KR20200132949A - 수의학적 용도를 위한 인터류킨-31 단클론성 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 IL-31 단백질 및 이의 공-수용체의 상호작용에 관여된 포유류 IL-31 단백질 상의 영역에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것으로서, 상기 항체의 상기 영역에의 결합이 하기로부터 선택되는 15H05 에피토프 결합 영역에서 돌연변이에 의해 영향받는다: 서열번호 157(고양잇과_IL31_야생형)로 표시되는 고양잇과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기들 (124 내지 135)의 영역; 서열번호 155(갯과_IL31)로 표시되는 갯과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기들 (124 내지 135)의 영역; 및 서열번호 165(말과_IL31)로 표시되는 말과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기들 (118 내지 129)의 영역. 그와 같은 항체는 고양이, 개, 또는 말에서 IL-31-매개된 장애의 치료에 유용한 수의학적 조성물의 형태일 수 있다.

Description

수의학적 용도를 위한 인터류킨-31 단클론성 항체
본 발명은, 진단 절차를 포함하는 임상 및 과학 절차에서의 재조합 단클론성 항체 및 그들의 용도의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 또한 포유동물, 예컨대 고양이, 개, 또는 말에서 IL-31-매개된 장애의 치료에 유용한 수의학적 조성물의 형태로 단리된 항-IL31 항체를 제공한다.
아토피성 피부염은 "독특한 임상적 특성을 가진 유전적으로-소인화된 염증성 및 소양성 알레르기 피부 질환"으로서 미국 수의 피부과 대학(American College of Veterinary Dermatology) 태스크포스에 의해 정의되어 왔다(Olivry 등. Veterinary Immunology and Immunopathology 2001; 81: 143-146). 태스크포스는 또한 갯과동물에서의 질환이 알레르겐-특이적 IgE와 연관된다는 것을 인식하였다(Olivry 등. 2001 상기; Marsella & Olivry Clinics in Dermatology 2003; 21: 122-133). 몇몇 소양증은, 2차 탈모증 및 홍반과 함께, 애완동물 주인에게 가장 두드러지고 관심가는 증상이다.
알레르기성 피부염에 관여된 잠재적 인자는 다수이고 잘 이해되어 있지 않다. 식품내 성분은 아토피성 피부염(Picco 등. Vet Dermatol. 2008; 19: 150-155), 뿐만 아니라 환경 알레르겐 예컨대 벼룩, 먼지벌레, 돼지풀, 식물 추출물 등을 유발시킬 수 있다. 유전적 인자는 또한 중요한 역할을 한다. 확인된 품종 선호가 없어도, 일부 상속 방식은 아토피성 피부염에의 소인을 증가시킨다고 생각된다(Sousa & Marsella Veterinary Immunology and Immunopathology 2001; 81: 153-157; Schwartzman 등. Clin. Exp. Immunol. 1971; 9: 549-569).
아토피성 피부염의 유행은 총 갯과 모집단의 10%인 것으로 추정된다(Marsella & Olivry 2003 상기; Scott 등. Canadian Veterinary Journal 2002; 43: 601-603; Hillier Veterinary Immunology and Immunopathology 2001; 81: 147-151). 세계적으로, 약 4백5십만 마리의 개는 이런 만성 및 평생 병태에 걸린다. 발생은 증가되는 것처럼 보인다. 갯과 품종 및 성별 선호는 의심받았지만, 지리적 영역에 따라 매우 다양할 수 있다(Hillier, 2001 상기; Picco 등. 2008 상기).
고양잇과 알레르기성 피부염은 건강한 고양이에서 반응을 유도하지 않는 서브스턴스에 면역계의 비정상 반응에 의해 야기된다고 생각된 염증성 및 소양성 피부 병태이다. 고양잇과 알레르기성 피부염의 가장 일관된 특성은 만성 재발성 소양증이다. 고양이에서 알레르기성 피부염의 흔한 임상 증상은 자가-유도된 탈모증, 속립성 피부염, 호산구성 육아종 복합 병변(치석, 육아종, 및 무통 궤양 포함), 및 벗겨짐, 짓무름, 및/또는 궤양을 특징으로 하는 집중된 두경부 소양증을 포함한다. 품종 및 성별 선호가 입증되지 않았고 새끼 고양이가 상기 질환에 더욱 걸리기 쉬워 보인다(Hobi 등. Vet Dermatol 2011 22: 406-413; Ravens 등. Vet Dermatol 2014; 25: 95-102; Buckely In Practice 2017; 39: 242-254).
알레르기성 피부염으로 진단된 고양이를 위한 현행 치료는 임상 징후의 심각성, 지속기간, 및 소유자 애호에 좌우되고 알레르겐-특이적 면역요법 및 항소양성 약물 예컨대 글루코코르티코이드 및 사이클로스포린을 포함한다(Buckley, 상기). 면역요법 치료는 일부 환자에 효과적이지만 빈번한 주사를 요구하고, 임상 개선은 6-9 개월 동안 보이지 않을 수 있다(Buckley, 상기). 글루코코르티코이드 및 사이클로스포린 같은 면역억제 약물은 일반적으로 효과적이지만 장기 사용은 바람직하지 않은 역효과를 종종 초래한다.
말에서의 아토피성 피부염은 소양증의 잠재적 원인으로서 인식된다. 말과 아토피성 피부염에서 환경 알레르겐의 역할은 더 잘 인식되어 있다. 상기 질환은, 관여된 알레르겐(들)에 따라, 계절성 또는 비-계절성일 수 있다. 연령, 품종, 및 성별 선호는 광범위하게 보고되지 않아 왔다. School of Veterinary Medicine, University of California, Davis(SVM-UCD)의 예비 작업에서, 발병시 중위 연령은 6.5살이었고, 서러브레드는 말의 25%를 차지하는 가장 흔한 품종이었고, 숫컷(보통 거세된 숫말)은 암말보다 거의 2배나 많았지만; 이들 데이터는 겨우 24마리의 말로부터 나오고, 전반적으로 병원 모집단과 아직 비교되지 않아 왔다. 종종 안면, 뒷다리, 또는 몸통에 관한, 소양증은 말과 아토피성 피부염의 가장 흔한 임상 징후이다. 탈모증, 홍반, 두드러기, 및 구진은 모두 존재할 수 있다. 두드러기 병변은 상당히 심각할 수 있지만, 소양성은 아닐 수 있다. 말에서 두드러기 아토피성 피부염에 대한 가족성 소인이 있을 수 있다. 말은, 과도한 스케일링, 소형 표피 잔고리, 또는 포피성 구진("속립성 피부염")에 의해 전형화된, 2차 농피증을 가질 수 있다. 아토피성 피부염의 진단은 임상 징후 그리고 다른 진단, 특히 곤충(응애) 과민증의 배제에 기반된다(White Clin Tech Equine Pract 2005; 4: 311-313; Fadok Vet Clin Equine 2013; 29 541-550). 현재, 말에서 아토피성 피부염의 관리는, 알레르기성 반응에 의해 유발된 염증 및 소양증을 억제시킴으로써, 그리고 특정 원인을 다룸으로써(즉, 담당 알레르겐을 확인하고 알레르겐-특이적 백신을 제형화함으로써), 모두 증상적으로 실시된다. 증상적 접근법은 환자를 편하게 하고 자가-외상을 최소화하기 위해 단기간에서 전형적으로 필요하다. 이러한 접근법은 안티히스타민, 필수 지방산, 펜톡시필린, 및 글루코코르티코이드를 포함하는 국소 및 전신 요법의 조합의 용도에 의존한다. 환경 알레르기 제어에 대한 1차 접근법은 과민증 반응을 유발하는 알레르겐의 확인을 포함한다. 알레르겐-특이적 면역요법이 아토피성 말에 도움될 수 있음이 피부과 의사에 의해 흔하게 수용된다. 하지만, 일반 규칙으로서, 대부분의 말들은 면역요법의 최초 6 개월후에나 개선을 보여준다(Marsella Vet Clin Equine 2013; 29: 551-557). 또한, 말에서 면역억제 약물의 장기 사용은 바람직하지 않은 역효과를 초래할 수 있다.
T 헬퍼 유형 2 세포에 의해 생산된 사이토카인인 인터류킨-31(IL-31)은 인간, 마우스, 및 개에서 소양증을 유도하는 것으로 밝혀졌다(Bieber N Engl J Med 2008; 358: 1483-1494; Dillon 등. Nat Immunol 2004; 5:752-60; Bammert 등의 미국 특허 번호 8,790,651; Gonzalez 등. Vet Dermatl. 2013; 24(1): 48-53). IL-31은 IL-31 수용체 A(IL-31RA) 및 온코스타틴 M 수용체(OSMR)로 구성된 공-수용체를 결합시킨다(Dillon 등. 2004 상기 및 Bilsborough 등. J Allergy Clin Immunol. 2006 117(2):418-25). 수용체 활성화는 JAK 수용체(들)를 통해 STAT의 인산화를 초래한다. 공-수용체의 발현은 대식세포, 각질세포 및 배근신경절에서 밝혀졌다.
최근, IL-31이 피부염, 소양성 피부 병변, 알레르기, 및 기도 과민증에 관여되는 것이 밝혀졌다. Zoetis Inc.(Parsippany, NJ)에 의해 생산된 갯과 항-IL-31 단클론성 항체인, 시토포인트(Cytopoint)®는 아토피성 피부염을 가진 개에서 소양증 및 피부 병변을 감소시킨다고 밝혀졌다(Gonzalez 등. 2013 상기, Michels 등. Vet Dermatol. 2016; Dec; 27(6): 478-e129). 수의학적 포유동물에서 IL-31-매개된 장애를 예방 및 치료하기 위해 항-IL31 항체를 추가로 제공하는 것이 바람직할 것이다. 고양이 및 말에서 아토피성 및 알레르기성 피부병을 위한 안전하고 효과적인 대안 치료를 위한 현재 미충족된 필요성을 고려하여, 아토피성 피부염을 가진 고양이 및 말에서 소양증 및 피부 병변을 감소시키기 위해 고양잇과 및 말과 항-IL-31 항체를 제공하는 것이 특히 바람직할 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 IL-31 단백질의 이의 공-수용체와의 상호작용에 관여된 포유류 IL-31 단백질 상의 영역에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공하고, 여기서 상기 항체의 상기 영역에의 결합이 하기의 적어도 하나로부터 선택되는 15H05 에피토프 결합 영역에서 돌연변이에 의해 영향받는다: a) 서열번호 157(고양잇과_IL31_야생형)로 표시되는 고양잇과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기 124 내지 135의 영역; b) 서열번호 155(갯과_IL31)로 표시되는 갯과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기 124 내지 135의 영역; 및 c) 서열번호 165(말과_IL31)로 표시되는 말과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기 118 내지 129의 영역.
일 구현예에서, 15H05 에피토프 결합 영역에서 상기 언급된 돌연변이는 하기의 적어도 하나로부터 선택된다: (a) 서열번호 157의 126 및 128 위치가 알라닌으로 변경되는 돌연변이체; (b) 서열번호 155의 126 및 128 위치가 알라닌으로 변경되는 돌연변이체; 및 (c) 서열번호 165의 120 및 122 위치가 알라닌으로 변경되는 돌연변이체.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 단클론성 항체는 15H05 에피토프 영역에 결합한다. 바꾸어 말하면, 일 구현예에서, 본 발명은 IL-31 단백질의 이의 공-수용체와의 상호작용에 관여된 포유류 IL-31 단백질 상의 영역에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공하고, 여기서 결합 영역은 하기의 적어도 하나로부터 선택되는 15H05 에피토프 결합 영역이다: a) 서열번호 157(고양잇과_IL31_야생형)로 표시되는 고양잇과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기 124 내지 135의 영역; b) 서열번호 155(갯과_IL31)로 표시되는 갯과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기 124 내지 135의 영역; 및 c) 서열번호 165(말과_IL31)로 표시되는 말과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기 118 내지 129의 영역.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 특이적으로 결합하는 포유류 IL-31은 고양잇과 IL-31이고, 여기서 항체는 서열번호 157(고양잇과_IL31_야생형)로 표시되는 고양잇과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기 125 내지 134의 영역에 결합한다. 일부 구현예에서, 고양잇과 IL-31에서 이 영역에 결합하는 항체는 하기로부터 선택되는 프레임워크 2(FW2) 변화를 포함하는 VL 쇄를 포함하고: 42 위치에서 라이신 대신에 아스파라긴, 43 위치에서 발린 대신에 이소류신, 46 위치에서 류신 대신에 발린, 49 위치에서 라이신 대신에 아스파라긴, 및 이들의 조합, 여기서 상기 위치는 서열번호 127(FEL_15H05_VL1)의 넘버링을 지칭한다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 특이적으로 결합하는 포유류 IL-31은 갯과 IL-31이고, 여기서 항체는 서열번호 155(갯과_IL31)로 표시되는 갯과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기 125 내지 134의 영역에 결합한다.
또 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 특이적으로 결합하는 포유류 IL-31은 말과 IL-31이고, 여기서 항체는 서열번호 165(말과_IL31)로 표시되는 말과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기 117 내지 128의 영역에 결합한다.
일 구현예에서, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 상보성 결정 영역(CDR) 서열의 하기 조합을 포함한다:
1) 항체 15H05: SYTIH(서열번호 1)의 가변 중쇄(VH)-CDR1, NINPTSGYTENNQRFKD(서열번호 2)의 VH-CDR2, WGFKYDGEWSFDV(서열번호 3)의 VH-CDR3, RASQGISIWLS(서열번호 4)의 가변 경쇄(VL)-CDR1, KASNLHI(서열번호 5)의 VL-CDR2, 및 LQSQTYPLT(서열번호 6)의 VL-CDR3; 또는
2) VH 또는 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 모 항체 15H05와 상이한 1)의 변이체.
일 구현예에서, 항체 15H05/1505의 변이체는 CDR들 내에서 하기 위치들 중 하나 이상에서의 치환을 포함한다: 중쇄 CDR 1, 2 및 3, 각각에서 서열번호 1로부터 잔기 4(I); 서열번호 2로부터 잔기 1-3(NIN), 5-7(TSG), 9-11(TEN) 및 13(Q); 서열번호 3으로부터 잔기 4(K), 6(D) 및 13(V), 그리고 CDRL1, 2, 및 3, 각각으로부터 서열번호 4로부터 잔기 3-7(SQGIS), 서열번호 5로부터 잔기 3(S) 및 5(L), 및 서열번호 6에서 잔기 4(Q), 5(T) 및 9(T). 일 구현예에서, 이들 치환의 하나 이상은 보존적 아미노산 치환이다.
일 구현예에서, 상기 단클론성 항체 15H05는 하기 중 하나 이상을 포함한다:
a) FEL_15H05_VL1_FW2를 포함하는 가변 경쇄:
EIQMTQSPSSLSASPGDRVTITCRASQGISIWLSWYQQKPGNIPKVLINKASNLHIGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDAATYYCLQSQTYPLTFGGGTKLEIK(서열번호 135), 및
b) FEL_15H05_VH1을 포함하는 가변 중쇄:
QVLLVQSGAEVRTPGASVKIFCKASGYSFTSYTIHWLRQAPAQGLEWMGNINPTSGYTENNQRFKDRLTLTADTSTNTAYMELSSLRSADTAMYYCARWGFKYDGEWSFDVWGAGTTVTVSS(서열번호 121).
본 발명은 또한 상보성 결정 영역(CDR) 서열의 하기 조합을 포함하는 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다:
1) 항체 ZIL1: SYGMS(서열번호 13)의 가변 중쇄(VH)-CDR1, HINSGGSSTYYADAVKG(서열번호 14)의 VH-CDR2, VYTTLAAFWTDNFDY(서열번호 15)의 VH-CDR3, SGSTNNIGILAAT(서열번호 16)의 가변 경쇄(VL)-CDR1, SDGNRPS(서열번호 17)의 VL-CDR2, 및 QSFDTTLDAYV(서열번호 18)의 VL-CDR3;
2) 항체 ZIL8: DYAMS(서열번호 19)의 VH-CDR1, GIDSVGSGTSYADAVKG(서열번호 20)의 VH-CDR2, GFPGSFEH(서열번호 21)의 VH-CDR3, TGSSSNIGSGYVG(서열번호 22)의 VL-CDR1, YNSDRPS(서열번호 23)의 VL-CDR2, SVYDRTFNAV(서열번호 24)의 VL-CDR3;
3) 항체 ZIL9: SYDMT(서열번호 25)의 VH-CDR1, DVNSGGTGTAYAVAVKG(서열번호 26)의 VH-CDR2, LGVRDGLSV(서열번호 27)의 VH-CDR3, SGESLNEYYTQ(서열번호 28)의 VL-CDR1, RDTERPS(서열번호 29)의 VL-CDR2, ESAVDTGTLV(서열번호 30)의 VL-CDR3;
4) 항체 ZIL11: TYVMN(서열번호 31)의 VH-CDR1, SINGGGSSPTYADAVRG(서열번호 32)의 VH-CDR2, SMVGPFDY(서열번호 33)의 VH-CDR3, SGESLSNYYAQ(서열번호 34)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 35)의 VL-CDR2, ESAVSSDTIV(서열번호 36)의 VL-CDR3;
5) 항체 ZIL69: SYAMK(서열번호 37)의 VH-CDR1, TINNDGTRTGYADAVRG(서열번호 38)의 VH-CDR2, GNAESGCTGDHCPPY(서열번호 39)의 VH-CDR3, SGESLNKYYAQ(서열번호 40)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 41)의 VL-CDR2, ESAVSSETNV(서열번호 42)의 VL-CDR3;
6) 항체 ZIL94: TYFMS(서열번호 43)의 VH-CDR1, LISSDGSGTYYADAVKG(서열번호 44)의 VH-CDR2, FWRAFND(서열번호 45)의 VH-CDR3, GLNSGSVSTSNYPG(서열번호 46)의 VL-CDR1, DTGSRPS(서열번호 47)의 VL-CDR2, SLYTDSDILV(서열번호 48)의 VL-CDR3;
7) 항체 ZIL154: DRGMS(서열번호 49)의 VH-CDR1, YIRYDGSRTDYADAVEG(서열번호 50)의 VH-CDR2, WDGSSFDY(서열번호 51)의 VH-CDR3, KASQSLLHSDGNTYLD(서열번호 52)의 VL-CDR1, KVSNRDP(서열번호 53)의 VL-CDR2, MQAIHFPLT(서열번호 54)의 VL-CDR3;
8) 항체 ZIL159: SYVMT(서열번호 55)의 VH-CDR1, GINSEGSRTAYADAVKG(서열번호 56)의 VH-CDR2, GDIVATGTSY(서열번호 57)의 VH-CDR3, SGETLNRFYTQ(서열번호 58)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 59)의 VL-CDR2, KSAVSIDVGV(서열번호 60)의 VL-CDR3;
9) 항체 ZIL171: TYVMN(서열번호 61)의 VH-CDR1, SINGGGSSPTYADAVRG(서열번호 62)의 VH-CDR2, SMVGPFDY(서열번호 63)의 VH-CDR3, SGKSLSYYYAQ(서열번호 64)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 65)의 VL-CDR2, ESAVSSDTIV(서열번호 66)의 VL-CDR3;
10) 항체 04H07: SYWMN(서열번호 200)의 VH-CDR1, MIDPSDSEIHYNQVFKD(서열번호 201)의 VH-CDR2, QDIVTTVDY(서열번호 202)의 VH-CDR3, KSSQSLLYSINQKNHLA(서열번호 203)의 VL-CDR1, WASTRES(서열번호 204)의 VL-CDR2, QQGYTYPFT(서열번호 205)의 VL-CDR3;
11) 항체 06A09: SYWMN(서열번호 206)의 VH-CDR1, MIDPSDSETHYNQIFRD(서열번호 207)의 VH-CDR2, QDIVTTVDY(서열번호 208)의 VH-CDR3, KSSQSLLYSINQKNFLA(서열번호 209)의 VL-CDR1, WASTRES(서열번호 210)의 VL-CDR2, QQHYGYPFT(서열번호 211)의 VL-CDR3; 또는
12) VH 또는 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 각각의 모 항체 ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159, ZIL171, 04H07 또는 06A09와 상이한 1) 내지 11)의 변이체.
본 발명의 일부 구현예에서,
1) 항체 ZIL1은 하기 중 하나 이상을 포함하고:
a) CAN-ZIL1_VL을 포함하는 가변 경쇄:
QSVLTQPTSVSGSLGQRVTISCSGSTNNIGILAATWYQQLPGKAPKVLVYSDGNRPSGVPDRFSGSKSGNSATLTITGLQAEDEADYYCQSFDTTLDAYVFGSGTQLTVL(서열번호 77), 및
b) CAN-ZIL1_VH를 포함하는 가변 중쇄:
EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLQWVAHINSGGSSTYYADAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVEVYTTLAAFWTDNFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 75);
2) 항체 ZIL8은 하기 중 하나 이상을 포함하거나:
a) CAN-ZIL8_VL을 포함하는 가변 경쇄:
QSVLTQPASVSGSLGQKVTISCTGSSSNIGSGYVGWYQQLPGTGPRTLIYYNSDRPSGVPDRFSGSRSGTTATLTISGLQAEDEADYYCSVYDRTFNAVFGGGT(서열번호 81), 및
b) CAN-ZIL8_VH를 포함하는 가변 중쇄:
EVQLVESGGDLVKPAGSLRLSCVASGFTFSDYAMSWVRQAPGRGLQWVAGIDSVGSGTSYADAVKGRFTISRDDAKNTLYLQMFNLRAEDTAIYYCASGFPGSFEHWGQGTLVTVSS(서열번호 79); 또는
하기 중 하나 이상을 포함하거나:
c) ZTS_5864_VL을 포함하는 가변 경쇄:
QSVLTQPSSVSGTLGQRITISCTGSSSNIGSGYVGWYQQVPGMGPKTVIYYNSDRPSGVPDRFSGSKSGSSGTLTITGLQAEDEADYYCSVYDRTFNAVFGGGTHLTVLGQPKSAPPRSHSSRPISYAVFCL(서열번호 230), 및
d) ZTS_5864_VH를 포함하는 가변 중쇄:
DVQLVESGGDLVKPGGSLRLTCVASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLQWVAGIDSVGSGTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKTEDTATYYCASGFPGSFEHWGQGALVTVSS(서열번호 228); 또는
하기 중 하나 이상을 포함한다:
e) ZTS_5865_VL을 포함하는 가변 경쇄:
SVLTQPSSVSGTLGQRITISCTGSSSNIGSGYVGWYQQVPGMGPKTVIYYNSDRPSGVPDRFSGSKSGSSGTLTITGLQAEDEADYYCSVYDRTFNAVFGGGTHLTVLGQPKSAPPRSHSSRPISYAVFCL(서열번호 234), 및
f) ZTS_5865_VH를 포함하는 가변 중쇄:
DVQLVESGGDLVKPGGSLRLTCVASGFTFSDYAMNWVRQAPGKGLQWVAGIDSVGSGTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSGLKTEDTATYYCASGFPGSFEHWGQGTLVTVSS(서열번호 232).
3) 항체 ZIL9는 하기 중 하나 이상을 포함하고:
a) CAN-ZIL9_VL을 포함하는 가변 경쇄:
SSVLTQPPSVSVSLGQTATISCSGESLNEYYTQWFQQKAGQAPVLVIYRDTERPSGIPDRFSGSSSGNTHTLTISGARAEDEADYYCESAVDTGTLVFGGGTHLAVL(서열번호 85), 및
b) CAN-ZIL9_VH를 포함하는 가변 중쇄:
EVQLVESGGDLVKPPGSLRLSCVASGFTFSSYDMTWVRQAPGKGLQWVADVNSGGTGTAYAVAVKGRFTISRDNAKKTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLGVRDGLSVWGQGTLVTVSS(서열번호 83);
4) 항체 ZIL11은 하기 중 하나 이상을 포함하고:
a) CAN-ZIL11_VL을 포함하는 가변 경쇄:
SSVLTQPPSVSVSLGQTATISCSGESLSNYYAQWFQQKAGQAPVLVIYKDTERPSGIPDRFSGSSSGNTHTLTISGARAEDEADYYCESAVSSDTIVFGGGT(서열번호 89), 및
b) CAN-ZIL11_VH를 포함하는 가변 중쇄:
EVQLVESGGDLVKPAGSLRLSCVASGFTFRTYVMNWVRQAPGKGLQWVASINGGGSSPTYADAVRGRFTVSRDNAQNSLFLQMNSLRAEDTAVYFCVVSMVGPFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 87);
5) 항체 ZIL69는 하기 중 하나 이상을 포함하고:
a) CAN-ZIL69_VL을 포함하는 가변 경쇄:
SSVLTQPPSVSVSLGQTATISCSGESLNKYYAQWFQQKAGQAPVLVIYKDTERPSGIPDRFSGSSAGNTHTLTISGARAEDEADYYCESAVSSETNVFGSGTQLTVL(서열번호 93), 및
b) CAN-ZIL69_VH를 포함하는 가변 중쇄:
EVQLVESGGDLVKPAGSLRLSCVASGFTFSSYAMKWVRQAPGKGLQWVATINNDGTRTGYADAVRGRFTISKDNAKNTLYLQMDSLRADDTAVYYCTKGNAESGCTGDHCPPYWGQGTLVTVSS(서열번호 91);
6) 항체 ZIL94는 하기 중 하나 이상을 포함하고:
a) CAN-ZIL94_VL을 포함하는 가변 경쇄:
QTVVIQEPSLSVSPGGTVTLTCGLNSGSVSTSNYPGWYQQTRGRTPRTIIYDTGSRPSGVPNRFSGSISGNKAALTITGAQPEDEADYYCSLYTDSDILVFGGGTHLTVL(서열번호 97), 및
b) CAN-ZIL94_VH를 포함하는 가변 중쇄:
EVQLVDSGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSTYFMSWVRQAPGRGLQWVALISSDGSGTYYADAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAIFWRAFNDWGQGTLVTVSS(서열번호 95);
7) 항체 ZIL154는 하기 중 하나 이상을 포함하고:
a) CAN-ZIL154_VL을 포함하는 가변 경쇄:
DIVVTQTPLSLSVSPGETASFSCKASQSLLHSDGNTYLDWFRQKPGQSPQRLIYKVSNRDPGVPDRFSGSGSGTDFTLRISGVEADDAGLYYCMQAIHFPLTFGAGTKVELK(서열번호 101), 및
b) CAN-ZIL154_VH를 포함하는 가변 중쇄:
EVHLVESGGDLVKPWGSLRLSCVASGFTFSDRGMSWVRQSPGKGLQWVAYIRYDGSRTDYADAVEGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWDGSSFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 99);
8) 항체 ZIL159는 하기 중 하나 이상을 포함하고:
a) CAN-ZIL159_VL을 포함하는 가변 경쇄:
SNVLTQPPSVSVSLGQTATISCSGETLNRFYTQWFQQKAGQAPVLVIYKDTERPSGIPDRFSGSSSGNIHTLTISGARAEDEAAYYCKSAVSIDVGVFGGGTHLTVF(서열번호 105), 및
b) CAN-ZIL159_VH를 포함하는 가변 중쇄:
EVQLVESGGDLVKPAGSLRLSCVASGFTFSSYVMTWVRQAPGKGLQWVAGINSEGSRTAYADAVKGRFTISRDNAKNTLYLQIDSLRAEDTAIYYCATGDIVATGTSYWGQGTLVTVSS(서열번호 103);
9) 항체 ZIL171은 하기 중 하나 이상을 포함하고:
a) CAN-ZIL171_VL을 포함하는 가변 경쇄:
SSVLTQPPSVSVSLGQTATISCSGKSLSYYYAQWFQQKAGQAPVLVIYKDTERPSGIPDRFSGSSSGNTHTLTISGARAEDEADYYCESAVSSDTIVFGGGTHLTVL(서열번호 109), 및
b) CAN-ZIL171_VH를 포함하는 가변 중쇄:
EVQLVESGGDLVKPAGSLRLSCVASGFTFRTYVMNWVRQAPGKGLQWVASINGGGSSPTYADAVRGRFTVSRDNAQNSLFLQMNSLRAEDTAIYFCVVSMVGPFDYWGHGTLVTVSS(서열번호 107);
10) 항체 04H07은 하기 중 하나 이상을 포함하고:
a) Mu_04H07_VL을 포함하는 가변 경쇄:
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSINQKNHLAWFQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPARFTGSGSGTDFTLTISSVKTEDLAVYYCQQGYTYPFTFGSGTKLEIK(서열번호 214), 및
b) Mu_04H07_VH를 포함하는 가변 중쇄:
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWAKQRPGQGLEWIGMIDPSDSEIHYNQVFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARQDIVTTVDYWGQGTTLTVSS(서열번호 212);
11) 항체 06A09는 하기 중 하나 이상을 포함한다:
a) Mu_06A09_VL을 포함하는 가변 경쇄:
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSINQKNFLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKSEDLAVYYCQQHYGYPFTFGSGTKLEIK(서열번호 218), 및
b) Mu_06A09_VH를 포함하는 가변 중쇄:
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKAYGYTFTSYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIDPSDSETHYNQIFRDKATLTIDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARQDIVTTVDYWGQGTTLTVSS(서열번호 216).
일 구현예에서, 본 발명에 따른 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 포유동물에서 IL-31-매개된 소양성 또는 알레르기성 병태를 감소, 억제 또는 중화시킨다. 일 구현예에서, 그와 같은 포유동물은 개, 고양이, 또는 말로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 단클론성 항체는 키메라이다. 추가 구현예에서, 항체는 개화되거나, 고양이화되거나, 말화되거나, 완전 갯과이거나, 완전 고양잇과이거나, 완전 말과이다.
본 발명은 또한 상기 기재된 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 치료적 유효량을 포함하는 수의학적 조성물을 제공한다.
대상체에서 IL-31-매개된 장애의 치료 방법으로서, 대상체에게 상기 기재된 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 또한 제공된다.
일 구현예에서, IL-31-매개된 장애는 소양성 또는 알레르기성 병태이다. 일부 구현예에서, 소양성 또는 알레르기성 병태는 아토피성 피부염, 습진, 건선, 경피증 및 소양증으로부터 선택되는 소양성 병태이다. 다른 구현예에서, 소양성 또는 알레르기성 병태는 알레르기성 피부염, 여름 습진, 두드러기, 호흡곤란증, 염증성 기도 질환, 재발성 기도 폐색, 기도 과민반응, 만성 폐쇄성 폐 질환, 및 자가면역에서 비롯된 염증성 과정으로부터 선택되는 알레르기성 병태이다.
다른 구현예에서, IL-31-매개된 장애는 종양 진행이다. 일부 구현예에서, IL-31-매개된 장애는 호산구성 질환 또는 비만세포종이다.
포유동물에게 상기 기재된 바와 같이 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 투여함으로써 포유동물에서 IL-31 활성의 억제 방법이 추가로 제공된다.
IL-31-매개된 장애를 가진 포유동물의 치료에서 사용하기 위한 상기 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 또한 제공된다.
IL-31-매개된 장애를 가진 포유동물을 치료하기 위한 상기 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 용도가 추가로 제공된다.
IL-31의 검출 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법이 또한 제공된다: 상기 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 존재 하에서 IL-31을 포함하는 샘플을 인큐베이션하는 단계; 및 샘플에서 IL-31에 결합되는 항체를 검출하는 단계. 일 구현예에서, 상기 방법은 샘플에서 IL-31을 정량화하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 상보성 결정 영역(CDR) 서열의 하기 조합 중 하나 이상을 포함하는 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 생산하는 숙주 세포를 제공한다:
1) 항체 15H05: SYTIH(서열번호 1)의 가변 중쇄(VH)-CDR1, NINPTSGYTENNQRFKD(서열번호 2)의 VH-CDR2, WGFKYDGEWSFDV(서열번호 3)의 VH-CDR3, RASQGISIWLS(서열번호 4)의 가변 경쇄(VL)-CDR1, KASNLHI(서열번호 5)의 VL-CDR2, 및 LQSQTYPLT(서열번호 6)의 VL-CDR3;
2) 항체 ZIL1: SYGMS(서열번호 13)의 가변 중쇄(VH)-CDR1, HINSGGSSTYYADAVKG(서열번호 14)의 VH-CDR2, VYTTLAAFWTDNFDY(서열번호 15)의 VH-CDR3, SGSTNNIGILAAT(서열번호 16)의 가변 경쇄(VL)-CDR1, SDGNRPS(서열번호 17)의 VL-CDR2, 및 QSFDTTLDAYV(서열번호 18)의 VL-CDR3;
3) 항체 ZIL8: DYAMS(서열번호 19)의 VH-CDR1, GIDSVGSGTSYADAVKG(서열번호 20)의 VH-CDR2, GFPGSFEH(서열번호 21)의 VH-CDR3, TGSSSNIGSGYVG(서열번호 22)의 VL-CDR1, YNSDRPS(서열번호 23)의 VL-CDR2, SVYDRTFNAV(서열번호 24)의 VL-CDR3;
4) 항체 ZIL9: SYDMT(서열번호 25)의 VH-CDR1, DVNSGGTGTAYAVAVKG(서열번호 26)의 VH-CDR2, LGVRDGLSV(서열번호 27)의 VH-CDR3, SGESLNEYYTQ(서열번호 28)의 VL-CDR1, RDTERPS(서열번호 29)의 VL-CDR2, ESAVDTGTLV(서열번호 30)의 VL-CDR3;
5) 항체 ZIL11: TYVMN(서열번호 31)의 VH-CDR1, SINGGGSSPTYADAVRG(서열번호 32)의 VH-CDR2, SMVGPFDY(서열번호 33)의 VH-CDR3, SGESLSNYYAQ(서열번호 34)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 35)의 VL-CDR2, ESAVSSDTIV(서열번호 36)의 VL-CDR3;
6) 항체 ZIL69: SYAMK(서열번호 37)의 VH-CDR1, TINNDGTRTGYADAVRG(서열번호 38)의 VH-CDR2, GNAESGCTGDHCPPY(서열번호 39)의 VH-CDR3, SGESLNKYYAQ(서열번호 40)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 41)의 VL-CDR2, ESAVSSETNV(서열번호 42)의 VL-CDR3;
7) 항체 ZIL94: TYFMS(서열번호 43)의 VH-CDR1, LISSDGSGTYYADAVKG(서열번호 44)의 VH-CDR2, FWRAFND(서열번호 45)의 VH-CDR3, GLNSGSVSTSNYPG(서열번호 46)의 VL-CDR1, DTGSRPS(서열번호 47)의 VL-CDR2, SLYTDSDILV(서열번호 48)의 VL-CDR3;
8) 항체 ZIL154: DRGMS(서열번호 49)의 VH-CDR1, YIRYDGSRTDYADAVEG(서열번호 50)의 VH-CDR2, WDGSSFDY(서열번호 51)의 VH-CDR3, KASQSLLHSDGNTYLD(서열번호 52)의 VL-CDR1, KVSNRDP(서열번호 53)의 VL-CDR2, MQAIHFPLT(서열번호 54)의 VL-CDR3;
9) 항체 ZIL159: SYVMT(서열번호 55)의 VH-CDR1, GINSEGSRTAYADAVKG(서열번호 56)의 VH-CDR2, GDIVATGTSY(서열번호 57)의 VH-CDR3, SGETLNRFYTQ(서열번호 58)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 59)의 VL-CDR2, KSAVSIDVGV(서열번호 60)의 VL-CDR3;
10) 항체 ZIL171: TYVMN(서열번호 61)의 VH-CDR1, SINGGGSSPTYADAVRG(서열번호 62)의 VH-CDR2, SMVGPFDY(서열번호 63)의 VH-CDR3, SGKSLSYYYAQ(서열번호 64)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 65)의 VL-CDR2, ESAVSSDTIV(서열번호 66)의 VL-CDR3;
11) 항체 04H07: SYWMN(서열번호 200)의 VH-CDR1, MIDPSDSEIHYNQVFKD(서열번호 201)의 VH-CDR2, QDIVTTVDY(서열번호 202)의 VH-CDR3, KSSQSLLYSINQKNHLA(서열번호 203)의 VL-CDR1, WASTRES(서열번호 204)의 VL-CDR2, QQGYTYPFT(서열번호 205)의 VL-CDR3;
12) 항체 06A09: SYWMN(서열번호 206)의 VH-CDR1, MIDPSDSETHYNQIFRD(서열번호 207)의 VH-CDR2, QDIVTTVDY(서열번호 208)의 VH-CDR3, KSSQSLLYSINQKNFLA(서열번호 209)의 VL-CDR1, WASTRES(서열번호 210)의 VL-CDR2, QQHYGYPFT(서열번호 211)의 VL-CDR3; 또는
13) VH 또는 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 각각의 모 항체 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159, ZIL171, 04H07 또는 06A09와 상이한 1) 내지 12)의 변이체.
항체의 생산을 초래하는 조건 하에서 상기 기재된 숙주 세포를 배양시키는 단계, 및 숙주 세포 또는 숙주 세포의 배양 배지로부터 항체를 단리시키는 단계를 포함하는, 항체의 생산 방법이 또한 제공된다.
본 발명에 따른 단리된 핵산이 아래 기재된다. 그와 같은 핵산은 상기-기재된 가변 중쇄 또는 가변 경쇄 CDR 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 단리된 핵산은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 CDR 둘 모두를 인코딩하는 핵산 서열을 함유할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 가변 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 서열의 하기 조합 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다:
1) 15H05: SYTIH(서열번호 1)의 가변 중쇄(VH)-CDR1, NINPTSGYTENNQRFKD(서열번호 2)의 VH-CDR2, 및 WGFKYDGEWSFDV(서열번호 3)의 VH-CDR3;
2) ZIL1: SYGMS(서열번호 13)의 VH-CDR1, HINSGGSSTYYADAVKG(서열번호 14)의 VH-CDR2, 및 VYTTLAAFWTDNFDY(서열번호 15)의 VH-CDR3;
3) ZIL8: DYAMS(서열번호 19)의 VH-CDR1, GIDSVGSGTSYADAVKG(서열번호 20)의 VH-CDR2, 및 GFPGSFEH(서열번호 21)의 VH-CDR3;
4) ZIL9: SYDMT(서열번호 25)의 VH-CDR1, DVNSGGTGTAYAVAVKG(서열번호 26)의 VH-CDR2, 및 LGVRDGLSV(서열번호 27)의 VH-CDR3;
5) ZIL11: TYVMN(서열번호 31)의 VH-CDR1, SINGGGSSPTYADAVRG(서열번호 32)의 VH-CDR2, 및 SMVGPFDY(서열번호 33)의 VH-CDR3;
6) ZIL69: SYAMK(서열번호 37)의 VH-CDR1, TINNDGTRTGYADAVRG(서열번호 38)의 VH-CDR2, 및 GNAESGCTGDHCPPY(서열번호 39)의 VH-CDR3;
7) ZIL94: TYFMS(서열번호 43)의 VH-CDR1, LISSDGSGTYYADAVKG(서열번호 44)의 VH-CDR2, 및 FWRAFND(서열번호 45)의 VH-CDR3;
8) ZIL154: DRGMS(서열번호 49)의 VH-CDR1, YIRYDGSRTDYADAVEG(서열번호 50)의 VH-CDR2, 및 WDGSSFDY(서열번호 51)의 VH-CDR3;
9) ZIL159: SYVMT(서열번호 55)의 VH-CDR1, GINSEGSRTAYADAVKG(서열번호 56)의 VH-CDR2, 및 GDIVATGTSY(서열번호 57)의 VH-CDR3;
10) ZIL171: TYVMN(서열번호 61)의 VH-CDR1, SINGGGSSPTYADAVRG(서열번호 62)의 VH-CDR2, 및 SMVGPFDY(서열번호 63)의 VH-CDR3;
11) 04H07: SYWMN(서열번호 200)의 VH-CDR1, MIDPSDSEIHYNQVFKD(서열번호 201)의 VH-CDR2, 및 QDIVTTVDY(서열번호 202)의 VH-CDR3;
12) 06A09: SYWMN(서열번호 206)의 VH-CDR1, MIDPSDSETHYNQIFRD(서열번호 207)의 VH-CDR2, 및 QDIVTTVDY(서열번호 208)의 VH-CDR3; 또는
13) VH CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 각각의 모 항체 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159, ZIL171, 04H07 또는 06A09의 CDR과 상이한 1) 내지 12)의 변이체.
일 구현예에서, 상기 기재된 단리된 핵산은 가변 경쇄 상보성 결정 영역(CDR) 서열의 하기 조합 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다:
1) 15H05: RASQGISIWLS(서열번호 4)의 가변 경쇄(VL)-CDR1, KASNLHI(서열번호 5)의 VL-CDR2, 및 LQSQTYPLT(서열번호 6)의 VL-CDR3;
2) ZIL1: SGSTNNIGILAAT(서열번호 16)의 VL-CDR1, SDGNRPS(서열번호 17)의 VL-CDR2, 및 QSFDTTLDAYV(서열번호 18)의 VL-CDR3;
3) ZIL8: TGSSSNIGSGYVG(서열번호 22)의 VL-CDR1, YNSDRPS(서열번호 23)의 VL-CDR2, 및 SVYDRTFNAV(서열번호 24)의 VL-CDR3;
4) ZIL9: SGESLNEYYTQ(서열번호 28)의 VL-CDR1, RDTERPS(서열번호 29)의 VL-CDR2, 및 ESAVDTGTLV(서열번호 30)의 VL-CDR3;
5) ZIL11: SGESLSNYYAQ(서열번호 34)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 35)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSDTIV(서열번호 36)의 VL-CDR3;
6) ZIL69: SGESLNKYYAQ(서열번호 40)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 41)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSETNV(서열번호 42)의 VL-CDR3;
7) ZIL94: GLNSGSVSTSNYPG(서열번호 46)의 VL-CDR1, DTGSRPS(서열번호 47)의 VL-CDR2, 및 SLYTDSDILV(서열번호 48)의 VL-CDR3;
8) ZIL154: KASQSLLHSDGNTYLD(서열번호 52)의 VL-CDR1, KVSNRDP(서열번호 53)의 VL-CDR2, 및 MQAIHFPLT(서열번호 54)의 VL-CDR3;
9) ZIL159: SGETLNRFYTQ(서열번호 58)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 59)의 VL-CDR2, 및 KSAVSIDVGV(서열번호 60)의 VL-CDR3;
10) ZIL171: SGKSLSYYYAQ(서열번호 64)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 65)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSDTIV(서열번호 66)의 VL-CDR3;
11) 04H07: KSSQSLLYSINQKNHLA(서열번호 203)의 VL-CDR1, WASTRES(서열번호 204)의 VL-CDR2, QQGYTYPFT(서열번호 205)의 VL-CDR3;
12) 06A09: KSSQSLLYSINQKNFLA(서열번호 209)의 VL-CDR1, WASTRES(서열번호 210)의 VL-CDR2, QQHYGYPFT(서열번호 211)의 VL-CDR3; 또는
13) VH 또는 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 각각의 모 항체 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159, ZIL171, 04H07 또는 06A09의 CDR과 상이한 1) 내지 12)의 변이체.
일 구현예에서, 본 발명은 가변 경쇄 상보성 결정 영역(CDR) 서열의 하기 조합 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다:
1) 15H05: RASQGISIWLS(서열번호 4)의 가변 경쇄(VL)-CDR1, KASNLHI(서열번호 5)의 VL-CDR2, 및 LQSQTYPLT(서열번호 6)의 VL-CDR3;
2) ZIL1: SGSTNNIGILAAT(서열번호 16)의 VL-CDR1, SDGNRPS(서열번호 17)의 VL-CDR2, 및 QSFDTTLDAYV(서열번호 18)의 VL-CDR3;
3) ZIL8: TGSSSNIGSGYVG(서열번호 22)의 VL-CDR1, YNSDRPS(서열번호 23)의 VL-CDR2, 및 SVYDRTFNAV(서열번호 24)의 VL-CDR3;
4) ZIL9: SGESLNEYYTQ(서열번호 28)의 VL-CDR1, RDTERPS(서열번호 29)의 VL-CDR2, 및 ESAVDTGTLV(서열번호 30)의 VL-CDR3;
5) ZIL11: SGESLSNYYAQ(서열번호 34)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 35)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSDTIV(서열번호 36)의 VL-CDR3;
6) ZIL69: SGESLNKYYAQ(서열번호 40)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 41)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSETNV(서열번호 42)의 VL-CDR3;
7) ZIL94: GLNSGSVSTSNYPG(서열번호 46)의 VL-CDR1, DTGSRPS(서열번호 47)의 VL-CDR2, 및 SLYTDSDILV(서열번호 48)의 VL-CDR3;
8) ZIL154: KASQSLLHSDGNTYLD(서열번호 52)의 VL-CDR1, KVSNRDP(서열번호 53)의 VL-CDR2, 및 MQAIHFPLT(서열번호 54)의 VL-CDR3;
9) ZIL159: SGETLNRFYTQ(서열번호 58)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 59)의 VL-CDR2, 및 KSAVSIDVGV(서열번호 60)의 VL-CDR3;
10) ZIL171: SGKSLSYYYAQ(서열번호 64)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 65)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSDTIV(서열번호 66)의 VL-CDR3;
11) 04H07: KSSQSLLYSINQKNHLA(서열번호 203)의 VL-CDR1, WASTRES(서열번호 204)의 VL-CDR2, 및 QQGYTYPFT(서열번호 205)의 VL-CDR3;
12) 06A09: KSSQSLLYSINQKNFLA(서열번호 209)의 VL-CDR1, WASTRES(서열번호 210)의 VL-CDR2, QQHYGYPFT(서열번호 211)의 VL-CDR3; 또는
13) VL CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 각각의 모 항체 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159, ZIL171, 04H07 또는 06A09의 CDR과 상이한 1) 내지 12)의 변이체.
본 발명은 추가로 상기 기재된 핵산의 적어도 하나를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 또한 고양잇과 항체의 일관성 및/또는 품질의 개선 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법을 제공한다: 숙주 세포에서 고양잇과 IgG 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 고양잇과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 발현시켜 고양잇과 항체를 생산하는 단계로서, 고양잇과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 야생형 고양잇과 IgG 카파 경쇄 불변 영역에서라면 존재할 C-말단 QRE 서열을 인코딩하는 서열이 변형되고/거나 결실되는 카파 경쇄 불변 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단계. 그와 같은 변형은, 예를 들어, c-말단에 대한 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환, 또는 부가가 발생하도록 뉴클레오타이드 서열에 대한 변형을 포함할 수 있다.
구현예에서, 고양잇과 항체의 일관성 및/또는 품질의 개선 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 고양잇과 항체의 야생형 고양잇과 IgG 카파 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 단계로서, 상기 야생형 고양잇과 카파 경쇄 불변 영역이 QRE의 C-말단 아미노산 서열을 포함하는, 단계;
b) a)로부터의 뉴클레오타이드 서열에서 C-말단 QRE를 인코딩하는 서열을 제거하고/거나 변형시켜 수정된 카파 경쇄 불변 뉴클레오타이드 서열을 형성하는 단계;
c) b)로부터의 수정된 카파 경쇄 불변 뉴클레오타이드 서열을 고양잇과 IgG 카파 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 조합시켜 완전 고양잇과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 형성하는 단계; 및
d) 숙주 세포에서 고양잇과 IgG 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 c)로부터의 완전 고양잇과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 발현시켜 야생형 고양잇과 IgG 카파 경쇄 불변 영역에서라면 존재할 C-말단 QRE 서열이 변형되고/거나 결실되는 고양잇과 항체를 생산하는 단계.
일 구현예에서, 고양잇과 항체의 일관성 및/또는 품질의 개선은 자유 IgG 카파 경쇄의 수준을 감소시켜, 그것에 의하여 온전한 고양잇과 IgG 항체 단량체의 백분율을 증가시키는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 고양잇과 IgG 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 고양잇과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 동일 벡터 상에서 운반된다. 또 다른 구현예에서, 고양잇과 IgG 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 고양잇과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 별도 벡터 상에서 운반된다.
고양잇과 항체의 일관성 및/또는 품질의 개선 방법의 구현예에서, 고양잇과 항체는 사이토카인 및/또는 성장 인자-매개된 장애에서 관여된 표적에 특이적으로 결합한다. 일 특정 구현예에서, 고양잇과 항체는 고양잇과 IL-31 또는 고양잇과 NGF에 특이적으로 결합한다.
일 구현예에서, 고양잇과 항체는 하기 서열을 갖는 카파 경쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 포함한다. 그와 같은 변이체는, 예를 들어, 서열번호 186의 c-말단에 대한 하나 이상의 아미노산 잔기(들)의 부가 또는 변형을 포함할 수 있다:
RSDAQPSVFLFQPSLDELHTGSASIVCILNDFYPKEVNVKWKVDGVVQNKGIQESTTEQNSKDSTYSLSSTLTMSSTEYQSHEKFSCEVTHKSLASTLVKSFQRSEC(서열번호 186).
본 발명은 추가로 갯과 항체의 일관성 및/또는 품질의 개선 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법을 제공한다: 숙주 세포에서 갯과 IgG 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 갯과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 발현시켜 갯과 항체를 형성하는 단계로서, 갯과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 야생형 갯과 IgG 카파 경쇄(갯과 LC 카파 wt, 서열번호 194) 불변 영역에서라면 존재할 C-말단 QRVD 서열을 인코딩하는 서열이 변형되고/거나 결실되는 카파 경쇄 불변 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단계. 그와 같은 변형은, 예를 들어, c-말단에 대한 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환, 또는 부가가 발생하도록 뉴클레오타이드 서열에 대한 변형을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 갯과 항체의 일관성 및/또는 품질의 개선 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 갯과 항체의 야생형 갯과 IgG 카파 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 단계로서, 상기 야생형 갯과 카파 경쇄 불변 영역이 QRVD의 C-말단 아미노산 서열을 포함하는, 단계;
b) a)로부터의 뉴클레오타이드 서열에서 C-말단 QRVD를 인코딩하는 서열을 제거하고/거나 변형시켜 수정된 카파 경쇄 불변 뉴클레오타이드 서열을 형성하는 단계;
c) b)로부터의 수정된 카파 경쇄 불변 뉴클레오타이드 서열을 갯과 IgG 카파 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 조합시켜 완전 갯과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 형성하는 단계; 및
d) 숙주 세포에서 갯과 IgG 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 c)로부터의 완전 갯과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 발현시켜 야생형 갯과 IgG 카파 경쇄 불변 영역에서라면 존재할 C-말단 QRVD 서열이 변형되고/거나 결실되는 갯과 항체를 생산하는 단계.
일 구현예에서, 갯과 항체의 일관성 및/또는 품질 개선은 자유 IgG 카파 경쇄의 수준을 감소시켜, 그것에 의하여 온전한 갯과 IgG 항체 단량체의 백분율을 증가시키는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 갯과 IgG 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 갯과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 동일 벡터 상에서 운반된다. 또 다른 구현예에서, 갯과 IgG 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 갯과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 별도 벡터 상에서 운반된다.
갯과 항체의 일관성 및/또는 품질의 개선 방법의 일 구현예에서, 갯과 항체는 사이토카인 및/또는 성장 인자-매개된 장애에서 관여된 표적에 특이적으로 결합한다. 일 특정 구현예에서, 갯과 항체는 갯과 IL-31에 특이적으로 결합한다.
갯과 항체의 일관성 및/또는 품질의 개선 방법의 일 구현예에서, 갯과 항체는 하기 서열을 갖는 카파 경쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 포함한다. 그와 같은 변이체는, 예를 들어, 서열번호 179의 c-말단에 대한 하나 이상의 아미노산 잔기(들)의 부가 또는 변형을 포함할 수 있다:
RNDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASVVCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSEC(서열번호 179).
본원에 기재된 수정된 카파 경쇄 불변 영역은, 예컨대, 비제한적으로, 본 발명의 명세서 및 청구항에서 기재된 임의의 갯과 또는 고양잇과 항체를 포함하는, 임의의 수의 고양잇과 및 갯과 항체와 함께 사용될 수 있다. IL-31 이외의 표적을 갖는 갯과 및 고양잇과 항체는 또한 본원에 개시된 수정된 카파 경쇄 불변 영역과 적합하게 조합되도록 구상된다. 본 발명은 그와 같은 항체가 본 명세서 및 청구항에서 본 개시내용에 기반하여 개선된 일관성 및/또는 품질을 갖는다고 합리적으로 예상되기 때문에 본원에 개시된 그와 같은 수정된 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 임의의 고양잇과 또는 갯과 항체를 포함한다.
도 1은 상이한 종으로부터의 IL-31 사이 아미노산 서열 보존을 도시하는 정렬이다. 특히, 서열번호 155(갯과 IL-31), 서열번호 157(고양잇과 IL-31), 서열번호 165(말과 IL-31), 및 서열번호 181(인간 IL-31) 사이의 비교는 도시된다. 갯과, 고양잇과, 말 및 인간 IL-31 사이 퍼센트 아미노산 서열 동일성은 또한 표시된다.
도 2는 마우스 기원으로부터 유래된 CDR을 가진 후보 항체가 Biacore 시스템에서 표면 플라즈몬 공명(SPR)(Biacore Life Sciences(GE Healthcare), Uppsala, Sweden)을 사용하여 고양잇과 및 갯과 IL-31을 결합시키는 친화도를 상세히 설명한다.
도 3은 갯과 및 고양잇과 세포 검정에 의해 측정된 경우 마우스 기원으로부터 유래된 CDR을 가진 후보 항체의 효능(IC50(μg/ml))을 도시하는 표이다. 특히, 후보 항체는 갯과 DH-82 또는 고양잇과 FCWF4 대식세포-유사 세포에서 IL-31-매개된 STAT 인산화를 억제시키는 그들의 능력에 대하여 평가되었다.
도 4는 간접 ELISA 및 Biacore 방법 둘 모두를 사용하여 다양한 단백질에 대한 개 기원의 CDR을 가진 후보 단클론성 항체의 결합에 대하여 수득된 결과를 도시한다. 간접 ELISA로, 단클론성 항체 15H05 에피토프 영역에서 돌연변이를 가졌던 고양잇과 IL-31 15H05 돌연변이체 및 야생형 고양잇과 IL-31에 대한 결합(ELISA OD)이 평가되었다. 결합을 확증하기 위해, 비아코어(biacore) 분석은 표면으로서 갯과, 고양잇과, 말과, 인간, 고양잇과 15H05 돌연변이체, 및 고양잇과 11E12 돌연변이체 IL-31 단백질 그리고 항체의 단일 시험 농도를 사용하여 수행되었다. 고양잇과 IL-31 11E12 돌연변이체는 단클론성 항체 11E12 에피토프 영역에서 돌연변이를 가졌다.
