CN103619880A

CN103619880A - Ip-10抗体剂量递增方法

Info

Publication number: CN103619880A
Application number: CN201280032766.7A
Authority: CN
Inventors: A.Y.罗; W.L.特里冈纳; J.沈; L-A.许; Y.张; B.斯托佛; 陈海滨; H.黄; 陶晓路; C.布罗库思
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2011-04-29
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2014-03-05
Also published as: WO2012149320A1; EP2702076A1; MX2013012284A; US20140065164A1; BR112013027867A2; US20140127229A1; JP2014516944A; EA201391582A1; US9429581B2; CA2834552A1

Abstract

在某些实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者体内IP-10相关疾病的方法，包括：(a)向受试者施用预定剂量的抗IP10抗体；(b)检测该受试者的样品中抗-IP10抗体的水平；和(c)如果步骤(b)中抗-IP10抗体的水平低于阈值暴露水平，则增加受试者体内抗-IP10抗体的剂量，从而使受试者的IP-10相关疾病得到治疗。

Description

IP-10抗体剂量递增方法

发明背景

γ干扰素诱导蛋白10(IP-10)（也称作CXCL10）是一种10kDa趋化因子，由多种细胞，包括内皮细胞、单核细胞、成纤维细胞和角质形成细胞，响应IFN-γ而分泌。IP-10还存在于人迟发型超敏(DTH)反应的皮肤巨噬细胞和内皮细胞中。尽管IP-10最初是基于它被IFN-γ诱导的性质而得名的，但是它也可以被IFN-α诱导，例如在树突细胞中。在中枢神经系统的细胞中，例如在星形胶质细胞和小胶质细胞中，IP-10表达还可以被刺激物如IFN-γ、病毒和脂多糖等所诱导。

IP-10的受体已经被验明为CXCR3，一种七次跨膜受体。CXCR3在活化的T淋巴细胞上表达，但不在静息T淋巴细胞以及B淋巴细胞、单核细胞或粒细胞上表达。在NK细胞上，CXCR3在TGF-β1的刺激下上调。还鉴定了CXCR3的其它两种配体：MIG和ITAC。在活化的T细胞中，IP-10与CXCR3的结合介导钙动员和趋化作用。IP-10与活化的NK细胞上的CXCR3的结合也可诱导趋化作用和细胞内钙动员。在胸腺内，IP-10是TCRαβ⁺CD8⁺T细胞,TCRγδ⁺T细胞和NK-型细胞的化学引诱物。

IP-10或其受体CXCR3已经在多种不同的炎症和自身免疫性疾病中被鉴定，包括多发性硬化、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、肝炎、脊髓损伤、系统性红斑狼疮、移植排斥反应、干燥综合征。因此，需要有用于治疗IP-10相关疾病（例如炎症和自身免疫性疾病）的治疗剂（例如抗-IP10抗体）以及治疗方法。

发明概要

在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗需要治疗的受试者的IP10-相关疾病的方法。该方法包括：(a)向受试者施用预定剂量的抗-IP10抗体；(b)检测该受试者的样品中抗-IP10抗体的水平；和(c)如果步骤(b)中抗-IP10抗体的水平低于阈值暴露水平，则增加受试者体内抗-IP10抗体的剂量，从而使受试者的IP-10相关疾病得到治疗。任选地，该方法中使用的抗-IP10抗体特异结合人IP-10，而不与人MIG或人ITAC交叉反应。优选地，抗-IP10抗体是MDX-1100（一种全长人单克隆抗体）。一种示例抗-IP10抗体包括：(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区。另一种示例抗-IP10抗体包括：(a)包含SEQ IDNO:3的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:4的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO:5的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO:8的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO:9的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:10的轻链可变区CDR3。

在某些方面中，上述方法的步骤(b)通过如下的方法检测抗-IP10抗体的水平，其包括在适合于抗体-抗原复合物形成的条件下使所述样品与结合该抗-IP10抗体的抗体接触，随后检测抗体-抗原复合物的形成。优选地，与抗-IP10抗体结合的抗体是抗独特型抗体。例如，该抗独特型抗体与MDX-1100的一个或多个CDR结合。示例性抗独特型抗体包括，但不仅限于，在工作实施例中描述的10C8,6C9,2F5和23H10。在一个具体的实例中，该检测方法利用两种抗独特型抗体，即10C8和23H10，分别作为捕获抗体和可检测抗体（也称作“检测抗体”）。任选地，检测的完成是通过选自下组的方法实现的：EIA、ELISA、RIA、间接竞争免疫测定、直接竞争免疫测定、非竞争免疫测定、夹心式免疫测定和凝集测定。

在某些方面中，上述方法的IP10-相关疾病是炎症或自身免疫性疾病。炎症或自身免疫性疾病的实例包括但不限于：多发性硬化、类风湿性关节炎、炎性肠病（例如，溃疡性结肠炎、克罗恩病）、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、炎性皮肤病症（例如，银屑病，扁平苔藓）、自身免疫性甲状腺疾病（例如格雷夫斯病(Graves’disease)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)）、

综合征、肺部炎症（例如，哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺结节病、淋巴细胞肺泡炎(lymphocytic alveolitis)）、移植排斥、脊髓损伤、脑损伤（例如，中风）、神经变性性疾病（例如，阿尔茨海默病、帕金森氏病）、龈炎、基因治疗诱导的炎症、血管生成疾病、炎性肾脏病（例如，IgA肾病、膜增生性肾小球肾炎、急进型肾小球肾炎）和动脉粥样硬化。炎症或自身免疫性疾病的一个具体实例是炎性肠病（例如溃疡性结肠炎或克罗恩病）。

在某些实施方案中，本发明提供了一种分离的单克隆抗体（例如抗独特型抗体）或其抗原结合部分，其特异结合抗-IP10抗体。优选地，抗-IP10抗体是MDX-1100。一种示例性抗-IP10抗体包括：(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区。另一种示例性抗-IP10抗体包括：(a)包含SEQ ID NO:3的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:4的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO:5的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO:8的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO:9的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:10的轻链可变区CDR3。示例性抗独特型抗体包括，但不仅限于，如工作实施例中描述的10C8,6C9,2F5和23H10。

在某些实施方案中，本发明提供了一种杂交瘤细胞系，其产生特异结合抗-IP抗体（例如MDX-1100）的单克隆抗体（例如抗独特型抗体）或其抗原结合部分。

在某些实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含(1)特异结合抗-IP10抗体（例如MDX-1100）的单克隆抗体（例如抗独特型抗体）或其抗原结合部分；和(2)药物可接受的载体。

在某些实施方案中，本发明提供了用于检测样品中治疗性抗-IP10抗体（例如MDX-1100）的方法。该方法包括在适合于抗体-抗原复合物形成的条件下使所述样品与针对抗-IP10抗体的抗体（例如抗独特型抗体）或其抗原结合部分接触，随后检测所述复合物的形成。例如，抗独特型抗体与MDX-1100的一个或多个CDR结合。示例性抗独特型抗体包括，但不仅限于，如工作实施例中描述的10C8,6C9,2F5和23H10。在一个具体实例中，检测方法利用两种抗独特型抗体，即10C8和23H10，分别作为捕获抗体和可检测抗体（也称作“检测抗体”）。任选地，检测的完成是通过选自下组的方法完成的：EIA、ELISA、RIA、间接竞争免疫测定、直接竞争免疫测定、非竞争免疫测定、夹心式免疫测定和凝集测定。

在某些实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，其包括(1)特异性结合抗-IP10抗体(例如MDX-1100)的单克隆抗体（例如抗独特型抗体）或其抗原结合部分；和(2)帮助抗体-抗原复合物形成所需要的试剂。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于治疗需要治疗的受试者的IP10-相关疾病的方法，包括：(a)向受试者施用抗-IP10抗体；(b)通过免疫测定检测该受试者的样品中抗-IP10抗体的水平；和(c)如果该抗-IP10抗体的水平低于阈值暴露水平，则增加受试者体内抗-IP10抗体的剂量；如果抗-IP10抗体的水平处于或高于阈值暴露水平，则不增加受试者体内抗-IP10抗体的剂量。

附图简述

图1显示了基于研究第57天的MDX-1100Cminss而分层(stratified)的临床响应率、临床缓解率和黏膜愈合率的暴露-响应（E-R）关系。

图2显示了临床响应率相对于研究第57天的MDX-1100Cminss的Logistic回归分析。

图3显示了临床缓解率相对于研究第57天的MDX-1100Cminss的Logistic回归分析。

图4显示了黏膜愈合率相对于研究第57天的MDX-1100Cminss的Logistic回归分析。

图5显示了经负log10转化的p-值相对于作为可能的目标暴露(targetexposure)的不同Cminss的作图。

图6A和6B显示了两种抗独特型克隆10C8和6C9的结合活性的分析。

图7显示了两种抗独特型克隆2F5和23H10的结合活性的分析。

图8显示了亚克隆10C8的结合活性的分析。

图9显示了亚克隆6C9,2F5和23H10的结合活性的分析。

图10显示了克隆10C8与IP10竞争的结合活性的分析。

图11显示了克隆2F5和23H10与IP10竞争的结合活性的分析。

图12A显示了6A5人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)和氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。绘出了CDR1(SEQ ID NO:3),CDR2(SEQID NO:4)和CDR3(SEQ ID NO:5)区，并指示了V、D和J种系衍生。

图12B显示了6A5人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)和氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。绘出了CDR1(SEQ ID NO:8),CDR2(SEQID NO:9)和CDR3(SEQ ID NO:10)区，并指示了V和J种系衍生。

发明详细说明

本发明涉及分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体，其特异结合IP-10（本文称作“IP10抗体”或“抗-IP10抗体”）并抑制IP-10的功能性质。在某些实施方案中，本发明提供了结合IP-10抗体的抗独特型抗体。在某些实施方案中，本发明提供了使用这样的抗独特型抗体检测生物样品中IP10抗体的方法。在进一步的实施方案中，本发明提供了新型有效的治疗IP10相关疾病（例如炎症或自身免疫性疾病）的方法，其包括：(1)给受试者使用抗-IP10抗体；(b)检测该受试者的样品中抗-IP10抗体的水平；和(c)如果步骤(b)中抗-IP10抗体的水平低于某一水平，则增加施与受试者的抗-IP10抗体的剂量，从而治疗受试者的IP-10相关疾病。在进一步的实施方案中，本发明提供了一种治疗需要治疗的受试者的IP10相关疾病的方法，包括：(1)对受试者施用抗-IP10抗体；(b)通过免疫测定检测该受试者的样品中抗-IP10抗体的水平；和(c)如果抗-IP10抗体的水平低于阈值暴露水平，则增加施与受试者的抗-IP10抗体的剂量；如果抗-IP10抗体的水平处于或高于阈值暴露水平，则不增加施与受试者的抗-IP10抗体的剂量。

为了使本发明更加容易理解，首先对一些术语进行定义。其他定义在详细说明各处中给出。

术语“γ干扰素诱导蛋白10”、“IP-10”和“CXCL10”可互换使用，包括人IP10的变体、同种型和物种同源物。因此，在某些情况下，本发明的人IP10抗体可以和来自其它非人物种的IP10交叉反应。在其它情况下，所述抗体可以完全对人IP-10特异，而不会显示物种交叉反应性或其它类型的交叉反应性。人IP-10的完整氨基酸序列的登录号为NP_001556。猕猴IP-10的完整氨基酸序列的

登录号为AAK95955。小鼠IP-10的完整氨基酸序列的

登录号为NP_067249。

术语“CXCR3”是指IP-10(CXCL10)的受体。人CXCR3的完整氨基酸序列的

登录号为NP_001495。

术语“MIG”是指CXCR3的配体，也称作干扰素-γ诱导的单核因子，其与IP-10不同。人MIG的完整氨基酸序列的

登录号为NP_002407。

术语“ITAC”是指CXCR3的配体，也称作干扰素诱导的T细胞α化学引诱物，其与IP-10不同。人ITAC的完整氨基酸序列的

登录号为NP_005400。

如这里所使用的，术语“抗体”包括完全抗体和其任何抗原结合片段（即“抗原结合部分”）或单链。“抗体”是指一种至少包含由二硫键互联的两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(这里缩写为V_H)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH₁,CH₂和CH₃构成。每条轻链由轻链可变区(这里缩写为V_L)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。V_H和V_L区可以被进一步细分为称作互补决定区(CDR)的超变区，它们之间被称作框架区(FR)的更保守的区域分隔。每个V_H和V_L区由三个CDR和四个FR构成，从氨基端到羧基端的排列顺序如下：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。重链和轻链的可变区含有一个与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞（例如效应细胞）和经典补体系统中的第一补体(C1q)。

