается способа по данному изобретению, где образец делят по меньшей мере на 2 фракции и
a) инкубируют образец, полученный от млекопитающего, по меньшей мере с одним антигеном без какой-либо последующей стимуляции и при условии, что антиген не является ΡΡΌ, для образования образца с ответом;
b) инкубируют вторую фракцию образца с неактивным раствором для образования нулевого образца;
c) определяют ΙΡ-10 уровень в двух фракциях;
Д) определяют зависимый от антигена ΙΡ-10 ответ образца, вычитая ΙΡ-10 уровень, определенный в нулевом образце, от ΙΡ-10, определенного в образце с ответом;
е) сравнивают зависимый от антигена ΙΡ-10 ответ или значение, полученное от него, с контрольным уровнем или значением, полученным от него, тем самым определяют, сталкивалось ли ранее млекопитающее с антигеном и, таким образом, производит ли иммунологическую реактивность к антигену, или сталкивалось ранее с другими антигенами, производя иммунологическую перекрестную реактивность к антигену, и/или инфекция собирается развиться.
Отличительное значение представляет собой значение, которое определили путем измерения параметра или параметров и в здоровой контрольной популяции, и в популяции с известной инфекцией, тем самым определяющее отличительное значение, которое идентифицирует инфицированную популяцию или с предопределенной специфичностью, или с предопределенной чувствительностью, на основе анализа связи между значениями параметра и известными клиническими данными здоровой контрольной популяции и популяции инфицированных пациентов, как видно из детального обсуждения в примерах данного описания. Отличительное значение, определенное таким способом, действительно для той же экспериментальной схемы в будущих отдельных тестах.
В специфических экспериментальных схемах, описанных здесь (пример 5), пороговый уровень ΙΡ10, принимаемый как пороговое значение, как обнаружили, находится в диапазоне, без ограничения, 141000 пг/мл. Предпочтительно порог находится в диапазоне от 100 до 800 пг/мл, таком как 100-600, например, в диапазоне 150-400, таком как 150-300, например, в диапазоне 150-250, таком как 175-215.
Предпочтительно пороговый значение составляет 180-224 или 225 пг/мл.
Разбавление образца, объединенные измерения с другими параметрами, такими как, без ограничения, интерлейкин-2, интерферон гамма и/или макрофаговый хемотаксический белок-1, или другие параметры, приведут к другим пороговым значениям, которые можно определить согласно изложенным здесь идеям. Другие экспериментальные схемы, другие образцы, другие антигены и другие параметры, конечно, приведут к другим пороговым значениям, которые специалист в данной области может определить согласно изложенным здесь идеям с помощью нормальных разработанных методик или обычных экспериментов.
Уровень индуцированного специфического к антигену биомаркера также зависит от антигенов, выбранных для стимуляции. Некоторые антигены являются более мощными индукторами, чем другие, а также число различных доступных антигенов, а именно пептидов, приведет к повышенному числу отвечающих клеток и более высокому продуцированию биомаркера. Следовательно, пороговая точка также зависит от антигена и болезни. Кроме того, другие виды имеют другие спектры антигена главного комплекса гистосовместимости, следовательно, те же антигены, тестированные в различных видах, приведут к видоспецифическим порогам.
Измерения биомаркерной концентрации можно перевести в международные ед. (МО). МО сопоставляется с биологической активностью биомаркера и является контролем для определения эффективности различных способов измерений. В других вариантах осуществления данного изобретения определен- 17 020412 ное пороговое значение можно объединить с индексом стимуляции (определенным как концентрация антиген-стимулированного ΙΡ-10, деленная на концентрацию нестимулированной плазмы).
Значение индекса стимуляции, как обнаружили, находится в диапазоне, без ограничения, 1-6 или выше. Предпочтительно индекс стимуляции составляет по меньшей мере 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, 3,25, 3,5, 3,75 или 4. Данное изобретение раскрывает значение индекса стимуляции в диапазоне, кратном нескольким сотням. Таким образом, рассматривается значение индекса стимуляции по меньшей мере 10, 20, 50, 75, 100, 200, 300 или даже 1000.
Порог и индекс стимуляции могут быть различными для латентной инфекции, свежей инфекции, субклинической инфекции или активной инфекции. Более специфически, в случае инфекции М. ШЬегси1о818 пороговое значение и индекс стимуляции могут быть различными, например, для экстрапульмонального ТВ, пульмонального ТВ или и того, и другого, вылеченной инфекции, латентного ТВ. Порог и индекс стимуляции, уровень изменения могут быть различными, где инфекция обнаружена в присутствии ВИЧ, других совместных инфекций, иммунной супрессии.
В зависимости от распространения или ожидаемого распространения присутствия болезни пороговый уровень и/или индекс стимуляции можно отрегулировать для получения как можно меньшего количества ложных положительных или как можно меньшего количества ложных отрицательных результатов, как требуется, в зависимости от тяжести болезни и последствий определения, является ли пациент положительным по тесту или отрицательным по тесту. В случае туберкулеза анализ, представленный в данном изобретении, имеет четкое преимущество над другими ίη νίΙΐΌ тестами, доступными в настоящее время. Так как антиген-специфическое продуцирование ΙΡ-10 выше, чем продуцирование ΙΡΝ-γ (см., например, примеры 4 и 17), порог и индекс стимуляции можно регулировать в более широких диапазонах, таким образом, расширяя возможности диагностирования.
Пороговый уровень может быть различным, если нужно диагностировать одного пациента с симптомами, или если тест применяют при обследовании большого числа индивидуумов в популяции.
Порог и индекс стимуляции могут быть основаны на объединенных ΙΡ-10 измерениях и измерениях других биомаркеров, таких как, без ограничения, интерлейкин-2, интерферон гамма (ΙΝΡ-γ) и/или моноцит/макрофаговый хемотаксический белок-1 (МСР-1). Соединение порога и/или индекса стимуляции может привести к другим значениям, которые можно определить согласно идеям данного изобретения.
Хотя любой из известных аналитических способов измерения уровней этих анализируемых образцов будет функционировать в данном изобретении, как очевидно для специалиста в данной области, аналитический способ, применяемый для каждого маркера, должен быть тем же способом, применяемым для получения контрольных данных для конкретного маркера. Если новый аналитический способ применяется для конкретного маркера или комбинации маркеров, должен быть получен новый набор контрольных данных на основе данных, полученных способом.
Многопараметровый дискриминантный анализ и другие оценки риска можно выполнить на пакете статистических данных коммерчески доступной компьютерной программы 81а11511са1 Апа1у818 8у51ет (произведенной и продаваемой 8А8 ПъШШе Пзс.) или с помощью других способов мультипараметрового статистического анализа или других пакетов статистических данных или программного обеспечения, известного специалисту в данной области.
Как очевидно для специалиста в данной области, в любом из вариантов осуществления, обсуждаемых выше, изменение рискового порогового уровня положительного теста или использование различных априорных рисков, которые могут относиться к различным подгруппам в популяции, могло бы изменить результаты дискриминантного анализа для каждого пациента.
Тесты на стабильность, описанные здесь, предполагают, что ΙΡ-10 высоко стабильный при стандартной обработке (а именно замораживание или хранение в течение длительного времени при комнатной температуре и температурах ниже 10°С); таким образом, данное изобретение заключает, что ΙΡ-10 является эффективным аналитом для клинического применения. Данные, представленные здесь, показывают, что ΙΡ-10 потенциально важный маркер для применения в прогнозировании, диагностике, мониторинге и обследовании инфекционных болезней.
Для того чтобы определить клиническую тяжесть опосредованной клетками иммунной реактивности, средство для оценивания обнаруживаемого сигнала измеренного ΙΡ-10 включает контроль или контрольное средство.
Контроль также позволяет рассчитать в анализе и вариантах способа набор вариантов, обработанных вариантов, вариантов, связанных с объединением ΙΡ-10 и других биомаркеров, и других вариантов, не связанных напрямую или косвенно с ΙΡ-10 уровнем.
В контексте данного изобретения выражение контроль касается стандарта по отношению к количеству, качеству или типу, против которого можно сравнивать другие значения или характеристики, такой как, например, стандартная кривая.
Контрольные данные отражают уровень ΙΡ-10 для субъектов с опосредованной клетками иммунной реактивности (также рассматривают как пораженные, подвергнувшиеся, вакцинированные, инфицированные или больные) и/или уровень ΙΡ-10 для нормальных субъектов (также рассматривают как непора- 18 020412 женные, неподвергнувшиеся, невакцинированные, неинфицированные или здоровые).
В еще одном варианте осуществления по данному изобретению устройство выбрано из группы, включающей анализ, иммуноанализ, тест-полоску, сухую тест-полоску, электрическое устройство, электрод, устройство для считывания (спектрофотометрические устройства для считывания, ΙΡ-устройства для считывания, изотопные устройства для считывания и аналогичные устройства для считывания), гистохимию и подобное средство, включающее контроль, фильтровальную бумагу, цветную реакцию, видимую невооруженным глазом.
ΙΡ-10
ΙΡΝ-γ-индуцируемый белок 10 (ΙΡ-10) или СХСЬ10 является хемокином. Ген ΙΡ-10 картирован на 4с|21 с помощью ш 8Йи гибридизации. Экспрессия ΙΡ-10 активируется интерферонами (ΙΡΝ, а именно интерфероном гамма (ΙΡΝ-γ)) и воспалительными стимулирующими средствами, и он экспрессирован при многих воспалительных болезнях ТЫ-типа в ряде тканей и типах клеток.
Последовательность гена человека можно найти в Λί'.’ί'.ΈδδΙΟΝ № ВС010954 (д 15012099) в банке генов.
Хемокины представляют собой группу небольших (приблизительно 8-14 кДа), преимущественно основных, родственных по структуре молекул, которые регулируют клеточную направленную миграцию различных типов лейкоцитов путем взаимодействий с подгруппой 7-трансмембранных, соединенных с О белком рецепторов. Хемокины также играют фундаментальные роли в развитии, гомеостазе и работе иммунной системы, и они влияют на клетки центральной нервной системы, а также на эндотелиальные клетки, вовлеченные в ангиогенез или ангиостаз. Хемокины делят на 2 главных подсемейства, СХС и СС, на основе расположения первых 2 из 4 консервативных цистеиновых остатков; 2 цистеина отделены одной аминокислотой в СХС хемокинах и расположены рядом в СС хемокинах. СХС хемокины дополнительно подразделяют на ЕЬР и НеЕЬР типы на основе присутствия или отсутствия смежной последовательности д1и-1еи-агд и Ν концом к СХС мотиву. Тип ЕЬР является хемотаксическим для нейтрофилов, тогда как тип НеЕЬР хемотаксический для лимфоцитов.
ΙΡ-10 ингибирует формирование колоний костного мозга, обладает противораковой активностью ш У1уо, является хемоаттрактантом для моноцитов человека и Т-клеток и способствует Т-клеточной адгезии к эндотелиальным клеткам. ΙΡ-10 является мощным ингибитором ангиогенеза ш У1уо. ΙΡ-10 может участвовать в регуляции ангиогенеза во время воспаления и онкогенеза. ΙΡ-10 является также мишеневым геном ΡΛδ и надэкспрессирован при большинстве колоректальных раков. С помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса показали, что ΙΡ-10 взаимодействовал с Ν концом СХСР3 через гидрофобную щель, образованную Ν-петлей и 408-петлевой областью ΙΡ-10, подобно взаимодействию поверхности других хемокинов, таких как ГЬ8. Была обнаружена дополнительная область взаимодействия, которая состояла из гидрофобной щели, образованной Ν концом и 308 петлей ΙΡ-10. Предполагают, что механизм, вовлекающий 308 петлю и конфигурацию бета нити 2, может объяснять взаимодействие и антагонистическую функцию ΙΡ-10 с ССР3.
В случае туберкулеза высокие уровни ΙΡ-10 обнаружили при туберкулезной гранулеме лимфатического узла и легкого, в плевральных выпотах и в сыворотке или плазме пациентов с ТВ и сопутствующей инфекцией ТВ-ВИЧ, проверяя синдром восстановления иммунитета.
Определение уровня ΙΡ-10
Иммунной эффекторной молекулой предпочтительно является цитокин, такой как, без ограничения, ΙΡ-10. Присутствие или уровень иммунного эффектора можно определить по уровню самой молекулы или по степени, с которой ген экспрессирован. Уровень ΙΡ-10 оценивают с помощью общепринятых аналитических способов, таких как иммунологические способы, известные в данной области.
Измерения иммунного эффектора можно комбинировать с измерениями других иммунных эффекторов по уровню гена, РНК или белка согласно изложенным здесь идеям.
Как заявлено выше, выявление иммунных эффекторных молекул можно выполнить по уровням белка или нуклеиновой кислоты. Следовательно, контроль присутствия или уровня указанной иммунной эффекторной молекулы включает прямые и непрямые данные. Например, высокие уровни ΙΡ-10 мРНК являются непрямыми данными, показывающими повышенные уровни ΙΡ-10. Лиганды к иммунным эффекторам, в частности, применяются при обнаружении и/или количественном анализе этих молекул.