도 5: 도 5a는 Can_11E12_VL_cUn_1(서열번호 182) 및 CAN_11E12_VL_cUn_FW2(서열번호 184)로서 지정된 이전에 개시된 개화된 11E12 서열을 FEL_11E12_VL1(서열번호 113) 및 FEL_11E12_VL1_FW2(서열번호 117)로서 지정된 고양이화된 버젼과 비교하는 마우스 항체 11E12 VL 서열(서열번호 73)의 정렬을 도시한다. 도 5a에서 정렬 아래 주목된 것은 IL-31 단백질에 이러한 항체의 친화도를 회복하는 데 필요하였던 Fel_11E12_VL1에 대한 관련 변화의 위치를 도시하는 점이다. 도 5b는 FEI_15H05_VL1(서열번호 127) 및 FEI_15H05_VL_FW2(서열번호 135)로서 본원에 지정된 고양이화된 15H05 VL 서열과 MU_15H05_VL(서열번호 69)로서 본원에 지정된 마우스 항체 15H05 VL 서열의 정렬을 도시한다. 도 5b에서 정렬 아래 점은 이러한 항체의 마우스 및 키메라 형태와 비교된 경우 갯과 및 고양잇과 IL-31에 이의 친화도를 회복, 뿐만 아니라 개선하는 데 요구되었던 고양이화된 15H05 VL(Fel_15H05_VL1)에 대한 필요한 변화를 표시한다.
도 6: 도 6a는 알라닌 치환이 발생하는 위치를 강조하는 돌연변이체 15H05(서열번호 163) 및 11E12(서열번호 161)와 야생형 고양잇과 IL-31(서열번호 157)의 정렬을 도시한다. 도 6b는 항체 11E12(부위 1) 및 15H05(부위 2)의 결합에 관여된 2개 아미노산의 위치를 강조하는 고양잇과 IL-31 상동성 모델을 도시한다. 도 6c는 야생형 및 이들 돌연변이체가 코팅 항원으로서 사용되는 경우 야생형 고양잇과 IL-31에 대한 그리고 돌연변이체 IL-31 단백질 15H05(서열번호 163) 및 11E12(서열번호 161)에 대한 단클론성 항체 11E12 및 15H05의 결합에 대하여 수득된 결과를 도시하는 그래프이다.
도 7은 Biacore를 사용하여 mAb 15H05 및 11E12의 경쟁 결합 평가를 도시하는 그래프이다. 도 7a는 갯과 IL-31에 대한 마우스 15H05 및 11E12 항체용 경쟁 결합 데이터를 도시한다. 도 7b는 고양잇과 IL-31 표면에서 항체 15H05 및 11E12용 경쟁 결합 데이터를 도시한다.
도 8은 야생형 및 이들 돌연변이체가 코팅 항원으로서 사용되는 경우 야생형 고양잇과 IL-31에 대한 그리고 돌연변이체 IL-31 단백질 15H05(서열번호 163) 및 11E12(서열번호 161)에 대한 OSMR 및 IL-31Ra의 개별 수용체 서브유닛의 결합에 대하여 수득된 결과를 도시하는 그래프이다.
도 9는 고양이의 IL-31 유도된 소양증 모델에서 마우스:고양잇과 11E12 키메라, 마우스:고양잇과 15H05 키메라, 및 고양이화된 11E12(고양잇과 11E12 1.1)의 예비 효능을 도시하는 그래프이다.
도 10은 고양이 소양증 도전 모델에서 고양이화된 15H05 항 IL-31 항체 일명 ZTS-361의 효능의 생체내 평가를 도시하는 그래프이다. 도 10a는 그룹 T02에 항체 투여의 날인 0 일째와 -7 일째 내지 28 일째의 T01 비히클 위약 및 T02 항체 ZTS-361 그룹에 대한 기준선 사전-도전 소양성 행동을 도시한다. 도 10b는 비히클 위약 대조군과 비교된 경우 IL-31 도전 이후 7 일째(p < 0.0001), 21 일째(p < 0.0027), 및 28 일째(p < 0.0238)에 관찰된 소양증에서 상당한 감소를 입증하는 항체 ZTS-361의 효능을 도시한다.
도 11: 도 11a는 정상 실험실에 비교하여 아토피성 및 알레르기성 피부염을 가진 개들 중에 의뢰인 소유 동물에서 IL-31의 혈장 수준을 도시하는 그래프이다 도 11b는 미국에서 몇몇 상이한 지리적 영역으로부터 알레르기성 피부염(AD)의 추정 진단이 있는 고양이에서 혈청 IL-31 수준을 결정하기 위한 최근 연구의 결과를 도시하는 그래프이다. 도 11c는 1.75 μg/kg 갯과 IL-31의 피하 용량의 투여 이후 개들에서 갯과 IL-31의 약동학적 프로파일을 도시하는 그래프이다.
도 12는 ZTS-361인 레인 1을 비교하는 4-12% 비-환원 SDS PAGE를 도시하고, 이에 대한 중쇄는 고양잇과 IgG 중쇄 불변(서열번호 173; 고양잇과_HC_대립유전자A_1)과 조합된 (서열번호 121; FEL_15H05_VH1)이다. ZTS-361에 대하여, 경쇄는 고양잇과 IgG 경쇄 불변(서열번호 175; 고양잇과_LC_카파_G_마이너스)과 조합된 (서열번호 135; FEL-15H05-VL1_FW2)이다. 레인 2는 마우스 15H05이고, 이에 대한 중쇄는 마우스 IgG 중쇄 불변(서열번호 188; 마우스_HC_IgG1)과 조합된 (서열번호 67; MU_15H05_VH)이다. 마우스 15H05에 대하여, 경쇄는 마우스 IgG 경쇄 불변(서열번호 190; 마우스_LC_카파)과 조합된 (서열번호 69; F MU_15H05_VL)이다. 온전한은 약 150 kDa의 예상된 분자량을 가진 쇄간 디설파이드 결합에 의해 결합된 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄가 있는 IgG를 지칭한다. HHL은 "중 중 경"을 지칭하고 약 125 kDa의 예상된 분자량 및 1개의 경쇄 누락을 가진 IgG이다. HH는 "중 중"을 지칭하고 약 100 kDa의 예상된 분자량 및 두 경쇄 누락을 가진 IgG이다. HL은 "중 경"을 지칭하고 약 75 kDa의 예상된 분자량 및 1개의 중쇄와 1개의 경쇄를 가진 IgG이다. L은 "경"을 지칭하고, 자유 경쇄로서 본원에 또한 지칭된, 약 25 kDa의 예상된 분자량 및 1개의 경쇄를 가진 IgG이다.
도 13: 도 13A는 (상기 각각 기재된) ZTS-361 또는 마우스 15H05를 발현시키는 안정한 세포주로부터 IgG를 비교하는 비-환원 모세관 겔 전기영동(NR-CGE)에 대한 결과를 도시한다. 퍼센트 단량체 및 아종은 도 13B에서 전기영동도로서 도시된 NR-CGE를 사용하여 실험 결과로부터 계산된다. 시간 보정 면적(TCA)은 이동 시간에 의해 분할된 계기 결과로부터의 개별 피크 면적으로서 정의된다. 총 TCA는 0.3% 초과 또는 상당의 모든 피크에 대하여 TCA들의 합계로서 정의된다. 퍼센트 단량체 온전한 IgG(%단량체) 및 개별 단편(%HHL 및 %L)은 총 TCA의 퍼센트로서 그들의 개별 TCA들에 기반하여 계산된다. % 단편은 온전한 IgG의 것보다 더 적은 분자량을 가지고 이동하는 모든 피크 면적의 합계이다.
도 14: 도 14a는 (실시예 섹션의 섹션 1.9에서 그리고 상기 기재된) ZTS-361의 개별 안정한 CHO 클론으로부터 IgG를 비교하는 4-12% 비-환원 SDS PAGE를 도시한다. 레인 1 및 8은 비교용 IgG 참고 표준이다. 퍼센트 단량체는 BioRad VersaDoc 소프트웨어를 사용하여 약 150 kDa의 예상된 분자량으로 이동하는 각 밴드의 밀도계 분석으로부터 계산된다. %단편은 더 적은 분자량을 가진 개별 밴드의 합계이다. 도 14b는 ZTS-361의 개별 안정한 CHO 클론으로부터 IgG를 비교하는 비-환원 모세관 겔 전기영동(NR-CGE)에 대한 결과를 도시한다. 시간 보정 면적(TCA)은 이동 시간에 의해 분할된 계기 결과로부터 개별 피크 면적으로서 정의된다. 총 TCA는 0.3% 초과 또는 상당의 모든 피크에 대하여 TCA의 합계로서 정의된다. 퍼센트 단량체 온전한 IgG(%단량체) 및 퍼센트 단편(% 단편)은 총 TCA의 퍼센트로서 그들의 개별 TCA에 기반하여 계산된다. % 단편은 온전한 IgG의 것보다 더 적은 분자량으로 이동하는 모든 피크 면적의 합계이다.
도 15는 묘사된 종에 대하여 Ig 카파 경쇄 불변 단백질의 c-말단 단부 상의 아미노산을 도시한다. 갯과 LC 카파 wt, 묘사된 C-말단 아미노산 잔기는 서열번호 194의 103 내지 109 위치이고, 묘사된 뉴클레오타이드 잔기 번호는 서열번호 195의 잔기 번호 307 내지 330이고; 고양잇과 LC 카파 G 마이너스(G-), 묘사된 C-말단 아미노산 잔기는 서열번호 175의 105 내지 110 위치이고, 묘사된 뉴클레오타이드 잔기 번호는 서열번호 176의 잔기 번호 313 내지 330이고; 돼지 LC 카파, 묘사된 C-말단 아미노산 잔기는 서열번호 196의 104 내지 108 위치이고, 묘사된 뉴클레오타이드 잔기 번호는 서열번호 197의 잔기 번호 310 내지 327이고; 밍크 LC 카파, 묘사된 C-말단 아미노산 잔기는 서열번호 198의 105 내지 108 위치이고, 묘사된 뉴클레오타이드 잔기 번호는 서열번호 199의 잔기 번호 313 내지 327이고; 인간 LC 카파, 묘사된 C-말단 아미노산 잔기는 서열번호 192의 102 내지 106 위치이고, 묘사된 뉴클레오타이드 잔기 번호는 서열번호 193의 잔기 번호 304 내지 321이고; 마우스 LC 카파, 묘사된 C-말단 아미노산 잔기는 서열번호 190의 102 내지 106 위치이고, 묘사된 뉴클레오타이드 잔기 번호는 서열번호 191의 잔기 번호 304 내지 321이다. 회색 직사각형은 온전한 항체에 필요한 IgG 불변 중쇄와 쇄간 디설파이드 결합을 형성하는 c-말단 시스테인의 위치에 윤곽을 그린다. 회색 직사각형은 갯과, 고양잇과, 및 돼지(Arun 등. 1996 Zentralbl Veterinarmed. Nov; 43(9):573-6), 밍크(Bovkun 등. 1993 Eur J Immunol. Aug; 23(8):1929-34), 마우스(Woloschak 등. 1987 Mol Immunol. Jul; 24(7):751-7), 인간(Barandun 등. 1976 Blood. Jan; 47(1):79-89)에 따라 묘사된 종으로부터 IgG에 의한 카파 경쇄 활용의 증가하는 백분율을 강조한다. 밝은 회색으로 묘사된 뉴클레오타이드는 그 위치에서 단일 뉴클레오타이드 변화가 정지 코돈을 초래할 그들 코돈을 강조한다.
도 16: 도 16A는 예상된 디설파이드간 및 디설파이드내 결합의 상대 위치를 강조하는 고양잇과 IgG의 픽토랄 표현이다. CYS15, 묘사된 아미노산 잔기는 고양잇과 HC 대립유전자A wt(서열번호 171) 및 고양잇과 HC 대립유전자A 1(서열번호 173)의 15 위치이고, 묘사된 뉴클레오타이드 잔기 번호는 고양잇과 HC 대립유전자A wt(서열번호 172)의 잔기 번호 43-45 및 고양잇과 HC 대립유전자A 1(서열번호 174)의 43-45 각각이다. CYS107, 묘사된 아미노산 잔기는 고양잇과 LC 카파 G 마이너스(서열번호 175)의 107 위치이고, 묘사된 뉴클레오타이드 잔기 번호는 고양잇과 LC 카파 G 마이너스(서열번호 176)의 잔기 번호 319-321이다. 도 16B는 상기 기재된 CYS15 및 CYS107의 위치를 강조하는 ZTS-361의 상동성 모델이다. 도 16C는 고양잇과 중쇄 및 경쇄의 쇄간 짝짓기를 책임지는 2개 시스테인의 위치를 재차 강조하는 16b에서 둘러싼 영역의 확대된 그림이다. 묘사된 와이어 표면 쉘은 고양잇과 LC 카파 G-에 대하여 도 15에서 기재된 CYS107을 바로 뒤따르는 카파 경쇄 불변 잔기 QRE에 대하여 계산된 정전기 기여이다.
도 17: 도 17a는 (실시예 섹션의 섹션 1.9에서 및/또는 상기 기재된) 항체 ZTS-361 및 ZTS-1505를 생산하는 안정한 CHO 세포주를 창출하는 데 사용되는 중쇄 및 경쇄에 상응하는 서열 ID 수를 기재한다. 강조되는 것은 고양잇과 LC 카파 G 마이너스 QRE 마이너스(서열번호 186)이고, 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 고양잇과 LC 카파 G 마이너스 QRE 마이너스(서열번호 187)이다. 도 17b는 ZTS-1505의 개별 안정한 CHO 클론으로부터 IgG를 비교하는 비-환원 모세관 겔 전기영동(NR-CGE)에 대한 결과를 도시한다. 시간 보정 면적(TCA)은 이동 시간에 의해 분할된 계기 결과로부터 개별 피크 면적으로서 정의된다. 총 TCA는 0.3% 초과 또는 상당의 모든 피크에 대한 TCA의 합계로서 정의된다. 퍼센트 단량체 온전한 IgG(%단량체) 및 퍼센트 단편(% 단편)은 총 TCA의 퍼센트로서 그들의 개별 TCA에 기반하여 계산된다. % 단편은 온전한 IgG의 것보다 더 적은 분자량으로 이동하는 모든 피크 면적의 합계이다. 도 17c는 ZTS-1505를 생산하는 단일 안정한 CHO 클론에 비교된 항체 ZTS-361을 생산하는 단일 안정한 CHO 클론의 비교를 도시한다. 2개의 안정한 클론의 비교는 A 내지 G 표지화된 8개의 독립 배양 조건에 걸쳐서 실시되었다. 14 일의 배양 이후 각 배양의 퍼센트 생존력은 표시된다. 역가는 각각의 배양 조건 하에서 각 안정한 클론에 의한 14 일의 배양 후 생산된 항체의 양을 표시한다. 다양한 배양 조건을 사용하여 성장된 각 클론에서 NR-CGE로부터 계산된 퍼센트 단량체는 표시된다.
도 18: 도 18a는 ClustallW 소프트웨어를 사용하여 계산된 항 IL-31에 대한 이들 항-고양잇과 NGF 항체의 가변 영역들을 비교하는 퍼센트 동일성을 도시한다. 도 18b 및 18c는 박스로 윤곽이 그려진 CDR을 가진 항-고양잇과 IL-31 및 NGF 항체 가변 중쇄 및 경쇄 각각의 정렬을 도시한다.
도 19는 변형된 카파 불변 C-말단과 함께 그리고 상기 없이 항-고양잇과 IL-31 및 항-고양잇과 NGF 항체들을 비교하는 NR CGE로부터 결과를 도시한다.
도 20은 고양잇과 내지 말과 IL-31의 ClustallW 서열 정렬을 도시한다.
도 21은 ClustallW를 사용하여 마우스 항체 15H05에 비교된 항체 04H07 및 06A09의 가변 중쇄(도 21a) 및 경쇄(도 21b)의 정렬을 도시한다. 비교로, 6개 CDR들 각각의 위치는 박스로 윤곽이 그려진다.
도 22는 알라닌 치환된 CDR 돌연변이체의 스크리닝에 대하여 반응의 역치를 정의하는 데 사용되는 항-IL31 항체 ZTS-1505 +/-3 표준 편차의 평균 프로파일을 도시하는 Biacore Sensorgram이다.
도 23은 야생형 항체에 대한 IL-31-매개된 pSTAT 신호전달 억제 및 빈딩기(bindingi)를 비교하는 항체 ZTS-1505의 중쇄 CDR의 알라닌 치환 돌연변이유발의 결과를 도시한다.
도 24는 야생형 항체에 대한 IL-31-매개된 pSTAT 신호전달 억제 및 빈딩기를 비교하는 항체 ZTS-1505의 경쇄 CDR의 알라닌 치환 돌연변이유발의 결과를 도시한다.
도 25: 도 25a 및 25b는 ZTS-5864 및 ZTS-5865로서 본원에 지정된 2개 고양이화된 항체의 결합 친화도 및 세포 효능, 각각을 도시한다.
도 26은 고양이 소양증 도전 모델에서 고양이화된 ZTS-5864 항-IL-31 항체의 효능의 생체내 평가의 결과가 묘사된 그래프이다.
도 12, 13, 및 14에서 기재된 항체는 도 17c로부터의 배양 조건 A와 동등한 배양 조건에서 성장되었다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1은 MU_15H05_VH_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR1이고;
서열번호 2는 MU_15H05_VH_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR2이고;
서열번호 3은 MU_15H05_VH_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR3이고;
서열번호 4는 MU_15H05_VL_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR1이고;
서열번호 5는 MU_15H05_VL_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR2이고;
서열번호 6은 MU_15H05_VL_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR3이고;
서열번호 7은 11E12-VH-CDR1로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR1이고;
서열번호 8은 11E12-VH-CDR2로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR2이고;
서열번호 9는 11E12-VH-CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR3이고;
서열번호 10은 11E12-VL-CDR1로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR1이고;
서열번호 11은 11E12-VL-CDR2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR2이고;
서열번호 12는 11E12-VL-CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR3이고;
서열번호 13은 CAN_ZIL1_VH_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR1이고;
서열번호 14는 CAN_ZIL1_VH_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR2이고;
서열번호 15는 CAN_ZIL1_VH_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR3이고;
서열번호 16은 CAN_ZIL1_VL_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR1이고;
서열번호 17은 CAN_ZIL1_VL_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR2이고;
서열번호 18은 CAN_ZIL1_VL_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR3이고;
서열번호 19는 CAN_ZIL8_VH_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR1이고;
서열번호 20은 CAN_ZIL8_VH_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR2이고;
서열번호 21은 CAN_ZIL8_VH_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR3이고;
서열번호 22는 CAN_ZIL8_VL_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR1이고;
서열번호 23은 CAN_ZIL8_VL_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR2이고;
서열번호 24는 CAN_ZIL8_VL_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR3이고;
서열번호 25는 CAN_ZIL9_VH_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR1이고;
서열번호 26은 CAN_ZIL9_VH_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR2이고;
서열번호 27은 CAN_ZIL9_VH_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR3이고;
서열번호 28은 CAN_ZIL9_VL_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR1이고;
서열번호 29는 CAN_ZIL9_VL_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR2이고;
서열번호 30은 CAN_ZIL9_VL_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR3이고;
서열번호 31은 CAN_ZIL11_VH_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR1이고;
서열번호 32는 CAN_ZIL11_VH_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR2이고;
서열번호 33은 CAN_ZIL11_VH_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR3이고;
서열번호 34는 CAN_ZIL11_VL_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR1이고;
서열번호 35는 CAN_ZIL11_VL_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR2이고;
서열번호 36은 CAN_ZIL11_VL_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR3이고;
서열번호 37은 CAN_ZIL69_VH_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR1이고;
서열번호 38은 CAN_ZIL69_VH_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR2이고;
서열번호 39는 CAN_ZIL69_VH_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR3이고;
서열번호 40은 CAN_ZIL69_VL_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR1이고;
서열번호 41은 CAN_ZIL69_VL_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR2이고;
서열번호 42는 CAN_ZIL69_VL_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR3이고;
서열번호 43은 CAN_ZIL94_VH_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR1이고;
서열번호 44는 CAN_ZIL94_VH_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR2이고;
서열번호 45는 CAN_ZIL94_VH_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR3이고;
서열번호 46은 CAN_ZIL94_VL_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR1이고;
서열번호 47은 CAN_ZIL94_VL_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR2이고;
서열번호 48은 CAN_ZIL94_VL_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR3이고;
서열번호 49는 CAN_ZIL154_VH_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR1이고;
서열번호 50은 CAN_ZIL154_VH_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR2이고;
서열번호 51은 CAN_ZIL154_VH_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR3이고;
서열번호 52는 CAN_ZIL154_VL_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR1이고;
서열번호 53은 CAN_ZIL154_VL_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR2이고;
서열번호 54는 CAN_ZIL154_VL_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR3이고;
서열번호 55는 CAN_ZIL159_VH_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR1이고;
서열번호 56은 CAN_ZIL159_VH_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR2이고;
서열번호 57은 CAN_ZIL159_VH_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR3이고;
서열번호 58은 CAN_ZIL159_VL_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR1이고;
서열번호 59는 CAN_ZIL159_VL_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR2이고;
서열번호 60은 CAN_ZIL159_VL_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR3이고;
서열번호 61은 CAN_ZIL171_VH_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR1이고;
서열번호 62는 CAN_ZIL171_VH_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR2이고;
서열번호 63은 CAN_ZIL171_VH_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR3이고;
서열번호 64는 CAN_ZIL171_VL_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR1이고;
서열번호 65는 CAN_ZIL171_VL_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR2이고;
서열번호 66은 CAN_ZIL171_VL_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR3이고;
서열번호 67은 MU_15H05_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄이고;
서열번호 68은 MU_15H05_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 69는 MU_15H05_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 70은 MU_15H05_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 71은 MU-11E12-VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄이고;
서열번호 72는 MU-11E12-VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 73은 MU-11E12-VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 74는 MU-11E12-VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 75는 CAN-ZIL1_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄이고;
서열번호 76은 CAN-ZIL1_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 77은 CAN-ZIL1_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 78은 CAN-ZIL1_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 79는 CAN-ZIL8_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄이고;
서열번호 80은 CAN-ZIL8_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 81은 CAN-ZIL8_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 82는 CAN-ZIL8_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 83은 CAN-ZIL9_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄이고;
서열번호 84는 CAN-ZIL9_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 85는 CAN-ZIL9_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 86은 CAN-ZIL9_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 87은 CAN-ZIL11_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄이고;
서열번호 88은 CAN-ZIL11_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 89는 CAN-ZIL11_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 90은 CAN-ZIL11_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 91은 CAN-ZIL69_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄이고;
서열번호 92는 CAN-ZIL69_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 93은 CAN-ZIL69_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 94는 CAN-ZIL69_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 95는 CAN-ZIL94_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄이고;
서열번호 96은 CAN-ZIL94_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 97은 CAN-ZIL94_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 98은 CAN-ZIL94_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 99는 CAN-ZIL154_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄이고;
서열번호 100은 CAN-ZIL154_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 101은 CAN-ZIL154_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 102는 CAN-ZIL154_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 103은 CAN-ZIL159_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄이고;
서열번호 104는 CAN-ZIL159_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 105는 CAN-ZIL159_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 106은 CAN-ZIL159_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 107은 CAN-ZIL171_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄이고;
서열번호 108은 CAN-ZIL171_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 109는 CAN-ZIL171_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 110은 CAN-ZIL171_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 111은 FEL_11E12_VH1로서 본원에 지칭된 가변 중쇄이고;
서열번호 112는 FEL_11E12_VH1로서 본원에 지칭된 가변 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 113은 FEL_11E12_VL1로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 114는 FEL_11E12_VL1로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 115는 FEL_11E12_VL2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 116은 FEL_11E12_VL2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 117은 FEL_11E12_VL1_FW2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 118은 FEL_11E12_VL1_FW2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 119는 FEL_11E12_VL1_K46Q로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 120은 FEL_11E12_VL1_K46Q로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 121은 FEL_15H05_VH1로서 본원에 지칭된 가변 중쇄이고;
서열번호 122는 FEL_15H05_VH1로서 본원에 지칭된 가변 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 123은 FEL_15H05_VH2로서 본원에 지칭된 가변 중쇄이고;
서열번호 124는 FEL_15H05_VH2로서 본원에 지칭된 가변 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 125는 FEL_15H05_VH3으로서 본원에 지칭된 가변 중쇄이고;
서열번호 126은 FEL_15H05_VH3으로서 본원에 지칭된 가변 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 127은 FEL_15H05_VL1로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 128은 FEL_15H05_VL1로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 129는 FEL_15H05_VL2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 130은 FEL_15H05_VL2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 131은 FEL_15H05_VL3으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 132는 FEL_15H05_VL3으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 133은 FEL_15H05_VL1_FW1로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 134는 FEL_15H05_VL1_FW1로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 135는 FEL_15H05_VL1_FW2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 136은 FEL_15H05_VL1_FW2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 137은 FEL_15H05_VL1_FW3으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 138은 FEL_15H05_VL1_FW3으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 139는 FEL_15H05_VL1_FW1_FW2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 140은 FEL_15H05_VL1_FW1_FW2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 141은 FEL_15H05_VL1_FW1_FW3으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 142는 FEL_15H05_VL1_FW1_FW3으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 143은 FEL_15H05_VL1_FW2_FW3으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 144는 FEL_15H05_VL1_FW2_FW3으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 145는 FEL_15H05_VL1_FW2_K42N으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 146은 FEL_15H05_VL1_FW2_K42N으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 147은 FEL_15H05_VL1_FW2_V43I로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 148은 FEL_15H05_VL1_FW2_V43I로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 149는 FEL_15H05_VL1_FW2_L46V로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 150은 FEL_15H05_VL1_FW2_L46V로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 151은 FEL_15H05_VL1_FW2_Y49N으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 152는 FEL_15H05_VL1_FW2_Y49N으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 153은 FEL_15H05_VL1_FW2_K42N_V43I로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 154는 FEL_15H05_VL1_FW2_K42N_V43I로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 155는 갯과_IL31로서 본원에 지칭된 갯과 IL-31 단백질의 아미노산 서열이고;
서열번호 156은 갯과_IL31로서 본원에 지칭된 갯과 IL-31 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 157은 C-말단 His 태그를 가진 야생형 고양잇과 IL-31 단백질을 표시하는 고양잇과_IL31_야생형으로서 본원에 지칭된 아미노산 서열이고;
서열번호 158은 고양잇과_IL31_야생형으로서 본원에 지칭된 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 159는 N-말단 His 태그를 가진 고양잇과 IL-31 단백질을 표시하는 고양잇과_IL_31_E_콜리로서 본원에 지칭된 아미노산 서열이고;
서열번호 160은 고양잇과_IL_31_E_콜리로서 본원에 지칭된 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 161은 C-말단 His 태그를 가진 돌연변이체 고양잇과 IL-31 11E12 단백질을 표시하는 고양잇과_IL31_11E12_돌연변이체로서 본원에 지칭된 아미노산 서열이고;
서열번호 162는 고양잇과_IL31_11E12_돌연변이체로서 본원에 지칭된 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 163은 C-말단 His 태그를 가진 돌연변이체 고양잇과 IL-31 15H05 단백질을 표시하는 고양잇과_IL31_15H05_돌연변이체로서 본원에 지칭된 아미노산 서열이고;
서열번호 164는 고양잇과_IL31_15H05_돌연변이체로서 본원에 지칭된 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 165는 말과_IL31로서 본원에 지칭된 말과 IL-31 단백질의 아미노산이고;
서열번호 166은 말과_IL31로서 본원에 지칭된 말과 IL-31 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 167은 인간 IgG1 Fc에 융합된 고양잇과 OSMR의 세포외 도메인을 표시하는 고양잇과_OSMR_hIgG1_Fc로서 본원에 지칭된 아미노산 서열이고;
서열번호 168은 고양잇과_OSMR_hIgG1_Fc로서 본원에 지칭된 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 169는 인간 IgG1 Fc에 융합된 고양잇과 IL-31Ra를 표시하는 고양잇과_IL31Ra_HIgG1_Fc_X1_Fn3으로서 본원에 지칭된 아미노산 서열이고;
서열번호 170은 고양잇과_IL31Ra_HIgG1_Fc_X1_Fn3으로서 본원에 지칭된 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 171은 고양잇과_HC_대립유전자A_wt로서 본원에 지칭된 고양잇과 중쇄이고;
서열번호 172는 고양잇과_HC_대립유전자A_wt로서 본원에 지칭된 고양잇과 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 173은, 항체 효과기 기능을 제거하기 위해 알라닌(A)으로 서열번호 171의 야생형 서열의 120, 121, 및 123 위치, 각각에서 M, L, 및 G를 대체하도록 조작된, 고양잇과_HC_대립유전자A_1로서 본원에 지칭된 고양잇과 중쇄이고;
서열번호 174는 고양잇과_HC_대립유전자A_1로서 본원에 지칭된 고양잇과 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 175는, 이 위치에 야생형 고양잇과 카파 경쇄에서 정상적으로 존재하는 N이 Q로 변화되도록 103 위치에서 당화 녹아웃(G-)으로 조작된, 고양잇과_LC_카파_G_마이너스로서 본원에 지칭된 고양잇과 카파 경쇄이고;
서열번호 176은 고양잇과_LC_카파_G_마이너스로서 본원에 지칭된 고양잇과 카파 경쇄의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 177은 갯과_HC_65_1로서 본원에 지칭된 갯과 중쇄이고;
서열번호 178은 갯과_HC_65_1로서 본원에 지칭된 갯과 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 179는 갯과_LC_카파로서 본원에 지칭된 갯과 카파 경쇄이고;
서열번호 180은 갯과_LC_카파로서 본원에 지칭된 갯과 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 181은 인간 IL-31의 아미노산 서열이고;
서열번호 182는 Can_11E12_VL_cUn_1로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 mAb 서열이고;
서열번호 183은 Can_11E12_VL_cUn_1로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 mAb 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 184는 Can_11E12_VL_cUn_FW2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 mAb 서열이고;
서열번호 185는 Can_11E12_VL_cUn_FW2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 mAb 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 186은, i) 이 위치에 야생형 고양잇과 카파 경쇄에서 정상적으로 존재하는 N이 Q로 변화되도록 103 위치에서 당화 녹아웃(G-), 및 ii) 야생형에 비해 C-말단 QRE의 결실로 조작된, 고양잇과_LC_카파_G_마이너스_QRE_마이너스로서 본원에 지칭된 고양잇과 카파 경쇄이고;
서열번호 187은 고양잇과_LC_카파_G_마이너스_QRE_마이너스로서 본원에 지칭된 고양잇과 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 188은 마우스_HC_IgG1로서 본원에 지정된 마우스 중쇄이고;
서열번호 189는 마우스_HC_IgG1로서 본원에 지정된 마우스 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 190은 마우스_LC_카파로서 본원에 지정된 마우스 카파 경쇄이고;
서열번호 191은 마우스_LC_카파로서 본원에 지정된 마우스 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 192는 인간_LC_카파로서 본원에 지정된 인간 카파 경쇄이고;
서열번호 193은 인간_LC_카파로서 본원에 지정된 인간 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 194는 갯과_LC_카파_wt로서 본원에 지정된 야생형 갯과 카파 경쇄이고;
서열번호 195는 갯과_LC_카파_wt로서 본원에 지정된 야생형 갯과 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 196은 돼지_LC_카파로서 본원에 지정된 돼지 카파 경쇄이고;
서열번호 197은 돼지_LC_카파로서 본원에 지정된 돼지 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 198은 밍크_LC_카파로서 본원에 지정된 밍크 카파 경쇄이고;
서열번호 199는 밍크_LC_카파로서 본원에 지정된 밍크 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 200은 Mu_04H07_VH_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR1이고;
서열번호 201은 Mu_04H07_VH_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR2이고;
서열번호 202는 Mu_04H07_VH_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR3이고;
서열번호 203은 Mu_04H07_VL_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR1이고;
서열번호 204는 Mu_04H07_VL_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR2이고;
서열번호 205는 Mu_04H07_VL_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR3이고;
서열번호 206은 Mu_06A09_VH_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR1이고;
서열번호 207은 Mu_06A09_VH_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR2이고;
서열번호 208은 Mu_06A09_VH_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 중쇄 CDR3이고;
서열번호 209는 Mu_06A09_VL_CDR1로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR1이고;
서열번호 210은 Mu_06A09_VL_CDR2로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR2이고;
서열번호 211은 Mu_06A09_VL_CDR3으로서 본원에 지칭된 가변 경쇄 CDR3이고;
서열번호 212는 Mu_04H07_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄이고;
서열번호 213은 Mu_04H07_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 214는 Mu_04H07_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 215는 Mu_04H07_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 216은 Mu_06A09_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄이고;
서열번호 217은 Mu_06A09_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 218은 Mu_06A09_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 219는 Mu_06A09_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 220은 ZTS_768_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄이고;
서열번호 221은 ZTS_768_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 222는 ZTS_768_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 223은 ZTS_768_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 224는 ZTS_943_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄이고;
서열번호 225는 ZTS_943_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 226은 ZTS_943_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 227은 ZTS_943_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 228은 ZTS_5864_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄이고;
서열번호 229는 ZTS_5864_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 230은 ZTS_5864_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 231은 ZTS_5864_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 232는 ZTS_5865_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄이고;
서열번호 233은 ZTS_5865_VH로서 본원에 지칭된 가변 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 234는 ZTS_5865_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄이고;
서열번호 235는 ZTS_5865_VL로서 본원에 지칭된 가변 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 236은 고양잇과_LC_람다로서 본원에 지칭된 고양잇과 카파 경쇄의 아미노산 서열이고;
서열번호 237은 고양잇과_LC_람다로서 본원에 지칭된 고양잇과 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다.
정의
본 발명을 상세히 기재하기 전에, 본 발명의 문맥에서 사용되는 몇몇 용어들은 정의될 것이다. 이들 용어들에 더하여, 나머지는 필요시 명세서에서 다른 곳에 정의된다. 본원에 달리 명확하게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 기술 분야의 용어는 그들의 기술분야 인식된 의미를 가질 것이다.
명세서 및 청구항에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 달리 분명하게 지시하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 예를 들어, "항체" 지칭은 그와 같은 항체의 복수를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이, 기타를 배제하지 않고, 인용된 요소를 포함하는 것을 의미하기 위한 것이다.
에피토프는, 본원에 사용되는 바와 같이, 항체의 CDR에 의해 인식된 항원 결정기를 지칭한다. 다시 말해, 에피토프는 항체에 의해 인식 및 결합될 수 있는 임의의 분자의 그 부분을 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용되는 바와 같이 용어 "에피토프"는 항-IL-31 제제가 반응하는 IL-31의 영역을 지칭한다.
"항원"은 항체에 의해 추가적으로 인식 및 결합될 수 있는 항체에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 부분이다(상응하는 항체 결합 영역은 파라토프로서 지칭될 수 있다). 일반적으로, 에피토프는 분자, 예를 들어, 아미노산 또는 당 측쇄의 화학적 활성 표면 그룹화로 이루어지고, 특정 3차원 구조적 특징 뿐만 아니라 특정 전하 특징을 갖는다. 에피토프는 면역계에 의해 인식되는 단백질에서 항원 결정기이다. 에피토프를 인식하는 면역계의 성분은 항체, T-세포, 및 B-세포이다. T-세포 에피토프는 항원-제시 세포(APC)의 표면에서 디스플레이되고 전형적으로 8-11(MHC 클래스 I) 또는 15 플러스(MHC 클래스 II) 아미노산 길이이다. T-세포에 의해 디스플레이된 MHC-펩타이드 복합체의 인식은 그들의 활성화에 중요하다. 이들 기전은 자가 대 "비-자가" 단백질 예컨대 박테리아 및 바이러스의 적당한 인식을 허용한다. 반드시 연속적이지 않은 독립적 아미노산 잔기는 T-세포 수용체에 의해 갈라진 APC 결합 및 후속 인식과의 상호작용에 기여한다(Janeway, Travers, Walport, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition New York: Garland Science; 2001). 가용성 항체 및 세포 표면 회합된 B-세포 수용체에 의해 인식되는 에피토프는 길이 및 연속의 정도가 매우 다양하다(Sivalingam and Shepherd, Immunol. 2012; 51(3-4): 304-309). 재차 심지어 단백질 서열의 연속 스트레치에서 발견된 에피토프 또는 선형 에피토프는 항체 파라토프 또는 B-세포 수용체와의 접촉의 핵심 포인트를 표시하는 불연속 아미노산을 종종 가질 것이다. 항체 및 B-세포에 의해 인식된 에피토프는 3차원 공간의 단백질에서 접촉의 공통 영역을 포함하는 아미노산으로 입체구조적일 수 있고 단백질의 3차 및 4차 구조적 특성에 의존한다. 이들 잔기는 1차 아미노산 서열의 공간적으로 구별된 영역에서 종종 발견된다.
본원에 사용되는 바와 같이 "미모토프"는 항원의 에피토프를 모방하는 선형 또는 구속 펩타이드이다. 미모토프는 동물에서 획득된 면역학적 반응의 성숙화를 초래하는 B-세포를 결합시키는 데 필요한 3차원 구조 및/또는 T-세포 효과기를 유도할 수 있는 1차 아미노산 서열을 가질 수 있다. 주어진 에피토프 항원용 항체는 그 에피토프를 모방하는 미모토프를 인식할 것이다.
항체 결합의 문맥에서 용어 "특이적으로"는 특이적 항원, 즉, 폴리펩타이드, 또는 에피토프에 대한 항체의 높은 친화력 및/또는 높은 친화도 결합을 지칭한다. 많은 구현예에서, 특이적 항원은 항체-생산 세포가 단리된 동물 숙주를 면역시키는 데 사용되는 항원(또는 항원의 단편 또는 하위단편)이다. 항원을 특이적으로 결합시키는 항체는 다른 항원에 대한 동일 항체의 결합보다 더 강하다. 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체는 약한, 그러나 검출가능한 수준(예를 들면, 관심 폴리펩타이드에 보여진 결합의 10% 이하)에서 다른 폴리펩타이드를 결합시킬 수 있다. 그와 같은 약한 결합, 또는 배경 결합은, 예를 들면 적당한 대조군의 사용에 의해, 대상체 폴리펩타이드에 대한 특이적 항체 결합과 쉽게 구별가능하다. 일반적으로, 특이적 항체는 10-7 M 이하, 예를 들면, 10-8 M 이하(예를 들면, 10-9 M 이하, 10-10 이하, 10-11이하, 10-12 이하, 또는 10-13 이하 등)의 KD를 가진 결합 친화도로 항원에 결합한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 2개 경쇄 및 2개 중쇄를 갖는 온전한 면역글로불린을 지칭한다. 그래서 단일 단리된 항체 또는 단편은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 합성 항체, 재조합 항체, 키메라 항체, 헤테로키메라 항체, 개화된 항체, 고양이화된 항체, 완전 갯과 항체, 완전 고양잇과 항체, 또는 완전 말과 항체일 수 있다. 용어 "항체"는 바람직하게는 단클론성 항체 및 이의 단편, 그리고 IL-31 단백질 및 이의 단편에 결합할 수 있는 이의 면역학적 결합 등가물을 지칭한다. 용어 항체는 동종 분자, 또는 혼합물 예컨대 복수의 상이한 분자 정체성으로 구성된 혈청 산물을 지칭하는 데 모두 사용된다.
"자연 항체" 및 "자연 면역글로불린"은 일반적으로, 2개 동일한 경쇄(L) 및 2개 동일한 중쇄(H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로사량체 당단백질이다. 각 경쇄는 1개의 공유 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 반면 디설파이드 연결의 수는 상이한 면역글로불린 아이소타입의 중쇄 중에서 다양하다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 정기적으로 이격된 쇄내 디설파이드 브릿지를 갖는다. 각 중쇄는 다수의 불변 도메인에 이어서 한쪽 단부에 가변 도메인(VH)을 갖는다. 각 경쇄는 한쪽 단부에 가변 도메인(VL) 및 이의 다른 단부에 불변 도메인을 갖고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인으로 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인으로 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이 계면을 형성한다고 믿어진다.
용어 "항체 단편"은, 제한 없이, 단리된 단일 항체 쇄, Fv 작제물, Fab 작제물, Fc 작제물, 경쇄 가변 또는 상보성 결정 영역(CDR) 서열 등을 포함하는, 온전한 항체 구조보다 적은 것을 지칭한다.
용어 "가변" 영역은 프레임워크 및 (초가변으로서 달리 알려진) CDR을 포함하고 가변 도메인의 특정 부분이 항체 중에 서열에서 광범위하게 상이하고 이의 특정 항원용 각 특정 항체의 결합 및 특이성으로 사용된다는 사실을 지칭한다. 하지만, 가변성은 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 균일하게 분포되지 않는다. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인에서 모두 초가변 영역으로 불리는 3개의 분절에서 농축된다. 가변 도메인의 더욱 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역(FR)으로 불린다. 본래의 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은, 루프 연결을 형성하는, 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, β-시트 입체배치를 주로 채택하는, 그리고 일부 경우에 β-시트 구조의 일부를 형성하는, 다중 FR들을 포함한다. 각각의 쇄에서 초가변 영역은 FR들에 의해 매우 가까이 함께 결합되고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역과, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(참고 Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), pages 647-669). 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접적으로 관여되지 않지만, 다양한 효과기 기능, 예컨대 항체-의존적 세포 독성에서 항체의 참여를 나타낸다.
용어 "초가변 영역"은 본원에 사용되는 경우 항원 결합을 책임지는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(Kabat 등. (1991), 상기) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 그들 잔기(Chothia 및 Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같이 초가변 영역 잔기 이외의 그들 가변 도메인 잔기이다.
항체의 파파인 소화는, 단일 항원-결합 부위, 및 잔류 "Fc" 단편을 각각 갖는, "Fab" 단편으로 불리는, 2개의 동일 항원-결합 단편을 생산하고, 이의 명칭은 쉽게 결정화하는 이의 능력을 반영한다. 펩신 처리는 2개의 항원-조합 부위를 갖고 항원을 여전히 교차-연결할 수 있는 F(ab')2 단편을 산출한다.
"Fv"는 완전 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이러한 영역은 밀집, 비-공유 회합에서 1개 중쇄 및 1개 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 각 가변 도메인의 3개 초가변 영역이 VH-VL 이량체의 표면에서 항원-결합 부위를 정의하도록 상호작용하는 것이 이 입체배치 내에 있다. 집합적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 하지만, 심지어 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 단 3개의 초가변 영역을 포함하는 Fv의 절반)은, 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도에서라도, 항원을 인식 및 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인(들)을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복실 말단에서 소수 잔기의 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 자유 티올 기를 보유하는 Fab'에 대하여 본원에서의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그들 사이 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링은 또한 알려진다.
임의의 척추동물 종으로부터 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는, 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는, 2개의 명확하게 뚜렷한 유형의 하나로 지정될 수 있다.
면역글로불린은 그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 의존하여 상이한 클래스로 지정될 수 있다. 현재 면역글로불린의 5개의 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있고, 이들 중 몇몇은 서브클래스(아이소타입), 예를 들면, (마우스 및 인간 명칭에 의해 정의된 바와 같이) IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 추가로 분할될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤 각각으로 불린다. 면역글로불린의 상이한 클래스의 서브유닛 구조 및 3차원 입체배치는 다중 종에서 잘 알려진다. 이들 불변 도메인과 연관된 개별 아이소타입의 유행 및 기능적 활성은 종-특이적이고 실험적으로 정의되어야 한다.
본원에 정의된 바와 같이 "단클론성 항체"는 세포의 단일 클론(특히, 세포, 예컨대 하이브리도마 세포의 단일 클론)에 의해 생산된 항체이고, 그러므로 항체의 단일 순수 동종 유형이다. 동일 클론으로부터 생산된 모든 단클론성 항체는 동일성이고 동일 항원 특이성을 갖는다. 용어 "단클론성"은 세포의 단일 클론, 단일 세포, 및 그 세포의 자손에 관한 것이다.
본원에 정의된 바와 같이 "완전 갯과 항체"는 세포(전형적으로 CHO 세포주)의 클론에 의해 생산된 단클론성 항체이고, 그러므로 항체의 단일 순수 동종 유형이다. 면역화된 포유동물, 예컨대 개의 단일 B 세포로부터 확인된 항체는 그들의 가변 도메인 서열의 확인 이후 재조합 IgG 단백질로서 창출된다. 갯과 불변 도메인(중쇄 및 경쇄 카파 또는 람다 불변)에 이들 가변 도메인의 그라프팅은 재조합 완전 갯과 항체의 생성을 초래한다. 동일 클론으로부터 생산된 모든 완전 갯과 단클론성 항체는 동일성이고 동일 항원 특이성을 갖는다. 용어 "단클론성"은 세포의 단일 클론, 단일 세포, 및 그 세포의 자손에 관한 것이다.
본원에 정의된 바와 같이 "완전 고양잇과 항체"는 세포(전형적으로 CHO 세포주)의 클론에 의해 생산된 단클론성 항체이고, 그러므로 항체의 단일 순수 동종 유형이다. 면역화된 포유동물, 예컨대 개의 단일 B 세포로부터 확인된 항체는 그들의 가변 도메인 서열의 확인 이후 재조합 IgG 단백질로서 창출된다. 고양잇과 불변 도메인(중쇄 및 경쇄 카파 또는 람다 불변)에 이들 가변 도메인의 그라프팅은 재조합 완전 고양잇과 항체의 생성을 초래한다. 동일 클론으로부터 생산된 모든 완전 고양잇과 단클론성 항체는 동일성이고 동일 항원 특이성을 갖는다. 용어 "단클론성"은 세포의 단일 클론, 단일 세포, 및 그 세포의 자손에 관한 것이다.
본원에 정의된 바와 같이 "완전 말과 항체"는 세포(전형적으로 CHO 세포주)의 클론에 의해 생산된 단클론성 항체이고, 그러므로 항체의 단일 순수 동종 유형이다. 면역화된 포유동물, 예컨대 개의 단일 B 세포로부터 확인된 항체는 그들의 가변 도메인 서열의 확인 이후 재조합 IgG 단백질로서 창출된다. 말과 불변 도메인(중쇄 및 경쇄 카파 또는 람다 불변)에 이들 가변 도메인의 그라프팅은 재조합 완전 말과 항체의 생성을 초래한다. 동일 클론으로부터 생산된 모든 완전 말과 단클론성 항체는 동일성이고 동일 항원 특이성을 갖는다. 용어 "단클론성"은 세포의 단일 클론, 단일 세포, 및 그 세포의 자손에 관한 것이다.
본원에서 단클론성 항체는, 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 한 부분이 특정 종으로부터 유래된 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 상기와 상동성인 한편, 쇄(들)의 나머지가 또 다른 종으로부터 유래된 항체, 뿐만 아니라 그와 같은 항체의 단편에서 상응하는 서열과 동일성이거나 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린)를 특이적으로 포함한다. 전형적으로, 키메라 항체는 경쇄 및 중쇄 유전자가, 전형적으로 상이한 종에 속하는 항체 가변 및 불변 영역 유전자로부터 유전적 조작에 의해 작제된 항체이다. 예를 들어, 마우스 단클론성 항체로부터 유전자의 가변 분절은 갯과 불변 분절에 결합될 수 있다. 키메라 마우스:갯과 IgG의 일 구현예에서, 항원 결합 부위는 마우스로부터 유래되는 한편 FC 부분은 갯과이다.
비-갯과(예를 들면, 쥣과) 항체의 "개화된" 형태는 비-갯과 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 함유하는 유전적으로 조작된 항체이다. 개화된 항체는 수령체의 초가변 영역 잔기가 비-갯과 종(공여체 항체), 예컨대 원하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 마우스로부터 초가변 영역 잔기로 대체되는 갯과 면역글로불린 서열(수령체 항체)이다. 일부 경우에, 갯과 면역글로불린 서열의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-갯과 잔기로 대체된다. 게다가, 개화된 항체는 수령체 항체에서 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 실시된다. 일반적으로, 개화된 항체는 적어도 하나의, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, 여기에서 초가변 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-갯과 면역글로불린 서열의 것들에 상응하고 FR들의 모두 또는 실질적으로 모두는 갯과 면역글로불린 서열의 것들이다. 개화된 항체는 선택적으로 또한 완전, 또는 적어도 한 부분의 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 갯과 면역글로불린 서열의 것을 포함할 것이다. 마우스 IgG의 종분화 또는 개화의 일 구현예에서, 마우스 CDR은 갯과 프레임워크에 그라프팅된다.
비-고양잇과(예를 들면, 쥣과) 항체의 "고양이화된" 형태는 비-고양잇과 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 함유하는 유전적으로 조작된 항체이다. 고양이화된 항체는 수령체의 초가변 영역 잔기가 비-고양잇과 종(공여체 항체), 예컨대 원하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 마우스로부터 초가변 영역 잔기로 대체되는 고양잇과 면역글로불린 서열(수령체 항체)이다. 일부 경우에, 고양잇과 면역글로불린 서열의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-고양잇과 잔기로 대체된다. 게다가, 고양이화된 항체는 수령체 항체에서 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 실시된다. 일반적으로, 고양이화된 항체는 적어도 하나의, 및 전형적으로 2개의, 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, 여기에서 초가변 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-고양잇과 면역글로불린 서열의 것들에 상응하고 FR의 모두 또는 실질적으로 모두는 고양잇과 면역글로불린 서열의 것들이다. 고양이화된 항체는 선택적으로 또한 완전, 또는 적어도 한 부분의 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 고양잇과 면역글로불린 서열의 것을 포함할 것이다.
비-말과(예를 들면, 쥣과) 항체의 "말화된" 형태는 비-말과 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 함유하는 유전적으로 조작된 항체이다. 말화된 항체는 수령체의 초가변 영역 잔기가 비-말과 종(공여체 항체), 예컨대 원하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 마우스로부터 초가변 영역 잔기로 대체되는 말과 면역글로불린 서열(수령체 항체)이다. 일부 경우에, 말과 면역글로불린 서열의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-말과 잔기로 대체된다. 게다가, 말화된 항체는 수령체 항체에서 또는 공여체 항체에서 발견되지 않은 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 실시된다. 일반적으로, 말화된 항체는 적어도 하나의, 및 전형적으로 2개의, 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, 여기에서 초가변 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-말과 면역글로불린 서열의 것들에 상응하고 FR의 모두 또는 실질적으로 모두는 말과 면역글로불린 서열의 것들이다. 말화된 항체는 선택적으로 또한 완전, 또는 적어도 한 부분의 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 말과 면역글로불린 서열의 것을 포함할 것이다.
"완전 갯과" 항체는 비-갯과 면역글로불린으로부터 유래된 서열을 함유하지 않는 유전적으로 조작된 항체이다. 완전 갯과 항체는 초가변 영역 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 자연 발생 갯과 항체(공여체 항체)로부터 유래되는 갯과 면역글로불린 서열(수령체 항체)이다. 일부 경우에, 갯과 면역글로불린 서열의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-갯과 잔기로 대체된다. 게다가, 완전 갯과 항체는, 예컨대 비제한적으로 친화도를 변형시키기 위해 CDR에서 변화를 포함하는, 수령체 항체에서 또는 공여체 항체에서 발견되지 않은 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 실시된다. 일반적으로, 완전 갯과 항체는 적어도 하나의, 및 전형적으로 2개의, 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, 여기에서 초가변 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 갯과 면역글로불린 서열의 것들에 상응하고 FR의 모두 또는 실질적으로 모두는 갯과 면역글로불린 서열의 것들이다. 완전 갯과 항체는 선택적으로 또한 완전, 또는 적어도 한 부분의 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 갯과 면역글로불린 서열의 것을 포함할 것이다.
"완전 고양잇과" 항체는 비-고양잇과 면역글로불린으로부터 유래된 서열을 함유하지 않는 유전적으로 조작된 항체이다. 완전 고양잇과 항체는 초가변 영역 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 자연 발생 고양잇과 항체(공여체 항체)로부터 유래되는 고양잇과 면역글로불린 서열(수령체 항체)이다. 일부 경우에, 고양잇과 면역글로불린 서열의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-고양잇과 잔기로 대체된다. 게다가, 완전 고양잇과 항체는, 예컨대, 비제한적으로 친화도를 변형시키기 위해 CDR에서 변화를 포함하는, 수령체 항체에서 또는 공여체 항체에서 발견되지 않은 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 실시된다. 일반적으로, 완전 고양잇과 항체는 적어도 하나의, 및 전형적으로 2개의, 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, 여기에서 초가변 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 고양잇과 면역글로불린 서열의 것들에 상응하고 FR의 모두 또는 실질적으로 모두는 고양잇과 면역글로불린 서열의 것들이다. 완전 고양잇과 항체는 선택적으로 또한 완전, 또는 적어도 한 부분의 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 고양잇과 면역글로불린 서열의 것을 포함할 것이다.
"완전 말과" 항체는 비-말과 면역글로불린으로부터 유래된 서열을 함유하지 않는 유전적으로 조작된 항체이다. 완전 말과 항체는 초가변 영역 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 자연 발생 말과 항체(공여체 항체)로부터 유래되는 말과 면역글로불린 서열(수령체 항체)이다. 일부 경우에, 말과 면역글로불린 서열의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-말과 잔기로 대체된다. 게다가, 완전 말과 항체는, 예컨대, 비제한적으로 친화도를 변형시키기 위해 CDR에서 변화를 포함하는, 수령체 항체에서 또는 공여체 항체에서 발견되지 않은 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 실시된다. 일반적으로, 완전 말과 항체는 적어도 하나의, 및 전형적으로 2개의, 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, 여기에서 초가변 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 말과 면역글로불린 서열의 것들에 상응하고 FR의 모두 또는 실질적으로 모두는 말과 면역글로불린 서열의 것들이다. 완전 말과 항체는 선택적으로 또한 완전, 또는 적어도 한 부분의 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 말과 면역글로불린 서열의 것을 포함할 것이다.
용어 "헤테로키메라"는 본원에 정의된 바와 같이 항체(중쇄 또는 경쇄) 쇄들 중 하나가 개화, 고양이화, 또는 말화되는 한편 나머지가 키메라인 항체를 지칭한다. 일 구현예에서, (CDR의 모두가 마우스이고 모든 FR이 고양잇과인) 고양이화된 가변 중쇄는 (CDR의 모두가 마우스이고 모든 FR이 마우스인 키메라 가변 경쇄와 짝짓기된다. 이 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 둘 모두는 고양잇과 불변 영역에 융합된다.