如这里所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”（或简称为“抗体部分”）是指抗体的一个或多个保持特异性结合抗原（例如IP-10或IP10抗体）能力的片段。已经显示，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段实现。术语抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，一种由V_H,V_L,C_L和C_H1结构域构成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，一种包含两条通过铰链区二硫键相连的Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由V_H和C_H1结构域构成；(iv)Fv片段，由抗体单条臂的V_L和V_H结构域构成；(v)dAb片段(Ward et al.,Nature,341:544-546(1989))，其由一个V_H结构域构成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。而且，尽管Fv片段的两个结构域，V_L和V_H，由不同的基因编码，但是可以用重组方法通过一段合成接头将它们连接起来，使它们能够构建成为一个单一蛋白链，其中V_L和V_H区配对形成单价分子（称作单链Fv(scFv)；见例如Bird et al.,Science,242:423-426(1988);和Huston etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879-5883(1988))。这种单链抗体也意图包含在术语抗体的“抗原结合部分”之内。使用本领域技术人员已知的传统技术获得这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式筛选所获得的片段的功用。

如这里所使用的，“分离的抗体”是指这样的抗体，其基本上没有(substantially free of)其它具有不同抗原特异性的抗体（例如分离的特异性结合IP10的抗体基本上没有特异结合除IP10之外的抗原的抗体）。然而，特异结合IP10的分离抗体可能与其它抗原，例如来自其它物种的IP10分子，具有交叉反应性。而且，分离抗体可以基本上没有其它细胞材料和/或化学剂。

如这里所使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有单一分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体组分对某个特定的表位显示单一的结合特异性和亲和力。

如这里所使用的，术语“人抗体”意图包含如下的抗体，其可变区的框架和CDR区均来自人种系免疫球蛋白序列。而且，如果抗体含有恒定区，则恒定区也来自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基（例如通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变）。然而，如这里所使用的，术语“人抗体”不意图包含如下的抗体，其中来源于另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列被嫁接到人框架序列上。

术语“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性的抗体(antibodies)，它们的可变区的框架和CDR区均来源于人种系免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，杂交瘤包括从转基因非人动物（例如转基因小鼠）获得的、基因组中包含人重链转基因和轻链转基因的B细胞，与永生细胞融合。

如这里所使用的，术语“重组人抗体”包括所有通过重组方法制备、表达、产生或分离的人抗体，例如(a)从用人免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物（例如小鼠）或由其制备的杂交瘤分离得到的抗体，(b)从被转染从而表达人抗体的宿主细胞，例如从转染瘤，分离得到的抗体，(c)从重组、组合人抗体文库分离得到的抗体，和(d)通过其它涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的手段制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人抗体的可变区中的框架区和CDR区均来自人种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方案中，可以对这样的重组人抗体进行体外突变（或者当使用被人Ig序列转基因的动物时，进行体内体细胞突变），以至于重组抗体V_H和V_L区的氨基酸序列虽然来自于人种系V_H和V_L序列并与人种系V_H和V_L序列近缘，但不是体内人抗体种系库中天然存在的序列。

结合抗-IP抗体的抗体

在某些方面中，本发明提供了特异针对抗-IP10抗体（例如MDX-1100）的单克隆或多克隆抗体。优选地，此类抗体是抗独特型(抗-Id)抗体。抗独特型(抗-Id)抗体是一种如下的抗体，其识别一般与抗体之抗原结合位点相关的独特决定簇。Id抗体可以通过用要制备抗-Id的抗体免疫动物来制备。被免疫的动物会识别免疫用抗体的独特型决定簇并对进行响应，产生针对这些独特型决定簇的抗体（抗-Id抗体）。见例如美国专利No.4,699,880。下面提供了用于产生与抗IP10抗体结合的单克隆抗体的示例技术。

单克隆抗体可以从一群基本上同质的抗体获得，基本上同质的抗体即构成该群体的各个抗体是相同的，只是可能存在少量自然发生的突变。因此，修饰语“单克隆”是指抗体的如下特征，即其不是离散(discrete)抗体的混合物。例如，单克隆抗体可以用首先由Kohler等,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)制备。在杂交瘤方法中，小鼠或其它合适的宿主动物，例如仓鼠，被如上所述地免疫，引发产生或能够产生特异结合用于免疫的蛋白的抗体的淋巴细胞。可选择地，淋巴细胞可以被体外免疫。然后，用合适的融合剂，例如聚乙二醇，将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice,59-103页,AcademicPress(1986))。

将这样制备的杂交瘤细胞接种并生长于合适的培养基中，其优选地含有一种或多种可以抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或生存的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质会阻止HGPRT缺陷细胞的生长。优选的骨髓瘤细胞是这样的细胞，其融合效率高，支持选出的抗体产生细胞稳定高水平地产生抗体，并且对培养基例如HAT培养基敏感。其中，骨髓瘤细胞系的实例是小鼠骨髓瘤细胞系，例如来自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系，其可以从索尔克研究所细胞供应中心(Salk Institute Cell Distribution Center)（San Diego,Calif.USA）获得，而SP-2,P3X63Ag.U.1,or X63-Ag8-653细胞可以从美国典型微生物菌种保藏中心(American Type Culture Collection)(Manassas.Va.USA)获得。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已被描述用于产生人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,51-63页,Marcel Dekker,Inc.,NewYork(1987))。

对于杂交瘤在其中生长的培养基，测定其中是否有兴趣抗体的单克隆抗体产生。优选地，通过免疫沉淀或通过体外结合测定，例如放射免疫(RIA)或ELISA，来确定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。还对这些克隆进行筛选，选出当用作捕获剂和/或可检测抗体时在测定中产生背景噪音最小者。单克隆抗体的结合亲和性可以通过例如Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析加以确定。在鉴定出可以产生具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，可以通过有限稀释程序对克隆进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,59-103页,Academic Press(1986))。用于该目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以作为动物体内的腹水瘤在体内生长。通过亚克隆筛选的单克隆抗体适当地通过常规免疫球蛋白纯化程序，例如蛋白

琼脂糖色谱、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱，从培养基、腹水或血清中分离。

一种具体的使用杂交瘤技术的制备技术包括用混于佐剂(例如单磷酰脂质A/海藻糖二棒分枝菌酸酯)中的感兴趣抗体、或者感兴趣抗体与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)或与鲎血蓝蛋白的缀合物免疫(例如通过注射到足掌或脾脏)小鼠(例如CAF1小鼠或Balb/c)。注射的次数依需要而定。处死小鼠并从被免疫的小鼠，特别是具有高滴度的小鼠，获得胭窝淋巴结或脾细胞，并与鼠骨髓瘤细胞系如SP2/0或P3X63Ag.U.1(美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,Va.))融合。对所得的杂交瘤筛选对感兴趣的抗体具有结合亲和力的抗体，而排除结合不同抗原的其它抗体。这种筛选可以通过常规的ELISA来实施，检测可结合固定的感兴趣抗体的抗体的分泌，或者检测具有超过约95%的抑制能力(抑制兴趣抗体与蛋白抗原的结合)的IgG的产生。该筛选限定了一个对感兴趣抗体具有正常或更高反应性、并且具有选择性的抗体群体。可以进行进一步的筛选以鉴定具有对ELISA而言特别优选的性质的抗体。用于筛选优选抗独特型抗体的标准包括其以相对高的亲和力(Kd<大约10^-8M)结合感兴趣抗体，且其与感兴趣抗体的结合应当与对分析物跨膜蛋白的结合互斥。还应当提供具有最少背景噪音的最清晰的测定。

阳性克隆可以使用装置通过表面等离子体共振进行再次筛选，测量抗独特型抗体对感兴趣抗体的亲和性以及结合的互斥性。可以将兔抗-小鼠IgG(Fc)固定到生物传感器表面上，并用于从杂交瘤培养上清液捕获抗独特型抗体。可以将0.2nM的感兴趣抗体单独或与0.9nM C反应蛋白(CRP)一起注射到被固定的抗独特型抗体的表面上，并比较相对质量积累。通过有限稀释对选出的杂交瘤细胞进行克隆，获得期望的克隆。然后从这些克隆纯化并分离抗独特型抗体。制备抗独特型抗体的实例见例如美国公开Nos.2002/0142356和2008/0176257，以及Durrant等,Int.J.Cancer,1:92(3):414-420(2001)和Bhattacharya-Chatterjee,Curr.Opin.Mol.Ther.,3(1):63-69(2001)。

在某些实施方案中，单克隆抗体还可以通过重组的方法产生。通过常规程序容易地对编码单克隆抗体的DNA进行分离和测序(例如通过能够特异结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞用作这些DNA的优选来源。一旦分离DNA，可以将DNA置于表达载体中，随后转染进入宿主细胞，例如不会产生免疫球蛋白的大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文献见Skerra等,Curr.Opin.Immunol.,5:256-262(1993)和Pluckthun,Immunol.Revs.,130:151-188(1992)。

在进一步的实施方案中，抗体或抗体片段可以从用McCafferty等,Nature,348:552-554(1990)描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离。Clackson等,Nature,352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续的出版物描述了通过链改组产生高亲和性(nM范围)人抗体(Marks等,Bio/Technology,10:779-783(1992)),使用组合感染和体内重组作为构建极大噬菌体文库的策略(Waterhouse等,Nucl.Acids Res.,21:2265-2266(1993))。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的常规单克隆抗体杂交瘤技术的可用替代。

DNA也可以被修饰，例如通过用人重链和轻链恒定域的编码序列代替同源鼠序列(见例如美国专利No.4,816,567;Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851(1984))，或者通过将非免疫球蛋白多肽编码序列的全部或部分共价连接到免疫球蛋白编码序列上来加以修饰。

许多可用于实践本发明的操作规程，无论是否在这里被详细描述，均是分子生物学、生物化学、免疫学和医学领域的技术人员所熟知的。一旦确定了感兴趣抗体，产生可结合抗-IP10抗体的抗体属于本领域普通技术人员的技能范围之内。

检测方法

在某些实施方案中，本发明针对抗-IP10抗体(例如MDX-1100)的抗体或其抗原结合部分可以用于检测受试者体内的治疗性抗-IP10抗体(例如MDX-1100)和其片段或衍生物。优选地，这样的抗体是抗独特型(抗-Id)抗体。例如，在适合形成抗体-抗原复合物的条件下，将来自测试受试者的体液(例如血液、血清或血浆)或组织样品与本发明的抗-MDX-1100单克隆抗体或其抗原结合部分接触。然后可以通过本文中描述的或者本领域已知的(见例如O’Connor等,Cancer Res.,48:1361-1366(1988))方法确定这些复合物的存在或量，其中将测试样品中发现的复合物的存在或量与在一系列含有已知量的抗原的标准品或对照样品中发现的复合物的存在或量进行比较。因此，本发明涉及用于检测生物样品(例如血液、血清、血浆、尿液、脑脊液、粘液或唾液)中的抗-IP10抗体例如MDX-1100(或其片段和/或衍生物)的方法。

在任何所述检测测定中，该方法可以采用免疫测定，例如酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、间接竞争免疫测定、直接竞争免疫测定、非竞争免疫测定、夹心式免疫测定、凝集测定或其它本文中记载的或本领域已知的免疫测定(见例如Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques,pp.147-158,CRC Press,Inc.(1987))。免疫测定可以构建成同源或异源模式。异源免疫测定的独特之处在于包含将结合的分离物与游离的分析物固相分离，或将结合的标签与游离的标签固相分离。固相可以采用本领域熟知的各种形式，包括但不仅限于，试管、平板、珠子或条(strips)。一种具体的形式是微量滴定板。固相材料可以包括各种玻璃、聚合物、塑料、纸或膜。特别期望的是塑料，例如聚苯乙烯。异源免疫测定可以是竞争或非竞争的(即三明治形式)（见例如美国专利No.7,195,882）。