В частности, применяются антитела к иммунным эффекторам. Методики для анализов, предполагаемых здесь, известны в данной области и включают, например, сэндвич-анализы, хМАР мультиплексирование, Ьитшех, ЕП§А и ЕП§ро1. Контроль к антителам включает части антител, оптимизированные для млекопитающих (таттаПаш/еб) антитела (например, гуманизированные (1шташ8еб)). рекомбинантные или синтетические антитела и гибридные и одноцепочечные антитела.
И поликлональные, и моноклональные антитела получают с помощью иммунизации с иммунными эффекторами или их антигенными фрагментами, и каждый тип используется для иммуноанализов. Способы получения обоих типов сыворотки хорошо известны в данной области.
Поликлональная сыворотка менее предпочтительна, но ее относительно легко получать с помощью инъекции приемлемого лабораторного животного с эффективным количеством иммунного эффектора
- 19 020412 или его антигенной части, забора сыворотки или плазмы у животного и выделения специфической сыворотки любой из известных иммуно-абсорбентных методик. Хотя антитела, полученные этим способом, применимы фактически в любом типе иммуноанализа, они в целом менее полезны по причине потенциальной гетерогенности продукта.
Применение моноклональных антител в иммуноанализе особенно предпочтительно из-за способности продуцировать их в больших количествах и гомогенности продукта. Получение гибридомных клеточных линий для продуцирования моноклонального антитела, полученного с помощью слияния бессмертной клеточной линии и лимфоцитов, сенсибилизированных против иммуногенного препарата, можно выполнить с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области.
Выявление можно также получить или прямой оценкой ТР-10 с помощью специфического антитела при иммуноанализе конкурентной флуоресцентной поляризации (ΤΈΡΑ), или выявлением гомодимеризации интерферона-гамма с помощью индуцированной димеризацией флуоресцентной поляризации (ОШР). В любом случае, выявление и количественная оценка будет составлять вплоть до или менее чем 6 пг/мл.
В способе, применяемом в настоящее время, в поставляемом образцовом материале предел выявления анализа составляет 6 пг/мл, с модификациями он может быть ниже.
Если материал образца разбавлен, концентрация №-10 в указанном образце будет ниже, но все еще будет определяться (см. пример 9). Другие экспериментальные схемы и другие параметры дадут другие значения, которые можно определить согласно изложенным здесь идеям.
Квалифицированному специалисту известны несколько методик определения биологических маркеров, таких как №-10. Присутствие или уровень иммунного эффектора можно определить с помощью ΕΟδΑ, Ьиттех, ЕГ^РО^ методик на основе мРНК, подобных ΡΤ-РСР, или внутриклеточной проточной цитометрии.
Ьиттех
Интерферон гамма (№Ν-γ) был золотым стандартом для ΤΗ1 ответа для иммунологии инфекционных болезней и, особенно, для иммунологии ТВ. ΞΕΝ-γ, определенный с помощью Ьиттех, является плохим маркером из-за более низкой чувствительности по сравнению с коммерческим ΕΟδΑ, разработанным для теста ОиапИГегоп (см. пример 10). Однако, ВР-Ю легко обнаруживать с помощью Ьиттех, и, следовательно, можно заменить ΖΡΝ-γ как инструмент обследования в системе Ьиттех.
Данные, предусмотренные в некоторых из примеров, ниже, получены с помощью применения Ьиттех, который позволяет мультиплексирование аналитов в растворе с проточной цитометрией. С помощью уместной методики Ьиттех по сути дела кодирует по цвету микросферы хМАР, комбинируя различные отношения двух флуоресцентных красок. Каждый комплект гранул конъюгируется с разным захваченным антителом. Применение выявления антител с помощью Р-фикоэритринового мечения позволяет количественное определение реакций между антигеном и антителом, происходящих на поверхности микросферы, путем измерения относительной интенсивности флуоресценции.
Система способна измерить множество образцов небольших объемов и до 100 различных аналитов можно оценить одновременно в одном 50 мкл образце.
Настоящие данные получили по протоколу Вюкоигсе. Кратко, суспензии гранул от отдельного ЬР-10 и наборы ΖΡΝ-γ объединили в лунках 96-луночного планшета с предварительно смоченной фильтровальной бумагой. Гранулы дважды промыли раствором для промывания и добавили буфер для инкубации.
Образцы (здесь 4-50 мкл) разбавили 1:32, 1:10, 1:8 или 1:1 методом разведения и добавили в планшет. Планшет инкубировали 2 ч при комнатной температуре при 600 грт на шейкере для титровальных планшетов. После двух промываний добавили 100 мкл коктейля выявляемых антител на лунку, и планшет инкубировали при комнатной температуре 1 ч на шейкере для титровальных планшетов. После двух промываний добавили 100 мкл раствора стрептавидина с ΡΡΕ (Р-фикоэритрин) на лунку. В заключение, после 30 мин инкубации и трех промываний добавили 100 мкл раствора для промывания в каждую лунку, и планшет поместили на платформу ΧΥ Ьиттех.
Для каждой лунки проанализировали минимум 100 специфических по аналиту гранул по флуоресценции и гранул, и ΡΡΕ.
ΕΟδΑ
Данные, предусмотренные в некоторых из примеров, ниже, получены с помощью применения ΕΟδΑ согласно протоколу Вюкоигсе. Образцы (5-50 мкл) добавили в лунки 96-луночного плоскодонного планшета с предварительно помещенными ЬР-10 антителами. Во все лунки добавили 50 мкл биотинового конъюгата. Планшет закрыли и инкубировали при комнатной температуре 3 ч, затем содержимое лунок аспирировали и промыли 4х рабочим буфером для промывания. Затем добавили 100 мкл разбавленного стрептавидин-НРР (пероксидаза хрена) во все лунки, планшет закрыли и инкубировали при комнатной температуре 30 мин. Затем лунки аспирировали и промыли 4х рабочим буфером для промывания, затем в каждую лунку добавили 50 мкл стабилизированного хромогена, а планшет инкубировали при комнатной температуре 30 мин, защищая от света. В заключение 100 мкл стоп-раствора добавили в каждую лунку, и планшет считывали на устройстве для считывания ΕΟδΑ при 450 нм.
- 20 020412
Иммунохроматографические тесты (1СТ)
Принцип теста: 1СТ (например, латеральная полоска) представляет собой ίη νίΙΐΌ иммунодиагностический тест, в котором используют первичное антитело (ЛЬ) и одно-четыре вторичных ЛЬ, все специфические к ΙΡ-10. Первичное АЬ присоединяется к коллоидальному золоту и впитывается в подушечку для образца с полосой, содержащей одно вторичное АЬ в фиксированной линии.
На первом этапе инкубированный образец добавляют в левую часть подушечки для образца. Сыворотка или плазма будет течь вперед на полосу, позволяя любому присутствующему ΙΡ-10 связаться с меченным коллоидальным золотом первичным АЬ. Вторичное АЬ иммобилизовано на линии поперек мембраны полосы. Когда карта закрыта, образец и меченное первичное АЬ на полосе подушечки контактирует с краем мембраны. Затем образец и меченное первичное АЬ мигрируют вдоль полосы мембраны, пересекая линию иммобилизованного вторичного АЬ. Объяснение теста: любой ΙΡ-10, образовавший комплекс с меченым золотом первичным АЬ, захватывается вторичным АЬ на мембране, и на линии происходит изменение цвета. Тогда тест объясняется либо а) по интенсивности цвета, либо Ь) путем сравнения двух тестов, один из которых выполнен на образце с ответом (например, плазма стимулированного антигеном тестируемого материала, такого как цельная кровь), а другой выполнен на нулевом образце, каждый вычитает интенсивность изменения цвета в нулевом тесте от интенсивности изменения цвета в тесте Ад и сравнивают это с контролем.
Считывание теста также можно автоматизировать или полуавтоматизировать с помощью компьютеризированного интерфейса. Эту схему можно было бы построить так, что автоматизированный интерфейс определит интенсивность изменения цвета на линии.
Инфекция
Один аспект данного изобретения касается способа, где антиген-специфических ΙΡ-10 ответ выше контрольного уровня показывает, что млекопитающее ранее сталкивалось с антигеном или сталкивалось ранее с другими антигенами, производящими перекрестную реактивность к антигену по причине, например, инфекционной стадии, такой как активная болезнь, активная субклиническая инфекция, свежая или латентная инфекция или вакцинирование).
Микроорганизм
По данному изобретению инфекции могут быть вызваны микроорганизмами, такими как, без ограничения, бактерии, паразиты, грибы, вирусы, прионы и/или вироиды.
В представленном предпочтительном варианте осуществления микроорганизм выбран из группы, включающей микобактерии, грамположительные бактерии, грамотрицательные бактерии, ЫкЮпа, энтерококк, №1ккепа, вибрион, трепонему (сифилис), ВоггеПа, лептоспиру, СЫатуФа, ретровирусы (ВИО, ВИЧ-1 и ВИЧ-2), цитомегаловирус, поксвирусы, вирус Эпштейна-Барра, энтеровирус, морбилливирусы, рабдовирусы (бешенство), рубивирусы (краснуха), флавивирусы (денге, желтая лихорадка), вирусы герпеса, вирус Варицелла-Зостер, гепатита С и В, лейшманию, Тохор1акта допйп, трипаносомы, плазмодий (молниеносная трехдневная малярия, трехдневная малярия, малярия овале), РпеитосукБк сатит (РСР), коронавирусы (например, серьезный острый респираторный синдром (8АКБ), вирус Эбола или марбургский вирус и различные нематоды, трематоды.
В еще более предпочтительном варианте осуществления микроорганизм выбран из группы, включающей МусоЬасЮпит, ЬещЬтата, СЫатуФа, Тгурапокота и ЗсЫкЮкота.
В случае, когда инфекция представляет собой или вызывается МусоЬас1етшт, указанная МусоЬас!етшт принадлежит комплексным организмам М. 1иЬегси1ок1К (М. 1иЬегси1ок1К, М. Ьоν^к и М. аГпсапит), МусоЬас!егшт, у которых область различия (ΡΌ1) не была удалена (М. капкаки, М. к/и1дак М. тагшит, М. Гкп'ексепк, М. дак1гп), МусоЬаскетшт, патогенным для людей (М. апшп и М. 1ерга), и другим нетуберкулезным МусоЬаскетшт.
Таким образом, в одном представленном предпочтительном варианте осуществления МусоЬаскетшт представляет собой М. киЬегси1ок1К.
В случае, когда инфекция представляет собой или была вызвана СЫатуФа, указанная СЫатуФа может быть выбрана из группы, включающей С. ктаскотайк, С. тштйатат и С. кшк, С. рпеитотае и/или С. рыйаск
В предпочтительном варианте осуществления по данному изобретению СЫатуФа представляет собой С. (гаскотакк.
Вакцинация
Один аспект данного изобретения касается способа, где зависимый от антигена ΙΡ-10 ответ выше контрольного уровня показывает, что млекопитающее сталкивалось ранее с антигеном или сталкивалось ранее с другими антигенами, производя перекрестную реактивность к антигену по причине вакцинации против какого-либо упомянутого здесь микроорганизма.
Ответ на вакцину на основе нежизнеспособного материала может привести к низким уровням высвобождения антиген-специфического ΙΡΝ-γ, а так как ΙΡ-10 высвобождается в высоких количествах, его можно использовать для обнаружения ответов на вакцину в доклинических, клинических испытаниях, а затем в общепринятой установке.
- 21 020412
Туберкулез
Туберкулез (обычно сокращаемый как ТВ) является инфекционной болезнью, вызванной бактерией МусоЬас!егшт 1иЬегси1о818, которая наиболее часто поражает легкие (пульмональный ТВ), но может также поражать все другие органы в организме, например, центральную нервную систему (менингит), лимфатическую систему, кровеносную систему (милиарный туберкулез), мочеполовую систему, кости и суставы. Инфекция М. 1иЬегси1о818 может также остаться бессимптомной стадией, которая обычно известна как латентная, неактивная или субклиническая ТВ инфекция.
В представленном предпочтительном варианте осуществления данное изобретение касается способа диагностирования и мониторинга различных, например, отличных, картин туберкулеза: активная туберкулезная болезнь, активная положительная микроскопия или отрицательная микроскопия ТВ инфекции, латентная туберкулезная инфекция и свежая туберкулезная инфекция.
Иммунный анализ основан на оценивании продуцирования ΙΡ-10 антиген-специфическим Тлимфоцитом при взаимодействии с представляющими антиген клетками (например, моноциты/макрофаги), отвечающими на выбранные пептидные последовательности секреторных белков МТВ. Эти пептидные последовательности выбраны по их иммуногенности и их специфичности, а также потенциально можно использовать другие пептиды.
Способ и набор можно применять для диагностирования активной туберкулезной болезни, для диагностирования свежей инфекции у здоровых, контактирующих с пациентом, страдающим положительным по мокроте пульмональным туберкулезом, для диагностирования здоровых с латентной инфекцией, для мониторинга ответа на лечение в случае пульмонального и экстрапульмонального туберкулеза и для различия между латентной инфекцией и активным состоянием туберкулезной болезни.