"변이체" 항-IL-31 항체는 모 항체 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기(들)의 부가, 결실 및/또는 치환 덕분에 "모" 항-IL-31 항체 아미노산 서열과 아미노산 서열에서 상이하고 모 항-IL-31-항체의 적어도 하나의 원하는 활성을 보유하는 분자를 본원에서 지칭한다. 원하는 활성은 특이적으로 항원을 결합시키는 능력, 동물에서 IL-31 활성을 감소, 억제 또는 중화시키는 능력, 그리고 세포-기반 검정에서 IL-31-매개된 pSTAT 신호전달을 억제시키는 능력을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 변이체는 모 항체의 하나 이상의 초가변 및/또는 프레임워크 영역(들)에서 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함한다. 예를 들어, 변이체는 모 항체의 하나 이상의 초가변 및/또는 프레임워크 영역에서 적어도 하나의, 예를 들면 약 1 내지 약 10개, 바람직하게는 약 2 내지 약 5개의 치환을 포함할 수 있다. 대개, 변이체는 모 항체 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 서열과 적어도 50% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 65%, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 이 서열에 관한 동일성 또는 상동성은, 필요하면, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 서열 정렬 및 갭 도입 후, 모 항체 잔기와 동일성인 후보 서열에서 아미노산 잔기의 백분율로서 본원에 정의된다. 항체 서열에 N-말단, C-말단, 또는 내부 확장, 결실, 또는 삽입의 어느 것도 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 미치는 것으로 해석되지 않아야 한다. 변이체는 IL-31을 결합시키는 능력을 보유하고 바람직하게는 모 항체의 것들보다 우수한 원하는 활성을 갖는다. 예를 들어, 변이체는 더 강한 결합 친화도, 동물에서 IL-31 활성을 감소, 억제 또는 중화시키는 향상된 능력, 및/또는 세포-기반 검정에서 IL-31-매개된 pSTAT 신호전달을 억제시키는 향상된 능력을 가질 수 있다.
"변이체" 핵산은 서열에서 "모" 핵산과 상이한 분자를 본원에서 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드 서열 분기는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 돌연변이 변화 예컨대 결실, 치환, 또는 부가에서 비롯될 수 있다. 각각의 이들 변화는 주어진 서열에서 1회 초과, 단독으로 또는 조합으로 발생할 수 있다.
본원에서 "모" 항체는 변이체의 제조에 사용되는 아미노산 서열에 의해 인코딩되는 것이다. 일 구현예에서, 모 항체는 갯과 프레임워크 영역을 갖고, 존재하면, 갯과 항체 불변 영역(들)을 갖는다. 예를 들어, 모 항체는 개화된 또는 갯과 항체일 수 있다. 또 다른 예로서, 모 항체는 고양이화된 또는 고양잇과 항체일 수 있다. 더욱 또 다른 예로서, 모 항체는 말화된 또는 말과 항체일 수 있다. 더욱 추가 예로서, 모 항체는 쥣과 단클론성 항체이다.
명세서 및 청구항 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이 용어 "항원 결합 영역", "항원-결합 부분", 및 기타 등등은 항원과 상호작용하고 항원에 대하여 이의 특이성 및 친화도를 항체에서 부여하는 아미노산 잔기를 함유하는 항체 분자의 그 부분을 지칭한다. 항체 결합 영역은 항원-결합 잔기의 적절한 입체배치를 유지하는 데 필요한 "프레임워크" 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명에 따른 항체의 항원-결합 부분은 대안적으로, 예를 들어 IL-31-특이적 펩타이드 또는 폴리펩타이드 또는 항-IL-31 펩타이드 또는 폴리펩타이드로서 본원에 지칭될 수 있다.
용어 "단리된"은 물질(예를 들면, 항체 또는 핵산)이 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리되고/거나 회복되는 것을 의미한다. 이의 자연 환경의 오염물 성분은 물질에 대하여 진단적 또는 치료적 용도를 방해할 물질이고, 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 핵산에 관하여, 단리된 핵산은 염색체에서 정상적으로 회합되는 5' 내지 3' 서열로부터 분리되는 것을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 물질은 물질의 95중량% 초과, 가장 바람직하게는 99중량% 초과까지 정제될 수 있다. 물질의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 물질은 재조합 세포 내에 원위치 물질을 포함한다. 대개, 하지만, 단리된 물질은 적어도 하나의 정제 단계로 제조될 것이다.
본원에 사용되는 경우 용어 "표지"는 항체 또는 핵산에 직접적으로 또는 간접적으로 컨쥬게이션되는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 스스로 자체 검출가능할 수 있거나(예를 들면, 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉진시킬 수 있다.
용어 "핵산", "폴리뉴클레오타이드", "핵산 분자" 및 기타 등등은 본원에 교환가능하게 사용될 수 있고 DNA 및 RNA에서 일련의 뉴클레오타이드 염기(또한 소위 "뉴클레오타이드")를 지칭한다. 핵산은 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 및/또는 그들의 유사체를 함유할 수 있다. 용어 "핵산"은, 예를 들어, 단일-가닥 및 이중-가닥 분자를 포함한다. 핵산은, 예를 들어, 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, DNA 분자(예를 들면, cDNA), RNA 분자(예를 들면, mRNA), 재조합 핵산, 플라스미드, 그리고 기타 벡터, 프라이머 및 프로브일 수 있다. 양쪽 5' 내지 3' (센스) 및 3' 내지 5' (안티센스) 폴리뉴클레오타이드는 포함된다.
"대상체" 또는 "환자"는 본 발명의 분자에 의해 영향받을 수 있는 치료가 필요한 동물을 지칭한다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 동물은 척추동물을 포함하고, 포유동물 예컨대 갯과, 고양잇과, 및 말과 동물이 특히 바람직한 예이다.
"치료적 유효량"(또는 "유효량")은 활성 구성성분, 예를 들면, 대상체 또는 환자에게 투여된 경우 유익한 또는 원하는 결과를 유효화하는 데 충분한, 본 발명에 따른 제제의 양을 지칭한다. 유효량은 하나 이상의 투여, 도포 또는 투약으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 치료적 유효량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, "치료적 유효량"은 증상에서의 임상적 개선을 포함하는 소양성 병태 또는 알레르기성 병태의 치료와 연관된 하나 이상의 파라미터에서 객관적으로 측정된 변화를 생기게 하는 것이다. 물론, 치료적 유효량은 치료중인 특정 대상체 및 병태, 대상체의 체중 및 연령, 질환 상태의 심각성, 선택되는 특정 화합물, 따라야 할 투약 레지멘, 투여의 타이밍, 투여의 방식 및 기타 등등에 따라 다양할 것이고, 이들 모두는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료적"은 질환 또는 장애에 대하여 전체 스펙트럼의 치료를 포괄한다. 본 발명의 "치료적" 제제는, 위험에 처한 것으로 확인될 수 있는 표적 동물에게 설계된 절차를 혼입시키는 것들(약리유전학)을 포함하는, 예방성 또는 예방적인 방식으로; 또는 사실상 호전적 또는 치유적인 방식으로 작용할 수 있거나; 치료중인 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상의 진전의 속도 또는 정도를 느리게 하도록 작용할 수 있다.
"치료", "치료하는", 및 기타 등등은 양쪽 치료적 처치 및 예방성 또는 예방적 처치를 지칭한다. 치료가 필요한 동물은 장애를 이미 가진 것들 뿐만 아니라 장애가 예방되어야 하는 것들을 포함한다. 질환 또는 장애의 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 (즉, 임상 증상이 발달하지 않도록 하는) 질환 또는 장애에 대한 예방 또는 보호; 질환 또는 장애 억제(즉, 임상 증상의 발달 정지 또는 억압); 및/또는 질환 또는 장애 완화(즉, 임상 증상의 경감 야기)를 포함한다. 인정될 바와 같이, 궁극적 귀납 이벤트 또는 이벤트들이 미공지 또는 잠복성일 수 있기 때문에 질환 또는 장애를 "예방하는"과 "억압하는"간의 식별이 항상 가능하지 않다. 따라서, 용어 "예방조치"는 양쪽 "예방하는" 및 "억압하는"을 포괄하는 "치료"의 한 유형을 구성한다고 이해될 것이다. 용어 "치료"는 따라서 "예방조치"를 포함한다.
용어 "알레르기성 병태"는 신체에 외래인 서브스턴스와 면역계 사이 상호작용에 의해 야기된 장애 또는 질환으로서 본원에 정의된다. 이 외래 서브스턴스는 일명 "알레르겐"이다. 흔한 알레르겐은 공기알레르겐, 예컨대 화분, 먼지, 곰팡이, 먼지 벌레 단백질, 벌레 물림으로부터 주입된 타액 등을 포함한다. 알레르기성 병태의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 알레르기성 피부염, 여름 습진, 두드러기, 호흡곤란증, 염증성 기도 질환, 재발성 기도 폐색, 기도 과민반응, 만성 폐쇄성 폐 질환, 및 자가면역에서 비롯된 염증성 과정, 예컨대 과민성 장증후군(IBS).
용어 "소양성 병태"는 완화하기 위해 피부를 문지르거나 긁고 싶은 충동을 생기게 하는 극심한 가려움증을 특징으로 하는 질환 또는 장애로서 본원에 정의된다. 소양성 병태의 예는, 비제한적으로 하기를 포함한다: 아토피성 피부염, 알레르기성 피부염, 습진, 건선, 경피증 및 소양증.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "세포", "세포주", 및 "세포 배양물"은 교환가능하게 사용될 수 있다. 이들 용어들 모두는 또한, 임의의 및 모든 후속 세대인, 그들의 자손을 포함한다. 모든 자손이 의도적 또는 우연한 돌연변이로 인해 동일성이지 않을 수 있음이 이해된다. 이종 핵산 서열 발현의 문맥에서, "숙주 세포"는 시험관내 또는 생체내 위치하든 원핵 또는 진핵 세포(예를 들면, 박테리아 세포, 효모 세포, 포유류 세포, 및 곤충 세포)를 지칭한다. 예를 들어, 숙주 세포는 트랜스제닉 동물에 위치할 수 있다. 숙주 세포는 벡터용 수령체로서 사용될 수 있고 벡터를 복제할 수 있고/거나 벡터에 의해 인코딩된 이종 핵산을 발현시킬 수 있는 임의의 형질전환가능한 유기체를 포함할 수 있다.
"조성물"은 활성 제제 및 불활성일 수 있는 또 다른 화합물 또는 조성물(예를 들면, 표지), 또는 활성제, 예컨대 아쥬반트의 조합을 의미하기 위한 것이다.
본원에 정의된 바와 같이, 본 발명에서의 사용에 적합한 약학적으로 허용가능한 담체는 당업자에게 잘 알려진다. 그와 같은 담체는, 제한 없이, 물, 식염수, 완충 식염수, 인산염 완충액, 알코올성/수성 용액, 유탁액 또는 현탁액을 포함한다. 기타 종래 이용된 희석제, 아쥬반트 및 부형제는 종래 기술에 따라 첨가될 수 있다. 그와 같은 담체는 에탄올, 폴리올, 및 이의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 및 주입가능한 유기 에스테르를 포함할 수 있다. 완충액 및 pH 조정 제제는 또한 이용될 수 있다. 완충액은, 제한 없이, 유기 산 또는 염기로부터 제조된 염을 포함한다. 대표적 완충액은, 제한 없이, 유기 산 염, 예컨대 시트르산의 염, 예를 들면, 시트레이트, 아스코르브산, 글루콘산, 히스티딘-HCl, 탄산, 타르타르산, 석신산, 아세트산, 또는 프탈산, 트리스, 트리메탄민 하이드로클로라이드, 또는 인산염 완충액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스, 트레할로스, 수크로스, 및 염화나트륨, 락테이트화된 링거 또는 고정 오일을 포함할 수 있다. 정맥내 담체는 유체 및 영양 보충물, 전해질 보충물, 예컨대 링거 덱스트로스에 기반된 것들 및 기타 등등을 포함할 수 있다. 보존제 및 기타 첨가제 예컨대, 예를 들어, 항균제, 항산화제, 킬레이트화 제제(예를 들면, EDTA), 불활성 기체 및 기타 등등은 또한 약학적 담체에서 제공될 수 있다. 본 발명은 담체의 선택에 의해 제한되지 않는다. 적당한 pH 등장성, 안정성 및 기타 종래의 특징을 갖는, 상기-기재된 성분으로부터, 이들 약학적으로 허용가능한 조성물의 제조는 당해 분야의 기술 내에 있다. 예를 들면, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed, Lippincott Williams & Wilkins, publ., 2000; 및 The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4.sup.th edit., eds. R. C. Rowe 등, APhA Publications, 2003과 같은 텍스트를 참고한다.
용어 "보존적 아미노산 치환"은 주어진 아미노산 잔기에 대하여 임의의 아미노산 치환을 표시하고, 여기에서 대리 잔기는 폴리펩타이드 기능(예를 들면, 효소 활성)에서 실질적인 감소가 일어나지 않는 주어진 잔기의 것과 매우 화학적으로 유사하다. 보존적 아미노산 치환은 종래 기술에서 흔하게 알려지고 이의 예는, 예를 들면, 미국 특허 번호 6,790,639, 6,774,107, 6,194,167, 또는 5,350,576에서 기재된다. 바람직한 구현예에서, 보존적 아미노산 치환은 하기 6개의 그룹 중 하나 내에서 발생하는 임의의 하나일 것이다.
· 1. 소형 지방족, 실질적으로 비-극성 잔기: Ala, Gly, Pro, Ser, 및 Thr;
· 2. 대형 지방족, 비-극성 잔기: Ile, Leu, 및 Val; Met;
· 3. 극성, 음으로 하전된 잔기 및 그들의 아미드: Asp 및 Glu;
· 4. 극성, 음으로 하전된 잔기의 아미드: Asn 및 Gln; His;
· 5. 극성, 양으로 하전된 잔기: Arg 및 Lys; His; 및
· 6. 대형 방향족 잔기: Trp 및 Tyr; Phe.
바람직한 구현예에서, 보존적 아미노산 치환은, 고유 잔기 (보존적 치환) 쌍으로서 열거되는, 하기의 어느 하나일 것이다: Ala (Ser); Arg (Lys); Asn (Gln; His); Asp (Glu); Gln (Asn); Glu (Asp); Gly (Pro); His (Asn; Gln); Ile (Leu; Val); Leu (Ile; Val); Lys (Arg; Gln; Glu); Met (Leu; Ile); Phe (Met; Leu; Tyr); Ser (Thr); Thr (Ser); Trp (Tyr); Tyr (Trp; Phe); 및 Val (Ile; Leu).
폴리펩타이드가 보존적 아미노산 치환(들)을 함유할 수 있는 만큼, 이의 폴리뉴클레오타이드는 보존적 코돈 치환(들)을 함유할 수 있다. 코돈 치환은, 발현된 경우, 상기 기재된 바와 같이, 보존적 아미노산 치환을 생산하면 보존적으로 간주된다. 아미노산 치환을 초래하지 않는, 축퇴 코돈 치환은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드에서 또한 유용하다. 그래서, 예를 들면, 본 발명의 구현예에서 유용한 선택되는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 이와 함께 형질전환되도록 발현 숙주 세포에 의해 발휘된 코돈 사용 빈도를 가깝게 하기 위해, 또는 달리 이의 발현을 개선하기 위해 축퇴 코돈 치환에 의해 돌연변이될 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명이 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜, 및 시약 등에 제한되지 않고 그 자체로 다양할 수 있음이 이해되어야 한다. 본원에 사용되는 전문용어는 특정 구현예만을 기재하기 위한 목적이고, 청구항에 의해 단독으로 정의되는, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 기재된 항체와 함께 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자들에 의해 공통으로 이해되는 의미를 가질 수 있다. 추가로, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수형을 포함할 수 있고 복수 용어는 단수형을 포함할 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 그리고 단백질 및 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드 화학 및 혼성화에 관하여 활용된 용어, 및 기술은 잘 알려지고 종래 기술에서 흔하게 사용되는 것들이다.
표준 기술은 재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성, 및 조직 배양 및 형질주입(예를 들면, 전기천공, 리포펙션)에 사용된다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조자의 설명에 따라 또는 종래 기술에서 흔하게 달성된 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이 수행된다. 전술한 기술 및 절차는 종래 기술에서 잘 알려진 종래의 방법에 따라 그리고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반 및 더욱 구체적 참조문헌에서 기재된 바와 같이 일반적으로 수행된다, 예를 들면, Sambrook 등. MOLECULAR CLONING: LAB. MANUAL (3rd ed., Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001) 및 Ausubel 등. Current Protocols in Molecular Biology (New York: Greene Publishing Association/Wiley Interscience), 1993을 참고한다. 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 제약 화학에 관하여 활용된 명칭, 그리고 상기의 실험실 절차 및 기법은 널리 알려지고 종래 기술에서 흔하게 사용되는 것들이다. 표준 기법은 화학 합성, 화학 분석, 약학적 제조, 제형화, 및 전달, 그리고 환자의 치료에 사용된다.
실시예에서 이외에서 또는 달리 명시되는 경우 이외에서, 본원에 사용되는 구성성분 또는 반응 조건의 양을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에서 용어 "약"에 의해 변형된 것으로서 이해되어야 한다.
확인된 모든 특허 및 기타 공보는, 예를 들어, 본 발명에 관하여 사용될 수 있는 그와 같은 공보에서 기재된 방법론을 기재 및 개시할 목적으로 참고로 본원에 분명하게 편입된다. 이들 공보는 본원의 데이터 제출에 앞서 그들의 개시를 위하여 단독으로 제공된다.
본 발명은, 진단 절차를 포함하는, 임상 및 과학 절차에서 재조합 단클론성 항체 및 펩타이드 그리고 그들의 용도를 제공한다. 분자 생물학 및 재조합 기술의 방법의 출현으로, 재조합 수단에 의해 항체 및 항체-유사 분자를 생산하고 그것에 의하여 항체의 폴리펩타이드 구조에서 발견된 특이적 아미노산 서열에 대하여 코딩하는 유전자 서열을 생성하는 것이 가능하다. 그와 같은 항체는, 특이적 에피토프 및 항원 결정기에 대하여 친화도를 가진 활성 사량체(H2L2) 구조를 형성하기 위한 합성된 쇄의 조합과, 상기 항체의 폴리펩타이드 쇄를 인코딩하는 유전자 서열의 클로닝화에 의해 또는 상기 폴리펩타이드 쇄의 직접 합성에 의해 생산될 수 있다. 이것은 상이한 종 및 공급원으로부터 중화 항체의 서열 특징을 갖는 항체의 용이한 생산을 허용하였다.
항체의 공급원, 또는 이들이 재조합으로 작제된 방법, 또는 이들이, 시험관내 또는 생체내, 합성되는 방법과 무관하게, 트랜스제닉 동물, 실험실 또는 상용 크기의 대형 세포 배양물을 사용하여, 트랜스제닉 식물을 사용하여, 또는 공정의 임의의 단계에서 살아있는 유기체를 이용하지 않는 직접 화학 합성에 의해, 모든 항체는 유사한 전반적 3차원 구조를 갖는다. 이 구조는 H2L2로서 종종 주어지고 항체가 흔히 2개의 경쇄(L) 아미노산 및 2개의 중쇄(H) 아미노산을 포함한다는 사실을 지칭한다. 두 쇄는 구조적으로 상보적 항원 표적과 상호작용할 수 있는 영역을 갖는다. 표적과 상호작용하는 영역은 "가변" 또는 "V" 영역으로서 지칭되고 상이한 항원 특이성의 항체와 아미노산 서열에서의 차이를 특징으로 한다. 어느 한쪽 H 또는 L 쇄의 가변 영역은 항원 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열을 함유한다.
상기 언급된 바와 같이, 명세서 및 청구항 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이 용어 "항원 결합 영역", "항원-결합 부분" 및 기타 등등은 항원과 상호작용하고 항체에서 항원에 대한 이의 특이성 및 친화도를 부여하는 아미노산 잔기를 함유하는 항체 분자의 그 부분을 지칭한다. 항체 결합 영역은 항원-결합 잔기의 적절한 입체배치를 유지하는 데 필요한 "프레임워크" 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명에 따른 항체의 항원-결합 부분은, 예를 들어 IL-31-특이적 펩타이드 또는 폴리펩타이드로서 또는 항-IL-31 펩타이드 또는 폴리펩타이드로서 본원에 지칭될 수 있다.
상이한 특이성의 항체들간의 극한 가변성 때문에 "초가변"으로 불리는 더 작은 서열이 항원 결합 영역을 제공하는 H 또는 L 쇄의 가변 영역 내에 있다. 그와 같은 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 영역으로서 또한 지칭된다. 이들 CDR 영역은 특정 항원 결정기 구조에 대하여 항체의 기본 특이성을 설명한다.
CDR들은 가변 영역 내에서 아미노산의 비-연속성 스트레치를 나타내지만, 종과 무관하게, 가변 중쇄 및 경쇄 영역 내에서 이들 임계적 아미노산 서열의 위치 장소는 가변 쇄의 아미노산 서열 내에서 유사한 장소를 갖는 것으로 밝혀졌다. 모든 항체의 가변 중쇄 및 경쇄 각각은, 서로 각각 비-연속성인, 3개의 CDR 영역을 갖는다.
모든 포유류 종에서, 항체 펩타이드는 불변(즉, 고도로 보존된) 및 가변 영역을 함유하고, 후자 내에서, CDR들 그리고 CDR들 외부가 아닌 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역 내에서 아미노산 서열로 구성된 소위 "프레임워크 영역"이 있다.
항체의 CDR 영역에 의해 인식된 항원 디터미네이트에 관하여, 이것은 "에피토프"로서 또한 지칭된다. 다시 말해서, 에피토프는 항체에 의해 인식, 및 결합될 수 있는 임의의 분자의 그 부분을 지칭한다(상응하는 항체 결합 영역은 파라토프로서 지칭될 수 있다).
"항원"은 그 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생산하기 위해 동물을 추가적으로 유도할 수 있는 항체에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 한 부분이다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 상기 지칭된 특이적 반응은 항원이, 고도로 선택적 방식으로, 다른 항원에 의해 유발될 수 있는 수많은 다른 항체가 아니고 이의 상응하는 항체와 반응할 것을 나타내기 위한 의미이다.
본 발명의 항체는 양쪽 온전한 면역글로불린 분자 뿐만 아니라 이의 부분, 단편, 펩타이드 및 유도체, 예컨대, 예를 들어, 항원 또는 에피토프를 결합시킬 수 있는 항체의 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fse, CDR 영역, 파라토프, 또는 임의의 부분(예를 들면, 폴리펩타이드) 또는 펩타이드 서열을 포함하는 의미이다. 항체는 분자와 특이적으로 반응할 수 있다면 분자를 "결합할 수 있"어서 그것에 의하여 항체에 분자를 결합한다고 언급된다.
본 발명의 항체는 또한, 임의의 알려진 기술, 예컨대, 비제한적으로, 효소 절단, 펩타이드 합성, 또는 재조합 기술에 의해 제공된, 키메라 항체, 헤테로키메라 항체, 개화된 항체, 고양이화된 항체, 또는 말화된 항체, 뿐만 아니라 이의 단편, 부분, 영역, 펩타이드 또는 유도체를 포함한다. 본 발명의 그와 같은 항체는 갯과 IL-31 또는 고양잇과 IL-31의 적어도 하나를 특이적으로 결합할 수 있다. 항체 단편 또는 부분은 온전한 항체의 Fc 단편이 부족할 수 있고, 순환으로부터 더욱 신속하게 제거할 수 있고, 온전한 항체보다 덜한 비-특이적 조직 결합을 가질 수 있다. 항체 단편의 예는 종래 기술에서 잘 알려진 방법을 사용하여, 예를 들어 효소, 예컨대 (Fab 단편을 생산하기 위해) 파파인 또는 (F(ab')2 단편을 생산하기 위해) 펩신을 이용한 단백질분해 절단에 의해 온전한 항체로부터 생산될 수 있다. 참고, 예를 들면, Wahl 등, 24 J. Nucl. Med. 316-25 (1983). 항체의 부분은 임의의 상기 방법에 의해 만들어질 수 있거나, 재조합 분자의 한 부분을 발현시킴으로써 만들어질 수 있다. 예를 들어, 재조합 항체의 CDR 영역(들)은 단리될 수 있고 적당한 발현 벡터로 서브클로닝될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 번호 6,680,053을 참고한다.
명세서 및 청구항 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이 용어 "항원 결합 영역", "항원-결합 부분", 및 기타 등등은 항원과 상호작용하고 항체에서 항원에 대하여 이의 특이성 및 친화도를 부여하는 아미노산 잔기를 함유하는 항체 분자의 그 부분을 지칭한다. 항체 결합 영역은 항원-결합 잔기의 적절한 입체배치를 유지하는 데 필요한 "프레임워크" 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명에 따른 항체의 항원-결합 부분은 대안적으로, 예를 들어 IL-31-특이적 펩타이드 또는 폴리펩타이드로서 또는 항-IL-31 펩타이드 또는 폴리펩타이드로서 본원에 지칭될 수 있다.
클론 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159, ZIL171, 04H07, 및 06A09 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열
일부 구현예에서, 본 발명은 갯과 IL-31, 고양잇과 IL-31, 또는 말과 IL-31의 적어도 하나에 특이적으로 결합하는 신규한 단클론성 항체를 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명의 단클론성 항체는 갯과 IL-31, 고양잇과 IL-31, 또는 말과 IL-31에 결합하고 IL-31 수용체 A(IL-31Ra) 및 온코스타틴-M-특이적 수용체(OsmR 또는 IL-31Rb)를 포함하는 이의 공-수용체 복합체에 대한 이의 결합, 및 상기의 활성화를 예방한다. 본 발명의 단클론성 항체는 이의 클론에 할당된 숫자를 지칭하는 "15H05", "ZIL1", "ZIL8", "ZIL9", "ZIL11", "ZIL69", "ZIL94", "ZIL154", "ZIL159", "ZIL171", 04H07, 및 06A09로서 본원에 확인된다. 본원에, "15H05", "ZIL1", "ZIL8", "ZIL9", "ZIL11", "ZIL69", "ZIL94", "ZIL154", "ZIL159", "ZIL171", "04H07", 및 "06A09"는 또한 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159, ZIL171, 04H07, 및 06A09 항체 각각을 결합시키는 이의 능력 때문에 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159, ZIL171, 04H07, 및 06A09로서 확인된 IL-31 에피토프와 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 파라토프 또는 CDR의 부분을 지칭한다. 본원에 기재된 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159, ZIL171, 04H07, 및 06A09의 몇몇 재조합, 키메라, 헤테로키메라, 개화된, 고양이화된, 말화된, 완전 갯과, 완전 고양잇과, 및/또는 완전 말과 형태는 동일 명칭에 의해 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 15H05는 적어도 이들이 동일 CDR들을 공유하기 때문에 1505로서 본원에 대안적으로 지칭될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 IL-31 단백질의 이의 공-수용체와의 상호작용에 관여된 포유류 IL-31 단백질 상의 영역에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공하고, 여기서 상기 항체의 상기 영역에의 결합이 하기의 적어도 하나로부터 선택되는 15H05 에피토프 결합 영역에서 돌연변이에 의해 영향받는다: a) 서열번호 157(고양잇과_IL31_야생형)로 표시되는 고양잇과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기 124 내지 135의 영역; b) 서열번호 155(갯과_IL31)로 표시되는 갯과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기 124 내지 135의 영역; 및 c) 서열번호 165(말과_IL31)로 표시되는 말과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기 118 내지 129의 영역. 일 구현예에서, 15H05 에피토프 결합 영역에서의 돌연변이는 하기의 적어도 하나로부터 선택된다: (a) 서열번호 157의 126 및 128 위치가 알라닌으로 변경되는 돌연변이체; (b) 서열번호 155의 126 및 128 위치가 알라닌으로 변경되는 돌연변이체; 및 (c) 서열번호 165의 120 및 122 위치가 알라닌으로 변경되는 돌연변이체.
일 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 상기 기재된 15H05 에피토프 결합 영역에 결합한다. 바꾸어 말하면, 일 구현예에서, 본 발명은 IL-31 단백질의 이의 공-수용체와의 상호작용에 관여된 포유류 IL-31 단백질 상의 영역에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공하고, 여기서 결합 영역은 하기의 적어도 하나로부터 선택된다: a) 서열번호 157(고양잇과_IL31_야생형)로 표시되는 고양잇과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기 124 내지 135의 영역; b) 서열번호 155(갯과_IL31)로 표시되는 갯과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기 124 내지 135의 영역; 및 c) 서열번호 165(말과_IL31)로 표시되는 말과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기 118 내지 129의 영역.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 특이적으로 결합하는 포유류 IL-31은 고양잇과 IL-31이고, 여기서 항체는 서열번호 157(고양잇과_IL31_야생형)로 표시되는 고양잇과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기 125 내지 134의 영역에 결합한다. 일부 구현예에서, 고양잇과 IL31에 결합하는 항체는 하기로부터 선택되는 프레임워크 2(FW2) 변화를 포함하는 VL 쇄를 포함하고: 42 위치에서 라이신 대신에 아스파라긴, 43 위치에서 발린 대신에 이소류신, 46 위치에서 류신 대신에 발린, 49 위치에서 라이신 대신에 아스파라긴, 및 이들의 조합, 여기서 상기 위치는 서열번호 127(FEL_15H05_VL1)의 넘버링을 지칭한다.
일 구현예에서, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 상보성 결정 영역(CDR) 서열의 하기 조합을 포함한다:
1) 항체 15H05: SYTIH(서열번호 1)의 가변 중쇄(VH)-CDR1, NINPTSGYTENNQRFKD(서열번호 2)의 VH-CDR2, WGFKYDGEWSFDV(서열번호 3)의 VH-CDR3, RASQGISIWLS(서열번호 4)의 가변 경쇄(VL)-CDR1, KASNLHI(서열번호 5)의 VL-CDR2, 및 LQSQTYPLT(서열번호 6)의 VL-CDR3; 또는
2) VH 또는 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 모 항체 15H05와 상이한 1)의 변이체.
일 구현예에서, 상기 항체 15H05는 하기 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄의 적어도 하나를 포함한다:
a) FEL_15H05_VL1_FW2를 포함하는 가변 경쇄:
EIQMTQSPSSLSASPGDRVTITCRASQGISIWLSWYQQKPGNIPKVLINKASNLHIGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDAATYYCLQSQTYPLTFGGGTKLEIK(서열번호 135), 및
b) FEL_15H05_VH1을 포함하는 가변 중쇄:
QVLLVQSGAEVRTPGASVKIFCKASGYSFTSYTIHWLRQAPAQGLEWMGNINPTSGYTENNQRFKDRLTLTADTSTNTAYMELSSLRSADTAMYYCARWGFKYDGEWSFDVWGAGTTVTVSS(서열번호 121).
또 다른 구현예에서, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 상보성 결정 영역(CDR) 서열의 하기 조합을 포함한다:
1) 항체 ZIL1: SYGMS(서열번호 13)의 가변 중쇄(VH)-CDR1, HINSGGSSTYYADAVKG(서열번호 14)의 VH-CDR2, VYTTLAAFWTDNFDY(서열번호 15)의 VH-CDR3, SGSTNNIGILAAT(서열번호 16)의 가변 경쇄(VL)-CDR1, SDGNRPS(서열번호 17)의 VL-CDR2, 및 QSFDTTLDAYV(서열번호 18)의 VL-CDR3;
2) 항체 ZIL8: DYAMS(서열번호 19)의 VH-CDR1, GIDSVGSGTSYADAVKG(서열번호 20)의 VH-CDR2, GFPGSFEH(서열번호 21)의 VH-CDR3, TGSSSNIGSGYVG(서열번호 22)의 VL-CDR1, YNSDRPS(서열번호 23)의 VL-CDR2, SVYDRTFNAV(서열번호 24)의 VL-CDR3;
3) 항체 ZIL9: SYDMT(서열번호 25)의 VH-CDR1, DVNSGGTGTAYAVAVKG(서열번호 26)의 VH-CDR2, LGVRDGLSV(서열번호 27)의 VH-CDR3, SGESLNEYYTQ(서열번호 28)의 VL-CDR1, RDTERPS(서열번호 29)의 VL-CDR2, ESAVDTGTLV(서열번호 30)의 VL-CDR3;
4) 항체 ZIL11: TYVMN(서열번호 31)의 VH-CDR1, SINGGGSSPTYADAVRG(서열번호 32)의 VH-CDR2, SMVGPFDY(서열번호 33)의 VH-CDR3, SGESLSNYYAQ(서열번호 34)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 35)의 VL-CDR2, ESAVSSDTIV(서열번호 36)의 VL-CDR3;
5) 항체 ZIL69: SYAMK(서열번호 37)의 VH-CDR1, TINNDGTRTGYADAVRG(서열번호 38)의 VH-CDR2, GNAESGCTGDHCPPY(서열번호 39)의 VH-CDR3, SGESLNKYYAQ(서열번호 40)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 41)의 VL-CDR2, ESAVSSETNV(서열번호 42)의 VL-CDR3;
6) 항체 ZIL94: TYFMS(서열번호 43)의 VH-CDR1, LISSDGSGTYYADAVKG(서열번호 44)의 VH-CDR2, FWRAFND(서열번호 45)의 VH-CDR3, GLNSGSVSTSNYPG(서열번호 46)의 VL-CDR1, DTGSRPS(서열번호 47)의 VL-CDR2, SLYTDSDILV(서열번호 48)의 VL-CDR3;
7) 항체 ZIL154: DRGMS(서열번호 49)의 VH-CDR1, YIRYDGSRTDYADAVEG(서열번호 50)의 VH-CDR2, WDGSSFDY(서열번호 51)의 VH-CDR3, KASQSLLHSDGNTYLD(서열번호 52)의 VL-CDR1, KVSNRDP(서열번호 53)의 VL-CDR2, MQAIHFPLT(서열번호 54)의 VL-CDR3;
8) 항체 ZIL159: SYVMT(서열번호 55)의 VH-CDR1, GINSEGSRTAYADAVKG(서열번호 56)의 VH-CDR2, GDIVATGTSY(서열번호 57)의 VH-CDR3, SGETLNRFYTQ(서열번호 58)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 59)의 VL-CDR2, KSAVSIDVGV(서열번호 60)의 VL-CDR3;
9) 항체 ZIL171: TYVMN(서열번호 61)의 VH-CDR1, SINGGGSSPTYADAVRG(서열번호 62)의 VH-CDR2, SMVGPFDY(서열번호 63)의 VH-CDR3, SGKSLSYYYAQ(서열번호 64)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 65)의 VL-CDR2, ESAVSSDTIV(서열번호 66)의 VL-CDR3;
10) 항체 04H07: SYWMN(서열번호 200)의 VH-CDR1, MIDPSDSEIHYNQVFKD(서열번호 201)의 VH-CDR2, QDIVTTVDY(서열번호 202)의 VH-CDR3, KSSQSLLYSINQKNHLA(서열번호 203)의 VL-CDR1, WASTRES(서열번호 204)의 VL-CDR2, QQGYTYPFT(서열번호 205)의 VL-CDR3;
11) 항체 06A09: SYWMN(서열번호 206)의 VH-CDR1, MIDPSDSETHYNQIFRD(서열번호 207)의 VH-CDR2, QDIVTTVDY(서열번호 208)의 VH-CDR3, KSSQSLLYSINQKNFLA(서열번호 209)의 VL-CDR1, WASTRES(서열번호 210)의 VL-CDR2, QQHYGYPFT(서열번호 211)의 VL-CDR3; 또는
12) VH 또는 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 각각의 모 항체 ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159, ZIL171, 04H07 또는 06A09와 상이한 1) 내지 11)의 변이체.
본 발명의 일부 구현예에서,
1) 항체 ZIL1은 하기 중 하나 이상을 포함하고:
a) CAN-ZIL1_VL을 포함하는 가변 경쇄:
QSVLTQPTSVSGSLGQRVTISCSGSTNNIGILAATWYQQLPGKAPKVLVYSDGNRPSGVPDRFSGSKSGNSATLTITGLQAEDEADYYCQSFDTTLDAYVFGSGTQLTVL(서열번호 77), 및
b) CAN-ZIL1_VH를 포함하는 가변 중쇄:
EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLQWVAHINSGGSSTYYADAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVEVYTTLAAFWTDNFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 75);
2) 항체 ZIL8은 하기 중 하나 이상을 포함하거나:
a) CAN-ZIL8_VL을 포함하는 가변 경쇄:
QSVLTQPASVSGSLGQKVTISCTGSSSNIGSGYVGWYQQLPGTGPRTLIYYNSDRPSGVPDRFSGSRSGTTATLTISGLQAEDEADYYCSVYDRTFNAVFGGGT(서열번호 81), 및
b) CAN-ZIL8_VH를 포함하는 가변 중쇄:
EVQLVESGGDLVKPAGSLRLSCVASGFTFSDYAMSWVRQAPGRGLQWVAGIDSVGSGTSYADAVKGRFTISRDDAKNTLYLQMFNLRAEDTAIYYCASGFPGSFEHWGQGTLVTVSS(서열번호 79);
항체 ZIL8은 하기 중 하나 이상을 포함하거나:
c) ZTS_5864_VL을 포함하는 가변 경쇄:
QSVLTQPSSVSGTLGQRITISCTGSSSNIGSGYVGWYQQVPGMGPKTVIYYNSDRPSGVPDRFSGSKSGSSGTLTITGLQAEDEADYYCSVYDRTFNAVFGGGTHLTVLGQPKSAPPRSHSSRPISYAVFCL(서열번호 230), 및
d) ZTS_5864_VH를 포함하는 가변 중쇄:
DVQLVESGGDLVKPGGSLRLTCVASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLQWVAGIDSVGSGTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKTEDTATYYCASGFPGSFEHWGQGALVTVSS(서열번호 228);
항체 ZIL8은 하기 중 하나 이상을 포함하고:
e) ZTS_5865_VL을 포함하는 가변 경쇄:
SVLTQPSSVSGTLGQRITISCTGSSSNIGSGYVGWYQQVPGMGPKTVIYYNSDRPSGVPDRFSGSKSGSSGTLTITGLQAEDEADYYCSVYDRTFNAVFGGGTHLTVLGQPKSAPPRSHSSRPISYAVFCL(서열번호 234), 및
f) ZTS_5865_VH를 포함하는 가변 중쇄:
DVQLVESGGDLVKPGGSLRLTCVASGFTFSDYAMNWVRQAPGKGLQWVAGIDSVGSGTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSGLKTEDTATYYCASGFPGSFEHWGQGTLVTVSS(서열번호 232);
3) 항체 ZIL9는 하기 중 하나 이상을 포함하고:
a) CAN-ZIL9_VL을 포함하는 가변 경쇄:
SSVLTQPPSVSVSLGQTATISCSGESLNEYYTQWFQQKAGQAPVLVIYRDTERPSGIPDRFSGSSSGNTHTLTISGARAEDEADYYCESAVDTGTLVFGGGTHLAVL(서열번호 85), 및
b) CAN-ZIL9_VH를 포함하는 가변 중쇄:
EVQLVESGGDLVKPPGSLRLSCVASGFTFSSYDMTWVRQAPGKGLQWVADVNSGGTGTAYAVAVKGRFTISRDNAKKTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLGVRDGLSVWGQGTLVTVSS(서열번호 83);
4) 항체 ZIL11은 하기 중 하나 이상을 포함하고:
a) CAN-ZIL11_VL을 포함하는 가변 경쇄:
SSVLTQPPSVSVSLGQTATISCSGESLSNYYAQWFQQKAGQAPVLVIYKDTERPSGIPDRFSGSSSGNTHTLTISGARAEDEADYYCESAVSSDTIVFGGGT(서열번호 89), 및
b) CAN-ZIL11_VH를 포함하는 가변 중쇄:
EVQLVESGGDLVKPAGSLRLSCVASGFTFRTYVMNWVRQAPGKGLQWVASINGGGSSPTYADAVRGRFTVSRDNAQNSLFLQMNSLRAEDTAVYFCVVSMVGPFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 87);
5) 항체 ZIL69는 하기 중 하나 이상을 포함하고:
a) CAN-ZIL69_VL을 포함하는 가변 경쇄:
SSVLTQPPSVSVSLGQTATISCSGESLNKYYAQWFQQKAGQAPVLVIYKDTERPSGIPDRFSGSSAGNTHTLTISGARAEDEADYYCESAVSSETNVFGSGTQLTVL(서열번호 93), 및
b) CAN-ZIL69_VH를 포함하는 가변 중쇄:
EVQLVESGGDLVKPAGSLRLSCVASGFTFSSYAMKWVRQAPGKGLQWVATINNDGTRTGYADAVRGRFTISKDNAKNTLYLQMDSLRADDTAVYYCTKGNAESGCTGDHCPPYWGQGTLVTVSS(서열번호 91);
6) 항체 ZIL94는 하기 중 하나 이상을 포함하고:
a) CAN-ZIL94_VL을 포함하는 가변 경쇄:
QTVVIQEPSLSVSPGGTVTLTCGLNSGSVSTSNYPGWYQQTRGRTPRTIIYDTGSRPSGVPNRFSGSISGNKAALTITGAQPEDEADYYCSLYTDSDILVFGGGTHLTVL(서열번호 97), 및
b) CAN-ZIL94_VH를 포함하는 가변 중쇄:
EVQLVDSGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSTYFMSWVRQAPGRGLQWVALISSDGSGTYYADAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAIFWRAFNDWGQGTLVTVSS(서열번호 95);
7) 항체 ZIL154는 하기 중 하나 이상을 포함하고:
a) CAN-ZIL154_VL을 포함하는 가변 경쇄:
DIVVTQTPLSLSVSPGETASFSCKASQSLLHSDGNTYLDWFRQKPGQSPQRLIYKVSNRDPGVPDRFSGSGSGTDFTLRISGVEADDAGLYYCMQAIHFPLTFGAGTKVELK(서열번호 101), 및
b) CAN-ZIL154_VH를 포함하는 가변 중쇄:
EVHLVESGGDLVKPWGSLRLSCVASGFTFSDRGMSWVRQSPGKGLQWVAYIRYDGSRTDYADAVEGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWDGSSFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 99);
8) 항체 ZIL159는 하기 중 하나 이상을 포함하고:
a) CAN-ZIL159_VL을 포함하는 가변 경쇄:
SNVLTQPPSVSVSLGQTATISCSGETLNRFYTQWFQQKAGQAPVLVIYKDTERPSGIPDRFSGSSSGNIHTLTISGARAEDEAAYYCKSAVSIDVGVFGGGTHLTVF(서열번호 105), 및
b) CAN-ZIL159_VH를 포함하는 가변 중쇄:
EVQLVESGGDLVKPAGSLRLSCVASGFTFSSYVMTWVRQAPGKGLQWVAGINSEGSRTAYADAVKGRFTISRDNAKNTLYLQIDSLRAEDTAIYYCATGDIVATGTSYWGQGTLVTVSS(서열번호 103);
9) 항체 ZIL171은 하기 중 하나 이상을 포함하고:
a) CAN-ZIL171_VL을 포함하는 가변 경쇄:
SSVLTQPPSVSVSLGQTATISCSGKSLSYYYAQWFQQKAGQAPVLVIYKDTERPSGIPDRFSGSSSGNTHTLTISGARAEDEADYYCESAVSSDTIVFGGGTHLTVL(서열번호 109), 및
b) CAN-ZIL171_VH를 포함하는 가변 중쇄:
EVQLVESGGDLVKPAGSLRLSCVASGFTFRTYVMNWVRQAPGKGLQWVASINGGGSSPTYADAVRGRFTVSRDNAQNSLFLQMNSLRAEDTAIYFCVVSMVGPFDYWGHGTLVTVSS(서열번호 107);
10) 항체 04H07은 하기 중 하나 이상을 포함하고:
a) Mu_04H07_VL을 포함하는 가변 경쇄:
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSINQKNHLAWFQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPARFTGSGSGTDFTLTISSVKTEDLAVYYCQQGYTYPFTFGSGTKLEIK(서열번호 214), 및
b) Mu_04H07_VH를 포함하는 가변 중쇄:
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWAKQRPGQGLEWIGMIDPSDSEIHYNQVFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARQDIVTTVDYWGQGTTLTVSS(서열번호 212);
11) 항체 06A09는 하기 중 하나 이상을 포함한다:
a) Mu_06A09_VL을 포함하는 가변 경쇄:
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSINQKNFLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKSEDLAVYYCQQHYGYPFTFGSGTKLEIK(서열번호 218), 및
b) Mu_06A09_VH를 포함하는 가변 중쇄:
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKAYGYTFTSYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIDPSDSETHYNQIFRDKATLTIDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARQDIVTTVDYWGQGTTLTVSS(서열번호 216).
다른 구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 항체를 생산하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 이의 범위 내에서, 본 발명의 항-IL-31 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159, ZIL171, 04H07, 06A09, 또는 IL-31-특이적 폴리펩타이드 또는 이의 펩타이드의 아미노산 서열을 인코딩하는 임의의 뉴클레오타이드 서열이 본 발명의 범위 내에서 또한 포함된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 가변 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 서열의 하기 조합 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다:
1) 15H05: SYTIH(서열번호 1)의 가변 중쇄(VH)-CDR1, NINPTSGYTENNQRFKD(서열번호 2)의 VH-CDR2, 및 WGFKYDGEWSFDV(서열번호 3)의 VH-CDR3;
2) ZIL1: SYGMS(서열번호 13)의 VH-CDR1, HINSGGSSTYYADAVKG(서열번호 14)의 VH-CDR2, 및 VYTTLAAFWTDNFDY(서열번호 15)의 VH-CDR3;
3) ZIL8: DYAMS(서열번호 19)의 VH-CDR1, GIDSVGSGTSYADAVKG(서열번호 20)의 VH-CDR2, 및 GFPGSFEH(서열번호 21)의 VH-CDR3;
4) ZIL9: SYDMT(서열번호 25)의 VH-CDR1, DVNSGGTGTAYAVAVKG(서열번호 26)의 VH-CDR2, 및 LGVRDGLSV(서열번호 27)의 VH-CDR3;
5) ZIL11: TYVMN(서열번호 31)의 VH-CDR1, SINGGGSSPTYADAVRG(서열번호 32)의 VH-CDR2, 및 SMVGPFDY(서열번호 33)의 VH-CDR3;
6) ZIL69: SYAMK(서열번호 37)의 VH-CDR1, TINNDGTRTGYADAVRG(서열번호 38)의 VH-CDR2, 및 GNAESGCTGDHCPPY(서열번호 39)의 VH-CDR3;
7) ZIL94: TYFMS(서열번호 43)의 VH-CDR1, LISSDGSGTYYADAVKG(서열번호 44)의 VH-CDR2, 및 FWRAFND(서열번호 45)의 VH-CDR3
8) ZIL154: DRGMS(서열번호 49)의 VH-CDR1, YIRYDGSRTDYADAVEG(서열번호 50)의 VH-CDR2, 및 WDGSSFDY(서열번호 51)의 VH-CDR3;
9) ZIL159: SYVMT(서열번호 55)의 VH-CDR1, GINSEGSRTAYADAVKG(서열번호 56)의 VH-CDR2, 및 GDIVATGTSY(서열번호 57)의 VH-CDR3;
10) ZIL171: TYVMN(서열번호 61)의 VH-CDR1, SINGGGSSPTYADAVRG(서열번호 62)의 VH-CDR2, 및 SMVGPFDY(서열번호 63)의 VH-CDR3,
11) 04H07: SYWMN(서열번호 200)의 VH-CDR1, MIDPSDSEIHYNQVFKD(서열번호 201)의 VH-CDR2, 및 QDIVTTVDY(서열번호 202)의 VH-CDR3;
12) 06A09: SYWMN(서열번호 206)의 VH-CDR1, MIDPSDSETHYNQIFRD(서열번호 207)의 VH-CDR2, 및 QDIVTTVDY(서열번호 208)의 VH-CDR3; 또는
13) VH CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 각각의 모 항체 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159, ZIL171, 04H07 또는 06A09의 CDR과 상이한 1) 내지 12)의 변이체.
일 구현예에서, 상기 기재된 단리된 핵산은 가변 경쇄 상보성 결정 영역(CDR) 서열의 하기 조합 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다:
1) 15H05: RASQGISIWLS(서열번호 4)의 가변 경쇄(VL)-CDR1, KASNLHI(서열번호 5)의 VL-CDR2, 및 LQSQTYPLT(서열번호 6)의 VL-CDR3;
2) ZIL1: SGSTNNIGILAAT(서열번호 16)의 VL-CDR1, SDGNRPS(서열번호 17)의 VL-CDR2, 및 QSFDTTLDAYV(서열번호 18)의 VL-CDR3;
3) ZIL8: TGSSSNIGSGYVG(서열번호 22)의 VL-CDR1, YNSDRPS(서열번호 23)의 VL-CDR2, 및 SVYDRTFNAV(서열번호 24)의 VL-CDR3;
4) ZIL9: SGESLNEYYTQ(서열번호 28)의 VL-CDR1, RDTERPS(서열번호 29)의 VL-CDR2, 및 ESAVDTGTLV(서열번호 30)의 VL-CDR3;
5) ZIL11: SGESLSNYYAQ(서열번호 34)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 35)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSDTIV(서열번호 36)의 VL-CDR3;
6) ZIL69: SGESLNKYYAQ(서열번호 40)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 41)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSETNV(서열번호 42)의 VL-CDR3;
7) ZIL94: GLNSGSVSTSNYPG(서열번호 46)의 VL-CDR1, DTGSRPS(서열번호 47)의 VL-CDR2, 및 SLYTDSDILV(서열번호 48)의 VL-CDR3;
8) ZIL154: KASQSLLHSDGNTYLD(서열번호 52)의 VL-CDR1, KVSNRDP(서열번호 53)의 VL-CDR2, 및 MQAIHFPLT(서열번호 54)의 VL-CDR3;
9) ZIL159: SGETLNRFYTQ(서열번호 58)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 59)의 VL-CDR2, 및 KSAVSIDVGV(서열번호 60)의 VL-CDR3;
10) ZIL171: SGKSLSYYYAQ(서열번호 64)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 65)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSDTIV(서열번호 66)의 VL-CDR3;
11) 04H07: KSSQSLLYSINQKNHLA(서열번호 203)의 VL-CDR1, WASTRES(서열번호 204)의 VL-CDR2, QQGYTYPFT(서열번호 205)의 VL-CDR3;
12) 06A09: KSSQSLLYSINQKNFLA(서열번호 209)의 VL-CDR1, WASTRES(서열번호 210)의 VL-CDR2, QQHYGYPFT(서열번호 211)의 VL-CDR3; 또는
13) VH 또는 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 각각의 모 항체 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159, ZIL171, 04H07 또는 06A09의 CDR과 상이한 1) 내지 12)의 변이체.
일 구현예에서, 본 발명은 가변 경쇄 상보성 결정 영역(CDR) 서열의 하기 조합 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다:
1) 15H05: RASQGISIWLS(서열번호 4)의 가변 경쇄(VL)-CDR1, KASNLHI(서열번호 5)의 VL-CDR2, 및 LQSQTYPLT(서열번호 6)의 VL-CDR3;
2) ZIL1: SGSTNNIGILAAT(서열번호 16)의 VL-CDR1, SDGNRPS(서열번호 17)의 VL-CDR2, 및 QSFDTTLDAYV(서열번호 18)의 VL-CDR3;
3) ZIL8: TGSSSNIGSGYVG(서열번호 22)의 VL-CDR1, YNSDRPS(서열번호 23)의 VL-CDR2, 및 SVYDRTFNAV(서열번호 24)의 VL-CDR3;
4) ZIL9: SGESLNEYYTQ(서열번호 28)의 VL-CDR1, RDTERPS(서열번호 29)의 VL-CDR2, 및 ESAVDTGTLV(서열번호 30)의 VL-CDR3;
5) ZIL11: SGESLSNYYAQ(서열번호 34)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 35)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSDTIV(서열번호 36)의 VL-CDR3;
6) ZIL69: SGESLNKYYAQ(서열번호 40)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 41)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSETNV(서열번호 42)의 VL-CDR3;
7) ZIL94: GLNSGSVSTSNYPG(서열번호 46)의 VL-CDR1, DTGSRPS(서열번호 47)의 VL-CDR2, 및 SLYTDSDILV(서열번호 48)의 VL-CDR3;
8) ZIL154: KASQSLLHSDGNTYLD(서열번호 52)의 VL-CDR1, KVSNRDP(서열번호 53)의 VL-CDR2, 및 MQAIHFPLT(서열번호 54)의 VL-CDR3;
9) ZIL159: SGETLNRFYTQ(서열번호 58)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 59)의 VL-CDR2, 및 KSAVSIDVGV(서열번호 60)의 VL-CDR3;
10) ZIL171: SGKSLSYYYAQ(서열번호 64)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 65)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSDTIV(서열번호 66)의 VL-CDR3;
11) 04H07: KSSQSLLYSINQKNHLA(서열번호 203)의 VL-CDR1, WASTRES(서열번호 204)의 VL-CDR2, 및 QQGYTYPFT(서열번호 205)의 VL-CDR3;
12) 06A09: KSSQSLLYSINQKNFLA(서열번호 209)의 VL-CDR1, WASTRES(서열번호 210)의 VL-CDR2, QQHYGYPFT(서열번호 211)의 VL-CDR3; 또는
13) VL CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 각각의 모 항체 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159, ZIL171, 04H07 또는 06A09의 CDR과 상이한 1) 내지 12)의 변이체.
본 발명은 추가로 상기 기재된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
아래 추가로 상세히 기재될 바와 같이, 가변 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 서열들의 상기-기재된 조합 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 서열은 가변 경쇄 CDR 서열들의 상기-기재된 조합 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 서열과 함께 동일 벡터에서 함유될 수 있다. 대안적으로, 가변 경쇄 CDR 서열들의 상기-기재된 조합 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 서열 및 가변 중쇄 CDR 서열드의 상기-기재된 조합 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 서열은 각각 별도 벡터에서 함유될 수 있다.