在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种检测来自受试者的生物样品中MDX-1100的方法，其包括如下步骤（见下文）。

在测定的第一步中，使生物样品接触固定的捕获抗体，例如针对MDX-1100的抗独特型抗体，并与之一起温育。这些抗独特型抗体优选地是单克隆抗体，并可以来自任何物种，但优选地是来自啮齿动物，更优选地鼠(例如10C8,6C9,2F5和23H10，如工作实施例中所述)。固定常规上通过使抗体不溶化来实现，固定或是在测定程序之前进行，例如通过吸附于不溶于水的基质或表面(美国专利No.3,720,760)，或通过非共价或共价偶联(例如使用戊二醛或碳二亚胺交联，事先活化(例如用硝酸和还原剂，如美国专利No.3,645,852或Rotmans等,J.Immunol.Methods,57:87-98(1983)所述)或者不事先活化支持物，或者在测定程序之后固定捕获抗体，例如通过免疫沉淀。

用于免疫测定的固相可以是任何基本上不溶于水、且可以用于免疫测量性测定(immunometric assays)的惰性支持物或载体，包括例如表面、颗粒、多孔材料等形式的支持物。通用的支持物的实例包括小片层(small sheet)、

凝胶、聚氯乙烯、塑料珠和用聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等制成的测试板或试管，包括96孔滴定板，以及颗粒材料(particulate materials)，例如滤纸、琼脂糖、交联葡聚糖和其它多糖。或者，适当地采用活性水不溶性基质，例如氰-溴化物活化的碳水化合物和美国专利Nos.3,969,287;3,691,016;4,195,128;4,247,642;4,229,537和4,330,440中描述的活性基质来进行捕获试剂固定。在一个具体的实施方案中，固定的捕获抗体被包被在微滴定板上，特别地，所用的固相是可以用于一次分析几个样品的多孔微滴定板。最优选的是

或MaxiSorp96孔ELISA板，例如商品名为

MaxiSorb或

的产品。固相被如上所述地用捕获抗体包被，其可以合意地通过非共价或共价相互作用连接或物理连接。用于附接的技术包括在美国专利No.4,376,110和本文引用的参考文献中所述的那些。如果是共价的，将平板或其它固相与交联剂和捕获抗体一起温育，温育条件是本领域众所周知的，例如在室温下1个小时。通常使用的用于将捕获剂附接到固相基底的交联剂包括，例如1,1-双(重氮乙酰)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如与4-叠氮水杨酸的酯，同基双功能亚胺酸酯，包括二琥珀酰亚胺基酯如3,3′-二硫双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)，和双功能马来酰亚胺如双-N-马来酰亚胺基-1,8-辛烷。衍生化剂例如甲基-3-((对叠氮苯基)-二硫)丙酰异丙亚胺(propioimidate)可以产生光活化性(photoactivatable)中间产物，该中间产物能够在光存在下形成交联。

被包被的平板随后通常用封闭剂处理，封闭剂非特异性结合结合位点并使结合位点饱和，从而防止游离配体无谓地结合在平板的孔上的过量位点上。服务于此目的的合适封闭剂的实例包括，例如，明胶、牛血清白蛋白、卵清蛋白、酪蛋白和脱脂牛奶。封闭处理通常在环境温度下处理大约1-4个小时，优选地大约1.5-3小时。

选择样品与固定的捕获抗体的温育条件，使测试的灵敏度最大并使解离最小，并保证样品中存在的任何感兴趣抗体均与固定的捕获抗体结合。优选地，温育在相当恒定的温度下完成，温度范围从大约0℃到大约40℃，优选地在室温或室温附近。温育时间一般不超过大约10小时。优选地，温育时间为室温或大约室温下大约0.5-3小时，更优选地大约1.5-3小时，以最大化感兴趣抗体与捕获抗体的结合。如果添加了蛋白酶抑制剂以防止生物流体中的蛋白酶降解感兴趣抗体，则温育的持续时间可以更长。

在本文中的测试方法的第二步(该步骤是可选的)中，将生物样品与被固定的捕获抗体分离(优选地通过清洗)，以除去未被捕获的感兴趣抗体(例如MDX-1100)。清洗可以进行3次或更多次。清洗的温度一般从冰箱温度到中等温度，在实验期间保持恒定温度，通常为大约0-40℃，更优选地大约4-30℃。如果担心被捕获的感兴趣抗体在随后的步骤中可能有一定程度的解离，则在此阶段也可以添加交联剂或其它合适的试剂，使当前已结合的感兴趣抗体与捕获剂共价连接。

在第三步中，将结合有任何感兴趣抗体(例如MDX-1100)的被固定的捕获抗体与可检测的抗体接触，优选地在大约20-40℃的温度下，更优选地大约36-38℃。虽然可检测的抗体可以是多克隆或单克隆抗体，但优选地是单克隆抗体，更优选地是啮齿动物抗体，更加优选的是鼠抗体。在一个具体的实施方案中，本文的测定中的可检测抗体是针对MDX-1100的抗独特型抗体，例如工作实施例中所述的10C8,6C9,2F5和23H10。任选地，可检测抗体可以被直接检测，且例如是生物素化的。生物素化的标记物的检测手段优选地是亲和素或链亲和素-HRP，检测手段的读取方式优选是荧光或比色。

测定中的包被(捕获)和检测可以使用相同的抗独特型抗体，或者，包被和检测可以使用不同的抗体。优选地，选择它们使背景噪音最小化。

在测定方法的第四步中，使用用于可检测抗体的检测手段来测量样品中当前与捕获抗体结合的任何感兴趣抗体(例如MDX-1100)的水平。如果生物样品来自临床病人，则该测量步骤优选地包括将上述三个步骤的反应结果与标准曲线进行比较，以确定感兴趣抗体相比于已知量的水平。

可检测抗体(这里称作“第一抗体”)可以被直接标记或间接标记，间接标记是在洗掉多余的第一抗体之后，添加摩尔过量的标记的第二抗体。第二抗体是针对第一抗体的动物物种的IgG的抗体。在后一种间接测定中，向样品中添加针对第一抗体的已标记抗血清，从而在原位产生标记抗体。用于第一或第二抗体的标记物是任何不会干扰游离的感兴趣抗体与抗独特型抗体的结合的、可检测的官能团。合适的标记物的实例是在已知的免疫测定中使用的多种标记物，包括可以被直接检测的部分，例如荧光色素、化学发光剂和放射性标记物，以及必须经过反应或衍生化才能被检测的部分，例如酶。这些标记物的实例包括放射性同位素³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H和¹³¹I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹磺酰(dansyl)、伞形花内酯，荧光素酶例如萤火萤光素酶和细菌荧光素酶(见例如美国专利No.4,737,456)、萤光素、2,3-二氢双酮酞嗪(2,3-dihydrophthalazinedione)、HRP、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，与利用过氧化氢来氧化染料前体的酶(如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶)偶联，生物素（可以通过例如亲和素、链亲和素、链亲和素-HRP和链亲和素-β-半乳糖苷酶与MUG检测到），自旋标记物(spin labels)，噬菌体标记物，稳定的自由基，等。在一个具体的实施方案中，标记物是生物素，且检测手段是亲和素或链亲和素-HRP。

可以使用常规方法将这些标记物共价连接到蛋白或多肽上。例如，可以使用偶联剂如二醛、碳二亚胺、二马来酰亚胺、双亚胺(bis-imidates)、双偶氮化联苯胺(bis-diazotized benzidine)等用上述荧光、化学发光和酶标记物标记抗体。见例如美国专利Nos.3,940,475(荧光法)和3,645,090(酶法);Hunter等,Nature,144:945(1962);David等,Biochemistry,13:1014-1021(1974);Pain等,J.Immunol.Methods,40:219-230(1981);和Nygren,J.Histochem.Cytochem.,30:407-412(1982)。一种标记物实例是生物素，使用链亲和素-HRP用作检测手段。这些标记物(包括酶)与抗体的连接对于免疫测定技术领域的普通技术人员而言是标准操作程序。见例如O’Sullivan等.“Methods for thePreparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay,”in Methods in Enzymology,Langone,J.J.and Van Vunakis,H.编辑.73卷,147-166页,Academic出版社,New York,N.Y.(1981)。

添加了最后一种标记抗体之后，如下确定已结合的抗体量：通过清洗除去多余的未结合的标记抗体，然后使用适用于该标记物的检测方法测量捕获标记物的量，并将测得的量与生物样品中感兴趣抗体的量相关联。例如，在使用酶的情况下，显色和测量得到的颜色的量将会是所存在的感兴趣抗体量的直接量度。具体地，如果标记物是HRP，则用490nm吸光度的底物OPD检测颜色。在另一个实例中，在从固定相洗去针对未标记的第一抗体的酶标记第二抗体之后，通过将固定的捕获试剂与酶的底物温育来显现颜色或化学发光，并加以测量。然后，通过与平行进行的标准感兴趣抗体产生的颜色化化学发光进行比较，计算感兴趣抗体的浓度。

试剂盒

在某些实施方案中，本发明提供了可用于上述测定的试剂盒，其包括一种或多种针对兴趣抗-IP10抗体(例如MDX-1100)的抗体(单克隆或多克隆)，或其抗原结合部分，以及帮助抗体-抗原复合物形成和/或检测所需的试剂。优选地，这些试剂盒的抗体是抗独特型抗体。例如，本发明的试剂盒是有包装的组合，包括如下基本组件：(a)捕获试剂，其包含至少一种针对MDX-1100的抗独特型抗体(这里称作“捕获抗体”)；(b)至少一种可检测的(标记或未标记)抗独特型抗体，其与MDX-1100上的另一不同表位结合；和(c)关于如何使用这些试剂实施测定方法的使用说明。

任选地，该试剂盒还包含所述的捕获抗体的固体支持物，固体支持物可以作为单独的组件提供，或者可以作为上面已经固定好捕获抗体的组件提供。因此，试剂盒中的捕获抗体可以是固定在固体支持物上的，或者它们被固定在这样的固体支持物上：该支持物包含在试剂盒中，或者在试剂盒之外另行提供。例如，捕获抗体被包被在微滴定板上。可检测抗体可以是标记抗体或者是未标记抗体，标记抗体直接检测，未标记抗体通过在不同物种中产生的针对该未标记抗体的标记抗体来检测。当标记物是酶时，试剂盒通常包含底物和酶所需的辅助因子，当标记物是荧光团时，可以包含提供该可检测发色团的染料前体，而当标记物是生物素时，则可以包含亲和素，例如亲和素、链亲和素、或与HRP或β-半乳糖苷酶及MUG缀合的链亲和素。

在一个具体的实施方案中，捕获抗体是选自如工作实施例中所述的10C8,6C9,2F5和23H10的抗独特型抗体。另外，在一个具体实施方案中，可检测抗体是选自10C8,6C9,2F5和23H10的抗独特型抗体，其中捕获抗体和可检测抗体与MDX-1100上的不同表位结合。

试剂盒可以进一步包含与所述抗独特型抗体结合的感兴趣抗体(例如纯化的MDX-1100)或其片段作为阳性对照。该试剂盒可以进一步包含不会与所述抗独特型抗体反应的抗体作为阴性对照。试剂盒可以进一步包括其它添加物，例如稳定化剂、清洗缓冲液和温育缓冲液等。试剂盒的组分可以按照预定的比例提供，适当地改变各试剂的相对量以便使试剂溶液中的浓度使测定的灵敏度实质上得到最大化。特别地，试剂可以作为干粉提供，通常是冻干粉，包括赋形剂，赋形剂在溶解时可以提供具有适当浓度的试剂溶液，用于与待测试的样品组合。

治疗方法

在某些实施方案中，本发明提供了全新而有效的治疗IP10相关疾病(例如炎症或自身免疫性疾病)的方法，其包括：(a)向受试者施用预定剂量的抗IP10抗体；(b)检测该受试者的样品中抗-IP10抗体的水平；和(c)如果步骤(b)中抗-IP10抗体的水平低于阈值暴露水平，则增加受试者体内抗-IP10抗体的剂量(例如，增加至治疗有效剂量)，从而使受试者的IP-10相关疾病得到治疗；和如果步骤(b)中抗-IP10抗体的水平处于或高于阈值暴露水平，则不增加受试者体内抗-IP10抗体的剂量。特别地，样品中抗-IP10抗体的水平可以通过上述任何一种测定方法加以检测。