Хламидия
Хламидия является общим выражением для инфекции с какой-либо бактерией, принадлежащей таксономической группе СЬ1атуб1ае. СЫатуб1а (гаскотаЖ является главной причиной инфекции глаз человека и половых органов. С. (гаскотаЖ естественно нашли живой только внутри человеческих клеток, и она является одной из распространенных передаваемых половым путем инфекций у людей во всем мире, около четырех миллионов случаев хламидиевой инфекции наблюдается в Соединенных Штатах каждый год. Не у всех инфицированных людей проявляются симптомы инфекции. Приблизительно половина всех мужчин и три четверти всех женщин, зараженных хламидиями, не проявляют симптомы и не знают, что они инфицированы. Это может быть серьезным, но легко поддается лечению антибиотиками, если обнаруживается вовремя.
Одинаково важно, хламидиевая инфекция глаз является самой частой причиной предотвратимой слепоты в мире.
В представленном предпочтительном варианте осуществления данное изобретение касается способа диагностирования и мониторинга хламидиевой инфекции.
Иммунный анализ основан на оценивании продуцирования ΙΡ-10 антиген-специфическим Тлимфоцитов при взаимодействии с представляющими антиген клетками (например, моноциты/макрофаги), отвечающими на неочищенные антигены или очищенные антигены, такие как, без ограничения, пептиды. Потенциально пептидные последовательности можно выбрать по их иммуногенности и их специфичности, и аналогично можно применить другие пептиды.
Антиген
Выбор антигена, приемлемого для данного изобретения, также рассматриваемого как тестантиген(антигены) и антиген, выбранный для оценивания, зависит от типа инфекции, которую квалифицированный специалист хотел бы определить, следовательно, выбранные антигены связаны с болезнью. Например, при мониторинге МТВ инфекции любые доступные МТВ антигены могли бы произвести необходимый ответ и наоборот. Некоторые антигены уже применяются в существующих коммерческих анализах. Следует понимать, что любой признак и/или аспект, обсуждаемый выше или ниже в связи с тест-антигеном (антигенами) по данному изобретению, применяется по аналогии с антигеном, выбранным для оценивания.
Где инфекция, как полагают, связана с туберкулезом, антиген или по меньшей мере один антиген выбран из группы, включающей ΚΌ-1 антигены, Ε8ΑΤ-6, СΡΡ10, ТВ7.7, Ад 85, Η8Ρ-65, Ад85А, Ад85В, ΜΡΤ51, МРТ64, ТВ10.4, М!Ь8.4, ккрХ, М!Ь12, МЛ9.9, МЛ32А, ΡδΙδ-1, Ρδΐδ-2, Ρδΐδ-3, ΜΡΤ63, М!Ь39, М!Ь41, ΜΡΤ83, 71-КЭа, ΡΡΕ68 и ЬррХ.
В представленном предпочтительном варианте осуществления антиген или по меньшей мере один антиген выбран из группы, включающей Е8АГО6, СΡΡ-10 ТВ7.7, Ад 85, Η8Ρ 65 и ΚΌ-1 антигены.
В еще одном варианте осуществления по данному изобретению антиген представляет собой Е8АЖ
6.
В другом варианте осуществления по данному изобретению антиген представляет собой СΡΡ-10.
В следующем варианте осуществления по данному изобретению антиген представляет собой ТВ 7.7.
В представленном предпочтительном варианте осуществления по данному изобретению антигены представляют собой ΚΌ-1 антигены.
- 22 020412
Несколько исследовательских институтов работают над идентификацией антигенов, серьезно экспрессированных отдельным инфекционным агентом, так называемые микроб- или болезнеспецифические антигены. В случае М. 1иЪегси1оз13 специфические антигены экспрессированы на различных стадиях инфекции, таких как, без ограничения, неактивная, латентная, активная, свежая, пульмональная, экстрапульмональная, локализованная или вылеченная стадии.
Данное изобретение можно осуществить с помощью таких антигенов, которые, таким образом, обеспечивают инструмент идентификации определенной стадии (например, латентная инфекция М. 1иЪегси1оз1з).
В предпочтительном варианте осуществления несколько антигенов от одного микроорганизма можно добавить при получении образца с ответом. При добавлении нескольких антигенов из различных типов ткани эффективность анализа повышается. В случае туберкулеза, комбинируя пептидные антигены Е8АТ-6, СРР-10 и ТВ7.7 белки, увеличивается вероятность, что тест охватывает наиболее широкий диапазон типов ткани и, таким образом, дает более ясные и более надежные результаты теста в различных популяциях пациентов.
Где инфекция, как полагают, связана с хламидией, антиген или по меньшей мере один антиген выбран из группы, включающей экстракт серовара Ό, основной белок наружной мембраны (МОМР), богатые цистеином белки наружной мембраны (ОМР), ОМР2, ОМР3, полиморфные ОМР (РОМР), аденозин дифосфат/аденозин трифосфат транслоказа СЫатуФа риеитота, белки-порины В (РогВз) и СТ521.
Как видно из данного изобретения, источник инфекции может быть разным. В варианте осуществления по данному изобретению антиген или по меньшей мере один антиген выбран из группы, включающей фиксированные эпимастиготы, фиксированные трипомастиготы, нарушенные эпимастиготы, нарушенные трипомастиготы, очищенные антигенные фракции эпимастигот, полуочищенные антигенные фракции эпимастигот, трипомастиготные экскреторные-секреторные антигены (ТЕЗА), предоминантный вариабельный антигенный тип (УАТ), вариабельный поверхностный гликопротеин (У8С), транссиалидаза (Т8), например, Т813, амастиготный поверхностный белок-2 (А8Р2), КМР-11т, СКА, А§30, ίΣδ, ТСК27, Ад1, 1Ь7, Н49, ТСК39, РЕР-2, А§36, ΙΕ9, МАР, ЗАРА, ТСЫА, Ад13, ТсН В12, ТсЕ, .11Л А13, 1Р8, Тс-24, Тс-28, Тс-40, Су-Ьзр70, МК-Н8Р70, Сгр-Ьзр78, СЕА, СКР, 8А85-1.1, РСаВР (жгутиковый Са2+-связывающий белок), ЕЬ-160 (жгутиковый поверхностный белок 160 кДа) и РКА (жгутиковый повторяющийся антиген), причем указанные антигены имеют отношение к трипаносомам.
В предпочтительном варианте осуществления по данному изобретению антиген или по меньшей мере один антиген выбран из группы, включающей фиксированные эпимастиготы, фиксированные трипомастиготы, нарушенные эпимастиготы, нарушенные трипомастиготы, очищенные антигенные фракции эпимастигот, полуочищенные антигенные фракции эпимастигот, трипомастиготные экскреторныесекреторные антигены (ТЕЗА), предоминантный вариабельный антигенный тип (УАТ), вариабельный поверхностный гликопротеин (У8С), транссиалидазу (Т8), например, Т813, амастиготный поверхностный белок-2 (А8Р2), РСаВР (жгутиковый Са2+-связывающий белок), РЬ-160 (жгутиковый поверхностный белок 160 кДа) и РКА (жгутиковый повторяющийся антиген).
В случае, когда инфекция связана с шистосомами, антиген или по меньшей мере один антиген выбран из группы, включающей нарушенное яйцо шистосомы, экскретированые/секретированные гликопротеины (Е8), покровные (ТС) гликопротеины, растворимый яичный антиген (8ЕА), растворимый экстракт 8. таизош (8УАР), гемоцианин фиссуреллы (КЬН), КР26, 8.) 31, 8.) 32, парамиозин, 8т62-1гУ5, 8т37-8С3РПН, 8т28-С8Т, 8т14-РАВР, РК52-филамин РЕ45-фосфоглицераткиназа, РЫ8-циклофилин, МАР3, 8т23, МАР4, 8т28-ТР1, 8т97, САА, ССА и белок теплового шока 70 8с1йз1озота таизош.
В предпочтительном варианте осуществления по данному изобретению антиген или по меньшей мере один антиген выбран из группы, включающей экскретированные/секретированные гликопротеины (Е8), покровные (ТС) гликопротеины, растворимые яичные антигены (8ЕА), растворимый экстракт 8. таизош (ЗУАР), гемоцианин фиссуреллы (КЬН) и КР26.
Что касается лейшмании, антиген или по меньшей мере один антиген выбран из группы, включающей нарушенные промастиготы, лейшманин, гСВР, гОКРР, гдр63, гК9, гК26, гК39, РЫ18-циклофилин, МАР3, 8т23, МАР4, 8т28-ТР1, 8т97, САА и ССА.
Фактически любой антиген, специфический к видам, подлежащим анализу, можно применять по данному изобретению.
В другом предпочтительном варианте осуществления диапазон различных антигенов различных болезней можно объединить, чтобы обеспечить инструмент обследования с низкой специфичностью для отдельной болезни, но высокой чувствительностью для инфекции. Набор, объединяющий, например, панель антигенов микробов военнослужащих, подвергнувшихся им во время миссии (например, малярия, туберкулез, лейшманиоз, шистосомоз и/или трипаносомоз), позволит врачам выполнить одно срочное тест-обследование вместо ряда различных тестов.
В другом предпочтительном варианте осуществления объединенные наборы могут включать антигены различных микробов, инфицирующий орган (например, виды Ыеззепа и СЫатуФа, вызывающие воспаление органов таза), или включать антигены инфекционных агентов, которые вызывают общие симптомы (например, поддающуюся лечению диарею, вызванную кампилобактерной и шигелловой ин- 23 020412 фекцией, можно отличить от неподдающейся лечению диареи, вызванной вирусом, например, ротавирусом).
Субъект
Ссылка на субъект включает людей или отличные от людей виды, включая приматов, домашний скот (например, овца, коровы, свиньи, лошади, осел, козы), лабораторных животных (например, мыши, крысы, кролики, морские свинки, хомячки), животных-компаньонов (например, собаки, кошки), виды птиц (например, домашняя птица, вольерные птицы), рептилий и амфибий. Данное изобретение применимо, следовательно, в медицине, а также в ветеринарии для домашних животных и диких проявлений жизни.
Общие сведения
Ссылка на известный уровень техники в этом описании не должна рассматриваться как признание или какая-либо форма утверждения, что этот известный уровень техники является частью общих общедоступных сведений в любой стране.
Все ссылки на патенты и непатентные документы, процитированные в данной заявке, включены в данное описание ссылкой во всей их полноте.
Как будет очевидно, предпочтительные признаки и характеристики одного аспекта данного изобретения можно применять для других аспектов данного изобретения. Данное изобретение может быть воплощено в других специфических формах без отступления от сущности или его существенных признаков. Вышеупомянутые варианты осуществления, следовательно, следует рассматривать во всех отношениях иллюстративными, а не ограничивающими данное изобретение, описанное здесь. Объем данного изобретения, таким образом, показан приложенной формулой изобретения, а не описанием выше, и все изменения, которые находятся в пределах значения и диапазона эквивалентности формулы изобретения, должны быть охвачены ссылкой здесь.
Следует понимать, что любой признак и/или аспект, обсужденный выше применительно к способам по данному изобретению, применяется по аналогии способам диагностирования.
По всему данному описанию выражение включать или варианты, такие как включает или включающий, следует понимать как включение заявленного элемента, целого или части, или группы элементов, целых или частей, но не исключение любого другого элемента, целого или части, или группы элементов, целых или частей.
Данное изобретение далее будет описано посредством следующих неограничивающих фигур и примеров.
Описание графических материалов
Фиг.1. Корреляция между плазменным ШЫ^, СР-10 и ШЫ^. Цельную кровь стимулировали 20-24 ч или солевым раствором (нестимулированная) (1а), специфическими к М. 1нЬегси1о818 антигенами (1Ь), или митогеном (1с). Продуцирование цитокина оценили в плазменных супернатантах с помощью ЕЫ8А (ΙΗΝ-γ) или мультиплексирования (ЕР-10).
Фиг. 2. Сравнение антиген-специфического и СР-10 цитокиновое продуцирование (а именно
Ад-нулевой), оцененное с помощью ОнапОГегоп ЕЫ8А и Ьитшех, соответственно. Значения представлены в пг/мл. Прямые линии представляют средние значения, диапазон представлен в табл. 2.
Фиг. 3. РОС кривая представляет чувствительность и специфичность анализа СР-10. Ось х представляет 1-специфичность, а ось у - чувствительность.
Фиг. 4. Сравнение антиген-специфического СР-10 и ^Ν^ продуцирования. ^Ν^ проверяли неразбавленным, СР-10 анализировали при разбавлении 1:8.
Фиг. 5. Антиген-специфическое ^Ν^ и [Р-Ю/СХСЬЮ продуцирование у пациентов с отрицательным или неопределенным СиапОГегоп тестом.
Цельную кровь 6 ОиапОГегоп в пробирке ЮРТ-[Т) отрицательного и одного ОРТ-П неопределенного ТВ пациента стимулировали 20-24 ч или с солевым раствором, или М. 1иЬегси1о818 специфическими антигенами. Продуцирование цитокина оценили в плазменном супернатанте с помощью ЕЫ8А (ΙΗΝ-γ) и мультиплексированной технологии (СР-10). Антиген-специфическое продуцирование представляет стимулированный антигеном образец, с вычитанием нестимулированного образца. Прямые линии представляют средние значения (знаковый ранговый критерий Уилкоксона).