유전 코드가 축퇴적이기 때문에, 1개 보다 많은 코돈이 특정 아미노산을 인코딩하는 데 사용될 수 있다. 유전 코드를 사용하여, 하나 이상의 상이한 뉴클레오타이드 서열은 확인될 수 있고, 각각의 이들은 아미노산을 인코딩할 수 있을 것이다. 특정 올리고뉴클레오타이드가, 사실상, 실제 XXX-인코딩 서열을 구성할 것이라는 개연성은 특정 코돈이 항-IL-31 항체 또는 이의 IL-31-특이적 부분을 발현시키는 진핵 또는 원핵 세포에서 (특정 아미노산을 인코딩하는 데) 실제로 사용되는 빈도 그리고 비정상 염기 짝짓기 관계를 고려함으로써 추정될 수 있다. 그와 같은 "코돈 사용 규칙"은 Lathe 등, 183 J. Molec. Biol. 1-12 (1985)에 의해 개시된다. Lathe의 "코돈 사용 규칙"을 사용하여, 단일 뉴클레오타이드 서열, 또는 항-IL-31 서열을 인코딩할 수 있는 이론상 "가장 유망한" 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 뉴클레오타이드 서열의 세트는 확인될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 항체 코딩 영역이 또한 본원에 기재된 항체 및 펩타이드의 변이체(작용제)를 초래하는 표준 분자 생물학적 기법을 사용하여 실재하는 항체 유전자를 변경시킴으로써 제공될 수 있음이 또한 의도된다. 그와 같은 변이체는, 항체의 CDR 영역에서 포함하는, 항-IL-31 항체 또는 IL-31-특이적 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 아미노산 서열에서 결실, 부가 및 치환을 비제한적으로 포함한다. 예를 들어, 항체의 CDR 영역 또는 다른 영역 내에서 항원 결합을 위하여 비-임계적인 것으로 발견되는 잔기는 치환될 수 있다. 특정 잔기가 항원 결합에 비-임계적인지 여부를 평가하는 데 사용되는 실험작업의 유형의 예는 아래 실시예 섹션의 섹션 1.21에서 기재된다. 일 구현예에서, 하나 이상의 치환은, 본원에 추가로 상세히 기재되는, 보존적 아미노산 치환이다. 하지만, CDR 변이체를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 변이체는 보존적 아미노산 치환에 제한되지 않는다.
예를 들어, 일 클래스의 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 그와 같은 치환은 유사한 특징의 또 다른 아미노산으로 항-IL-31 항체 펩타이드에서 주어진 아미노산을 치환하는 것들이다. 보존적 치환으로서 전형적으로 보이는 것은, 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu, 및 Ile 중에서, 하나의 또 다른 것으로의 대체; 하이드록실 잔기 Ser 및 Thr의 교환, 산성 잔기 Asp 및 Glu의 교환, 아미드 잔기 Asn 및 Gln 사이의 치환, 염기성 잔기 Lys 및 Arg의 교환, 방향족 잔기 Phe, Tyr, 및 기타 등등의 대체이다. 아미노산 변화가 표현형으로 침묵성일 것 같은 것에 관한 지침은 Bowie 등, 247 Science 1306-10 (1990)에서 발견된다.
변이체 또는 작용제 항-IL-31 항체 또는 IL-31-특이적 폴리펩타이드, 또는 펩타이드는 완전 기능성일 수 있거나 하나 이상의 활성에서 기능이 부족할 수 있다. 완전 기능성 변이체는 비-임계 잔기에서 또는 비-임계 영역에서의 변이 또는 보존적 변이만을 전형적으로 함유한다. 기능성 변이체는 또한 기능에서 변화 없음 또는 미미한 변화를 초래하는 유사 아미노산의 치환을 함유할 수 있다. 대안적으로, 그와 같은 치환은 어느 정도 기능에 긍정적으로 또는 부정적으로 영향을 미칠 수 있다. 비-기능성 변이체는 하나 이상의 비-보존적 아미노산 치환, 결실, 삽입, 역위, 또는 절단 또는 임계 잔기 또는 임계 영역에서 치환, 삽입, 역위, 또는 결실을 전형적으로 함유한다.
기능에 필수적인 아미노산은 당업계에서 알려진 방법, 예컨대 부위-유도된 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발에 의해 확인될 수 있다. Cunningham 등, 244 Science 1081-85 (1989). 후자 절차는 분자에서 모든 잔기에 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 수득한 돌연변이체 분자는 그 다음 생물학적 활성, 예컨대 에피토프 결합 또는 시험관내 ADCC 활성에 대하여 시험된다. 리간드-수용체 결합에 대하여 임계적인 부위는 또한 구조 분석, 예컨대 결정학, 핵자기 공명, 또는 광친화도 표지화에 의해 결정될 수 있다. Smith 등, 224 J. Mol. Biol. 899-904 (1992); de Vos 등, 255 Science 306-12 (1992).
게다가, 폴리펩타이드는 20개의 "자연 발생" 아미노산 이외의 아미노산을 종종 함유한다. 추가로, 말단 아미노산을 포함하는, 많은 아미노산은 자연 공정, 예컨대 프로세싱 및 기타 번역후 변형에 의해, 또는 종래 기술에서 잘 알려진 화학적 변형 기술에 의해 변형될 수 있다. 알려진 변형은, 비제한적으로, 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 결합, 헴 모이어티의 공유 결합, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 포스포티딜이노시톨의 공유 결합, 가교-결합, 고리화, 디설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교결합의 형성, 시스틴의 형성, 파이로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마 카복실화, 당화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질분해 프로세싱, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 아미노산의 단백질로의 트랜스퍼-RNA 매개된 부가, 예컨대 아르기닐화, 및 유비퀴틴화를 포함한다.
그와 같은 변형은 당업자에게 잘 알려지고 과학 문헌에서 매우 상세히 기재되어 왔다. 몇몇 특히 흔한 변형, 당화, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카복실화, 하이드록실화 및 ADP-리보실화는, 예를 들어, 대부분의 기초 텍스트, 예컨대 Proteins--Structure and Molecular Properties (2nd ed., T. E. Creighton, W.H. Freeman & Co., NY, 1993)에서 기재된다. 많은 상세 검토는, 예컨대 Wold, Posttranslational Covalent Modification of proteins, 1-12 (Johnson, ed., Academic Press, NY, 1983); Seifter 등. 182 Meth. Enzymol. 626-46 (1990); 및 Rattan 등. 663 Ann. NY Acad. Sci. 48-62 (1992)에 의해 이 대상체에서 이용가능하다.
따라서, 본 발명의 IL-31-특이적 항체, 폴리펩타이드, 및 펩타이드는 또한 치환된 아미노산 잔기가 유전 코드에 의해 인코딩된 것이 아닌 유도체 또는 유사체를 포괄한다.
유사하게, 아미노산 서열뿐만 아니라 변이에 있어서 부가 및 치환, 그리고 방금 기재된 변형은 IL-31 항원 및/또는 이의 에피토프 또는 펩타이드의 아미노산 서열에 똑같이 적용가능할 수 있고, 따라서 본 발명에 의해 포괄된다. 상기 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 단클론성 항체를 인코딩하는 유전자는 IL-31의 인식에서 특히 효과적이다.
항체 유도체
항체 유도체가 본 발명의 범위 내에서 포함된다. 항체의 "유도체"는 정상적으로 단백질의 한 부분이 아닌 추가의 화학적 모이어티를 함유한다. 단백질의 공유 변형은 본 발명의 범위 내에서 포함된다. 그와 같은 변형은 선택되는 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화 제제와 항체의 표적화된 아미노산 잔기를 반응시킴으로써 분자에 도입될 수 있다. 예를 들어, 종래 기술에서 잘-알려진, 2기능성 제제를 이용한 유도체화는 수-불용성 지지체 매트릭스에 또는 기타 거대분자 담체에 항체 또는 단편을 가교-결합시키는 데 유용하다.
유도체는 또한 표지되는 방사성 표지화된 단클론성 항체를 포함한다. 예를 들어, 방사성 요오드(125I, 131I), 탄소(14C), 황(35S), 인듐(111In), 삼중수소(3H) 또는 기타 등등으로; 효소, 예컨대 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제, 베타-D-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, 글루코아밀라제, 카복실산 안히드라제, 아세틸콜린 에스테라제, 리소자임, 말레이트 데하이드로게나제 또는 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제와, 바이오틴 또는 아비딘이 있는 단클론성 항체의 컨쥬게이트; 및 또한 생물발광 제제(예컨대 루시퍼라제), 화학발광 제제(예컨대 아크리딘 에스테르) 또는 형광 제제(예컨대 피코빌리프로테인)와 단클론성 항체의 컨쥬게이트.
본 발명의 또 다른 유도체 2기능성 항체는, 2개의 상이한 항원 그룹을 인식하는 2개의 별도 항체의 부분들을 조합함으로써 생성된, 이중특이적 항체이다. 이것은 가교결합 또는 재조합 기법에 의해 달성될 수 있다. 추가적으로, 모이어티는 항체 또는 이의 한 부분에 첨가되어 (예를 들면, 혈류로부터 청소 시간을 연장함으로써) 생체내 반감기를 증가시킬 수 있다. 그와 같은 기법은, 예를 들어, PEG 모이어티 첨가(또한 일명 PEG화)를 포함하고, 종래 기술에서 잘-알려진다. 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0031671를 참고한다.
항체의 재조합 발현
일부 구현예에서, 대상 단클론성 항체를 인코딩하는 핵산은 숙주 세포에 직접적으로 도입되고, 세포는 인코딩된 항체의 발현을 유도하는 데 충분한 조건 하에서 인큐베이션된다. 대상 핵산이 세포에 도입된 후, 세포는 항체의 발현을 허용하기 위해 약 1-24 시간의 기간 동안, 정상적으로 37℃에서, 때때로 선택 하에서 전형적으로 인큐베이션된다. 일 구현예에서, 항체는 세포가 성장중인 배지의 상청액에 분비된다.
전통적으로, 단클론성 항체는 쥣과 하이브리도마 계통에서 고유 분자로서 생산되어 왔다. 그 기술에 더하여, 본 발명은 단클론성 항체의 재조합 DNA 발현을 제공한다. 이것은 개화된, 고양이화된, 말화된, 완전 갯과, 완전 고양잇과, 및 완전 말과 항체, 뿐만 아니라 선택의 숙주 종에서 광범위한 항체 유도체 및 융합 단백질의 생산을 허용한다.
본 발명의 적어도 하나의 항-IL-31 항체, 부분 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열은, 결찰용 평활단부 또는 부착단부 말단, 적당한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 소화, 적당한 경우 점착성 단말의 충전, 바람직하지 않은 연결을 피하기 위한 알칼린 포스파타제 처리, 및 적당한 리가제를 이용한 결찰을 포함하는, 종래의 기법에 따라 벡터 DNA와 재조합될 수 있다. 그와 같은 조작용 기법은, 예를 들면, Maniatis 등, MOLECULAR CLONING, LAB. MANUAL, (Cold Spring Harbor Lab. Press, NY, 1982 and 1989)에 의해 개시되고, Ausubel 등. 1993 상기는 단클론성 항체 분자 또는 이의 항원 결합 영역을 인코딩하는 핵산 서열을 작제하는 데 사용될 수 있다.
핵산 분자, 예컨대 DNA는 전사 및 번역 조절 정보를 함유하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하면 폴리펩타이드를 "발현시킬" 수 있다고 언급되고 그와 같은 서열은 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 "작동가능하게 연결된"다. 작동가능한 연결은 조절 DNA 서열 및 발현되고자 하는 DNA 서열이 회복가능한 양으로 항-IL-31 펩타이드 또는 항체 부분과 같은 유전자 발현을 허용하는 방식으로 이어지는 연결이다. 유전자 발현에 필요한 조절 영역의 정확한 성질은 유사한 기술분야에서 잘 알려진 바와 같이, 유기체부터 유기체까지 다양할 수 있다. 예를 들면, Sambrook 등, 2001 상기; Ausubel 등, 1993 상기를 참고한다.
본 발명은 따라서, 어느 한쪽 원핵 또는 진핵 세포에서, 항-IL-31 항체 또는 IL-31-특이적 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 발현을 포괄한다. 적합한 숙주는 어느 한쪽 생체내, 또는 원위치 박테리아, 효모, 곤충, 균, 새 및 포유류 세포를 포함하는 박테리아 또는 진핵 숙주, 또는 포유류, 곤충, 새 또는 효모 기원의 숙주 세포를 포함한다. 포유류 세포 또는 조직은 인간, 영장류, 햄스터, 토끼, 설치류, 암소, 돼지, 양, 말, 염소, 개 또는 고양이 기원일 수 있지만, 임의의 기타 포유류 세포는 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 도입된 뉴클레오타이드 서열은 수령체 숙주에서 자율 복제할 수 있는 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 혼입될 것이다. 임의의 광범위한 벡터는 이 목적에 이용될 수 있다. 예를 들면, Ausubel 등, 1993 상기를 참고한다. 특정 플라스미드 또는 바이러스 벡터 선택에서 중요한 인자는 하기를 포함한다: 벡터를 함유하는 수령체 세포가 벡터를 함유하지 않는 그들 수령체 세포로부터 선택 및 인식될 수 있는 용이성; 특정 숙주에서 요구되는 벡터의 카피 수; 및 상이한 종의 숙주 세포들 사이 벡터를 "왕복"할 수 있는 것이 바람직한지의 여부.
당업계에 알려진 원핵 벡터의 예는 플라스미드, 예컨대 대장균에서 복제할 수 있는 것들(예컨대, 예를 들어, pBR322, ColE1, pSC101, pACYC 184, .pi.VX)을 포함한다. 그와 같은 플라스미드는, 예를 들어, Maniatis 등, 1989 상기; Ausubel 등, 1993 상기에 의해 개시된다. 바실러스 플라스미드는 pC194, pC221, pT127 등을 포함한다. 그와 같은 플라스미드는 그리츠잔(Gryczan)에 의해, THE MOLEC. BIO. OF THE BACILLI 307-329 (Academic Press, NY, 1982)에서 개시된다. 적합한 스트렙토마이세스 플라스미드는 pIJ101(Kendall 등, 169 J. Bacteriol. 4177-83 (1987)), 및 스트렙토마이세스 박테리오파지, 예컨대 .phi.C31(Chater 등, in SIXTH INT'L SYMPOSIUM ON ACTINOMYCETALES BIO. 45-54 (Akademiai Kaido, Budapest, Hungary 1986)을 포함한다. 슈도모나스 플라스미드는 John 등, 8 Rev. Infect. Dis. 693-704 (1986); Izaki, 33 Jpn. J. Bacteriol. 729-42 (1978); 및 Ausubel 등, 1993 상기에서 검토된다.
대안적으로, 항-IL-31항체 또는 펩타이드를 인코딩하는 cDNA의 발현에 유용한 유전자 발현 요소는 비제한적으로 (a) 바이러스 전사 프로모터 및 그들의 인핸서 요소, 예컨대 SV40 초기 프로모터(Okayama 등, 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983)), 라우스 육종 바이러스 LTR(Gorman 등, 79 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 6777 (1982)), 및 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스 LTR(Grosschedl 등, 41 Cell 885 (1985)); (b) 스플라이스 영역 및 폴리아데닐화 부위, 예컨대 SV40 후기 영역으로부터 유래된 것들(Okayarea 등, MCB, 3: 280 (1983)), 및 (c) 예컨대 SV40에서 폴리아데닐화 부위(Okayama 등, 1983, 상기)를 포함한다.
면역글로불린 cDNA 유전자는, 발현 요소로서 SV40 초기 프로모터 및 이의 인핸서, 마우스 면역글로불린 H 쇄 프로모터 인핸서, SV40 후기 영역 mRNA 스플라이싱, 토끼 S-글로빈 개재 서열, 면역글로불린 및 토끼 S-글로빈 폴리아데닐화 부위, 및 SV40 폴리아데닐화 요소를 사용하여, Weidle 등, 51(1) 유전자 21-29 (1987)에 의해 기재된 바와 같이 발현될 수 있다.
부분 cDNA, 부분 게놈 DNA로 구성된 면역글로불린 유전자(Whittle 등, 1 Protein Engin. 499-505 (1987))에 대하여, 전사 프로모터는 인간 사이토메갈로바이러스일 수 있고, 프로모터 인핸서는 사이토메갈로바이러스 및 마우스/인간 면역글로불린일 수 있고, mRNA 스플라이싱 및 폴리아데닐화 영역은 고유 염색체 면역글로불린 서열일 수 있다.
일 구현예에서, 설치류 세포에서의 cDNA 유전자의 발현에 대하여, 전사 프로모터는 바이러스 LTR 서열이고, 전사 프로모터 인핸서는 어느 한쪽 또는 양쪽 마우스 면역글로불린 중쇄 인핸서 및 바이러스 LTR 인핸서이고, 스플라이스 영역은 31 bp 초과의 인트론을 함유하고, 폴리아데닐화 및 전사 종결 영역은 합성되고 있는 면역글로불린 쇄에 상응하는 고유 염색체 서열로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 다른 단백질을 인코딩하는 cDNA 서열은 상기-인용된 발현 요소와 조합되어 포유류 세포에서 단백질의 발현을 달성한다.
각각의 융합된 유전자는 발현 벡터에 조립될 수 있거나 삽입될 수 있다. 키메라 면역글로불린 쇄 유전자 산물을 발현시킬 수 있는 수령체 세포는 그 다음 항-IL-31 펩타이드 또는 키메라 H 또는 키메라 L 쇄-인코딩 유전자로 하나씩 형질주입되거나, 키메라 H 및 키메라 L 쇄 유전자로 공-형질주입된다. 형질주입된 수령체 세포는 혼입된 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양되고 발현된 면역글로불린 쇄 또는 온전한 항체 또는 단편은 배양물로부터 회복된다.
일 구현예에서, 항-IL-31 펩타이드 또는 키메라 H 및 L 쇄, 또는 이들의 부분을 인코딩하는 융합된 유전자는 수령체 세포를 그 다음 공-형질주입하는 데 사용되는 별도 발현 벡터에서 조립된다. 대안적으로 키메라 H 및 L 쇄를 인코딩하는 융합된 유전자는 동일한 발현 벡터에서 조립될 수 있다.
발현 벡터의 형질주입 및 키메라 항체의 생산에 대하여, 수령체 세포주는 골수종 세포일 수 있다. 골수종 세포는 형질주입된 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 면역글로불린을 합성, 조립 및 분비시킬 수 있고 면역글로불린의 당화용 기전을 보유한다. 골수종 세포는 배양물에서 또는 마우스의 복강에서 성장될 수 있고, 여기에서 분비된 면역글로불린은 복수액으로부터 수득될 수 있다. 기타 적합한 수령체 세포는 림프성 세포, 예컨대 인간 또는 비-인간 기원의 B 림프구, 인간 또는 비-인간 기원의 하이브리도마 세포, 또는 종간 헤테로하이브리도마 세포를 포함한다.
본 발명의 키메라, 개화된, 고양이화된, 말화된, 완전 갯과, 완전 고양잇과, 또는 완전 말과 항-IL-31 항체 작제물 또는 IL-31-특이적 폴리펩타이드 또는 펩타이드(예를 들면, 본원에 기재된 항체의 항원-결합 부분)를 운반하는 발현 벡터는, 형질전환, 형질주입, 컨쥬게이션, 원형질 융합, 인산칼슘-침전, 및 폴리양이온, 예컨대 디에틸아미노에틸(DEAE) 덱스트란을 이용한 응용과 같은 생화학 수단, 그리고 전기천공, 직접 미세주입, 및 미립자 폭격과 같은 기계적 수단을 포함하는, 임의의 다양한 적합 수단에 의해 적당한 숙주 세포에 도입될 수 있다. Johnston 등, 240 Science 1538-1541 (1988).
효모는 면역글로불린 H 및 L 쇄의 생산을 위하여 박테리아보다 실질적 이점을 제공할 수 있다. 효모는 당화를 포함하는 번역후 펩타이드 변형을 실행한다. 효모에서 원하는 단백질의 생산에 사용될 수 있는 고 카피 수 플라스미드 및 강한 프로모터 서열을 이용하는 다수의 재조합 DNA 전략은 현재 실재한다. 효모는 클로닝된 포유류 유전자 산물의 리더 서열을 인식하고 리더 서열을 보유하는 펩타이드(즉, 프레-펩타이드)를 분비한다. Hitzman 등, 11th Int'l Conference on Yeast, Genetics & Molec. Biol. (Montpelier, France, 1982).
효모 유전자 발현 시스템은 항-IL-31 펩타이드, 항체 및 조립된 쥣과 및 키메라, 헤테로키메라, 개화된, 고양이화된, 말화된, 완전 갯과, 완전 고양잇과, 또는 완전 말과 항체, 이의 단편 및 영역의 생산, 분비 및 안정성의 수준에 대하여 일상적으로 평가될 수 있다. 효모가 글루코스 풍부 배지에서 성장되는 경우 다량으로 생산된 당분해 효소에 대하여 코딩하는 적극적으로 발현된 유전자로부터 프로모터 및 종결 요소를 혼입시키는 임의의 일련의 효모 유전자 발현 시스템은 이용될 수 있다. 알려진 당분해 유전자는 또한 매우 효율적인 전사 조절 신호를 제공할 수 있다. 예를 들어, 포스포글리세린산 키나제(PGK) 유전자의 프로모터 및 종결자 신호는 이용될 수 있다. 다수의 접근법은 효모에서 클로닝된 면역글로불린 cDNA의 발현용 선택적 발현 플라스미드 평가를 위하여 실시될 수 있다(Vol. II DNA Cloning, 45-66, (Glover, ed.,) IRL Press, Oxford, UK 1985를 참고한다).
박테리아 균주는 또한 본 발명에 의해 기재된 항체 분자 또는 펩타이드의 생산을 위하여 숙주로서 이용될 수 있다. 숙주 세포와 호환성인 종으로부터 유래되는 레플리콘 및 조절 서열을 함유하는 플라스미드 벡터는 이들 박테리아 숙주에 관련되어 사용된다. 벡터는 복제 부위, 뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 특이적 유전자를 운반한다. 다수의 접근법은 박테리아에서 클로닝된 면역글로불린 cDNA에 의해 인코딩된 쥣과, 키메라, 헤테로키메라, 개화된, 고양이화된, 말화된, 완전 갯과, 완전 고양잇과, 또는 완전 말과 항체, 단편 및 영역 또는 항체 쇄의 생산용 발현 플라스미드 평가를 위하여 실시될 수 있다(Glover, 1985 상기; Ausubel, 1993 상기; Sambrook, 2001 상기; Colligan 등, eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, NY, NY (1994-2001); Colligan 등, eds. Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY (1997-2001)를 참고한다).
숙주 포유류 세포는 시험관내 또는 생체내 성장될 수 있다. 포유류 세포는 H 및 L 쇄의 리더 펩타이드 제거, 폴딩 및 조립, 항체 분자의 당화, 및 기능성 항체 단백질의 분비를 포함하여 면역글로불린 단백질 분자에 대한 번역후 변형을 제공한다.
상기 기재된 림프성 기원의 세포에 더하여, 항체 단백질의 생산용 숙주로서 유용할 수 있는 포유류 세포는 섬유아세포 기원의 세포, 예컨대 Vero(ATCC CRL 81) 또는 CHO-K1(ATCC CRL 61) 세포를 포함한다.
많은 벡터 시스템은 포유류 세포에서 클로닝된 항-IL-31 펩타이드 H 및 L 쇄 유전자의 발현에 이용가능하다(Glover, 1985 상기를 참고한다). 상이한 접근법은 완전 H2L2 항체를 수득하기 위해 뒤따를 수 있다. 세포내 회합 그리고 완전 사량체 H2L2 항체 및/또는 항-IL-31 펩타이드에 H 및 L 쇄의 연결을 달성하기 위해 동일 세포에서 H 및 L 쇄를 공-발현시키는 것이 가능하다. 공-발현은 동일 숙주에서 동일 또는 상이한 플라스미드 어느 한쪽을 사용함으로써 발생할 수 있다. 두 H 및 L 쇄 및/또는 항-IL-31 펩타이드용 유전자는 동일 플라스미드에 배치될 수 있고, 이는 그 다음 세포에 형질주입되고, 그것에 의하여 양쪽 쇄를 발현시키는 세포에 대하여 직접적으로 선택한다. 대안적으로, 세포는 1개의 쇄, 예를 들어 L 쇄를 인코딩하는 플라스미드로 먼저 형질주입된 다음, 제2 선택가능한 마커를 함유하는 H 쇄 플라스미드로 수득한 세포주가 형질주입될 수 있다. 어느 한쪽 경로를 통해 항-IL-31 펩타이드 및/또는 H2L2 분자를 생산하는 세포주는 추가의 선택가능한 마커와 함께 펩타이드, H, L, 또는 H 플러스 L 쇄의 추가의 카피를 인코딩하는 플라스미드로 형질주입되어 형질주입된 세포주의 향상된 안정성 또는 조립된 H2L2 항체 분자의 더 높은 생산과 같은 향상된 특성이 있는 세포주를 생성할 수 있다.
재조합 항체의 장기, 고수율 생산을 위하여, 안정한 발현은 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 분자를 안정하게 발현시키는, 세포주는 조작될 수 있다. 복제의 바이러스 기원을 함유하는 발현 벡터을 이용하기 보다, 숙주 세포는 면역글로불린 발현 카셋트 및 선택가능한 마커로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 이후, 조작된 세포는 농축된 배지에서 1-2 일 동안 성장하게 될 수 있고 그 다음 선택적 배지로 스위칭된다. 재조합 플라스미드에서 선택가능한 마커는 선택에 내성을 부여하고 세포가 플라스미드를 염색체에 안정하게 통합하고 성장하게 만들어 차례로 세포주에 클로닝 및 확장될 수 있는 중심지를 형성한다. 그와 같은 조작된 세포주는 항체 분자와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물/성분의 스크리닝 및 평가에서 특히 유용할 수 있다.
일단 본 발명의 항체가 생산되었다면, 면역글로불린 분자의 정제에 대하여 당업계에서 알려진 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 후 특이적 항원용 친화도, 및 크기화 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 분별 용해도에 의해, 또는 단백질의 정제용 임의의 기타 표준 기법에 의해 정제될 수 있다. 많은 구현예에서, 항체는 세포로부터 배양 배지에 분비되고 배양 배지로부터 수확된다.
약학적 적용
본 발명의 항-IL-31 항체 또는 IL-31-특이적 폴리펩타이드 또는 펩타이드는, 예를 들어 반려 동물, 예컨대 개, 고양이, 및 말에서 소양성 및/또는 알레르기성 병태의 치료에서 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 그와 같은 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 본원에 기재된 항-IL-31 항체의 항원-결합 부분을 포함한다. 더욱 특히, 본 발명은 추가로 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 및, 활성 구성성분으로서, 본 발명에 따른 항체 또는 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 항체는 본 발명에 따른 키메라, 헤테로키메라, 개화된, 고양이화된, 말화된, 완전 갯과, 완전 고양잇과, 또는 완전 말과 항체일 수 있다. 온전한 면역글로불린 또는 그들의 결합 단편, 예컨대 Fab는 또한 구상된다. 본 발명의 항체 및 이의 약학 조성물은 비경구, 예를 들면, 피하, 근육내 또는 정맥내 투여에 유용하다.
본 발명의 항-IL-31 항체 및/또는 IL-31-특이적 폴리펩타이드 및/또는 IL-31-특이적 펩타이드는 어느 한쪽 개별 치료적 제제로서 또는 기타 치료적 제제와 조합으로 투여될 수 있다. 이들은 단독으로 투여될 수 있지만, 선택되는 투여의 경로 및 표준 약학적 실무에 기초하여 선택되는 약학적 담체와 일반적으로 투여된다.
본원에 개시된 항체의 투여는, 기도 표면에 (약학적 제형에서 전형적으로 운반된) 항체의 비경구 주사(예컨대 복강내, 피하, 또는 근육내 주사), 경구를 포함하는, 임의의 적합한 수단에 의해, 또는 국소 투여에 의해 실시될 수 있다. 기도 표면에의 국소 투여는 비강내 투여에 의해(예를 들면, 점적기, 면봉, 또는 흡입기의 사용에 의해) 실시될 수 있다. 항체의 기도 표면에의 국소 투여는 흡입 투여에 의해, 예컨대 에어로졸 현탁액으로서 항체를 함유하는 (양쪽 고체 및 액체 입자를 포함하는) 약학적 제형의 호흡성 입자를 창출하고, 그 다음 대상체가 호흡성 입자를 흡입하도록 함으로써 또한 실시될 수 있다. 약학적 제형의 호흡성 입자의 투여 방법 및 장치는 잘 알려지고, 임의의 종래 기법은 이용될 수 있다. 경구 투여는, 예를 들어, 소화성 액체 또는 고체 제형의 형태일 수 있다.
일부 원하는 구현예에서, 항체는 비경구 주사로 투여된다. 비경구 투여에 대하여, 항-IL-31 항체 또는 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 약학적으로 허용가능한 비경구 비히클과 회합하여 용액, 현탁액, 유탁액 또는 동결건조 분말로서 제형화될 수 있다. 예를 들어 비히클은 허용가능한 담체, 예컨대 수성 담체에서 분해된 항체 또는 이의 칵테일의 용액일 수 있다. 그와 같은 비히클은 물, 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 트레할로스 또는 수크로스 용액, 또는 5% 혈청 알부민, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신 및 기타 등등이다. 리포솜 및 비수성 비히클, 예컨대 고정 오일은 또한 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균성이고 일반적으로 입자상 물질이 없다. 이들 조성물은 종래, 잘 알려진 멸균화 기법에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 생리학적 조건에 가까이 하기 위해 요청시 약학적으로 허용가능한 보조제, 예컨대 pH 조정 및 완충 제제, 독성 조정 제제 및 기타 등등, 예를 들어 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨 등을 함유할 수 있다. 이들 제형에서 항체의 농도는, 예를 들어 약 0.5% 미만, 보통 약 1중량% 또는 적어도 약 1중량%부터 15중량% 또는 20중량% 만큼까지 광범위하게 다양할 수 있고 선택되는 특정 투여 방식에 따라 유체 용적, 점도 등에 주로 기반하여 선택될 것이다. 비히클 또는 동결건조된 분말은 등장성을 유지하는 첨가제(예를 들면, 염화나트륨, 만니톨) 및 화학적 안정성을 유지하는 첨가제(예를 들면, 완충액 및 보존제)를 함유할 수 있다. 제형은 흔히 사용되는 기법으로 멸균화된다.
비경구로 투여가능한 조성물의 실제 제조 방법은 알려질 것이거나 당업자에 명백해질 것이고, 예를 들어, REMINGTON'S PHARMA. SCI. (15th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1980)에 더욱 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 항체는 사용에 앞서 저장용으로 동결건조될 수 있고 적합한 담체에서 재구성될 수 있다. 이 기법은 종래 면역 글로불린에 효과적인 것으로 밝혀졌다. 임의의 적합한 동결건조 및 재구성 기법은 이용될 수 있다. 동결건조 및 재구성이 다양한 정도의 항체 활성 상실을 초래할 수 있고 사용 수준이 보상하도록 조정되어야 할 수 있음이 당업자에 의해 인정될 것이다.
본 항체 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 실재하는 질환에 대하여 재발의 예방 및/또는 치료적 처치용으로 투여될 수 있다. 적합한 약학적 담체는, 이 기술분야에서 표준 참조 텍스트인 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES의 최신판에서 기재된다.
치료적 적용에서, 조성물은 질환을 이미 앓고 있는 대상체에게, 질환 및 이의 합병증을 치유 또는 적어도 부분적으로 정지 또는 완화하는 데 충분한 양으로 투여된다. 이것을 달성하기에 충분한 양은 "치료적 유효 용량" 또는 "치료적 유효량"으로서 정의된다. 이러한 사용에 효과적인 양은 질환의 심각성 및 대상체의 자체 면역계의 일반 상태에 좌우될 것이지만, 일반적으로 체중 kg당 약 0.1 mg 항체 내지 체중 kg당 약 15 mg 항체, 바람직하게는 체중 kg당 약 0.3 mg 항체 내지 체중 kg당 약 12 mg의 항체의 체중 범위이다. 일 구현예에서, 치료적 유효량은 최대 12 mg/kg의 체중 용량으로 적어도 1 개월 지속기간의 효능을 제공할 것이다. 외인성 서브스턴스의 최소화 및 본 발명의 본 갯과-유사, 고양잇과-유사, 및 말과-유사 항체에 의해 달성되는 "외래 서브스턴스"의 더 낮은 개연성의 관점에서, 이들 항체의 실질적 과량을 투여하는 것이 가능할 수 있다.
투여된 투약량은, 물론, 알려진 인자, 예컨대 특정 제제의 약력학적 특징, 및 이의 투여 방식 및 투여 경로; 수령체의 연령, 건강, 및 체중; 병용 처치의 증상 종류의 성질 및 정도, 치료의 빈도, 및 원하는 효과에 의존하여 다양할 것이다.
비-제한 예로서, 개, 고양이, 또는 말에서 IL-31-관련 병리의 치료는 상기 기재된 투약량 범위에서 본 발명의 항-IL-31 항체의 격주 또는 매달 투약량으로서 제공될 수 있다.
갯과, 고양잇과, 또는 말과 치료적 용도를 위한 예시적인 항체는, 본 발명에 따라, 강력한 생체내 항-IL-31 활성을 갖는 고 친화도(이들은 또한 고 친화력일 수 있다) 항체, 및 이의 단편, 영역 및 유도체이다. 항체 단편 및 영역은 항-Il-31 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 펩타이드로서 본원에 대안적으로 지칭될 수 있다.
조성물의 단일 또는 다중 투여는 치료하는 수의사에 의해 선택되고 있는 패턴 및 용량 수준으로 실시될 수 있다. 임의의 이벤트에서, 약학적 제형은 대상체를 효과적으로 치료하는 데 충분한 본 발명의 항체 또는 항체들의 대량을 제공할 수 있다.
진단 적용
본 발명은 또한 소양성 및/또는 알레르기성 병태를 갖는 것으로 알려지거나 갖는 것으로 의심받는 반려 동물에서 IL-31 검출용 진단 방법에서 사용하기 위한 상기 항-IL-31 항체, 폴리펩타이드, 및/또는 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 항-IL-31 항체, 폴리펩타이드, 및/또는 펩타이드는 샘플에서 IL-31, 또는 항-IL-31 항체를 검출 또는 정량화하는 면역검정에 유용하다. IL-31용 면역검정은 전형적으로 IL-31에 선택적으로 결합할 수 있는 본 발명의 검출가능하게 표지화된 고 친화도(또는 고 친화력) 항-IL-31 항체, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드의 존재 하에서 임상 또는 생물학적 샘플을 인큐베이션하는 단계, 및 샘플에서 결합되는 표지화된 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 항체를 검출하는 단계를 포함한다. 다양한 임상 검정 절차는 종래 기술에서 잘 알려진다. 예를 들면, IMMUNOASSAYS FOR THE 80'S(Voller 등, eds., Univ. Park, 1981)를 참고한다. 그와 같은 샘플은 조직 생검, 혈액, 혈청, 및 분변 샘플, 또는 동물 대상체로부터 수집되고 아래 기재된 바와 같이 ELISA 분석을 거친 액체를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체에 항원의 결합은 고체 지지체의 사용 없이 검출된다. 예를 들어, 항체에 항원의 결합은 액체 형식으로 검출될 수 있다.
다른 구현예에서, 항-IL-31 항체, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드는, 예를 들어, 니트로셀룰로스, 또는 세포, 세포 입자 또는 가용성 단백질을 고정화시킬 수 있는 또 다른 고체 지지체에 고정될 수 있다. 지지체는 그 다음 적합한 완충액으로 세정된 다음 검출가능하게 표지화된 IL-31-특이적 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 항체로 처리될 수 있다. 고체상 지지체는 그 다음 완충액으로 2회 세정되어 미결합된 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 항체를 제거할 수 있다. 고체 지지체 상의 결합된 표지의 양은 그 다음 알려진 방법 단계에 의해 검출될 수 있다.
"고체상 지지체" 또는 "담체"는 폴리펩타이드, 펩타이드, 항원, 또는 항체를 결합시킬 수 있는 임의의 지지체를 지칭한다. 잘-알려진 지지체 또는 담체는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF), 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 자연 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스, 및 자철광을 포함한다. 담체의 성질은 본 발명의 목적을 위하여 어느 정도 가용성 또는 불용성 어느 한쪽일 수 있다. 지지체 물질은 커플링된 분자가 IL-31 또는 항-IL-31 항체에 결합할 수 있는 한 가상으로 임의의 가능한 구조 입체배치를 가질 수 있다. 그래서, 지지체 입체배치는 비드처럼 구형이거나, 시험관의 내부 표면, 또는 막대의 외부 표면처럼 원통형일 수 있다. 대안적으로, 표면은 편평, 예컨대 시트, 배양 접시, 시험 스트립 등일 수 있다. 예를 들어, 지지체는 폴리스티렌 비드를 포함할 수 있다. 당업자는 항체, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 항원 결합을 위한 많은 다른 적합한 담체를 알 것이거나, 일상적 실험작업에 의해 동종을 확인할 수 있다.
잘 알려진 방법 단계는 주어진 다수의 항-IL-31 폴리펩타이드, 펩타이드 및/또는 항체의 결합 활성을 결정할 수 있다. 당업자는 일상적 실험작업에 의해 작동성 및 최적 검정 조건을 결정할 수 있다.
IL-31-특이적 폴리펩타이드, 펩타이드 및/또는 항체의 검출가능한 표지화는 효소 면역검정(EIA), 또는 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)에서 사용하기 위하여 효소에 연결함으로써 달성될 수 있다. 연결된 효소는 노출된 기질과 반응하여, 예를 들어, 분광광도계, 형광계 또는 시각적 수단으로 검출될 수 있는 화학적 모이어티를 생성한다. 본 발명의 IL-31-특이적 항체를 검출가능하게 표지화하는 데 사용될 수 있는 효소는, 비제한적으로, 말레이트 데하이드로게나제, 스타필로콕칼 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라제, 효모 알코올 데하이드로게나제, 알파-글리세로포스페이트 데하이드로게나제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린에스테라제를 포함한다.
IL-31-특이적 항체를 방사성으로 표지화함으로써, 방사면역검정(RIA)의 사용을 통해 IL-31을 검출하는 것이 가능하다. Work 등, LAB. TECHNIQUES & BIOCHEM. 1N MOLEC. Bio. (No. Holland Pub. Co., NY, 1978)를 참고한다. 방사성 동위원소는 감마 계수기 또는 신틸레이션 계수기의 사용과 같은 수단으로 또는 자기방사법으로 검출될 수 있다. 본 발명의 목적에 특히 유용한 동위원소는 하기를 포함한다: 3H, 125I, 131I, 35S, 14C, 및 125I.
IL-31-특이적 항체를 형광 화합물로 표지화하는 것이 또한 가능하다. 형광 표지화된 항체가 적절한 파장의 광에 노출되는 경우, 이의 존재는 그 다음 형광으로 인해 검출될 수 있다. 가장 흔하게 사용되는 형광 표지화 화합물 중에는 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프트알데하이드 및 플루오레사민이 있다.
IL-31-특이적 항체는 또한 형광-방출 금속 그와 같은 125Eu, 또는 란탄족원소 시리즈의 기타를 사용하여 검출가능하게 표지화될 수 있다. 이들 금속은 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌디아민-테트라아세트산(EDTA)과 같은 금속 킬레이트화 그룹을 사용하여 IL-31--특이적 항체에 부착될 수 있다.
IL-31-특이적 항체는 또한 화학발광 화합물에의 커플링에 의해 검출가능하게 표지화될 수 있다. 화학발광으로 표지화된 항체의 존재는 그 다음 화학적 반응의 과정 동안 일어나는 발광의 존재 검출로 결정된다. 유용한 화학발광 표지화 화합물의 예는 루미놀, 이소루미놀, 테로마틱(theromatic) 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르이다.
마찬가지로, 생물발광 화합물은 본 발명의 IL-31-특이적 항체, 부분, 단편, 폴리펩타이드, 또는 유도체를 표지화하는 데 사용될 수 있다. 생물발광은 촉매적 단백질이 화학발광 반응의 효율을 증가시키는 생물학적 시스템에서 발견된 화학발광의 한 유형이다. 생물발광 단백질의 존재는 발광의 존재 검출로 결정된다. 표지화의 목적으로 중요한 생물발광 화합물은 루시페린, 루시페라제 및 에쿼린이다.
IL-31-특이적 항체, 부분, 단편, 폴리펩타이드, 또는 유도체의 검출은, 예를 들어, 검출가능한 표지가 방사성 감마 방출체이면, 신틸레이트 계수기로, 또는, 예를 들어, 표지가 형광 물질이면, 형광계로 달성될 수 있다. 효소 표지의 경우에, 검출은 효소용 기질을 이용하는 컬러로메트릭(colorometric) 방법으로 달성될 수 있다. 검출은 또한 유사하게 제조된 표준과의 비교에서 기질의 효소 반응의 정도의 시각적 비교로 달성될 수 있다.
본 발명의 목적을 위하여, 상기 검정으로 검출되는 IL-31은 생물학적 샘플에서 존재할 수 있다. IL-31을 함유하는 임의의 샘플은 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 생물학적 유체, 예컨대, 예를 들어, 혈액, 혈청, 림프, 소변, 분변, 염증성 삼출액, 뇌척수액, 양수, 조직 추출물 또는 균등액, 및 기타 등등이다. 본 발명은 이들 샘플만을 사용하는 검정에 제한되지 않지만, 본 명세서의 관점에서, 다른 샘플의 사용을 허용하는 적합한 조건을 결정하는 것이 당업자에게 가능하다.
원위치 검출은 동물 대상체로부터 조직학적 표본을 제거하고, 그와 같은 표본에 본 발명의 표지화된 항체의 조합을 제공함으로써 달성될 수 있다. 항체(또는 이의 부분)를 생물학적 샘플에 표지화된 항체(또는 부분)를 도포 또는 중첩시킴으로써 제공될 수 있다. 그와 같은 절차의 사용을 통해, 검사된 조직에서 IL-31의 존재 뿐만 아니라 IL-31의 분포를 결정하는 것이 가능하다. 본 발명을 사용하여, 당업자는 임의의 광범위 조직학적 방법(예컨대 염색화 절차)이 그와 같은 원위치 검출을 달성하기 위해 변형될 수 있음을 용이하게 인지할 것이다.
본 발명의 항체, 단편 또는 유도체는, "2-부위" 또는 "샌드위치" 검정으로도 알려진, 면역계 검정에서 이용에 순응될 수 있다. 전형적인 면역계 검정에서, 다량의 미표지화된 항체(또는 항체의 단편)는 시험되고 있는 유체에서 불용성인 고체 지지체에 결합되고 다량의 검출가능하게 표지화된 가용성 항체는 첨가되어 고체-상 항체, 항원, 및 표지화된 항체 사이 형성된 3차 복합체의 검출 및/또는 정량화를 허용한다.
항체는 샘플에서 IL-31을 정량적으로 또는 정성적으로 검출하는 데 또는 IL-31을 발현시키는 세포의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다. 이것은 형광 현미경검사, 유세포분석, 또는 형광 검출과 커플링된 형광적으로 표지화된 항체(아래 참고)를 이용하는 면역형광 기법으로 달성될 수 있다. 진단 목적으로, 항체는 어느 한쪽 표지화 또는 미표지화될 수 있다. 미표지화된 항체는 항체, 예컨대 갯과 또는 고양잇과 면역글로불린 불변 영역에 특이적인 항체와 반응성인 다른 표지화된 항체(제2 항체)와 조합으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 항체는 직접적으로 표지화될 수 있다. 광범위의 표지, 예컨대 방사성핵종, 형석, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제, 리간드(특히 합텐) 등은 이용될 수 있다. 수많은 유형의 면역검정, 예컨대 이전에 논의된 것들은 이용가능하고 당업자에게 잘 알려진다.
일 구현예에서, IL-31 검출용 진단 방법은 측면 유동 면역검정 테스트이다. 이것은 면역크로마토그래피 검정, 신속 면역이동(Rapid ImmunoMigration; RIM™) 또는 스트립 테스트로서도 알려진다. 측면 유동 면역검정은 테스트 스트립 형식을 맞추기 위해 단일 축을 따라 작동하도록 순응된 본질적으로 면역검정이다. 다수의 기술 변이는 상품으로 개발되어 왔지만, 이들은 모두 동일한 기본 원리에 따라 작동한다. 전형적인 테스트 스트립은 하기 성분으로 이루어진다: (1) 샘플 패드 - 테스트 샘플이 도포되는 흡수성 패드; (2) 컨쥬게이트 또는 시약 패드 - 이것은 착색된 입자(일반적으로 콜로이드성 금 입자, 또는 라텍스 미소구체)에 컨쥬게이션된 표적 분석물에 특이적인 항체를 함유함; (3) 반응 막 - 항-표적 분석물 항체가 포착 구역 또는 테스트 선으로서 막을 거쳐 일렬로 고정화되는 전형적으로 소수성 니트로셀룰로스 또는 셀룰로스 아세테이트 막(컨쥬게이트 항체에 특이적인 항체를 함유하는, 제어 구역이 또한 존재할 수 있음); 및 (4) 심지 또는 폐기물 저장소 - 모세관 활동에 의해 반응 막을 거쳐 샘플을 채취하고 그것을 수집하도록 설계된 추가 흡수성 패드. 스트립의 성분은 불활성 받침 물질에 일반적으로 고정되고 간단한 딥스틱 형식으로 또는 포착 및 제어 구역을 보여주는 반응 윈도우 및 샘플 포트가 있는 플라스틱 포장 내에서 표시될 수 있다.
미생물학 테스팅에서 사용되는 측면 유동 면역검정의 2개의 주요 유형이 있다: 이중 항체 샌드위치 검정 및 경쟁 검정. 이중 항체 샌드위치 형식에서, 샘플은 샘플 패드로부터 존재하는 임의의 표적 분석물이 결합할 컨쥬게이트 패드를 통해 컨쥬게이트까지 이동한다. 샘플은 그 다음 표적/컨쥬게이트 복합체가 막에서 가시선을 생산하는 고정화된 항체에 결합할 포착 구역에 도달하는 때까지 막을 거쳐 계속 이동한다. 샘플은 그 다음 제어 구역에 도달하는 때까지 스트립을 따라 추가로 이동하고, 여기에서 과잉 컨쥬게이트는 막에서 제2 가시선을 결합 및 생산할 것이다. 이 제어 선은 샘플이 막을 거쳐 의도된 대로 이동하였다는 것을 나타낸다. 막에서 2개의 선명한 선은 긍정적 결과이다. 제어 구역에서 단일 선은 부정적 결과이다. 경쟁 검정은 컨쥬게이트 패드가 표적 분석물에, 또는 이의 유사체에 이미 결합되는 항체를 함유한다는 점에서 이중 항체 샌드위치 형식과 상이하다. 표적 분석물이 샘플에서 존재하면, 따라서 컨쥬게이트와 결합하지 않을 것이고 미표지화된채 남아 있을 것이다. 샘플이 막을 따라 이동하고 포착 구역에 도달함에 따라 과량의 미표지화된 분석물은 고정화된 항체에 결합할 것이고 컨쥬게이트의 포착을 차단할 것이고, 이로써 가시선은 생산되지 않는다. 미결합된 컨쥬게이트는 그 다음 가시 제어 선을 생산하는 제어 구역에서 항체에 결합할 것이다. 막에서 단일 제어 선은 긍정적 결과이다. 포착 및 제어 구역에서 2개의 가시선은 부정적 결과이다. 하지만, 과량의 미표지화된 표적 분석물이 존재하지 않으면, 약한 선은 포착 구역에서 생산될 수 있어, 결정적이지 않은 결과를 나타낸다. 측면 유동 기술에서 다수의 변이가 있다. 막에서 포착 구역은 항체보다는 (표적 분석물에 따라) 고정화된 항원 또는 효소를 함유할 수 있다. 멀티플렉스 테스트를 창출하기 위해 다중 포착 구역을 도포하는 것이 또한 가능하다. 예를 들어, 두 EHEC Shiga 독소 ST1 및 ST2를 별도로 동일한 샘플에서 검출할 수 있는 상용 테스트 스트립은 개발되어 왔다.
중요하게, 본 발명의 항체는 개, 고양이, 또는 말에서 소양성 및/또는 알레르기성 진단에서 도움이 될 수 있다. 더욱 특히, 본 발명의 항체는 반려 동물에서 IL-31의 과발현을 확인할 수 있다. 그래서, 본 발명의 항체는 중요한 면역조직화학 도구를 제공할 수 있다. 일 구현예에서, 검정 설계는 여기에서 구상되어서 IL-31 미모토프(펩타이드)는 검정에서 검출을 위하여 표지화되는 본 발명의 항체를 포착하는 데 사용된다. 이러한 포착된 항체는 숙주 종에서 고유 순환 IL-31의 친화도 더 낮은 부착된 미모토프에 친화도를 가질 것이다. 이 구현예에서, 숙주 종으로부터 유래된 유체의 인큐베이션은 고체 표면에 속박되는 표지화된 항체:미모토프 복합체로 인큐베이션된다. 숙주 종으로부터 유래된 테스트 유체에서 IL-31의 존재는 항체에 더 높은 친화도를 가질 것이고, 그래서 세정 단계 동안 제거될 수 있는 고체 표면으로부터 표지화된 항체를 자유화시킨다. 테스트 유체에서 IL-31의 수준은 그래서 미모토프-결합된 표면에서 보이는 신호의 결여와 상관관계가 있을 수 있다. 그와 같은 검정이 진단 테스트로서 사용하기 위하여 조사 또는 임상 셋팅에서 IL-31을 측정하기 위한 유용성을 가질 것이 생각된다.
본 발명의 항체는, 유전자 발현 프로파일 측정에 고도로 적합한 항체 어레이에서 사용될 수 있다.
키트
대상 방법을 실시하기 위한 키트가 본 발명의 범위 내에 또한 포함된다. 키트는 적어도 본 발명의 항체들 중 하나 이상, 동종을 인코딩하는 핵산, 또는 동종을 함유하는 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는, 일반적으로 동결건조된 형태로, 용기에서 제공될 수 있다. 표지 또는 독소에 컨쥬게이션될 수 있거나, 미컨쥬게이션될 수 있는 항체는 완충액, 예컨대 트리스, 포스페이트, 카보네이트 등, 안정화제, 살생물제, 불활성 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 또는 기타 등등을 가진 키트에서 전형적으로 포함된다. 일반적으로, 이들 물질은 활성 항체의 양에 기반하여 5중량% 미만으로, 그리고 대개 항체 농도에 재차 기반하여 적어도 약 0.001중량%의 총량으로 존재할 것이다. 빈번하게, 활성 구성성분을 희석하기 위해 불활성 증량제 또는 부형제를 포함하는 것이 바람직할 것이고, 여기에서 부형제는 총 조성물의 약 1중량% 내지 99중량%로 존재할 수 있다. 1차 항체에 결합할 수 있는 제2 항체가 검정에서 이용되는 경우, 이것은 일반적으로 별도 바이알에서 존재할 것이다. 제2 항체는 표지에 전형적으로 컨쥬게이션되고 상기 기재된 항체 제형과 유사한 방식으로 제형화된다. 키트는 일반적으로 또한 사용 지침의 셋트를 포함할 것이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 키트는 샘플에서 갯과, 고양잇과, 또는 말과 IL-31 단백질 검출에 유용한 테스트 스트립 키트(측면 유동 면역검정 키트)이다. 그와 같은 테스트 스트립은 전형적으로 테스트 샘플이 도포되는 샘플 패드; 갯과, 고양잇과, 또는 말과 IL-31에 특이적인 항체를 함유하는 컨쥬게이트 또는 시약 패드[여기서 상기 항체는 착색된 입자(일반적으로 콜로이드성 금 입자)에 컨쥬게이션됨]; 항-IL-31 항체가 포착 구역 또는 테스트 선으로서 막을 거쳐 일렬로 고정화되는 반응 막(컨쥬게이트 항체에 특이적인 항체를 함유하는, 제어 구역은 또한 존재할 수 있음); 및 모세관 활동에 의해 반응 막을 거쳐 샘플을 채취하고 그것을 수집하도록 설계된 추가 흡수성 패드를 포함할 것이다. 테스트 스트립 키트는 일반적으로 또한 사용법을 포함할 것이다.
고양잇과 또는 갯과 항체의 일관성 및/또는 품질의 개선 방법
상기 방법은 본 발명 섹션의 개요에서, 뿐만 아니라 본원의 실시예 및 도면에서 상기 기재된다.
본 발명자들은 고유 생식계열이 말단 경쇄 시스테인을 넘어서 추가의 잔기를 인코딩하는 그들 동물 종으로부터 카파 경쇄 불변의 c-말단 단부의 제거, 또는 변형이 이들 종에 대하여 동종 재조합 항체의 생산에 모두 유익하고 안정한 세포주로부터 생산된 항체의 양(예를 들면, 수율 개선)에 유익하다는 것을 놀랍게도 알아내었다. 본원에 기재된 결과는 고양잇과(및 갯과)의 카파 경쇄에서 말단 시스테인을 넘어서 추가의 아미노산 잔기가 항체의 잘못짝짓기 및 빈약한 생산을 초래하는 중쇄와의 효율적인 짝짓기에 유해하다는 것을 뒷받침한다.
일 구현예에서, 본 발명은 고양잇과 항체의 일관성 및/또는 품질의 개선 방법을 제공한다. 본 방법은 숙주 세포에서 고양잇과 IgG 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 고양잇과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 발현시켜 고양잇과 항체를 생산하는 단계를 포함하고, 여기서 고양잇과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 야생형 고양잇과 IgG 카파 경쇄 불변 영역에서라면 존재할 C-말단 QRE 서열을 인코딩하는 서열이 변형되고/거나 결실되는 카파 경쇄 불변 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 도 15에서 도시된 고양잇과 Ig 카파 경쇄 불변 도메인의 C-말단 아미노산 잔기에 관하여, 일 구현예에서, 본 발명은 서열번호 175의 고양잇과 경쇄 카파 서열의 CYS107을 바로 뒤따르는 c-말단 "QRE"의 제거를 제공한다. 이러한 변형은 단량체 재조합 고양잇과 IgG의 생산을 개선하는 것으로 밝혀졌다. 하지만, 본 발명은 이와 관련하여 제한되지 않는다. 예를 들어, 고유 QRE 대신에 107 위치에 시스테인의 c-말단 단부에 연속적으로 부가된 3개 더 추가의 아미노산은 아미노산이 최소 정전하 영향을 갖는다면 용인될 수 있다.
본 발명은 추가로 갯과 항체의 일관성 및/또는 품질의 개선 방법을 제공한다. 본 방법은 숙주 세포에서 갯과 IgG 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 갯과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 발현시켜 갯과 항체를 생산하는 단계를 포함하고, 여기서 갯과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 야생형 갯과 IgG 카파 경쇄 불변 영역에서라면 존재할 C-말단 QRVD 서열을 인코딩하는 서열이 변형되고/거나 결실되는 카파 경쇄 불변 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 도 15에서 도시된 갯과 Ig 카파 경쇄 불변 도메인의 C-말단 아미노산 잔기에 관하여, 일 구현예에서, 본 발명은 서열번호 194의 갯과 경쇄 카파 서열의 CYS105를 바로 뒤따르는 c-말단 "QRVD"의 제거를 제공한다. 하지만, 본 발명은 이와 관련하여 제한되지 않는다. 예를 들어, 고유 QRVD 대신에 105 위치에 시스테인의 c-말단 단부에 연속적으로 부가된 3개 더 추가의 아미노산은 아미노산이 최소 정전하 영향을 갖는다면 용인될 수 있다.