术语“治疗”包括施用抗-IP10抗体防止或延迟IP10-相关疾病症状、并发症或生物化学指征的出现，缓解症状，或阻滞或抑制疾病(例如炎症或自身免疫性疾病)的进一步发展。治疗可以是预防性的(防止或延迟疾病的发生，或防止临床或亚临床症状的显现)或者在疾病显现后治疗性抑制或减轻症状。

如这里所使用的，术语“剂量”是指施用给受试者的抗-IP10抗体的量。

如这里所使用的，术语“治疗有效剂量”是指如下的抗-IP10抗体的剂量，其优选地导致疾病症状严重程度降低，无疾病症状期的频率和持续时间增加，或防止由病患导致的损伤或失能。本领域的普通技术人员能够根据受试者的身材、受试者病症的严重程度和所选的特殊组合物或给药途径等因素确定这些量。

如这里所使用的，术语“阈值暴露水平”是指在诱发期和/或维持期向受试者施用抗-IP10抗体后可实现临床上有意义的诱发和/或保持疾病缓解的最低暴露水平。阈值暴露水平可以通过如工作实施例中所述的暴露-响应分析容易地加以确定。例如，阈值暴露水平可以是40-150μg/mL范围的波谷浓度(例如40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150μg/mL)。

本发明至少部分地基于在对一种人抗-IP10抗体(即MDX-1100)进行临床试验治疗炎性肠病(IBD)期间获得的观察结果，如下文所述。该试验证明了在用MDX-1100治疗的患者体内MDX-1100的药代动力学(PK)参数的变化性。同时，该试验证明了MDX-1100在本研究中具有极低的免疫原性。而且，该试验证明存在强烈的药物暴露/响应关系，波谷药物水平与效力直接相关。

对于许多炎症或自身免疫性疾病(例如IBD)，常规的治疗包括(1)在诱导期用相对高的药物剂量，旨在将急性病置于控制之下；和(2)维持期(或治疗期)用相对低的剂量，旨在防止疾病复发(见例如美国专利公布号2006/0009385)。尽管上述临床试验结果是在诱导期获得的，但是这些观察结果(例如PK参数的可变性、极低的免疫原性或强的暴露-响应关系)似乎是该分子性质和/或其作用机制所固有的。因此，申请人预期在维持期也有相似的观察结果。

本发明的一个方面是使患者用药过量最小化，同时优化效力(例如在维持期)。在一个具体实例中，本发明提供了一种治疗IP-10相关病症的方法，包括：(1)向受试者施用维持剂量(例如预定剂量)的抗IP-10抗体；(2)如果受试者不能保持响应(也称作“丧失响应”或“复发”)，将进行诊断性测定来测量受试者体内抗-IP10抗体的暴露水平(例如血液浓度)；(3)如果抗-IP10抗体的暴露水平低于阈值暴露水平，则递增受试者体内的剂量，从而在受试者体内保持药物响应。这可以保证在长期治疗期间，患者接受个人化剂量(例如仅保持必需的药物量)，这通过临床评估和目标药物浓度测量来确定。

1.抗-IP10抗体

在某些方面中，本发明涉及抗-IP10抗体的用途，其特征是具有特殊的功能特征或性质。例如，抗体特异结合人IP-10。此外，抗体可以和来自一种或多种非人灵长动物，例如猕猴，的IP-10交叉反应。优选地，抗体不与小鼠IP-10交叉反应。而且，尽管MIG和ITAC也是CXCR3受体的配体，但是本发明的抗体优选地不与人MIG或人ITAC交叉反应。进一步，本发明的抗体能够抑制IP-10的一种或多种功能活性。例如，在一个实施方案中，抗体抑制IP-10对CXCR3的结合。在另一个实施方案中，抗体抑制IP-10诱导的钙内流。在另外一个实施方案中，抗体抑制IP-10诱导的细胞迁移(趋化作用)。抗-IP10抗体的其它功能特征或性质在美国申请公布号2005/0191293中也有描述，其内容在此明确通过引用并入。

抗-IP10抗体的实例是单克隆抗体1D4,1E1,2G1,3C4,6A5,6A8,6B10,7C10,8F6,10A12和13C4，如美国申请公布号2005/0191293中所述，其内容在此明确通过引用并入。

在一个优选实施方案中，抗-IP10抗体包括：(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区。

在另一个优选实施方案中，抗-IP10抗体包括：(a)包含SEQ ID NO:3的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:4的重链可变区CDR2；(c)包含SEQID NO:5的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO:8的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO:9的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:10的轻链可变区CDR3。

如本文中定义的，本发明的抗-IP10抗体包括这样的抗体，其重链和轻链区的氨基酸序列与本文中所述的优选抗体的氨基酸序列同源，并且其中该抗体保持本发明抗-IP10抗体的期望功能性质。例如，抗-IP10抗体包括这样的抗体，其包含(a)重链可变区，其包含与选自SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少80%,90%,95%,98%或99%相同的氨基酸序列；(b)轻链可变区，其包含与选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少80%,90%,95%,98%或99%相同的氨基酸序列。在另一个实例中，抗-IP10抗体包括这样的抗体，其包含：(a)重链可变区CDR1，其包含与SEQ ID NO:3至少80%,90%,95%,98%或99%相同的氨基酸序列；(b)重链可变区CDR2，其包含与SEQ ID NO:4至少80%,90%,95%,98%或99%相同的氨基酸序列；(c)重链可变区CDR3，其包含与SEQ ID NO:5至少80%,90%,95%,98%或99%相同的氨基酸序列；(d)轻链可变区CDR1，其包含与SEQ ID NO:8至少80%,90%,95%,98%或99%相同的氨基酸序列；(e)轻链可变区CDR2，其包含与SEQ ID NO:9至少80%,90%,95%,98%或99%相同的氨基酸序列；和(f)轻链可变区CDR3，其包含与SEQ ID NO:10至少80%,90%,95%,98%或99%相同的氨基酸序列。任何同源抗体均特异性结合IP-10，并显示至少一种如下的功能性质：(i)该抗体抑制IP-10与CXCR3的结合；(ii)该抗体抑制IP-10诱导的钙内流；(iii)该抗体抑制IP-10诱导的细胞迁移；(iv)该抗体与猕猴IP-10交叉反应；(v)该抗体不与小鼠IP-10交叉反应；(vi)该抗体不与人MIG交叉反应；(vii)该抗体不与人ITAC交叉反应。同源的抗-IP10抗体在美国申请公布号2005/0191293中也有描述，将其内容明确通过引用并入本文。

如本文所定义的，本发明的抗-IP10抗体还包括与治疗部分缀合的抗-IP10抗体或其片段，治疗部分例如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素，。这些缀合物在本文中称作“免疫缀合物”。包含一种或多种细胞毒素的免疫缀合物被称作“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂包括任何对细胞有害(例如可杀死细胞)的作用剂。实例包括细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴化乙锭，伊米丁，丝裂霉素，依托泊苷，替尼泊苷，长春新碱，长春碱，秋水仙碱，多柔比星，柔红霉素，二羟基炭疽菌素二酮，米托蒽醌，普卡霉素，放线菌素D，1-去氢睾酮，糖皮质激素，丁卡因，利多卡因，普鲁卡因，普萘洛尔，及嘌呤霉素及其类似物或其同系物。治疗剂还包括，例如，抗代谢药（例如，氨甲喋呤，6-巯基嘌呤，6-硫代鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟脲嘧啶，氮烯咪胺），烷基化剂（例如，氮芥，thioepa苯丁酸氮芥，美法仑，卡莫司汀（BSNU）和洛莫司汀（CCNU），环磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，链脲霉素，丝裂霉素C，和顺二氯二氨铂（DDP）顺铂），蒽环类药物（例如，柔红霉素（原名道诺霉素）和多柔比星），抗生素（例如，更生霉素（原名放线菌素），博莱霉素，普卡霉素，和氨茴霉素（AMC）），和抗有丝分裂剂（例如，长春新碱和长春花碱）。其它可以和本发明抗体缀合的治疗性细胞毒素优选实例duocarmycins，卡里奇霉素(calichemamicin)，美登木素(maytansines)和auristatins，及其衍生物。抗体缀合物的一个实例是商品化的

Wyeth-Ayerst)。抗-IP10抗体的免疫缀合物在美国申请公布号2005/0191293中也有描述，将其内容明确通过引用并入本文。

如本文中所定义的，本发明的抗-IP10抗体还包括含有抗-IP10抗体或其片段的双特异性分子。抗-IP10抗体或其抗原结合部分可以被衍生化或连接于另一功能分子，例如另一肽或蛋白(例如另一抗体或某个受体的配体)，以产生能够结合至少两个不同结合位点或靶分子的双特异性分子。抗-IP10抗体或其片段可能实际上被衍生化或连接于多于一种其它功能分子，以产生能够结合多于两个不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子；这些多特异性分子也意图包含在本文中所使用的术语“双特异性分子”的范围内。为了产生双特异性分子，抗-IP10抗体可以功能性连接于(例如通过化学缀合、遗传融合、非共价缔合或其它)一种或多种其它结合分子，例如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，从而产生双特异性分子。双特异性抗-IP10抗体在美国申请公布号2005/0191293中也有描述，其内容明确通过引用并入本文。

2.治疗IP10相关疾病的方法

在某些方面中，本发明涉及使用抗-IP10抗体(包括免疫缀合物和双特异性分子)治疗受试者体内的IP10相关疾病。如本文中所使用的，术语“受试者”意图包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长动物、绵羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖动物和爬行动物。这些方法特别适合于治疗患有与IP-10表达异常有关的疾病的人类患者。当针对IP-10的抗体与另一种试剂一同施加时，两种药物可以顺次或同时施用。

术语“IP10相关疾病或病症”或“IP-10介导的疾病或病症”是指局部和/或系统性生理病症，其中IP10是导致该病症表现的主要介导者。IP10相关疾病的一个实例是炎症或自身免疫性疾病，包括但不仅限于，多发性硬化、类风湿性关节炎、炎性肠病（例如，溃疡性结肠炎、克罗恩病）、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、炎性皮肤疾病（例如，银屑病，扁平苔藓）、自身免疫性甲状腺疾病（例如格雷夫斯病(Graves’disease)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)）、干燥综合征、肺部炎症（例如，哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺结节病、淋巴细胞肺泡炎(lymphocytic alveolitis)）、移植排斥、脊髓损伤、脑损伤（例如，中风）、神经变性性疾病（例如，阿尔茨海默病、帕金森氏病）、龈炎、基因治疗诱导的炎症、血管生成疾病、炎性肾脏病（例如，IgA肾病、膜增生性肾小球肾炎、急进型肾小球肾炎）和动脉粥样硬化。IP10相关疾病在美国申请公布号2005/0191293中也有描述，将其内容明确通过引用并入本文。

3.药物组合物和施用途径

在某些方面中，本发明涉及一种组合物(例如药物组合物)，其含有与药物可接受载体配制在一起的一种或一组抗-IP10单克隆抗体或其抗原结合部分。这些组合物可以包含一种或一组(例如两种或更多种不同的)本发明抗体或免疫缀合物或双特异性分子。例如，药物组合物可以包含与靶抗原上的不同表位结合，或者具有互补的活性的一组抗体(或免疫缀合物或双特异性分子)。任选地，本发明提供了组合疗法，该组合疗法是通过使用包含抗-IP10抗体和其它作用剂的药物组合物实现的。例如，该组合疗法可以包含抗-IP10抗体和至少一种其它抗炎剂或免疫抑制剂。可以在组合疗法中使用的治疗剂的实例在美国申请公布号2005/0191293中有更详细的描述，将其内容明确通过引用并入本文。

如本文中所使用的，“药物可接受的载体”包括任何和全部生理相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂、及类似物。优选地，载体适合于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。根据施用途径，活性化合物，即抗体、免疫缀合物或双特异性分子，可以被包被在某种材料中，以保护该化合物免于受到可能使化合物失活的酸和其它自然条件的作用。药物组合物可以包含一种或多种药物可接受的盐。药物组合物的其它成分在美国申请公布号2005/0191293中有更详细的描述，将其内容明确通过引用并入本文。