Примеры
В следующих примерах показано выполнение анализа СР-10 с помощью инфекции МусоЬас1епит 1иЬегси1о818 и СЫатуФа 1тасЬотаЙ8, как примерах принципа теста.
Общие способы
В примерах 1-17 применялась стимуляция цельной крови для демонстрации принципа, в примере 18 применялись мононуклеарные клетки очищенной крови (РВМС).
Стимуляция цельной крови
1. Объем 1 мл гепаринизированной крови отобрали в три вакуумные пробирки (Се11е81т8, Австралия), покрытые
а) солевым раствором для получения нестимулированного образца или нулевого образца (применя- 24 020412 ется взаимозаменяемо);
b) пептидами, полученными из белков ΕδΑΤ-6, СРР-10 и ТВ-7.7 для образования антигенного образца (Ад);
c) фитогемагглютинином (РНА) для образования митогенного образца.
2. Пробирки инкубировали 20-24 ч при 37°С.
3. Пробирки центрифугировали 10 мин при 2000° грт.
4. Плазму собрали и заморозили до или ниже - 40°С.
Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС)
1. РВМС отделили от цельной крови центрифугированием в градиенте плотности (ЬутрЬоргер; Кусотей) и заморозили в жидком азоте до применения.
2. РВМС разморозили и пересуспендировали в ΚΡΜΙ 1640, дополненной 1% пенициллина/стрептомицина, 1% заменимых аминокислот, 1% глутамина, 1% пировата, 1% ΗΕΡΕδ (Ν-2гидроксиэтилпиперазин-Ы-2-этансульфоновая кислота) и 10% человеческой АВ сыворотки (местный банк крови, К1д8Ьо8рка1е1, Копенгаген).
3. Жизнеспособность и число клеток определили окрашиванием нигрозином.
4. Клетки культивировали в трех повторностях в круглодонных микротитровальных планшетах (Яипс) при 1,25х105 клеток/лунка в общем объеме 100 мкл.
Получение антигена экстракта серовара Ό штамма С. 1гас1ютаП8
1. СП1атуЙ1а 1гас1ютаИ8 серовар Ό штамм (И^-3/Сх) размножали в клетках НеЬа 229 и фракционировали на 30 фракций с узким молекулярным весом с помощью методики мультиэлюции.
2. С. ЛасПотаГО серовар Ό в буфере δΡΟ центрифугировали при 30000 д в течение 30 мин.
3. Пеллету пересуспендировали в стерильной воде и буфере Лэммли для образца 1:1 с последующим кипячением в течение 5 мин.
4. После повторной обработки ультразвуком суспензию центрифугировали при 30000 д в течение 30 мин.
5. Супернатантный неочищенный экстракт серовара Ό штамма С. ЛасПотаГО применяли как антиген.
Стимуляция РВМС с антигеном серовара Ό
1. РВМС высеяли, как описано выше, и клетки стимулировали
a) с 2 мкг/мл антигена серовара Ό для образования образца антигена;
b) без антигена для образования нестимулированого образца.
2. Клетки инкубировали при 37°С во влажном воздухе (5% СО2 и 95% воздуха).
3. Супернатанты собрали через 5 дней для количественного определения ΙΡ-10.
4. Плазму собрали и заморозили при или ниже -40°С.
Измерения биомаркера
Ьитшех
ΙΡ-10, и/или МСР-1, и/или ГО-2 оценили на платформе Ьитшех и выполнили согласно протоколу Вю8оигсе.
1. Суспензии гранул из отдельных наборов ΙΡ-10, ГО-2, МСР-2 и/или ΙΡΝ-γ объединили в лунках 96луночного планшета на предварительно смоченной фильтровальной бумаге.
2. Гранулы дважды промыли раствором для промывания и добавили буфер для инкубации.
3. Образцы разбавили 1:1, 1:8, 1:10 или 1:20 методом разведения и 100 мкл добавили в планшет.
4. Планшет инкубировали 2 ч при комнатной температуре при 600 грт на шейкере для титровальных планшетов.
5. После двух промываний добавили 100 мкл коктейля выявленного антитела на лунку, и планшет инкубировали при комнатной температуре 1 ч на шейкере для титровальных планшетов.
6. После двух промываний добавили 100 мкл раствора стрептавидина с ΡΡΕ на лунку.
7. После 30 мин инкубации и трех промываний добавили 100 мкл раствора для промывания в каждую лунку и планшет поместили на платформу ΧΥ Ьитшех.
8. Из каждой лунки проанализировали минимум 100 специфических к аналиту гранул по флуоресценции и гранул, и ΚΡΕ.
ΙΡ-10 ΕΠδΑ
Измерения ΙΡ-10 выполнили с помощью одноэтапного типа ΕΠδΑ от Вю8оигсе (ЛлаЛодеп, США).
ΕΠδΑ ΙΡΝ-γ
Измерения ΙΡΝ-γ выполнили с помощью одноэтапного сэндвич-метода типа ΕΠδΑ; ОнапПГегоп ΙΡΝ-γ ΕΠδΑ (Се11е8Й8, Австралия). Уровни ΙΡΝ-γ анализировали с помощью программного обеспечения производителя (версия 2.50). Набор Се11е8Й8 ΕΠδΑ работает в Международных ед. (ΜΕ) (1 международная ед./мл соответствует концентрации 50 пг/мл), в представленных примерах результаты ΕΠδΑ ΙΡΝ-γ выражены в пг/мл.
ОиапПГегоп тестирование (ΡΡΤ-ΙΤ тест)
Продуцирование ΙΡΝ-γ оценивали с помощью ОнапПГегоп ΕΠδΑ. Согласно указаниям производи- 25 020412 теля от ΙΡΝ-γ ответа нестимулированного образца вычли ΙΡΝ-γ ответ в образце, стимулированном М. !иЬегси1о818 - специфическими антигенами, и в митогенном образце. Результат ΟΤΡ-ΙΤ считали положительным, если ответ на специфические антигены составлял >17,5 пг/мл (0,35 МЕ/мл) и >25% нестимулированного значения, не принимая во внимание митогеном стимулированный ΙΡΝ-γ ответ; отрицательным, если ответ на специфические антигены составил <17,5 пг/мл (0,35 МЕ/мл), а митогеном стимулированный ΙΡΝ-γ ответ составил >25 пг/мл (0,5 МЕ/мл). Тест считали неопределенным, если и ответ на специфические антигены составил <17,5 пг/мл (0,35 МЕ/мл), и митогеном стимулированный ΙΡΝ-γ ответ составил <25 пг/мл (0,5 МЕ/мл); или ΙΡΝ-γ ответ в нестимулированном образце составил >400 пг/мл (8 МЕ/мл), независимо от антиген-специфического или митогеном стимулированного ответа.
Пример 1.
Высокие уровни плазменного ГР-10 индуцировали стимуляцией цельной крови с М. !иЬегси1о818 специфическими антигенами от пациентов, инфицированных М. !иЬегси1о818.
Протестировали цельную кровь 12 пациентов с положительным по мокроте туберкулезом легких из Дании (п=2) и Гвинеи-Бисау (η=9) и 11 здоровых неподвергнувшихся ТВ датчан в качестве контроля (молодые врачи, научные сотрудники и студенты факультета инфекционных болезней и подразделения клинических исследований при Нййо^е НокрйаЦ. ВИЧ положительных пациентов не было. Исследование было одобрено комитетом по этике Копенгагена и Фредериксборга и комитетом по этике ГвинеиБисау.
Результаты
Уровни ΙΡΝ-γ и РР-10 (средние значения и диапазон) в плазме образцов цельной крови, инкубированных с нулевым контролем, Ад или митогеном, оцененные с помощью Ьиттех РР-10, Ьиттех ΙΡΝ-γ или коммерческим РиапШегоп-ШЫ^ ЕЫ8А, представлены в табл. 1.
Продуцирование ЕР-10 после инкубации с М. !иЬегси1о818 специфическими антигенами четко связано с наличием инфекции М. !иЬегси1о818 у пациента; очень высокие уровни !Р-10 в плазме, 1025 пг/мл (диапазон 497,3-2080,4 пг/мл), культуры цельной крови индуцировали во время стимуляции с М. !иЬегси1о818 специфическими антигенами у пациентов, инфицированных М. !иЬегси1о818, тогда как очень низкие уровни Ш-Ю, 40,4 пг/мл (диапазон 19,7-158,8), наблюдали в культуре цельной крови 11 здоровых датчан, не подвергавшихся инфекции или без признаков инфекции М. !иЬегси1о818 (контроли). Разница между двумя группами была высоко существенной; р<0,0001 показал, что высвобождение !Р-10 действительно индуцировано антигеном.
Количество стимулированного антигеном Ш-Ю 1024 пг/мл (диапазон 497-2080 пг/мл) был существенно выше уровней ΙΡΝ-γ, определенных с помощью ЕЫ8А, 223,5 (99-1283 пг/мл), и Ьиттех, 90,7 пг/мл (37-464 пг/мл), (р = 0,01 и 0,001).
По сравнению с Ш-Ю значительно более низкие уровни в плазме ΙΡΝ-γ определили с помощью ОипаиГегоп-ЕиЗА, но разница между инфицированными ТВ и неинфицированными ТВ была все еще существенной. ΙΡΝ-γ, оцененный с помощью Ьиттех, был даже ниже, чем ΙΡΝ-γ, оцененный с помощью ΟΡΤ-ΙΡΝ-γ ЕЫ8А, и поэтому не будут обсуждаться далее.
В заключение, Р-К) является высоко специфическим маркером инфекции М. !иЬегси1о818, когда цельную кровь от инфицированного человека стимулируют с М. !иЬегси1о818 специфическими антигенами. Ш-Ю намного легче оценивать, и он обладает большим потенциалом как более чувствительный маркер из-за высоких уровней высвобождения.
- 26 020412
Таблица 1
Продуцирование ΙΡΝ-γ и ΙΡ-10 (пг/мл/ в плазме цельной крови,
стимулированной солевым митогеном от: раствором, антигеном или
контрольных индивидуумов (п=11) пациентов с ТВ (п=12)
1ΡΝ-γ (ЕЫ8А)
Солевой раствор 8,5 (6,5-11,5) 10,3 (6,5-134,5)
Антигены 8,9 (5,0-14,0) 223,5 (99,0-1283,0/
Митоген 1613,0 (45,5-1798,5) 272,8 (31,5-1750,5)
ΙΡΝ-γ (Μιιΐΐίρίβχ)
Солевой раствор 5,0 (5,0-11,5) 5,0 (5,0-70,2)
Антигены 5,0 (5,0-11,8) 90,7 (37,3-464,2/
Митоген 291,9 (5,0-2980,7) 160,9 (5,0-2913,4)
ΙΡ-10
Солевой раствор 27,1 (17,7-140,6) 150,9 (61,1-991,9/
Антигены 40,4(19,7-158,8) 1025 (497,3-2080,4/
Митоген 993,5 (164,0->2800) 843,0 (384,4-2587,9)
Табл. 1. Продуцирование ΙΡΝ-γ и ΙΡ-10 в культуре цельной крови. Цельную кровь стимулировали 20-24 ч солевым раствором (нестимулированная), М. 1иЬегси1о818 специфическими антигенами или митогеном. Продуцирование цитокина оценили с помощью ЕЫ8Л (ΙΡΝ-γ) и мультиплексирования (ΙΡΝ-γ, ΙΡ-10).
а Значения представляют собой среднее (диапазон).
Ь Достоверно различный (Р < 0,0001). с Достоверно различный (Р < 0,0005).
б Достоверно различный (Р < 0,008). Тест Крускала-Уоллиса.
Пример 2.
Повышенное спонтанное высвобождение ΙΡ-10 в плазме нестимулированной культуры цельной крови (нулевой образец) от пациентов с активной инфекцией ТВ; ΙΡ-10 - маркер активной болезни
Как видно из табл. 1, пациенты с активным туберкулезом обладали в 5,6 раз более высокими плазменными уровнями ΙΡ-10 в нестимулированных образцах цельной крови (нулевой контроль) (150,9 пг/мл (61,1-991,9)) по сравнению со здоровыми контрольными индивидуумами (27,1 пг/мл (17,7-140,6)) р=0,0005. Не наблюдалось достоверной разницы в плазме нулевого ΙΡ-10 между пациентами с активным туберкулезом из Гвинея-Бисау и Дании (р=0,67).
В заключение, это показывает, что определение спонтанного высвобождения ΙΡ-10 в комбинации со стимулированным антигеном высвобождением ΙΡ-10 можно применять для отличия здоровых индивидуумов от пациентов с активным ТВ.
Пример 3.