본원에서 결과는 상기 방법이 완전히 뚜렷한 표적을 인식하는 구조적으로 이질적인 항체에 적용하는 것을 명확하게 입증하고, 그러므로 이들 변형은, 비제한적으로 항-IL31 및 항-NGF 항체를 포함하는, 고양잇과 항체, 뿐만 아니라 카파 경쇄 불변 영역에서 추가의 C-말단 아미노산을 보유하는 기타 포유류 항체의 폭넓은 속에 유사하게 적용할 수 있을 것 같다. 임의의 하나의 이론에 구속됨을 바라지 않지만, 이러한 경쇄 변형은 단량체 IgG의 더 많은 양 및 잠재적으로 더 높은 전체적 항체 수율을 초래하는 안정한 CHO 세포주로부터 유도된 생산 동안 면역글로불린 쇄 짝짓기의 더 높은 충실도를 초래하는 것처럼 보인다. 이들 속성 모두는 상용 등급 항체 치로제 제조의 관점으로부터 고도로 바람직하다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 항-IL-31 항체는 본원에 개시된 카파 경쇄 불변 결실 및/또는 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 고양잇과 항체는 카파 경쇄 불변 영역의 c-말단에 정상적으로 존재하는 "QRE"가 제거되었고 최소 정전하 영향을 갖는 최대 3개 추가의 아미노산으로 선택적으로 대체된 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 고양잇과 항체는 하기 서열을 갖는 고양잇과 카파 경쇄 또는 이의 변이체를 포함한다:
RSDAQPSVFLFQPSLDELHTGSASIVCILNDFYPKEVNVKWKVDGVVQNKGIQESTTEQNSKDSTYSLSSTLTMSSTEYQSHEKFSCEVTHKSLASTLVKSFQRSEC(서열번호 186).
본 발명은 이제 아래 비-제한 실시예로 추가로 기재될 것이다. 아래 실시예 섹션에서 그리고 도면에서, 그들의 지정에 "11E12"를 함유하는 항체에 대하여 표시된 임의의 데이터는 본 발명의 항체와 비교를 위한 것이다.
실시예
1.1. 중국 햄스터 난소(CHO) 세포로부터 갯과 인터류킨 31(cIL-31)의 생산
인터류킨 31 단백질은 상동성 종들 중에 아미노산 서열 보존에서 다양하지만(도 1), 유형 I 사이토카인 패밀리의 다른 구성원과 공통 구조 구성을 갖는다고 믿어진다(Boulay 등. 2003, Immunity. Aug; 19(2):159-632003; Dillon 등. 2004 Nat Immunol. Jul; 5(7):752-60). 이 업다운 번들 위상은 이들 사이토카인에 의해 공유된 수용체 인식의 방식에 중요하다(Dillon 등. 상기, Cornelissen 등. 2012 Eur J Cell Biol. Jun-Jul; 91(6-7):552-66). 상이한 종들 사이에서의 IL-31 단백질 서열 동일성에서의 변이로, 상이한 에피토프 성향 및 국소 아미노산 조성이 주어지면 하나의 종에 대해 발생된 항체가 서로 교차-반응할 것인지를 예측하는 것은 불가능하다. 그 결과, IL-31 단백질의 다중 형태는 다중 종 및 발현 시스템을 나타내는 이러한 작업에 고려되었다. 갯과 IL-31 단백질(cIL-31)은 항체 히트의 효력 및 친화도를 테스트하기 위해 면역원 및 시약으로서 사용하도록 생산되었다. 재조합 cIL-31은 CHO 세포에서 CHROMOS ACE(Artificial Chromosome Expression) 시스템(Chromos Molecular Systems, Inc., Burnaby, British Columbia)를 사용하여 창출되어 (서열번호 155; 갯과_IL31)의 서열, 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 156; 갯과_IL31)을 갖는 분비된 갯과 IL-31 단백질을 생성하였다. 세포 배양물(CHO 세포주)의 400 ml로부터 조건화된 배지는 수득되었고 4.5 시간 동안 QA 완충액(20 mM 트리스 pH 8.0, 20 mM NaCl)의 10 용적에 대해 투석되었다. 투석된 배지는 0.2 μm 여과되었고 QA 완충액으로 사전-평형화된 SOURCE™ Q 컬럼(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)에서 1 ml/분으로 장입되었다. 단백질은 다단계 선형 구배를 사용하여 용출되었다. 대부분의 cIL-31은 통과(FT) 분획에 남아있었고, 소량의 cIL-31은 사면에서 초기에 용출되었다. 단백질의 동일성은 트립신 소화의 질량-분광법(MS) 분석 및, 웨스턴 면역블랏팅으로 이전에 확인되었다. FT 분획에서 단백질은 4-5 배 농축되었고 밤새 인산염 완충 식염수(PBS)에 대해 4℃에서 투석되었다. 단백질의 안정성은 투석 이후 PBS에 체크되었다. 침전은 관찰되지 않았고, 단백질분해는 며칠후 4℃에서 관찰되지 않았다. N-글리코시다제 F를 사용하는 탈-당화 실험은 SDS-PAGE 상의 약 15 kDa의 단일 밴드까지 떨어진 단백질 응축을 초래하였다. 단백질 농도는 표준으로서 소 혈청 알부민 (BSA)와 비신코닌 검정(BCA 검정)을 사용하여 결정되었다(ThermoFisher Scientific, Inc., Rockford, IL). 단백질 용액은 분취량으로 분할되었고, 순간 빙결되었고(액체 N2) -80℃에 저장되었다.
1.2. CHO 세포로부터 야생형 및 돌연변이체 고양잇과 인터류킨 31(fIL-31)의 일시적 발현
적당한 에피토프 결합 특성을 가진 항체의 확인을 돕기 위해, 야생형 및 돌연변이체 고양잇과 IL-31 단백질은 친화도 및 세포-기반 검정에서 생산, 정제, 및 평가용 포유류 발현 시스템에서 발현되었다. IL-31에서 항체 11E12의 결합 부위는 이전에 기재되었다(Bammert 등의 미국 특허 번호 8,790,651). 항체 15H05에 의해 인식된 IL-31 상의 신규 결합 부위의 특성규명은 본원에 기재된다. 야생형 지정은 고유 아미노산 잔기에 변화 없는 전장 고양잇과 IL-31 단백질이다. 돌연변이체 단백질은 각각의 항체에 대한 결합에 (변경된 경우) 영향을 미치는 IL-31 단백질에서 아미노산내 돌연변이를 지칭하는 그들의 상응하는 항체 명칭(11E12 및 15H05)에 의해 지정되었다. 고양잇과 IL-31 15H05 단백질에 요구된 적당한 돌연변이의 확인은 섹션 1.10에서 아래 기재된다. 목적은 IL-31 에피토프에서 아미노산을 변화시키는 것 그리고 각각의 항체에 대한 결합 표현형의 상실을 관찰하는 것이었다. 비교는 그 다음 새로운 후보 항체가 돌연변이체가 아닌 야생형 단백질에 결합하는지를 보기 위한 스크리닝 동안 실시될 수 있다. 새로운 항체 히트는 그 다음 항체 11E12 또는 15H05와 동일한 또는 유사한 에피토프에 대한 결합에 따라 비닝될 수 있다.
발현 작제물은 코돈 최적화되었고 중국 햄스터 난포(CHO) 세포에서 발현용으로 합성되었다. 합성된 유전자는 일시적 발현 용도로 pD2529(ATUM 벡터)에 클로닝되었다. 야생형 고양잇과 IL-31 단백질은 (서열번호 157; 고양잇과_IL31_야생형)에 의해 표시되고, 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 158; 고양잇과_IL31_야생형)이다. 돌연변이체 고양잇과 IL-31 11E12 단백질은 (서열번호 161; 고양잇과_IL31_11E12_돌연변이체)에 의해 표시되고, 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 162; 고양잇과_IL31_11E12_돌연변이체)이다. 돌연변이체 고양잇과 IL-31 15H05 단백질은 (서열번호 163; 고양잇과_IL31_15H05_돌연변이체)에 의해 표시되고, 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 164; 고양잇과_IL31_15H05_돌연변이체)이다. 재조합 고양잇과 IL-31 단백질은 일시적 CHO 발현을 위한 제조자의 최대 역가 프로토콜을 따름으로써 ExpiCHO-S™ 세포(ThermoFisher Scientific, Inc., Rockford, IL)에서 발현되었다. 형질주입 12 일후 세포는 원심분리 및 여과되어 조건화된 배지에서 분비된 단백질을 포착하였다. 각 작제물(야생형 및 돌연변이체)에 대하여, (0.2 μm 여과된, CHO 세포 배양물로부터) 120 mL의 조건화된 배지는 NaCl, 5 mM 이미다졸, 및 pH 7.4의 첨가로 30 mS/cm로 조정되었다. 각 배지 샘플은 5 mM 이미다졸, 20 mM 인산나트륨, 300 mM NaCl, pH 7.4로 평형화된 5 mL의 HisPur Cobalt 수지(ThermoFisher Scientific, Inc., Rockford, IL)와 조합되었다. 각 샘플 및 수지는 4℃에서 밤새 혼합되도록 하였다. 수지는 BioRad Econcolumns(Bio-Rad, Hercules, CA)를 통해 주입함으로써 수집(및 미결합된 분획으로부터 분리)되었다. 수지는 (상기와 같이) 5 x 5 mL의 완충액으로 세정되었고 그 다음 동일 완충액에서 5 x 5 mL의 500 mM 이미다졸로 용출되었다. 분획은 SDS-PAGE로 평가되었다. 농도는 표준 방법을 사용하여 BCA 단백질 검정으로 측정되었다.
1.3. 대장균으로부터 고양잇과 인터류킨 31(fIL-31)의 생산
재조합 고양잇과 IL-31 단백질은 검정 시약으로서 사용하기 위해 그리고 생체내 도전 연구용으로 고양이에서 소양성 반응을 유도하기 위해 대장균 발현 숙주에서 생성되었다. 고양잇과 IL-31을 나타내는 유전자는 대장균에서 최적 발현을 위하여 합성되었다. 발현 작제물은 검출 및 정제용 N-말단 6-His 태그를 함유하는 전장 고양잇과 IL-31 유전자로 창출되었다. 이러한 고양잇과 IL-31 단백질은 (서열번호 159; 고양잇과_IL-31_E_콜리)에 의해 표시되고, 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 160; 고양잇과_IL-31_E_콜리)이다. 서열 확인된 플라스미드는 대장균 BL21 DE3(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)을 형질전환시키는 데 사용되었고 후속 단백질 발현은 실시되었다.
대장균으로부터 세포 페이스트(262.3 g)는 하기와 같이 용해되었다: 세포 페이스트는 500 mL의 50 mM 트리스 pH 8에서 재현탁되었고, 스테인레스 망 필터를 통해 여과되어 입자를 제거하였고, 그 다음 1300 psi로 미소유동기를 통한 2개 패스를 통해 용해되었다. 용해물(약 1200 mL 용적)은 4개 병으로 분할되었고, 12,000 g로 20분 동안 10℃에서 원심분리되었다. 상청액은 경사분리되었고 폐기되었다. 각 펠렛은 300 mL의 5 mM EDTA, 0.5% 트리톤 X-100, pH 9.0의 현탁, 및 10℃에서 12,000 g로 50 분 원심분리로 세정되었다. 상청액은 경사분리되었고 폐기되었다. 세정된 펠렛은 폴딩 및 단리까지 -20℃에 저장되었다.
단리에 앞서, 펠렛들 중 하나는 물로 세정되어 잔류 세제를 제거하였고, 그 다음 4℃에서 10,000 g로 20 분 원심분리되었다. 재차, 상청액은 경사분리되었다. 마지막으로, 세정된 펠렛은 60 mL의 50 mM 인산나트륨, 300 mM NaCl, 6 M 구아니딘-HCl, 5 mM 이미다졸, pH 7.4에서 가용화되었다. 펠렛은 실온에서 대략 25 분 동안 혼합하게 된 다음 4℃에서 10,000g로 20 분 원심분리되었다. 이 시간, 상청액은 경사분리되었고 추가 프로세싱을 위하여 보관되었다. (원래 용적으로 물에서 재현탁된) 펠렛은 SDS-PAGE만을 위하여 남겨두었다. 미정제 IMAC(고정화된 금속 친화도 크로마토그래피)는 폴딩에 앞서 순도를 증가시키기 위해 수행되었다. 이 경우에, 15 mL의 Ni-NTA Superflow(Qiagen Inc, Germantown, MD, Cat #30450, 동일 완충액에서 사전-평형화됨)는 정화된 상청액에 첨가되었고 실온에서 약 90분 동안 혼합하게 되었다. 미결합된 분획은 경사분리되었고 SDS-PAGE를 위하여 남겨두었다. IMAC 수지는 (가용화 완충액과 동일한) 5 mM 이미다졸, 50 mM 인산나트륨, 300 mM NaCl, 6 M 구아니딘-HCl, pH 7.4로 세정되었다. 수지는 (먼저 7.5 mL 및 그 다음 15 mL로 여러 회, Bradford 검정에 의한 단백질 용출 모니터링) 200 mM 이미다졸, 50 mM 인산나트륨, 300 mM NaCl, 6 M 구아니딘-HCl, pH 7.4로 용출되었다. (Bradford에 따라) 단백질을 함유하는 용출 분획은 추가 프로세싱을 위하여 풀링되었다(125 mL).
IL-31 단백질은 하기와 같이 폴딩되었다. IL-31은 최종 10 mM까지 디티오트레이톨의 첨가로 감소되었고, 실온에서 2 시간 동안 혼합하게 되었다. 희석된 샘플은 그 다음 신속하게 교반하면서 2500 mL(20X 용적)의 PBS + 1 M NaCl에 적가식 희석되었다. 요소의 이론적 농도는 이 지점에서 약 0.4 M이어야 한다. 요소의 나머지는 밤새 4℃에, 3개 교환 (4L 각각)의 PBS에 대한 투석으로 느리게 제거되었다. 투석 이후, 샘플은 0.2 μm 여과되어 미폴딩된/침전된 단백질을 제거하였다.
샘플은, 제2 라운드의 IMAC에 의해, 이 시간 선형 구배 용출하면서 추가 정제되었다. 15 mL의 Ni-NTA Superflow 수지는 샘플에 첨가되었고 밤새 4℃에 (현수된 교반 바로) 교반함으로써 배치식으로 결합하게 되었다. 재차, 미결합된 분획은 경사분리되었고 남겨두었다. Ni-NTA Superflow 수지는 XK16 컬럼(GE Healthcare Lifesciences, Marlborough, MA)에 패킹되었고 AKTA 브랜드 크로마토그래피 시스템(GE Healthcare Lifesciences, Marlborough, MA)에 연결되었다. 컬럼은 그 다음 50 mM 트리스, 300 mM NaCl, pH 8.2로 세정되었고 세정 완충액에서 각각, 0 내지 500 mM 이미다졸의 150 mL 선형 구배를 통해 용출되었다. 분획은 SDS-PAGE로 분석되었다. IL-31의 충분한 순도를 갖는 분획은 풀링되었고 밤새, 4℃에, 3개 교환(2L 각각)의 PBS에 대해 투석으로 재차 완충액 교환되었다. 마지막으로, 폴딩된 및 정제된 샘플은 투석으로부터 수집되었고, 멸균 여과되었고, 분취된 농도 측정되었고, 드라이-아이스/이소프로판올 중탕에서 순간 빙결되었고, -80℃에 저장되었다.
1.4. 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 IL-31에 대한 항-IL-31 항체의 친화도 결정 방법
후보 mAb가 갯과 및 고양잇과 IL-31을 결합시키는 친화도는 Biacore 시스템(Biocore Life Sciences(GE Healthcare), Uppsala, Sweden)에서 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하여 결정되었다. 표면에 항체를 고정화하는 경우 발생할 수 있는 차등 표면 제조와 연관된 친화도 차이를 피하기 위해; IL-31이 표면에 직접적으로 컨쥬게이션된 전략은 이용되었다. 고정화는 N-하이드록시석신이미드(NHS)/1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDC) 화학을 사용하여 5 μg/mL IL-31을 커플링하는 아민에 의해 수득되었다. 칩은 에탄올아민으로 급랭되었고 모든 후보 mAb들이 고정화된 IL-31에 결합하였던 친화도는 평가되었다. 모든 곡선은 1:1 모델에 맞춤화되었다. 1 x 10 -11M(1E-11 M) 미만의 친화도 상수(KD)는 계기용 검출의 정량화의 하한 아래이다. 친화도 측정용 결과는 본원에 기재된다.
1.5. 갯과 및 고양잇과 대식세포 세포에서 갯과 및 고양잇과 IL-31 유도된 pSTAT3 신호전달의 억제에 의해 평가된 항-IL-31 항체의 효력 결정 방법
억제 활성을 가진 후보를 확인하기 위해, 항체는 어느 한쪽 갯과 또는 고양잇과 세포-기반 검정에서 IL-31-매개된 STAT3 인산화에 영향을 미치는 그들의 능력에 대하여 평가되었다. STAT3 인산화는 갯과 DH-82(ATCC® CRL-10389™) 또는 고양잇과 FCWF4 대식세포-유사 세포(ATCC CRL-2787)에서 결정되었다. DH82 및 FCWF4 세포는 24 시간 동안 10 ng/mL의 갯과 인터페론 감마(R&D Systmes, Minneapolis, MN)로 또는 96 시간 동안 125 ng/mL의 고양잇과 인터페론 감마(R&D Systems, Minneapolis, MN), 각각으로 프라이밍되어, 수용체 발현을 증가시켰다. 두 세포 유형은 IL-31 및 mAb 처리에 앞서 2 시간 동안 혈청 부족되었다. 2개의 독립 방법을 사용하여, 모든 후보 mAb들은 어느 한쪽 1 μg/mL 갯과 또는 0.2 μg/mL 고양잇과 IL-31 유도된 STAT3 인산화를 억제시키는 그들의 능력에 대하여 평가되었다. 검정은 또한 갯과 및 고양잇과 사이토카인의 교차-반응성 그리고 두 종에서 신호전달을 억제하는 항체 능력의 교차-기능성을 입증하기 위해 운용되었다. 복합체 형성을 확신하기 위해, 세포 자극에 앞서 mAb 및 IL-31 사이토카인의 1 시간 공-인큐베이션은 완료되었다. IL-31 세포 자극은 5 분 동안 실시되었다. STAT3 인산화는 AlphaLISA SureFire ULTRA™ 기술(Perkin Elmer, Waltham, MA)을 사용하여 측정되었다. 항체 농도 및 순도가 미공지되는 경우, 하이브리도마 상청액은 1 mg/ml 갯과 또는 0.2 mg/ml 고양잇과 IL-31로의 1 시간 공-인큐베이션 이후 STAT3 인산화를 억제하는 그들의 능력에 대하여 정성적으로 측정되었다. 이들 검정에서 IL-31-매개된 STAT3 인산화를 억제하는 그들의 능력에 의해 정의된 개별 단클론성 항체의 효력은 선택되는 항체의 추가 전진을 위한 핵심 선택 특징으로 간주되었다. 용어 효력은 이들 검정으로부터 계산된 IC50 값을 지칭하고 IL-31에 의해 유도된 신호전달이 이의 최대 값의 절반으로 감소되는 항체의 농도이다. 본원에 기재된 증가된 효력은 더 낮은 IC50 값에 상관관계가 있다.
1.6. 갯과 및 고양잇과 인터류킨 31을 인식하는 마우스 및 갯과 단클론성 항체의 확인
마우스 및 개는 항체 확인의 목적으로 재조합 갯과 IL-31(서열번호 155)로 면역화되었다. 면역화된 동물로부터 혈청 항체 역가는 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA)을 사용하여 결정되었다. 갯과 또는 고양잇과 IL-31(50 ng/웰)은 폴리스티렌 마이크로플레이트에 고정화되었고 포착 항원으로서 사용되었다. 면역화된 동물로부터 혈청은 0.05% tween-20(PBST)이 있는 인산염 완충 식염수에서 희석되었다. 항-IL-31 항체의 존재는 적당한 2차 HRP 표지화된 항체로 검출되었다. 색소원 기질(SureBlue Reserve TMB 1-Component Microwell Peroxidase Substrate, KPL, Inc., Gaithersburg, MD)의 첨가 및 실온(RT)에서 10 분 인큐베이션 이후 반응은 100 μL의 0.1 N HCl 첨가로 중단되었다. 각 웰의 흡광도는 450 nm의 광학 밀도(OD)에서 결정되었다. 항체는 ELISA를 사용하여 갯과 및 고양잇과 IL-31을 결합시키는 그들의 능력으로 선택되었다. 일부 경우에, 추가 특성규명은 포착 항원으로서 고양잇과 IL-31 단백질의 돌연변이체 형태와 ELISA를 사용하여 선택의 시간에 수행되었다. 원하는 결합 및 억제 특성을 가진 항체를 생산하는 세포는 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) IgG를 나타내는 RNA 전사체의 서열 분석으로 선택되었다.
마우스 항체의 경우에, 단일 반응성 CF-1 마우스로부터 공여체 비장세포는 융합에 사용되었고 하이브리도마 상청액은 ELISA에 의해 어느 한쪽 갯과 또는 고양잇과 IL-31 단백질에 결합하는 항체를 위하여 스크리닝되었다. 이것은 IL-31의 양쪽 종에 서브-나노몰 친화도를 갖는, 단일 마우스 항체, Mu-15H05의 확인을 초래하였다(도 2A). 마우스 항 IL-31 15H05는 추가로 서브클로닝되어 동종 항체를 생산하는 그리고 가변 중쇄 및 경쇄의 서열분석을 위하여 하이브리도마를 생성하였다. 항체 15H05에 대하여 결정된 마우스 항 IL-31 가변 서열은 하기와 같이, 15H05 가변 중쇄 (서열번호 67; MU-15H05-VH), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 68; MU-15H05-VH), 15H05 가변 경쇄 (서열번호 69; MU-15H05-VL), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 70; MU-15H05-VL)이다. 마우스 항체 15H05에 더하여, 미국 특허 번호 8,790,651, Bammert 등에서 이전에 기재된 마우스-유래된 항체 11E12가 추가로 고려되었다. 높은 친화도를 가진 양쪽 갯과 및 고양잇과 IL-31 단백질을 결합시키는 항체 11E12의 능력을 보여주는 데이터는 본원에 기재된다. 고양잇과 IL-31을 결합시키는 11E12의 능력은 이러한 항체를 고양이에서 잠재적인 치료적 용도 및 고양이화를 위한 적합한 후보로 만들었다. 항체 11E12에 대하여 이전에 결정된 마우스 항 IL-31 가변 서열은 하기와 같이, 11E12 가변 중쇄 (서열번호 71; MU-11E12-VH), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 72; MU-11E12-VH), 11E12 가변 경쇄 (서열번호 73; MU-11E12-VL), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 74; MU-11E12-VL)이다.
백신화 이후 상승된 항 IL-31 역가를 갖는 개는 원하는 표현형을 가진 항체를 생산하는 B-세포 모집단의 분석을 위하여 선택되었다. B-세포는 추가 분석을 위하여 PBMC, 골수, 비장, 또는 림프절로부터 유래되었다. 단일 B-세포는 개별 웰들로 격리되었고 US 2012/0009671A1, US 2016/0252495A1, US 9,188,593, WO 2015/176162 A9, 및 WO 2016/123692 A1에서 기재된 방법을 사용하여 갯과 IL-31(AbCellera, Vancouver, BC)의 야생형, 11E12 돌연변이체, 및 15H05 돌연변이체 형태를 결합시킬 수 있는 분비된 IgG들의 존재에 대하여 검정되었다.
이러한 스크리닝 전략은 이의 공-수용체 복합체를 통한 신호 전달 및 결합에 중요한 IL-31 단백질의 알려진 영역에 기반된다. 스크리닝을 위한 이들 돌연변이체 단백질의 선택은 본원의 섹션 1.2에서 기재된다. 가변 중쇄 및 경쇄 IgG 도메인의 서열분석은 개별 후보 B-세포로부터 RT-PCR 반응 이후 실시되었다. 이들 스크린은 추가 평가를 위하여 선택되는 9개 갯과 항체의 확인을 초래하였다. 이들 갯과 항 IL-31 가변 서열은 하기와 같이, ZIL1 가변 중쇄 (서열번호75; CAN-ZIL1_VH), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 76; CAN-ZIL1_VH), ZIL1 가변 경쇄 (서열번호 77; CAN-ZIL1_VL), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 78; CAN-ZIL1_VL); ZIL8 가변 중쇄 (서열번호79; CAN-ZIL8_VH), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 80; CAN-ZIL8_VH), ZIL8 가변 경쇄 (서열번호 81; CAN-ZIL8_VL), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 82; CAN-ZIL8_VL); ZIL9 가변 중쇄 (서열번호 83; CAN-ZIL9_VH), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 84; CAN-ZIL9_VH), ZIL9 가변 경쇄 (서열번호 85; CAN-ZIL9_VL), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 86; CAN-ZIL9_VL); ZIL11 가변 중쇄 (서열번호 87; CAN-ZIL11_VH), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 88; CAN-ZIL11_VH), ZIL11 가변 경쇄 (서열번호 89; CAN-ZIL11_VL), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 90; CAN-ZIL11_VL); ZIL69 가변 중쇄 (서열번호 91; CAN-ZIL69_VH), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 92; CAN-ZIL69_VH), ZIL69 가변 경쇄 (서열번호 93; CAN-ZIL69_VL), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 94; CAN-ZIL69_VL); ZIL94 가변 중쇄 (서열번호 95; CAN-ZIL94_VH), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 96; CAN-ZIL94_VH), ZIL94 가변 경쇄 (서열번호 97; CAN-ZIL94_VL), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 98; CAN-ZIL94_VL); ZIL154 가변 중쇄 (서열번호 99; CAN-ZIL154_VH), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 100; CAN-ZIL154_VH), ZIL154 가변 경쇄 (서열번호 101; CAN-ZIL154_VL), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 102; CAN-ZIL154_VL); ZIL159 가변 중쇄 (서열번호 103; CAN-ZIL159_VH), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 104; CAN-ZIL159_VH), ZIL159 가변 경쇄 (서열번호 105; CAN-ZIL159_VL), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 106; CAN-ZIL159_VL); ZIL171 가변 중쇄 (서열번호 107; CAN-ZIL171_VH), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 108; CAN-ZIL171_VH), ZIL171 가변 경쇄 (서열번호 109; CAN-ZIL171_VL), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 110; CAN-ZIL171_VL)이다.
추가 특성규명을 위하여 선택되는 상기 언급된 9개 단클론성 항체는 ZIL1, ZIL8, ZIL8, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159, 및 ZIL171로서 명세서, 도면, 또는 청구항에서 다른 곳에서 지칭될 수 있다.
1.7. 재조합 키메라 및 완전 갯과 항체의 작제
항체 가변 도메인은 항원 결합을 책임진다. 각각의 불변 영역에 전체 가변 도메인의 그라프팅은 IL-31 면역원을 결합시키는 항체의 능력에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는 것으로 예상된다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 올바른 서열이 확인되었는지를 동시에 입증하기 위해 그리고 동종 물질을 생산하기 위해, 발현 벡터는 포유류 발현 시스템에서 재조합 키메라 또는 완전 갯과 항체를 생산하도록 설계되었다. 여기에 기재된 키메라 항체는 고양잇과 또는 갯과 IgG 분자의 각각의 중 및 경 불변 영역에 그라프팅된 숙주 종 항체로부터 가변 서열(CDR 및 프레임워크 둘 모두)로 이루어진다(예를 들어; 마우스 가변 : 갯과 불변은 마우스:갯과 키메라로서 지칭된다). 여기에 기재된 완전 갯과 항체는 갯과 IgG 분자의 각각의 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 그라프팅된 숙주 종 항체(갯과)로부터 가변 서열(양쪽 CDR 및 프레임워크)로 이루어진다. 합성 DNA 서열은 선택되는 항체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 서열에 대하여 작제되었다. 이들 서열은 독특한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 코작(Kozak) 공통 서열 및, N-말단 분비 리더를 함유하여 포유류 세포주로부터 재조합 항체의 발현 및 분비를 촉진시킨다.
마우스:고양잇과 키메라에 대하여, 각각의 가변 영역은 고양잇과 IgG 중쇄 (서열번호 173; 고양잇과_HC_대립유전자A_1), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 174; 고양잇과_HC_대립유전자A_1) 또는 경쇄 (서열번호 175; 고양잇과_LC_카파_G_마이너스), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 176; 고양잇과_LC_카파_G_마이너스) 불변 영역 어느 한쪽을 함유하는 포유류 발현 플라스미드에 클로닝되었다. 마우스:갯과 키메라 또는 완전 갯과 항체에 대하여, 각 마우스 또는 갯과 가변 영역은 갯과 IgG 중쇄 (서열번호 177; 갯과_HC_65_1), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 178; 갯과_HC_65_1) 또는 경쇄 (서열번호 179; 갯과_LC_카파), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 180; 갯과_LC_카파) 불변 영역 어느 한쪽을 함유하는 포유류 발현 플라스미드에 클로닝되었다. 각 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 플라스미드는, CMV 프로모터의 제어 하에서, 표준 방법을 사용하여 HEK 293 세포에 공-형질주입되었다. 6일의 발현 이후, 키메라 mAb는 단백질 정제용 표준 방법에 따른 MabSelect Sure 단백질 A 수지(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)를 사용하여 50 ml의 일시적으로 형질주입된 HEK293FS 세포 상청액으로부터 정제되었다. 용출된 분획은 풀링되었고, 10,000 명목 MW 컷오프 Nanosep Omega 원심 장치(Pall Corp., Port Washington, NY)를 사용하여 약 500 μl로 농축되었고, 밤새 4℃에 1x PBS, pH7.2에서 투석되었고 추가 사용을 위하여 4℃에 저장되었다. 선택되는 재조합 항체의 친화도 및 세포 기반 효력은 아래 기재된다.
도 2는 비아코아(biacore)를 사용하여 마우스 기원으로부터 유래된 CDR을 가진 항체의 친화도를 상세히 설명한다. 도 2A는 양쪽 고양잇과 및 갯과 IL-31 표면에 대한 마우스 항 IL-31 항체 11E12 및 15H05의 친화도 및 고양잇과 및 갯과 키메라 형태의 상응하는 친화도를 도시한다. 이들 관찰은 양쪽 마우스 항체에 대하여 올바른 서열을 입증하고 키메라 형태로의 이의 전환의 결과로서 양쪽 IL-31 종에 대한 일부 친화도를 상실한 마우스:고양잇과 15H05 키메라를 예외로 마우스 모체와 비교된 경우 키메라 형태로의 전환이 동등한 또는 더 높은 친화도를 가진 항체를 초래한다는 것을 나타낸다. 항체 11E12 및 15H05의 완전 마우스 및 키메라 형태는 섹션 1.5에서 기재된 갯과 및 고양잇과 세포 검정에서의 활성에 대하여 또한 시험되었다. 도 3은 이들 검정에 대한 결과를 도시한다. 마우스 항체 11E12 및 15H05는 신호전달을 자극하기 위해 양쪽 갯과 및 고양잇과 IL-31을 사용하여 갯과 및 고양잇과 세포 유형에 대한 활성에 대하여 시험되었다. 양쪽 마우스 항체의 효력은 IC50에서 약간의 증가를 보여주는 고양잇과 FCWF4 세포에서 고양잇과 IL-31에 대한 15H05를 예외로 고양잇과 사이토카인을 사용하여 양쪽 갯과 및 고양잇과 세포에 대해 비교가능하였다. 마우스 15H05는 약간 더 높은 갯과 검정에서 효력을 가진 양쪽 고양잇과 및 갯과 세포에서 갯과 IL-31 신호전달을 차단할 수 있었다. 이들 결과는 이들 항체에 의해 인식된 각각의 에피토프가 양쪽 갯과 및 고양잇과 IL-31에서 실재하고 이들 항체의 결합이 양쪽 종으로부터 관련 세포주에서 수용체-매개된 세포 신호전달을 중화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
도 3은 또한 양쪽 세포 검정에서 선택되는 키메라의 효력을 기재한다. 마우스 항체의 고양잇과 및 갯과 키메라로의 전환은 고양잇과 효력 검정(IC50 범위 1.15 - 3.45 μg/ml)에서 고양잇과 IL-31에 대한 효력에서 최소 영향을 미쳤다. 유사한 결과는 이들 키메라가 15H05 마우스:갯과 키메라에 대하여 관찰된 효력(IC50 = 0.71 μg/ml)에서 약간 증가가 있는 갯과 DH82 세포주에서 고양잇과 IL-31 신호전달에 대해 시험된 경우 관찰되었다. 일반적으로 양쪽 갯과 및 고양잇과 세포 유형에서 갯과 IL-31에 대해 IC50 값의 증가가 있었다. 마우스:고양잇과 15H05 키메라는 마우스:갯과 형태(IC50 28.61 대 12.49 μg/ml)에 비교된 이 검정 형식에서 약간 덜 강력하였다. 마우스 항체에 대한 관찰과 일치하는, 갯과 및 고양잇과 키메라 형태로의 전환은 효력에서 최소 변화를 초래하였다.
면역화된 개의 단일 B 세포로부터 확인된 상기 기재된 항체는 그들의 가변 도메인 서열의 확인 이후 재조합 IgG 단백질로서 작제되었다. 갯과 중쇄 Fc(65_1 아이소타입)에 이들 가변 도메인의 그라프팅은 재조합 완전 갯과 항체의 생성을 초래하였다. 야생형 고양잇과 IL-31을 결합하였고 이의 결합이 (즉 15H05 에피토프에서 유도되는) 고양잇과 IL-31 15H05 돌연변이체에 대해 감소되었던 추가의 갯과 항체를 확인하는 것이 흥미로웠다. 이러한 대체 공급원(갯과 대 마우스)으로부터 수득된 이들 항체는 15H05 에피토프를 인식하고 그래서 선택하기 위한 상이한 물리적 특성을 가진 항체의 다양성을 증가시키는 추가의 파라토프(CDR들을 포함하는, IL-31 단백질을 인식하는 항체의 부분)를 제공한다.
도 4는 양쪽 ELISA 및 Biacore 방법을 사용하여 다양한 단백질에 대한 이들 재조합 갯과 항체의 결합에 대하여 수득된 결과를 도시한다. 간접 ELISA 방법에 대하여, 야생형 및 고양잇과 IL-31 15H05 돌연변이체 단백질에 대한 항체 결합은 평가되었다. 모두 9개 갯과 단클론성 항체(ZIL1, ZIL8, ZIL8, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159, 및 ZIL171)는 야생형 고양잇과 IL-31에 결합할 수 있었고 결합은 이들을 확인하는 데 사용되는 초기 스크리닝 동안 결정된 올바른 결합 표현형을 입증하는 mAb 15H05 에피토프 영역에서 돌연변이에 의해 영향받았다. 비교로, 11E12 항체는 야생형 고양잇과 IL-31에 결합하였고 이의 결합은 도 4에서 데이터에 의해 증명된 바와 같이 15H05 에피토프 영역에서 돌연변이에 의해 영향받지 않았다. 결합을 입증하기 위해, 비아코어 분석은 항체의 표면 및 단일 시험 농도로서 갯과, 고양잇과, 말과, 인간, 고양잇과 15H05 돌연변이체, 및 고양잇과 11E12 돌연변이체 IL-31 단백질을 사용하여 수행되었다. ELISA 관찰과 유사하게, 시험된 모든 항체는 야생형 고양잇과 IL-31에 결합하였다. 본 섹션에서 상기 기재된 데이터와 일치하여, 마우스 항체 11E12 및 15H05 둘 모두는 갯과 및 고양잇과 IL-31 표면에 결합하였다. 3개 추가의 항체, ZIL69(부분적 갯과 결합), ZIL94, 및 ZIL159는 이러한 이중 결합 특성을 갖는 것으로 나타났다. 9개 완전 갯과 항체의 이러한 그룹으로부터, 겨우 ZIL1 및 ZIL9가 말과 IL-31과 교차-반응하였다. 참고로, 항체 15H05는 3개 종을 거쳐 에피토프 보존의 일부 수준을 나타내는 갯과, 고양잇과, 및 말과 IL-31에 결합하였던 본원에 검정된 전체 중 단 하나이었다. 대조적으로, 본원에 기재된 항체의 어느 것도 인간 IL-31에 결합하지 않았다. 추가의 비아코어 표면은 15H05(15H05 돌연변이체) 또는 11E12(11E12 돌연변이체) 에피토프에서 돌연변이가 있는 2개 단백질 및 야생형 고양잇과 IL-31에 항체의 차등 결합을 보여주는 ELISA 관찰을 입증하는 데 사용되었다. 예상된 바와 같이, 대조군 마우스 항체 11E12는 15H05 IL-31 돌연변이체에 결합하였고 에피토프에서 돌연변이로 인해 11E12 IL-31 돌연변이체에 결합하지 않았다. 마찬가지로 마우스 15H05는 15H05 돌연변이체에 결합하지 않았고 이들 2개 항체에 의해 인식된 별도 결합 에피토프를 추가로 식별하는 11E12 IL-31 돌연변이체에 대한 결합을 보유하였다. ELISA 결과와 일치하여, 모든 완전 갯과 항체는 (부분적으로 영향받은) ZIL94, ZIL154, 및 ZIL171을 예외로 15H05 돌연변이에 의해 영향받았다. 다른 결과는 2개의 검정 방법론에서 차이에 기인될 수 있다. 게다가, 3개 항체의 결합은 또한 11E12 돌연변이; ZIL1(부분적으로 영향받음), ZIL8, 및 ZIL159에 의해 영향받는 것으로 나타났다. 이들 결과는 이들 항체에 의해 인식된 에피토프가 IL-31 단백질의 양쪽 영역에서 변화에 의해 영향받는 것을 나타낸다. 종합하면 이들 결과는 항체 15H05에 의해 인식되는 고양잇과 IL-31 단백질상의 영역에 결합을 공유하는 갯과 B 세포로부터 유래된 9개의 항체 특성규명을 뒷받침한다.
1.8. 쥣과 11E12 및 15H05 항체의 고양이화 및 결합 친화도의 최적화
항-약물 항체(ADA)의 생성은 단클론성 항체를 포함하는 임의의 생물치료 단백질의 효능의 상실과 연관될 수 있다. 문헌의 포괄적 평가는 면역원 완전 인간 mAb 및 비-면역원 키메라 mAb의 예가 찾아질 수 있어도 단클론성 항체의 종분화가 mAb가 면역원이 되는 성향을 감소시킬 수 있다는 것을 보여주었다. 본원에 제공된 항-IL-31 단클론성 항체에 대하여 ADA 형성과 관련된 위험 완화를 돕기 위해, 고양이화 전략은 이용되었다. 이러한 고양이화 전략은 CDR 그라프팅에 대하여 가장 적당한 고양잇과 생식계열 항체 서열 확인에 기반된다. 양쪽 가변 중쇄 및 경쇄에 대하여 모든 이용가능한 고양잇과 생식계열 서열의 광범위한 분석 이후, 생식계열 후보는 마우스 mAb에 대한 그들의 상동성에 기반하여 선택되었고, 마우스 조상 mAb로부터 CDR은 고유 고양잇과 CDR을 대체하는 데 사용되었다. 목적은 생체내 면역원성의 잠재력을 최소화하기 위해 고양잇과 항체 프레임워크를 사용하여 고 친화도 및 세포-기반 활성을 유지하는 것이었다. 고양이화된 mAb는 발현되었고 세포-기반 검정에서 고양잇과 IL-31에 대한 그들의 친화도 및 그들의 효력에 대하여 특성규명되었다. 고양이화된 항체가 IL-31을 결합하는 이의 능력을 상실하는 경우에, 조직적 분석은 착수되어 하기를 확인하였다; 1) 기능의 상실을 책임지는 쇄, 2) 기능의 상실을 책임지는 프레임워크, 및 3) 상실 기능을 책임지는 아미노산(들).
mAb 11E12 및 15H05의 고양이화된 가변 중쇄 및 경쇄를 나타내는 합성 뉴클레오타이드 작제물은 만들어졌다. 각각의 고양잇과 중 또는 카파 불변 영역을 함유하는 플라스미드에 각 가변 쇄의 서브클로닝 이후, 플라스미드는 HEK 293 세포에서 항체 발현을 위하여 공-형질주입되었다. 항체 11E12의 고양이화에서 초기 시도는 VL 프레임워크 (서열번호 113; FEL_11E12_VL1), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 114; FEL_11E12_VL1), 및 (서열번호 115; FEL_11E12_VL2), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 116; FEL_11E12_VL2)와 독립적으로 짝짓기된 단일 고양잇과 VH 프레임워크 (서열번호 111; FEL_11E12_VH1), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 112; FEL_11E12_VH1)의 활용에 집중하여 고양잇과 11E12 1.1 및 고양잇과 11E12 1.2 각각을 형성하였다. 종분화에서 이러한 시도는 고양잇과 및 갯과 IL-31 단백질 둘 모두에 대한 고양잇과 11E12 1.1을 이용한 친화도의 상실 그리고 항체의 마우스 형태와 비교된 경우 고양잇과 11E12 1.2 mAb를 이용한 결합의 총 상실을 초래하였다(도 2B). 이들 종분화된 항체의 효력은 고양잇과 IL-31 사이토카인을 사용하여 갯과 DH82 및 고양잇과 FCWF4 세포 검정에서 시험되었다. 고양이화된 11E12 1.1은 항체의 마우스 버젼과 비교된 경우 고양잇과 FCWF 검정에서 고양잇과 IL-31에 대한 효력에서 약 2-배 감소되었다. 고양이화된 11E12 1.2에 대하여 친화도의 상실과 일치하여, 세포 효력의 완전 상실은 이러한 항체에 대하여 관찰되었다(도 3). mAb 11E12 동원체의 개화 동안 이전의 경험에 기반하여, 유사한 전략은 개화에 대한 친화도 상실을 회복하기 위한 시도에서 착수되었다(미국 특허 번호 8,790,651, Bammert 등). 고양잇과 11E12 VL1의 고양이화된 프레임워크 2(FW2) 영역의 (서열번호 73; Mu_11E12_VL), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 74; Mu_11E12_VL)로부터 마우스 FW2로의 치환은 고양잇과 11E12 VL1 FW2를 생성하기 위해 실시되었다. 게다가, 고양잇과 VL (K46Q)의 46 위치에 단일 치환은 (서열번호 119; FEL_11E12_VL1_K46Q), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 120; FEL_11E12_VL1_K46Q)를 생성하기 위해 수행되었다. 상기 VL의 Fel_11E12_VH1과의 짝짓기는 고양잇과 11E12 1.1 FW2 및 고양잇과 11E12 1.1 K46Q 각각을 초래하였다. FW2 변화는 마우스 및 키메라 형태의 것에 상당하는 KD를 초래하는 고양잇과 IL-31 단백질에 대한 고양잇과 11E12 1.1 FW2용 친화도의 회복을 초래하였다(도 2A 및 2B). 이들 변화는 하지만 고양잇과 및 갯과 사이토카인에서 이러한 에피토프를 결합시키는 항체 11E12s 능력의 성질에서 분명한 구별을 나타내는 갯과 IL-31 단백질에 대한 고양잇과 11E12 1.1 FW2 친화도에서 해로운 효과를 가졌다. 고양잇과 11E12 1.1 K46Q에서 단일 아미노산 치환은 이러한 항체의 친화도에 영향을 미칠 수 없었다. 고양잇과 IL-31 단백질에 대하여 항체 11E12 1.1 FW2의 증가된 친화도는 갯과 DH82 검정에서 고양잇과 사이토카인에 대한 증가된 효력을 초래하였다(도 3).
마우스 항체 15H05를 이용한 고양이화 노력은 총 9개 고양이화된 mAb들에 대하여 3개의 고양잇과 VL 프레임워크와 3개의 고양잇과 VH 프레임워크의 조합에 집중하였다. FEL_15H05_VH1(서열번호 121; FEL_15H05_VH1), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 122; FEL_15H05_VH1)은 (서열번호 127; FEL_15H05_VL1), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 128; FEL_15H05_VL1)과 조합되었고, (서열번호 129; FEL_15H05_VL2), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 130; FEL_15H05_VL2), 및 (서열번호 131; FEL_15H05_VL3), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 132; FEL_15H05_VL3)은 고양잇과 15H05 1.1, 고양잇과 15H05 1.2, 및 고양잇과 15H05 1.3 각각을 창출하는 데 사용되었다. FEL_15H05_VH2(서열번호 123; FEL_15H05_VH2), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 124; FEL_15H05_VH2)는 (서열번호 127; FEL_15H05_VL1), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 128; FEL_15H05_VL1)과 조합되었고, (서열번호 129; FEL_15H05_VL2), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 130; FEL_15H05_VL2), 및 (서열번호 131; FEL_15H05_VL3), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 132; FEL_15H05_VL3)은 고양잇과 15H05 2.1, 고양잇과 15H05 2.2, 및 고양잇과 15H05 2.3 각각을 창출하는 데 사용되었다. FEL_15H05_VH3(서열번호 125; FEL_15H05_VH3), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 126; FEL_15H05_VH3)은 (서열번호 127; FEL_15H05_VL1), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 128; FEL_15H05_VL1)과 조합되었고, (서열번호 129; FEL_15H05_VL2), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 130; FEL_15H05_VL2), 및 (서열번호 131; FEL_15H05_VL3), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 132; FEL_15H05_VL3)은 고양잇과 15H05 3.1, 고양잇과 15H05 3.2, 및 고양잇과 15H05 3.3 각각을 창출하는 데 사용되었다. 항체 11E12를 이용한 관찰과 유사하게, 항체 15H05의 고양이화에서 최초 시도는 마우스 15H05와 비교된 경우 고양잇과 IL-31 단백질에 대한 친화도의 상실 그리고 15H05 마우스 고양잇과 키메라와 비교된 경우 중성 작용을 초래하였다(도 2A 및 2C). 갯과 IL-31에 결합하는 고양이화된 항체 11E12를 이용한 관찰과 유사하게, 고양잇과 15H05 VH 및 VL 프레임워크의 특정 조합은 갯과 IL-31에 대한 친화도 면에서 중성 내지 양성 효과를 가졌다(참고 도 2C: 고양잇과 15H05 1.1, 2.2, 및 3.2).
고양이화된 항체 15H05의 친화도를 회복하기 위한 노력에서, 각각의 고양이화된 15H05 VH는 마우스 15H05 VL과 짝짓기되어 헤테로키메라 항체를 생성하였다. FEL_15H05_VH1(서열번호 121; FEL_15H05_VH1), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 122; FEL_15H05_VH1)은 MU_15H05_VL(서열번호 69; MU_15H05_VL), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 70; MU_15H05_VL)과 조합되어 고양잇과 15H05 VH1 마우스 VL을 생성하였다. FEL_15H05_VH2(서열번호 123; FEL_15H05_VH2), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 124; FEL_15H05_VH2)는 MU_15H05_VL(서열번호 69; MU_15H05_VL), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 70; MU_15H05_VL)과 조합되어 고양잇과 15H05 VH2 마우스 VL을 생성하였다. FEL_15H05_VH3(서열번호 125; FEL_15H05_VH3), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 126; FEL_15H05_VH3)은 MU_15H05_VL(서열번호 69; MU_15H05_VL), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 70; MU_15H05_VL)과 조합되어 고양잇과 15H05 VH3 마우스 VL을 생성하였다. 이들 고양이화된 VH 마우스 VL 헤테로키메라는 갯과 및 고양잇과 IL-31에 대한 그들의 친화도에 대하여 분석되었다. 고양이화된 15H05 VH1 및 VH3의 마우스 15H05 VL과의 짝짓기는 마우스 및 키메라 형태에 상당하거나 보다 더 양호하게 고양잇과 IL-31에 대한 친화도를 회복하였다. 개선된 친화도에서 이 추세는 갯과 IL-31 단백질에 또한 관찰되었다(도 2A 및 2C).
친화도 상실을 책임지는 15H05 프레임워크에서 위치를 추가로 분석하기 위해, 15H05(FEL_15H05_VH1)의 단일 고양이화된 VH는 마우스 15H05 VL로부터 개별 프레임워크 치환과 짝짓기하는 데 사용되었다. FEL_15H05_VH1(서열번호 122; FEL_15H05_VH1), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 123; FEL_15H05_VH1)은 FEL_15H05_VL1_FW1(서열번호 133; FEL_15H05_VL1_FW1), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 134; FEL_15H05_VL1_FW1), FEL_15H05_VL1_FW2(서열번호 135; FEL_15H05_VL1_FW2), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 136; FEL_15H05_VL1_FW2), 및 FEL_15H05_VL1_FW3(서열번호 137; FEL_15H05_VL1_FW3), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 138; FEL_15H05_VL1_FW3)과 독립적으로 조합되어 고양잇과 15H05 1.1 FW1, 고양잇과 15H05 1.1 FW2, 및 고양잇과 15H05 1.1 FW3 각각을 창출하였다. 고양잇과 15H05 1.1 상에서 마우스 15H05 FW1의 치환은 양쪽 고양잇과 및 갯과 IL-31에 대한 친화도에 해로웠지만, 마우스 FW2 또는 FW3이 고양잇과 15H05 1.1에서 치환된 경우, 우수한 친화도는 갯과 및 고양잇과 IL-31에 대해 달성되었고 FW2는 양쪽 종에 대하여 우수하였다(도 2C). 추가의 쌍별 프레임워크 치환은 이러한 접근법에 의한 친화도 조정의 정도를 결정하기 위해 수행되었다. FEL_15H05_VH1(서열번호 121; FEL_15H05_VH1), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 122; FEL_15H05_VH1)은 FEL_15H05_VL1_FW1_2(서열번호 139; FEL_15H05_VL1_FW1_FW2), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 140; FEL_15H05_VL1_FW1_FW2), FEL_15H05_VL1_FW2_3(서열번호 143; FEL_15H05_VL1_FW2_FW3), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 144; FEL_15H05_VL1_FW2_FW3), 및 FEL_15H05_VL1_FW1_3(서열번호 141; FEL_15H05_VL1_FW1_FW3), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 142; FEL_15H05_VL1_FW1_FW3)과 독립적으로 조합되어 고양잇과 15H05 1.1 FW1_2, 고양잇과 15H05 1.1 FW2_3, 및 고양잇과 15H05 1.1 FW1_3 각각을 제공하였다. 흥미롭게, 마우스 FW1 단독의 치환은 친화도에 해로웠던 반면 FW1의 FW2 또는 FW3과의 조합은 양쪽 고양잇과 및 갯과 IL-31에 양호한 친화도를 초래하였다(도 2C).
마지막으로, 고양이화된 VH 및 VL 서열의 가장 유망한 조합으로 시작하는 고양잇과 프레임워크에서 복귀돌연변이의 수를 최소화하기 위한 시도는 실시되었다. 이를 위하여, FEL_15H05_VH1(서열번호 121; FEL_15H05_VH1), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 122; FEL_15H05_VH1)은 FEL_15H05_VL1_FW2_K42N(서열번호 145; FEL_15H05_VL1_FW2_K42N), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 146; FEL_15H05_VL1_FW2_K42N), FEL_15H05_VL1_FW2_V43I(서열번호 147; FEL_15H05_VL1_FW2_V43I), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 148; FEL_15H05_VL1_FW2_V43I), FEL_15H05_VL1_FW2_L46V(서열번호 149; FEL_15H05_VL1_FW2_L46V), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 150; FEL_15H05_VL1_FW2_L46V), FEL_15H05_VL1_FW2_Y49N(서열번호 151; FEL_15H05_VL1_FW2_Y49N), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 152; FEL_15H05_VL1_FW2_Y49N), 및 FEL_15H05_VL1_FW2_K42N_V43I(서열번호 153; FEL_15H05_VL1_FW2_K42N_V43I), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 154; FEL_15H05_VL1_FW2_K42N_V43I)와 독립적으로 조합되어 고양잇과 15H05 1.1 K42N, 고양잇과 15H05 1.1 V43I, 고양잇과 15H05 1.1 L46V, 고양잇과 15H05 1.1 Y49N, 및 고양잇과 15H05 1.1 K42N_V43I 각각을 제공하였다. 고양이화된 15H05 VL1에서 전체 마우스 FW2 프레임워크의 치환이 갯과 및 고양잇과 IL-31에 우수한 친화도를 가진 항체를 초래하였던 반면(도 2C, 고양잇과 15H05 1.1 FW2), FW2 아미노산 잔기의 개별 복귀돌연변이는 모두 4개의 치환이 IL-31 에피토프에서 CDR의 위치화를 위하여 최적 3차 구조를 유지하는 데 필요하다는 것을 나타내는 중성 또는 악성 효과를 가졌다. 고양잇과 및 갯과 IL-31에 고양이화된 15H05 1.1 FW2의 증가된 친화도는 추가 작업을 위하여 이 항체의 선택으로 이어진다.
도 5a는 이전에 참고된 개화된 11E12 서열을 고양이화된 버젼과 비교하는 마우스 항체 11E12 VL 서열의 정렬을 도시한다. 아래 참고로 정렬은 IL-31 단백질에 이 항체의 친화도를 회복하는 데 필요하였던 Fel_11E12_VL1에 관련 변화의 위치를 보여주는 점들이다. 마찬가지로 도 5b는 이 항체의 마우스 및 키메라 형태와 비교된 경우 갯과 및 고양잇과 IL-31에 이의 친화도를 회복, 뿐만 아니라 개선하는 데 요구되었던 고양이화된 15H05 VL(Fel_15H05_VL1)에 필요한 변화를 도시한다.