调整剂量方案以提供最佳的期望响应(例如治疗响应)。例如，可以给予单次推注(bolus)，随时间推移给予数个细分的剂量，或者可以根据治疗状况的危急程度成比例地减少或增加剂量。特别有利的是，将肠胃外组合物配制成剂量单位的形式，以方便施用和使剂量均一。如本文中所使用的，剂量单位形式是指物理上离散的单位，这些单位被调整为供要治疗的受试者使用的单元(unitary)剂量；每个单位含有据计算可以产生期望的治疗效果的预定量的抗-IP10抗体，以及与之一起的所需的药物载体。剂量单位形式的规格可取决于并依赖于(a)抗-IP10抗体的独特特征以及希望获得特定治疗效果，和(b)为治疗个体中的敏感性而配合这样的抗-IP10抗体的技术的内在限制。

为了抗-IP10抗体的施用，剂量范围是大约1-50mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg,3mg/kg,5mg/kg,10mg/kg,15mg/kg,20mg/kg,25mg/kg,30mg/kg,35mg/kg,40mg/kg,45mg/kg或50mg/kg体重。一个治疗方案的实例采用每天施用1次，每周3次，每周2次，每周1次，每2周1次，每3周1次，每4周1次，每月1次，每3个月1次，或者每3-6个月1次。在一个实例中，抗-IP10抗体的剂量方案包括通过静脉内给药1mg/kg体重或3mg/kg体重，抗体以如下的剂量时间表给药：(i)每4周1次，共6次，然后每3个月1次；(ii)每3周1次；(iii)3mg/kg体重1次，随后每3周给予1mg/kg体重1次。

在一个具体实施方案中，抗-IP10抗体在诱导期通过静脉内输注施用，在维持期通过皮下注射施用。施用频率可以从每天1次到每月1次。如果受试者在维持期不能保持响应(也称作“丧失响应”或“复发”)，则可以使用诊断测定，测量受试者体内抗-IP10抗体的暴露水平(例如血液水平)；(3)如果抗-IP10抗体的暴露水平低于阈值暴露水平，则递增受试者体内的剂量。任选地，可以通过增加施用频率(例如将频率从每周1次增加到每周2次)递增受试者体内的剂量。

在一些实施方案中，将两种或多种具有不同结合特异性的单克隆抗体同时施用，在这种情况下，每种抗体的施用剂量处于标明的范围内。抗-IP10抗体通常多次施加。单次剂量之间的间隔可以是例如每周，每月，每3个月或每年。时间间隔还可以是不规律的，通过测量患者体内IP-10抗体的血液水平决定。在某些方面中，调节剂量使血浆浓度为大约1-600μg/ml，在一些方法中为大约25-300μg/ml。

或者，抗-IP10抗体可以作为持续释放形式施用，在这种情况下，所需的施用频率更低。剂量和频率随着抗体在患者体内的半衰期而改变。一般地，人抗体显示的半衰期最长，随后是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性还是治疗性而不同。在预防应用中，在较长的时期内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者在其余生中持续接受治疗。在治疗应用中，有时需要在相对短的时间间隔内接受相对高的剂量，直至疾病被减轻或消除，优选地直至患者的疾病症状显示部分或完全缓解。之后，患者可以按照预防方案给药。

抗-IP10抗体在药物组合物中的实际剂量水平可以加以变化，以便使活性成分的量可以有效地为特定患者、组合物、施用模式实现期望的治疗响应，而不会对患者有毒性。所选的剂量水平取决于各种药代动力学因素，包括所用抗-IP10抗体或其酯、盐或亚胺的活性，施用途径，施用时间，所用抗-IP10抗体的排泄速度，治疗的持续时间，与所用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料，被治疗患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康状况和先前用药历史，以及医学领域众所周知的其它因素。

本发明进一步通过如下的实施例加以例证，这些实施例不应视为进一步的限制。本专利说明书明确通过援引并入所有附图和所有参考文献、专利、公开的专利申请。

实施例1

MDX-1100在溃疡性结肠炎患者体内的暴露-响应分析及用于治疗溃疡性结肠炎患者的MDX-1100的目标暴露(Target Exposure)的确定

在一项II期、双盲、安慰剂对照、随机、多中心、多剂量的临床研究中，研究了MDX-1100在患有中度至严重溃疡性结肠炎(UC)患者体内诱发的临床响应，并与安慰剂进行比较。临床数据的暴露-响应(E-R)分析确定了安全对治疗UC患者而言安全且有效的MDX-1100的目标暴露。

方法

1.E-R分析中的患者群体

将109名来自7个国家40个站点的UC患者随机分组，接受安慰剂(N=54)或10mg/kg MDX-1100(N=55)，每隔一周静脉内输注1次，总共给予4个剂量(剂量在研究的第1、15、29和43天施用)。

本研究遵循由国际协调会议制定的良好临床试验规范(Good ClinicalPractice)，并遵循欧盟指南(European Union Directive)2001/20/EC和美国联邦法规集第21编第5部分(United States Code of Federal Regulations,Title21,Part50(21CFR50))中的伦理学原则，以及源自《赫尔辛基宣言》的伦理学原则。在本研究开始之前，本研究方案、修正案和受试者告知同意得到了临床审查委员会(IRB)/独立伦理委员会(IEC)的批准。在本研究开始之前，研究者为每位受试者提供了IRB/IEC的书面知情同意书的书面批准/赞成意见和任何其它相关信息。在参与研究之前，从每位受试者，或者在不能获得受试者授予的知情同意书的情况下，从受试者的法律上可以接受的代表获得了自由授予的书面知情同意书，包括为确认受试者适合于本研究进行的任何筛选程序的知情同意书。

所有患者都具有活动UC，活动UC定义为Mayo得分(Mayo score)6-10，且根据内窥镜检查从中度到严重的活跃疾病(Mayo内窥镜检查亚得分≥2)。所有患者均在接受稳定剂量的5-氨基水杨酸(5-ASA)、皮质类固醇、咪唑硫嘌呤(AZA)和/或6-巯嘌呤(6-MP)。

这109位患者被定义为意向性治疗(intent-to-treat)(ITT)群体，并且是用于评估效力量度的主要群体。这109位患者中，有2位患者(均被指派到安慰剂组)经过了随机化但未接受治疗。因此，将其余107位患者被定义为安全性群体，其中包括所有接受过至少1次完全或部分剂量安慰剂(N=52)或MDX-1100(N=55)的患者。表1和2总结了患者处置方式和人口统计情况。

表1

患者处置(ITT群体)

表2

患者人口统计(ITT群体)

2.MDX-1100在UC患者体内的药代动力学分析

在研究的第1、15、29和43以及在研究的第57天，在给予每次剂量之前至多60分钟从每位患者获取用于药代动力学评估MDX-1100的血清样品。MDX-1100的血清浓度用已经确认的ELISA测定方法进行测量。将MDX-1100在研究第57天的血清波谷浓度推导为每位接受MDX-1100治疗的患者的稳态波谷浓度(Cminss)。

3.效力和安全性量度的E-R分析以及对MDX-1100的目标暴露的确定

在E-R分析中评估的暴露量度是研究第57天时MDX-1100的Cminss。在E-R分析中评估的效力量度是：(1)临床响应，其定义为在研究第57天时患者的总Mayo得分从基线(筛选)降低至少3分并且降低至少30%，同时直肠出血的亚得分降低至少1分或者直肠出血的绝对亚得分为0或1(临床响应率的定义为，每个治疗组中具有临床响应的患者的比例)；(2)临床缓解，其定义为在研究第57天时总Mayo得分≤2分，各项单独亚得分无超过1分者，并且患者粪便中没有血液(临床缓解率的定义为，每个治疗组中具有临床缓解的患者比例)；和(3)黏膜愈合，其定义为在研究第57天时患者的内窥镜检查亚得分为0或1(黏膜愈合率的定义为，每个治疗组中具有黏膜愈合的患者比例)。在E-R分析中评估的安全性量度是死亡、严重不良事件(SAE)、治疗相关SAE、由于SAE导致的中止、不良事件(AE)、治疗相关的AE、和由于AE导致的中止。

对于E-R分析，将所有在研究第57天具有MDX-1100Cminss值的ITT患者根据Cminss值分层为一组三分位：(1)低(26.4-78.6μg/mL)；(2)中(79.2-105μg/mL)；和高(108-235μg/mL)。为每个Cminss三分位计算临床响应率、临床缓解率和黏膜愈合率，并用Fisher确切检验法提供95%CI。使用Logistic回归单独研究Cminss与每个效力量度值之间的暴露-响应关系。计算与暴露加倍相关的比值比(Odds ratio)及其95%CI。并报告P值。对所有接受安慰剂的患者、所有接受MDX-1100的患者、和所有接受MDX-1100并且其Cminss处于最高三分位(≥108μg/mL)的患者的安全性量度进行了列表。

4.MDX-1100用于治疗UC患者的目标暴露的确定

选择对MDX-1100的最佳目标暴露，以使得其暴露小于目标暴露的患者与其暴露大于目标暴露的患者之间在总体效力上得到最大程度的区分。根据如下的算法确定MDX-1100的目标暴露——对于任何给定的暴露c，进行Fisher确切检验以确定在暴露小于c的患者与暴露大于c的患者之间临床响应率、临床缓解率和黏膜愈合率是否存在差异。选择具有最小相应p值的暴露作为目标暴露。

结果

1.MDX-1100在UC患者体内的药代动力学

报告的所有ELISA测定的人血清中MDX-1100的浓度都是在分析批(analytical runs)中使用合适的校准曲线和满足预定接受标准的质控样品生成的，并且在分析时遵循可适用的现行SOP。表3显示了测定性能的总结。

表3

人血清中MDX-1100的测定和性能的总结

a分析QC的最大值.

4次剂量后，MDX-1100的波谷浓度(Cmin)从第15天的42.2μg/mL增加到第57天的91.3μg/mL(表4)。研究第57天的Cmin视为Cminss，其依据是：MDX-1100在人体内的半衰期为大约8天，以及每两周1次(Q2week)的剂量方案。MDX-1100Cminss的变异系数(CV%)在研究第57天为44.2%，并且与其它的生物学治疗相似(见例如Fasanmade AA等,Int J Clin PharmacolTher.2010,48(5):297-308;Nestorov I,Semin Arthritis Rheum.2005Apr;34(5Suppl1):12-8.综述)。

表4

MDX-1100之Cmin(μg/mL)的统计总结

^a在施加输注剂量之前在先前剂量(predose)下采集的波谷浓度

2.临床响应率、临床缓解率、黏膜愈合率与MDX-1100Cminss的响应-暴露关系

E-R分析证明，MDX-1100的较高Cminss与临床响应率、临床缓解率、和黏膜愈合率的显著增加相关联(图1)。MDX-1100的Cminss处于最高三分位亚组的患者(Cminss:108-235μg/mL)与接收安慰剂治疗或MDX-1100Cminss处于较低的两个三分位的患者相比，获得了最高的临床响应率、临床缓解率和黏膜愈合率。MDX-1100Cminss达到最高三分位亚组的患者和接受安慰剂治疗的患者获得的临床响应率、临床缓解率和黏膜愈合率分别为87.5%对37%,43.8%对18.5%,和68.8%对35.2%。MDX-1100Cminss处于最高三分位亚组的患者与安慰剂治疗患者或者MDX-1100Cminss处于较低的两个三分位的患者相比，Mayo得分也得到了显著改善：Mayo得分从基线平均降低4.7，相比于2.8。

临床响应率、临床缓解率和黏膜愈合率的Logistic回归分析也证明，当UC患者用MDX-1100治疗时，如果他们实现了MDX-1100Cminss增加，就可以实现更高的临床响应率、临床缓解率和黏膜愈合率。临床响应率、临床缓解率和黏膜愈合率的比值比分别为3.77(P=0.017),2.85(P=0.071),和3.08(P=0.03)。换言之，若患者获得的MDX-1100Cminss提高到2倍，患者实现临床响应、临床缓解和黏膜愈合的几率会分别增加到3.77,2.85,和3.08倍(图2-4)。