Корреляция между высвобождением ΙΡΝ-γ и ΙΡ-10
Существует четкая корреляция между высвобождением ΙΡΝ-γ и ΙΡ-10 в культуре цельной крови, но высвобождение ΙΡ-10 выше. Отдельные ответы на ΙΡ-10 после стимуляции нулевым контролем, антигеном или митогеном и соответствующий ЕЫ8Л ΙΡΝ-γ показаны на фиг. 1а-с. Наблюдали четкую корреляцию между уровнями ΙΡ-10 и ЕЫ8Л ΙΡΝ-γ в плазме стимулированной антигеном цельной крови (коэффициент Спирмена г=0,87, 95% СТ 0,71-0,95, р<0,0001) (фиг. 1Ь) и в плазме стимулированной митогеном цельной крови, хотя не с тем же самым уровнем (г=0,54, 95% СТ. 0,15-0,78, р=0,008) (фиг. 1с).
В заключение, высвобождение ΙΡ-10 и ΙΡΝ-γ в культуре цельной крови коррелирует, но высвобождение ΙΡ-10 имеет более высокое значение. Это делает ΙΡ-10 лучшим маркером, чем ΙΡΝ-γ в ш-уйто ТВ тестах.
Пример 4.
Антиген-специфическое продуцирование ΙΡ-10 выше, чем антиген-специфическое продуцирование ΙΡΝ-γ.
Для определения количества цитокина, высвобождаемого в ответ на антигены, представляют в культуре (а именно, антиген-специфический (Ад-специфический) цитокиновый ответ). Антигенспецифический цитокиновый ответ вычислили как дельта значение (=цитокиновое продуцирование в культуре стимулированной антигеном цельной крови за вычетом количества, высвобожденного в плазму культуры нестимулированной цельной крови). Дельта значение позволяет сравнивать антигенспецифические ΙΡΝ-γ и ΙΡ-10 цитокиновое продуцирование. Как видно на фиг. 2, ΙΡ-10 анализ оценивает более высокие значения Ад-специфического ΙΡ-10 (870,4 пг/мл (260,5-1575,9 пг/мл)) по сравнению с Адспецифическим ΙΡΝ-γ (216,5 пг/мл (80,5-1273,0 пг/мл)) р = 0,006 (Манна-Уитни). Средние значения и диапазоны представлены в табл. 2.
В заключение, ΙΡ-10 высвобождается в более высоких количествах (р=0,006), таким образом, его легче оценивать и он представляется лучшим маркером, чем ΙΡΝ-γ.
- 27 020412
Таблица 2
Табл. 2. Сравнение Ад-специфического ΙΝΡ-γ и ΙΡ-10 цитокинового продуцирования, оцененного с помощью ОиаШйегоп ЕЫ8А и Ьиштех, соответственно (тест Крускала-Уоллиса).
Пример 5.
Очень высокая чувствительности и специфичность анализа ΙΡ-10
Продемонстрирована очень высокая чувствительность и специфичность анализа ΙΡ-10 с помощью ТВ как примера принципа теста. Высокую чувствительность и специфичность анализа ΙΡ-10, описанного в данном изобретении, определили с помощью анализа КОС кривой на основе уровней значений антиген-специфического ΙΡ-10 (антиген-стимулированный минус нулевой контроль). Существующий анализ КОС кривой основан на 12 пациентах, больных ТВ, и 11 здоровых контрольных индивидуумах, описанных в примере 1. На фиг. 3 показано, что ΙΡ-10 тест четко отделяет пациентов с активным туберкулезом и здоровых контрольных индивидуумов. В этом эксперименте в ΙΡ-10 тесте площадь под кривой (АИС) составляет 1,0.
В заключение, ΙΡ-10 анализ, применяемый в диагностике инфекции М. !иЬегси1о818, как показали, был на 100% чувствительным и на 100% специфическим, что лучше, чем ныне применяемые ίη νίίτο тесты ТВ. ΙΡ-10 тест способен четко отличить пациентов с и без туберкулезной инфекции. На основе такого ограниченного материала можно установить порог от 27,6 до 260,5 пг/мл и достичь полной сегрегации.
Пример 6.
ΙΡ-10 является эффективным маркером латентного ТВ у иммуносупрессированных.
Цельную кровь шести пациентов с ревматоидным артритом (КА), получавших кортикостероиды и метотрексат®, стимулировали нулевым контролем, одним М. 1иЬегси1о818 специфическим антигеном (Е8АТ6) или митогеном (РНА). Концентрацию ΙΡ-10 оценивали в супернатанте с помощью Ьиштех, как описано выше. Известно, что пациенты 1-3 были отрицательными по тесту ОнаШБегоп, а пациенты 4-6 были положительными по тесту ОнаШйегоп.
Как видно из табл. 3, все пациенты, несмотря на супрессию иммунитета, поддерживали высокие уровни ΙΡ-10 в ответ на положительный митогенный контроль. Высокие уровни стимулированного Е8АТ6 ΙΡ-10 (диапазон 668-2800 пг/мл) наблюдали у всех пациентов с латентным ТВ (положительный тест ОнаШБегоп). В заключение, тест, основанный на ΙΡ-10, можно применять для диагностирования латентной инфекции ТВ у пациентов с супрессией иммунитета.
Таблица 3
Табл. 3. Шесть пациентов с ревматоидным артритом стимулировали с нулевым контролем, Е8АТ-6 (один из антигенов, применяемый в тесте ОнаШБегоп) или митогеном, ΙΡ-10 оценивали с помощью Ьиштех. Верхние три пациента отрицательные по тесту ОнаШБегоп, а нижние три - положительные по тесту ОнаШБегоп. У всех пациентов не наблюдаются симптомы активного ТВ, но страдают от КА и принимают массивное иммуносупрессивное лечение от серьезного КА (кандидаты для биологического лечения, а именно ΤΝΡ-α блокаторами).
- 28 020412
Пример 7.
ΙΡ-10 как маркер латентного ТВ у здоровых людей, как известно, подвергнувшихся ТВ в молодости
Два тестируемых человека (КУ и АКА), как известно, подвергнувшихся ТВ в молодости, что подтверждено конверсией ΡΡΌ, без туберкулезной хемопрофилактики и без сопутствующих заболеваний, протестировали по ΙΡ-10 реагированию с помощью способа, описанного выше. Доноры, как было известно, были положительными по ОиаШйегоп по предварительным тестам. Оба тестируемых человека реагировали с сильными специфическими по антигену (Е8АТ-6) ΙΡ-10 ответами (302,9 и 916,1 пг/мл), как видно из табл. 9. Человек КУ был протестирован дважды с промежутком 2 мес., наблюдается хорошее воспроизведение результатов (данные не показаны).
В заключение, ΙΡ-10 является четким маркером латентной туберкулезной инфекции.
Таблица 4
АКА + 22,5 325,4 631
Табл. 4. Два здоровых пациента, как известно, подвергнувшихся ТВ в молодости, протестированы по отвечаемости на туберкулезный антиген (Е8АТ6).
Пример 8.
Уровень спонтанного ΙΡ-10 в образце в комбинации с антиген-специфическим высвобождением ΙΡ10 может отличить здоровых с или без латентной ТВ инфекции от пациентов с активным ТВ.
В примере 6 (табл. 3) показано, что спонтанные (нулевые) ΙΡ-10 уровни низкие и у инфицированных с латентным туберкулезом (34 пг/мл (диапазон 31-63 пг/мл)), и у неинфицированных (38 пг/мл (диапазон 35-87 пг/мл)) пациентов с ревматоидным артритом. Эти уровни были так же низки как у неинфицированных здоровых доноров (27,1 пг/мл (диапазон 17,7-140,6 пг/мл), табл. 1) и доноров с латентной инфекцией (22,5 и 10,4 пг/мл, табл. 4.). Если объединить всех пациентов без активного туберкулеза и сравнить эти низкие уровни с высокими уровнями спонтанного высвобождения ΙΡ-10, наблюдаемых у пациентов с активным ТВ (150,9 пг/мл (диапазон 61,1-991,9), табл. 1), обнаруживается высоко достоверное различие (р<0,0001, Манн-Уитни).
В заключение, комбинацию спонтанного и антиген-специфического высвобождения ΙΡ-10 можно применять для отличия активной и латентной туберкулезной инфекции.
Пример 9.
Разбавление образцов плазмы можно выполнить без потери чувствительности ΙΡ-10 теста.
Разбавление образца - поэтапное понижение концентраций путем добавления разбавляющего раствора. Протестировали, влияет ли разбавление образца плазмы после инкубации в несколько раз на образцы плазмы с высокой и низкой концентрацией ΙΡ-10, и влияет ли это разбавление на чувствительность ΙΡ-10 анализа. Образцы разбавили методом разведения, предусмотренным в наборе Вюкоитсе Ьиштех.
Как видно из табл. 5, разбавление образцов приводит к поэтапному снижению уровней ΙΡ-10 в плазме стимулированной антигеном и митогеном цельной крови и в плазме нестимулированной (нулевой) цельной крови.
Таблица 5
ΙΡ-10
Фактор разбавления Пациент А Пациент Б
1:2 22,5 10,4
* ё О О 1:4 11,7 5,2
ё Р-
1:8 4,4 2,9
аз § 1:16 1,3 1,3
1:2 631 491
X и 1:4 430 327
К
(- а 1:8 396 197
1:16 277 130
1:2 325 927
а
1:4 225 541
о
( Мит 1:8 139 438
1:16 89 326
Табл. 5. Плазму стимулированной нулевым контролем, антигеном и митогеном цельной крови разбавили 1:2-1:16 методом разведения и анализировали по ΙΡ-10 уровням с помощью Ьиштех.
- 29 020412
Из табл. 5 видно, что концентрация антиген-специфического ΙΡ-10 остается очень высокой даже в образце, разбавленном в 16 раз (275 и 128 пг/мл).
Фиг. 4 представляет данные от 7 контрольных и 8 пациентов с туберкулезом, тестированных по антиген-специфическим ΙΡΝ-γ и ΙΡ-10 ответам. Антиген-специфическое продуцирование ΙΡ-10 оценили после разбавления 1:8 образца, а ΙΡΝ-γ ответ оценили в неразбавленном образце. Снова обнаружили высоко специфические ΙΡ-10 значения, указывающие на то, что ΙΡ-10 является четким маркером инфекции М. 1иЪегси1о818 (р=0,0003) даже при разбавлении 1:8. Кроме того, значения разбавленного 1:8 ΙΡ-10 (среднее значение 1097 пг/мл (диапазон 225-3045 пг/мл)) выше по сравнению с ΙΡΝ-γ, проанализированным на неразбавленном материале образца (среднее значение 269 пг/мл (диапазон 81-1273 пг/мл)) р= 0,014 (тест согласованных пар Уилкоксона).
Эти результаты показывают, что ΙΡ-10 является надежным маркером для диагностического анализа и что ΙΡ-10 тест можно применять в тестовой схеме, где материала образца очень мало. Это создает условия для целого ряда применений ΙΡ-10 теста, где образец можно разбавить (или перед, или после инкубации), в случаях, когда имеется очень мало материала образца (непосредственно применимого, например, в коммерческом продукте для младенцев с очень маленьким объемом крови).
В заключение, показано, что образцы плазмы можно разбавить без потери чувствительности ΙΡ-10 теста.
Пример 10.
ΙΡ-10 более чувствительный, чем ΙΡΝ-γ, и улучшает ίη νίίτο диагностирование туберкулезной инфекции.
Для исследования потенциала ΙΡ-10 по улучшению чувствительности известного ΟΡΤ-ΙΤ теста протестировали ΙΡ-10 ответы у пациентов, страдающих туберкулезом, с отрицательными или неопределенными результатами ΟΡΤ-ΙΤ теста (характеристики пациентов и отдельные измерения показаны в табл. 6). Другими словами, эти пациенты были ложно отрицательными в ΙΡΝ-γ тесте. Фиг. 5 показывает антигенспецифические ΙΡ-10 и ΙΡΝ-γ ответы у 7 пациентов с ТВ и отрицательным или неопределенным ΟΡΤ-ΙΤ тестом. Антиген-специфические ΙΡΝ-γ ответы, определенные с помощью ΟΡΤ-ΙΤ ЕЫ§А, варьируют от 0 до 12,8 пг/мл, тогда как антиген-специфические ΙΡ-10 ответы варьируют от 0 до 532 пг/мл. Из этих 7 пациентов 3 были также ΙΡ-10 неотвечающими с антиген-специфическим ответом ниже 10 пг/мл, тогда как другие 4 пациента отвечали со средним значением ΙΡ-10 уровня 318 пг/мл (диапазон 196-532 пг/мл). Из этих 4 пациентов с отрицательным ΟΡΤ-ΙΤ тестом и положительным ΙΡ-10 ответом 2 были ВИЧ инфицированными с количеством клеток СЭ4 32 клетки/мкл и 300 клеток/мкл, соответственно. Митоген специфическое высвобождение ΙΡ-10 было высоким у всех доноров в диапазоне от 394 до 2800 пг/мл. Эти результаты подчеркивают, что чувствительность ΙΡ-10 по ίη νίίτο тестам повышается по сравнению с ΙΡΝ-γ по тестам.