1.9. 글루타민 합성효소(GS) 플라스미드로부터 고양이화된 항 IL-31 항체를 발현시키는 세포주의 생성
고양이화된 15H05 1.1 FW2는 추가 특성규명을 위하여 항체의 동종 공급을 생산할 안정한 세포주의 생성용 후보로서 선택되었다. 세포주 생산용 고양이화된 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자는 GS 플라스미드 pEE 6.4 및 pEE 12.4 각각(Lonza, Basel, Switzerland)에 클로닝되었다. 수득한 플라스미드는 제조자의 프로토콜에 따라 소화되었고 함께 결찰되어 단일 포유류 발현 플라스미드를 형성하였다. ZTS-927에 대하여, 중쇄는 고양잇과 IgG 중쇄 불변 (서열번호 171; 고양잇과_HC_대립유전자A_wt), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 172; 고양잇과_HC_대립유전자A_wt)와 조합된 (서열번호 121; FEL_15H05_VH1), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 122; FEL_15H05_VH1)이다. ZTS-927에 대하여, 경쇄는 고양잇과 IgG 경쇄 불변 (서열번호 175; 고양잇과_LC_카파_G_마이너스), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 176; 고양잇과_LC_카파_G_마이너스)와 조합된 (서열번호 135; FEL-15H05-VL1_FW2), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 136; FEL-15H05-VL1_FW2)이다. ZTS-361에 대하여, 중쇄는 고양잇과 IgG 중쇄 불변 (서열번호 173; 고양잇과_HC_대립유전자A_1), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 174; 고양잇과_HC_대립유전자A_1)과 조합된 (서열번호 121; FEL_15H05_VH1), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 122; FEL_15H05_VH1)이다. ZTS-361에 대하여, 경쇄는 고양잇과 IgG 경쇄 불변 (서열번호 175; 고양잇과_LC_카파_G_마이너스), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 176; 고양잇과_LC_카파_G_마이너스)와 조합된 (서열번호 135; FEL-15H05-VL1_FW2), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 136; FEL-15H05-VL1_FW2)이다. ZTS-1505에 대하여, 중쇄는 고양잇과 IgG 중쇄 불변 (서열번호 173; 고양잇과_HC_대립유전자A_1), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 174; 고양잇과_HC_대립유전자A_1)과 조합된 (서열번호 121; FEL_15H05_VH1), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 122; FEL_15H05_VH1)이다. ZTS-1505에 대하여, 경쇄는 고양잇과 IgG 경쇄 불변 (서열번호 186; 고양잇과_LC_카파_G_마이너스_QRE_마이너스), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 187; 고양잇과_LC_카파_G_마이너스_QRE_마이너스)와 조합된 (서열번호 135; FEL-15H05-VL1_FW2), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 136; FEL-15H05-VL1_FW2)이다. ZTS-1505에 대하여 친화도 및 효력 데이터는 본 실시예 섹션의 섹션 1.18에서 아래 기재된다.
항체의 일시적 생산을 증명하기 위해, 각각의 플라스미드는 HEK 293 세포를 형질주입하는 데 사용되었고 발현은 다양한 크기 배양물에서 실시되었다. 단백질은 표준 단백질 정제 방법에 따른 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 사용하여 조건화된 HEK 배지로부터 단리되었다. 배지는 크로마토그래피 수지에 장입되었고 pH 시프트에 의해 용출되었다. 용출된 단백질은 pH 조정되었고, 투석되었고, 사용에 앞서 멸균 여과되었다. ZTS-361은 고양이 소양증 모델에서 평가를 위하여 이어서 사용되어 생체내 효능을 평가하였다. 단일 GS 플라스미드로부터 생산된 항체, ZTS-927 및 ZTS-361은 친화도 및 효력에 대하여 시험되었다. 도 2D는 비아코어를 사용하여 이들 항체의 친화도 평가용 결과를 도시한다. 고양잇과 IL-31에 대한 ZTS-927 및 ZTS-361의 친화도는 조상 마우스 mAb 15H05의 마우스 및 키메라 형태의 것과 매우 일치한다. 이들 2개 항체의 효력은 양쪽 갯과 및 고양잇과 세포 검정을 사용하여 갯과 및 고양잇과 IL-31에 대해 결정되었다(도 3). 이전 관찰과 일치하여 IC50 값은 양쪽 세포 유형을 가진 IL-31의 갯과 형태를 사용하는 경우 비례하여 더 높았다. 고양잇과 IL-31에 대한 ZTS-927 및 ZTS-361용 IC50 값은 단일 GS 플라스미드를 형성하는 생산된 mAb 15H05의 최종 고양이화된 버젼이 세포주 개발에 적합하였음을 나타내는 항체의 키메라 및 마우스 형태로부터 유래된 값과 또한 매우 일치하였다.
후보 항체를 생산하는 안정한 세포주의 생성을 위하여, GS 플라스미드는, 플라스미드 골격에서 단일 부위에 컷팅하는, 제한 효소, PvuI로 형질주입에 앞서 선형화되었다. GS-CHOK1SV(클론 144E12) 세포는 전기천공을 통해 선형화된 플라스미드 DNA로 형질주입되었다. 세포는 안정한 풀을 생성하기 위해 48-웰 플레이트(48WP)에서 플레이팅되었다. 풀이 48WP에서 적어도 50% 합류성이었던 경우, 100μl의 상청액은 ForteBio Octet 및 단백질 A 바이오센서(Pall ForteBio, Fremont, CA)를 사용하여 IgG 발현에 대하여 분석되었다. 최상의 발현 클론은 6 웰-플레이트(6 WP)로 그 다음 125 mL 진탕 플라스크(SF)에 규모 확대되었다. 세포가 125 mL 플라스크에서 현탁 배양물에 순응하였다면, 각 세포주 풀의 2개 바이알은 LN 저장을 위하여 보관되었다. 제조하는 세포주가 클론성이어야 하기 때문에, 최상부 3개의 최고 발현 풀은 96 웰 배양 플레이트에서 제한 희석함으로써 서브클로닝되었다. 클론성을 증명하기 위해 그리고 제한 희석의 제2 라운드를 피하기 위해, 96 웰 플레이트는 단일-세포의 이미지 및 그들의 후속 성장을 포착하는 Molecular Devices Clone-Select Imager(CSI)(Molecular Devices LLC, San Jose, CA)를 사용하여 이미지화되었다. 클론은 96WP에서 성공적인 CSI 이미지, 성장 및 생산에 기반하여 선택되었다.
세포 배양 성장 및 생산력을 평가하기 위해, 최상부 발현 풀은 125 mL SF내 14-일 공급된 배치에서 추가로 평가되었다. 세포는 Life Technologies의 CD CHO 플러스 4개 아미노산, 사유 공급물 CDF v6.2, 및 10% 글루코스로 이루어지는 공급물 및 플랫폼 배지에서 씨딩되었다. 14-일 공급된-배치 이후, 풀은 원심분리되었고 CD CHO 생산된 mAB는 0.20 μm 폴리에테르설폰(PES) 막을 통해 상청액을 여과시킴으로써 단리된 다음 정제되었다.
전형적인 정제는 235 mL 컬럼의 MabSelect(GE healthcare, cat #17-5199-02)에 장입된 (0.2 μm 여과된, CHO 세포 배양물로부터) 2 L의 조건화된 배지로 이루어진다. 컬럼은 PBS로 사전-평형화되었다. 샘플은 2.5 분 초과의 체류 시간으로 장입되었다. 장입 이후, 컬럼은 재차 PBS로, 그 다음 25 mM 아세트산나트륨, pH 대략 중성으로 세정되었다. 컬럼은 25 mM 아세트산, pH 3.6으로 용출되었고, 그 다음 250 mM 아세트산, 250 mM 염화나트륨, pH 약 2.2로 박리되었다. 분획(50 mL)은 용출 및 스트립 단계 동안 수집되었다. A280에서 UV 흡광도는 전반적으로 모니터링되었다. 피크 분획은 풀링되었고, 20 mM 아세트산나트륨의 첨가로 약 5.5로 pH 조정되었고, 그 다음 완충액의 3개 교환에 대해 투석되었다. 투석물은 수집되었고, 멸균 여과되었고, 4℃에 저장되었다.
1.10. 항체 15H05에 의해 인식된 IL-31에서 에피토프의 확인
항체에 의해 인식되는 IL-31에서 에피토프에 관한 지식은 IL-31Ra:OSMR 공-수용체에 대한 결합으로부터 사이토카인을 중화시키는 기전 이해에 중요하다. 게다가, 에피토프를 안다는 것은 관련한 집중된 면역 반응을 유도하기 위한 서브유닛 백신으로서 그리고 분석 포착 시약으로서 대단한 유용성을 가질 수 있는 펩타이드 에피토프 모방물(미모토프)의 설계 및 항체 결합 친화도의 최적화를 (비제한적으로) 가능하게 한다. CLIPS(스캐폴드상에서 펩타이드의 화학적 연결)를 사용하는 다단계 공정 기술(Timmerman 등. J Mol Recognit. 2007; 20(5): 283-299)은 mAb 15H05(Pepscan, Lelystad Netherlands)의 파라토프에 결합할 수 있는 펩타이드를 확인 및 최적화하는 데 사용되었다. 양쪽 갯과 및 고양잇과 IL-31 단백질에 대한 mAb 15H05의 친화도는 높아서(도 2, MU-15H05) 양쪽 IL-31 종의 1차 서열은 이 작업에 관련된 것으로 간주되었다. 갯과 IL-31 단백질을 나타내는 펩타이드 마이크로어레이 라이브러리는 창출되었고 간접 ELISA를 사용하여 mAb 15H05를 결합할 수 있는 펩타이드를 확인하는 데 사용되었다. 1차 아미노산 서열이 IL-31에서 mAb 15H05의 결합 영역을 나타내는 펩타이드의 확인 이후, 집중된 전체 대체 분석은 IL-31의 분절을 나타내는 펩타이드를 사용하여 그리고 각 위치에서 19개의 다른 가능한 아미노산 잔기로 이러한 mAb 15H05 결합 영역에서 12개 아미노산의 각각을 대체하여 수행되었다. 이러한 분석은 mAb 15H05 결합에 관여된 IL-31에서 핵심 아미노산 잔기를 확인하는 데 필수적이었고 또한 갯과 1차 서열에서의 치환이 항체 결합의 향상으로 이어진다는 것을 증명하였다.
항체 11E12에 의해 인식되는 갯과 IL-31 단백질에서 아미노산은 이전에 기재되었다(미국 특허 번호 8,790,651, Bammert 등). 알라닌으로 전환된 경우 mAb 11E12의 결합에 영향을 미치는 갯과 IL-31 단백질에서 위치를 보여주는 갯과 IL-31 단백질의 돌연변이 분석은 그안에 기재되었다. 상기 mAb 15H05에 대하여 기재된 완전 대체 분석 그리고 11E12의 결합 에피토프의 이전 지식에 기반하여, 고양잇과 IL-31 단백질의 돌연변이체 형태는 각 항체(상기 섹션 1.2에서 기재된 돌연변이체)에 의해 인식된 에피토프에서 2개의 핵심 잔기로 알라닌을 치환시킴으로써 창출되었다. 각 에피토프용 돌연변이는 돌연변이의 부위를 인식하는 항체에 따라 명명되었다(돌연변이체 11E12 및 15H05 대 자연 wt 단백질 서열).
도 6a는 알라닌 치환이 발생하는 위치를 강조하는 돌연변이체 15H05(서열번호 163) 및 11E12(서열번호 161)와 야생형 고양잇과 IL-31(서열번호 157)의 정렬을 도시한다. IL-31은 업 앤 다운 구성을 보유하는 4개 나선형 번들을 가진 사이토카인의 IL-6 패밀리에 속한다(CATH 데이터베이스, Dawson 등. 2017 Nucleic Acids Res. 2017 Jan 4; 45 (Database issue): D289-D295). 상동성 모델은 MOE 소프트웨어(Chemical Computing Group, Montreal, QC, Canada)를 사용하는 인간 IL-6 구조 1P9M(Boulanger 등. 2003 Science. Jun 27; 300(5628):2101-4)에 기반하여 생성되었다. 도 6b는 항체 11E12(부위 1) 및 15H05(부위 2)의 결합에 관여된 아미노산의 위치를 강조하는 고양잇과 IL-31 상동성 모델을 도시한다. 각 항체용 결합 부위는 IL-31 단백질에서 별도 위치에 위치한 것처럼 보인다.
고양잇과 IL-31의 이들 돌연변이체 형태를 결합시키는 mAb 11E12 및 15H05 능력의 영향을 결정하기 위해, 간접 ELISA는 면역검정 플레이트에서 직접적으로 코팅된 돌연변이체를 사용하여 운용되었다. 도 6c는 mAb 11E12 및 15H05가 이러한 검정 양식에서 야생형 고양잇과 IL-31에 결합할 수 있다는 것을 증명하는 이러한 ELISA에 대한 결과를 도시한다. 돌연변이체 11E12가 포착 단백질로서 사용되는 경우, mAb 11E12의 결합은 매우 저하되고 mAb 15H05의 결합은 부분적으로 저하된다. (미국 특허 번호 8,790,651, Bammert 등에서 기재된) 갯과 IL-31에서 11E12 에피토프의 이전 분석은 4개의 아미노산 잔기가 알라닌으로 돌연변이된 경우 mAb의 결합에 영향을 미쳐서 2개 잔기의 돌연변이가, 이 경우에, 이러한 ELISA 형식을 사용하여 mAb 11E12의 높은 친화도 결합을 완전히 제거하는 데 충분하지 않을 수 있다는 것을 나타냈다. 11E12 돌연변이체에 대한 mAb 15H05 결합의 소수 저하는 15H05 결합 부위를 유효화하는 2개의 전면 나선의 움직임으로부터 돌연변이의 번역 효과 때문일 것 같다. mAb 15H05 결합(돌연변이체 15H05)에 영향을 미치도록 설계된 돌연변이는 ELISA에 의해 이러한 IL-31 돌연변이체를 결합시키는 mAb 1505 능력의 완전 상실을 보여준다. 11E12 돌연변이체와 달리, mAb 15H05(돌연변이체 15H05)에 의해 인식된 랜덤 코일에서의 변화는 2개의 에피토프 사이 구별을 추가로 뒷받침하는 mAb 11E12 결합에서 영향이 없었다(도 6c).
1.11. 비아코어를 사용하는 mAbs 15H05 및 11E12의 경쟁 결합 평가
mAb 15H05 및 11E12에 의해 결합된 IL-31 에피토프를 추가로 특성규명하기 위해, IL-31 단백질을 함유하는 표면이 생성된 다음 항체가 순차적 첨가되는 비아코어를 사용하여 차단 실험은 수행되었다. 도 7은 11E12 또는 15H05의 포착 이후 IL-31에 대한 각 항체의 상대 결합을 도시한다. 컬럼 표지화된 HBS-EP(검정 완충액)은 경쟁 없이 IL-31 표면 단독에 결합하는 각 항체로부터 수득된 최대 신호를 나타낸다. 도 7a는 갯과 IL-31에 대한 마우스 15H05 및 11E12 항체용 경쟁 결합 데이터를 도시한다. 이들 결과는 항체 15H05 및 11E12가 이들이 단백질에서 뚜렷한 에피토프를 인식하였다는 것을 나타내는 서로의 존재 하에서 갯과 IL-31에 결합할 수 있다는 것을 분명히 나타낸다. 도 7a에 관련된 센서그람(sensorgram)은 양쪽 항체의 해리 동력학이 이러한 새롭게 형성된 비아코어 표면에서 매우 느리고, 그러므로 결합 부위의 추가의 차지가 동일 항체(데이터는 도시되지 않음)의 첨가와 발생할 수 없다는 것을 나타낸다.
도 7b는 인식된 에피토프에서 중첩 없음을 재차 보여주는 고양잇과 IL-31 표면에서 항체 15H05 및 11E12에 대한 경쟁 결합 데이터를 도시한다. 동일 항체의 존재 하에서 추가의 항체의 결합은 사용되는 표면의 더 불량한 품질로 인한 증가된 오프 레이트(off rate)의 결과이다. 증가된 오프 레이트는 도 2에서 새롭게 형성된 고양잇과 IL-31 표면으로부터 KD 값과 비교될 수 있고 보여질 수 있다.
이들 결과는 뚜렷한 에피토프가 MU-11E12와 비교된 경우 항체 MU-15H05에서 함유된 CDR에 의해 인식되는 것을 나타내는 섹션 1.10에서 에피토프 맵핑 데이터를 추가로 뒷받침한다. 항체 15H05에 의해 인식된 에피토프는 (미국 특허 번호 8,790,651, Bammert 등)에서 기재된 항체 11E12로부터 뚜렷하고 다중 종에서 이러한 사이토카인 활성의 중성화용 IL-31 단백질에서 신규 표적이다. 이들 발견은 고양잇과 IL-31 상동성 모델(도 6b)에서 기재된 결합 부위의 뚜렷한 공간 관계를 강조하고 사이토카인의 이러한 면이 IL-31Ra:OSMR 수용체 복합체와의 상호작용에 중요하다는 가설을 뒷받침한다.
1.12. 가용성 고양잇과 IL-31 공-수용체(IL-31RA 및 OSMR)의 합성 및 특성규명
IL31Ra 및 OSMR 서브유닛으로 이루어지는, 인간 IL-31 헤테로머 수용체 공-복합체는 JAK-STAT 경로의 IL31-매개된 세포간 활성화에 요구되고 아토피성 피부 질환에서 관여하는 것으로 나타났다(Dillon 등. 2004 Nat Immunol. Jul; 5(7):752-60, Dreuw 등. 2004 J Biol Chem. 279:36112?36120; 및 Diveu 등. 2004 Eur Cytokine Netw. 15:291-302). 인간 IL-31 Ra 서브유닛은 IL-31이 세포 표면 수용체와 접촉하는 경우 발생하는 초기 결합 이벤트로서 나중에 기재되었고 이 이벤트는 높은 친화도 공-수용체 복합체의 후속 형성이 있는 OSMR의 모집을 위한 전제조건이다(Le Saux 등. 2010 J Biol Chem. Jan 29;285(5):3470-7). 우리는 고양잇과 IL-31 단백질이 양쪽 OSMR 및 IL-31 Ra에 독립적으로 결합할 수 있다는 증거를 여기에 기재한다. 이러한 관찰은 신규하고 IL-31 단백질이 IL-31Ra:OSMR 공-수용체와 상호작용하는 방법의 이해에 그리고 개별 서브유닛과 독립적으로 상호작용함에 따라 IL-31의 생물학적 역할에 중요한 영향을 갖는다.
IL-31이 이의 공-수용체에 결합하는 방법의 이해를 가능하게 하기 위해 그리고 확인된 항체의 억제 특성을 특성규명하기 위해, 2개의 수용체 형태는 합성되었다. 개별 IL-31 수용체 서브유닛 IL-31Ra(서열번호 169; 고양잇과_IL31Ra_HIgG1_Fc_X1_Fn3), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 170; 고양잇과_IL31Ra_HIgG1_Fc_X1_Fn3), 및 OSMR-(서열번호 167; 고양잇과_OSMR_hIgG1_Fc), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 168; 고양잇과_OSMR_hIgG1_Fc)는 모두 인간 IgG1 Fc 융합물로서 작제되었다. 인간 동족체에 상동성에 의해, 사이토카인 결합, 피브로넥틴 III, 및 Ig-유사 도메인은 확인되었다. 개별 수용체 서브유닛을 평가하기 위해, (이의 예상된 N-말단 근위 피브로넥틴 III 도메인과) OSMR 및 IL-31Ra의 세포외 도메인은, 그들의 고유 신호 펩타이드를 모두 사용하는, 인간 IgG1 Fc 융합물로서 생성되었다. 모든 합성 카셋트는 pcDNA3.1에 클로닝되었고, ExpiCHO 시스템에서 발현되었고 상기 기재된 바와 같이 정제되었다.
야생형 및 돌연변이체 IL-31 단백질을 결합하는 이들 수용체 형태의 능력을 분석하기 위해, 그리고 간접 ELISA는 4℃에서 carb/bicarb 완충액(sigma C3041-100CAP)에서 밤새 임뮬론(immulon) 2HB 플레이트(1 μg/ml) 상에 각각의 단백질의 100 μL를 코팅시킴으로써 운용되었다. ELISA 플레이트는 그 다음 실온에서 1 시간 동안 PBST내 5% NFDM 차단 완충액으로 차단되었고 이어서 1 시간 동안 룸에서 각 수용체 작제물의 다중 농도를 결합시켰다. PBST를 이용한 세정 이후, 결합된 수용체의 존재(Fc 융합)는 실온에서 1 시간 동안 마우스 항-인간 IgG1(Lifetech A10684, 1:500 희석액)을 사용하여 확인되었다. 웰은 PBST를 이용하여 재차 세정되었고 KPL 수레블루(sureblue) 3,3',5,5'-테트라-메틸벤지딘(TMB) 마이크로웰 기질로 전개되었다. 도 8은 포착물로서 고양잇과 IL-31 단백질의 야생형 및 돌연변이체 형태를 사용하여 이러한 간접 ELISA용 결과를 도시한다. 이들 데이터는 IL-31Ra 및 OSMR 수용체 서브유닛에 독립적으로 결합하는 야생형 고양잇과 IL-31의 능력을 증명한다. 이들 관찰은 IL-31 단백질이 IL-31Ra 서브유닛에 초기에 결합하고 상기 부위에 OSMR을 추가로 모집한다는 것을 나타내는 이전의 보고와 대조적이다. IL-31의 생물학적 역할이 여전히 결정중임에 따라, 질환, 예컨대 아토피성 피부염에서 이의 역할의 약화에 잠재적 결말 그리고 수용체 결합의 동력학을 이해하는 것이 매우 중요하다. 이러한 이유로, IL-31Ra 및 OSMR을 인식하는 IL-31의 능력을 방해할 수 있는 에피토프에 결합하는 항체를 특성규명하는 경우 이들 관찰은 고려되었다.
섹션 1.2에서 우리는 알라닌으로 전환된 그들의 결합 부위에서 핵심 아미노산을 가진 돌연변이체(돌연변이체 11E12 및 15H05 각각)에 대한 항체 11E12 및 15H05의 약화된 결합을 기재한다. 개별 IL-31Ra 및 OSMR 수용체 서브유닛에 결합하는 능력에서 이들 돌연변이의 영향을 이해하는 것이 그러므로 매우 흥미로웠다. 도 8은 어느 한쪽 11E12 또는 15H05 결합 부위에서의 돌연변이가 결합하는 IL-31Ra 및 OSMRs 능력을 완전히 방해하여 양쪽 수용체 서브유닛과 IL-31의 상호작용에 필요한 에피토프를 양쪽 항체가 결합한다는 것을 나타냄을 도시한다. 결합의 부족은 또한 돌연변이에서 비롯하는 IL-31의 확인에서의 변화에 기인될 수 있지만 이들 돌연변이체는 이것이 사실이 아님을 시사하는 항체에 여전히 결합할 수 있다. 이러한 핵심 발견은 이의 공-수용체를 통해 신호전달하는 사이토카인 능력을 중화시키는 그리고 이 과정 동안 어느 한쪽 수용체에 사이토카인의 세포 회합을 추가로 차단하는 IL-31에서 에피토프를 인식하는 양쪽 항체 11E12 및 15H05(및 유도체)의 능력을 뒷받침한다. 이들 데이터는 순환으로부터 IL-31을 제거할 수 있는 그리고 세포 표면 또는 가용성 수용체 형태에 결합할 수 없게 만들 수 있는 항체의 확인을 뒷받침한다.
1.13. 고양잇과 IL-31 소양증 도전 모델에서 키메라 항체의 생체내 평가
이의 표적을 효과적으로 중화시키는 항체의 능력은 생체내 효력에 외삽을 허용하는 세포 기반 검정에서 적당한 친화도 및 효력을 가진 표적 단백질에서 관련 에피토프에 대한 결합의 검사를 통해 시험관내 평가될 수 있다. 마우스 조상 mAbs 11E12 및 15H05로부터 생성된 항체의 2개 시리즈를 특성규명하기 위해 취해진 단계들은 상기 기재된다. 섹션 1.7은 최초 마우스 단클론성 항체와 비교가능한 갯과 및 고양잇과 IL-31에 대한 수득한 친화도를 가진 mAb 11E12 및 15H05의 마우스:고양잇과 키메라 형태의 생성을 기재한다(도 2A). 11E12 및 15H05의 마우스:고양잇과 키메라 형태는 또한 갯과 및 고양잇과 대식세포 세포에서 고양잇과 IL-31 유도된 pSTAT3 신호전달의 억제를 나타내는 비교가능한 IC50 값을 가졌다(도 3). 섹션 1.8에서 고양이화 과정 동안, 마우스 mAb 11E12는 갯과 및 고양잇과 IL-31에 대한 친화도의 후속 상실(도 3) 및 갯과 및 고양잇과 세포에서 고양잇과 IL-31 신호전달에 대한 효력의 상실(도 3)을 가진 고양이화된 버젼(고양잇과 11E12 1.1)으로 전환되었다. 섹션 1.8에서 기재된 고양이화된 11E12 및 15H05 항체의 최적화에 앞서, 고양이 도전 모델에서 고양잇과 IL-31의 소양성 활성을 중화시키는 이들 예비 고양이화된 및 키메라 형태의 능력을 이해하는 것이 흥미로웠다. 흥미로운 것은 소양증의 중화에서 이들 상이한 항체의 약력학적 효과 그리고 효능에 영향을 미칠 수 있는 친화도, 세포 효력, 또는 에피토프 인식에 대한 임의의 상관관계를 이해하는 것이었다. 소양증 도전 모델에서 생체내 효능에 상관관계가 있는 다양한 세포 효력 수행은 시험관내 검정을 사용하여 필요한 추가 최적화를 예측할 수 있다.
마우스:고양잇과 11E12 키메라, 마우스:고양잇과 15H05 키메라, 및 고양이화된 11E12(고양잇과 11E12 1.1)의 예비 효능을 시험하기 위해, 고양이에서 IL-31 유도된 소양증 모델은 개발되었다. 0.5 μg/kg 고양잇과 IL-31(서열번호 159; 고양잇과_IL-31_E_콜리), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 160; 고양잇과_IL-31_E_콜리)의 정맥내 용량 이후, 고양이는 (비제한적으로) 혀로 핥기, 씹기, 긁기, 및 머리 또는 몸통 흔들기를 포함하는 일시적 소양성 행동을 묘사할 것이다. 케이지에 대한 닦기는 소양성 활성으로 간주되지 않았다. 소양성 관찰은 IL-31 단백질의 투여에 앞서 30 분 동안 그리고 이후 1 시간 동안 훈련된 조사자에 의해 진행한다. 본 연구를 위하여, 고양잇과 IL-31을 이용한 기준선 도전은 항체를 이용한 투약에 앞서 최대 1 개월 수행되었다. 0 일째에, 0.5 mg/kg 항체 용량은 각 동물에 사전-결합된 복합체 주사에 앞서 60 분 동안 실온에서 0.5 μg/kg의 고양잇과 IL-31과 조합되었다. "무 mAb" 대조군은 대조군으로 포함되었다. mAb의 용량은 사이토카인에 대한 항체의 총 몰 과량을 나타낸다. 소양성 활성은 0, 7, 및 21 일째에 기재된 바와 같이 모니터링되었다. 도 9에서의 결과는 위약 대조군과 비교된 경우 0, 7, 및 21 일째에 mAb 마우스:고양잇과 15H05 키메라를 이용한 소양증 점수에서 상당한 개선(p<0.05)을 도시한다. 마우스:고양잇과 11E12 키메라가 0 일째에 효능에서 초기 추세를 보여주었어도, 비히클 위약과 비교된 경우 임의의 시점에 소양증에서 상당한 감소를 달성하지 못했다. 고양잇과 11E12 1.1은 0 일째에 소양증을 감소시키지 못했고 비히클 위약과 비교된 경우 효능에서 추세를 보여주지 못해서 7 및 21 일째 추가 IL-31 도전은 수행되지 못했다.
종합하면 이들 결과는 IL-31에 의해 유도된 고양이에서의 소양성 행동 예방에서 고양잇과 11E12 1.1에 대한 효능이 부족한 이들 항체의 활성 사이 분명한 묘사를 보여준다. 고양잇과 11E12 1.1의 친화도 및 효력의 상실은 유사하게 생체내 효능의 부족을 초래하였다. 마우스:고양잇과 11E12 키메라 및 마우스:고양잇과 15H05 키메라의 효능 성과를 비교하는 경우 구별은 더욱 미묘하다. 두 mAb들의 키메라 형태는 그들의 마우스 조상에 비교가능한 KD 값을 가지고 마우스:고양잇과 11E12의 친화도는 양쪽 고양잇과 및 갯과 IL-31보다 약간 우수하다(도 2A). 이러한 증가된 친화도는 하지만 마우스:고양잇과 15H05 키메라가 고양잇과 FCWF4 세포에서 고양잇과 IL-31 유도된 pSTAT3 신호전달에 대해 마우스:고양잇과 11E12 키메라의 것에 약 2-배 증가된 IC50을 가짐에 따라 증가된 효력으로 직접적으로 해석하지 않는다(도 3). 이들 데이터는 항체 15H05 CDR이 고양잇과 IL-31을 인식하는 방식이 고양이의 소양증 차단에서 차례로 더욱 효과적으로 만드는 이의 공-수용체를 통해 신호전달하는 사이토카인 능력 중화에 우수하다는 것을 제시한다. 이들 세포 검정에서 관찰된 IC50의 차이는 생체내 효력을 예측하기 위한 그리고 일련의 항체 양쪽 내에서 및 사이에서 에피토프 인식의 미묘한 차이를 식벽하기 위한 유망한 수단을 제공한다.
1.14. 고양이 소양증 도전 모델에서 고양이화된 15H05 항 IL-31 항체의 효능의 생체내 평가
상기 기재된 마우스:고양잇과 15H05 키메라를 사용하는 양성 효능 성과에 기반하여, 추가 작업은 (섹션 1.8에서 상기 기재된) 고양이화된 15H05의 친화도 및 효력을 증가시키기 위해 실시되었다. 항체 고양잇과 15H05 1.1에서 가변 경쇄 고양잇과 프레임워크의 조직적 치환은 마우스 15H05에 비교된 양쪽 고양잇과 및 갯과 IL-31에 증가된 친화도를 갖는 고양잇과 15H05 1.1 FW2의 확인을 초래한다(도 2). 단일 플라스미드에 고양잇과 15H05 1.1 FW2의 중쇄 및 경쇄의 조합은 HEK 및 CHO 발현 시스템으로부터 생산 이후 ZTS-927 및 ZTS-361 항체의 형성을 초래한다. 단일 플라스미드로부터 발현에서 비롯하는 양쪽 항체의 친화도 및 효력은 도 2 및 3 각각에서 또한 기재된다.
완전 고양이화된 항-고양잇과 IL-31 mAb ZTS-361의 효능은 IL-31 유도된 생체내 고양이 모델에서 소양성 행동을 중화시키는 이의 능력에 대하여 평가되었다. 도 10a는 0 일째가 그룹 T02의 항체 투여의 날인 -7 일째부터 28 일째까지 T01 비히클 위약 및 T02 항체 ZTS-361 그룹에 대하여 기준선 사전-도전 소양성 행동을 도시한다. 본 그래프에서 도시된 바와 같이, IL-31 도전에 앞서 양쪽 T01 및 T02 그룹에 대하여 채점된 소양성 행동의 가변성은 30 분 관찰 기간 내에서 0과 10 사이 관찰된 소양성 이벤트의 수로 거의 변화가 없었다. 본 연구는 0 일째에 고양이가 고양잇과 IL-31과 조합 없이 피하로 4 mg/kg ZTS-361이 투약되어 사전-결합된 복합체를 생성하였다는 점에서 섹션 1.13에서 상기 기재된 예비 고양잇과 도전 모델과 상이하였다. 이것은 항체 ZTS-361이 순환 IL-31을 결합 및 중화하기에 충분한 노출을 가져야 하는 항체가 필요한 최초 IL-31 도전에 앞서 7 일 동안 순환될 것임에 따라 더욱 엄격한 효능 평가를 나타낸다.
본 연구를 위하여, 소양성 행동은 IL-31 단백질의 0.5 μg/kg 정맥내 도전 이후 1 시간 동안 7, 21, 및 28 일째 평가되었다. 도 10b는 비히클 위약 대조군과 비교된 경우 IL-31 도전 이후 7 일째(p < 0.0001), 21 일째(p < 0.0027), 및 28 일째 (p<0.0238) 관찰된 소양증에서 상당한 감소를 증명하는 항체 ZTS-361의 효능을 도시한다. 이러한 도전 모델로부터 데이터는 마우스:고양잇과 15H05 키메라의 효능을 증명하는 이전의 관찰을 뒷받침하고 15H05 CDR들에 의해 인식된 고양잇과 IL-31에서 에피토프의 관련성 및 세포-기반 효력을 뒷받침한다. 이들 데이터는 생체내 고양잇과 IL-31에 의해 유도된 소양증을 중화시키는 항체 ZTS-361의 능력을 추가로 뒷받침하고 이러한 항체가 아토피성 피부염을 포함하는 고양이의 IL-31-매개된 질환의 치료에서 치료제로서 작용할 수 있다는 것을 제시한다.
의뢰인 소유 동물에서 IL-31의 혈장 수준을 검사하는 최근 데이터는 정상 실험실 비글에 비교하여 아토피성 및 알레르기성 피부염을 가진 개들 중에 유통되는 사이토카인의 증가된 양을 보여준다(도 11a). 최근 연구는 미국에서 몇몇 상이한 지리적 영역으로부터 알레르기성 피부염(AD)의 추정 진단으로 고양이의 혈청 IL-31 수준을 결정하기 위해 수행되었다. 도 11b는, 아토피성 및 알레르기성 피부염을 가진 개처럼, 이 추정 진단으로 조사된 73마리 고양이가 17마리 연령-매칭된 대조군 고양이에서 205 fg/ml에 비교하여 8799 fg/ml의 평균 순환 IL-31 수준을 가졌다는 것을 나타내는 이러한 평가로부터의 결과를 도시한다. 이전의 모델 개발 연구에서 갯과 IL-31의 수준을 이해하기 위해, 갯과 IL-31의 약동학적 프로파일은 1.75 μg/kg의 피하 용량의 투여 이후 개에서 분석되었다. 도 11c는 약 30 ng/ml의 최대치에 도달하는 처음 한 시간 내에 피크 혈장 수준 그리고 3 시간에 약 400 pg/ml의 유지된 수준을 도시한다. 이들 발견에 기반하여 이 고양잇과 모델에서 사용되는 0.5 μg/kg 고양잇과 IL-31의 정맥내 용량이 개 및 고양이에 대하여 자연 발생 질환 상태에서 관찰된 것보다 훨씬 과도한 순환량을 초래할 것을 믿는 것이 합리적이다.
1.15. 선도 고양이화된 항 IL-31 항체의 진보에 사용되는 분석 방법
세포주 개발의 과정 동안, 다양한 분석 방법은 항체 치료제가 일관된 영지에서 제조될 수 있음을 보증하기 위해 이용된다. (비제한적으로) 생산물 동일성, 순도, 및 효력을 보증하는 분석 방법에 세심한 주의는 선도 단클론성 항체의 일관된 생산 그리고 표적 동물 종에서 효력 및 안전성 성과에 대한 강한 상관관계에 중요하다. 항체가 쇄간 디설파이드 결합을 통해 결합된 2개 헤테로이량체 유닛의 호모이량체이기 때문에, 짝짓기 공정에서 임의의 파괴는 단백질 약물 생산물의 비-균일성을 초래할 수 있다. 항체의 해리를 모니터링하는 데 매우 적합한 2개의 분석 방법은 비-환원(NR) 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 및 비-환원(NR) 모세관 겔 전기영동(CGE)이다.
NR SDS-PAGE는 테스트 샘플에서 개별 단백질 종의 질량의 편리한 정성적 결정 방법을 제공한다. SDS는 단백질에 순 음전하를 균일하게 부여하는 단백질과 소수성으로 회합하여 질량에 기반된 개별 성분의 분리를 허용한다. 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동 분리 이후, 단백질은 검출을 허용하기 위해 쿠마씨 블루 같은 염료로 염색된다. 염색의 비-선형성은 개별 단백질 밴드의 절대 정량화를 예방하지만 밀도계 분석을 할 수 있는 소프트웨어(VersaDoc, Bio-Rad)를 사용하여 추정을 허용한다. CGE로서 흔히 알려진, 모세관 겔 전기영동은 단백질을 균일 음전하를 재차 초래하는 SDS 처리하고 비-공유 단백질 복합체를 해리시킨다. 전기장의 존재 하에서, SDS-코팅된 단백질은 애노드쪽으로 이동하고 220 nm의 고정된 파장에 자외선 흡광도를 사용하여 검출된다. 분리는 대체가능한 SDS-중합체 겔 체화 매트릭스로 채워진 모세관 내의 샘플에서 성분의 크기에 기반된다. 비-환원 CGE에서, 알킬화 제제 요오도아세트아미드(IAM)는 첨가되어 샘플 제조 동안 디설파이드 결합 셔플링을 최소화한다. 온전한 IgG는 임의의 분획화된 종으로부터 분리되어, 순도를 정량화한다. CGE 분석용 소프트웨어(예는 Empower 또는 32 Karat임)는 이동 시간에 의한 개별 피크 면적으로서 정의되는 시간 수정 영역(TCA)을 이용한다. 총 TCA는 0.3% 이상의 모든 피크에 대한 TCA들의 합계로서 정의된다. 퍼센트 단량체 온전한 IgG 및 아종은 그래서 총 TCA의 퍼센트로서 그들의 개별 TCA들에 기반하여 계산될 수 있다.
소양증의 고양잇과 모델에 대하여 기재된 ZTS-361용 유망한 생체내 효능 데이터를 감안하면(섹션 1.14), 항체의 다양한 다수의 추가 특성규명은 이들 기재된 분석 방법을 사용하여 결정되었다. 이 과정 동안, 고양이화된 항 IL-31(ZTS-361) 항체를 발현시키는 안정한 풀이 마우스 조상 하이브리도마 15H05에 비하여 SDS-PAGE의 쿠마씨 염색에 의해 가시적인 (자유 경쇄를 포함하는) 더 낮은 분자량 종의 증가된 수준을 갖는다는 것이 확인되었다(도 12). 본원에, 온전한, 또는 온전한 단량체는 약 150 kDa의 예상된 분자량을 가진 쇄간 디설파이드 결합에 의해 함께 결합된 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄가 있는 IgG를 지칭한다. HHL은 1개의 경쇄 누락 및 약 125 kDa의 예상된 분자량을 가진 IgG를 "중 중 경"으로서 본원에 지칭한다. HH는 양쪽 경쇄 누락 및 약 100 kDa의 예상된 분자량을 가진 IgG를 "중 중"으로서 본원에 지칭한다. HL은 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 및 약 75 kDa의 예상된 분자량을 가진 IgG를 "중 경"으로서 본원에 지칭한다. L은, 자유 경쇄로서 본원에 또한 지칭된, 1개의 경쇄 및 약 25 kDa의 예상된 분자량을 가진 IgG를 "경"으로서 본원에 지칭한다. NR CGE를 사용하여 이러한 동일 물질의 정량적 평가는 마우스 조상 15H05(94.7%)와 비교된 경우 ZTS-361에 대하여 상당히 덜 온전한 단량체 IgG(83%)를 드러냈다(도 13A). 도 13B는 NR CGE에 의한 샘플의 분해 이후 전기영동도를 도시한다. 상이한 체류 시간에 이들 피크로부터의 데이터는 샘플 1(ZTS-361) 및 샘플 2(마우스 15H05)에 대한 총계의 퍼센트 TCA를 정량화하는 데 사용되었다. 주요 온전한 IgG 피크보다 더 적은 분자량을 가진 소수 피크의 합계는 도 13A에서 나타난 퍼센트 단편(% 단편)을 계산하는 데 사용된다. ZTS-361을 생산하는 안정한 CHO 풀은 마우스 하이브리도마 15H05를 가진 겨우 5.3%와 비교하여 고양이화된 IgG의 분획화된 형태로서 발견된 최종 항체 생산물의 17%를 초래하였다.
이러한 현상의 이해를 돕기 위해, 단일 클론성 CHO 세포 단리물은 온전한 IgG 단량체의 백분율이 개별 클론들 사이에서 다양하였는지를 보기 위해 ZTS-361 클론성 풀로부터 유래되었다. 도 14a는 ZTS-361을 안정하게 발현시키는 8개 개별 클론의 배양물로부터 유래된 정제된 항체를 이용한 쿠마씨-염색된 NR SDS-PAGE를 도시한다. 비교를 위하여 1 및 8 표지화된 레인은 온전한 IgG 단량체의 높은 백분율(약 97%)을 갖는 것으로 알려진 참고 표준 항체를 도시한다. 밴드 강도의 정성적 밀도계 결정은 도면의 우측에서 도시된다. 퍼센트 온전한 단량체의 클론성 변이는 평균 약 82%인 80.2% 내지 86% 범위이다. 마찬가지로 퍼센트 단편의 정량화는 개별 클론에 대하여 평균 17.5%인 14.0% 내지 19.5% 범위이었다. 도 14b는 NR-CGE를 사용하여 이들 개별 클론의 정량적 평가를 도시한다. 더 적은 변이는 시험된 8개 클론에 걸쳐 관찰된 86.3%의 평균 퍼센트 온전한 단량체 및 13.7%의 더 적은 분자량 종의 백분율로 이러한 방법을 사용하여 관찰된다. 높은 수준의 일관성이 개별 클론들 중에 ZTS-361에 대하여 온전한 IgG 단량체의 백분율로 관찰된 동안, 온전한 IgG 단량체의 전체 수준이 항체의 마우스 버젼에 대하여 관찰하였던 것보다 더 낮은 이유를 이해하는 것이 흥미로웠다. 일시적 발현 시스템(예는 HEK 및 CHO 세포임)으로부터 생산된, 비제한적으로 고양이화된 항체를 포함하는, 항체가 높은 수준의 퍼센트 단량체 형태(약 88% 내지 약 92%)를 가진 IgG의 생산을 초래하였다는 것을 유의하는 것이 중요하다(데이터 도시되지 않음). 상응하여 이들 일시적 배양물로부터 생산된 항체 양은 안정한 CHO 계통으로부터의 것보다 상당히 더 적다. 임의의 1개 이론에 의해 구속되기를 바라지 않지만, 고양이화된 및 기타 종으로 보여진 분획화된 항체 종의 발생은 숙주 세포가 다량의 항체를 예외적으로 생산중인 조건 하에서 관찰될 수 있고 배양 조건 및/또는 항체 분자 조성에서 고유의 제한은 관찰된다.
1.16. 포유동물의 다중 종으로부터 IgG 카파 경쇄 불변 도메인의 1차 아미노산 서열의 고려
고양이화된 항체 ZTS-361에 대한 잠재적 제한의 분석은 1차 항체 서열의 고려로 시작하였다. ZTS-361은 고양잇과 IgG 중쇄 불변 영역 (서열번호 173; 고양잇과_HC_대립유전자A_1)n, 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 174; 고양잇과_HC_대립유전자A_1)과 조합된 가변 영역 (서열번호 121; FEL_15H05_VH1), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 122; FEL_15H05_VH1)을 포함하는 중쇄 그리고 고양잇과 IgG 경쇄 불변 영역 (서열번호 175; 고양잇과_LC_카파_G_마이너스), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 176; 고양잇과_LC_카파_G_마이너스)와 조합된 가변 영역 (서열번호 135; FEL-15H05-VL1_FW2), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 136; FEL-15H05-VL1_FW2)를 포함하는 경쇄로 구성된다. 자연 발생 고양잇과 항체 중쇄 불변 영역의 기능성 특성은 Strietzel 등(2014 Veterinary Immunology and Immunopathology April 15; 158(3-4): 214-223)에 의해 이전에 기재되어 왔다. 우리는 중쇄 불변 영역 (서열번호 171; 고양잇과_HC_대립유전자A_1)을 사용하여 고양이화된 항체 ZTS-361의 클로닝 및 발현을 본원에 기재한다. 서열번호 171 고양잇과 HC 대립유전자A 1은 Strietzel 등 2014 상기에서 고양잇과 IgG1a에 상응하고 인간 IgG1에 기능적으로 동등한 것처럼 보인다. 다양한 세트의 종으로부터 다른 불변 영역과 이 중쇄 불변 영역의 정렬 및 이들 기능성 속성의 비교는 온전한 IgG 단량체의 형성에서 비효율을 초래할 관심의 임의의 명백한 영역을 드러내지 않았다(데이터는 나타나지 않음).
ZTS-361(서열번호 175; 고양잇과_LC_카파_G_마이너스)에서 사용되는 카파 불변 쇄의 유사한 분석은 적어도 고양잇과 및 갯과 서열에서 관찰된 카파 불변 경쇄 다양성의 독특한 양태를 드러낸다. 상이한 종은 상이한 빈도로 그들의 면역글로불린 레퍼토리에서 카파 경쇄를 이용한다. 도 15는 표시된 종으로부터 몇몇 카파 경쇄 불변에 대하여 대표적인 c-말단 아미노산 및 상응하는 뉴클레오타이드를 도시한다. 묘사된 종으로부터 IgG들에 의한 카파 경쇄 이용의 백분율은 하기에 따른다; 갯과, 고양잇과, 및 돼지(Arun 등. 1996 Zentralbl Veterinarmed. Nov; 43(9):573-6), 밍크(Bovkun 등. 1993 Eur J Immunol. Aug; 23(8):1929-34), 마우스(Woloschak 등. 1987 Mol Immunol. Jul; 24(7):751-7), 인간(Barandun 등. 1976 Blood. Jan; 47(1):79-89). 단클론성 항체의 일상적 생성은 마우스를 사용하여 실시된다. 도 15에서 묘사된 바와 같이 마우스는 람다 경쇄에 비교된 경우 시간의 약 95% 카파 경쇄를 이용한다. 대조적으로 개 및 고양이는 그들의 면역글로불린 레퍼토리에서 람다 경쇄를 주로 사용한다(9% 및 8% 각각). 비교로, 2개의 비-인간(돼지 및 밍크) 및 인간 포유동물은 균형된 활용 카파 및 람다 경쇄 용법(50%, 46%, 및 약 50% 각각)을 보여준다. 대부분의 c-말단 시스테인의 위치는 이러한 도면에서 주해되고 상이한 종에 걸쳐 정렬된다. 이러한 시스테인은 불변 중쇄와 쇄간 공유 디설파이드 결합의 형성에 참여함에 따라 온전한 IgG 구조를 형성하기 위해 생성된 4차 복합체의 형성에 중요하다. 임의의 1개 이론에 의해 구속되기를 바라지 않지만, 적어도 갯과 및 고양잇과 카파 경쇄가 말단 시스테인의 다음에 다중 아미노산을 함유한다는 것을 주목하는 것이 매우 흥미롭다. 이들 추가의 아미노산 잔기는 극성(글루타민) 및 전하(아르기닌, 아스파르트산 및 글루탐산) 둘 모두를 갖는다. 이들 잔기는, 비제한적으로, 이들이 외부 수성 환경과 상호작용을 포함하는 수소 결합 상호작용과 함께하는 환경에서 전형적으로 찾아진다. 말단 시스테인을 넘어서 이들 추가의 잔기의 성질 및 위치는 IgG 헤테로이량체를 형성하는 데 필요한 쇄간 디설파이드 결합의 형성을 방해할 수 있다. 2마리의 포유동물(돼지 및 밍크)은 c-말단 시스테인을 넘어서 더 적은 추가의 잔기를 갖고, 대략 동등한 비율(50% 및 46% 각각)로 카파 및 람다 경쇄를 사용한다. 서열번호 175의 아미노산 위치 107에서 시스테인의 바로 다음에 카파 경쇄 불변의 c-말단에서 아미노산의 변이 및 결실이 있는 ZTS-361의 재조합 형태의 생성은 HEK 세포로부터 일시적 발현을 사용하여 창출되었고 NR-CGE에 의해 퍼센트 단량체 IgG에 대하여 시험되었다(데이터는 나타나지 않음). 이전에 언급된 바와 같이, 미짝짓기된 경쇄 및 더 적은 분자량 IgG 복합체의 생산은 항체가 안정한 클론성 세포로부터 과잉생산중인 바의 조건 하에서 더욱 명백하다. NR-CGE는 하지만 세포(예 HEK 및 CHO)의 일시적 형질주입에 의해 생산된 배양물로부터 온전한 단량체 IgG 대 더 적은 분자량 오염물의 양에서 차이를 검출할 수 있다. 이것은 일시적 배양물로부터 생산된 퍼센트 단량체 IgG의 정성적 평가를 허용한다. 일시적 배양물로부터 NR-CGE의 이러한 정성적 사용은 퍼센트 단량체 IgG의 존재를 위한 ZTS-361의 카파 불변 쇄의 c-말단에 다중 변형 및 결실의 검정을 허용한다(데이터는 나타나지 않음). 임의의 1개 이론에 의해 구속되기를 바라지 않지만, 고양잇과 카파 불변 쇄의 c-말단으로부터 잔기 QRE의 결실은 단량체 재조합 고양잇과 IgG의 생산에 가장 적합한 것처럼 보인다. c-말단에 다른 부가는 허용되는 것처럼 보인다. 일반적으로, 고양잇과 LC 카파 G 마이너스(서열번호 175)의 107 위치에 시스테인을 넘어서 부가된 1개 또는 2개 추가의 아미노산은 일시적 생산된 IgG로부터 퍼센트 단량체의 정성적 평가를 사용하여 용인되는 것처럼 보인다. 이들 동일 정성적 검정을 사용하여 아미노산이 최소 정전하 영향을 갖는다면 고유 QRE 아미노산 잔기 대신에 107 위치에 시스테인의 c-말단 단부에 연속적으로 부가된 3개 더 추가의 아미노산이 용인될 수 있는 것처럼 보인다. 고양잇과 LC 카파 G 마이너스(서열번호 175)의 107 위치에 시스테인의 다음에 추가의 아미노산의 수 및 화학적 특성이 카파 경쇄 불변과 상응하는 Ig 중쇄 불변 사이 쇄간 디설파이드 결합의 효율적 형성에 영향을 미칠 것이 본원에 주목된다. 이러한 영역에 변형 및/또는 결실이 안정한 재조합 세포주로부터 균일 온전한 IgG 생산의 유리한 효과를 가질 수 있음이 생각될 수 있다.
인간 및 마우스 카파 경쇄 c-말단 아미노산은 말단 시스테인이고, 그러므로 추가의 아미노산 잔기는 중쇄 불변과 디설파이드 결합의 형성 동안 외부 환경과 상호작용하는 데 이용불가능하다. 그러므로, 적어도 고양잇과 및 갯과 카파 경쇄 불변에서 이들 추가의 c-말단 잔기가 이들 항체 종의 적은 부유로 인해 자연에서 보통 관찰될 수 없지만, 실험실 셋팅에서 이들 종분화된 형태의 과잉생산에 고도로 연관성일 수 있는 이러한 디설파이드 결합의 형성에 제한을 나타내는 것이 본원에 가정된다. 그와 같은 제한은 재조합 항체가 안정한 세포주로부터 생산되는 경우 이전에 기재된 HHL, HH, HL, 및 L 종의 존재를 초래하는 카파 경쇄 및 중쇄 불변 쇄의 c-말단 사이 디설파이드 결합의 형성의 부족을 포함할 수 있다. 이들 더 적은 분자량 종은 균일한 약물 제품의 생산에서 바람직하지 않고 그들의 존재는 품질 및 안전성 관점으로부터 문제가 될 수 있다.
이러한 관찰에 덧붙여 도 15에서 각 아미노산 문자 아래에 나타나는 이러한 영역에서 아미노산 잔기를 인코딩하는 코돈이 있다. 포유동물에서 리보솜내에 종결 폴리펩타이드 번역을 신호하는 3개의 정지 코돈(TAA, TGA, 및 TAG)이 있다. 임의의 1개 특정 이론에 의해 구속되기를 바라지 않지만, c-말단 시스테인의 다음에(그리고 포함하는) 아미노산에 대하여 인코딩하는 대부분의 코돈이 정지 코돈에서 떨어진 1개의 뉴클레오타이드인 것이 관찰되었다(도 15, 코돈에서 밝은 회색 문자). 우리는 이들 다양한 뉴클레오타이드 위치에 체세포 돌연변이가 IgG 카파 항체의 올바른 쇄 짝짓기 및 효율적 발현을 허용하는 최적 면역글로불린 카파 불변 쇄 길이 및 아미노산 조성의 선택을 초래할 수 있다는 것을 본원에 가정한다. 말단 시스테인에 연속적인 c-말단에 실재할 수 있는 적당한 아미노산의 허용을 평가하는 경우 미묘한 차이는 간과될 수 없다. 돼지 경쇄에서 잔기 EA 또는 밍크 경쇄에서 Q의 부가가 쇄간 디설파이드의 형성 및 온전한 IgG 분자의 발현에 해로운 영향이 거의 내지 전혀 없을 수 있는 관찰이 본원에 주목된다. 이들 종은 카파 및 람다 경쇄의 동등한 사용을 보여주고 이들 부가의 허용가능성에 대하여 허용된 영역에서 기재된다. 비제한적으로, 갯과 및 고양잇과 c-말단 카파 경쇄 잔기에 관하여, c-말단 시스테인으로부터의 거리 및 아르기닌 및 (아스파르트산 및 글루탐산) 잔기의 충전된 성질은 이의 각각의 중쇄와 공유 디설파이드 결합을 효율적으로 및 올바르게 형성하기 위해 고양잇과 및 갯과 항체의 능력에서 상당한 영향을 갖는다고 믿어진다.
1.17. 고양잇과 중쇄 및 카파 경쇄 계면의 4차 구조적 관찰
도 16A는 ZTS-361에 동등한 중쇄 및 경쇄가 있는 고양잇과 IgG의 예상된 구조의 그림 표현이다(지지적 분석 데이터는 도시되지 않음). 쇄내 및 쇄간 디설파이드 결합의 위치는 단순화용 구조의 단 한쪽 아암에서 중쇄 시스테인(CYS15) 및 경쇄 시스테인(CYS107)을 강조하여 보여진다. CYS15, 묘사된 아미노산 잔기는 고양잇과 HC 대립유전자A wt(서열번호 171) 및 고양잇과 HC 대립유전자A 1(서열번호 173)의 15 위치이고, 묘사된 뉴클레오타이드 잔기 번호는 고양잇과 HC 대립유전자A wt(서열번호 172)의 잔기 번호 43-45 및 고양잇과 HC 대립유전자A 1(서열번호 174)의 43-45 각각이다. CYS107, 묘사된 아미노산 잔기는 고양잇과 LC 카파 G 마이너스(서열번호 175) 및 고양잇과 LC 카파 G 마이너스 QRE 마이너스(서열번호 186)의 107 위치이고, 묘사된 뉴클레오타이드 잔기 번호는 고양잇과 LC 카파 G 마이너스(서열번호 176)의 잔기 번호 319-321 및 고양잇과 LC 카파 G 마이너스 QRE 마이너스(서열번호 187)의 319-321이다. 이전에 언급된 바와 같이, 고양잇과 ZTS-361의 조성은 인간 IgG1과 기능적으로 동등하지만; 디설파이드 결합 패턴의 성질은 인간 IgG2의 것과 더욱 유사하다(데이터는 나타나지 않음). 도 16B는 MOE 소프트웨어(Chemical Computing Group, Montreal, QC, Canada)를 사용하여 명확성으로 CYS15 및 CYS107의 가까운 위치를 강조하는 ZTS-361의 2개 F(ab')2 아암을 나타내는 상동성 모델을 도시한다. 도 16C는 CYS107에 바로 다음인 카파 경쇄 불변 잔기 QRE에 의해 기여되는 국소 환경에 추가의 정전하의 기여를 도시한다. 이들 3개 아미노산으로부터 전하는 이러한 도에서 와이어 표면 쉘로서 표시된다. 상동성 모델은 알파 나선 같은 정돈된 2차 구조적 요소 및 정돈된 베타 시트에서 찾아진 것들보다 덜 정확한 랜덤 코일 구조로 구성된 영역을 나타낸다. 이것은, 하지만, IgG 불변 도메인의 이러한 영역이 보존된 IgG 구조와 이러한 영역의 정돈된 성질 및 풍부한 구조적 데이터에 의해 양호하게 정의되기 때문에 중쇄의 CYS15에 대한 고려는 덜하다. 마찬가지로, 경쇄의 CYS107은 수많은 항체 구조에서 분해되었고 중쇄의 CYS15에 대한 이의 접근은 인정될 수 있다. 말단 경쇄 시스테인 넘어 모델에서 잔기의 부가는 인접한 잔기의 기하학 및 국소 에너지 최소치의 계산에 기반하여 정의될 수 있을 뿐이다. ZTS-361의 고양잇과 카파 경쇄의 이러한 설명은 실험 설계용 가설을 생성하기 위해 작업 모델 생산에 최선의 노력을 나타낸다. 종합하면, 이들 결과는 고양잇과(및 아마 기타 종)의 카파 경쇄에서 말단 시스테인 넘어 추가의 아미노산 잔기가 항체의 잘못짝짓기 및 빈약한 생산을 아마 초래하는 중쇄와 효율적 짝짓기에 해롭다는 것을 제시한다.
1.18. 변형된 카파 불변 C-말단을 가진 고양이화된 항 IL-31 항체 ZTS-1505의 생성
ZTS-361을 이용한 동종 항체 제조의 일관된 생산의 잠재적 제한을 감안하면 생산된 퍼센트 단량체의 부족에 대한 해결책을 찾는 것이 필요하다고 생각되었다. 앞으로, 비제한적으로, 이러한 노력은, 고양잇과 IgG 중쇄 불변 영역 (서열번호 173; 고양잇과_HC_대립유전자A_1), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 174; 고양잇과_HC_대립유전자A_1)과 조합된 가변 영역 (서열번호 121; FEL_15H05_VH1), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 122; FEL_15H05_VH1)을 포함하는 중쇄인, ZTS-1505의 생성이었다. ZTS-1505에 대하여, 경쇄는 고양잇과 IgG 경쇄 불변 영역 (서열번호 186; 고양잇과_LC_카파_G_마이너스_QRE_마이너스), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 187; 고양잇과_LC_카파_G_마이너스_QRE_마이너스)와 조합된 가변 영역 (서열번호 135; FEL-15H05-VL1_FW2), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 136; FEL-15H05-VL1_FW2)를 포함한다. ZTS-1505는 카파 경쇄와 비효율적 짝짓기에서 비롯하는 더 적은 분자량 종을 가진 항체 생산의 바람직하지 않은 효과를 피하기 위한 노력에서 경쇄 카파 불변의 c-말단 최단부에 떨어져 3개 추가의 잔기 QRE의 제거를 제외하고, ZTS-361과 동일하다. 이들 잔기의 제거가 단량체 IgG 생산의 공정에 유익하다는 것이 구상된다. 하지만, 본 발명은 카파 경쇄에 대한 다른 변화가 실시되었고 일시적 발현에서 예비 실험 데이터에 기반하여 중성 또는 심지어 유익한 효과를 갖는 것처럼 보이기 때문에 카파 경쇄에서 이러한 1개의 변형에 반드시 제한되지 않는다(데이터는 도시되지 않음).
도 17a는 ZTS-1505에 사용되는 상이한 경쇄를 강조하는 항체 ZTS-361 및 ZTS-1505를 작제하는 데 사용되는 가변 및 불변 서열을 기재한다. ZTS-1505를 발현시키는 안정한 CHO 세포주의 창출은 본원의 섹션 1.9에서 기재된다. 항체 품질의 평가는 매우 흥미로워서 안정한 CHO 형질주입으로부터 개별 클론은 단량체 항체를 생산하는 그들의 능력에 대하여 조사되었다. 도 17b는 NR-CGE를 이용하여 이들 개별 클론의 정량적 평가용 결과를 도시한다. 23개의 개별 안정한 CHO 클론은 평가되었고 높은 수준의 일관성은 평균 90.3%로 생산된 퍼센트 단량체에서 관찰되었다. 이것은 ZTS-361의 개별 클론성 단리물로 생산된 평균 퍼센트 단량체로부터 4% 증가(도 14b) 및 안정한 풀로 관찰된 7.3% 증가(도 13A)를 나타낸다. 도 17c는 상이한 배양 조건 하에서 항체 ZTS-361 및 ZTS-1505를 발현시키는 개별 안정한 CHO 세포주의 직접 비교를 도시한다. 참고로, 도 12, 13 및 14에서 기재된 항체는 도 17c에서 배양 조건 A와 동등한 배양 조건에서 성장되었고 이들 조건은 본원의 섹션 1.9에서 기재된다. 양쪽 세포주는 14일 동안 성장되었고 퍼센트 생존력, 역가(항체 수율, g/L), 및 NR-CGE에 의한 퍼센트 단량체는 결정되었다. 퍼센트 생존력은 양쪽 세포주로 시험된 모든 조건에 걸쳐서 일관되었다. NR-CGE에 의한 퍼센트 단량체는 추가의 QRE 잔기가 부족한 ZTS-1505에서 카파 경쇄 불변이 고양잇과 중쇄 불변과 카파 경쇄 사이 쇄 회합에서 긍정적 효과를 가졌다는 것을 재차 나타내는 ZTS-361에 ZT-1505를 비교하는 퍼센트 단량체에서 일관된 4-5% 개선을 보여주었다. ZTS-361에 비교하여 생산된 ZTS-1505 항체의 양에서 개선은 더욱 더 놀라웠다. ZTS-1505는 야생형 카파 경쇄 불변을 보유하는 ZTS-361에 비교된 경우 안정한 CHO 세포로부터 항체의 생산에서, 평균으로, 3.5 배 개선을 생산하였다.
카파 경쇄 불변 변형이 ZTS-1505의 친화도 및 효력에 영향을 미치지 않았는지를 보장하기 위해, 갯과 및 고양잇과 세포에서 IL-31-매개된 pSTAT 신호전달의 억제 및 비아코어를 사용하여 비교 분석은 수행되었다. 아래 표 1은 표면 포착물로서 IL-31 단백질의 다중 종을 사용하여 비아코어 분석용 결과를 기재한다. 이들 결과는 갯과, 고양잇과, 및 말과 IL-31 단백질에 대한 거의 동일한 친화도가 야생형 고양잇과 카파 불변 c-말단을 갖는 ZTS-361에 비교된 경우 경쇄 카파 불변 변형을 보유하는 ZTS-1505에 대하여 관찰되었다는 것을 보여준다. 본원의 섹션 1.2에 기재된 고양잇과 15H05 및 고양잇과 11E12 돌연변이체에 ZTS-1505용 예상된 결합 표현형은 여기에 또한 기재된다. 카파 불변 쇄의 c-말단의 변형은 고양잇과 15H05 돌연변이체 단백질에 대한 ZTS-1505 결합의 부족 및, ZTS-361에 동등한, 고양잇과 11E12 돌연변이체에 대한 결합의 유지에 의해 증명된 바와 같이 에피토프에 대한 선택성을 변경시키지 않았다.
[표 1]
Figure pct00001
Figure pct00002
아래 표 2는 ZTS-361과 ZTS-1505를 비교하는 세포 효력 데이터를 나타낸다. ZTS-1505용 경쇄 카파 불변 변형은 비교가능한 IC50 값에 의해 표시된 바와 같이 갯과 DH82 및 고양잇과 FCWF-4 세포 각각에서 갯과 및 고양잇과 IL-31에 의해 유도된 세포 pSTAT 신호전달을 억제시키는 이 항체의 능력에 영향을 미치지 않았다.
[표 2]
Figure pct00003
종합하면 이들 결과는 고유 생식계열이 이들 추가의 잔기를 인코딩하는 그들 종으로부터 카파 경쇄의 c-말단 단부의 제거, 또는 변형이 이들 종을 위한 동종 재조합 항체의 생산에 유익하고 안정한 세포주로부터 생산된 항체의 양(예를 들면, 수율 개선)에 유익하다는 것을 제시한다. 게다가 그와 같은 변형은, 생산된 항체의 품질 및 수량을 향상시키면서, IL-31 표적 단백질에 대한 항체의 친화도 및 효력에 부정적 영향은 없다. 이들 인자가 다중 종에서 치료적 용도를 위하여 재조합 항체의 생산에 유익할 수 있다는 것이 본원에 주목된다.
1.19. 항 IL-31 mAb 1505를 이용한 NR CGE 결과의 확인 및 항 NGF 항체를 이용한 변형된 카파 불변 C-말단의 유용성에 대한 추가 증명
단백질 표적이 IL-31과 다른 상이한 항체에 퍼센트 단량체 IgG의 증가된 생산이 적용가능하였는지를 결정하는 것이 흥미로웠다. 이를 달성하기 위해, 안정한 CHO 세포주 풀의 추가의 세트는 고양잇과 베타-신경 성장 인자(NGF)(ZTS-768 및 ZTS-943)를 인식하는 고양이화된 항체를 이용하여 생성되었다. 항체 ZTS-768 중쇄용 서열은 고양잇과 IgG 중쇄 불변 영역 (서열번호 171; 고양잇과_HC_대립유전자A_wt), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 172; 고양잇과_HC_대립유전자A_wt)와 조합된 (서열번호 220; ZTS_768_VH), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 221; ZTS_768_VH)이다. 항체 ZTS-943 중쇄용 서열은 고양잇과 IgG 중쇄 불변 영역 (서열번호 171; 고양잇과_HC_대립유전자A_wt), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 172; 고양잇과_HC_대립유전자A_wt)와 조합된 (서열번호 224; ZTS_943_VH), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 225; ZTS_943_VH)이다. ZTS-768에 대하여 경쇄 가변은 (서열번호 222; ZTS_768_VL)이고, 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 223; ZTS_768_VL)이다. ZTS-768에 대하여, 이 경쇄 가변 영역은 고양잇과 IgG 경쇄 불변 영역 (서열번호 175; 고양잇과_LC_카파_G_마이너스), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 176; 고양잇과_LC_카파_G_마이너스)와 조합된다. ZTS-943에 대하여, 경쇄 가변 영역은 고양잇과 IgG 경쇄 불변 영역 (서열번호 186; 고양잇과_LC_카파_G_마이너스_QRE_마이너스), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 187; 고양잇과_LC_카파_G_마이너스_QRE_마이너스)와 조합된 (서열번호 226; ZTS_943_VL), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 227; ZTS_943_VL)이다. 항 IL-31 항체에 직접 비교를 위하여, ZTS-361 및 ZTS-1505의 안정한 풀은 또한 항 NGF 항체에 동일한 배양 및 정제 조건을 사용하여 생성되었다.
NR CGE는 상기 기재된 4개 항체의 생산 및 정제 이후 퍼센트 단량체 온전한 IgG 및 아종을 결정하는 데 사용되었다. 동일한 방법을 사용하여 생성되고 정제된 이들 항체의 비교로 뚜렷한 단백질 표적을 인식하는 구조적으로 다른 항체들 사이 변형된 카파 불변 C-말단 혼입의 유용성을 평가하는 것이 가능하였다. 도 18a는 ClustallW 소프트웨어를 사용하여 계산된 항 IL-31에 이들 항-고양잇과 NGF 항체의 가변 영역을 비교하는 퍼센트 동일성을 도시한다. 도 18b 및 18c는 박스로 윤곽이 그려진 CDR들이 있는 항-고양잇과 IL-31 및 NGF 항체 가변 중쇄 및 경쇄 각각의 정렬을 도시한다. 분명히 항-IL-31 및 -NGF 항체는, CDR로서 강조된 항원 결합 영역 내에서 특히, 전체 동일성의 부족으로 서로 뚜렷하다.
도 19는 변형된 카파 불변 C-말단이 있는 그리고 없는 항-고양잇과 IL-31 및 항-고양잇과 NGF 항체를 비교하는 NR CGE로부터 결과를 도시한다. 이전의 발견과 일치하여, 야생형 카파 경쇄(ZTS-361)를 함유하는 항 IL-31 항체는 HHL 아종의 우세한 8.71%가 있는 80.74% 단량체 IgG를 갖는 것으로 관찰되었다. 퍼센트 단량체에서 명백한 개선은 ZTS-1505(5.9% HHL이 있는 89.17% 단량체)를 생성하기 위해 3개 C-말단 잔기의 제거 이후 재차 관찰되었다. 야생형 카파 경쇄(ZTS-768)를 함유하는 항-고양잇과 NGF mAb로부터 정제된 IgG의 NR CGE 분석은 항 IL-31 ZTS-361과 비교하여 단리된 단량체 및 아종(12.33% HHL이 있는 80.81% 단량체)의 유사한 양을 초래하였다. 특히, 동일 패턴은 5.98% HHL인 우세한 아종이 있는 88.59% 단량체를 산출하는 항-고양잇과 NGF 항체로부터 C-말단 잔기의 제거 이후 관찰되었다.
이들 결과는 제거된 이들 잔기를 가진 IgG 대 카파 경쇄의 C-말단에서 야생형 아미노산 잔기(QRE)를 함유하는 고양잇과 IgG 단백질 사이 구조적 구별이 실재하는 것을 제안한다. 본원에 기재된 실험 결과는 이 카파 경쇄 변형의 사용이 아종 오염물의 감소된 양을 가진 단량체 고양잇과 IgG의 생산을 초래한다는 것을 뒷받침한다. 이것에 더하여, 본원에서 결과는 이러한 방법이 완전히 뚜렷한 표적을 인식하는 구조적으로 다른 항체에 적용한다는 것을 분명히 증명하고, 그러므로 이 변형은 카파 경쇄 불변 영역에서 추가의 C-말단 아미노산을 보유하는 다른 포유류 항체 뿐만 아니라 고양잇과 항체의 광범위한 종류에 적용가능할 것 같다. 임의의 1개 이론에 의해 구속되기를 바라지 않지만, 이 경쇄 변형은 단량체 IgG의 더 많은 양 및 잠재적으로 더 많은 전체 항체 수율을 초래하는 안정한 CHO 세포주로부터 유도된 생산 동안 면역글로불린 쇄 짝짓기의 더 높은 충실도를 초래하는 것처럼 보인다. 이들 속성들 모두는 상용 등급 항체 요법 제조의 관점으로부터 매우 바람직하다.
1.20. 고양잇과 IL-31에 대한 mAb 15H05 결합에 비교하여 말과 IL-31 단백질에서 동등한 영역에 결합하는 항-말과 IL-31 항체의 확인
본원에 기재된 마우스 15H05 혈통으로부터 항체를 사용하여 소양증의 고양잇과 모델에서 유망한 생체내 효능을 감안하면, IL-31 단백질의 말과 동원체에서 유사한 영역에 결합하는 신규 항체 기질을 확인하는 것이 바람직하였다. 이를 위하여, 마우스는 말과 IL-31에 결합하는 항체 확인의 목적으로 재조합 말과 IL-31(서열번호 165)로 면역화되었다.
면역화된 동물로부터 혈청 항체 역가는 이전에 기재된 바와 같이 ELISA를 사용하여 결정되었다. 단일 반응성 마우스로부터 공여체 비장세포는 융합에 사용되었고 하이브리도마 상청액은 ELISA에 의해 말과 IL-31 단백질에 결합하는 항체에 대하여 스크리닝되었다. 이것은 고양잇과 IL-31에서 항체 15H05의 결합 부위에 비교가능한 말과 IL-31 단백질에서 영역에 결합하는 2개 마우스 항체의 확인을 초래하였다. 본원의 섹션 1.10은 도 6b에서 고양잇과 IL-31의 상동성 모델에서 가까운 결합 부위의 실례로 항체 15H05의 결합 부위의 특성규명을 기재한다.
도 20은 ClustallW 소프트웨어를 사용하여 말과 IL-31(서열번호 165)과 고양잇과 IL-31 야생형(서열번호 157)의 정렬을 도시한다. 정렬 위의 화살표는 부위 2에서 고양잇과 IL-31에 대한 항체 15H05의 결합 영역 내에서 함유된 것으로 섹션 1.10에서 기재되는 잔기 P126 및 D128을 나타낸다(도 6b). 말과 IL-31 단백질에서 이 결합 부위를 공유하는 이들 2개의 항-말과 IL-31 항체는 04H07 및 06A09이다.
항-말과 IL-31 04H07 및 06A09는 동종 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해 그리고 가변 중쇄 및 경쇄의 서열분석을 위하여 추가로 서브클로닝되었다. 항체 04H07에 대하여 결정된 마우스 항 IL-31 가변 서열은 다음과 같다: 04H07 가변 중쇄 (서열번호 212; Mu_04H07_VH), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 213; Mu_04H07_VH), 04H07 가변 경쇄 (서열번호 214; Mu_04H07_VL), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 215; Mu_04H07_VL), 06A09 가변 중쇄 (서열번호 216; Mu_06A09_VH), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 217; Mu_06A09_VH), 06A09 가변 경쇄 (서열번호 218; Mu_06A09_VL), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 219; Mu_06A09_VL). 도 21은 ClustallW를 사용하여 마우스 항체 15H05에 비교된 04H07 및 06A09의 가변 중쇄(도 21a) 및 경쇄(도 21b)의 정렬을 도시한다. 비교로, 6개 CDR 각각의 위치는 박스로 윤곽이 그려진다. 항-말과 IL-31 항체 04H07 및 06A09는 공통 클론성 혈통으로부터 아마 출현하는 서로에 매우 유사하다. 항-고양잇과 IL-31 항체 15H05는 항-말과 IL-31 04H07 및 06A09에 비교된 CDRH3 및 CDRL1의 길이 그리고 CDR의 아미노산 서열에서 분명히 뚜렷하다. 고양잇과 IL-31에 대한 항체 15H05의 결합 부위가 말과 단백질에 비교된 경우 보존되는 것이 흥미롭다(도 20 화살표). 이들 결과는 구조적으로 뚜렷한 CDR이 2개의 IL-31 동원체에서 공통 에피토프 영역을 인식할 수 있다는 것을 추가로 예시한다.
1.21. 항 IL-31 항체 ZTS-1505에서 CDR의 알라닌 스캐닝
항원 인식을 책임지는 항체의 영역은 파라토프를 나타낸다. 파라토프는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 모두의 상보성 결정 영역(CDR)에서 아미노산의 조합에 의해 창출된다. 항체와 항원 사이 결합은 항원의 측쇄 또는 탄수화물 모이어티를 가진 CDR 잔기의 측쇄에 의해 종종 매개된다. 항체 인식에서 관여된 임계 측쇄 정의를 돕기 위해 알라닌 스캐닝 돌연변이유발은 중쇄 및 경쇄 둘 모두에서 각 CDR 잔기상에 수행되었다. 이들 돌연변이체는 그 다음 비아코어를 사용하여 고양잇과 IL-31을 결합시키는 능력에 대하여 개별적으로 시험되었고 FCWF-4 세포 기반 검정에서 IL-31-매개된 신호전달의 억제에 대하여 평가되었다.
모 mAb에 대한 알라닌 스캐닝 돌연변이체 mAb의 상대 친화도를 결정하기 위해 고양잇과 IL-31 코팅된 칩에 대한 결합 프로파일은 Biacore T200을 사용하여 100 nM에서 결정되었다. 모 mAb +/- 3 표준 편차의 4개 복제물의 평균 반응 유닛은 온- 및 오프-레이트 항체 결합 둘 모두를 포함하는 반응 유닛들의 역치를 정의하기 위한 파라미터를 생성하는 데 사용되었다(도 22). 이 역치 내에 해당된 각 돌연변이체에 대한 데이터 포인트의 백분율은 그 다음 "% 유사도 점수"를 정의하는 데 사용되었다(도 23). 항체 ZTS-1505내 각 중쇄 및 경쇄 CDR 위치에 알라닌의 치환에서 비롯하는 유사도 점수는 도 23 및 24 각각에서 도시된다.
세포 기반 검정에서 ZTS-1505 돌연변이체 항체의 상대 활성을 결정하기 위해 각 항체는 15 μg/mL로 Fcwf-4 세포에서 고양잇과-IL-31-매개된 STAT 인산화를 억제시키는 이의 능력에 대하여 평가되었다. STAT 인산화의 상대 억제는 모체에 비해 각 돌연변이체의 STAT 인산화의 % 억제를 평가함으로써 결정되었다. 중쇄 및 경쇄용 ZTS-1505의 각 CDR 위치에 알라닌의 치환으로부터의 결과는 도 23 및 24 각각에서 "모체에 대한 퍼센트 억제"로서 도시된다. 개별 알라닌 치환이 결합 친화도 및 세포 기반 활성에서 갖는 효과를 평가함으로써 각 CDR 아미노산 잔기의 측쇄는 항원 인식에서 이의 역할에 대하여 개별적으로 평가될 수 있다. 알라닌으로 변화될 수 있고 활성을 유지할 수 있는 CDR 잔기는 다양한 아미노산 치환이 가능할 것 같고 항원 인식에서 중요하지 않은 잔기를 나타낸다. 이들 데이터에 기반하여, 서열번호 1로부터 적어도 잔기 4(I); 서열번호 2로부터 잔기 1-3(NIN), 5-7(TSG), 9-11(TEN) 및 13(Q); 서열번호 3으로부터 잔기 4(K), 6(D) 및 13(V)은 중쇄 CDR 1, 2 및 3, 각각에서 항원 결합에 대하여 비-임계 잔기이다. 결합에 중요하지 않은 경쇄 잔기 CDR 잔기는 서열번호 4로부터 잔기 3-7(SQGIS), 서열번호 5로부터 잔기 3(S) 및 5(L), 및 CDRL1, 2 및 3, 각각으로부터 서열번호 6에서 잔기 4(Q), 5(T) 및 9(T)를 포함한다.
1.22. ZIL8 항체의 2개 고양이화된 버젼의 결합 친화도 및 세포 효력
본 실시예 섹션의 상기 섹션 1.6은 고양잇과 IL-31 일명 ZIL8을 인식하는 갯과 항체의 확인을 기재한다. 초기 스크리닝은 이러한 항체가 고양잇과 IL-31 단백질을 결합할 수 있다는 것을 드러냈지만, 이의 결합은 15H05 돌연변이에 의해 영향받는다. 그러므로, 고양이에서 치료제로서 사용하기 위하여 이러한 항체의 고양이화된 형태를 추구하는 것이 흥미로웠다. 이를 위하여, 고양이화 전략은 본원의 섹션 1.8에서 이전에 기재된 바와 같이 뒤따랐다. 적당한 고양잇과 프레임워크에 ZIL8 CDRS의 그라프팅은 항체 ZTS-5864 및 ZTS-5865를 산출하였다. 항체 ZTS-5864 중쇄용 서열은 고양잇과 IgG 중쇄 불변 영역 (서열번호 173; 고양잇과_HC_대립유전자A_1), 이의 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 174; 고양잇과_HC_대립유전자A_1)과 조합된 (서열번호 228; ZTS_5864_VH), 이의 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 229; ZTS_5864_VH)이다. ZTS-5864에 대하여 경쇄 가변은 (서열번호 230; ZTS_5864_VL), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 231; ZTS_5864_VL)이다. ZTS-5864에 대하여, 이 경쇄 가변 영역은 고양잇과 IgG 경쇄 불변 영역 (서열번호 236; 고양잇과_LC_람다), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 237; 고양잇과_LC_람다)와 조합된다. 항체 ZTS-5865 중쇄용 서열은 고양잇과 IgG 중쇄 불변 영역 (서열번호 173; 고양잇과_HC_대립유전자A_1), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 174; 고양잇과_HC_대립유전자A_1)과 조합된 (서열번호 232; ZTS_5865_VH), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 233; ZTS_5865_VH)이다. ZTS-5865에 대하여 경쇄 가변은 (서열번호 234; ZTS_5865_VL), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 235; ZTS_5865_VL)이다. ZTS-5865에 대하여, 이러한 경쇄 가변 영역은 고양잇과 IgG 경쇄 불변 영역 (서열번호 236; 고양잇과_LC_람다), 이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 237; 고양잇과_LC_람다)이다.
도 25a 및 25b는 2개의 고양이화된 항체 ZTS-5864 및 ZTS-5865의 이러한 친화도 및 세포 효력을 도시한다. 양쪽 항체는 ZTS-5864에 비교된 경우 친화도(KD (M))에서 약 4 배 증가를 갖는 ZTS-5864로 고양잇과 IL-31에 대한 고 친화도를 갖는다. 세포 효력은 FCFW4 세포에서 pSTAT3 신호전달을 자극하기 위해 고양잇과 IL-31을 사용하여 평가되었다. IC50 값은 본원에서 이전에 기재된 바와 같이 각 항체에 대하여 계산되었다. ZTS-5864는 ZTS-5865의 것에 이의 IC50 값을 비교하는 경우 약 3 배 더 강력하다. 양쪽 항체가 15H05 혈통으로부터 본원에서 이전에 기재된 그들 항체의 범위에서 IC50으로 강력하다고 간주되는 것은 주목할 가치가 있다(도 3). 고양잇과 FCFW4 세포로부터 pSTAT3 신호전달을 사용하는 이들 효력의 관련성은 소양증의 고양잇과 모델에서 키메라 및 고양이화된 항체를 사용하여 긍정적 생체내 효능 결과로 이전에 정성화되었다(도 9 및 도 10).
1.23. 고양이 소양증 도전 모델에서 고양이화된 ZTS-5864 항 IL-31 항체의 효능의 생체내 평가
ZTS-5864의 생체내 효능은 본 실시예 섹션의 섹션 1.14에서 이전에 기재된 바와 같이 유도된 소양증의 고양잇과 IL-31 모델에서 평가되었다. 도 26은 본 연구로부터 결과를 도시한다. 사전용량(-7 일째)은 T01 및 T02 그룹에서의 동물이 투약에 앞서 IL-31 도전에 대한 동등한 소양성 반응을 갖는다는 것을 나타낸다. 56 일 끝까지 연구의 과정 동안 T01 소양성 반응에서 매우 적은 변화는 관찰되었다. 대조적으로 0 일째에 피하로 주어진 ZTS-5864(3.0 mg/mg)는 56 일째까지 연구의 전체 과정 전반에 걸쳐 IL-31 도전의 소양성 효과를 약화시켰다(도 26, T02). 56 일째에 T02에 대하여 평균 소양성 점수에서 계속된 감소는 항체가 이 시점 넘어서 효능을 아마 유지할 것을 나타낸다. 이들 결과는 본원에서 항-고양잇과 IL-31 항체의 선택에 사용되는 강력한 기준을 강조한다. 이들 결과는 고양이에서 IL-31-매개된 장애의 치료를 위한 치료제로서 이들 종분화된 항체의 위치화를 추가로 뒷받침한다.
SEQUENCE LISTING <110> Zoetis Services LLC <120> INTERLEUKIN-31 MONOCLONAL ANTIBODIES FOR VETERINARY USE <130> ZP000226A <140> PCT/US2019/014885 <141> 2019-01-24 <150> US 62/643,940 <151> 2018-03-16 <160> 237 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Ser Tyr Thr Ile His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Asn Ile Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Thr Glu Asn Asn Gln Arg Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Trp Gly Phe Lys Tyr Asp Gly Glu Trp Ser Phe Asp Val 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ile Trp Leu Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Lys Ala Ser Asn Leu His Ile 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Leu Gln Ser Gln Thr Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Tyr Tyr Asp Ile Asn 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly 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Mus musculus <400> 72 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgaa ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagttg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcaaa tactatgata taaactgggt gaggcagagg 120 cctgaacagg gacttgagtg gattggatgg atttttcctg gagatggtgg tactaagtac 180 aatgagacgt tcaagggcaa ggccacactg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcaggctgac atctgaggac tctgctgtct atttctgtgc aagagggggg 300 acttcggtga taagggatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 73 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 73 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Glu Thr Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu 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Ala Ala Phe Trp Thr Asp Asn Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 76 <211> 372 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 76 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgtgg cttctggatt caccttcagt agttatggca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctgcagtg ggtcgcacac attaacagtg gtggaagtag cacatactac 180 gcagacgctg tgaagggacg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctctat 240 ctgcagatga acagcctgag agctgaggac acggccgtct attactgtgt ggaggtttac 300 actacgttag ctgcattctg gacagacaat tttgactact ggggccaggg aaccctggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 77 <211> 110 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 77 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Thr Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Asn Asn Ile Gly Ile Leu 20 25 30 Ala Ala Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu 35 40 45 Val Tyr Ser Asp Gly Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ser Ala Thr Leu Thr 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Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Phe Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Phe Pro Gly Ser Phe Glu His Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 80 <211> 351 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 80 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctgcagggtc cctgagactg 60 tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt gactatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 cctgggaggg gactgcagtg ggtcgcaggt attgacagtg ttggaagtgg cacaagctac 180 gcagacgctg tgaagggccg attcacaatc tccagagacg acgccaagaa cacactgtat 240 ctgcagatgt tcaacctgag agccgaggac acggccatat attactgtgc gagcgggttc 300 cctgggtcct ttgagcactg gggccagggc accctggtca ccgtctcctc a 351 <210> 81 <211> 104 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 81 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Gly 20 25 30 Tyr Val Gly Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Gly Pro Arg Thr Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asn Ser Asp 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Leu Ser Asn Tyr Tyr Ala 20 25 30 Gln Trp Phe Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr His Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Arg Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Ser Ala Val Ser Ser Asp Thr Ile 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr 100 <210> 90 <211> 321 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 90 tccagtgtgc tgactcagcc tccctcggta tcagtgtctc tggggcagac agcaaccatc 60 tcctgctctg gagagagtct gagtaactat tatgcacaat ggttccagca gaaggcaggc 120 caagcccctg tgttggtcat atataaggac actgagcggc cctctgggat ccctgaccga 180 ttctctggct ccagttcagg gaacacacac accctgacca tcagcggggc tcgggccgag 240 gacgaggctg actattactg tgagtcagca gtcagttctg atactattgt gttcggcgga 300 ggcacccacc tgaccgtcct c 321 <210> 91 <211> 124 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 91 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Ala Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 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attactgtgc gagatgggac 300 ggtagttctt ttgactattg gggccagggc accctggtca ccgtctcctc a 351 <210> 101 <211> 112 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 101 Asp Ile Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Ala Ser Phe Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Phe Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Pro Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Gly Val Glu Ala Asp Asp Ala Gly Leu Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Ile His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 102 <211> 336 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 102 gatattgtcg tgacacagac cccgctgtcc ctgtccgtca gccctggaga gactgcctcc 60 ttctcctgca aggccagtca gagcctcctg cacagtgatg gaaacacgta tttggattgg 120 ttccgacaga agccaggcca gtctccacag cgtttgatct acaaggtctc caacagagac 180 cctggggtcc cagacaggtt cagtggcagc gggtcaggga cagatttcac cctgagaatc 240 agcggagtgg aggctgacga tgctggactt tattactgca tgcaagcaat acactttcct 300 ctgacgttcg gagcaggaac caaggtggag ctcaaa 336 <210> 103 <211> 119 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 103 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Ala Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Asn Ser Glu Gly Ser Arg Thr Ala Tyr Ala Asp Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Gly Asp Ile Val Ala Thr Gly Thr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 104 <211> 357 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 104 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctgcagggtc cctgagactg 60 tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt agttatgtca tgacctgggt ccgccaggct 120 cctgggaagg gactgcagtg ggtcgcaggc attaatagtg aggggagtag gacagcctac 180 gcagacgctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa tacactttat 240 ctacaaatag acagcctgag agccgaggac acggccatat attactgtgc gacaggcgat 300 atagtagcga ctggtacttc gtattggggc cagggcaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 105 <211> 107 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 105 Ser Asn Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Thr Ile Ser Cys Ser Gly Glu Thr Leu Asn Arg Phe Tyr Thr 20 25 30 Gln Trp Phe Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Ile His Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Arg Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Ala Tyr Tyr Cys Lys Ser Ala Val Ser Ile Asp Val Gly 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Phe 100 105 <210> 106 <211> 321 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 106 tccaatgtac tgactcagcc tccctcggta tcagtgtctc tgggacagac agcaaccatc 60 tcctgctctg gagagactct gaatagattt tatacacaat ggttccagca gaaggcaggc 120 caagcccctg tgttggtcat atataaggac actgagcggc cctctgggat ccctgaccga 180 ttctccggct ccagttcagg gaacatacac accctgacca tcagcggggc tcgggccgag 240 gacgaggctg cctattactg caagtcagca gtcagtattg atgttggtgt gttcggcgga 300 ggcacccacc tgaccgtctt c 321 <210> 107 <211> 117 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 107 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Ala Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Val Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Asn Gly Gly Gly Ser Ser Pro Thr Tyr Ala Asp Ala Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Ser Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Val Ser Met Val Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 108 <211> 351 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 108 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgaagc ctgcagggtc cctgagactg 60 tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagg acctatgtca tgaactgggt ccgccaggct 120 cctgggaagg ggctgcaatg ggtcgcaagt attaacggtg gtggaagtag cccaacctac 180 gcagacgctg tgaggggccg attcaccgtc tccagggaca acgcccagaa ctcactgttt 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acagccatat atttttgtgt cgtgtcgatg 300 gttgggccct tcgactactg gggccatggg accctggtca ccgtgtcctc a 351 <210> 109 <211> 107 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 109 Ser Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Thr Ile Ser Cys Ser Gly Lys Ser Leu Ser Tyr Tyr Tyr Ala 20 25 30 Gln Trp Phe Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr His Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Arg Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Ser Ala Val Ser Ser Asp Thr Ile 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 110 <211> 321 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 110 tccagtgtgc tgactcagcc tccctcggta tcagtgtctc tggggcagac agcaaccatc 60 tcctgctctg gaaagagtct gagttactat tatgcacaat ggttccagca gaaggcaggc 120 caagcccctg tgttggtcat atataaggac actgagcggc cctctgggat ccctgaccga 180 ttctctggct ccagttcagg gaacacacac accctgacca tcagcggggc tcgggccgag 240 gacgaggctg actattactg tgagtcagca gtcagttctg atactattgt gttcggcgga 300 ggcacccacc tgaccgtcct c 321 <210> 111 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable heavy mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 111 Gln Val Leu Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Phe Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Tyr Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Thr Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Leu Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Thr Ser Val Ile Arg Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 112 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding felinized variable heavy mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 112 caggtgctgc tggtccagtc aggagcagag gtaaaaaagc ccggggcgag tgtcaagatt 60 ttctgtaagg cctccggata ctcttttacg tattacgata ttaactggct tcgccaggcc 120 cctgagcagg ggctcgaatg gatgggttgg atattccccg gagatggggg aaccaagtac 180 aacgaaacct tcaaggggag gctgaccctg actgcagata ccagcacgaa cacagtgtat 240 atggagttgt cctcactgcg atctgctgat actgccatgt actactgcgc tcgcggcggc 300 acttcagtta tcagggatgc catggactat tgggggcagg gcgcactcgt cactgtctcg 360 agc 363 <210> 113 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 113 Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr 100 105 <210> 114 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 114 gaaatccaga tgacacaatc tcccagctcc ctcagcgcat ctcctggcga cagggtaacc 60 atcacctgcc gcgccagcga gtcagtagac aactatggca tatccttcat gcactggtat 120 caacaaaagc ccgggaaagt ccccaaactg ttgatttaca gagcaagcaa tctcgagtca 180 ggagtcccat ctcgcttctc tggttccggt tccggaaccg acttcactct gacaatttct 240 tctctggagc ccgaggatgc cgctacatat tactgtcagc aaagcaataa agatccactg 300 accttcggac agggtaccaa gctggagatc aaa 333 <210> 115 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 115 Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Ser Ala Phe Leu Ser Arg Thr Leu Lys 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Val Lys Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ala Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Pro Glu Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr 100 105 <210> 116 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 116 gaggtggtgc tgactcagag tagcgcgttt ctgtctcgga ccctgaaaga gaaagctacc 60 atcacgtgca gggcaagcga gagcgtggac aactatggta tcagcttcat gcattggtat 120 cagcagaaac ctaatcaggc gcctaagctg ctcgtgaaaa gagcctccaa ccttgagagc 180 ggcgcaccat caaggttttc aggaagtggc agcgggacag acttcaccct tacaatctct 240 agtccagagc cggaggacgc agctacctac tattgccagc aatccaataa agacccgttg 300 acattcggcc aaggtacc 318 <210> 117 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 117 Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr 100 105 <210> 118 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 118 gagatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgagtgcta gcccggggga tcgagtgact 60 ataacatgtc gggccagtga atcagtggac aactatggaa tcagttttat gcactggtat 120 cagcagaagc ccggccagcc accgaagctg ttgatttatc gcgcaagcaa tctggagtca 180 ggagtgccct ctagattttc tgggagcggt tctggcacag atttcacact cacaatatca 240 tccttggaac cggaagacgc agccacatac tattgccagc agagtaacaa ggaccctttg 300 acttttggcc agggtacc 318 <210> 119 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 119 Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Val Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr 100 105 <210> 120 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 120 gagatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgagtgcta gcccggggga tcgagtgact 60 ataacatgtc gggccagtga atcagtggac aactatggaa tcagttttat gcactggtat 120 cagcagaagc ccggccaggt cccgaagctg ttgatttatc gcgcaagcaa tctggagtca 180 ggagtgccct ctagattttc tgggagcggt tctggcacag atttcacact cacaatatca 240 tccttggaac cggaagacgc agccacatac tattgccagc agagtaacaa ggaccctttg 300 acttttggcc agggtacc 318 <210> 121 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable heavy mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 121 Gln Val Leu Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Thr Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Phe Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Ala Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Thr Glu Asn Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Leu Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gly Phe Lys Tyr Asp Gly Glu Trp Ser Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 122 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding felinized variable heavy mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 122 caagtgcttc tggtgcaaag cggggcggaa gttaggaccc caggagcctc agtaaaaatt 60 ttttgtaagg catccggcta cagtttcacc agctacacta ttcactggct gaggcaggcc 120 ccggcccaag ggctggagtg gatgggaaat atcaatccca cgtctggcta tacagagaat 180 aaccaaaggt ttaaggatag gctgactctg acagctgaca catcaaccaa tacggcatac 240 atggagctct cctctctccg gagtgccgac accgccatgt actactgtgc tcggtggggg 300 tttaaatacg atggcgagtg gagcttcgac gtgtggggcg cgggcacaac cgtgaccgtc 360 tcgagc 366 <210> 123 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable heavy mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 123 Gln Val Leu Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Thr Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Phe Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Gly Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ser Pro Ala Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Thr Glu Asn Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Leu Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gly Phe Lys Tyr Asp Gly Glu Trp Ser Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 124 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding felinized variable heavy mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 124 caggtgctgc tcgtgcagag cggagccgaa gtgaggacac ccggtgcgag tgtaaaaatt 60 ttttgcaagg caagcggcta cgggtttaca tcctatacca tccactgggt gaggcagtcc 120 ccagcgcagg gacttgaatg gatgggaaat attaatccaa caagcgggta tactgaaaac 180 aaccaaagat ttaaggacag actgacactc accgcagata catctacaaa tacagcctac 240 atggagttgt cttccctgcg gagtgccgac acggctatgt actactgtgc tcggtggggg 300 tttaagtatg atggcgaatg gtccttcgac gtctggggag ctggaaccac cgtgaccgtc 360 tcgagc 366 <210> 125 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable heavy mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 125 Gln Val Leu Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Phe Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Thr Glu Asn Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Leu Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gly Phe Lys Tyr Asp Gly Glu Trp Ser Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 126 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding felinized variable heavy mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 126 caggtcctct tggttcaaag cggagccgaa gtccgaaaac cgggtgcctc agtgaaaatc 60 ttctgtaagg cctccggcta tagtttcacg agttacacaa tccactggct gcgacaggca 120 ccagagcagg gactggagtg gatgggaaat ataaatccga cgtctgggta cacagaaaac 180 aaccagagat tcaaggatag attgacactg accgcggata ctagtacaaa tacggcttac 240 atggaactgt cctcactccg gtcagccgac accgccatgt attactgtgc tcgctggggg 300 ttcaagtatg atggagagtg gagcttcgac gtatggggag ccggaaccac tgtgaccgtc 360 tcgagc 366 <210> 127 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 127 Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ile Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gln Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 128 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 128 gaaattcaga tgactcaatc accttcatct ttgagtgcat cacccggaga tagagttaca 60 atcacctgca gggcgagtca agggatctcc atatggttgt catggtatca gcagaaaccc 120 ggaaaggtcc cgaaactctt gatctacaag gcctctaacc tgcacattgg cgtgccaagc 180 cgattcagcg ggagcggaag tggcaccgac tttactctga cgatcagttc actggagccc 240 gaggacgctg caacatacta ttgtctgcaa tctcagacct accctctcac ctttggagga 300 ggtaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 129 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 129 Glu Ile Thr Met Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Gly Ser Pro Gly 1 5 10 15 Gln Gln Val Thr Met Asn Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ile Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln His Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Ser Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gln Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 130 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 130 gaaattacca tgacacaaag ccccggctcc ctggccggct cccccggaca gcaagtgacc 60 atgaattgtc gggccagcca gggaatttct atatggctct cttggtatca gcaaaaaccc 120 ggacagcacc ctaaacttct gatctacaaa gcaagtaact tgcacatcgg cgtccctgat 180 cgattcagtg gctcaggttc cggtacagat tttactctta ccatcagcaa tctgcaggct 240 gaggatgtgg caagctatta ctgtctccaa agtcagactt accctctgac atttgggggc 300 ggtaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 131 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 131 Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Ser Ala 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tgggagatca aa 322 <210> 133 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 133 Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Thr Ile Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ile Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gln Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 134 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 134 gacattcaga tgaatcagtc tcctagctca ctgtcagcca gccttggaga caccattaca 60 gtcacttgca gggcgagtca agggatctcc atatggttgt catggtatca gcagaaaccc 120 ggaaaggtcc cgaaactctt gatctacaag gcctctaacc tgcacattgg cgtgccaagc 180 cgattcagcg ggagcggaag tggcaccgac tttactctga cgatcagttc actggagccc 240 gaggacgctg caacatacta ttgtctgcaa tctcagacct accctctcac ctttggagga 300 ggtaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 135 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 135 Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ile Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Asn Lys Ala Ser Asn Leu His Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gln Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 136 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 136 gaaattcaga tgactcaatc accttcatct ttgagtgcat cacccggaga tagagttaca 60 atcacctgca gggcgagtca agggatctcc atatggttgt catggtatca gcagaaaccg 120 ggcaatatcc caaaggtgct gattaacaag gcctctaacc tgcacattgg cgtgccaagc 180 cgattcagcg ggagcggaag tggcaccgac tttactctga cgatcagttc actggagccc 240 gaggacgctg caacatacta ttgtctgcaa tctcagacct accctctcac ctttggagga 300 ggtaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 137 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 137 Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ile Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Ile Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gln Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 138 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 138 gaaattcaga tgactcaatc accttcatct ttgagtgcat cacccggaga tagagttaca 60 atcacctgca gggcgagtca agggatctcc atatggttgt catggtatca gcagaaaccc 120 ggaaaggtcc cgaaactctt gatctacaag gcctctaacc tgcacattgg ggtcccccca 180 aggttcagcg gatctggatc cgggacccac tttactctga ccataacaag cctgcagcct 240 gaagacattg ctacctatta ctgcctgcaa tctcagacct accctctcac ctttggagga 300 ggtaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 139 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 139 Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Thr Ile Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ile Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Val Leu Ile 35 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gcagaaaccg 120 ggcaatatcc caaaggtgct gattaacaag gcctctaacc tgcacattgg ggtcccccca 180 aggttcagcg gatctggatc cgggacccac tttactctga ccataacaag cctgcagcct 240 gaagacattg ctacctatta ctgcctgcaa tctcagacct accctctcac ctttggagga 300 ggtaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 145 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 145 Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ile Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gln Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 146 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 146 gaaatccaga tgacacagtc ccccagtagc ctttccgctt caccgggcga tagagtcact 60 attacgtgca gggcctccca gggtatttct atctggctga gctggtatca gcagaagccc 120 ggtaatgtgc caaagctctt gatctacaag gcatctaacc ttcatatcgg agtgccctca 180 agatttagtg ggtcaggcag cggaaccgat ttcacattga ccattagttc tctggaacca 240 gaggacgctg ccacttacta ctgcctgcag tcccaaacat accctttgac ttttgggggg 300 ggtaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 147 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 147 Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ile Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ile Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr 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catus <400> 151 Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ile Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Asn Lys Ala Ser Asn Leu His Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gln Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 152 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 152 gagatccaga tgacgcagag ccctagcagc ctctctgcat ccccaggaga cagagtaaca 60 attacctgtc gcgccagcca gggaatatct atatggctgt catggtatca acagaaaccg 120 ggaaaggttc caaagctctt gatcaataag gctagcaatc tgcatattgg agtgccctcc 180 cgcttctctg gtagcggaag tggcacagat ttcaccctga ccattagtag tctggagcct 240 gaggatgcgg ccacctacta 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to human IgG1 Fc <400> 167 Met Ala Leu Phe Ser Ala Phe Gln Thr Thr Phe Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Thr Tyr Gln Ser Glu Val Leu Ser Glu Pro Leu Ser Leu 20 25 30 Ala Pro Glu Ser Leu Glu Val Ser Ile Asp Ser Ala Arg Gln Cys Leu 35 40 45 His Leu Lys Trp Ser Val His Asn Leu Ala Tyr His Gln Glu Leu Lys 50 55 60 Met Val Phe Gln Ile Glu Ile Ser Arg Ile Lys Thr Ser Asn Val Ile 65 70 75 80 Trp Val Glu Asn Tyr Ser Thr Thr Val Lys Arg Asn Gln Val Leu Arg 85 90 95 Trp Ser Trp Glu Ser Lys Leu Pro Leu Glu Cys Ala Lys His Ser Val 100 105 110 Arg Met Arg Gly Ala Val Asp Asp Ala Gln Val Pro Glu Leu Arg Phe 115 120 125 Trp Ser Asn Trp Thr Ser Trp Glu Glu Val Asp Val Gln Ser Ser Leu 130 135 140 Gly His Asp Pro Leu Phe Val Phe Pro Lys Asp Lys Leu Val Glu Glu 145 150 155 160 Gly Ser Asn Val Thr Ile Cys Tyr Val Ser Arg Ser His Gln Asn Asn 165 170 175 Ile Ser Cys Tyr Leu Glu Gly Val Arg Met His Gly Glu Gln Leu Asp 180 185 190 Pro Asn Val Cys Val Phe His Leu Lys Asn Val Pro Phe Ile Arg Glu 195 200 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<213> Felis catus <400> 171 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 1 5 10 15 Thr Thr Ser Gly Ala Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Leu Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ala Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Leu Ser Asp Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Arg Lys Thr Asp His Pro Pro Gly Pro Lys Pro Cys Asp Cys 100 105 110 Pro Lys Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile 115 120 125 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu 130 135 140 Val Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln 145 150 155 160 Ile Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser 165 170 175 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 180 185 190 Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys 195 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modifications to modulate antibody effector function <400> 173 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 1 5 10 15 Thr Thr Ser Gly Ala Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Leu Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ala Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Leu Ser Asp Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Arg Lys Thr Asp His Pro Pro Gly Pro Lys Pro Cys Asp Cys 100 105 110 Pro Lys Cys Pro Pro Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Ile Phe Ile 115 120 125 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu 130 135 140 Val Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln 145 150 155 160 Ile Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser 165 170 175 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 180 185 190 Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys 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atccctcacc cagtctccgg gtaaa 1005 <210> 175 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of feline Kappa light chain engineered with glycosylation knockout (G-) at position 103 <400> 175 Arg Ser Asp Ala Gln Pro Ser Val Phe Leu Phe Gln Pro Ser Leu Asp 1 5 10 15 Glu Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Ile Val Cys Ile Leu Asn Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Lys Glu Val Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Val Gln 35 40 45 Asn Lys Gly Ile Gln Glu Ser Thr Thr Glu Gln Asn Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Gln 65 70 75 80 Ser His Glu Lys Phe Ser Cys Glu Val Thr His Lys Ser Leu Ala Ser 85 90 95 Thr Leu Val Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys Gln Arg Glu 100 105 110 <210> 176 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding feline Kappa light chain engineered with glyosylation knockout (G-) <400> 176 cggagtgatg ctcagccatc tgtctttctc ttccaaccat ctctggacga gttacataca 60 ggaagtgcct ctatcgtgtg catattgaat gacttctacc ccaaagaggt caatgtcaag 120 tggaaagtgg atggcgtagt ccaaaacaaa ggcatccagg agagcaccac agagcagaac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacga tgtccagtac ggagtaccaa 240 agtcatgaaa agttctcctg cgaggtcact cacaagagcc tggcctccac cctcgtcaag 300 agcttccaga ggagcgagtg tcagagagag 330 <210> 177 <211> 335 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 177 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys 100 105 110 Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile 115 120 125 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala 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familiaris <400> 178 gcctcaacaa ctgctcctag cgtgtttccc ctggccccta gctgcggaag tacctcaggc 60 agcacagtgg ccctggcttg tctggtgtct ggatatttcc ctgagccagt gaccgtgagt 120 tggaacagcg gctctctgac ctccggggtg cacacatttc catctgtgct gcagtctagt 180 ggcctgtact ccctgtcaag catggtgact gtgccttcct ctaggtggcc atcagaaact 240 ttcacctgca acgtggccca tcccgccagc aagaccaaag tggacaagcc cgtgcctaaa 300 agggagaatg gaagggtgcc aagaccacct gattgcccta agtgtccagc tccagaagcg 360 gcgggagcac caagcgtgtt catctttcca cccaagccca aagacacact gctgattgct 420 agaactcccg aggtgacctg cgtggtggtg gacctggatc cagaggaccc cgaagtgcag 480 atctcctggt tcgtggatgg gaagcagatg cagacagcca aaactcagcc tcgggaggaa 540 cagtttaacg gaacctatag agtggtgtct gtgctgccaa ttggacacca ggactggctg 600 aagggcaaac agtttacatg caaggtgaac aacaaggccc tgcctagtcc aatcgagagg 660 actatttcaa aagctagggg acaggctcat cagccttccg tgtatgtgct gcctccatcc 720 cgggaggaac tgtctaagaa cacagtgagt ctgacttgtc tgatcaaaga tttctttccc 780 cctgacattg atgtggagtg gcagagcaat gggcagcagg agccagaatc caagtacaga 840 accacaccac cccagctgga cgaagatggc tcctatttcc tgtacagtaa gctgtcagtg 900 gacaaatcta ggtggcagcg cggggatacc tttatctgcg ccgtgatgca cgaggctctg 960 cacaatcatt acacacaaga aagtctgtca catagccccg gcaag 1005 <210> 179 <211> 106 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 179 Arg Asn Asp Ala Gln Pro Ala Val Tyr Leu Phe Gln Pro Ser Pro Asp 1 5 10 15 Gln Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Ser Phe 20 25 30 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Ile Gln 35 40 45 Asp Thr Gly Ile Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Leu Ser 65 70 75 80 His Glu Leu Tyr Ser Cys Glu Ile Thr His Lys Ser Leu Pro Ser Thr 85 90 95 Leu Ile Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys 100 105 <210> 180 <211> 318 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 180 aggaacgacg cccagcctgc tgtgtatctg tttcagccct cccctgatca gctgcacact 60 ggctctgcta gtgtggtgtg tctgctgaac agcttctacc caaaggatat caatgtgaag 120 tggaaagtgg acggcgtgat ccaggatact gggattcagg agtccgtgac cgaacaggac 180 aaagattcaa catatagcct gagctccact ctgaccatgt ctagtaccga gtacctgagc 240 cacgaactgt attcctgcga gatcactcat aagtccctgc cctctaccct gatcaagagc 300 ttccagagat cagagtgt 318 <210> 181 <211> 164 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 181 Met Ala Ser His Ser Gly Pro Ser Thr Ser Val Leu Phe Leu Phe Cys 1 5 10 15 Cys Leu Gly Gly Trp Leu Ala Ser His Thr Leu Pro Val Arg Leu Leu 20 25 30 Arg Pro Ser Asp Asp Val Gln Lys Ile Val Glu Glu Leu Gln Ser Leu 35 40 45 Ser Lys Met Leu Leu Lys Asp Val Glu Glu Glu Lys Gly Val Leu Val 50 55 60 Ser Gln Asn Tyr Thr Leu Pro Cys Leu Ser Pro Asp Ala Gln Pro Pro 65 70 75 80 Asn Asn Ile His Ser Pro Ala Ile Arg Ala Tyr Leu Lys Thr Ile Arg 85 90 95 Gln Leu Asp Asn Lys Ser Val Ile Asp Glu Ile Ile Glu His Leu Asp 100 105 110 Lys Leu Ile Phe Gln Asp Ala Pro Glu Thr Asn Ile Ser Val Pro Thr 115 120 125 Asp Thr His Glu Cys Lys Arg Phe Ile Leu Thr Ile Ser Gln Gln Phe 130 135 140 Ser Glu Cys Met Asp Leu Ala Leu Lys Ser Leu Thr Ser Gly Ala Gln 145 150 155 160 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cagcagaagc ccggccagag cccccagcgg ctgatctaca gagccagcaa cctggaaagc 180 ggcgtgcccg atcggtttag cggctctggc agcggcaccg acttcaccct gcggatctct 240 cgggtggaag ccgatgacgc cggagtgtac tactgccagc agagcaacaa ggaccccctg 300 acctttggcg ccggtaccaa gctggagatc aag 333 <210> 184 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized variable light chain mAb sequence from Mus musculus and Canis <400> 184 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser 65 70 75 80 Arg Val Glu Ala Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 185 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding caninized variable light chain mAb sequence from Mus musculus and Canis <400> 185 gatatagtga tgacacaaac tcctctcagt ctttccgtat caccgggaga accggcttcc 60 atttcctgtc gggcctcaga gtctgtggac aactacggga tatccttcat gcactggtat 120 cagcagaaac ccggccagcc ccctaaactc cttatttaca gggccagtaa tctggaaagc 180 ggtgtgcccg atcgatttag cggttccggg agcggcacag atttcaccct gcgaatctct 240 agagttgaag cggatgatgc aggagtatat tactgccagc aatccaataa ggatcccctt 300 acattcggcg cgggtaccaa gctggagatc aag 333 <210> 186 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of feline Kappa light chain G minus with modified C-terminus <400> 186 Arg Ser Asp Ala Gln Pro Ser Val Phe Leu Phe Gln Pro Ser Leu Asp 1 5 10 15 Glu Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Ile Val Cys Ile Leu Asn Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Lys Glu Val Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Val Gln 35 40 45 Asn Lys Gly Ile Gln Glu Ser Thr Thr Glu Gln Asn Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu 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ggagttcaaa tgcagggtca 600 acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggcagaccga 660 aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag gataaagtca 720 gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag tggcagtgga 780 atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catgaacacg aatggctctt 840 acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga aatactttca 900 cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc ctctcccact 960 ctcctggtaa a 971 <210> 190 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 190 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 1 5 10 15 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln 35 40 45 Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg 65 70 75 80 His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro 85 90 95 Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu 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<210> 195 <211> 330 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 195 aatgatgccc agccagccgt ctatttgttc caaccatctc cagaccagtt acacacagga 60 agtgcctctg ttgtgtgctt gctgaatagc ttctacccca aagacatcaa tgtcaagtgg 120 aaagtggatg gtgtcatcca agacacaggc atccaggaaa gtgtcacaga gcaggacaag 180 gacagtacct acagcctcag cagcaccctg acgatgtcca gtactgagta cctaagtcat 240 gagttgtact cctgtgagat cactcacaag agcctgccct ccaccctcat caagagcttc 300 caaaggagcg agtgtcagag agtggactaa 330 <210> 196 <211> 108 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 196 Ala Asp Ala Lys Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Lys Glu Gln 1 5 10 15 Leu Glu Thr Gln Thr Val Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Ser Phe Phe 20 25 30 Pro Arg Glu Val Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Val Gln Ser 35 40 45 Ser Gly Ile Leu Asp Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Ser Leu Pro Thr Ser Gln Tyr Leu Ser 65 70 75 80 His Asn Leu Tyr Ser Cys Glu Val Thr His Lys Thr Leu Ala Ser Pro 85 90 95 Leu Val Lys Ser Phe Ser Arg Asn Glu Cys Glu Ala 100 105 <210> 197 <211> 327 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 197 gctgatgcca agccatccgt cttcatcttc ccgccatcga aggagcagtt agagacccaa 60 actgtctctg tggtgtgctt gctcaatagc ttcttcccca gagaagtcaa tgtcaagtgg 120 aaagtggatg gggtggtcca aagcagtggc atcctggata gtgtcacaga gcaggacagc 180 aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctctcgctgc ccacgtcaca gtacctaagt 240 cataatttat attcctgtga ggtcacccac aagaccctgg cctcccctct ggtcaaaagc 300 ttcagcagga acgagtgtga ggcttag 327 <210> 198 <211> 108 <212> PRT <213> Mustela vison <400> 198 Arg Asn Asp Ala Gln Pro Ser Val Phe Leu Phe Gln Pro Ser Gln Asp 1 5 10 15 Gln Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Lys Glu Val Thr Val Lys Trp Met Val Asp Gly Val Thr Lys 35 40 45 Asn Thr Gly Ile Leu Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Ile Pro Ser Thr Glu Tyr Leu 65 70 75 80 Ser His Glu Thr Tyr Ser Cys Glu Val Thr His Lys Ser Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Leu Val Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys Gln 100 105 <210> 199 <211> 327 <212> DNA <213> Mustela vison <400> 199 cggaatgatg cccagccatc cgtctttttg ttccaaccat ctcaggacca gttacatacc 60 ggcagtgcct ctgtcgtgtg cttgctgaat ggcttctacc ccaaagaagt cactgtcaaa 120 tggatggttg atggtgttac caaaaacaca ggcatcctag aaagtgtcac agaacaagac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacga tccccagtac ggagtaccta 240 agtcatgaga cgtactcctg tgaggtcact cacaagagcc tgtcctcccc tcttgtcaag 300 agcttccaaa ggagcgagtg ccaatga 327 <210> 200 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 200 Ser Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 201 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 201 Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Ile His Tyr Asn Gln Val Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 202 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 202 Gln Asp Ile Val Thr Thr Val Asp Tyr 1 5 <210> 203 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 203 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ile Asn Gln Lys Asn His Leu 1 5 10 15 Ala <210> 204 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 204 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 205 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 205 Gln Gln Gly Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 206 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 206 Ser Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 207 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 207 Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Ile Phe Arg 1 5 10 15 Asp <210> 208 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 208 Gln Asp Ile Val Thr Thr Val Asp Tyr 1 5 <210> 209 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 209 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ile Asn Gln Lys Asn Phe Leu 1 5 10 15 Ala <210> 210 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 210 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 211 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 211 Gln Gln His Tyr Gly Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 212 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 212 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 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25 30 Ile Asn Gln Lys Asn His Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ala Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Gly Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 215 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 215 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttaca 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtatca atcaaaagaa ccacttggcc 120 tggttccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgctcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaagactga agacctggca gtttattact gtcagcaagg ttatacctac 300 ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaa 339 <210> 216 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 216 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Tyr Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Ile Phe 50 55 60 Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Asp Ile Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 217 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 217 caggtccaat tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cctatggcta caccttcacc agttactgga tgaactgggt gaaacagagg 120 cctggacaag gccttgaatg gattggtatg attgatcctt cagacagtga aactcactac 180 aatcaaatat tcagggacaa ggccacattg actatagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagacaagat 300 atagtgacta cagttgacta ctggggccag ggcaccactc tcacagtctc ctca 354 <210> 218 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 218 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ile Asn Gln Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ser Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Gly Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 219 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 219 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtatca atcaaaagaa cttcttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaagtctga agacctggca gtttattact gtcagcaaca ttatggctat 300 ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaa 339 <210> 220 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable heavy mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 220 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Thr Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Thr Lys His Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ser Gly Tyr Asp Tyr Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 221 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding felinized variable heavy mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 221 gacgtgcaac tggtggagag tggaggggac cttgtaaagc caggcgggtc cctgcgcctg 60 acctgtgtag ccagcggctt cacttactcc aactattgga tgcactgggt cagacaggcc 120 cccggaaaag ggcttcagtg ggtggcaagg atcgatccct acggaggagg aacgaagcat 180 aacgagaagt tcaagcggag gtttactatc agtagagaca acgcgaaaaa tacactgtac 240 ctgcagatga atagtcttaa gacagaggat accgcgacct actattgcgt cagatccggc 300 tatgactatt actttgacgt ttggggacag ggcacactgg tcaccgtctc gagc 354 <210> 222 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 222 Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Asn Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Phe Gly Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 223 <211> 321 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 223 Gly Ala Ala Ala Thr Thr Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Thr Thr Cys Cys Thr Thr 20 25 30 Gly Thr Cys Cys Gly Cys Cys Ala Gly Thr Cys Cys Cys Gly Gly Ala 35 40 45 Gly Ala Thr Cys Gly Cys Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Ala Ala 50 55 60 Cys Cys Thr Gly Cys Cys Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Thr Gly Ala 65 70 75 80 Ala Ala Ala Thr Ala Thr Thr Thr Ala Thr Thr Cys Ala Thr Thr Cys 85 90 95 Cys Thr Cys Gly Cys Gly Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys Ala Gly Cys 100 105 110 Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr 115 120 125 Gly Cys Cys Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Ala 130 135 140 Thr Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Thr Ala Ala Cys Ala Cys Gly Thr 145 150 155 160 Thr Gly Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Thr Gly Cys Cys 165 170 175 Cys Ala Gly Thr Ala Gly Ala Thr Thr Cys Ala Gly Cys Gly Gly Gly 180 185 190 Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala Cys Cys Gly 195 200 205 Ala Thr Thr Thr Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Ala Ala Thr 210 215 220 Thr Thr Cys Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Cys Ala 225 230 235 240 Gly Ala Ala Gly Ala Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Ala Thr 245 250 255 Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Cys Cys Ala Gly Cys Ala Thr Cys Ala 260 265 270 Cys Thr Thr Thr Gly Gly Gly Ala Cys Cys Cys Cys Thr Thr Thr Cys 275 280 285 Ala Cys Thr Thr Thr Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly Gly Thr Ala 290 295 300 Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala 305 310 315 320 Ala <210> 224 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable heavy mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 224 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Thr Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Thr Lys His Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ser Gly Tyr Asp Tyr Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 225 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding felinized variable heavy mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 225 gacgtgcaac tggtggagag tggaggggac cttgtaaagc caggcgggtc cctgcgcctg 60 acctgtgtag ccagcggctt cacttactcc aactattgga tgcactgggt cagacaggcc 120 cccggaaaag ggcttcagtg ggtggcaagg atcgatccct acggaggagg aacgaagcat 180 aacgagaagt tcaagcggag gtttactatc agtagagaca acgcgaaaaa tacactgtac 240 ctgcagatga atagtcttaa gacagaggat accgcgacct actattgcgt cagatccggc 300 tatgactatt actttgacgt ttggggacag ggcacactgg tcaccgtctc gagc 354 <210> 226 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 226 Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Asn Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Phe Gly Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 227 <211> 321 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding felinized variable light mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 227 Gly Ala Ala Ala Thr Thr Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Thr Thr Cys Cys Thr Thr 20 25 30 Gly Thr Cys Cys Gly Cys Cys Ala Gly Thr Cys Cys Cys Gly Gly Ala 35 40 45 Gly Ala Thr Cys Gly Cys Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Ala Ala 50 55 60 Cys Cys Thr Gly Cys Cys Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Thr Gly Ala 65 70 75 80 Ala Ala Ala Thr Ala Thr Thr Thr Ala Thr Thr Cys Ala Thr Thr Cys 85 90 95 Cys Thr Cys Gly Cys Gly Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys Ala Gly Cys 100 105 110 Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr 115 120 125 Gly Cys Cys Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Ala 130 135 140 Thr Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Thr Ala Ala Cys Ala Cys Gly Thr 145 150 155 160 Thr Gly Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Thr Gly Cys Cys 165 170 175 Cys Ala Gly Thr Ala Gly Ala Thr Thr Cys Ala Gly Cys Gly Gly Gly 180 185 190 Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala Cys Cys Gly 195 200 205 Ala Thr Thr Thr Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Ala Ala Thr 210 215 220 Thr Thr Cys Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Cys Ala 225 230 235 240 Gly Ala Ala Gly Ala Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Ala Thr 245 250 255 Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Cys Cys Ala Gly Cys Ala Thr Cys Ala 260 265 270 Cys Thr Thr Thr Gly Gly Gly Ala Cys Cys Cys Cys Thr Thr Thr Cys 275 280 285 Ala Cys Thr Thr Thr Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly Gly Thr Ala 290 295 300 Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala 305 310 315 320 Ala <210> 228 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable heavy mAb sequence, from Canis familiaris and Felis catus <400> 228 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Thr Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Asp Ser Val Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Phe Pro Gly Ser Phe Glu His Trp Gly Gln Gly Ala Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 229 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding felinized variable heavy mAb sequence, Canis familiaris and Felis catus <400> 229 gatgtgcagc tggtggaaag cggcggcgat ctggtgaaac cgggcggcag cctgcgcctg 60 acctgcgtgg cgagcggctt tacctttagc gattatgcga tgagctgggt gcgccaggcg 120 ccgggcaaag gcctgcagtg ggtggcgggc attgatagcg tgggcagcgg caccagctat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acgcgaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgaa aaccgaagat accgcgacct attattgcgc gagcggcttt 300 ccgggcagct ttgaacattg gggccagggc gcgctggtga ccgtgagcag c 351 <210> 230 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable light mAb sequence, from Canis familiaris and Felis catus <400> 230 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Thr Leu Gly Gln 1 5 10 15 Arg Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Gly 20 25 30 Tyr Val Gly Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Met Gly Pro Lys Thr Val 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asn Ser Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Val Tyr Asp Arg Thr Phe 85 90 95 Asn Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 100 105 110 Lys Ser Ala Pro Pro Arg Ser His Ser Ser Arg Pro Ile Ser Tyr Ala 115 120 125 Val Phe Cys Leu 130 <210> 231 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding felinized variable light mAb sequence, Canis familiaris and Felis catus <400> 231 cagagcgtgc tgacccagcc gagcagcgtg agcggcaccc tgggccagcg cattaccatt 60 agctgcaccg gcagcagcag caacattggc agcggctatg tgggctggta tcagcaggtg 120 ccgggcatgg gcccgaaaac cgtgatttat tataacagcg atcgcccgag cggcgtgccg 180 gatcgcttta gcggcagcaa aagcggcagc agcggcaccc tgaccattac cggcctgcag 240 gcggaagatg aagcggatta ttattgcagc gtgtatgatc gcacctttaa cgcggtgttt 300 ggcggcggca cccatctgac cgtgctg 327 <210> 232 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable heavy mAb sequence, from Canis familiaris and Felis catus <400> 232 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Thr Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Asp Ser Val Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Phe Pro Gly Ser Phe Glu His Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 233 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding felinized variable heavy mAb sequence, Canis familiaris and Felis catus <400> 233 gatgtgcagc tggtggaaag cggcggcgat ctggtgaaac cgggcggcag cctgcgcctg 60 acctgcgtgg cgagcggctt tacctttagc gattatgcga tgaactgggt gcgccaggcg 120 ccgggcaaag gcctgcagtg ggtggcgggc attgatagcg tgggcagcgg caccagctat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acgcgaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga gcggcctgaa aaccgaagat accgcgacct attattgcgc gagcggcttt 300 ccgggcagct ttgaacattg gggccagggc accctggtga ccgtgagcag c 351 <210> 234 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Felinized variable light mAb sequence, from Canis familiaris and Felis catus <400> 234 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Thr Leu Gly Gln 1 5 10 15 Arg Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Gly 20 25 30 Tyr Val Gly Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Met Gly Pro Lys Thr Val 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asn Ser Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Val Tyr Asp Arg Thr Phe 85 90 95 Asn Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 100 105 110 Lys Ser Ala Pro Pro Arg Ser His Ser Ser Arg Pro Ile Ser Tyr Ala 115 120 125 Val Phe Cys Leu 130 <210> 235 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding felinized variable light mAb sequence, Canis familiaris and Felis catus <400> 235 cagagcgtgc tgacccagcc gagcagcgtg agcggcaccc tgggccagcg cattaccatt 60 agctgcaccg gcagcagcag caacattggc agcggctatg tgggctggta tcagcaggtg 120 ccgggcatgg gcccgaaaac cgtgatttat tataacagcg atcgcccgag cggcgtgccg 180 gatcgcttta gcggcagcaa aagcggcagc agcggcaccc tgaccattac cggcctgcag 240 gcggaagatg aagcggatta ttattgcagc gtgtatgatc gcacctttaa cgcggtgttt 300 ggcggcggca cccatctgac cgtgctg 327 <210> 236 <211> 106 <212> PRT <213> Felis catus <400> 236 Gly Gln Pro Lys Ser Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Asn 1 5 10 15 Glu Glu Leu Ser Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Ser Gly Leu Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Thr Pro 35 40 45 Ile Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Ser Pro Asn Glu Trp Lys 65 70 75 80 Ser Arg Ser Arg Phe Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Asn Val Val Pro Ala Glu Cys Ser 100 105 <210> 237 <211> 318 <212> DNA <213> Felis catus <400> 237 ggccagccca agagcgctcc ctccgtgacc ctgttccccc caagcaacga ggaactgagc 60 gccaacaagg ccaccctggt gtgcctgatc agcgacttct accccagcgg cctgaccgtg 120 gcctggaagg ccgatggcac ccctatcacc cagggcgtgg aaaccaccaa gcccagcaag 180 cagagcaaca acaaatacgc cgccagcagc tacctgagcc tgagccccaa cgagtggaag 240 tcccggtccc ggttcacatg ccaggtgaca cacgagggca gcaccgtgga aaagaacgtg 300 gtgcccgccg agtgcagc 318

Claims (49)

  1. 포유류 IL-31 단백질 및 이의 공-수용체의 상호작용에 관여된 상기 IL-31 단백질 상의 영역에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 상기 항체의 상기 영역에의 결합이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 15H05 에피토프 결합 영역에서의 돌연변이에 의해 영향받는, 단클론성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분:
    a) 서열번호 157(고양잇과_IL31_야생형)로 표시되는 고양잇과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기 124 내지 135의 영역;
    b) 서열번호 155(갯과_IL31)로 표시되는 갯과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기 124 내지 135의 영역; 및
    c) 서열번호 165(말과_IL31)로 표시되는 말과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기 118 내지 129의 영역.
  2. 제1항에 있어서,
    15H05 에피토프 결합 영역에서의 돌연변이가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단클론성 항체:
    (a) 서열번호 157의 126 및 128 위치가 알라닌으로 변경되는 돌연변이체;
    (b) 서열번호 155의 126 및 128 위치가 알라닌으로 변경되는 돌연변이체; 및
    (c) 서열번호 165의 120 및 122 위치가 알라닌으로 변경되는 돌연변이체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    항체가 15H05 에피토프 영역에 결합하는, 단클론성 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유류 IL-31이 고양잇과 IL-31이고, 항체가 서열번호 157(고양잇과_IL31_야생형)로 표시되는 고양잇과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기 125 내지 134의 영역에 결합하는, 단클론성 항체.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유류 IL-31이 갯과 IL-31이고, 항체가 서열번호 155(갯과_IL31)로 표시되는 갯과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기 125 내지 134의 영역에 결합하는, 단클론성 항체.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유류 IL-31이 말과 IL-31이고, 항체가 서열번호 165(말과_IL31)로 표시되는 말과 IL-31 서열의 대략 아미노산 잔기 117 내지 128의 영역에 결합하는, 단클론성 항체.
  7. 제4항에 있어서,
    항체가 고양잇과 IL31에 결합하고 42 위치에서 라이신 대신에 아스파라긴, 43 위치에서 발린 대신에 이소류신, 46 위치에서 류신 대신에 발린, 49 위치에서 라이신 대신에 아스파라긴, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 프레임워크 2(FW2) 변화를 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하고, 상기 위치가 서열번호 127(FEL_15H05_VL1)의 넘버링을 지칭하는, 단클론성 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 부분이 상보성 결정 영역(CDR) 서열의 하기 조합을 포함하는, 단클론성 항체:
    1) 항체 15H05: SYTIH(서열번호 1)의 가변 중쇄(VH)-CDR1, NINPTSGYTENNQRFKD(서열번호 2)의 VH-CDR2, WGFKYDGEWSFDV(서열번호 3)의 VH-CDR3, RASQGISIWLS(서열번호 4)의 가변 경쇄(VL)-CDR1, KASNLHI(서열번호 5)의 VL-CDR2, 및 LQSQTYPLT(서열번호 6)의 VL-CDR3; 또는
    2) VH 또는 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 모 항체 15H05와 상이한 1)의 변이체.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 부분이 상보성 결정 영역(CDR) 서열의 하기 조합을 포함하는, 단클론성 항체:
    1) 항체 ZIL1: SYGMS(서열번호 13)의 가변 중쇄(VH)-CDR1, HINSGGSSTYYADAVKG(서열번호 14)의 VH-CDR2, VYTTLAAFWTDNFDY(서열번호 15)의 VH-CDR3, SGSTNNIGILAAT(서열번호 16)의 가변 경쇄(VL)-CDR1, SDGNRPS(서열번호 17)의 VL-CDR2, 및 QSFDTTLDAYV(서열번호 18)의 VL-CDR3;
    2) 항체 ZIL8: DYAMS(서열번호 19)의 VH-CDR1, GIDSVGSGTSYADAVKG(서열번호 20)의 VH-CDR2, GFPGSFEH(서열번호 21)의 VH-CDR3, TGSSSNIGSGYVG(서열번호 22)의 VL-CDR1, YNSDRPS(서열번호 23)의 VL-CDR2, 및 SVYDRTFNAV(서열번호 24)의 VL-CDR3;
    3) 항체 ZIL9: SYDMT(서열번호 25)의 VH-CDR1, DVNSGGTGTAYAVAVKG(서열번호 26)의 VH-CDR2, LGVRDGLSV(서열번호 27)의 VH-CDR3, SGESLNEYYTQ(서열번호 28)의 VL-CDR1, RDTERPS(서열번호 29)의 VL-CDR2, 및 ESAVDTGTLV(서열번호 30)의 VL-CDR3;
    4) 항체 ZIL11: TYVMN(서열번호 31)의 VH-CDR1, SINGGGSSPTYADAVRG(서열번호 32)의 VH-CDR2, SMVGPFDY(서열번호 33)의 VH-CDR3, SGESLSNYYAQ(서열번호 34)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 35)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSDTIV(서열번호 36)의 VL-CDR3;
    5) 항체 ZIL69: SYAMK(서열번호 37)의 VH-CDR1, TINNDGTRTGYADAVRG(서열번호 38)의 VH-CDR2, GNAESGCTGDHCPPY(서열번호 39)의 VH-CDR3, SGESLNKYYAQ(서열번호 40)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 41)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSETNV(서열번호 42)의 VL-CDR3;
    6) 항체 ZIL94: TYFMS(서열번호 43)의 VH-CDR1, LISSDGSGTYYADAVKG(서열번호 44)의 VH-CDR2, FWRAFND(서열번호 45)의 VH-CDR3, GLNSGSVSTSNYPG(서열번호 46)의 VL-CDR1, DTGSRPS(서열번호 47)의 VL-CDR2, 및 SLYTDSDILV(서열번호 48)의 VL-CDR3;
    7) 항체 ZIL154: DRGMS(서열번호 49)의 VH-CDR1, YIRYDGSRTDYADAVEG(서열번호 50)의 VH-CDR2, WDGSSFDY(서열번호 51)의 VH-CDR3, KASQSLLHSDGNTYLD(서열번호 52)의 VL-CDR1, KVSNRDP(서열번호 53)의 VL-CDR2, 및 MQAIHFPLT(서열번호 54)의 VL-CDR3;
    8) 항체 ZIL159: SYVMT(서열번호 55)의 VH-CDR1, GINSEGSRTAYADAVKG(서열번호 56)의 VH-CDR2, GDIVATGTSY(서열번호 57)의 VH-CDR3, SGETLNRFYTQ(서열번호 58)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 59)의 VL-CDR2, 및 KSAVSIDVGV(서열번호 60)의 VL-CDR3;
    9) 항체 ZIL171: TYVMN(서열번호 61)의 VH-CDR1, SINGGGSSPTYADAVRG(서열번호 62)의 VH-CDR2, SMVGPFDY(서열번호 63)의 VH-CDR3, SGKSLSYYYAQ(서열번호 64)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 65)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSDTIV(서열번호 66)의 VL-CDR3;
    10) 항체 04H07: SYWMN(서열번호 200)의 VH-CDR1, MIDPSDSEIHYNQVFKD(서열번호 201)의 VH-CDR2, QDIVTTVDY(서열번호 202)의 VH-CDR3, KSSQSLLYSINQKNHLA(서열번호 203)의 VL-CDR1, WASTRES(서열번호 204)의 VL-CDR2, 및 QQGYTYPFT(서열번호 205)의 VL-CDR3;
    11) 항체 06A09: SYWMN(서열번호 206)의 VH-CDR1, MIDPSDSETHYNQIFRD(서열번호 207)의 VH-CDR2, QDIVTTVDY(서열번호 208)의 VH-CDR3, KSSQSLLYSINQKNFLA(서열번호 209)의 VL-CDR1, WASTRES(서열번호 210)의 VL-CDR2, 및 QQHYGYPFT(서열번호 211)의 VL-CDR3; 또는
    12) VH 또는 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 각각의 모 항체 ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159, ZIL171, 04H07 또는 06A09와 상이한 1) 내지 11)의 변이체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 포유동물에서 IL-31-매개된 소양성 또는 알레르기성 병태를 감소, 억제 또는 중화시키는, 단클론성 항체.
  11. 제10항에 있어서,
    포유동물이 개, 고양이 및 말로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단클론성 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 키메라인, 단클론성 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 개화되거나, 고양이화되거나, 말화되거나, 완전 갯과이거나, 완전 고양잇과이거나, 완전 말과인, 단클론성 항체.
  14. 제8항에 있어서,
    하기로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하는, 단클론성 항체:
    a) FEL_15H05_VL1_FW2를 포함하는 가변 경쇄:
    EIQMTQSPSSLSASPGDRVTITCRASQGISIWLSWYQQKPGNIPKVLINKASNLHIGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDAATYYCLQSQTYPLTFGGGTKLEIK(서열번호 135), 및
    b) FEL_15H05_VH1을 포함하는 가변 중쇄:
    QVLLVQSGAEVRTPGASVKIFCKASGYSFTSYTIHWLRQAPAQGLEWMGNINPTSGYTENNQRFKDRLTLTADTSTNTAYMELSSLRSADTAMYYCARWGFKYDGEWSFDVWGAGTTVTVSS(서열번호 121).
  15. 제9항에 있어서,
    1) 항체 ZIL1이 하기로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하고:
    a) CAN-ZIL1_VL을 포함하는 가변 경쇄:
    QSVLTQPTSVSGSLGQRVTISCSGSTNNIGILAATWYQQLPGKAPKVLVYSDGNRPSGVPDRFSGSKSGNSATLTITGLQAEDEADYYCQSFDTTLDAYVFGSGTQLTVL(서열번호 77), 및
    b) CAN-ZIL1_VH를 포함하는 가변 중쇄:
    EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLQWVAHINSGGSSTYYADAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVEVYTTLAAFWTDNFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 75);
    2) 항체 ZIL8이 하기로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하거나:
    a) CAN-ZIL8_VL을 포함하는 가변 경쇄:
    QSVLTQPASVSGSLGQKVTISCTGSSSNIGSGYVGWYQQLPGTGPRTLIYYNSDRPSGVPDRFSGSRSGTTATLTISGLQAEDEADYYCSVYDRTFNAVFGGGT(서열번호 81), 및
    b) CAN-ZIL8_VH를 포함하는 가변 중쇄:
    EVQLVESGGDLVKPAGSLRLSCVASGFTFSDYAMSWVRQAPGRGLQWVAGIDSVGSGTSYADAVKGRFTISRDDAKNTLYLQMFNLRAEDTAIYYCASGFPGSFEHWGQGTLVTVSS(서열번호 79);
    하기로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하거나:
    (c) ZTS_5864_VL을 포함하는 가변 경쇄:
    QSVLTQPSSVSGTLGQRITISCTGSSSNIGSGYVGWYQQVPGMGPKTVIYYNSDRPSGVPDRFSGSKSGSSGTLTITGLQAEDEADYYCSVYDRTFNAVFGGGTHLTVLGQPKSAPPRSHSSRPISYAVFCL(서열번호 230), 및
    (d) ZTS_5864_VH를 포함하는 가변 중쇄:
    DVQLVESGGDLVKPGGSLRLTCVASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLQWVAGIDSVGSGTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKTEDTATYYCASGFPGSFEHWGQGALVTVSS(서열번호 228);
    하기로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하고:
    (e) ZTS_5865_VL을 포함하는 가변 경쇄:
    SVLTQPSSVSGTLGQRITISCTGSSSNIGSGYVGWYQQVPGMGPKTVIYYNSDRPSGVPDRFSGSKSGSSGTLTITGLQAEDEADYYCSVYDRTFNAVFGGGTHLTVLGQPKSAPPRSHSSRPISYAVFCL(서열번호 234), 및
    (f) ZTS_5865_VH를 포함하는 가변 중쇄:
    DVQLVESGGDLVKPGGSLRLTCVASGFTFSDYAMNWVRQAPGKGLQWVAGIDSVGSGTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSGLKTEDTATYYCASGFPGSFEHWGQGTLVTVSS(서열번호 232);
    3) 항체 ZIL9가 하기로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하고:
    a) CAN-ZIL9_VL을 포함하는 가변 경쇄:
    SSVLTQPPSVSVSLGQTATISCSGESLNEYYTQWFQQKAGQAPVLVIYRDTERPSGIPDRFSGSSSGNTHTLTISGARAEDEADYYCESAVDTGTLVFGGGTHLAVL(서열번호 85), 및
    b) CAN-ZIL9_VH를 포함하는 가변 중쇄:
    EVQLVESGGDLVKPPGSLRLSCVASGFTFSSYDMTWVRQAPGKGLQWVADVNSGGTGTAYAVAVKGRFTISRDNAKKTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLGVRDGLSVWGQGTLVTVSS(서열번호 83);
    4) 항체 ZIL11이 하기로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하고:
    a) CAN-ZIL11_VL을 포함하는 가변 경쇄:
    SSVLTQPPSVSVSLGQTATISCSGESLSNYYAQWFQQKAGQAPVLVIYKDTERPSGIPDRFSGSSSGNTHTLTISGARAEDEADYYCESAVSSDTIVFGGGT(서열번호 89), 및
    b) CAN-ZIL11_VH를 포함하는 가변 중쇄:
    EVQLVESGGDLVKPAGSLRLSCVASGFTFRTYVMNWVRQAPGKGLQWVASINGGGSSPTYADAVRGRFTVSRDNAQNSLFLQMNSLRAEDTAVYFCVVSMVGPFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 87);
    5) 항체 ZIL69가 하기로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하고:
    a) CAN-ZIL69_VL을 포함하는 가변 경쇄:
    SSVLTQPPSVSVSLGQTATISCSGESLNKYYAQWFQQKAGQAPVLVIYKDTERPSGIPDRFSGSSAGNTHTLTISGARAEDEADYYCESAVSSETNVFGSGTQLTVL(서열번호 93), 및
    b) CAN-ZIL69_VH를 포함하는 가변 중쇄:
    EVQLVESGGDLVKPAGSLRLSCVASGFTFSSYAMKWVRQAPGKGLQWVATINNDGTRTGYADAVRGRFTISKDNAKNTLYLQMDSLRADDTAVYYCTKGNAESGCTGDHCPPYWGQGTLVTVSS(서열번호 91);
    6) 항체 ZIL94가 하기로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하고:
    a) CAN-ZIL94_VL을 포함하는 가변 경쇄:
    QTVVIQEPSLSVSPGGTVTLTCGLNSGSVSTSNYPGWYQQTRGRTPRTIIYDTGSRPSGVPNRFSGSISGNKAALTITGAQPEDEADYYCSLYTDSDILVFGGGTHLTVL(서열번호 97), 및
    b) CAN-ZIL94_VH를 포함하는 가변 중쇄:
    EVQLVDSGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSTYFMSWVRQAPGRGLQWVALISSDGSGTYYADAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAIFWRAFNDWGQGTLVTVSS(서열번호 95);
    7) 항체 ZIL154가 하기로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하고:
    a) CAN-ZIL154_VL을 포함하는 가변 경쇄:
    DIVVTQTPLSLSVSPGETASFSCKASQSLLHSDGNTYLDWFRQKPGQSPQRLIYKVSNRDPGVPDRFSGSGSGTDFTLRISGVEADDAGLYYCMQAIHFPLTFGAGTKVELK(서열번호 101), 및
    b) CAN-ZIL154_VH를 포함하는 가변 중쇄:
    EVHLVESGGDLVKPWGSLRLSCVASGFTFSDRGMSWVRQSPGKGLQWVAYIRYDGSRTDYADAVEGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWDGSSFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 99);
    8) 항체 ZIL159가 하기로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하고:
    a) CAN-ZIL159_VL을 포함하는 가변 경쇄:
    SNVLTQPPSVSVSLGQTATISCSGETLNRFYTQWFQQKAGQAPVLVIYKDTERPSGIPDRFSGSSSGNIHTLTISGARAEDEAAYYCKSAVSIDVGVFGGGTHLTVF(서열번호 105), 및
    b) CAN-ZIL159_VH를 포함하는 가변 중쇄:
    EVQLVESGGDLVKPAGSLRLSCVASGFTFSSYVMTWVRQAPGKGLQWVAGINSEGSRTAYADAVKGRFTISRDNAKNTLYLQIDSLRAEDTAIYYCATGDIVATGTSYWGQGTLVTVSS(서열번호 103);
    9) 항체 ZIL171이 하기로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하고:
    a) CAN-ZIL171_VL을 포함하는 가변 경쇄:
    SSVLTQPPSVSVSLGQTATISCSGKSLSYYYAQWFQQKAGQAPVLVIYKDTERPSGIPDRFSGSSSGNTHTLTISGARAEDEADYYCESAVSSDTIVFGGGTHLTVL(서열번호 109), 및
    b) CAN-ZIL171_VH를 포함하는 가변 중쇄:
    EVQLVESGGDLVKPAGSLRLSCVASGFTFRTYVMNWVRQAPGKGLQWVASINGGGSSPTYADAVRGRFTVSRDNAQNSLFLQMNSLRAEDTAIYFCVVSMVGPFDYWGHGTLVTVSS(서열번호 107);
    10) 항체 04H07이 하기로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하고:
    a) Mu_04H07_VL을 포함하는 가변 경쇄:
    DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSINQKNHLAWFQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPARFTGSGSGTDFTLTISSVKTEDLAVYYCQQGYTYPFTFGSGTKLEIK(서열번호 214), 및
    b) Mu_04H07_VH를 포함하는 가변 중쇄:
    QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWAKQRPGQGLEWIGMIDPSDSEIHYNQVFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARQDIVTTVDYWGQGTTLTVSS(서열번호 212);
    11) 항체 06A09가 하기로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하는:
    a) Mu_06A09_VL을 포함하는 가변 경쇄:
    DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSINQKNFLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKSEDLAVYYCQQHYGYPFTFGSGTKLEIK(서열번호 218), 및
    b) Mu_06A09_VH를 포함하는 가변 중쇄:
    QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKAYGYTFTSYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIDPSDSETHYNQIFRDKATLTIDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARQDIVTTVDYWGQGTTLTVSS(서열번호 216),
    단클론성 항체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 항체의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 IL-31-매개된 장애를 치료하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    IL-31-매개된 장애가 소양성 또는 알레르기성 병태인, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    소양성 또는 알레르기성 병태가 아토피성 피부염, 습진, 건선, 경피증 및 소양증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 소양성 병태인, 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    소양성 또는 알레르기성 병태가 알레르기성 피부염, 여름 습진, 두드러기, 호흡곤란증, 염증성 기도 질환, 재발성 기도 폐색, 기도 과민반응, 만성 폐쇄성 폐 질환, 및 자가면역에서 비롯된 염증성 과정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 알레르기성 병태인, 방법.
  20. 제16항에 있어서,
    IL-31-매개된 장애가 종양 진행인, 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    IL-31-매개된 장애가 호산구성 질환 또는 비만세포종인, 방법.
  22. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 IL-31 활성을 억제하는 방법.
  23. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 항체의 치료적 유효량을 포함하는 수의학적 조성물.
  24. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-31-매개된 장애를 가진 포유동물을 치료하는 데 사용하기 위한 항체.
  25. IL-31-매개된 장애를 가진 포유동물을 치료하기 위한, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
  26. (a) IL-31을 포함하는 샘플을 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 항체의 존재 하에서 인큐베이션하는 단계; 및
    (b) 상기 샘플에서 IL-31에 결합되는 항체를 검출하는 단계
    를 포함하는, IL-31을 검출하는 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    샘플에서 IL-31을 정량화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  28. 상보성 결정 영역(CDR) 서열의 하기 조합 중 하나 이상을 포함하는, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 단클론성 항체를 생산하는 숙주 세포:
    1) 항체 15H05: SYTIH(서열번호 1)의 가변 중쇄(VH)-CDR1, NINPTSGYTENNQRFKD(서열번호 2)의 VH-CDR2, WGFKYDGEWSFDV(서열번호 3)의 VH-CDR3, RASQGISIWLS(서열번호 4)의 가변 경쇄(VL)-CDR1, KASNLHI(서열번호 5)의 VL-CDR2, 및 LQSQTYPLT(서열번호 6)의 VL-CDR3;
    2) 항체 ZIL1: SYGMS(서열번호 13)의 가변 중쇄(VH)-CDR1, HINSGGSSTYYADAVKG(서열번호 14)의 VH-CDR2, VYTTLAAFWTDNFDY(서열번호 15)의 VH-CDR3, SGSTNNIGILAAT(서열번호 16)의 가변 경쇄(VL)-CDR1, SDGNRPS(서열번호 17)의 VL-CDR2, 및 QSFDTTLDAYV(서열번호 18)의 VL-CDR3;
    3) 항체 ZIL8: DYAMS(서열번호 19)의 VH-CDR1, GIDSVGSGTSYADAVKG(서열번호 20)의 VH-CDR2, GFPGSFEH(서열번호 21)의 VH-CDR3, TGSSSNIGSGYVG(서열번호 22)의 VL-CDR1, YNSDRPS(서열번호 23)의 VL-CDR2, 및 SVYDRTFNAV(서열번호 24)의 VL-CDR3;
    4) 항체 ZIL9: SYDMT(서열번호 25)의 VH-CDR1, DVNSGGTGTAYAVAVKG(서열번호 26)의 VH-CDR2, LGVRDGLSV(서열번호 27)의 VH-CDR3, SGESLNEYYTQ(서열번호 28)의 VL-CDR1, RDTERPS(서열번호 29)의 VL-CDR2, 및 ESAVDTGTLV(서열번호 30)의 VL-CDR3;
    5) 항체 ZIL11: TYVMN(서열번호 31)의 VH-CDR1, SINGGGSSPTYADAVRG(서열번호 32)의 VH-CDR2, SMVGPFDY(서열번호 33)의 VH-CDR3, SGESLSNYYAQ(서열번호 34)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 35)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSDTIV(서열번호 36)의 VL-CDR3;
    6) 항체 ZIL69: SYAMK(서열번호 37)의 VH-CDR1, TINNDGTRTGYADAVRG(서열번호 38)의 VH-CDR2, GNAESGCTGDHCPPY(서열번호 39)의 VH-CDR3, SGESLNKYYAQ(서열번호 40)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 41)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSETNV(서열번호 42)의 VL-CDR3;
    7) 항체 ZIL94: TYFMS(서열번호 43)의 VH-CDR1, LISSDGSGTYYADAVKG(서열번호 44)의 VH-CDR2, FWRAFND(서열번호 45)의 VH-CDR3, GLNSGSVSTSNYPG(서열번호 46)의 VL-CDR1, DTGSRPS(서열번호 47)의 VL-CDR2, 및 SLYTDSDILV(서열번호 48)의 VL-CDR3;
    8) 항체 ZIL154: DRGMS(서열번호 49)의 VH-CDR1, YIRYDGSRTDYADAVEG(서열번호 50)의 VH-CDR2, WDGSSFDY(서열번호 51)의 VH-CDR3, KASQSLLHSDGNTYLD(서열번호 52)의 VL-CDR1, KVSNRDP(서열번호 53)의 VL-CDR2, 및 MQAIHFPLT(서열번호 54)의 VL-CDR3;
    9) 항체 ZIL159: SYVMT(서열번호 55)의 VH-CDR1, GINSEGSRTAYADAVKG(서열번호 56)의 VH-CDR2, GDIVATGTSY(서열번호 57)의 VH-CDR3, SGETLNRFYTQ(서열번호 58)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 59)의 VL-CDR2, 및 KSAVSIDVGV(서열번호 60)의 VL-CDR3;
    10) 항체 ZIL171: TYVMN(서열번호 61)의 VH-CDR1, SINGGGSSPTYADAVRG(서열번호 62)의 VH-CDR2, SMVGPFDY(서열번호 63)의 VH-CDR3, SGKSLSYYYAQ(서열번호 64)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 65)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSDTIV(서열번호 66)의 VL-CDR3;
    11) 항체 04H07: SYWMN(서열번호 200)의 VH-CDR1, MIDPSDSEIHYNQVFKD(서열번호 201)의 VH-CDR2, QDIVTTVDY(서열번호 202)의 VH-CDR3, KSSQSLLYSINQKNHLA(서열번호 203)의 VL-CDR1, WASTRES(서열번호 204)의 VL-CDR2, 및 QQGYTYPFT(서열번호 205)의 VL-CDR3;
    12) 항체 06A09: SYWMN(서열번호 206)의 VH-CDR1, MIDPSDSETHYNQIFRD(서열번호 207)의 VH-CDR2, QDIVTTVDY(서열번호 208)의 VH-CDR3, KSSQSLLYSINQKNFLA(서열번호 209)의 VL-CDR1, WASTRES(서열번호 210)의 VL-CDR2, 및 QQHYGYPFT(서열번호 211)의 VL-CDR3; 또는
    13) VH 또는 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 각각의 모 항체 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159, ZIL171, 04H07 또는 06A09와 상이한 1) 내지 12)의 변이체.
  29. 상보성 결정 영역(CDR) 서열의 하기 조합 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산:
    1) 15H05: SYTIH(서열번호 1)의 가변 중쇄(VH)-CDR1, NINPTSGYTENNQRFKD(서열번호 2)의 VH-CDR2, 및 WGFKYDGEWSFDV(서열번호 3)의 VH-CDR3;
    2) ZIL1: SYGMS(서열번호 13)의 VH-CDR1, HINSGGSSTYYADAVKG(서열번호 14)의 VH-CDR2, 및 VYTTLAAFWTDNFDY(서열번호 15)의 VH-CDR3;
    3) ZIL8: DYAMS(서열번호 19)의 VH-CDR1, GIDSVGSGTSYADAVKG(서열번호 20)의 VH-CDR2, 및 GFPGSFEH(서열번호 21)의 VH-CDR3;
    4) ZIL9: SYDMT(서열번호 25)의 VH-CDR1, DVNSGGTGTAYAVAVKG(서열번호 26)의 VH-CDR2, 및 LGVRDGLSV(서열번호 27)의 VH-CDR3;
    5) ZIL11: TYVMN(서열번호 31)의 VH-CDR1, SINGGGSSPTYADAVRG(서열번호 32)의 VH-CDR2, 및 SMVGPFDY(서열번호 33)의 VH-CDR3;
    6) ZIL69: SYAMK(서열번호 37)의 VH-CDR1, TINNDGTRTGYADAVRG(서열번호 38)의 VH-CDR2, 및 GNAESGCTGDHCPPY(서열번호 39)의 VH-CDR3;
    7) ZIL94: TYFMS(서열번호 43)의 VH-CDR1, LISSDGSGTYYADAVKG(서열번호 44)의 VH-CDR2, 및 FWRAFND(서열번호 45)의 VH-CDR3;
    8) ZIL154: DRGMS(서열번호 49)의 VH-CDR1, YIRYDGSRTDYADAVEG(서열번호 50)의 VH-CDR2, 및 WDGSSFDY(서열번호 51)의 VH-CDR3;
    9) ZIL159: SYVMT(서열번호 55)의 VH-CDR1, GINSEGSRTAYADAVKG(서열번호 56)의 VH-CDR2, 및 GDIVATGTSY(서열번호 57)의 VH-CDR3;
    10) ZIL171: TYVMN(서열번호 61)의 VH-CDR1, SINGGGSSPTYADAVRG(서열번호 62)의 VH-CDR2, 및 SMVGPFDY(서열번호 63)의 VH-CDR3;
    11) 04H07: SYWMN(서열번호 200)의 VH-CDR1, MIDPSDSEIHYNQVFKD(서열번호 201)의 VH-CDR2, 및 QDIVTTVDY(서열번호 202)의 VH-CDR3;
    12) 06A09: SYWMN(서열번호 206)의 VH-CDR1, MIDPSDSETHYNQIFRD(서열번호 207)의 VH-CDR2, 및 QDIVTTVDY(서열번호 208)의 VH-CDR3; 또는
    13) VH CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 각각의 모 항체 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159, ZIL171, 04H07 또는 06A09의 CDR과 상이한 1) 내지 12)의 변이체.
  30. 제29항에 있어서,
    상보성 결정 영역(CDR) 서열의 하기 조합 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 단리된 핵산:
    1) 15H05: RASQGISIWLS(서열번호 4)의 가변 경쇄(VL)-CDR1, KASNLHI(서열번호 5)의 VL-CDR2, 및 LQSQTYPLT(서열번호 6)의 VL-CDR3;
    2) ZIL1: SGSTNNIGILAAT(서열번호 16)의 VL-CDR1, SDGNRPS(서열번호 17)의 VL-CDR2, 및 QSFDTTLDAYV(서열번호 18)의 VL-CDR3;
    3) ZIL8: TGSSSNIGSGYVG(서열번호 22)의 VL-CDR1, YNSDRPS(서열번호 23)의 VL-CDR2, 및 SVYDRTFNAV(서열번호 24)의 VL-CDR3;
    4) ZIL9: SGESLNEYYTQ(서열번호 28)의 VL-CDR1, RDTERPS(서열번호 29)의 VL-CDR2, 및 ESAVDTGTLV(서열번호 30)의 VL-CDR3;
    5) ZIL11: SGESLSNYYAQ(서열번호 34)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 35)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSDTIV(서열번호 36)의 VL-CDR3;
    6) ZIL69: SGESLNKYYAQ(서열번호 40)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 41)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSETNV(서열번호 42)의 VL-CDR3;
    7) ZIL94: GLNSGSVSTSNYPG(서열번호 46)의 VL-CDR1, DTGSRPS(서열번호 47)의 VL-CDR2, 및 SLYTDSDILV(서열번호 48)의 VL-CDR3;
    8) ZIL154: KASQSLLHSDGNTYLD(서열번호 52)의 VL-CDR1, KVSNRDP(서열번호 53)의 VL-CDR2, 및 MQAIHFPLT(서열번호 54)의 VL-CDR3;
    9) ZIL159: SGETLNRFYTQ(서열번호 58)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 59)의 VL-CDR2, 및 KSAVSIDVGV(서열번호 60)의 VL-CDR3;
    10) ZIL171: SGKSLSYYYAQ(서열번호 64)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 65)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSDTIV(서열번호 66)의 VL-CDR3;
    11) 04H07: KSSQSLLYSINQKNHLA(서열번호 203)의 VL-CDR1, WASTRES(서열번호 204)의 VL-CDR2, 및 QQGYTYPFT(서열번호 205)의 VL-CDR3;
    12) 06A09: KSSQSLLYSINQKNFLA(서열번호 209)의 VL-CDR1, WASTRES(서열번호 210)의 VL-CDR2, 및 QQHYGYPFT(서열번호 211)의 VL-CDR3; 또는
    13) VH 또는 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 각각의 모 항체 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159, ZIL171, 04H07 또는 06A09의 CDR과 상이한 1) 내지 12)의 변이체.
  31. 상보성 결정 영역(CDR) 서열의 하기 조합 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산:
    1) 15H05: RASQGISIWLS(서열번호 4)의 가변 경쇄(VL)-CDR1, KASNLHI(서열번호 5)의 VL-CDR2, 및 LQSQTYPLT(서열번호 6)의 VL-CDR3;
    2) ZIL1: SGSTNNIGILAAT(서열번호 16)의 VL-CDR1, SDGNRPS(서열번호 17)의 VL-CDR2, 및 QSFDTTLDAYV(서열번호 18)의 VL-CDR3;
    3) ZIL8: TGSSSNIGSGYVG(서열번호 22)의 VL-CDR1, YNSDRPS(서열번호 23)의 VL-CDR2, 및 SVYDRTFNAV(서열번호 24)의 VL-CDR3;
    4) ZIL9: SGESLNEYYTQ(서열번호 28)의 VL-CDR1, RDTERPS(서열번호 29)의 VL-CDR2, 및 ESAVDTGTLV(서열번호 30)의 VL-CDR3;
    5) ZIL11: SGESLSNYYAQ(서열번호 34)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 35)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSDTIV(서열번호 36)의 VL-CDR3;
    6) ZIL69: SGESLNKYYAQ(서열번호 40)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 41)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSETNV(서열번호 42)의 VL-CDR3;
    7) ZIL94: GLNSGSVSTSNYPG(서열번호 46)의 VL-CDR1, DTGSRPS(서열번호 47)의 VL-CDR2, 및 SLYTDSDILV(서열번호 48)의 VL-CDR3;
    8) ZIL154: KASQSLLHSDGNTYLD(서열번호 52)의 VL-CDR1, KVSNRDP(서열번호 53)의 VL-CDR2, 및 MQAIHFPLT(서열번호 54)의 VL-CDR3;
    9) ZIL159: SGETLNRFYTQ(서열번호 58)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 59)의 VL-CDR2, 및 KSAVSIDVGV(서열번호 60)의 VL-CDR3;
    10) ZIL171: SGKSLSYYYAQ(서열번호 64)의 VL-CDR1, KDTERPS(서열번호 65)의 VL-CDR2, 및 ESAVSSDTIV(서열번호 66)의 VL-CDR3;
    11) 04H07: KSSQSLLYSINQKNHLA(서열번호 203)의 VL-CDR1, WASTRES(서열번호 204)의 VL-CDR2, 및 QQGYTYPFT(서열번호 205)의 VL-CDR3;
    12) 06A09: KSSQSLLYSINQKNFLA(서열번호 209)의 VL-CDR1, WASTRES(서열번호 210)의 VL-CDR2, 및 QQHYGYPFT(서열번호 211)의 VL-CDR3; 또는
    13) VL CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 각각의 모 항체 15H05, ZIL1, ZIL8, ZIL9, ZIL11, ZIL69, ZIL94, ZIL154, ZIL159, ZIL171, 04H07 또는 06A09의 CDR과 상이한 1) 내지 12)의 변이체.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  33. 항체의 생산을 초래하는 조건 하에서 제28항에 따른 숙주 세포를 배양시키는 단계; 및
    상기 숙주 세포 또는 상기 숙주 세포의 배양 배지로부터 상기 항체를 단리시키는 단계
    를 포함하는, 항체의 생산 방법.
  34. 고양잇과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 고양잇과 IgG 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 숙주 세포에서 발현시켜 고양잇과 항체를 생산하는 단계로서, 상기 고양잇과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 야생형 고양잇과 IgG 카파 경쇄 불변 영역에서라면 존재할 C-말단 QRE 서열을 인코딩하는 서열이 변형되고/거나 결실되는 카파 경쇄 불변 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단계를 포함하는, 고양잇과 항체의 일관성 및/또는 품질을 개선시키는 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    a) 고양잇과 항체의 야생형 고양잇과 IgG 카파 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 단계로서, 상기 야생형 고양잇과 카파 경쇄 불변 영역이 QRE의 C-말단 아미노산 서열을 포함하는 단계;
    b) a)로부터의 뉴클레오타이드 서열에서 C-말단 QRE를 인코딩하는 서열을 제거하고/거나 변형시켜, 수정된 카파 경쇄 불변 뉴클레오타이드 서열을 형성하는 단계;
    c) b)로부터의 수정된 카파 경쇄 불변 뉴클레오타이드 서열을 고양잇과 IgG 카파 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 조합시켜, 완전 고양잇과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 형성하는 단계; 및
    d) c)로부터의 완전 고양잇과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 고양잇과 IgG 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 숙주 세포에서 발현시켜, 야생형 고양잇과 IgG 카파 경쇄 불변 영역에서라면 존재할 C-말단 QRE 서열이 변형되고/거나 결실되는 고양잇과 항체를 생산하는 단계
    를 포함하는 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서,
    고양잇과 항체의 일관성 및/또는 품질의 개선이 자유 IgG 카파 경쇄의 수준을 감소시켜, 그것에 의하여 온전한 고양잇과 IgG 항체 단량체의 백분율을 증가시키는 것을 포함하는, 방법.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    고양잇과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 고양잇과 IgG 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 숙주 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 동일 벡터 상에서 운반되는, 방법.
  38. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    고양잇과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 고양잇과 IgG 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 숙주 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 별도 벡터 상에서 운반되는, 방법.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    고양잇과 항체가 사이토카인 및/또는 성장 인자-매개된 장애에 관여된 표적에 특이적으로 결합하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    고양잇과 항체가 고양잇과 IL-31 또는 고양잇과 NGF에 특이적으로 결합하는, 방법.
  41. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    고양잇과 항체가 RSDAQPSVFLFQPSLDELHTGSASIVCILNDFYPKEVNVKWKVDGVVQNKGIQESTTEQNSKDSTYSLSSTLTMSSTEYQSHEKFSCEVTHKSLASTLVKSFQRSEC(서열번호 186) 서열을 갖는 카파 경쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 포함하는, 방법.
  42. 갯과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 갯과 IgG 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 숙주 세포에서 발현시켜 갯과 항체를 형성하는 단계로서, 상기 갯과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 야생형 갯과 IgG 카파 경쇄 불변 영역에서라면 존재할 C-말단 QRVD 서열을 인코딩하는 서열이 변형되고/거나 결실되는 카파 경쇄 불변 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단계를 포함하는, 갯과 항체의 일관성 및/또는 품질을 개선하는 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    a) 갯과 항체의 야생형 갯과 IgG 카파 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 단계로서, 상기 야생형 갯과 카파 경쇄 불변 영역이 QRVD의 C-말단 아미노산 서열을 포함하는 단계;
    b) a)로부터의 뉴클레오타이드 서열에서 C-말단 QRVD를 인코딩하는 서열을 제거하고/거나 변형시켜, 수정된 카파 경쇄 불변 뉴클레오타이드 서열을 형성하는 단계;
    c) b)로부터의 수정된 카파 경쇄 불변 뉴클레오타이드 서열을 갯과 IgG 카파 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 조합시켜, 완전 갯과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 형성하는 단계; 및
    d) c)로부터의 완전 갯과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 갯과 IgG 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 숙주 세포에서 발현시켜, 야생형 갯과 IgG 카파 경쇄 불변 영역에서라면 존재할 C-말단 QRVD 서열이 변형되고/거나 결실되는 갯과 항체를 생산하는 단계
    를 포함하는 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서,
    갯과 항체의 일관성 및/또는 품질의 개선이 자유 IgG 카파 경쇄의 수준을 감소시켜, 그것에 의하여 온전한 갯과 IgG 항체 단량체의 백분율을 증가시키는 것을 포함하는, 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    갯과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 갯과 IgG 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 숙주 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 동일 벡터 상에서 운반되는, 방법.
  46. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    갯과 IgG 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 갯과 IgG 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 숙주 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 별도 벡터 상에서 운반되는, 방법.
  47. 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    갯과 항체가 사이토카인 및/또는 성장 인자-매개된 장애에 관여된 표적에 특이적으로 결합하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서,
    갯과 항체가 갯과 IL-31 또는 갯과 NGF에 특이적으로 결합하는, 방법.
  49. 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    갯과 항체가 RNDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASVVCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSEC(서열번호 179) 서열을 갖는 카파 경쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 포함하는, 방법.
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