3.暴露-安全性的关系

用MDX-1100治疗的并且Cminss处于最高三分位亚组的患者的安全性概貌(safety profile)与整个MDX-1100安全性群体相当(表5)。MDX-1100Cminss处于最高三分位亚组的16位患者中有6位(37.5%)经历了至少一次AE，而在整个MDX-1100安全性群体的55位患者中有22位(40%)。这16位经历了AE的患者中只有2位(12.5%)被认为与研究治疗有关，相比之下，在整个MDX-1100安全性群体的55位患者中有11位(20.0%)。MDX-1100Cminss处于最高三分位亚组并经历至少一次AE的患者数目也与安慰剂组相当(分别为6/16[37.5%]和17/52[32.7%])。

在16位MDX-1100Cminss处于最高三分位亚组的患者中没有SAE报告，相比之下，整个MDX-1100安全性群体中则有4位患者(7.3%)报告了SAE。整个MDX-1100安全性群体中由于AE而中止的2位患者并不在Cminss最高三分位亚组中。此外，全部MDX-1100安全性群体中被报告发生感染的患者(55位患者中有7位，12.7%)均不处于Cminss最高三分位亚组中。

总之，根据本研究中有限数目的患者，未见与MDX-1100的Cminss关联的AE增加。

表5

不良事件概要^a(Cminss亚组)

^aAE的定义为在治疗期间或者在最后一次治疗剂量后70天内出现症状迹象，

包括没有预先治疗或者比预先治疗状态更差以及无论时间点的任何治疗相关AE。

^bSAE包括到研究药物后70天内研究人员认为严重的所有第3级(重度)以及更高级的事件(或严重度缺失的事件)。等级水平基于USA NCI AE分类指导。

^c与药物研究可能、很可能或一定相关(相关性缺失推定为相关)

4.用于治疗UC患者的MDX-1100的目标暴露

使用全部三种效力量度(临床响应率、临床缓解率和黏膜愈合率)来确定对MDX-1100的目标暴露。根据图5的结果，在大约100μg/mL的Cminss下，-log10转化的p-值达到最大，表明相应的p-值最小，因此其暴露大于该目标暴露的患者与其暴露小于该目标暴露的患者的区分效力最大。暴露-安全性分析提示MDX-1100是安全的，并且在本研究的Cminss处于最高三分位(108-235μg/mL)的UC患者中被良好耐受。因此将100μg/mL的Cminss值确定为MDX-1100的目标暴露，其对于用MDX-1100治疗UC患者而言是安全而有效的。

5.免疫原性分析

在本研究中，在第1、29、57和85天(给予末次剂量研究药物后42天)使用已确认有效的电化学发光(ECL)测定方法对来自安全性群体的样品进行MDX-1100的免疫原性评估。该ECL测定在任何患者中均未检测到针对MDX-1100的人抗人抗体。

实施例2

小鼠抗-MDX-1100独特型抗体的产生

材料和方法

1.免疫原

MDX-1100，在本文中也称作6A5，是一种人抗-IP10抗体(见例如美国申请公布号2005/0191293)。用MDX-1100(10mg/ml)制备Fab。用MDX-1100的Fab片段(2.92mg/ml)作为产生抗体的免疫原。

2.小鼠和免疫程序

使用下面的小鼠产生少数杂交瘤，例如10C8,6C9,2F5,和23H10。下面的表6总结了杂交瘤和用于产生它们的相应小鼠。

表6

杂交瘤及在其生产中所用的相应小鼠的列表

杂交瘤	小鼠ID	小鼠性别	小鼠基因型
				10C8	135878	雄性	BALB/C
6C9	135879	雌性	BALB/C
				2F5	222587	雌性	BALB/C
23H10	222587	雌性	BALB/C

用大约25-30μg MDX-1100的Fab通过腹腔、皮下和足垫注射免疫小鼠。这些免疫在不同的5天进行。随后，收集脾脏和淋巴结。

3.杂交瘤产生

使用Sp2/0骨髓瘤细胞系用于融合。将细胞在培养中保持1个月，每周传代2次。使用P388D1(ATCC,TIB-63FL)细胞的上清作为杂交瘤的条件化培养基。简而言之，将细胞培育并扩展到200mL。静止培养大约7天。将用完的上清离心并过滤通过一个0.2μm无菌滤器。将该细胞系传代1个月，然后解冻一瓶新的。

使用含有10%FBS

目录号SH30071.03;批号ASL31024)的DMEM(Gibco#12382-024)培养骨髓瘤融合伴侣(partner)和P388D1细胞。向杂交瘤生长培养基添加额外的培养基补充物，其包含5%Origen–杂交瘤克隆因子(Hybridoma Cloning Factor)

cat#210001),15%P388D1条件化培养基,β-巯基乙醇(Gibco cat#1019091),Hepes

#25060037)和HAT(Sigma,H0262;1.0x10^-4M次黄嘌呤,4.0x10^-7M氨基蝶呤,1.6x10^-5M胸苷),或HT(Sigma,H0137;1.0x10^-4M次黄嘌呤,1.6x10^-5M胸苷)。

下面的表7列出了从三只小鼠脾脏和淋巴结产生的用于融合的活细胞。对脾细胞进行电极融合。将所得的杂交瘤以200μl/孔接种到96孔

组织培养物处理的平板中。

表7

从小鼠脾脏和淋巴结产生的融合物列表

融合ID	小鼠ID	总脾细胞和淋巴细胞
			925	135878	1.8e8
926	135879	2.1e8
			2431	222587	2.1e8

结果

1.融合筛选、亚克隆和扩展

对融合物进行初始筛选，首先筛选直接结合MDX11006A5(完整6A5,6A5-生物素,或6A5Fab)的抗体；随后是探寻与其它抗-IP10人抗体(例如1D4和10A12)以及人IgG集合相比的特异性结合。

图6A显示，当通过ELISA筛选杂交瘤上清寻找MDX11006A5特异性抗体时，克隆10C8和6C9呈阳性。图6B显示，克隆10C8和6C9特异性结合6A5。图7显示，克隆2F5和23H10特异性结合6A5。

进一步，对亚克隆10C8,6C9,2F5,和23H10进行相似的分析，发现与6A5特异性结合(图8-9)。

2.抗体选择

抗体选择是基于：与MDX11006A5的直接结合，相比于无关抗体1D4和10A12及人IgG池特异针对6A5，以及抗独特型抗体竞争6A5-IP10的相互作用。在ELISA竞争性结合测定中，将1μg/ml,50μl羊抗-小鼠IgGγ包被在平板上。添加预先混合的6A5和IP10(抗原:抗体比=5:1)或全部仅有6A5。并添加1μg/ml,50μl稀释的抗独特型抗体。然后添加山羊抗-人IgGFcγ-HRP进行检测。

图10显示，在竞争性结合测定中，克隆10C8与IP10竞争。图11显示，在竞争性结合测定中，克隆2F5和23H10不与IP10竞争。

实施例3

通过Meso Scale Discovery(MSD)电化学发光免疫测定定量测定人血清中的

MDX-1100

开发了一种Meso Scale Discovery(MSD)电化学发光免疫测定系统，用于定量人血清中的MDX-1100。MSD方法采用一种技术，其中将生物素化的抗-MDX-1100小鼠单克隆抗体(克隆10C8)包被到链亲和素包被的96孔板上，用于捕获2%人血清中的MDX-1100。然后，使用磺基(sulfo)-标签标记的抗-MDX-1100小鼠单克隆抗体(克隆23H10)检测被捕获的MDX-1100。标准曲线在2%人血清中制备，范围从5ng/mL到300ng/mL(在100%人血清中为250-15,000ng/mL)，并拟合4参数logistic回归模型，以250ng/mL作为定位点(anchor point)。用于QC的测定内精密度在7.2%以内，测定间精密度在10.9%以内。参考标准的测定内精密度在6.7%以内，测定间精密度在6.4%以内。QC准确度处于标称数值±15.6%内。参考标准准确度为标称数值±5.4%。在定量下限500ng/mL时，10份溃疡性结肠炎患者血清样品中的10份的预测浓度与标称数值的偏差在±6.7%之内。测定性能不受分别高达100ng/mL和5000ng/mL的预温育IP10和硫酸乙酰肝素的影响，但是在HQC、MOC和LQC中，用1000ng/mLIP-10和50000ng/mL硫酸乙酰肝素可以观察到35-40%的干扰。MDX-1100和isoAsp-MDX-1100的回收没有差异。

材料和方法

A.溶液和试剂的制备

1.测定缓冲液(1%BSA和0.05%吐温-20，溶于DPBS中)

将50mL10%BSA溶液和2.5mL10%吐温-20溶液转移到500mL DPBS中。保存在2-8℃。制备后3个月内使用。

2.封闭缓冲液(5%BSA和0.05%吐温-20，溶于DPBS中):

将250mL10%BSA溶液和2.5mL10%吐温-20溶液添加到250mLDPBS中。保存在2-8℃。制备后3个月内使用。

3.PBS清洗缓冲液(PBS干粉包，pH7.4±0.2，含有0.05%v/v吐温-20)

将1个包装的PBS的内容物溶解在1升dH2O中，将溶液保存于室温。制备后1个月内使用。

4.测定缓冲液/2%人血清

将60μL人血清添加到2940μL测定缓冲液中。该溶液在使用当天制备。

5.生物素化小鼠抗独特型IP106A5MAb10C8

分成等份保存在-70℃。在使用之前，将每一个等份在室温下解冻。制备在测定缓冲液中最终的1μg/mL，并将其用于包被测定用平板。该试剂的每一个新批必须对先前一批滴定，并在测定中以一定的稀释度使用，使所得的结果与用先前批次观察到的结果相当。

6.磺基-标签标记的小鼠抗独特型IP106A5MAb23H10

将试剂分成等份并保存在-70℃。在测定缓冲液中制备终浓度为25ng/mL的磺基-标签标记的小鼠抗独特型IP106A5MAb23H10溶液用于测定。该试剂的每一个新批必须对先前一批滴定，并在测定中以一定的稀释度使用，使所得的结果与用先前一批观察到的结果相当。

7.MSD读取缓冲液T(2X)

将试剂保存在室温。通过在使用前用5mL dIH₂O稀释5mL MSD读取缓冲液T(4X)制备最终的2X溶液。

B.标准物的制备

1.MDX-1100工作溶液的制备

将20μL0.99mg/mL的储液添加到178μL人血清中，产生含有100μg/mL的溶液。进一步在测定缓冲液中稀释50倍，产生2%人血清中的2000ng/mL溶液(工作溶液1)，将该2000ng/mL溶液进一步在2%人血清中稀释20倍，成为100ng/mL(工作溶液2)。该工作溶液在制备当天使用。舍弃多余的溶液。

2.在2%人血清中制备校准标准曲线

标准曲线在测定缓冲液/2%人血清中制备，如下所述。

注意：体积足以用于一个平板。根据需要准备成比例的体积。

表8

校准标准曲线制备

*所列出的MDX-1100的浓度是在100%人血清中的浓度

3.质量控制样品的制备

(1)在100%人血清中制备MDX-1100QC样品

将20μL0.99mg/mL MDX-1100储液用970μL人血清稀释，产生一个含有20000ng/mL的溶液。用人血清适当稀释该20000ng/mL溶液，以产生15000,10000,6000,1000和500ng/mL(ULOQ,高,中,低和LLOQ)的QC样品。将QC样品分成25μL的等份保存在-70℃。

表9

质量控制样品制备

*所列出的MDX-1100的浓度是在100%人血清中的浓度

(2)2%人血清中的QC样品(高、中、低、LLOQ和稀释)的制备

为了将QC样品制备到测定的范围以及制备到测定所需的最小稀释度，通过添加10μL如前文制备的100%人血清QC样品到490μL测定缓冲液中来将每个QC样品1:50稀释，从而提供含有溶于2%人血清中的15000,10000,6000,1000和500ng/mL QC样品。这些稀释物在分析当天制备。