Таблица 6
о. о £ ή X 0} о, н О § О е со Диагнозь О (и ^3 и сО в « « 4е к о. Е сг К ей х ϋ ч- δ υ 25 § ίΪ χ с Й, Й ь ч δ X X & о_ с Результат ΙΡ-10*
IX О Си О X к Ш Сь О О X 1)
V б; о О 5 ¢5 X < £ Ξ δ £ § « и IX X н X < н X 2
I ОВ 50 пТВ +/и в 8 пол 300 8 7 32 отр 72 383 520 ПОЛ
2 ОВ 45 пТВ +/в в пол 333 13 13 596 отр 97 106 757 отр
3 ОВ 50 пТВ +/н в пол н в 7 10 1446 отр 98 107 2800 отр
4 ЦК 39 эпТВ +/+ пол 767 3 2 1051 отр 29 39 2800 отр
5 ΏΚ 36 пТВ +/+ отр Ή В 38 44 249 отр 716 1040 2800 пол
6 ок 41 пТВ +/+ н в Η В 7 20 291 отр 31 227 556 пол
7 ок 26 эпТВ +/+ пол 32 20 28 30 кеоп 301 834 394 пол
Табл. 6. Пациенты с активным ТВ и отрицательным или неопределенным результатом ΟΡΤ-ΙΤ теста были протестированы по ΙΡ-10 отвечаемости. а ОВ - Гвинея-Бисау; ΌΚ - Дания.
Ъ пТВ - пульмональный ТВ, эпТВ - экстрапульмональный ТВ.
с Цельную кровь стимулировали 20-24 ч либо с солевым раствором, с М.1иЪегси1о515 специфическими антигенами (ΈδΑΤ-6, СΡΡ10 и ТВ 7.7), или с митогеном (РИА). Продуцирование цитокина оценили с помощью ЕЫ8А (ΙΡΝ-γ) и мультиплексирования (ΙΡ-10).
н Положительный ΟΡΤ-ΙΤ ответ определили как антиген-специфический ответ на 17,5 пг/мл выше нулевого согласно указаниям производителя.
е Положительный ΙΡ-10 ответ определили как антиген-специфический ΙΡ-10 ответ на 36 пг/мл выше
- 30 020412 нулевого, произвольно основанного на средних результатах 11 здоровых контрольных пациентов + 3 стандартных отклонения (пациенты из примера 4).
6 н.в. - не выполняли.
ь Неопределенный.
Пример 11.
Сильные антиген-специфические ΙΡ-10 ответы могут производиться при краткой и длительной инкубации.
В табл. 7 представлены нестимулированные и антигеном стимулированные ответы типичных пациентов с ТВ, проверенные при 6-120-часовой инкубации. Как можно видеть из табл. 7, возможно индуцировать ΙΡ-10 ответы со стимуляцией антигенами при очень кратковременной инкубации. Образуется >1 нг за 6 ч, и очень высокие ответы 3-6 нг поддерживаются во время 120 ч инкубации. Эти заключения показывают, что результаты ΙΡ-10 теста являются очень надежными, и его можно выполнить за очень короткое (<6 ч) и очень длительное время инкубации.
Таблица 7
Время (часы) ΙΡ-10 (пг/мл) Солевой раствор Антигены
6 93 1173
12 117 3467
24 93 5467
48 96 5867
120 80 6133
Табл. 7. Нестимулированные (солевой раствор) и антиген-стимулированные ответы типичных пациентов с ТВ, проверенных при 6-120-часовой инкубации.
Пример 12.
Сильные антиген-специфические ΙΡ-10 ответы могут производиться при диапазоне температур инкубации.
Как видно из табл. 8, возможно индуцировать ΙΡ-10 ответы со стимуляцией антигенами при широком диапазоне температур. Получили > 200 пг/мл антиген-специфического ΙΡ-10 при 30°С, что показывает возможность инкубации ниже 30°С и что инкубация при температурах в диапазоне, например, 3037°С будет давать сильные антиген-специфические ответы.
Таблица 8
Температура (°С) Солевой раствор Антигены ”20/) 8 6
30,0 4 221
37,0 5 852
Табл. 8. Нестимулированные и антиген-стимулированные ответы типичного пациента с ТВ проверили при 24-часовой инкубации при 20-37°С. ΙΡ-10 значения выражены в пг/мл.
Пример 13.
Небольшие количества цельной крови можно разбавить перед инкубацией, и ΙΡ-10 ответы будут все так же сильными.
Образцы 1 мл (1:0), 0,5 мл (1:1) и 0,1 мл (1:10) цельной крови разбавили в ΚΡΜΙ-1640 при общем объеме 1 мл. Разбавленную цельную кровь стимулировали в ΟΡΤ-ΙΤ пробирках 24 ч. Значения не откорректированы по фактору разбавления. Как можно видеть из табл. 9, возможно разбавлять цельную кровь в ΚΡΜΙ-1640 перед инкубацией и все еще получить антиген-специфические ΙΡ-10 ответы >80 пг/мл. Это показывает, что дальнейшее разбавление возможно и можно разработать тестовый набор, использующий очень небольшие количества крови или клеток.
Таблица 9
Разбавление N А
1:0 93 5467
1:1 40 2933
1:10 13 93
Табл. 9. Нестимулированный и антиген-стимулированный ответы типичного пациента с ТВ с использованием небольших аликвот цельной крови, разбавленной в ΚΡΜΙ-1640. ΙΡ-10 уровни выражены в
- 31 020412 пг/мл.
Пример 14.
Стабильность ΙΡ-10 при 25°С
Аликвоты плазмы РНА стимулированной цельной крови четырех доноров хранили при 25°С в течение !/2, 1, 2, 4, 8 или 24 ч до анализа. Из табл. 10 видно, что ΙΡ-10 является очень стабильной молекулой, которая не распадается даже за 24 ч при 25°С.
Таблица 10
0 часа 63 769 482 127
’Л часа 57 649 471 115
1 час 72 754 461 116
2 часа 68 728 438 115
4 часа 62 727 487 126
8 часов 66 693 459 137
24 часа 77 763 455 149
Табл. 10. Стабильность ΙΡ-10 при 25°С (измерения выражены в пг/мл).
Пример 15.
Стабильность ΙΡ-10 при 5°С
Аликвоты плазмы РНА стимулированной цельной крови четырех доноров хранили при 5°С в течение 12, 24, 72, 144 ч или 216 ч (9 дней) до анализа. Из табл. 11 видно, что ΙΡ-10 является очень стабильной молекулой, которая не распадается даже за 216 ч (9 дней) при 5°С.
Таблица 11
0 часов 63 769 482 127
и ΙΛ 12 часов 71 646 отсутствует 134
5 Ви в 1 день 69 664 501 144
№ г 3 дня 78 784 539 166
В. М 6 дней 81 883 495 187
9 дней 93 728 520 183
Табл. 11. Стабильность ΙΡ-10 при 5°С.
Пример 16.
Стабильность ΙΡ-10 при циклах замерзание-оттаивание
Аликвоты плазмы РНА стимулированной цельной крови от четырех доноров заморозили (-80°С) и разморозили до х5 перед анализом. Из табл. 12 видно, что ΙΡ-10 является очень стабильной к замораживанию/оттаиванию молекулой, которая не распадается даже при х5 циклах замерзание-оттаивание.
Таблица 12
хО 63 769 482 127
х1 66 879 388 131
х2 74 793 513 122
8 8 Л хЗ 70 795 486 126
В 8 х4 65 952 459 126
ί о х5 80 746 483 142
Табл. 12. Стабильность ΙΡ-10 к замерзанию-оттаиванию
Пример 17.
ΙΡ-10 как диагностический биомаркер не зависит от платформы.
ΙΡ-10 уровни можно измерять не только с помощью Ьиттех, в примере 17 оценивали образцы 4 пациентов с активным ТВ и 4 здоровых контрольных индивидуумов с помощью технологии ЕЫ8А (Вюкоигсе).
Как можно понять из табл. 13, все четыре пациента производят антиген-специфический ΙΡ-10 выше
- 32 020412
457 пг/мл, тогда как все контрольные индивидуумы производят ΙΡ-10 ниже 13 пг/мл.
Таблица 13
Антиген-специфический ΙΡ-10 (пг/мл)
Контроль 1 9
Контроль 2 13
Контроль 3 0
Контроль 4 0
Пациент 1 457
Пациент 2 626
Пациент 3 719
Пациент 4 620
Табл. 13. Продуцирование антиген-специфического ΙΡ-10 от 4 контрольных индивидуумов и 4 пациентов, оцененное с помощью технологии ЕЫ§А.
Пример 18.
Комбинирование измерений ΙΡ-10 и других известных биомаркеров для создания более сильного комбинированного маркера и повышения числа положительных отвечающих
По неизвестным причинам некоторые индивидуумы сильно отвечают с одним биомаркером, а не другим, после стимуляции антигеном. Например, некоторые индивидуумы могут не показывать или ΙΡ10, или ΙΡΝ-γ ответы, или производят низкие уровни ΙΡ-10 или ΙΡΝ-γ. В этом случае одновременное измерение двух, трех, четырех или более биомаркеров повысит чувствительность анализа и повысит число положительных отвечающих. Комбинируя измерения ΙΡ-10 и, например, ΙΡΝ-γ, возможно выполнить диагностические прогнозирования, которые менее уязвимы для анэргии одного биомаркера.
Один подход к такой стратегии комбинированных биомаркеров показан в табл. 15, где ΙΡ-10 и ЦиапШетоп результаты из табл. 6 скомбинированы по следующей модели: если пациент реагирует положительно по меньшей мере на один из тестов, то пациента считают инфицированным. В представленном примере нет отрицательных отвечающих по φΡΤ-ΙΤ, которые положительны по ΙΡ-10 тесту.
Таблица 14
№ пациента ЦРТ-1Т результат ΙΡ-10 результат Объединенный ζ)ΡΤΙΤ/ΙΡ-1Ο результат
1 отр. пол. пол.
2 отр. отр. отр.
3 отр. отр. отр.
4 отр. отр. отр.
5 отр. пол. пол.
6 отр. пол. пол.
7 неоп. пол. пол.
Табл. 14. Результаты φΡΤ-ΙΤ и ΙΡ-10 тестов объединяют и интерпретируют как, если пациент положительный по меньшей мере по одному тесту, тогда пациента считают инфицированным. Пороговую точку для ΙΡ-10 теста определили как антиген-специфический ΙΡ-10 ответ на 36 пг/мл выше нулевого, произвольно основанного на средних результатов 11 здоровых контрольных индивидуумов + 3 стандартных отклонения (пациенты из примера 4).
Другой более сложный способ создания комбинированного биомаркера показан в табл. 16. Антиген-специфические ΙΡ-10 и ΙΡΝ-γ ответы объединяют путем сложения и умножения. Оценили семь неподвергнувшихся контрольных индивидуумов и 8 пациентов с активным ТВ. Из табл. 14 видно среднее значение и диапазон антиген-специфических ΙΡ-10 и ΙΡΝ-γ ответов; и среднее значение и диапазон складывают и умножают ΙΡ-10 и ΙΡΝ-γ ответы. При сложении промежуток между контрольным индивидуумом с самым высоким ответом и пациентом с самым низким ответом повышается от 62 пг/мл для ΙΡΝ-γ и 1727 пг/мл для ΙΡ-10 до 1863 пг/мл, а при умножении до 164642 (пг/мл)2. Это абсолютное повышение промежутка с помощью умножения также повысило относительное различие кратности для среднего до ошеломляющей величины 379274 раз, его сравнивают с антиген-специфическим ΙΡ-10, который имел различия кратности 619 между пациентами и контрольными индивидуумами или ΙΡΝ-γ, которые имели различие кратности 1074.
- 33 020412
Таблица 15
Антиген- специфиче ский1Р-10 Антигенспецифиче ский ΙΡΝ-γ Сложение Умножение
Контрольные индивидуумы п=7 Среднее 0 0 2 2
Минимальное 0 0 0 0
Максимальное 63 2 62 62
Пациенты п=8 Среднее 8779 215 9074 2019761
Минимальное 1800 64 1865 164704
Максимальное 24355 1018 25373 25146884
Табл. 15. Антиген специфический №-10 и антиген-специфический №Ν-γ сложили или умножили для создания объединенного №-10/№Ν-γ биомаркера. Антиген-специфические измерения <0 привели к 0.
Пример 19.
Диагноз инфекции СЫатуЛа 1гасйотаЙ8 с помощью №-10 анализа
РВМС выделили у 7 пациентов с инфекцией СЫатуЛа 1гасйотаЙ8 и у 7 доноров без зарегистрированной истории хламидиевой инфекции. РВМС стимулировали в 5-дневной культуре, и супернатанты анализировали по продуцированию №-10 с помощью Ьиттех, а по №Ν-γ продуцированию с помощью ΕΟδΑ. Из табл. 16 видно, что высокие уровни (>0,5 нг/мл) №-10 супернатанта культуры РВМС индуцировали стимуляцией антигеном экстракта серовара Ό СЫатуЛа 1гасЬотаЙ8 у пациентов, страдающих инфекции СЫатуЛа ЦасНотаЮ половых органов. Видно, что некоторые контрольные индивидуумы отвечали на такую неспецифическую стимуляцию, но уровни ниже. Высокое антиген-специфическое продуцирование №-10 составило >0,5 нг/мл.
В заключение, №-10 является новым диагностическим биомаркером хламидиевой инфекции.
Таблица 16
ΙΡ-10 (пг/мл) ΙΓΝ-γ (пг/мл)
Пулевой А§ А§- специфи ческий Нулевой А§ Ац- специфи ческий
Контроль 01 0 252 252 128 2184 2056
Контроль 10 45 14 -31 148 146 -2
Контроль 18 226 820 594 0 474 474
Контроль 20 282 998 716 4 2514 2510
Контроль 25 66 1240 1175 30 296 266
Контроль 28 0 2 2 40 112 72
Контроль 31 10 4 -6 84 162 78
Среднее значение 45 252 252 40 296 266
Пациент 01 14 2472 2458 0 7808 7808
Пациент 03 2 1449 1446 84 2976 2892
Пациент 04 498 3725 3227 10 8206 8196
2 н Пациент 05 13 1317 1304 36 7516 7480
5 д· Пациент 12 21 4707 4686 0 10214 10214
В Пациент 18 1 503 502 4 6264 6260
Пациент 02 58 1680 1621 10 4016 4006
Среднее значение 14 1680 1621 10 7516 7480
Табл. 16. Нулевой, антиген и антиген-специфические уровни №-10 и №Ν-γ индуцировали в 5дневной культуре РВМС.
- 34 020412
Ссылки
АЬгато С., Меудаагйеп К.Е., Оагаа Ό., кгапкеп К.Ь., К1ет М.К., Ко1к А.Г е! а1. Мопокте шйисей Ьу 1п!егГегоп датта апй ΙΡΝ-датта гекропке Ю а Гикюп рго!еш оГ МусоЬайегшт !иЬегси1ок1к ЕЗАТ-6 апй СΡР-10 ш Вга/Пкт !иЬегси1ок1к ракейк. МюгоЬек.
Воигдагк, А., О. Сагсекип, V. Марте/, С. Ьазсоих, V. Ое1сеу, В. Оюсщек Е. УюаШ, Р. Н. Ьадгапде, Ό. Зегей, апй В. Аи!гап. 2006. Ехр1окюп оГ ШЬегсиИп-кресШс Тк1-гекропкек шйисек 1ттипе гек!огакоп купйготе ш !иЬегси1ок18 апй ΗΙν со-1пГес!ей ракейк. АГОЗ 20:Ρ1-Ρ7.
Нидкек, А. I, Р. НйсЫпкоп, Т. Ооойтд, Ν. к кгее/ег, З. К. Но1йк\уог1к апй Р. Ό. .Токпкоп. 2005. О1адпо818 оГ МусоЬайегшт !иЬегси1ок1К 1пГесйоп икшд ЕЗАТ-6 апй ш1гасе11и1аг суЮкте суЮтеЦу. Скп. Ехр. Тттипок 142:132-139.
Ра1, М., К. 1окк1, З. Оодга, Ό. К. МепФгака, Р. Шгапд, З. Ка1апйг, А. Ь. Кешдо1й, к М. Со1Гогй Я, к. РПеу, апй Ό. Меп/1ек. 2006. Зепа1 Теккпд оГ Неакк Саге ^огкегк Гог ТиЬегси1ок1К икшд кИегГегоп--,' Аккау. Ат. I Рекрп. Сгк Саге Мей.

Claims (9)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ диагностирования инфекции, вызванной микроорганизмом, включающий этапы, на которых:
    a) инкубируют образец, включающий Т-клетки, полученные у субъекта, по меньшей мере с одним специфическим пептидным тест-антигеном микроорганизма,
    b) определяют специфический опосредованный Т-клетками иммунный ответ на тест-антиген путем измерения ΙΓ-10 уровня в указанном образце,
    c) сравнивают определенный кР-10 уровень с контрольным уровнем и
    й) определяют, что указанный субъект инфицирован указанным микроорганизмом, если определенный Ш-Ю уровень равен или выше контрольного уровня, и/или определяют, что указанный субъект не инфицирован указанным микроорганизмом, если указанный определенный Ш-Ю уровень ниже контрольного уровня, где указанный микроорганизм выбран из группы, включающей грамположительные бактерии, грамотрицательные бактерии, ЫкЮпа, энтерококки, №1ккепа, вибрион, трепонема, Воггека, лептоспира, Сккппуйк), ретровирусы (ВИО, ВИЧ-1 и ВИЧ-2), цитомегаловирус, поксвирусы, вирус Эпштейна-Барра, энтеровирус, морбилливирус, рабдовирусы, рубивирус, флавивирусы, вирусы герпеса, вирус ВарицеллаЗостер, гепатит С и В, лейшмания, Тохор1акта допйк, трипаносома, плазмодий, Рпеитосукйк сагит, коронавирус, вирус Эбола или марбургский вирус и различные нематоды, трематоды.
  2. 2. Способ диагностирования инфекции, вызванной микроорганизмом, где образец, включающий Тклетки, делят по меньшей мере на две фракции и
    a) инкубируют первую фракцию образца по меньшей мере с одним специфическим пептидным тест-антигеном микроорганизма для получения образца с ответом,
    b) инкубируют вторую фракцию образца с неактивным раствором для получения нулевого образца,
    c) определяют Ш-Ю уровень в двух фракциях,
    й) определяют зависимое от специфического тест-антигена микроорганизма опосредованное Тклетками значение иммунного ответа образца, вычитая ΙΓ-10 уровень, определенный в нулевом образце, из Ш-Ю, определенного в образце с ответом,
    е) сравнивают зависимое от специфического тест-антигена микроорганизма опосредованное Тклетками значение иммунного ответа с контрольным уровнем,
    Г) определяют, что указанный субъект инфицирован указанным микроорганизмом, если указанное значение специфического опосредованного Т-клетками иммунного ответа на тест-антиген равно или выше контрольного уровня, и/или определяют, что указанный субъект не инфицирован указанным микроорганизмом, если указанное значение специфического опосредованного Т-клетками иммунного ответа на тест-антиген ниже контрольного уровня.
  3. 3. Способ по п.2, при котором делят образец на три фракции и инкубируют третью фракцию образца с Т-клеточным активатором для получения положительного контроля.
  4. 4. Способ по любому из предыдущих пунктов, где инфекция является активной инфекцией, латентной инфекцией, свежей инфекцией и/или длительной латентной инфекцией.
  5. 5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где измерение Ш-Ю уровня производят при помощи иммунологического устройства, выбранного из группы, включающей ЕЫЗА, китшех, Ми1йр1ех, иммуноблоттинг, ТРк-анализы, иммунохроматографические анализы латерального потока, методики иммуноферментного анализа, КАЗТ (радиоаллергосорбентный тест), радиоиммуноанализы, иммунофлуоресцентный анализ и иммунологические анализы с использованием сухих тест-полосок, хроматографический тест с полосками и иммунохроматографический тест.
  6. 6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где измерение Ш-Ю уровня осуществляют по уровням нуклеиновой кислоты.
  7. 7. Способ по п.6, где измерение Ш-Ю уровня осуществляют по уровням мРНК.
    - 35 020412
  8. 8. Способ по любому из предыдущих пунктов, где измерение ЬР-10 уровня осуществляют полимеразной цепной реакцией.
  9. 9. Способ по любому из предыдущих пунктов, где микроорганизм представляет собой МусоЬас1епа и МусоЬас1епа выбрана из группы, включающей комплексные организмы М. 1иЪегси1о818, МусоЬас1епа, у которых область различия (ΚΌ1) не была удалена, и МусоЬасЮпа, патогенные для людей.
EA200970246A 2006-09-05 2007-09-05 Иммунологический мониторинг на основе ip-10 EA020412B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200601145 2006-09-05
DKPA200700262 2007-02-20
PCT/DK2007/000399 WO2008028489A2 (en) 2006-09-05 2007-09-05 Ip-i0 based immunological monitoring

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200970246A1 EA200970246A1 (ru) 2009-10-30
EA020412B1 true EA020412B1 (ru) 2014-11-28

Family

ID=38716188

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200970246A EA020412B1 (ru) 2006-09-05 2007-09-05 Иммунологический мониторинг на основе ip-10

Country Status (17)

Country Link
US (2) US8026076B2 (ru)
EP (4) EP2261658B1 (ru)
JP (1) JP5805368B2 (ru)
KR (1) KR101248491B1 (ru)
CN (1) CN101523217B (ru)
AT (1) ATE504000T1 (ru)
AU (1) AU2007294293B2 (ru)
BR (1) BRPI0714744B8 (ru)
CA (1) CA2662429C (ru)
DE (1) DE602007013620D1 (ru)
DK (2) DK2261658T3 (ru)
EA (1) EA020412B1 (ru)
IN (1) IN2015DN03125A (ru)
PL (1) PL2128612T3 (ru)
PT (1) PT2128612E (ru)
WO (1) WO2008028489A2 (ru)
ZA (1) ZA200902297B (ru)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0722105D0 (en) 2007-11-10 2007-12-19 Sec Dep For Environment Food A Antigens
KR20110036590A (ko) * 2008-06-25 2011-04-07 베일러 리서치 인스티튜트 결핵균 감염의 혈액 전사 시그너처
WO2010009494A1 (en) * 2008-07-25 2010-01-28 Cellestis Limited A diagnostic method
CN102246040B (zh) * 2008-12-15 2014-11-05 安特鲁姆生物技术（私人）有限公司 用于诊断结核病的方法和装置
GB0906215D0 (en) 2009-04-09 2009-05-20 Lalvani Ajit Diagnostic test
ES2413437T3 (es) * 2010-03-10 2013-07-16 Institut Pasteur HMGB1 y anticuerpos anti-HMGB1 en pacientes infectados por VIH especialmente con trastornos neurológicos
US20130078657A1 (en) * 2010-05-04 2013-03-28 Hvidovre Hospital Hyperthermia augmented in-vitro immune recognition
US20140087363A1 (en) * 2010-12-09 2014-03-27 Hvidovre Hospital Method for generating, storing, transporting, eluting and detecting clinical relevant information in plasma using filter paper
WO2012139591A1 (en) 2011-04-13 2012-10-18 Hvidovre Hospital Monitoring liver fibrosis in a hepatitis c infected patient
CN103619880A (zh) * 2011-04-29 2014-03-05 百时美施贵宝公司 Ip-10抗体剂量递增方法
CN103122033B (zh) * 2011-11-21 2015-08-19 厦门大学 一种嵌合重组抗原及其用途
US20140342936A1 (en) * 2011-12-15 2014-11-20 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and kits for diagnosing latent tuberculosis infection
WO2013168876A1 (ko) 2012-05-11 2013-11-14 가톨릭대학교 산학협력단 이식 후 면역 상태를 모니터링 하는 키트 및 이를 이용한 면역 상태의 모니터링 방법
JP6102438B2 (ja) 2012-05-30 2017-03-29 三菱化学株式会社 軸受部材、端部部材、感光体ドラムユニット、プロセスカートリッジ、及び軸受部材の製造方法
JP6020237B2 (ja) 2013-02-15 2016-11-02 三菱化学株式会社 軸受部材、端部部材、感光体ドラムユニット、及び軸受部材の製造方法
US10449228B2 (en) 2013-09-10 2019-10-22 Immusant, Inc. Dosage of a gluten peptide composition
KR101542510B1 (ko) 2014-01-15 2015-08-18 대한민국 초기 hiv-1 감염자에서 급속한 aids 질환 진행을 예측하기 위한 ip-10의 용도
CN106461675B (zh) * 2014-02-26 2019-07-12 斯坦陵布什大学 用于诊断肺结核的方法
KR101590324B1 (ko) * 2014-04-24 2016-02-01 연세대학교 산학협력단 향상된 결핵 진단 방법
AU2015249592A1 (en) * 2014-04-24 2016-12-15 Immusant, Inc. Use of Interleukin-2 for diagnosis of Celiac disease
EP3699930B1 (en) 2014-08-14 2024-02-07 MeMed Diagnostics Ltd. Computational analysis of biological data using manifold and a hyperplane
KR101748296B1 (ko) 2014-09-04 2017-06-19 연세대학교 산학협력단 마이코박테리움 압세수스 복합체 감염 폐질환 진단용 바이오마커 조성물
WO2016054038A1 (en) 2014-09-29 2016-04-07 Immusant, Inc. Use of hla genetic status to assess or select treatment of celiac disease
EP3221344A2 (en) 2014-11-21 2017-09-27 Immusant Inc. Peptides for use in treatment and diagnosis of type 1 diabetes
CN104897893A (zh) * 2015-06-10 2015-09-09 复旦大学附属华山医院 一种基于结核特异性il-31检测的诊断结核分枝杆菌感染的试剂盒
CN108699583B (zh) 2016-03-03 2022-11-01 米密德诊断学有限公司 用于区分细菌和病毒感染的rna决定子
EP3482200B1 (en) 2016-07-10 2022-05-04 Memed Diagnostics Ltd. Protein signatures for distinguishing between bacterial and viral infections
EP3482201B1 (en) * 2016-07-10 2022-12-14 Memed Diagnostics Ltd. Early diagnosis of infections
WO2018060998A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Memed Diagnostics Ltd. Methods of prognosis and treatment
US11353456B2 (en) 2016-09-29 2022-06-07 Memed Diagnostics Ltd. Methods of risk assessment and disease classification for appendicitis
CN108548917B (zh) * 2018-03-01 2021-07-06 广州市雷德生物科技有限公司 一种记忆性免疫细胞的检测体系及其应用
EP3899044A2 (en) 2018-12-20 2021-10-27 Mikrogen GmbH Method of detecting infection with pathogens causing tuberculosis
WO2021255237A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 Mikrogen Gmbh Method of detecting infection with pathogens causing tuberculosis
WO2022169842A1 (en) * 2021-02-02 2022-08-11 Revelation Biosciences, Inc. Rapid detection kits and methods for diagnosing infections of the respiratory tract
WO2022240887A1 (en) * 2021-05-10 2022-11-17 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Methods for detecting and staging cellular viral immune responses

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4965192A (en) * 1984-12-05 1990-10-23 Anda Biologicals A60-antigen from Mycobacteria and use thereof as tuberculin and as vaccine