4.测定程序

除非具体指出，否则所有步骤均在速度为200rpm的22℃摇床上执行。除非特别指出，平板在温育时盖有盖子。

1)在22℃摇床上，用封闭缓冲液(在DPBS中制备的5%BSA和0.05%吐温-20)封闭包被有链亲和素的96孔MSD平板至少30min。

2)向平板添加50μL生物素化的10C8(在测定缓冲液中1μg/mL)。平板用平板盖盖好，并在22℃摇床上温育60±30min。

3)用300μL PBST清洗平板3次。

4)向平板添加50μL在测定缓冲液/2%人血清缓冲液中制备的标准物、QC和样品。将平板在22℃摇床上温育120±30min。

5)平板用300μL PBST清洗3次。

6)向平板添加50μL磺基-标签23H10(在测定缓冲液中制备成25ng/mL)。将平板在摇床上温育60±30min。

7)将平板用300μL PBST清洗3次。

8)添加150μL MSD读出缓冲液T(在dIH2O中制备成2X)。在10分钟内，将平板在MSD Sector Imager2400上进行读数。

结果

1.标准曲线范围

在每个分析运行批次中，重复两次测定在2%人血清中制备的250-15000ng/mL MDX-1100的11点校准标准曲线。250ng/mL的标准是定位点，不进行接受标准检查(数据未显示)。

2.准确度和精密度

方法的准确度通过计算预测浓度与其标称数值的偏离进行评估。根据三个分析参考标准和QC的准确度和精密度信息使用SAS软件中的单向ANOVA获得，并列于表10和11。QC的测定内精密度在7.2%之内，测定间精密度在10.9%之内。参考标准的测定内精密度在6.7%之内，测定间精密度在6.4%之内。QC精密度处于标称数值±15.6%内。参考标准精密度处于标称数值±5.4%内。

表10

MDX-1100的QC准确度和精密度

100%人血清中的浓度ng/mL

2.选择性和基质干扰(matrix interference)

用10份单独的溃疡性结肠炎患者血清评估方法的选择性和基质干扰。每个基质运行批次用或不用500ng/mL(LLOQ)加标，在测定中进行测试。所有未加标的基质运行批次的定量均低于定量水平，而10个加标的基质运行批次的反算浓度均在LLQC的6.7%之内。表12显示，在本测定中没有观察到基质干扰。

3.人血清中的稀释的线性

通过首先用测定缓冲液50倍稀释2.5mg/mL QC样品，然后用测定缓冲液/2%人血清进行10倍系列稀释，对MDX-1100的稀释线性进行评估。这些单独的稀释用标准曲线和QC样品进行分析。结果总结于表13，表明分别稀释的测试样品的预测浓度在标称数值±10%之内。这些数据显示，研究样品可以在测定缓冲液/2%人血清中稀释至少50,000倍，而不会对测定的准确度和精密度有不良影响。

表13

稀释MDX-1100的线性

4.特异性

将IP10和硫酸乙酰肝素以如下浓度组合，并用于检测对低、中和高QC的定量的潜在干扰：(a)IP10为0,10,100,1000ng/ml;和(b)硫酸乙酰肝素为0,500,5000,50000ng/ml。

将每个潜在的干扰性试剂组合在基质空白、HQC、MQC和LQC中进行测试。样品在室温下温育1小时。结果如表14所示，显示当用50000ng/mL硫酸乙酰肝素+1000ng/mL IP10进行加标时，所有QC与未处理相比显示超过25%的差异；当用5000ng/mL硫酸乙酰肝素+100ng/mL IP10以及500ng/mL硫酸乙酰肝素+10ng/mL IP10加标时，所有QC与未加标的QC相比，显示出加标与未加标之间差异的百分比小于14.5%。

5.IsoAsp-MDX-1100回收率(recovery)

因为MDX-1100的异构体化(isomerization)以每年6%的速度发生，所以通过在10000,5000,2500ng/mL水平比较新鲜解冻的MDX-1100与纯化的isoAsp-MDX-1100来评估测定的回收率。结果如表15所示，显示两种形式的药物在3个水平下的回收率没有差异。

结论是，开发了一种用于定量人血清中MDX-1100的特异、精密并且准确的MSD免疫测定方法，其标准曲线浓度在净人血清中为250ng/mL-15,000ng/mL。

表15

MDX-1100和IsoAsp-MDX-1100的加标回收率比较

实施例4

用于定量测定正常人血清中MDX-1100的酶联免疫吸附测定(ELISA)

方法描述

本酶联免疫吸附测定(ELISA)设计用于检测人血清中的MDX-1100。用在测定缓冲液中制备的浓度为1.5μg/mL的生物素化抗-MDX-1100小鼠单克隆抗体(克隆10C8)包被已经包被有中性亲和素的平板。校准物、对照和样品用测定缓冲液稀释至测定MRD(1:1000)，并在平板中温育以捕获MDX-1100。然后使用在测定缓冲液中制备的浓度为0.25μg/mL的HRP-标记的抗-MDX-1100小鼠单克隆抗体(克隆23H10)检测被捕获的MDX-1100。添加TMB作为HRP底物。在添加终止溶液后，平板在Spectramax Plus酶标仪上进行读取，测得的光密度(OD)与平板上MDX-1100的浓度成正比。

分析物浓度通过从标准曲线插值确定，标准曲线是使用5参数logistic回归模型，权重因子为1/响应2拟合的。所需最小样品体积为10.0μL。MRD为1:1000。校准范围是1.25-320μg/mL，定量范围是2.5μg/mL-320μg/mL。样品保存在大约-80℃。

线性和校准标准物

该验证研究使用范围在1.25-320μg/mL的10个校准标准物。用5-参数logistic方程，权重因子为1/响应2拟合标准曲线。从13个从可接受运行批次的标准曲线的平均值计算得出吻合度为0.9972。

精密度和准确度

通过分析浓度范围从定量下限(LLOQ)到定量上限(ULOQ)的质量控制(QC)对精密度和准确度进行评估。分析了如下的QC水平：LLOQ(QC4=2.50μg/mL),备份(back-up)LLOQ(QC5;5.00μg/mL),低QC(QC1;7.50μg/mL),中QC(QC2;120μg/mL),高QC(QC3;200μg/mL),备份(back-up)ULOQ(QC6;240μg/mL)和ULOQ(QC7;320μg/mL)。精密度表达为每个池(pool)的变异百分比系数(PCV)。准确度表达为相对于理论值的百分比差异(PDT)。这些公式如下文所示(见公式)。在评估数据的可接受性之前将所有精密度和准确度数值均约至最近的整数。

百分比变异系数(PCV)

PCV=(标准偏差/平均值)x100

相对于理论值的百分比差异(PDT)

PDT=[100x((平均计算浓度-理论浓度)/理论浓度]

百分比差异

百分比差异=100x[|数值1-数值2|/((数值1+数值2)/2)]

正常人血清的测定内精密度和准确度

在单独实验运行批次中对每个QC水平(QC1-7)的6组重复(12个孔)进行分析，以确定每个QC的测定内精密度和准确度。为了满足精密度的接受标准，QC1-3和5-7的测定内样品预期具有的总PCV值≤20%，QC4预期的总PCV值≤25%。为了满足准确的接受标准，QC1-3和QC5-7的测定内样品预期具有的总PDT值在±20%之内，QC4预期具有的总PDT值在±25%之内。

测定内精密度和准确度分析在1JHX2(QCs1-3),2JHX2(QCs4-6)和6JHX2(QC7)等运行批次中执行。所有QC水平下的测定内样品的PCV值均可接受，范围从QC4(LLOQ)的3%到QC5(备份LLOQ)的14%。所有QC水平下的测定内精密度和准确度样品的PDT值也在接受标准之内，范围从-8%(QC7;ULOQ)到13%(QC1和QC2)。这些数据在表16中提供。

正常人血清的测定间精密度和准确度

使用来自7个可接受运行批次(1-6JHX2和8JHX2)的数据，每批含有每一QC水平(QC1-7)的两个重复，来确定测定间精密度和准确度。为了满足精密度标准，QC1-3和5-7的测定间样品预期具有的总PCR值≤20%，QC4预期的总PCV值≤25%。所有QC水平下的PCV值均可接受，范围从9%(QC2和QC3)到14%(QC5)。为了满足准确的接受标准，QC1-3和QC5-7的测定间样品预期具有的总PDT值在±20%之内，QC4预期的PDT值在±25%之内。所有QC水平下的PDT值均是可接受的，范围从-3%(QC1和QC7)到2%(QC2和QC3)。这些测定间精密度和准确度数据在表17中提供。表18提供了使用确认校准物和QC对QC1-7进行的所有验证运行批次的全部数据列表。

表16.测试内精密度和准确度数据

图注：

NRR 无记录结果

PCV 变异的百分比系数

PDT 与理论值的百分比差异

表17:可接受的验证运行批次的QC测试间数据

图注：

PCV 变异的百分比系数

PDT 与理论值的百分比差异

表18:所有使用验证QC的运行批次的测试间数据

图注：

PDT 变异的百分比系数

PCV 与理论值的百分比差异

NRR 无记录结果

测定灵敏度

通过评估QC4(LLOQ)的准确度和精密度来评价测定的灵敏度。预期QC4的PCV值小于25%且PDT值在±25%之内。QC4的两个重复置于1JHX2-8JHX2运行批次中，其中一个运行批次(7JHX2)由于中QC(QC2;120μg/mL)的QC定量不可接受而被排除。在7个可接受的运行批次中，QC4的平均PCV值为13%，平均PDT值为0%(表17)，良好地位于可接受限内。这些数据表明，ICD426的测定灵敏度在LLOQ是可以接受的。

稀释线性和弯勾效应(Hook Effect)

对初始高于标准曲线上限的样品进行稀释的能力的评价通过对从高于曲线的QC池制备的一系列稀释物(QC8)进行评估。通过将MDX-1100储液(10,200μg/mL)在收集的正常人血清中以1:20稀释至510μg/mL的浓度来制备QC8。注意，根据PPD的标准操作规程(SOP No.:LP-PAL-1013)，该浓度是能够为QC8保持最少95%血清的条件下可实现的最高浓度。制备QC8的稀释物，使终浓度从高于、穿过、直至低于定量范围，包括：510μg/mL,408μg/ml(Dil1.25),136μg/mL(Dil3.75),45.3μg/mL(Dil11.25),15.1μg/mL(Dil33.75),5.04μg/mL(Dil101.25)和1.68μg/mL(Dil303.75)。在运行批次8JHX2中对每个稀释水平的两个重复进行了分析(n=2,4孔)。

稀释因子为Dil3.75-Dil101.25(处于定量范围内)的样品的PDT值范围从-16%至-2%，满足PDT在±20%范围内的接受标准。稀释分析物浓度高于(Dil1and Dil1.25)或低于(Dil303.75)定量范围的样品的响应分别>ULOQ或<LLOQ。因此，本测定中的稀释线性被认为是可以接受的。

通过对QC8(510μg/mL)和QC8Dil1.25样品(408μg/mL)的响应与CAL10(320μg/mL;ULOQ)的响应进行比较，检查了前区(prozone)或弯勾效应(Hook Effect)。每个稀释的两个重复的O.D.值均大于CAL10的记录值，但未通过将校准曲线外推至UCOQ之外将其定量。因此可见，对于超过320μg/mL的ULOQ的MDX-1100浓度，包括510μg/mL，没有弯钩效应。

选择性(基质效应)

选择性是分析方法在生物基质中其它组分的存在下区分和定量感兴趣的分析物的能力。在正常人血清和溃疡性结肠炎和克罗恩病两种疾病状态下，对选择性进行了测试。对于每个正常和疾病状态群体，通过分析来自至少10个独立供体(5位男性和5位女性)的血清，在低QC(QC1,7.5μg/mL)和空白水平对选择性进行评估。对每个加标和未加标样品的一个重复进行分析(n=1,2孔)。对于每个供体群体(正常、溃疡性结肠炎和克罗恩病)，预期有80%的低加标会满足标准(定量值处于理论值上下20%的范围内)，而未处理基质运行批次的定量会低于LLOQ。

在运行批次3JHX2中，在正常人血清中测试了选择性。所有空白正常血清选择性样品(SP1-10)的筛选均低于LLOQ。当用低QC水平(7.5μg/mL)加标时，所有10个强化(fortified)正常人血清样品(SPF1-10)的PDT值定量为±20%之内，范围从0%-20%。这些数据如表19A所示。

运行批次4JHX2对来自10位溃疡性结肠炎个体的血清进行选择性测试。所有空白溃疡性结肠炎血清样品(SP11-20)均显示低于LLOQ。当用低QC水平(7.5μg/mL)处理时，所有10个强化的(fortified)溃疡性结肠炎个体(SPF11-20)的PDT值定量为±20%之内，范围从-2%-18%。这些数据总结在表19B中。

在运行批次12JHX2中测试了在来自10位克罗恩病个体的血清中的选择性。所有空白克罗恩病血清样品(SP21-30)的定量均低于LLOQ。当用低QC水平(7.5μg/mL)加标时，所有10个强化(fortified)克罗恩病个体(SPF21-30)的PDT值定量为±20%之内，范围从-15%-6%。这些数据如表19C所示。

总之，在空白和低QC水平下，100%来自正常和疾病状态的选择性样品满足接受标准。所有这些选择性数据总结在表19中。

干扰(溶血)

通过分析在溶血血清(hemolyzed serum)中制备的空白和加标(低和高QC)样品，评估溶血对研究样品定量的影响。使用在正常人血清中新鲜制备的校准曲线，对10个显示低水平溶血(依供应商的规定，血红蛋白浓度大约为70mg/dL)的供体个体和10个显示高水平溶血(依供应商的规定，血红蛋白浓度大约为550mg/dL)的供体个体进行评估。从每个溶血样品制备空白、低QC和高QC样品的单个重复(n=1,2孔)，并进行分析。每个加标的溶血样品的溶血数据的PCV值预期<20%，且平均值的准确度预期在该池的理论值的±20%之内。空白样品的PCV预期小于20%，并且定量低于LLOQ。每个水平下，需要至少80%的溶血样品满足接受标准。

在显示低水平溶血的样品中的干扰

运行批次10JHX2对10个显示低水平溶血的单独样品进行了分析。10个单独样品(HS1-10)中有1个在空白水平下的重复PCV值为33%，不满足接受标准，尽管该样品的两次重复确定均定量低于CAL1(定位点)和LLOQ。其余9个空白个体的定量均低于LLOQ，PCV值小于或等于13%。所有10个以低QC水平加标的单个样品(HEMQC1-10)均具有可接受的PCV值，范围从0%到6%，和可接受的PDT值，范围从-18%到-1%。10个以高QC水平加标的个体(HEMQC11-20)中有1个未能以可接受的PDT(HEMQC12;PDT=-23%)定量。其余9个以高QC水平加标的个体具有可接受的PCV，范围从0%到5%，并具有可接受的PDT值，范围从-7%到16%。总之，显示低水平溶血的样品满足接受标准：空白(90%可接受)、低QC水平(100%可接受)和高QC水平(90%可接受)。这些数据总结于表20A。

在显示高水平溶血的样品中的干扰

在运行批次11JHX2中对10个显示高水平溶血的单独样品进行了分析。10个单独样品(HS101-110)中有1个在空白水平下分析的重复PCV值为24%，不满足接受标准，尽管该样品的两次重复确定均定量低于CAL1(定位点)和LLOQ。其余9个空白个体的定量均低于LLOQ，PCV值小于或等于16%。所有10个以低QC水平加标的单个样品(HEMQC101-110)均具有可接受的PCV值，范围从1%到6%，和可接受的PDT值，范围从-15%到8%。所有10个以高QC水平加标的单个样品(HEMQC111-120)均具有可接受的PCV值，范围从0%到6%，和可接受的PDT值，范围从-7%到12%。总之，在空白(90%可接受)、低QC水平(100%可接受)和高QC水平(100%可接受)，满足了对显示高水平溶血的样品的接受标准。这些数据如表20B所示。

基质中分析物的稳定性

2-8℃下的解冻基质稳定性

在2-8℃评估解冻基质中MDX-1100的稳定性，以确定样品在解冻状态下保持一段时间是否会不良影响分析物在正常人血清中的稳定性。解冻低QC和高QC的6个重复样品(n=6,12孔)，让它们在冷藏箱中保持大约24小时，然后在5JHX2中进行分析。为了使稳定性样品的数据被认为可以接受，重复样品测定的PCV预期不超过20%，每个水平平均值的准确度预期在理论浓度的20%之内。低稳定性QC和高稳定性QC的总体PCV分别为4%和5%。低QC和高QC的相对理论值的百分比差异分别为-11%和10%。这些数据表明，MDX-1100在2-8℃稳定大约24小时。

室温下的稳定性

为了确定室温下(实验台上)的稳定性，解冻低QC和高QC的6个重复样品(n=6,12孔)，让它们在室温下保持大约24小时，然后在6JHX2中进行分析。为了满足接受标准，稳定性样品的PCV应≤20%，并且定量于理论浓度的上下20%之内。低稳定性QC和高稳定性QC的总体PCV分别为9%和8%。低QC和高QC相对理论值的百分比差异分别为-12%和6%。这些数据表明，MDX-1100在室温下的解冻基质中稳定大约24小时。

冷冻-解冻稳定性

对冷冻-解冻稳定性的评估在将低QC和高QC循环5次后进行。每个循环的组成如下：使样品保持冷冻(对于第一个循环为至少24个小时，对于随后所有的循环为至少12个小时)，然后将样品保存在环境室温至少30分钟，但是不超过2小时。在9JHX2中对经循环的低QC和高QC的6个重复样品(n=6,12孔)进行了分析。为了满足接受标准，冷冻-解冻样品的预期PCV≤20%，并且定量在理论浓度的上下20%之内。低稳定性QC和高稳定性QC的总体PCV分别为4%和8%。低QC和高QC相对于理论值的百分比差异分别为-13%和-8%，因此证实了相对5个冷冻-解冻循环的稳定性。

在-20℃和-80℃的短期稳定性

为了证实使用冷冻校准标准物的有效性，演示了MDX-1100在冷冻人血清中在涵盖验证过程中使用的最老的校准标准物或QC池的一段时间(15天)内的稳定性。为了检验这一点，将在-20℃和-80℃下冷冻15天的LQC和HQC与新鲜制备的校准曲线和接受QC进行比较。在14JHX2中对每个温度下的LQC和HQC样品的6个重复样(n=6,12孔)进行了测定。为了满足接受标准，保存在两个温度下的短期稳定性样品的PCV值必须≤20%，且PDT值必须在±20%内。-80℃下的低和高短期稳定性样品的总体PCV分别为16%和5%，PDT值分别为0%和13%。对于-20℃的短期稳定性样品，总体PCV值分别为7%和4%，PDT值分别为-6%和4%。这些数据表明，在-80℃或-20℃保存大约15天时，MDX-1100在正常人血清中是稳定的。

ICD426与ICD275的交叉验证

为了评估方法变化并且确定使用方法ICD426获得的结果是否与使用ICD274所得的数据一致，将BMS研究IM129-004(PPD项目编码:NDT)中分析的、代表高、中和低研究浓度的样品汇集成池(每个池≥3个单独样品)，产生了15个测试样品池。使用方法ICD426和ICD274对每个收集样品的一个重复(n=1,2孔)和方法ICD274中列举的每个接受QC(QC1:3μg/mL;QC2:7.5μg/mL;QC3:25μg/mL)的两个重复进行分析。方法若要认为得到了交叉验证，收集样品结果的2/3和QC水平结果的3/4的百分比差异(%DIFF)预期≤20%(使用ICD426获得的数值对使用ICD273获得的数值)。生成了一个单独的项目标号JHX4，以便将使用先前验证的方法(ICD274)获得的数据引入到辅助组(Assist)中。

交叉验证运行批次最初在运行批次13JHX2和1JHX4中进行。在15个样品池中，有13个(87%)满足接受标准，%DIFF值的范围从3%到18%。两个剩余的池，%DIFF值为29%和38%。总之，汇集成池的样品有87%满足用于交叉验证的接受标准。

还在13JHX2和1JHX4中分析了QC1-3。QC2和QC3的%DIFF分别为13%和7%，并且满足接受标准。QC1不能满足接受标准，%DIFF值为35%。通过在运行批次14JHX2和2JHX4中设定QC1的4个重复(n=4,8孔)，对两种QC1方法进行了二次比较。在14JHX2中鉴定了一个离群值(outlier)，并将其除去不予比较。该二次比较对QC1的%DIFF为18%。总之，用于比较汇集样品和QC的所有接受标准均被满足，从而交叉验证了方法ICD426和ICD274。

SOP偏差

在确认期间没有发现SOP偏差。

等同物

本领域的技术人员会意识到或者能够确认，使用常规的实验，可以获得本文中所述本发明具体实施方案的许多等同物。这些等同物意图包含在下面的权利要求中。

Claims

1.一种用于治疗需要治疗的受试者的IP10相关疾病的方法，包括：

(a)向受试者施用预定剂量的抗IP10抗体；

(b)检测该受试者的样品中抗-IP10抗体的水平；和

(c)如果步骤(b)中所述抗-IP10抗体的水平低于阈值暴露水平，则增加该受试者中所述抗-IP10抗体的剂量，使得受试者的所述IP-10相关疾病得到治疗。

2.权利要求1的方法，其中所述抗-IP10抗体特异性结合人IP-10，而不与人MIG或人ITAC交叉反应。

3.权利要求2的方法，其中所述抗-IP10抗体是MDX-1100。

4.权利要求1的方法，其中所述抗-IP10抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区。

5.权利要求4的方法，其中抗-IP10抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO:3的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO:4的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO:5的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO:8的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO:9的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO:10的轻链可变区CDR3。

6.权利要求1的方法，其中步骤(b)中抗-IP10抗体的水平通过如下的方法进行检测，所述方法包括在适合于抗体-抗原复合物形成的条件下使所述样品与结合抗-IP10抗体的抗体接触，随后探测抗体-抗原复合物的形成。

7.权利要求6的方法，其中所述与抗-IP10抗体结合的抗体是抗独特型抗体。

8.权利要求6的方法，其中所述抗独特型抗体与MDX-1100的一个或多个CDR结合。

9.权利要求8的方法，其中所述抗独特型抗体选自10C8,6C9,2F5和23H10。

10.权利要求9的方法，其中所述抗独特型抗体是10C8。

11.权利要求9的方法，其中所述抗独特型抗体是23H10。

12.权利要求6的方法，其中所述探测是通过选自下组的方法实现的：EIA、ELISA、RIA、间接竞争免疫测定、直接竞争免疫测定、非竞争免疫测定、夹心式免疫测定和凝集测定。

13.权利要求1的方法，其中所述IP10-相关疾病是炎症疾病或自身免疫疾病。

14.权利要求13的方法，其中所述炎症疾病或自身免疫疾病选自下组：多发性硬化、类风湿性关节炎、炎性肠病(例如，溃疡性结肠炎、克罗恩病)、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、炎性皮肤病症(例如，银屑病，扁平苔藓)、自身免疫性甲状腺疾病(例如格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎)、干燥综合征、肺部炎症(例如，哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺结节病、淋巴细胞肺泡炎)、移植排斥、脊髓损伤、脑损伤(例如中风)、神经变性疾病(例如阿尔茨海默病、帕金森氏病)、龈炎、基因治疗诱导的炎症、血管发生的疾病、炎性肾脏疾病(例如IgA肾病、膜性增生性肾小球性肾炎、急进型肾小球性肾炎)和动脉粥样硬化。

15.权利要求14的方法，其中所述炎症疾病或自身免疫疾病是炎性肠病。

16.权利要求15的方法，其中所述炎性肠病是溃疡性结肠炎。

17.权利要求15的方法，其中所述炎性肠病是克罗恩病。

18.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特异性结合抗-IP10抗体。

19.权利要求18的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体是抗独特型抗体。

20.权利要求18的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗-IP10抗体是MDX-1100。

21.权利要求20的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体与MDX-1100的一个或多个CDR结合。

22.权利要求20的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体选自10C8,6C9,2F5和23H10。

23.一种杂交瘤细胞系，其产生权利要求18的单克隆抗体。

24.一种试剂盒，包括：(1)特异性结合抗-IP10抗体的抗体或其抗原结合部分；和(2)帮助抗体-抗原复合物形成所需要的试剂。

25.一种用于治疗需要治疗的受试者的IP10-相关疾病的方法，包括：

(a)向受试者施用抗-IP10抗体；

(b)通过免疫测定检测该受试者的样品中所述抗-IP10抗体的水平；和

(c)如果所述抗-IP10抗体的水平低于阈值暴露水平，则增加受试者体内所述抗-IP10抗体的剂量；如果所述抗-IP10抗体的水平处于或高于阈值暴露水平，则不增加该受试者体内所述抗-IP10抗体的剂量。