US20030143641A1 (en) * 2000-10-18 2003-07-31 Brice Gary Todd Novel assay for detecting immune responses involving antigen specific cytokine and/or antigen specific cytokine secreting T-cells
WO2003063759A2 (en) * 2002-01-31 2003-08-07 Peptor Ltd. Hsp peptides and analogs for modulation of immune responses via antigen presenting cells

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2378763A1 (en) * 1999-07-13 2001-01-18 Statens Serum Institut Tuberculosis vaccine and diagnostics based on the mycobacterium tuberculosis esat-6 gene family
US20040038201A1 (en) 2002-01-22 2004-02-26 Whitehead Institute For Biomedical Research Diagnostic and therapeutic applications for biomarkers of infection
AU2002952548A0 (en) * 2002-11-08 2002-11-21 Cellestis Limited Diagnostic assay
WO2005012907A1 (en) * 2003-08-01 2005-02-10 Renovar, Inc. Systems and methods for characterizing kidney diseases
US7575862B2 (en) * 2003-12-09 2009-08-18 Asiagen Corporation Assay systems, kits and methods for detecting microorganisms
GB2427471B (en) 2004-03-04 2009-07-22 Laura Manuelidis Pre-symptomatic markers for diseases associated with transmissable spongiform encephalopaties
CN1989410A (zh) * 2004-05-24 2007-06-27 贝勒研究院 免疫应答评价方法
CA2478138A1 (en) 2004-08-17 2006-02-17 University Health Network Cxcl10-based diagnosis and treatment of respiratory illnesses
US7332294B2 (en) * 2004-08-17 2008-02-19 University Health Network CXCL10-based diagnosis and treatment of respiratory illnesses
CA2607581A1 (en) * 2005-05-05 2006-11-16 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Se Cretary, Department Of Health & Human Services Methods and compositions for detecting immune responses
EP1767937A1 (en) 2005-09-27 2007-03-28 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Method of diagnosis of tuberculosis related immune restoration syndrome (IRS)
BRPI0708912B8 (pt) * 2006-03-14 2021-07-27 Univ Oregon Health & Science métodos in vitro para detecção de mycobacterium tuberculosis e de células t expressando cd8 que especificamente reconhecem seq id no: 11 em um indivíduo
CN1866023B (zh) * 2006-05-25 2010-11-03 上海市肺科医院 一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4965192A (en) * 1984-12-05 1990-10-23 Anda Biologicals A60-antigen from Mycobacteria and use thereof as tuberculin and as vaccine
US20030143641A1 (en) * 2000-10-18 2003-07-31 Brice Gary Todd Novel assay for detecting immune responses involving antigen specific cytokine and/or antigen specific cytokine secreting T-cells
WO2003063759A2 (en) * 2002-01-31 2003-08-07 Peptor Ltd. Hsp peptides and analogs for modulation of immune responses via antigen presenting cells

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANANABA G.A. ET AL.: "Chemokine and chemokine receptor regulation of Th1 response against Chlamydia". ABSTRACTS OF THE GENERAL MEETING OF THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, vol. 101, 2001, page 347, XP008080144 & 101ST GENERAL MEETING OF THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY; ORLANDO, FL, USA; MAY 20-24, 2001, ISSN: 1060-2011, abstract *
AZZURRI A. ET AL.: "IFN-gama-inducible protein 10 and pentraxin 3 plasma levels are tools for monitoring inflammation and disease activity in Mycobacterium tuberculosis infection". MICROBES AND INFECTION, ELSEVIER, PARIS, FR, vol. 7, no. 1, January 2005 (2005-01), pages 1-8, XP004742531, ISSN: 1286-4579, the whole document in particular: abstract page 5, left-hand column, last paragraph - right-hand column, last paragraph *
BELAY TESFAYE ET AL.: "Chemokine and chemokine receptor dynamics during genital chlamydial infection". INFECTION AND IMMUNITY, vol. 70, no. 2, February 2002 (2002-02), pages 844-850, XP002437891, ISSN: 0019-9567, the whole document in particular: abstract figure 2 page 845, left-hand column, last paragraph - right-hand column, line 18 *
BOURGARIT ANNE ET AL.: "Explosion of tuberculin-specific Th1-responses induces immune restoration syndrome in tuberculosis and HIV co-infected patients". AIDS, LONDON, GB, vol. 20, no. 2, January 2006 (2006-01), pages F1-F7, XP002418216, ISSN: 0269-9370, the whole document in particular: abstract page F2-F3: Methods, page F3, right-hand column, paragraph 2-3, figure 1 *
FERRERO ELISABETTA ET AL.: "Macrophages exposed to Mycobacterium tuberculosis release chemokines able to recruit selected leucocyte subpopulations: Focus on gammadelta cells". IMMUNOLOGY, vol. 108, no. 3, March 2003 (2003-03), pages 365-374, XP002472604, ISSN: 0019-2805, the whole document in particular: abstract page 367, left-hand column, line 12-37, table 1, page 368, right-hand column, line 1-17 *
KREMLEV SERGEY G. ET AL.: "Differential expression of chemokines and chemokine receptors during microglial activation and inhibition". JOURNAL OF NEUROIMMUNOLOGY, vol. 149, no. 1-2, April 2004 (2004-04), pages 1-9, XP002472607, ISSN: 0165-5728, the whole document in particular: abstract figure 1 *
LINDHOLM C. ET AL.: "Induction of chemokine and cytokine responses by Helicobacter pylori in human stomach explants". SCANDINAVIAN JOURNAL OF GASTROENTEROLOGY, vol. 36, no. 10, October 2001 (2001-10), pages 1022-1029, XP008086376, ISSN: 0036-5521, the whole document abstract *
MOLESWORTH-KENYON S.J. ET AL.: "ABUNDANT EXPRESSION OF IP-10 AND MIG IN THE HSV-1 INFECTED CORNEA". INVESTIGATIVE OPHTHALMOLOGY & VISUAL SCIENCE, ASSOCIATION FOR RESEARCH IN VISION AND, US, vol. 45, no. 1, April 2004 (2004-04), page U127, XP008080137, ISSN: 0146-0404, the whole document *
NAGARAJAN UMA M. ET AL.: "Chlamydia trachomatis induces expression of IFN-gamma-inducible protein 10 and IFN-beta independent of TLR2 and TLR4, but largely dependent on MyD88". JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 175, no. 1, July 2005 (2005-07), pages 450-460, XP008086385, ISSN: 0022-1767, the whole document in particular: abstract page 451, right-hand column, line 44-68, page 453, right-hand column, line 7 - page 454, left-hand column, line 26 *
RUHWALD MORTEN ET AL.: "CXCL10/IP-10 release is induced by incubation of whole blood from tuberculosis patients with ESAT-6, CFP10 and TB7.7.". MICROBES AND INFECTION/INSTITUT PASTEUR, JUN 2007, vol. 9, no. 7, June 2007 (2007-06), pages 806-812, XP002472608, ISSN: 1286-4579, the whole document in particular: abstract, table 2, page 811, right-hand column, line 10-18, figure 1 *
SEMNANI ROSHANAK TOLOUEI ET AL.: "The early response to the infective stage of the filarial parasite Brugia malayi is dominated by inflammatory genes in macrophages". FASEB JOURNAL, vol. 16, no. 5, 22 March 2002 (2002-03-22), page A1038, XP008089531 & ANNUAL MEETING OF PROFESSIONAL RESEARCH SCIENTISTS ON EXPERIMENTAL BIOLOGY; NEW ORLEANS, LOUISIANA, USA; APRIL 20-24, 2002, ISSN: 0892-6638, abstract *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2059816A2 (en) 2009-05-20
DE602007013620D1 (de) 2011-05-12
BRPI0714744B1 (pt) 2018-10-16
US20120015386A1 (en) 2012-01-19
EP2261658A2 (en) 2010-12-15
EP2128612B1 (en) 2011-03-30
US8026076B2 (en) 2011-09-27
CA2662429C (en) 2016-06-28
EP2228651A1 (en) 2010-09-15
CA2662429A1 (en) 2008-03-13
BRPI0714744A8 (pt) 2016-04-05
AU2007294293A1 (en) 2008-03-13
BRPI0714744A2 (pt) 2013-05-07
EA200970246A1 (ru) 2009-10-30
ZA200902297B (en) 2015-10-28
KR101248491B1 (ko) 2013-04-03
EP2261658A3 (en) 2011-05-11
KR20090074026A (ko) 2009-07-03
WO2008028489A3 (en) 2008-05-15
EP2128612A3 (en) 2009-12-09
IN2015DN03125A (ru) 2015-10-02
DK2128612T3 (da) 2011-07-18
PT2128612E (pt) 2011-07-06
WO2008028489A2 (en) 2008-03-13
CN101523217B (zh) 2014-03-19
JP5805368B2 (ja) 2015-11-04
EP2128612A2 (en) 2009-12-02
US20100086950A1 (en) 2010-04-08
EP2261658B1 (en) 2015-01-28
JP2010502200A (ja) 2010-01-28
PL2128612T3 (pl) 2011-09-30
BRPI0714744B8 (pt) 2021-07-27
ATE504000T1 (de) 2011-04-15
CN101523217A (zh) 2009-09-02
AU2007294293B2 (en) 2013-06-27
DK2261658T3 (en) 2015-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA020412B1 (ru) Иммунологический мониторинг на основе ip-10
Villamor et al. Vitamin D serostatus and dengue fever progression to dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome
KR102022513B1 (ko) 감도가 증진된 세포 매개 면역 반응 검정법
Verweij et al. Waddlia chondrophila and Chlamydia trachomatis antibodies in screening infertile women for tubal pathology
Dziemian et al. Determination of the relative avidity of the specific IgG antibodies in human toxocariasis
Millman et al. Population-based genetic epidemiologic analysis of Chlamydia trachomatis serotypes and lack of association between ompA polymorphisms and clinical phenotypes
AU2012244350B2 (en) Ip-10 based immunological monitoring
Badiane et al. Sensitivity and specificity for malaria classification of febrile persons by rapid diagnostic test, microscopy, parasite DNA, histidine-rich protein 2, and IgG: Dakar, Senegal 2015
EA005776B1 (ru) Способ диагностики или прогнозирования основных респираторных бактериальных патогенов у субъекта
Flori et al. Reliability of immunoglobulin G antitoxoplasma avidity test and effects of treatment on avidity indexes of infants and pregnant women
WO2008052566A1 (en) Ccl8 based immunological monitoring
Mazhari et al. Identification of novel Plasmodium vivax proteins associated with protection against clinical malaria
Sarr et al. In vivo and in vitro analysis of chloroquine resistance in Plasmodium falciparum isolates from Senegal
KR102132964B1 (ko) 쯔쯔가무시균 유래 엑소좀을 이용한 쯔쯔가무시병의 진단방법
Eisenberg et al. The Serologic response to Cryptosporidium in HIV-infected persons: implications for epidemiologic research.
Collet et al. Identification of novel markers for uncomplicated lower genital tract infections and upper genital tract pathology due to Chlamydia trachomatis
ES2364173T3 (es) Control inmunológico basado en ip-10.
Tawfiq et al. Determination the Time of Toxoplasmosis among Pregnant Women by using IgG Avidity to Various Toxoplasma Gondii Antigens
Marshall et al. Utility of C-Reactive Protein and Procalcitonin for Detecting Bloodstream Infection in Patients with HIV/AIDS
Roeder Longitudinal Quantification of Neutralizing Antibodies and T cell Responses to COVID-19 mRNA Vaccines
Tutarlılığı The accuracy of IgG avidity for detection of acute toxoplasmosis among pregnant Saudi women
Abraha et al. Antibody response in individuals affected with Sars-Cov-2 infection: temporal trends and qualitative and quantitative differences in symptomatic and asymptomatic subjects. A Cross Sectional Analysis. Ab-Covid Study
JP2013532274A (ja) 高温で増大されるｉｎｖｉｔｒｏ免疫認識
Vijayakumar et al. Non-Invasive Materials and Methods in the Diagnosis of Visceral Leishmaniasis and its Treatment Monitoring: A Systematic Review
Almeria et al. Recent Developments in the Diagnosis and Detection of the Zoonotic Parasite Toxoplasma gondii Causing Foodborne Disease and Outbreaks

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment