KR20090074026A - Ｉｐ-10에 기초한 면역학적 모니터링 - Google Patents

Ｉｐ-10에 기초한 면역학적 모니터링 Download PDF

Info

Publication number
KR20090074026A
KR20090074026A KR1020097006853A KR20097006853A KR20090074026A KR 20090074026 A KR20090074026 A KR 20090074026A KR 1020097006853 A KR1020097006853 A KR 1020097006853A KR 20097006853 A KR20097006853 A KR 20097006853A KR 20090074026 A KR20090074026 A KR 20090074026A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antigen
level
sample
test
response
Prior art date
Application number
KR1020097006853A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101248491B1 (ko
Inventor
모르텐 러왈드
페르닐레 라븐
제스퍼 유겐-올센
Original Assignee
흐비도브르 하스피틀
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 흐비도브르 하스피틀 filed Critical 흐비도브르 하스피틀
Publication of KR20090074026A publication Critical patent/KR20090074026A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101248491B1 publication Critical patent/KR101248491B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56927—Chlamydia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/32—Mycobacterium
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • G01N2333/16—HIV-1, HIV-2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/295—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Chlamydiales (o)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/35—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/44—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from protozoa
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Jellies, Jams, And Syrups (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명은 신규한 진단상의 원리를 제안한다. 예를 들어 결핵균, 리슈만편모충 또는 클라미디아의 감염을 검출할 수 있는 테스트 시스템은, 항원의 단백질/펩타이드를 가진 면역 세포의 케모카인 IP-10 다음의 자극의 측정하는 것을 기초로 한다.
기술된 테스트 시스템 IP-10은 효과 파라미터로서 IFN-γ를 기초로 하는 테스트보다 더 민감하고, 그것은 테스트와 진단을 개선한다. 테스트은 샘플이 배양 시점에서 또는 분석 전에 희석될 수 있기 때문에 더 적은 양의 혈액을 사용하여 수행될 수 있다. 테스트는 더 짧은 배양 시간에서 수행될 수 있다. 게다가, 테스트 시스템은 예를 들어 활성, 근래의 및 잠복성 TB 감염과 같은 감염의 다양한 단계 사이에서 구별할 수 있는 것을 허용할 수 있다.
요컨대, 본 발명은 적어도 하나의 항원을 가진 포유동물로부터 얻어진 샘플을 배양하는 단계, 상기 샘플의 IP-10 레벨을 결정하는 단계, 및 상기 결정된 IP-10 레벨과 참고-레벨을 비교하여, 포유동물이 항원에 대한 면역학적 반응을 발생시키는 항원을 이전에 가지고 있었거나, 또는 항원에 대한 면역학적 교차 반응을 발생시키는 다른 항원을 이전에 가지고 있었는지를 결정하는 단계를 포함하는 면역학적 방법으로서 기술될 수 있다.

Description

ＩＰ-10에 기초한 면역학적 모니터링{IP-10 based immunological monitoring}
본 발명은 일반적으로 면역학적 분석, 보다 특별히, 세포-매개 면역 반응(CMI)을 측정하기 위한 분석에 관한 것이다. 보다 더 특별하게, 본 발명은 전체 혈액 또는 다른 적합한 생물학적 샘플을 사용하여 항원에 대한 세포-매개 반응을 측정하기 위한 분석과 키트를 제공한다. 분석은 인간, 가축 및 수의사 및 야생생물 적용을 위한 치료 및 진단 프로토콜에 유용하다.
세포-매개 면역 반응의 측정은 면역성에 대한 마커(marker)로서 많은 감염성 및 자기 면역성 질병의 면역 진단, 및 내생적 및 외생적인 항원에 대한 T-세포 반응의 검출에 중요하다(즉, 감염 및 백신).
본 발명은 T-세포 또는 항원을 가지고 있는 면역 시스템의 다른 세포를 포함하는 포유동물로부터의 샘플을 배양함에 의해 포유동물의 CMI를 측정하는 방법을 제공한다. IP-10의 생산이 그 다음에 검출된다. 면역 효과기(effecter)의 존재 또는 레벨은 그 다음에 피실험자의 세포 매개 반응성의 레벨을 나타낸다.
결핵(Tuberculosis)
결핵균(MTB)-특이 면역우성 항원의 발견은 결핵(TB)의 진단에 중요한 새로운 수단에 이르게 하였다. 초기 연구는 정의된 MTB 항원에 대한 반응에서 T 세포에 의한 인터페론 감마(IFN-γ)의 생체 안에서의 생산을 분석한 테스트에 의해 투베르쿨린 피부 테스트(TST)를 대신하기 위한 가능성을 보여주었다. 동시에, 주요한 진보는 특이성을 두드러지게 개선시킨 고도의 면역성 항원, 초기에 분비된 항원의 표적 6(ESAT-6) 및 배양 여과액 단백질 10(CFP-10) 및 TB7.7의 발견이었다. 이러한 항원은 병원균의 판별 부위(RD1) 내에서 부호화되고, 결과적으로 결핵예방(BCG) 백신 계통 및 대부분의 비-결핵균(예외는 마이코박테리움 칸사시이, 마이코박테리움 마리눔, 마이코박테리움 스줄가이를 포함한다)에 결여된다. RD1 부호화된 항원 ESAT-6, CFP-10, TB7.7의 겹쳐진 펩타이드에 대한 IFN-γ 반응은 두 개의 인가된 및 상업적으로 이용할 수 있는 테스트에서 MTB 감염의 검출을 위한 기초를 형성한다.
QuantiFERON-TB Gold(Cellestis Limited, Carnegie, Victoria, Australia), 전체 혈액 효소-연계된 면역분석법(ELISA)은 유럽 CE 마크 승인을 가지고, 최근에는 잠복성 TB 감염과 질병의 검출을 위한 미국 식약청(FDA)의 승인을 받았다.
말초 혈액 단핵 세포를 사용하는 T-SPOT.TB(Oxford Immunotec, Oxford, UK), 효소-연계된 면역스팟 분석법(ELISPOT)은 유럽 CE 마크 승인을 가지고, 2005년에 캐나다에서 사용을 승인받았다. T-SPOT.TB는 단지 ESAT-6 및 CFP10를 사용한다.
그러나, 현재 이용할 수 있는 테스트의 제한은 아래와 같다:
1) 민감도는 면역억제된 개체들(예를 들어 HIV 양성 또는 면역억제 약제를 받은 환자)에서 감소될 수 있다.
2) 일부의 상황에서 상대적으로 큰 부피의 혈액이 필요한데(QuantiFERON 테스트 당 3 ㎖ 및 T-SPOT.TB를 위해 8 ㎖), 유아 및 심하게 아프고 빈혈이 있는 어린이에서는 그것의 사용이 제한될 수 있다.
3) 테스트는 활성, 잠복성 및 근래의 감염 간에 구별되지 않는다.
4) 테스트는 누가 근래의 또는 잠복성 TB로부터 활성 TB로 진행될 것인지 예언할 수 있는 것으로 증명되지 않았다.
대부분의 테스트 제한은 매우 낮은 레벨에서 효과 파라미터 IFN-γ의 측정에 기인하고, 심지어 가장 민감한 방법(QuantiFERON 테스트에서 0.35 IU/㎖(17.5 pg/㎖) 까지 아래로 및 T-SPOT.TB에서 5 스팟/분야)의 제한에 근접한다. 민감도를 향상시키기 위한 컷-오프(cut-off)의 감소는 결과적으로 테스트의 감소된 특이성을 초래할 것이다. QuantiFERON 테스트에 기초한 최근의 발표는 낮은 범위의 IFN-γ에서 테스트 결과를 가진 사람의 반복된 테스트는 QuantiFERON(QFT) 테스트의 잘못된 양성 및 잘못된 음성 결과의 위험 가능성을 강조하는 컷-오프 레벨의 주위에서 바뀐다는 것을 보여준다(Pai, M 등).
테스트의 분명한 허무함을 극복하기 위하여, 민감성은 부가적인 결핵균 특이 항원을 사용함으로써 개선될 수 있고, 이는 QuantiFERON 테스트, TB7.7로 명명된 부가적인 항원을 지금 포함하고 잠재적으로 민감성이 개선되었으나 여전히 매우 낮은 IFN-γ 레벨에서 측정에 의존하는 QuantiFERON In tube 테스트(QFT-IT)의 제3의 세대에서 행해진다.
이러한 접근은 다른 사람들에 의해 시도되어 왔으며, 즉 최근에는 IFN-γ(MIG/CXCL9)에 의해 유도된 모노카인(monokine)이 결핵균 특이 항원(ESAT-6/CFP10) 및 PPD의 자극 후에 명확하게 생체 내에서 발현되었다는 것을 보여주었다. CXCL9의 민감성은, 그러나 매우 낮고 IFN-γ의 민감성 보다 더 낮다. ESAT-6 자극 후에 CD4+ T 세포의 세포내 사이토카인 사이토메트리(cytometry)에 기초한 또 다른 더 작은 연구는, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-10 또는 활성화 마커 CD40L의 발현이 비-TB 질병으로부터 TB를 구별할 수 있는 경우 테스트되었다. 이러한 마커의 아무것도 IFN-γ에 비교되거나 또는 우수한 것으로 알려져 있지 않다(Abramo C 등)(Hughes A. 등).
아직 TB 감염의 진단을 위한 IFN-γ를 대신하는 민감하고 특정한 마커는 현 재 발표된 문헌에서 확인되지 않았다. 다수가 이전의 항원 자극을 가진 감염의 진단에서 마커로서가 아니라 감염과 관련하여 IP-10을 발표하고 있다.
클라미디아(Chlamydia)
생식기의 클라미디아 감염의 진단은 1990년대부터 빠르게 진화되었다. 핵산 증폭 테스트(NAAT), 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR), 전사 매개 증폭(TMA), 및 DNA 가닥 치환 분석(SDA)가 지금 주요 산업이다. 미국 및 다른 많은 산업화된 국가에서 가장 일반적으로 사용되고 널리 연구된 클라미디아 NAATs는 Aptima(Gen-Probe), Probe-Tec(Becton-Dickinson), 및 Amplicor(Roche)이다. Aptima Combo Ⅱ 분석은 클라미디아 트라코마티스 및 임질의 원인인 임균(Neisseria gonorrhoeae)을 동시에 테스트한다. 클라미디아를 위한 NAAT는 경부(여성) 또는 요도(남성)로부터 수집된 스웝(swab) 표본으로부터 수행될 수 있다.
현재, NAATs는 단지 비뇨생색기 표본에 대한 규칙적인 승인을 가진다. NAATs는 크게 배양, 클라미디아 진단을 위한 역사적인 금 표준, 및 비-증폭된 탐침 테스트, 예를 들어 Pace Ⅱ(Gen-Probe)을 대신하여 왔다. 후자의 테스트는 상대적으로 둔감하며, 무증후성의 여성에서 단지 감염의 60-80%를 성공적으로 검출하고, 때때로 잘못하여 양성의 결과를 준다. 배양은 선택된 환경에서 유용하게 남아있고, 현재 비-생색기 표본을 테스트하기 위하여 승인된 단지 하나의 분석이다.
클라미디아 진단은 그러므로 복잡하고 개발 도상국에서는 쉽게 이용할수 없는, PCR과 같은 기술을 요구하는 자원에 기초한다. 빠르고 쉬운 기술은 이러한 중요한 질병의 진단 측정 기구를 개선할 것이다.
CA 2,478,138은 케모카인 CXCL10 폴리펩타이드의 상승된 혈액 레벨이 호흡기 병(예를 들어, SARS, 인플루엔자 및 지역사회-획득성 폐렴)과 관련되고, 환자의 진단에 유용하다는 것을 기재한다. 방법은 호흡기 병으로 괴로워하는 환자의 진단과 치료를 위하여 제공된다.
WO 05/091969는 검출할 수 있는 병리학 프라이온 단백질의 형성 이전에 존재하는 임상 신호 이전에 이러한 감염을 검출하는데 유용한 TSE(전염성 스폰지형태 뇌질환)을 위한 마커를 기재한다. IP-10은 발표된 몇개의 마커들 중 단지 하나이고, 이러한 적용은 어떤 항원 자극을 기재하지 않는다.
US 2004-038201은 대식세포에서 다른 병원균에 대한 반응에서 활성화된 독특한 유전자 발현 프로그램을 기재한다. IP-10은 다시 언급된 많은 마커에서 단지 하나이고, 이러한 적용은 어떤 항원 자극을 기재하지 않는다.
Annalisa Azzurri 등은 IFN-γ 유도성의 단백질 10을 기재하였고, 펜트락신 3 플라즈마 레벨은 결핵균 감염의 염증 및 질병 활성을 모니터링하기 위한 수단이 다. 상기 논문은 IP-10 플라즈마 레벨이 TB를 가진 환자에서 동시에 증가하는 것을 보여주며, 다시 이러한 참고문헌은 다른 항원 자극을 기재하지 않는다.
WO 03/063759는 진단 또는 치료에 유용한 펩타이드로부터 유래된 열충격 단백질(Hsp)을 확인하는 방법을 기재한다. 이 발명의 화합물의 효과는 LPS를 가진 다음의 자극에 대한 반응에서 IP-10 레벨을 측정하는 것에 의해 말초 혈액 단핵 세포에서 테스트되었다. LPS를 가진 다음의 자극 없이 테스트 화합물을 가진 직접적인 자극은, IP-10 레벨에서의 증가를 일으키기 않는다.
WO 07/039400은 HIV-TB가 함께 감염된 환자뿐만 아니라 결핵으로 감염된 환자에서 결핵과 관련된 면역 복구 증후군(TB-IRS)의 진단을 위한 방법과 키트를 기재한다. TB-IRS를 진단하기 위하여, 발명자들은 PPD에 대한 Th1 반응 레벨 및/또는 ESAT-6, CFP-10, 85B(음성의 조절)에 대한 Th1 반응과의 비교에서 16 KDA 단백질을 검출하였고, TB-IRS의 지표로서 Th1 반응에서 상승을 사용하였다.
감소된 민감성과 항원 자극을 사용하는 현재 이용가능한 테스트에 의해 검출할 수 있는 IFN-γ의 낮은 레벨의 문제점을 극복하기 위하여, 본 발명자들은 IFN-γ보다 선택적인 생물학적 마커의 사용을 제안한다.
본 발명은 CMI 반응을 상승시키는 피실험자의 가능성 또는 수용력의 분석을 제공한다. 분석은 항원의 자극에 대한 반응에서 면역 시스템의 세포에 의한 면역 효과기 분자 생산을 측정하는 것에 기초한다. 면역 효과기는 효과기에 특이한 항체와 같은 리간드를 사용하거나 또는 효과기를 부호화하는 유전자 발현의 레벨을 측정하는 것에 의해 검출될 수 있다.
그러므로, 본 발명은 피실험자 내에 CMI의 반응성을 결정하는 수단을 제공하고, 차례로 감염성 질병, 병리학적 상태, 면역성 레벨 및 내생적 또는 외생적 항원에 대한 T-세포 반응성의 마커의 진단을 위한 수단을 제공한다.
본 발명의 일 측면은 IP-10 반응을 상승시키는 피실험자의 가능성 또는 수용력의 분석에 관한 것이다. 분석은 항원의 자극에 대한 반응에서 면역 시스템의 세포에 의한 IP-10 생산을 측정하는 것에 기초한다. IP-10 생산은 IP-10에 특이한 항체와 같은 리간드를 사용하거나 또는 IP-10을 부호화하는 유전자 발현의 레벨을 측정하는 것에 의해 검출될 수 있다. 본 발명자들은 두 개의 다른 유형의 감염: 결핵과 클라미디아를 사용하는 테스트 원리를 증명하였다. 결핵의 경우, 결핵균 특이 자극에 기초한 테스트와 그 다음의 IP-10의 결정은 결핵균으로 감염된 사람을 확인할 수 있다. 클라미디아의 경우, 클라미디아 트라코마티스 추출물의 자극에 기초한 테스트는 클라미디아로 감염된 사람을 확인할 수 있다.
기술된 테스트 시스템은 현재 이용할 수 있는 분석에 기초하는 마커, IFN-γ의 레벨보다 생물학적 마커 IP-10의 높은 레벨을 측정한다. IP-10에 기초한 테스트 시스템은, 예를 들면 효과적인 파라미터로서 IFN-γ에 기초한 테스트만큼 특이하거나 더 민감하고, 면역이 제대로 발휘되지 못하는 개체들의 테스트와 진단을 개선하며(실시예 10), 샘플이 배양시 또는 분석 전에 희석될 수 있기 때문에 테스트는 더 낮은 양의 혈액을 사용하여 수행될 수 있다(실시예 9 및 13). 실시예 11에 나타낸 바와 같이, 몇 시간의 배양 후에 IP-10이 중요한 양으로 생산되는 것과 같이, 또한 진단 속도를 개선한다. 결핵의 경우, 테스트 시스템은 활성, 근래의 및 잠복성 TB 감염 간의 구별할 수 있는 것을 허용할 수 있으며, 게다가 테스트 시스템은 활성 TB로 진행되는 위험한 상태의 사람을 잠재적으로 확인할 수 있다. 테스트 시스템은 면역분석법(즉, ELISA 또는 Luminex)을 사용하는 IP-10 검출에 기초하고, 테스트 시스템은 테스트 결과가 육안으로 검출할 수 있는 색상 반응이 존재하는, 낮은 자원 환경에서 적용할 수 있는 분야 친화적인 면역크로마토크래피 테스트으로 잠재적으로 개발될 수 있다.
본 발명에서 기술된 분석은 일련의 문제들을 해결한다. 현재 이용할 수 있는 분석은 심지어 가장 민감한 검출 방법(결핵 테스트의 경우, QuantiFERON 테스트는 0.35 국제단위/㎖(17.5 pg/㎖)에서 양성 테스트를 위한 컷-오프 레벨을 가지고, T-SPOT.TB 테스트의 경우 5 스팟형성단위/분야)의 제한에 근접한, 매우 낮은 레벨에서 효과 파라미터 IFN-γ를 측정한다. 민감성을 향상시키기 위하여 컷-오프를 감소키는 것은 결국 테스트의 감소된 특이성을 초래할 것이다. QuantiFERON 테스트에 기초한 발표는 더 낮은 범위의 IFN-γ에서 테스트 결과를 가진 사람의 반복된 테스트은 Quantiferon(QFT) 테스트의 잘못된 양성 및 잘못된 음성 결과의 잠재적 위험성을 나타내는 컷-오프 레벨의 주위에서 바뀐다는 것을 보여주었다. 게다가, 현재의 테스트는 컷-오프 레벨 이상에서 IFN-γ 반응을 증가할 수 없는 면역억제된 개체들에서 잘못된 음성 결과를 줄 수 있다. IP-10 방출의 양이 항원 자극 후에 더 높게 되는 것과 같이, IFN-γ와 비교하였을 때: 면역억제된 개체에서 민감도는 더 높고, 잘못된 음성 테스트는 적고, 테스트 결과는 더 재현성있고, 및, 보다 적은 불확정한 테스트 결과가 예상된다.
게다가, 항원 유도된 IP-10이 그러한 고 농도에서 분비되기 때문에, 배양 단계 전 또는 후에 샘플을 희석하는 것이 가능하다. 이것은 테스트를 수행하는데 필요한 샘플 물질(예를 들어, 전체 혈액)의 양이 예를 들어, 전체 혈액의 경우 아래에서 또는 0.25 ㎖에서 또는 0.25 ㎖ 미만, 예를 들어 0.20 ㎖, 예를 들어 0.15 ㎖, 예를 들어 0.1 ㎖, 예를 들어 0.05 ㎖로 감소될 수 있는 것을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 테스트는 아래에서 또는 심지어 0.1 ㎖ 아래에서 수행될 수 있다. 그러므로, 낮은 혈액 부피를 갖는 환자(예를 들어, 어린이/유아 또는 빈혈이 있는 사람)에게 적합한 “소형 분석(mini assay)”이 개발될 수 있다. 게다가, 예를 들어 손가락-찌름(finger-prick) 방법으로부터 혈액을 사용하는, 소형 분석은 정맥 구멍뚫기가 회피되는 것과 같이 사용자에게 보다 더 친화적인 것으로 만들어질 수 있다.
게다가, 결핵의 경우 활성 및 잠복성 감염을 구별할 수 있는 가능한 시험이 현재 없다. 놀랍게도, 본 발명자들은 비-자극된 IP-10의 농도를 발견하였으나, 닐 샘플(예를 들어, 전체 혈액)과 같이 배양된 샘플 물질이 잠복성 질병 상태인 건강한 개체와 비교하여 활성 질병인 환자들 사이에서 더 높다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 항원-특이 테스트와 결합된 비활성 용액(Nil)으로 배양된 샘플 물질에서 IP-10의 농도는 활성 감염(예를 들어, 결핵) 대 잠복성 감염(예를 들어, 결핵)에 대한 마커로서 사용될 수 있다는 것을 제안한다.
분석
그러므로, 본 발명의 일측면은
a) 적어도 하나의 테스트-항원을 가진 포유동물로부터 얻어진 샘플을 배양하는 단계
b) 상기 샘플의 IP-10 레벨을 결정하는 단계
c) 결정된 IP-10 레벨과 참고-레벨을 비교하여, 포유동물이 상기 테스트-항원에 대한 면역학적 반응을 발생시키는 테스트-항원을 이전에 가지고 있었거나 또는 테스트-항원에 면역학적 교차 반응을 발생시키는 다른 항원을 이전에 가지고 있었는지를 결정하는 단계를 포함하는 면역학적 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 기술된 방법들 중 어떤 방법은 플랫폼(platform) 독립적인 것으로 알려져 있다. 따라서, ELISA, Luminex, 멀티플렉스(Multiplex), 이뮤노블로팅(Immunoblotting), TRF-분석, 면역크로마토크래피 측면 플로우 분석, 효소 증식된 면역분석법, RAST 테스트, 방사면역분석법(radioimmunoassays), 면역형광법 및 다양한 면역학적 건조 스틱 분석법(예를 들어, 크로마토그래피 스틱 테스트)과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 어떤 면역학적 방법이 본 발명에 적용될 수 있다.
두 번째 측면에서, 본 발명은 감염을 진단하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
a) 테스트-항원이 PPD 또는 LPS가 아닌 조건 하에 적어도 하나의 테스트-항원을 가진 포유동물로부터 얻어진 샘플을 배양하는 단계
b) 상기 샘플의 IP-10 레벨을 결정하는 단계
c) 결정된 IP-10 레벨과 참고-레벨을 비교하여, 결정된 IP-10 레벨이 참고-레벨 이상인 경우 상기 포유동물이 미생물에 감염되었는지 아닌지를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명자들은 선택된 테스트 항원(들) 또는 평가를 위한 항원(들)으로의 직접적인 자극은 당업자가 샘플이 테스트-항원(들)에 대한 면역학적 반응을 발생시키는 테스트-항원(들)을 가지고 있었거나 또는 선택된 테스트-항원(들)에 대한 면역학적 교차 반응을 발생시키는 다른 테스트-항원들을 이전에 가지고 있었는지를 결론지을 수 있게 하는 판독을 얻는데 충분하다는 것을 증명하여 왔다.
그러므로, 일 구현예에서, 본 발명은 또한 여기에 기술된 바와 같은, 어떤 그 이상의 또는 일련의 자극이 제외된 면역학적 방법에 관한 것이다.
일련의 또는 그 이상의 자극은 예를 들어 생물학적 비활성 물질 또는 미토겐, 박테리아 생산물 또는 생물학적 활성 단백질과 같으나 이에 제한되지 않는 염증성의 반응과 관련된 생물학적 효과를 가진 물질을 가진 샘플로 프라이밍하거나 자극하는 것과 같은 어떤 유형의 자극을 포함할 수 있다.
그러므로, 일 구현예에서, 본 발명은 여기에 기술된 바와 같은, LPS로의 어떤 그 이상의 또는 일련의 자극이 제외된 면역학적 방법에 관한 것이다.
따라서, 상기 방법은 예를 들어, 결핵, 클라미디아, 리슈만편모충, 트리파노소마편모충 및 주혈흡충과 같으나, 이에 제한되지 않는 감염성 질병을 발전시키는 고 위험성의 사람에서 감염의 검출을 위해 적용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로, 샘플이 적어도 2개의 분획으로 분할되고,
a) 반응 샘플을 발생시키기 위하여 테스트-항원(들)을 가진 샘플의 제1 분획을 배양하는 단계
b) 닐 샘플을 발생시키는 비활성 용액을 가진 샘플의 제2 분획을 배양하는 단계
c) 두 분획에서 IP-10 레벨을 결정하는 단계
d) 반응 샘플에서 결정된 IP-10으로부터 닐 샘플에서 결정된 IP-10 레벨을 뺌으로써 샘플의 항원-의존 IP-10 반응을 결정하는 단계
e) 테스트-항원-의존 IP-10 반응 또는 그로부터 유래된 값과 참고-레벨 또는 그로부터 유래된 값을 비교하는 단계로,
포유동물이 테스트-항원(들)을 가지고 있어서 테스트-항원(들)에 대한 면역학적 반응을 이전에 발생시켰는지 또는 테스트-항원(들)에 대한 면역학적 교차 반응을 발생시키는 다른 항원들을 이전에 가지고 및/또는 감염을 발전시킬 것인지를 결정한다.
일 구현예에서, 분석 수행은 평가를 위해 선택된 항원 면역자극성 분자의 부수된 부가에 의해 가능해질 수 있는데, 상기 면역자극성 분자는 IL-2, IL-12, TNF-α, 및 IFN-γ로 이루어진 비제한적인 군으로부터 선택되는 사이토카인일 수 있다.
다른 구현예에서, 면역자극성 분자는 가용성 수용체(receptor)(예를 들어, B7 분자의 이- 또는 중합체(CD80/CD86)) 또는 항체(예를 들어, CD28-결합 항체)이다.
다른 구현예에서, 면역자극성 분자는 T 세포에 동시-자극성 신호(당 기술분야의 당업자에게 신호2로 알려진)를 제공하는 특성을 가지는데, 상기 동시-자극성 신호는 IP-10 반응을 단독으로 유도할 수는 없으나 세포가 평가를 위해 선택된 항원에 대한 CMI 반응을 발생시키는 경우 IP-10 반응을 증가시킬 수 있다.
다른 구현예에서, 분석을 가능하게 하는 것은 배양 단계 동안 일어나는 항-염증성 진행을 억제하는 것에 의해 달성될 수 있다. 일 구현예에서, 분석은 IL-4, IL-10 및 TGF-β와 같으나 이에 제한되지 않는 항-염증성 분자를 결합하는 항체들 또는 가용성 수용체들을 억제하는 것에 의해 가능해질 수 있다.
다른 구현예에서, 분석을 가능하게 하는 것은 조절 T-세포와 같이 CMI 반응에 억제 작용하는 세포 개체군의 억제 또는 제거를 통하여 매개된 항-염증의 억제에 의해 달성될 수 있다.
특히 여기에서 사용된 용어로서, 정제된 단백질 유도체(PPD 또는 투베르쿨린)은 비-종-특이 분자의 침전물이다. PPD 또는 투베르쿨린은 결핵균 또는 마이코박테리아 아비움과 같은 다른 마이코박테리아의 혼합물로부터 단백질 추출에 의해 얻어진다. PPD는 일반적으로 BCG 또는 결핵균에 대하여 발생된 세포의 면역 또는 Th1 반응의 존재를 위하여 테스트에 사용된다. 예를 들면, 그것은 큰 마스터 배치, Connaught 투베르쿨린(CT68)으로부터 제조된 Connaught Laboratories Limited의 투버졸B로부터 얻어지거나, 또는 Statens Serum Institute(SSI, Copenhagen Denmark)로부터 얻어진 RT23의 형태에서 얻어질 수 있다.
ESAT-6 단백질(early secreted antigenic target 6)은 결핵균 단-기간 배양 여과액으로부터 정제된 주요한 분비 항원이다. 본 발명에서 가리키는 것과 같이, ESAT-6, CFP-10(culture filtrate protein 10) 및 85B는 세포 용해물과 정제로부터 얻어질 수 있고, 재조합 기술에 의해 얻어질 수 있으며, 또는 합성 폴리펩타이드로서 생산될 수 있다. 예를 들어, ESAT6는 Statens Serum Institute로부터의 재조합 단백질로서 얻어질 수 있다.
투베르쿨린 또는 PPD(purified protein derivative)는 단지 결핵균 게놈 내에 위치된 유전자(RD-1 지역)에 의해 부호화된 ESAT-6(early secreted antigenic target 6), CFP-10(culture filtrate protein 10), 및 TB7.7과 다르고, BCG(the Bacille of Calmette et Guerin) 내에 함유되지 않는다. PPD가 예를 들어 BCG 서브-가닥 및 병원성이 낮거나 없는 몇몇의 비-결핵균 종과 공유하는 다른 항원을 역시 함유하기 때문에 PPD와 다르다.
선택적으로, 방법은 샘플을 3개의 분획으로 분할하고, 양성의 대조구를 발생시키기 위하여 T-세포 활성제를 가진 샘플의 제3 분획을 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기서 면역 세포는 예를 들어 세 개의 분리된 개체군: 닐 대조구(예를 들어, 식염수(saline)), Ag 자극된 것(예를 들어, 클라미디아 또는 결핵 특이 단백질 또는 이의 유도체) 및 양성의 대조구(예를 들어, 피토헤마글루티닌)에서 배양될 수 있다. 면역 세포는 전체 혈액, 희석된 혈액 또는 말초 혈액 단핵 세포, 단핵 세포 또는 T 세포와 같은 세포 개체군의 다양한 정제의 형태일 수 있다. 세포는 혈액, 소변, 늑막액, 기관지액, 구강 세정액, 조직 생체분석액, 복수, 고름, 뇌척수액, 흡인물, 및/또는 여포액으로부터 얻어질 수 있다. 면역 세포는, 예를 들어 37 ℃에서 4-24시간 동안 배양된다.
일 구현예에서, 샘플은 적어도 2개의 분획으로 분할되고,
a) 반응 샘플을 발생시키기 위하여 항원을 가진 샘플의 제1 분획을 배양하는 단계
b) 닐 샘플을 발생시키기 위하여 비활성 용액을 가진 샘플의 제2 분획을 배양하는 단계
c) 두 분획에서 IP-10 레벨을 결정하는 단계
d) 반응 샘플에서 결정된 IP-10으로부터 닐 샘플에서 결정된 IP-10 레벨을 뺌으로써 샘플의 항원-의존 IP-10 반응을 결정하는 단계
e) 항원-의존 IP-10 반응 또는 그로부터 유래된 값과 참고-레벨 또는 그로부터 유래된 값을 비교하는 단계
f) 항원 자발적 IP-10 반응 또는 그로부터 유래된 값과 참고-레벨 또는 그로부터 유래된 값을 비교하는 단계로,
포유동물이 항원을 이전에 가지고 있어서 항원에 대한 면역학적 반응을 발생시켰는지 또는 항원에 대한 면역학적 교차 반응을 발생시키는 다른 항원을 이전에 가지고 있었는지를 결정하고, 포유동물이 치료에 반응하거나 또는 감염을 발전시킬 경우, 활성, 근래의, 또는 잠복성 감염을 가지는지 아닌지를 결정한다.
보다 특히, 샘플은 적어도 3개의 분획으로 분할되고,
a) 반응 샘플을 발생시키기 위하여 항원을 가진 샘플의 제1 분획을 배양하는 단계
b) 닐 샘플을 발생시키기 위하여 비활성 용액을 가진 샘플의 제2 분획을 배양하는 단계
c) 미토겐 샘플을 발생시키는 자극성 용액(예를 들어, PHA)을 가진 샘플의 제3 분획을 배양하는 단계
d) 세 분획에서 IP-10 레벨을 결정하는 단계
d) 반응 샘플에서 결정된 IP-10으로부터 닐 샘플에서 결정된 IP-10 레벨을 뺌으로써 샘플의 항원-의존 IP-10 반응을 결정하는 단계
e) 항원-의존 IP-10 반응 또는 그로부터 유래된 값과 참고-레벨 또는 그로부터 유래된 값을 비교하는 단계
f) 미토겐 샘플에서 결정된 IP-10으로부터 닐 샘플에서 결정된 IP-10 레벨을 뺌으로써 샘플의 미토겐 의존 IP-10 반응을 결정하는 단계
g) 미토겐 의존 IP-10 반응 또는 그로부터 유래된 값과 참고-레벨 또는 그로부터 유래된 값을 비교하는 단계
h) 항원 자발성 IP-10 반응 또는 그로부터 유래된 값과 참고-레벨 또는 그로부터 유래된 값을 비교하는 단계로,
포유동물이 항원을 이전에 가지고 있어서 항원에 대한 면역학적 반응을 발생시켰는지 또는 항원에 대한 면역학적 교차 반응을 발생시키는 다른 항원을 이전에 가지고 있었는지를 결정하고, 포유동물이 치료에 반응하거나 감염을 발전키거나, 또는 면역-억제된 경우, 활성, 근래의, 또는 잠복성 감염을 가지는지 아닌지를 결정한다.
용어 “미토겐”은 세포 분할을 촉진하는 어떤 화학적 또는 화학적 조성물을 나타낸다. 미토겐은 T 세포와 B 세포에 개별적으로 또는 동시에 작용할 수 있다. 따라서, 용어 미토겐은 또한 T 세포-활성제 및 B 세포-활성제를 포함하고, 그러므로 여기서는 호환성있게 사용된다. 본 발명의 미토겐은 피토헤마글루티닌(PHA), 콘카나발린 A(conA), 리포폴리사카라이드(LPS) 및 포크위드 미토겐(PWM)과 같으나 이에 제한되지 않는, 당 기술분야의 당업자에게 알려진 모든 미토겐을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 미토겐은 T-세포 활성제이고, 보다 바람직하게 미토겐은 PHA이다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 미토겐은 단핵 세포/대식 세포 활성제이다. IP-10 생산은 그 다음에 항체-기초한 기술, 예를 들어 xMAP, 멀티플렉싱(multiplexing), Luminex, ELISA, ELISPOT, 측면 스틱 분석 또는 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 또는 세포내 플로우 사이토메트리(IC-FACS)와 같은 mRNA 기초한 기술과 같으나 이에 제한되지 않는, 당업자에게 잘 알려진 어떤 사이토카인 또는 케모카인 검출 방법에 의해 결정된다.
항원(예를 들어, 클리미디아 추출 항원 또는 결핵 특이 단백질 또는 이의 유도체)에 대한 반응에서 IP-10의 양은 IP-10 배경 생산을 뺌으로써 결정될 수 있고, 예를 들어 결핵균의 가능한 감염은 이 항원-특이 IP-10 반응에 기초하여 해석된다.
본 발명의 적용에서 결핵 데이터는 현존하는 기술: 전체 혈액이 직접 식염수(닐), TB 특이 펩타이드 항원(Ag) 또는 미토겐(PHA)으로 예비-코팅된 진공채혈관에 직접 채혈되는 QuantiFERON® TB-GOLD In-Tube Test(Cellestis, Carnegie, Australia)를 사용하여 개발된다. 관은 현재의 바람직한 구현예어서 37 ℃에서 18시간 배양되었고, 사이토카인 농도가 Luminex 플랫폼(Luminex Corporation, USA)에서 xMAP 기술에 의해 Biosource 시약(Biosource Camarillo USA)를 사용하여 측정된 후에, 그러므로 더 높은 농도에서 발현되고 더 잘 수행하는, 전통적인 파라미터 IFN-γ로부터 IP-10까지 효과적인 파라미터를 교환할 수 있다.
본 발명의 높은 민감성은 이러한 방법을 어린이/신생아에서의 감염 및/또는 만성 잠복성 감염에서 활성 감염, 잠복성 감염, 근래의 감염 사이를 구별짓기 위한 우수한 도구이다. 그러므로, 일 구현예에서, 본 발명은 닐과 함께 참고-레벨 이상의 항원-의존 IP-10 반응이 포유동물이 활성 감염, 잠복성 감염, 근래의 감염, 및/또는 만성 잠복성 감염을 가지는 것을 확인하는 방법에 관한 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 테스트에 사용된 샘플 물질(예를 들어, 전체 혈액)의 양이 감소되는 방법에 관한 것이다. 전체 혈액이 3 내지 0.1 ㎖ 아래로 내려가는 경우, PBMCs인 경우 세포수가 1×106 내지 0.05×106 범위이다. 이러한 낮은 혈액 부피를 갖는 환자(특히 어린이/유아 또는 빈혈이 있는 사람)에게 적합한 “소형 분석(mini assay)”은 제공자에게 혈역학적 결과가 없이 질병(예를 들어, 결핵)을 진단할 수 있고, 또는 예를 들어 척수액, 늑막액 또는 탯줄로부터의 혈액과 같이 매우 부족한 샘플 물질에서 수행될 수 있기 때문에 혁신적이다.
다른 마커들과의 결합
하나 이상의 다음의 마커와의 결합에서 IP-10의 측정은 잘못된 양성의 수를 감소시키고 식별력을 증가시킬 것이다. 그러므로, 일 구현예에서, 방법은
a) 항원의 자극에 대한 반응에서 IP-10 및 MCP-1 레벨을 결정하는 단계,
b) IP-10과 MCP-1의 결정된 레벨을 결합하는 단계, 및
c) 결합된 참고-레벨과 상기 결합된 레벨을 비교하는 단계를 더 포함한다.
당업자에 의해 이해된 바와 같이, 결합된 참고-레벨은 IP-10 레벨과 건강한 개체군에서 MCP-1 레벨과 같으나 이에 제한되지 않는 어떤 제안된 결합의 마커의 측정에 의해, 상기 결정된 IP-10 및 MCP-1 레벨을 더함과 같으나 이에 제한되지 않는 계산의 수단에 의해 결합함으로써 결정된다. 결합된 참고-레벨은 결합된 참고-레벨의 분배와 관련된 선택된 컷-오프 시점, 예를 들어 건강한 개체군에서 평균 2+ 표준 편차에서 또는 당업자에게 알려진 다른 수단에 의해 결정된다.
나아가 결합의 마커는 IL-2 및 INF-γ를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은
a) 항원의 자극에 대한 반응에서 INF-γ 및 선택적으로 MCP-1 및/또는 IL-2의 레벨을 결정하는 단계,
b) IP-10과 INF-γ 및 선택적으로 MCP-1 및/또는 IL-2의 결정된 레벨을 결합하는 단계, 및
c) 결합된 참고-레벨과 상기 결합된 레벨을 비교하는 단계를 더 포함한다.
일 구현예에서, 방법은
a) 항원의 자극에 대한 반응에서 IP-10 레벨을 결정하는 단계
b) IP-10 레벨과 참고 레벨 또는 그로부터 유래된 값을 비교하는 단계
c) 상기 포유동물이 상기 항원을 이전에 가지고 있어서 항원에 대한 IP-10 반응을 발생시켰는지 아닌지를 결정하는 단계
d) 항원의 자극에 대한 반응에서 MCP-1 레벨을 결정하는 단계
e) MCP-1 레벨과 참고 레벨 또는 그로부터 유래된 값을 비교하는 단계
f) 상기 포유동물이 상기 항원을 이전에 가지고 있어서 항원에 대한 MCP-1 반응을 발생시켰는지 아닌지를 결정하는 단계
g) IP-10 반응과 MCP-1 반응을 결합하는 단계로,
포유동물이 항원을 이전에 가지고 있어서 적어도 하나의 생물학적 마커를 가진 항원에 대한 면역학적 반응을 발생시켰는지 아닌지를 결정하는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 방법은
a) 항원의 자극에 대한 반응에서 IP-10 레벨을 결정하는 단계
b) IP-10 레벨과 참고 레벨 또는 그로부터 유래된 값을 비교하는 단계
c) 상기 포유동물이 상기 항원을 이전에 가지고 있어서 항원에 대한 IP-10 반응을 발생시켰는지 아닌지를 결정하는 단계
d) 항원의 자극에 대한 반응에서 IL-2 레벨을 결정하는 단계
e) IL-2 레벨과 참고 레벨 또는 그로부터 유래된 값을 비교하는 단계
f) 상기 포유동물이 상기 항원을 이전에 가지고 있어서 항원에 대한 IL-2 반응을 발생시켰는지 아닌지를 결정하는 단계
g) 결정된 IP-10 반응과 IL- 반응을 결합하는 단계로,
포유동물이 항원을 이전에 가지고 있어서 적어도 하나의 생물학적 마커를 가진 항원에 대한 면역학적 반응을 발생시켰는지 아닌지를 결정하는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 방법은
a) 항원의 자극에 대한 반응에서 IP-10 레벨을 결정하는 단계
b) IP-10 레벨과 참고 레벨 또는 그로부터 유래된 값을 비교하는 단계
c) 상기 포유동물이 상기 항원을 이전에 가지고 있어서 항원에 대한 IP-10 반응을 발생시켰는지 아닌지를 결정하는 단계
d) 항원의 자극에 대한 반응에서 IFN-γ 레벨을 결정하는 단계
e) IFN-γ 레벨과 참고 레벨 또는 그로부터 유래된 값을 비교하는 단계
f) 상기 포유동물이 상기 항원을 이전에 가지고 있어서 항원에 대한 IFN-γ 반응을 발생시켰는지 아닌지를 결정하는 단계
g) 결정된 IP-10 반응과 IFN-γ 반응을 결합하는 단계로,
포유동물이 항원을 이전에 가지고 있어서 적어도 하나의 생물학적 마커를 가진 항원에 대한 면역학적 반응을 발생시켰는지 아닌지를 결정하는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 방법은
a) 항원의 자극에 대한 반응에서 IP-10 레벨을 결정하는 단계
b) IP-10 레벨과 참고 레벨 또는 그로부터 유래된 값을 비교하는 단계
c) 상기 포유동물이 상기 항원을 이전에 가지고 있어서 항원에 대한 IP-10 반응을 발생시켰는지 아닌지를 결정하는 단계
d) 항원의 자극에 대한 반응에서 INF-γ 및/또는 MCP-1 및/또는 IL-2 레벨을 결정하는 단계
e) INF-γ 및/또는 MCP-1 및/또는 IL-2 레벨과 각각의 생물학적 마커에 대한 참고 레벨 또는 그로부터 유래된 값을 비교하는 단계
f) 상기 포유동물이 상기 항원을 이전에 가지고 있어서 항원에 대한 INF-γ 및/또는 MCP-1 및/또는 IL-2 반응을 발생시켰는지 아닌지를 결정하는 단계
d) 결정된 IP-10 반응 및/또는 INF-γ 및/또는 MCP-1 및/또는 IL-2 반응을 결합하는 단계로,
포유동물이 항원을 이전에 가지고 있어서 적어도 하나의 조사된 생물학적 마커를 가진 항원에 대한 면역학적 반응을 발생시켰는지 아닌지를 결정하는 것을 포함한다.
진단
일 구현예에서, 이전에 언급한 바와 같이, IP-10은 감염과 같은 다양한 면역학적 상태로 추측되는 피실험자의 진단에 사용될 수 있다. 진단에 사용될 때, 본 발명에 따른 방법은 면역학적 상태, 예를 들어 감염의 존재를 결정하는 것을 도울 수 있는데, 대개는 임상의 증상과 그 이상의 실험실 테스트에 의해 달성된다. 테스트는 다양한 단계의 감염, 즉 어떤 증상이 없는 개체가 근래에 갖게 된 감염, 그러한 감염의 증상이 없는 개체가 수년 전에 갖게 된 감염, 환자가 감염에 기인한 증상을 갖는 활성 감염을 진단할 수 있다.
다른 구현예에서, IP-10은 결핵(예를 들어, 활성, 잠복성 또는 근래의 TB 감염)으로 추측되는 피실험자와 특히 잠복성으로부터 활성 결핵으로 진행하는 위험이 증가된 환자, 즉 면역억제 약물을 받는 환자(즉, 단일 클론의 항체 치료(anti-CD20 항체(예를 들어, Rituximabⓒ) 또는 TNF-α 차단 치료(예를 들어, Remicadeⓒ, Enbrelⓒ, Humiraⓒ))) 또는 스테로이드 또는 암-화학요법; 또는 면역억제 상태로 괴로워하는 환자(예를 들어, HIV 감염, 암, IDDM 또는 비-인슐린 의존성 진성 당뇨병(NIDDM), 자기 면역성 상태, 영양실조, 노령, 정맥주사 약물 사용(IVDU) 또는 유전성 면역 장애), 및 근래에 감염된 개체에서 진단에 사용될 수 있다. 사실 다음의 표준 지침에서, 이러한 환자는 약물 치료의 시작 전에 활성, 잠복성 또는 근래의 TB로 스크린되어야할 것이다.
현재 TNF-α 차단 치료에 후보인 환자 또는 TST 또는 결핵균 항원-특이 IFN-γ 테스트에 HIV 양성인 환자를 스크린하는 것이 강력하게 추천된다. 연구들이 이러한 테스트가 상기 언급된 환자 범주에서 믿을 수 없다는 것을 보여준 바와 같이, IP-10은 그것의 더 높은 민감성때문에 더 좋은 후보이다.
다른 구현예에서, IP-10은 클라미디아 감염(예를 들어, 비뇨 생식기 감염, 골반 감염 및/또는 눈에서의 감염)으로 추측되는 개체를 스크린하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 같은 기관 또는 해부 부위를 콜론화하거나, 또는 증상의 공통군을 발생시키는 다양한 감염성 병원균으로부터 항원을 결합하는 것을 허용한다. 다른 특이 항원의 결합에 의해 위험에 처한 환자를 스크린하는 것이 가능할 수 있으며, 또는 비뇨 생식기 감염과 같은 임상의 구별되지 않는 상태를 유발하는 공통 병원균을 제외하거나; 또는 항생제와 같은 동일한 치료에 민감할 수 있다.
그러므로, 일 구현예에서 본 발명은
a) 그것이 필요한 환자로부터 하나의 샘플을 얻고, 상기 샘플을 적어도 분획으로 분할하는 단계
b) 평가를 위해 선택된 특이 감염성 병원균(들)과 관련된 상기 항원을 가진 하나의 분획(반응 분획)을 자극하고, 불활성 용액을 가진 샘플의 제2 분획(닐 분획)을 배양하는 단계
c) 두 분획에서 IP-10 레벨을 측정하는 단계
d) 반응 분획으로부터 결정된 IP-10으로부터 닐-분획에서 결정된 IP-10 레벨을 뺌으로써 샘플의 항원-의존 IP-10 레벨을 결정하는 단계
e) 적어도 하나의 선택된 감염성 병원균에 대한 참고-레벨과 상기 결정된 항원-의존 IP-10 레벨을 비교하는 단계, 및
f) 항원-의존 IP-10 레벨이 참고 분획에서의 IP-10 레벨보다 더 높은 경우, 적어도 하나의 감염성 병원균으로 감염된 것과 같이 그것이 필요한 상기 환자를 조사하는 단계를 포함하는,
적어도 두 개의 감염성 질병에 대하여 동시에 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 방법은 감염성 질병의 위험이 높은 환자, 예를 들어 질병 풍토성 지역을 통하여 체류하거나 또는 여행하는 사람들을 스크리닝하기 위하여 적용될 수 있다.
그러므로, 본 발명의 일 구현예에서 감염성 질병은 말라리아, 결핵, 뇌막염, 일본 뇌염, 콜레라, 리슈마니나(leishmanina), 뎅기열 및 소아마비로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 구현예에서, 감염성 질병은 연성 하감(chancroid), 클라미디아 감염, 임질, 림프육아종 결막염(Lymphogranuloma venereum), 유레아플라즈마 유레알리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 마이코플라즈마 호미니스(Mycoplasma hominis), 트레포네마 팔리덤(Treponema pallidum), B형 간염, 단순 포진 바이러스(Herpes simplex virus), 인간 면역 결핍 바이러스, 인체유두종 바이러스, 연성 종양, 사면발이(Phthirius pubis), 옴진드기(Sarcoptes scabiei) 및 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis)로 이루어진 성적 접촉으로 감염되는 질병으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 감염성 질병은 치료할 수 있는 위장의 감염성 병원균, 예를 들어 시겔라(Shigella), 대장균, 캄필로박터, 비브리오 콜레라 박테리아, 크립토스포리디움 파르붐(Cryptosporidium parvum), 살모넬라 박테리아 및 살모넬라 티피 박테리아로 이루어 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 감염성 질병은 항생제로 치료할 수 없는 위장의 감염성 병원균, 예를 들어 로타바이러스, 노로바이러스, 아데노바이러스, 사포바이러스, 및 아스트로바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 감염성 질병은 예를 들어 혈액 은행에서 스크리닝되는 혈액 관련된 질병: A형 간염, E형 간염, 말라리아, 샤가스병(Chagas Disease), 바베스열원충증(Babesiosis), 리슈만편모충증, 원숭이 포말상 바이러스(Simian foamy virus), 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfelf-Jacob Disease, vCJD), 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob Disease, CJD), 사이토메갈로 바이러스(Cytomegalovirus, CMV) 및 엡스타인 바 바이러스(Epstein-Barr virus)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 구현예에서, 감염성 질병은 박테리아의 뇌수막염, 뇌수막염균(Neisseria meningitides), 폐렴구균, 리스테리아모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 녹농균, 포도상구균, 스트렙토코쿠스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae) 및 헤모필루스 인플루엔자를 초래할 수 있는 박테리아로 이루어진 군으로부터 선택된다.
따라서, 특이 항원의 선택은 당업자가 마이코박테리움 같은 다양한 종 사이에서 구별하는 것을 가능하게 하기 때문에, 종 특이 진단을 하는 것이 본 발명의 목적이다.
예후(prognosis)
일 구현예에서, IP-10은 감염과 같은 다양한 면역학적 상태로 진단된 피실험자의 예후를 예측하는데 사용될 수 있다. 환자 예후에 사용되었을 때, 본 발명에 따른 방법은 감염과 같은 면역학적 상태의 과정과 예상되는 결과를 예측하는 것을 도울 수 있어서 당업자가 적당한 치료 방법을 선택하는데 도움을 주고 상태의 확실한 치료 효과를 예측하는데 도움을 줄 수 있다.
모니터링
일 구현예에서, IP-10은 감염으로 진단된 피실험자를 모니터링하는데 사용될 수 있다. 환자 모니터링에 사용되었을 때, 본 발명에 따른 방법은 예를 들어 감염의 가능한 재발을 모니터링 및 예측하는 치료 동안 및 치료말기에 치료의 효능을 평가하는데 도움을 줄 수 있다.
본 발명에 의한 치료 효능을 모니터하는 가능성은 (예로서 결핵균의 감염을 사용하였을 때) 하기의 사항과 특히 관련된다:
a) 타액 현미경 분석(sputum microscopy), 마이코박테리움 배양, X-ray 또는 다른 방법과 같은 현재 이용할 수 있는 방법 대신에 간단한 혈액 채혈 방법에 의해 수행되기 쉽다.
b) 타액 현미경 분석, 마이코박테리움 배양, X-ray 또는 다른 방법과 비교하여 더 재현성이 있다.
c) 타액 현미경 분석, 마이코박테리움 배양, X-ray 또는 다른 방법, 예를 들어 특별한 폐외결핵으로 의심되는 경우의 생체 분석법, 또는 환자가 타액에 음성인 경우 기관지령분석과 관련된 침습 수술 과정과 비교하여 비용이 많이 들지 않는다.
d) RD1 겹쳐진 펩타이드에 기초한 결핵의 IFN-γ 분석법과 비교하여 더 민감하다.
e) 다른 면역 분석법이 단지 감염 또는 비감염을 구별하는데 반하여 활성 및 잠복성 결핵을 구별할 수 있다.
스크리닝(screening)
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 스크리닝 목적으로 사용된다. 즉, 본 발명에 따른 IP-10 레벨을 측정하는 것과 다양한 감염(예를 들어, 결핵균으로 감염)의 존재 또는 부재를 나타내는 예비-특이 레벨에 대한 측정된 레벨을 관련시키는 것에 의해 감염의 이전 진단 없이 피실험자를 평가하는데 사용된다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 스크리닝을 목적으로 사용된다. 즉, 본 발명을 나타내는 예비-특이 레벨에 따른 IP-10 레벨을 측정하는 것과 다양한 감염(예를 들어, 결핵균으로 감염)의 존재 또는 부재에서 측정된 레벨을 관련시키는 것에 의해 감염의 이전 진단 없으나 잠복성 질병의 재활성화의 위험에 처한 피실험자를 평가하는데 사용된다.
이전에 언급된 바와 같이, 본 발명은 적어도 두 개의 감염성 질병을 동시에 스크리닝하는 방법을 기재한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 방법은 예를 들어 기생충 또는 바이러스에 의해 유발된 감염(들)과 같으나 이에 제한되지 않는 다양한 질병에 대하여 혈액-제공자로부터 혈액을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
접촉 추적(contact tracing)
바람직한 구현예에서, IP-10은 다양한 감염, 예를 들어 결핵균에 노출된 피실험자의 진단에 사용될 수 있다. 접촉 추적에 사용되었을 때, 본 발명에 따른 방법은 감염, 예를 들어 결핵균의 감염의 존재를 결정하는 것을 도울 수 있다.
다른 구현예에서, IP-10은 결핵, 코로나 바이러스(예를 들어, 중증 호흡기 증후군), 인플루엔자, 에볼라(Ebola) 또는 마르부르그(Marburg) 바이러스와 같으나 이에 제한되지 않는 고도의 전염성의 감염의 발생에서 감염에 노출된 피실험자의 진단에 사용될 수 있다. 결핵의 경우: 접촉 추적에서 사용되었을 때, 본 발명에 따른 방법은 대개는 TST 또는 현재의 이용할 수 있는 IFN-γ 방출 분석을 평가함에 의해 달성되는 감염의 존재를 결정하는 것을 도울 수 있다.
향상된 경우 발견
바람직한 구현예에서, IP-10은 감염과 같은 다양한 질병의 진단에 사용될 수 있다. 향상된 경우 발견에 사용되었을 때, 본 발명에 따른 방법은 감염의 미생물학적 증거의 결핍때문에 진단이 어려우나, 대개는 임상의 증상, 치료에 대한 반응, 및 선택적인 진단의 부족을 평가하는 것에 의해서 또는 타액 배양과 같은 시간-걸리는 분석(수주)에 의해 달성되는 현미경 분석 음성 TB와 같으나 이에 제한되지 않는 감염의 존재를 결정하는 것을 도울 수 있다.
발병률 연구(prevalence studies)
바람직한 구현예에서, IP-10은 어린이, HIV 양성 이주자, 피난자, 건강관리사, 학동, 죄수, 실험실 기술자와 같은 관련된 개체군에서의 감염과 같으나 이에 제한되지 않는 다양한 면역학적 상태의 발병률을 연구하는데 사용될 수 있다. 발병률 연구에서 사용되었을 때, 본 발명에 따른 방법은 대개 TST에 의해 달성되는 감염, 예를 들어 개체군에서 잠복성 및 활성 TB를 결정하는 것을 도울 수 있다.
연구 목적
일 구현예에서, IP-10은 마이코박테리아, 그람 양성 박테리아, 그람 음성 박테리아, 리스테리아, 장구균(enterococci), 임균, 비브리오, 트레포네마균(매독), 보렐리아, 렙토스피라(leptospirae), 클라미디아, 레트로바이러스(SIV, HIV-1 및 HIV-2), 중증 호흡기 증후군(SARS) 및 NL-63과 같은 코로나 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 로타바이러스, 메타뉴모바이러스(metapneumovirus), 호흡기 합포체 바이러스(RSV), 수두바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 장내바이러스, 홍역바이러스, 랩도바이러스(광견병)로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물로부터 유래된 잠재하는 새로운 항원을 스크리닝하는 경우, 연구소에 의해 사용될 수 있다. 루비바이러스(풍진), 플라비바이러스(뎅기열, 황열), 헤르페스 바이러스, 바리셀리-조스터 바이러스(varicellea-zoster virus), C형 및 B형 간염, 리슈만편모충, 톡소플라즈마 곤디, 트리파노소마, 플라스모디움(팔시파룸(falciparum), 삼일열 말라리아 원충(vivax), 오발레, 말라리아), 폐포자충(pneumocystis carinii, PCP) 및 다양한 선충류, 흡충류, 이러한 항원들은 예를 들면 지질, 다당류 분자, 단백질 및 펩타이드일 수 있다. 실험실 연구 목적으로 사용되었을 때, 본 발명에 따른 방법은 백신과 진단 테스트의 개발에 적용할 수 있는 조사된 항원, 단백질 또는 펩타이드에 대한 면역 반응을 결정하는 것을 도울 수 있다.
예를 들어 폴리펩타이드와 같은 몇몇 항원 분자는 종 특이 또는 질병-특이로서 확인되나, 생체 내에서 T 세포 반응을 유도할 수 있는 능력은 민감한 마커의 결핍으로 인해 결정하기 어렵다. 그러한 후보 항원으로 자극 후에 결정된 IP-10은 잠재적으로 흥미있는 새로운 항원 또는 분자를 스크린하고 확인하는데 사용될 수 있다. 보다 특별히, 결핵균, 클라미디아 트라코마티스, HIV-1 또는 HCV로부터 유래된 항원의 경우; IP-10은 예를 들어 백신의 개발을 위한 T 세포 반응의 측정과 같이 이러한 항원들의 면역원성을 테스트할 때 연구소에 의해 사용될 수 있다.
치료 효과
본 발명자들은 배양 동안에 자발적인 방출의 반복된 테스트(닐 샘플)와 치료 동안에 항원 유도된 IP-10(Ag 샘플)이 치료 효과에 대한 마커로서 사용될 수 있다는 것을 제안한다. 자발적인 IP-10 반응이 치료 동안에 감퇴하는 경우, 이는 성공적으로 간주될 수 있는 반면, 감퇴가 관찰되지 않는 경우 치료 실패를 의심해보아야 한다.
본 발명자들은 예를 들어 TB 치료 동안에 자발적이고 항원 유도된 IP-10의 반복된 테스트는 치료 효과에 대한 마커로서 사용될 수 있다는 것을 제안한다. 항원-자극된 IP-10 반응이 치료 동안에 감퇴하는 경우, 이는 성공적으로 간주될 수 있는 반면, 감퇴가 관찰되지 않는 경우 치료 실패를 의심해보아야 한다.
본 발명에 따른 결정과 관련하여 여기에서 논의된 어떤 특징 및/또는 측면은 본 발명에 따른 “진단”, “예후”, “모니터링”, “스크리닝”, “연구 목적”, “접촉 추적”, “향상된 경우 발견” 및 “발병률 연구” 및 반대에 대한 유추에 의해 적용되는 것으로 이해되어진다.
배양 단계
CMI 시스템의 세포는 피실험자로부터 채혈 후 확장된 기간 후에 전체 혈액에서 CMI 반응을 상승시키는 능력을 잃고, 중재 없는 반응은 종종 심각하게 감소되거나 채혈 후 24 시간 결핍이며, 거기에서 연장된 방식으로 치료되지 않는다면 세포의 수명은 10 ℃ 이상의 온도에서 보존되어야 하나 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 항원을 가진 샘플의 자극은 내과 의사의 사무소, 진료소, 외래 환자 시설 및 수의 진료소 또는 농장과 같은 보호 위치 지점에서 수행되는 것은 노동의 감소를 준다. 한번 항원 자극이 완료되면, 새로운 활성 세포에 대한 요구는 더 이상 존재하지 않는다. IP-10 및 사이토카인 또는 면역 효과기 분자와 같은 다른 생물학적 마커는 플라즈마드에서 안정하고, 그러므로 샘플은 다른 감염성 질병 또는 다른 질병 진단에 사용된 표준 플라즈마드 샘플에 대한 유사한 방식에서 특별한 상태 또는 빠른 시간 요구 없이 저장되고, 냉동되고 또는 수송될 수 있다.
배양 단계는 5 내지 144시간, 보다 바람직하게는 5 내지 120시간 및 보다 더 바람직하게는 12 내지 24시간 또는 이 사이의 시간 기간일 수 있다. 그러므로, 본 발명의 일 구현예에서, 배양 시간은 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간, 26시간, 30시간, 36시간, 42시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간, 또는 144시간이다.
IP-10은 그러한 고농도로 분비되기 때문에, 샘플을 배양기 밖에서, 즉 실험실 책상 또는 일정한 온도의 항온 수조 또는 수송할 수 있는 운반 장치에서 배양할 수 있다. 이는 기본적인 실험 설비를 갖춘 개발도상국 또는 외래 환자 진료소에서 특히 유용하다.
배양 단계는 20 내지 43 ℃ 범위의 온도에서 수행할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 일 구현예에서, 배양 온도는 16 ℃, 18 ℃, 20 ℃, 22 ℃, 25 ℃, 26 ℃, 27 ℃, 28 ℃, 29 ℃, 30 ℃, 31 ℃, 32 ℃, 33 ℃, 35 ℃, 37 ℃, 38 ℃, 39 ℃, 40 ℃ 또는 41 ℃일 수 있다.
배양 단계는 고정되지 않은 온도 사이에서 수행될 수 있는데, 15 내지 40 ℃, 보다 바람직하게는 18 내지 37 ℃ 및 보다 더 바람직하게는 30 내지 37 ℃일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예는 희석된 샘플에서의 자극이 배양 배지를 세포 배양액으로 부가하여 수행되는 것을 허용한다.
본 발명의 다른 구현예는 샘플의 자극이 비활성 희석 액체(예를 들어, 식염수)를 상기 세포 배양액에 부가하여 수행되는 것을 허용한다.
샘플
본 발명의 일 구현예는 피실험자에서 CMI 반응을 측정하는 방법을 고려하는데, 상기 방법은 상기 샘플이 항원에 자극 후 면역 효과기 분자를 생산할 수 있는 면역 시스템의 세포를 포함하는 상기 피실험자로부터 샘플을 수집하고, 항원과 함께 상기 샘플을 배양하고, 그 후에 상기 면역-효과기 분자의 존재 또는 레벨이 세포-매개 면역 반응을 상승시키는 상기 피실험자의 능력을 나타내는 면역 효과기 분자의 존재 또는 레벨의 상승을 측정하는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 샘플은 혈액, 소변, 늑막액, 기관지액, 구강 세정액, 조직 생체분석액, 복수, 고름, 뇌척수액, 흡인물, 및 여포액으로 이루어진 군으로부터 유래된다.
바람직한 구현예에서, 샘플은 혈액으로부터 유래된다.
그러나, 샘플은 또한 전체 혈액, 늑막액으로부터의 단핵 세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC's), T 세포, CD4 T 세포, CD8 T 세포, 감마-델타 T 세포, 단핵세포, 대식세포 및 NK 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 포함한다.
편리하게, 샘플이 전체 혈액인 경우, 핼액 수집관은 항응고제(예를 들어, 헤파린)로 처리된다. 전체 혈액이 바람직하고 가장 편리한 샘플임에도 불구하고, 본 발명은 늑막액, 복수액, 림프액, 척수 또는 대뇌액, 조직액 및 코, 및 폐액과 같은 호흡기액과 같으나 이에 제한되지 않는 면역 세포를 함유하는 다른 샘플로 확장한다.
일 구현예에서, 본 발명은 그러므로 샘플이 혈액, 소변, 늑막액, 기관지액, 구강 세정액, 조직 생체분석액, 복수액, 고름, 뇌척수액, 흡인물, 및/또는 여포액으로부터 유래된, 방법에 관한 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 그러므로 샘플이 말초 단핵 세포, T 세포, CD4 T 세포, CD8 T 세포, 감마-델타 T 세포, 단핵세포, 대식세포, 수지상 세포 및 NK 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 샘플은 항원, 미토겐 또는 “닐”이 존재하는 세 개의 적절한 용기에 수집될 수 있는 전체 혈액이다. 다른 구현예에서, 항원, 미토겐 또는 “닐”은 샘플, 예를 들어 전체 혈액을 함유하는 분획(alliquot)에 후에 부가될 수 있다.
다른 구현예에서, 샘플은 항원, 미토겐 또는 “닐”을 함유하는 수집관에 수집되거나 또는 항원, 미토겐 또는 닐이 부가된 전체 혈액의 분획에 수집될 수 있는 전체 혈액이다.
일반적으로, 혈액은 항응고제(바람직하게 헤파린, 선택적으로 예를 들어 구연산염 또는 EDTA)의 존재에서 유지된다. 항응고제는 혈액이 부가될 때 혈액 수집관에 존재한다. 혈액 수집관의 사용은 바람직하나 표준 자동화 실험실 시스템에 반드시 양립되는 것은 아니며, 이들은 큰-스케일 및 무작위의 입수 샘플링에서 분석하기 위하여 수정될 수 있다. 혈액 수집관은 또한 취급 비용을 최소화하고 전체 혈액과 플라즈마에 대한 실험실 노출을 감소시키고, 결과적으로 인간 면역 결여 바이러스와 같으나 이에 제한되지 않는 병원균에 걸리는 것으로부터 실험실 인원의 위험을 감소시킨다.
전체 혈액의 분획은 10-4000 ㎕, 예를 들어 50 ㎕, 100 ㎕, 200 ㎕, 300 ㎕, 400 ㎕, 500 ㎕, 600 ㎕, 700 ㎕, 800 ㎕, 900 ㎕, 1000 ㎕, 1100 ㎕, 1200 ㎕, 1300 ㎕, 1400 ㎕, 1500 ㎕, 1600 ㎕, 1700 ㎕, 1800 ㎕, 1900 ㎕, 2000 ㎕, 2100 ㎕, 2200 ㎕, 2300 ㎕, 2400 ㎕, 2500 ㎕, 2600 ㎕, 2700 ㎕, 2800 ㎕, 2900 ㎕ 또는 3000 ㎕와 같으나 이에 제한되지 않는 범위의 부피일 수 있다.
샘플은 관, 조직 배양 웰(well) 또는 다른 용기에서 배양될 수 있으며, 항원, 미토겐 및 “닐”은 적절한 농도로 부가될 수 있다.
혈액 수집-관은 진공채혈관(vaccutainer-tube) 또는 다른 유사한 관을 포함하나, 혈액은 또한 개방형관 또는 모세관으로 직접 채혈될 수 있다.
키트
본 발명은 세포 매개된 반응을 상승시키는 피실헙자의 능력 평가용 키트를 더 고려한다. 키트는 편리하게 혈액 정제된 세포, 생체분석 또는 다른 물질과 같은 피실험자로부터 샘플을 받기 쉬운 하나 이상의 구획을 가진 구획된 형태이다. 구획 또는 또 다른 구획은 또한 샘플이 전체 혈액인 경우 헤파린을 함유하기 쉬울 수 있다.
일반적으로, 키트는 사용 설명서 세트를 가진 판매용으로 포장된 형태이다. 사용 설명서는 일반적으로 피실험자에서 CMI 반응을 측정하는 방법의 형태일 수 있는데, 상기 방법은 상기 샘플이 항원에 의해 자극 후 면역 효과기 분자를 생산할 수 있는 면역 시스템의 세포를 포함하는 상기 피실험자로부터 샘플을 수집하고, 키트와 공급된 항원을 가진 샘플을 배양하고, 그 후에 상기 면역 효과기 분자의 존재 또는 레벨이 세포-매개된 면역 반응을 상승시키는 상기 피실험자의 능력을 나타내는 IP-10의 존재 또는 레벨의 상승을 측정하는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 키트는 항원과 특히 면역-분석법에서 IP-10과 반응하는 단일 클론 또는 다클론성의 항체, 또는 진단 시약으로서의 용도에서 상기 항체의 특이 결합 파편을 함유한다.
본 발명의 고려된 키트는 제1 성분이 다수의 혈액관을 포함하고, 제2 성분이 면역 효과기 분자에 대한 항체-기초한 검출 수단을 포함하고, 및 제3 성분이 (ⅰ) 혈액 수집관에서 혈액을 수집; (ⅱ) 관을 혼합하고; (ⅲ) 관을 배양하고; (ⅳ) 관을 원심분리하여 플라즈마를 수집하고; 및 (ⅴ) 플라즈마 내의 면역 효과기 분자를 검출하는 것을 포함하는 사용 설명서 세트를 포함하는 다중 성분의 형태일 수 있다.
분석은 또한 자동화 또는 반-자동화될 수 있으며, 자동화된 측면은 컴퓨터 소프트웨어로 조절될 수 있다.
본 발명의 분석은 높은 처리량 스크리닝 또는 하나의 피실험자로부터 면역 효과기를 스크리닝하기 위하여 자동화 또는 반-자동화될 수 있다. 자동화는 편리하게 컴퓨터 소프트웨어로 조절될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 IP-10 레벨의 존재 또는 부재를 평가하기 위하여 컴퓨터 프로그램 생산품을 고려하는데, 상기 생산품은 (1) 입력 값으로서, 라벨을 붙인 항체 또는 mRNA와 결합된 리포터 분자의 동일성을 수취하는 코드, (2) 리포터 분자의 레벨 및/또는 리포터 분자가 부착된 분자의 동일성을 결정하기 위하여 상기 입력 값을 참고 값과 비교하는 코드; 및 (3) 코드를 저장하는 컴퓨터 읽기 쉬운 매체를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 IP-10의 존재 또는 부재 또는 레벨을 평가하기 위한 컴퓨터로 확장되며, 상기 컴퓨터는 (1) 기계-읽기 쉬운 데이터로 부호화된 데이터 저장 물질을 포함하는 기계-읽기 쉬운 데이터 저장 수단, 여기서 상기 기계-읽기 쉬운 데이터 Ⅰ은 라벨을 붙인 항체 또는 mRNA와 결합된 리포터 분자를 확인하는 입력 값을 포함한다; (2) 상기 기계-읽기쉬운 데이터를 처리하기 위한 사용 설명서를 저장하기 위한 작동 메모리, (3) 리포터 분자 또는 그들이 부착된 분자의 동일성 또는 레벨의 평가를 제공하기 위한 상기 값을 비교하기 위하여 상기 기계-읽기쉬운 데이터를 처리하기 위한, 상기 작동 메모리와 상기 기계 읽기쉬운 데이터 저장 수단에 연결된 중앙처리장치; 및 (4) 비교의 결과를 수취하기 위한, 상기 중앙처리장치에 연결된 출력 하드웨어를 포함한다.
특이성 및 민감성
어떤 주어진 진단 테스트의 민감성은 테스트에 의해 정확하게 확인되거나 진단된 양성 반응을 가진 개체의 일부를 정의하는데, 주어진 상태의 모든 개체가 양성 테스트를 가지는 경우 예를 들면 민감성은 100%이다. 주어진 차단 테스트의 특이성은 테스트에 의해 정확하게 확인되거나 진단된 상태가 없는 개체의 일부를 반영하는데, 상태가 없는 모든 개체가 음성 테스트 결과를 갖는 경우, 예를 들어 특이성은 100%이다.
민감성은 기술된 본 발명의 방법에 의해 정확하게 확인된(예를 들어, 양성 IP-10 테스트 결과), 주어진 상태(예를 들어, 활성 TB 감염)를 가진 개체의 일부로서 정의된다.
여기서 특이성은 기술된 본 발명의 방법에 의해 정확하게 확인된(예를 들어, 음성 IP-10 테스트 결과), 상태(예를 들어, 활성 TB 감염)가 없는 개체의 일부로서 정의된다.
수용자-반응 특성(Receiver-operating characteristics)
진단 테스트의 정확성은 그것의 수용자-반응 특성(ROC)에 의해 가장 잘 기술된다(특히 Zweig, M. H., 및 Campbell, G., Clin. Chem. 39(1993) 561-577) 참조). ROC 그래프는 관찰된 전체적인 데이터 범위에 걸친 결정 경계를 계속해서 변경하여 생기는 모든 민감성/특이성 짝의 도면이다.
실험실 테스트의 임상 수행은 그것의 진단의 정확성, 또는 피실험자를 임상적으로 적절한 하위 집단으로 정확하게 분류하는 능력에 의존한다. 진단의 정확성은 조사된 피실험자의 두 개의 다른 상태를 정확하게 구별하는 테스트의 능력을 측정한다. 그러한 상태는 예를 들면 건강과 질병, 잠복성 또는 최근의 감염 대 비감염, 또는 양성 대 악성 질병이다.
각각의 경우, ROC 도면은 결정 경계의 완전한 범위에 대한 민감성 대 1-특이성을 그림으로써 두 분배 사이의 중복을 묘사한다. 민감성, 또는 참된-양성 분획[(참된-양성 테스트 결과의 수)(참된-양성의 수 + 잘못된-음성 테스트 결과의 수)로서 정의]은 y-축에 있다. 이는 또한 질병의 존재 또는 상태에서 양성으로서 가르켜진다. 그것은 영향을 받은 하위 집단으로부터 단독으로 계산된다. 잘못된-양성 분획, 또는 1-특이성[(잘못된-양성 결과의 수)/(참된-음성의 수 + 잘못된-양성 결과의 수)]는 x-축에 있다. 그것은 특이성의 색인이고 영향을 받지 않은 하위 집단으로부터 전체적으로 계산된다.
참된- 및 잘못된-양성 분획은 두 개의 다른 하위 집단으로부터 테스트 결과를 사용하는 것에 의해 전체적으로 개별적으로 계산되기 때문에, ROC 도면은 샘플의 질병의 잘병률에 독립적이다. ROC 도면의 각 지점은 특정한 결정 경계에 상응하는 민감성/-특이성 쌍을 나타낸다. 완전한 구별을 가진 테스트(결과의 두 개의 분배에서 중복이 없음)은 참된-양성 분획이 1.0, 또는 100%(완전한 민감성), 및 잘못된-양성 분획은 0(완전한 특이성)인, 상부의 왼쪽 모퉁이를 통하여 통과하는 ROC 도면을 가진다. 구별이 없는(두 집단의 결과의 동일한 분배) 테스트에 대한 이론적인 도면은 하부의 왼쪽 모퉁이로부터 상부의 오른쪽 모퉁이까지 45° 대각선이다. 대부분의 도면은 이러한 두 개의 극단 사이에 떨어진다. (ROC 도면이 완전히 45° 대각선 아래로 완전히 떨어지면, “초과”로부터 “미만” 또는 그와 반대로 “양성도”에 대한 표준을 전환함으로써 쉽게 교정된다.) 정성적으로, 더 가까운 도면은 상부의 왼쪽 모퉁이, 더 높은 테스트의 전체적인 정확도이다.
실험실 테스트의 진단 정확도를 정량하는 하나의 편리한 목적은 단일 수에 의해 그것의 수행을 표현하는 것이다. 가장 보편적인 세계적인 측정은 ROC 도면 하의 범위이다. 협정에 의해, 이런 범위는 항상 0.5 이상이다(그렇지 않은 경우, 하나는 그것을 그렇게 만들기 위한 결정 규칙을 전환할 수 있다). 값은 1.0(두 집단의 테스트 값의 완전한 분리)과 0.5(테스트 값의 두 집단 사이에 명확한 분배적 차이가 없음) 사이에 정렬된다. 범위는 대각선 또는 90% 특이성에서 민감성에 가장 가까운 지점과 같은 도면, 그러나 전체적인 도면의 특정 일부에 단지 의존하지 않는다. 이것은 정량적이고, ROC 도면이 얼마나 완전한 것(범위 = 1.0)에 가까운가의 기술적인 표현이다.
신규한 마커 IP-10의 임상 유용성은 주어진 감염을 위한 다른 진단의 수단과의 비교 및 결합에서 평가될 수 있다. 결핵균으로 감염된 경우, 신규한 마커 IP-10의 임상 유용성은 확립된 진단 도구 확립된 마커 IFN-γ 또는 수용자 반응 도표 분석을 사용한 TST와의 비교에서 평가될 수 있다. 실시예 5를 참조한다.
그러므로, 포유동물이 항원을 가지고 있었는지 아닌지를 검출하는 면역학적 방법을 제공하는 것이 본 발명의 바람직한 구현예의 목적이며, 방법은
a) 상기 포유동물의 샘플에서 항원-특이 IP-10 생산의 레벨을 결정하는 단계
b) 건강한 개체군으로부터 얻어진 IP-10 레벨의 백분위수 도면을 그리는 단계
c) 건강한 개체군에서 결정된 IP-10 레벨 및 문제의 항원에 대한 면역학적 반응을 발생시키는 개체군에서 결정된 IP-10 레벨에 기초한 ROC(receiver operating characteristics) 도표를 그리는 단계
d) 요구된 특이성을 선택하는 단계
e) ROC 도표로부터 요구된 특이성에 상응하는 민감성을 결정하는 단계
f) 백분위수 도면으로부터 결정된 민감성에 상응하는 IP-10 레벨을 결정하는 단계; 및
g) 샘플에서 IP-10 레벨이 결정된 민감성에 상응하는 상기 IP-10 레벨과 같거나 더 높은 경우 항원에 대한 면역학적 반응을 갖는 개체를 예측하고, 샘플에서 IP-10 레벨이 결정된 특이성에 상응하는 상기 전체 IP-10 레벨보다 더 낮은 경우 항원에 대한 면역학적 반응을 가질 것 같지 않거나 갖지 않는 것으로 개체를 예측하는 단계를 포함한다.
그러므로, 포유동물이 항원을 가지고 있었는지 아닌지를 검출하는 면역학적 방법을 제공하는 것이 본 발명의 바람직한 구현예의 다른 목적이며, 방법은
a) 상기 포유동물의 샘플에서 항원-특이 IP-10 생산의 레벨을 결정하는 단계
b) 건강한 개체군으로부터 얻어진 IP-10 레벨의 백분위수 도면을 그리는 단계
c) 건강한 개체군에서 결정된 IP-10 레벨 및 문제의 항원에 대한 면역학적 반응을 발생시키는 개체군에서 결정된 IP-10 레벨에 기초한 ROC(receiver operating characteristics) 도표를 그리는 단계
d) 요구된 민감성을 선택하는 단계
e) ROC 도표로부터 요구된 민감성에 상응하는 특이성을 결정하는 단계
f) 백분위수 도면으로부터 결정된 민감성에 대응하는 IP-10 레벨을 결정하는 단계; 및
g) 샘플에서 IP-10 레벨이 결정된 민감성에 상응하는 상기 IP-10 레벨과 같거나 더 높은 경우 항원에 대한 면역학적 반응을 갖는 개체를 예측하고, 샘플에서 IP-10 레벨이 결정된 민감성에 상응하는 상기 전체 IP-10 레벨보다 더 낮은 경우 항원에 대한 면역학적 반응을 가질 것 같지 않거나 갖지 않는 것으로 개체를 예측하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 특이성은 70 내지 100%, 보다 바람직하게 80 내지 100%, 보다 바람직하게 90 내지 100%일 수 있다. 그러므로, 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 특이성은 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
본 발명에 따른 방법의 민감성은 70 내지 100%, 보다 바람직하게 80 내지 100%, 보다 바람직하게 90 내지 100%일 수 있다. 그러므로, 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 민감성은 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 실시예 5를 참조한다.
IP-10의 레벨은 참고 데이터 또는 피실험자가 증가된 위험에 처해 있거나 또는 예를 들어 감염의 가능성이 있는지 아닌지를 결정하기 위한 컷-오프 값과 같은 참고 값의 세트와 비교된다.
검출 효율을 증가시키기 위하여, IP-10의 혈액 레벨은 피실험자가 감염될 것 같거나 또는 예를 들어 감염을 발전시킬 증가된 위험에 처해 있는지 아닌지를 결정하기 위한 참고 데이터의 세트와 비교될 수 있다.
검출 효율을 증가시키기 위하여, PHA 유도된 IP-10 레벨과 IP-10의 항원 자극된 레벨은 피실험자가 감염을 가지거나 또는 감염 또는 질병을 발전시킬 증가된 위험에 처해 있는지 아닌지를 결정하기 위한 참고 데이터의 세트와 비교될 수 있다.
환자가 예를 들어 감염을 발전시킬 증가된 위험에 처해 있는지 아닌지를 결정하기 위하여, 컷-오프가 확립되어야만 한다. 이 컷-오프는 실험실, 내과 의사 또는 각 환자에 의한 개별사항에 의해 확립될 수 있다.
선택적으로, 컷 지점은 음성 대조구의 평균, 중간 또는 기하평균으로서 결정될 수 있다((예를 들어, 감염되지 않고, 건강하고 노출되지 않고, TB 감염이 없는 환자) +/- 하나 이상의 표준 편차 또는 표준 편차로부터 유래된 값).
항원 공격에 후에, 일부 개체는 생물학적 마커에 강하게 반응하는 반면 다른 것에는 아니다. 예를 들어, 일부 개체는 IP-10 또는 IFN-γ 반응을 나타내지 않을 것이며, 그러므로 낮은 레벨의 IP-10 또는 IFN-γ을 단지 생산한다. 이러한 경우, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 생물학적 마커의 동시의 측정은 분석의 민감성을 증가시키고 양성 반응자의 수를 증가시킬 것이다. 그러므로, IP-10과 IFN-γ, IL-2, 또는 MCP-1과 같으나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 생물학적 마커의 결합에 의해, 단일 생물학적 마커 면역성 결역(anergy)에 보다 적게 공격받기 쉬운 진단 예측을 만드는 것이 가능하다.
다른 구현예에서, IP-10 측정은 하나 이상의 다른 생물학적 마커의 측정과 결합되고, 결합된 참고-레벨과 비교된다. 측정된 생물학적 마커 레벨은 덧셈, 뺄셈, 곱셈과 같은 산술연산, 및 백분율의 산수 처리, 제곱근, 누승법, 및 로그함수에 의해 결합될 수 있다. 다양한 생물학적 마커 결합과 결합된 참고-값을 계산하는 다양한 수단은 당업자에게 알려진 수단에 의해 수행될 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 생물학적 마커의 개체의 측정은(IFN-γ 및/또는 IL-2와 결합에서 IP-10과 같으나 이에 제한되지 않는) 개체의 생물학적 마커 농도가 참고-레벨, 예를 들어 컷-오프 지점과 비교된 후에 결합될 수 있다. 이러한 접근은 단지 몇몇의 항원뿐만 아니라 하나에서 몇몇의 생물학적 마커를 포함하는 테스트 결과를 발생시킨다. 다양한 생물학적 마커 조합과 조합된 참고-값을 계산하는 다양한 수단은 당업자에게 알려진 수단에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 생물학적 마커 IP-10과 MCP-1, IL-2 및 INF-γ로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 생물학적 마커의 결합은 민감성 및/또는 특이성과 관련된 상승적인 효과를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 생물학적 마커 IP-10, MCP-1 및 IL-2의 결합은 민감성 및/또는 특이성과 관련된 상승적인 효과를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 생물학적 마커 IP-10, MCP-1 및 IFN-γ의 결합은 민감성 및/또는 특이성과 관련된 상승적인 효과를 제공한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 생물학적 마커 IP-10, IL-2 및 IFN-γ의 결합은 민감성 및/또는 특이성과 관련된 상승적인 효과를 제공한다.
특히 여기에서 사용된 상승작용은 함께 작용하는 몇몇 생물학적 마커가 단지 분리된 생물학적 마커 민감성 또는 특이성을 이해하는 것에 의해 예측된 것보다 진단에 대한 더 큰 민감성 또는 특이성을 갖는 “결합된 생물학적 마커 신호”를 창조하여, 잘못된 양성의 수를 감소시키고 구별력을 증가시키는 현상을 나타낸다.
ELISA 또는 면역크로마토그래피 스틱 테스트와 같으나 이에 제한되지 않는 판독에 기초한 항체에서; 다른 생물학적 마커를 결합하는 둘 이상의 항체는 여기서 상승작용에서 작용하고 더 강한 반응에 이르게 하는 생물학적 마커의 총 양의 증가된 결합 및 테스트에서의 증가된 민감성을 가능하게 한다. 결합된 판독은 여기에서 기재와 일치하여 수행될 수 있다.
위험 평가
본 발명자들은 항원에 대한 세포-매개 반응을 측정하기 위한 신규 마커를 성공적으로 확인한다. 마커 IP-10의 농도는 항원에 대한 세포 매개 면역-반응을 가진 피실험자에서 증가된다. 그리고 IP-10은 예를 들어 결핵균의 감염의 검출을 위한 효과적인 마커인 것으로 보인다.
민감성은 어떤 다른 확립된 마커보다 더 높고, 특이성은 어떤 다른 확립된 마커와 유사하거나 또는 더 좋다(실시예 4, 5 및 10을 참조한다).
통계적인 추론은 예를 들면 나이, 직업, 노출, 유전적 배경, HLA-유형에 의존하는 질병을 갖는 위험에 기초할 수 있다.
컷-오프 지점은 질병, 직업, 지리학적 거주 또는 노출 위험과 같으나 이에 제한되지 않는 테스트된 개체의 특이 상태에 기초하여 달라질 수 있다.
컷-오프 지점은 나이, 성별, 유전적 배경(즉, HLA-유형), 습득된 또는 유전된 면역 반응이 제대로 발휘되지 못하는 면역 작용(예를 들어, HIV 감염, 당뇨병, 신장 또는 간장 쇠약의 환자, 코르티코스테로이드, 화학 요법, TNF-α 차단제, 유사 분열 억제제와 같으나 이에 제한되지 않는 면역-변형 약물로 치료중인 환자)과 같으나 이에 제한되지 않는 테스트되는 개체의 특이 상태에 기초하여 달라질 수 있다.
그러므로, 결정 또는 컷-오프 제한을 조절하는 것은, 만약 존재한다면 감염의 검출을 위한 테스트 민감성과, 또는 만약 이러한 제한 미만인 경우 감염 또는 질병을 제외하기 위한 그것의 특이성을 결정할 것이다. 그 다음에 원리는 컷-오프 지점을 초과한 값은 증가된 위험을 나타내고, 컷-오프 지점 미만의 값은 감소된 위험을 나타낸다는 것이다.
게다가, 불확정한 결과를 갖는 테스트 샘플은 개별적으로 해석되어야만 한다. 불확정한 결과는 미토겐 자극된 샘플(PHA)에서 IP-10의 뜻밖의 낮은 레벨을 가진 결과로서 정의된다. 불확정한 IP-10 결과에 대한 최종 컷 지점은 특히 컷-오프 레벨이 더 낮은 레벨에서 선택될 수 있는 면역 억제된 연구 집단에 따라 결정될 수 있다.
컷-오프 레벨
당 기술분야의 당업자들에 의해 일반적으로 이해될 수 있는 바와 같이, 세포-매개 면역 반응의 스크리닝 방법은 비교에 의해 결정을 만드는 과정이다. 어떤 결정-만드는 공정에서, 참고-값은 질병 또는 관심의 상태를 갖는 피실험자 및/또는 질병, 감염, 또는 관심의 상태를 갖지 않는 피실험자에 기초한다.
컷-오프 레벨(또는 컷-오프 지점)은 그 이상의 침습적인 진단성 테스트에 대하여 계속되는 피실험자의 수를 포함하는 몇몇의 표준, 예를 들어, 그 이상의 진단성 테스트에 대하여 계속되는 모든 피실험자에 대한 감염을 가지거나 및/또는 발전시키는 평균 위험, 환자 특이 위험이 예를 들어 400에서 1이거나 또는 1:250(단체 또는 개체 피실험자를 스크리닝함에 의해 정의되는 바와 같은)과 같은 특정 위험 레벨보다 더 큰 어떤 피실험자가 그 이상의 침습적인 진단성 테스트에 대하여 계속될 결정 또는 당 기술분야에서 당업자에게 알려진 다른 표준에 기초할 수 있다.
컷-오프 레벨은 테스트된 개체들의 특정 집단과 같으나 이에 제한되지 않는 몇몇의 표준에 기초하여 조절될 수 있다. 예를 들어, 컷-오프 레벨은 면역결여를 갖는 개체 및 활성 질병으로 진행하는 큰 위험에 처한 환자에서 더 낮게 될 수 있으며, 컷-오프 레벨은 활성 질병으로 발전할 낮은 위험에 처한 다른 건강한 개체에서 더 높아질 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 피실험자가 감염을 갖는 경우 결정하는 방법을 개시하는데, 이는
(a) 피실험자로부터 샘플을 얻는 단계, 및
(b) 샘플에 존재하는 IP-10의 농도, 피실험자가 감염을 가질 것 같은 것을 나타내는 선택된 컷-오프와 같거나 더 높은 농도에서 샘플에 존재하는 IP-10 폴리펩타이드의 존재를 정량적으로 결정하는 단계를 포함한다.
보다 특별히, 본 발명의 일 측면은
a) 적어도 하나의 항원을 가진 포유동물로부터 얻어진 샘플을 배양하는 단계
b) 상기 샘플의 IP-10 레벨을 결정하는 단계
c) 결정된 IP-10 레벨과 참고-레벨을 비교하여, 포유동물이 항원에 대한 면역학적 반응을 발생시키는 항원을 이전에 가지고 있었거나 또는 항원에 면역학적 교차 반응을 발생시키는 다른 항원을 이전에 가지고 있었는지를 결정하는 단계를 포함하는 면역학적 방법에 관한 것이다.
보다 특별히, 본 발명의 다른 측면은
a) 어떤 일련의 자극이 없고 항원이 PPD가 아닌 조건 하에 적어도 하나의 항원을 가진 포유동물로부터 얻어진 샘플을 배양하는 단계
b) 상기 샘플의 IP-10 레벨을 결정하는 단계
c) 결정된 IP-10 레벨과 참고-레벨을 비교하여, 상기 포유동물이 상기 항원(들)에 대한 면역학적 반응을 발생시키는 상기 적어도 하나의 항원을 이전에 가지고 있었거나 또는 상기 항원(들)에 면역학적 교차 반응을 발생시키는 다른 항원을 이전에 가지고 있었는지를 결정하는 단계를 포함하는 면역학적 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 샘플을 적어도 2개의 분획으로 분할되고,
a) 어떤 일련의 자극이 없고 항원이 반응 샘플을 발생시키는 PPD가 아닌 조건 하에 적어도 하나의 항원을 가진 포유동물로부터 얻어진 샘플을 배양하는 단계
b) 닐 샘플을 발생시키기 위하여 비활성 용액을 가진 샘플의 제2 분획을 배양하는 단계
c) 두 분획에서 IP-10 레벨을 결정하는 단계
d) 반응 샘플에서 결정된 IP-10으로부터 닐 샘플에서 결정된 IP-10 레벨을 뺌으로써 샘플의 항원-의존 IP-10 반응을 결정하는 단계
e) 항원-의존 IP-10 반응 또는 그로부터 유래된 값과 참고-레벨 또는 그로부터 유래된 값을 비교하는 단계로,
포유동물이 항원을 이전에 가지고 있어서 항원에 대한 면역학적 반응을 발생시켰는지 또는 항원에 대한 면역학적 교차 반응을 발생시키는 다른 항원을 이전에 가지고 있어서 및/또는 감염을 발전시킬 것인지를 결정하는, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.
구별할 수 있는 값은 여기 실시예에서의 상세한 논의로부터 명백한 것과 같은, 파라미터 값과 건강한 대조 개체군과 감염 환자 개체군의 알려진 임상 데이터 간의 관계 분석에 기초한 미리 결정된 특이성 또는 미리 결정된 민감성을 가진 감염된 개체군을 확인하는 구별할 수 있는 값을 결정함에 의하여, 파라미터 또는 건강한 대조 개체군 및 알려진 감염을 가진 개체군에서의 파라미터를 측정함에 의해 결정된 값이다. 이러한 방식으로 결정된 구별할 수 있는 값은 향후 개체 테스트에서 동일한 실험적 설정을 위하여 타당하다.
여기에서(실시예 5)에서 기술된 특이 실험 설정에서, 컷-오프 값으로서 유용한 IP-10의 레벨 경계는 14 pg/㎖ 내지 1000 pg/㎖와 같으나 이에 제한되지 않는 것으로 발견되었다. 바람직하게, 컷-오프는 100-600 범위와 같은 100 pg/㎖와 800 pg/㎖ 사이, 예를 들어 150-400 범위, 예를 들어 150-300 범위, 예를 들어 150-250 범위, 예를 들어 175-215 범위이다.
바람직하게, 컷-오프 값은 180 pg/㎖, 181 pg/㎖, 182 pg/㎖, 183 pg/㎖, 184 pg/㎖, 185 pg/㎖, 186 pg/㎖, 187 pg/㎖, 188 pg/㎖, 189 pg/㎖, 190 pg/㎖, 191 pg/㎖, 192 pg/㎖, 193 pg/㎖, 194 pg/㎖, 195 pg/㎖, 196 pg/㎖, 197 pg/㎖, 198 pg/㎖, 199 pg/㎖, 200 pg/㎖, 201 pg/㎖, 202 pg/㎖, 203 pg/㎖, 204 pg/㎖, 205 pg/㎖, 206 pg/㎖, 207 pg/㎖, 208 pg/㎖, 209 pg/㎖, 210 pg/㎖, 211 pg/㎖, 212 pg/㎖, 213 pg/㎖, 214 pg/㎖, 215 pg/㎖, 216 pg/㎖, 217 pg/㎖, 218 pg/㎖, 219 pg/㎖, 220 pg/㎖, 221 pg/㎖, 222 pg/㎖, 223 pg/㎖, 224 pg/㎖ 또는 225 pg/㎖이다.
샘플의 희석, 인터류킨-2, 인터페론 감마 및/또는 대식세포 주화성 단백질-1과 같으나 이에 제한되지 않는 다른 파라미터와 결합된 측정, 또는 다른 파라미터는 본 명세서의 기재에 따라서 결정될 수 있는, 다른 컷-오프 값을 초래할 것이다. 다른 실험 설정, 다른 샘플, 다른 항원, 및 다른 파라미터는 물론 표준 설계 순서 또는 일상의 실험에 의해 당 기술분야의 당업자에 의해 여기에서의 기재에 따라 결정될 수 있는, 다른 컷-오프 값을 초래할 것이다.
유도된 항원 특이 생물학적 마커 레벨의 레벨은 또한 자극을 위해 선택된 항원에 의존한다. 일부 항원은 다른 것보다 더 강력한 유도물질이나, 또한 다른 이용할 수 있는 항원, 즉 펩타이드의 수는 반응하는 세포의 증가된 수와 더 높은 생물학적 마커 생산을 초래할 것이다. 그러므로, 컷-오프 지점은 또한 항원-의존적이고 질병 의존적이다. 게다가, 다른 종은 다른 주요한 면역적합성 항원 레퍼토리를 가지므로, 다른 종에서 테스트된 동일한 항원은 종-특이 컷-오프를 초래할 것이다.
생물학적 마커 농도의 측정은 국제 단위(IU)로 변경될 수 있다. IU는 생물학적 마커의 생물학적 활성에 관한 것이고, 다양한 측정 방법 간의 벤치마크에 대한 참고이다. 본 발명의 다른 구현예에서, 결정된 컷-오프 값은 자극-색인(비-자극된 플라즈마 농도에 의해 분할된 항원-자극된 IP-10 농도로 정의된)과 결합될 수 있다.
자극-색인 값은 1 내지 6 또는 그 이상의 범위로 알려져 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 자극-색인은 적어도 1.25, 1.5, 1.75, 2, 2.25, 2.5, 2.75, 3, 3.25, 3.5, 3.75, 또는 4이다. 본 발명은 수백배의 범위 내의 자극-색인 값조차도 개시한다. 그러므로, 적어도 10, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 또는 심지어 1000의 자극-색인 값이 고려된다.
컷-오프와 자극-색인은 잠복성 감염, 근래의 감염, 준-임상의 감염 또는 활성 감염에 대하여 다를 수 있다. 보다 특별히, 결핵균으로 감염된 경우, 컷-오프 값과 자극-색인은 예를 들면 특별한 폐외 TB, 폐 TB, 또는 양쪽, 치료된 감염, 잠복성 TB에 대하여 다를 수 있다. 컷-오프와 자극-색인, 변화의 레벨은 HIV, 다른 동시-감염, 면역 억제의 존재에서 발견되는 감염에서 다를 수 있다.
발병률 또는 질병의 존재의 기대되는 발병률에 의존하기 때문에, 컷-오프 레벨 및/또는 자극-색인은 질병의 혹독성과 환자가 테스트에 대하여 양성인지 또는 테스트에 대하여 음성인지를 결정하는 결과에 의존하는, 원하는 바와 같은 거의 없는 잘못된 양성 또는 거의 없는 잘못된 음성과 같이 얻기 위하여 조절될 수 있다. 결핵의 경우에, 이 발명에서 제안된 분석은 현재 이용할 수 있는 다른 생체 내에서의 테스트에 대하여 명확한 이점을 가진다. 항원-특이 IP-10 생산은 생산된 IFN-γ보다 더 높고(실시예 4 및 17 참조), 컷-오프와 자극-색인은 진단을 위한 기회를 넓히는 더 넓은 범위로 조절될 수 있다.
증상을 가진 단일 환자가 진단되거나 또는 테스트가 개체군으로부터 많은 수의 개체를 스크리닝하는데 사용되는 경우, 컷-오프 레벨은 다를 수 있다.
컷-오프와 자극-색인은 결합된 IP-10 측정과 인터류킨-2, 인터페론 감마(INF-γ) 및/또는 단핵세포/대식세포 주화성 단백질-1(MCP-1)과 같으나 이에 제한되지 않는 다른 생물학적 마커의 측정에 기초할 수 있다. 복합의 컷-오프 및/또는 자극-색인은 본 발명의 기재에 따라서 결정될 수 있는, 다른 값을 초래할 수 있다.
이러한 분석물의 레벨을 측정하기 위한 어떤 알려진 분석 방법이 본 발명에서 작용할 것이 당 기술분야에서 당업자에게는 분명한 것임에도 불구하고, 각각의 마커를 위해 사용된 분석방법은 특정 마커를 위한 참고 데이터를 발생시키는데 사용된 동일한 방법이어야 한다. 새로운 분석 방법이 특정 마커 또는 마커의 결합을 위해 사용되는 경우, 방법과 함께 발전된 데이터에 기초한, 새로운 참고 데이터 세트가 발생되어야만 한다.
다변수 DISCRIMINANT 분석 및 다른 위험 평가는 상업적으로 이용할 수 있는 컴퓨터 프로그램 통계 패키지 Statistical Analysis System(SAS Institute Inc.에 의해 제조 및 판매되는)에서 또는 당 기술분야의 당업자에게 알려진 다변수 통계학적 분석의 다른 방법 또는 다른 통계학적 소프트웨어 패키지 또는 스크리닝 소프트웨어에 의해 수행될 수 있다.
당 기술분야의 당업자에게 분명한 바와 같이, 위에서 논의된 어떤 구현예에서, 양성 테스트의 위험 컷-오프 레벨을 변경하거나 또는 개체군의 다른 하위 집단에 적용할 수 있는 다른 선험적인 위험을 사용하는 것은 각각의 환자에서 판별할 수 있는 분석의 결과를 변경할 수 있다.
여기에서 기술된 안정성 테스트은 IP-10이 일상적 처리(즉, 냉동 또는 상온 및 10 ℃ 미만의 온도에서 장기간 동안 저장)로 높게 안정하다는 것을 제안하며; 그러므로, 본 발명자들은 IP-10이 임상의 용도에서 매력적인 분석물이라고 결론짓는다. 여기에서 제안된 데이터는 IP-10이 감염성 질병의 예후, 진단, 모니터링 및 스크리닝에서의 용도로 잠재적으로 가치있는 마커라는 것을 제안한다.
세포-매개 면역 반응의 임상적 혹독성을 결정하기 위하여, 측정된 IP-10의 검출할 수 있는 신호를 평가하기 위한 수단은 참고 또는 참고 수단을 포함한다.
참고는 또한 분석 및 방법 변화, 키트 변화, 조작 변화, IP-10과 다른 생물학적 마커를 결합하는 것과 관련된 변화, 및 IP-10에 직접적 또는 간접적으로 관련되지 않은 다른 변화에서 계산하는 것을 가능하게 만든다.
본 발명의 명세서에서, 용어 “참고”는 다른 값 또는 특징이 비교될 수 있는, 예를 들어 표준 도표에 대한, 양, 질 또는 유형과 관련된 표준에 관한 것이다.
참고 데이터는 세포-매개 면역 반응(또한 영향받은, 노출된, 백신 접종된, 감염된 또는 질병에 걸린과 같이 언급되는)을 갖는 피실험자에 대한 IP-10 레벨 및/또는 정상의 피실험자(또는 영향받지 않은, 노출되지 않은, 백신 접종되지 않은, 감염되지 않은, 또는 건강한과 같이 언급되는)의 IP-10 레벨을 반영한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 장치는 분석, 면역분석, 스틱, 건조-스틱, 전기 장치, 전극, 판독기(분광광도 판독기, RI-판독기, 등방성 판독기 및 유사한 판독기), 조직 화학(histochemistry), 및 참고, 여과지, 육안으로 볼 수 있는 색상 반응과 통합된 유사한 수단으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
IP-10
IFN-γ 유도성 단백질 10(IP-10) 또는 CXCL10은 케모카인이다. IP-10 유전자는 본래의 장소에 혼성화에 의하여 4q21에 배치된다. IP-10 발현은 인테페론(IFNs, 즉 인터페론 감마(IFN-γ))과 염증성 자극에 의해 상향 조절되고, 그것은 다양한 조직과 세포 유형에서 많은 Th1-유형 염증 질병에서 발현된다.
인간 유전자 서열은 유전자 은행의 ACCESSION 번호 BC010954(gi15012099) 하에서 발견될 수 있다.
케모카인은 7-막전위, G 단백질-결합된 수용체의 하부세트와 상호작용을 통하여 다양한 유형의 백혈구의 세포 교환(cell trafficking)을 조절하는, 작고, 대개 기본적이고, 구조적으로 관련된 분자의 집합이다. 케모카인은 또한 발전, 항상성, 및 면역 시스템의 작용에서 기본적인 역할을 하며, 혈관생성 또는 혈관경련에 관련된 내피 세포에서 뿐만 아니라 중추신경계의 세포에서 효과를 가진다. 케모카인은 2개의 주요 아과, CXC 및 CC로 분할되고, 4-보존된 시스테인 잔기의 처음 2의 배열에 기초하며; 2 시스테인은 CXC 케모카인에서 단일 아미노산에 의해 분리되고 CC 케모카인에 가까워진다. CXC 케모카인은 나아가 근접한 글루탐산-류신-아르기닌(glu-leu-arg) 서열과 CXC 시작으로의 N 말단의 존재 또는 부재에 기초한 ELR 및 비-ELR 유형으로 다시 분할된다. ELR 유형은 호중성인 반면, 비-ELR 유형은 림프구에 주화성이다.
IP-10은 골수 군체 형성을 억제하고, 생체 안에서의 항암성 활성을 가지고, 인간 단핵세포와 T-세포에 대한 케모어트랙턴트(chemoattractant)이며, 내피세포에 T 세포 부착을 촉진한다. IP-10은 생체 안에서 혈관생성의 강력한 억제제이다. IP-10은 염증과 종양 형성 동안에 혈관생성에 관여할 수 있다. IP-10은 또한 RAS 표적 유전자이고, 대부분의 직장암의 경우에 과발현된다. 핵자기공명 분광기의 사용은 IP-10이 IL8과 같은 다른 케모카인의 상호작용 표면과 유사한, IP-10의 N-루프와 40s-루프 지역에 의해 형성된 소수성 틈을 경유하여 CXCR3의 N 말단과 상호작용하는 것을 보여주었다. 상호작용의 부가적인 지역은 N-말단과 IP-10의 30s 루프에 의해 형성된 소수성 틈으로 이루어진 것으로 발견되었다. 30s 루프와 관련된 메카니즘과 베타 가닥 2의 배열은 CCR3를 가진 IP-10의 상호작용과 혈관생성 작용을 설명할 수 있는 것을 제안한다.
결핵의 경우에, 높은 레벨의 IP-10은 림프 노드와 폐 결핵 육아종에서, 늑막 유출물에서 및 TB 환자와 면역 재구성 증후군을 경험하는 TB-HIV 동시 감염된 혈청 또는 플라즈마에서 발견되었다.
IP-10 레벨 결정
면역 효과기 분자는 바람직하게 IP-10과 같으나 이에 제한되지 않는 사이토카인이다. 면역 효과기의 존재 또는 레벨은 분자 그 자체의 또는 유전자가 발현되는 범위까지의 레벨에서 결정될 수 있다. IP-10 레벨은 보편적인 분석 방법, 예를 들어 당 기술분야에 알려진 면역학적 방법에 의해 측정된다.
면역-효과기의 측정은 유전자, RNA, 또는 여기에서 기재에 따른 단백질 레벨에서 다른 면역 효과기의 측정과 결합될 수 있다.
위에서 언급된 바와 같이, 면역 효과기 분자의 검출은 단백질 또는 핵산 레벨에서 만들어질 수 있다. 결과적으로, 상기 면역 효과기의 존재 또는 레벨에 대한 참고는 직접 및 간접 데이터를 포함한다. 예를 들면, 높은 레벨의 IP-10 mRNA는 IP-10의 증가된 레벨을 보여주는 간접적인 데이터이다. 면역 효과기에 대한 리간드는 이러한 분자들의 검출 및/또는 정량화에 특히 유용하다.
면역 효과기에 대한 항체는 특히 유용하다. 여기에서 고려된 분석을 위한 기술은 당 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들면, 샌드위치 분석, xMAP 멀티플렉싱, Luminex, ELISA 및 ELISpot을 포함한다. 항체에 대한 참고는 항체, 포유류화된(예를 들어 인간화된) 항체, 재조합 또는 합성 항체 및 혼성 및 단일 사슬 항체의 일부를 포함한다.
다클론성 및 단클론성 항체는 면역 효과기 또는 이것의 항원성 분획과의 면역조치에 의해 얻어질 수 있고, 양쪽 유형은 면역분석에 이용될 수 있다. 두 유형의 혈청을 얻는 방법은 당 기술분야에 잘 알려져 있다.
다클론성 혈청은 덜 바람직하나, 면역 효과기, 또는 이것의 항원성 일부의 효과적인 양을 가진 적당한 실험실 동물의 주입하고, 동물로부터 혈청 또는 플라즈마를 모으고 어떤 알려진 면역-흡착제 기술에 의해 특정 혈청을 분리함에 의해 상대적으로 쉽게 제조된다. 이러한 방법에 의해 생산된 항체는 사실상 어떤 유형의 면역분석에서 이용할 수 있음에도 불구하고, 그것들은 생산품의 잠재적인 이질성때문에 일반적으로 덜 지지된다.
면역분석에서 단클론성 항체의 사용은 그것들을 큰 양으로 생산할 수 있는 능력과 생산품의 균일성때문에 특히 바람직하다. 불사의 세포계와 면역성 제조에 대한 민감화된 림프구를 용해하는 것에 의해 유도된 단클론성 항체 생산을 위한 하이브리도마(hybridoma) 세포계의 제조는 당 기술분야의 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해 행해질 수 있다.
검출은 또한 경쟁적인 형광 편광 면역분석(CFIPA)에서 특이 항체를 사용하는 IP-10의 직접적인 측정 또는 유도된 형광 편광(DIFP) 이량체화에 의한 인터페론-감마의 균일이량체화(homodimerization)의 검출에 의해 얻어질 수 있다. 양 쪽의 경우, 검출 및 정량화는 6 pg/㎖ 아래로 또는 미만일 것이다.
제공된 실시예 물질에서 현재 사용된 방법에서, 분석의 검출 제한은 6 pg/㎖이고, 변경되는 경우 이는 더 낮아질 것이다.
샘플 물질이 희석되는 경우, 상기 샘플에서 IP-10 농도는 더 낮아질 것이나, 여전히 검출할 수 있다(실시예 9 참조). 다른 실험 설정과 다른 파라미터는 여기에서 기재에 따라 결정될 수 있는, 다른 값을 초래할 것이다.
몇몇 기술은 IP-10과 같은 생물학적 마커의 검출을 위한 당업자에게 알려져 있다. 면역 효과기의 존재 또는 레벨은 ELISA, Luminex, ELISPOT, RT-PCR 또는 세포내 플로우 사이토메트리와 같은 mRNA 기초한 기술들에 의해 결정될 수 있다.
Luminex
인터페론 감마(IFN-γ)는 감염성 질병 면역학과 특히 TB 면역학에서 Th1 반응을 위한 금 표준(gold standard)이었다. Liminex에 의해 결정된 IFN-γ는 Quantiferon 테스트를 위해 개발된 상업적인 ELISA와 비교되는 낮은 민감성 때문에 열등한 마커이다(실시예 10 참조). 그러나, IP-10은 Luminex에 의해 쉽게 검출되고, 그러므로 Luminex 시스템에서 조사 또는 스크리닝 수단으로서 IFN-γ를 대체할 수 있다.
아래의 일부 실시예를 위해서 제공된 데이터는 플로우 사이토메트리를 거친 용액에서 분석물의 멀티플렉싱을 허용하는 Luminex의 사용에 의해 발생된 것이다. 적절한 기술의 사용에 의해, Luminex는 두 개의 형광 염료의 다른 비율을 결합함에 의해 xMAP 미소구체를 내부적으로 색상 부호화한다. R-피코에리트린(phycoerythrin)-라벨된 검출 항체의 사용은 대응하는 형광 강도의 측정에 의해 미소구체 표면에서 일어나는 항원-항체 반응의 정량화를 허용한다.
시스템은 작은 부피에서 많은 샘플을 측정할 수 있고, 100까지의 다른 분석물은 단일 50 ㎕ 샘플에서 동시에 측정될 수 있다.
현재의 데이터는 Biosource 프로토콜에 따라서 얻어졌다. 간단하게, 개체의 IP-10으로부터의 비드 현탁액, 및 IFN-γ 키트는 예비-적셔진 필터 96 플레이트 웰에 결합되었다. 비드는 세척 용액으로 두번 세척되었고, 배양 버퍼가 부가되었다.
샘플(여기서 4-50 ㎕)는 분석 희석에서 1:32, 1:10, 1:8 또는 1:1로 희석되고 플레이트에 부가되었다. 플레이트는 타이터 플레이트 진탕기(titer plate shaker)에서 60 rpm으로 상온에서 2시간 동안 배양되었다. 두 번 세척한 후에, 웰마다 100 ㎕ 검출 항체 혼합물이 부가되었고, 플레이트는 타이터 플레이트 진탕기에서 상온에서 1시간 동안 배양되었다. 두 번 세척한 후에, 100 ㎕ 스트렙아비딘(strepavidin)-RPE 용액이 웰마다 부가되었다. 최종적으로, 30분 배양하고 세번 세척한 후에, 세척 용액 100 ㎕가 각각의 웰에 부가되었고, 플레이트는 Luminex의 XY 플랫폼에 위치되었다.
각각의 웰로부터, 최소 100 분석물 특정 비드가 비드- 및 RPE 형광을 위하여 분석되었다.
ELISA
아래의 일부 실험예를 위해 제공된 데이터는 Biosource 프로토콜에 따른 ELISA의 사용에 의해 발생되었다. 샘플(5 내지 50 ㎕)은 IP-10 항체를 가진 미리 로드된 96 평평한 바닥의 플레이트의 웰에 부가되었다. 비오틴 컨쥬게이트(Biotin Conjugate) 50 ㎕가 모든 웰에 부가되었다. 플레이트는 덮여지고, 웰의 내용물이 흡입되고 작업 세척 버퍼(Working Wash Buffer)로 4x 세척되기 전까지 3시간 동안 상온에서 배양되었다. 그 다음에, 희석된 스트렙타비딘-HRP 100 ㎕가 웰에 부가되고, 플레이트는 덮여지고 상온에서 30분 동안 배양되었다. 그 다음에, 50 ㎕의 고정화 색원체(Stabilized Chromogen)가 각각의 웰에 첨가되고 플레이트가 빛으로부터 보호되어 30분 동안 상온에서 배양되기 전에 웰이 흡입되고 작업 세척 버퍼로 4x 세척되었다. 최종적으로, 100 ㎕ 정지 용액(Stop Solution)이 각각의 웰에 부가되고, 플레이트는 450 ㎚에서 ELISA 판독기에서 판독되었다. 면역크로마토크래프 테스트(ICT).
면역크로마토크래프 테스트(ICT)
테스트 원리: ICT(예를 들어, 측면의 스틱)은 첫째의 항체(Ab)와 IP-10을 위한 하나에서 네개의 두번째 Ab의 모든 특이를 사용하는 생체 안에서의 면역진단 테스트이다. 첫번째 Ab는 콜로이드형 금에 부착되고 고정된 선에서 하나의 두번째 Ab를 함유하는 레인을 가진 샘플 패드 안에 주입되었다.
첫번째 단계에서, 배양된 샘플은 샘플 패드의 왼쪽 부분에 부가되었다. 혈청 또는 플라즈마는 콜로이드형 금-라벨된 첫번째 Ab에 결합하기 위하여 존재하는 어떤 IP-10을 허용하는 레인 안에서 앞으로 흐를 것이다. 두번째 Ab는 레인의 막을 가로지르는 선에서 고정화된다. 카드가 닫히게 되면, 샘플과 패드의 레인의 라벨된 첫번째 Ab는 막의 끝에 접촉한다. 샘플과 라벨된 첫번째 Ab는 그 다음에 고정화된 두번쩨 Ab 라인을 가로지르는 막 레인을 따라서 이동한다. 테스트 해석: 금-라벨된 첫번째 Ab와 복합된 어떤 IP-10은 막의 두번째 Ab에 의해 포획되고, 색상 변화는 선에서 일어난다. 그 다음에, 테스트는 a. 색상 강도에 기초하거나 또는 b. 두개의 테스트를 비교함으로써 해석되는데, 하나는 반응 샘플(예를 들어, 전체 혈액과 같은 항원 자극된 테스트 물질의 플라즈마)에서 수행되고, 하나는 닐 샘플에서 수행되고, 하나는 Ag 테스트에서의 색상 변화의 강도로부터 닐 테스트에서의 색상 변화의 강도를 빼고, 이를 참고와 비교한다.
테스트의 판독은 또한 컴퓨터화된 인터페이스를 사용하는 자동화 또는 반-자동화일 수 있다. 이러한 설정은 자동화된 인터페이스가 라인의 색상 변화의 강도를 결정하기 위하여 구성될 수 있다.
감염
본 발명의 일 측면은 참고-레벨 이상의 항원-특이 IP-10 반응이 포유동물이 항원을 이전에 가지고 있었거나 또는 예를 들어 활성 감염, 활성 무증상 감염, 근래의 또는 잠복성 감염 또는 백신 접종된 것과 같은 감염성 단계 때문에 항원에 대한 교차 반응을 발생시키는 다른 항원을 이전에 가지고 있었는지를 나타내는 방법에 관한 것이다.
미생물
본 발명에 따르면, 감염은 박테리아, 기생충, 진균류, 바이러스, 프라이온, 및/또는 비로이드와 같으나 이에 제한되지 않는 미생물에 의해 발생될 수 있다.
현재의 바람직한 구현예에서, 미생물은 마이코박테리아, 그람 양성 박테리아, 그람 음성 박테리아, 리스테리아, 장구균, 임균, 비브리오, 트레포네마균(매독), 보렐리아, 렙토스피라, 클라미디아, 레트로바이러스(SIV, HIV-1, HIV-2), 사이토메갈로바이러스, 수두바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 장내바이러스, 모르빌리바이러스, 랩도바이러스(광견병), 루비바이러스(풍진), 플라비바이러스(뎅기열, 황열), 헤르페스 바이러스, 바리셀리-조스터 바이러스, C형 및 B형 간염, 리슈만편모충, 톡소플라즈마 곤디, 트리파노소마, 플라스모디움(팔시파룸, 삼일열 말라리아 원충, 오발레, 말라리아), 폐포자충(PCP), 코로나바이러스(예를 들어, 중증 호흡기 증후군(SARS)), 에볼라 또는 마르부르그 및 다양한 선충류, 흡충류로 이루어진 군으로부터 선택된다.
보다 더 바람직한 구현예에서, 미생물은 마이코박테리아, 리슈만편모충, 클라미디아, 트리파노소마편모충 및 주혈흡충으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
감염이 마이코박테리아에 의해 유발되거나 유발되었던 경우, 상기 마이코박테리아는 결핵 복합균(결핵균, 소결핵균 및 마이코박테리아 아프리카눔), 판별 부위(RD1)가 삭제되지 않은 마이코박테리아(마이코박테리아 칸사시이, 마이코박테리아 스줄가이, 마이코박테리아 마리눔, 마이코박테리아 플라베센스, 마이코박테리아 가스트리), 인간에 발병성 마이코박테리아(마이코박테리아 아비움 및 나병균) 및 다른 비-결핵균에 속한다.
그러므로, 현재 바람직한 일 구현에에서, 마이코박테리아는 결핵균이다.
감염이클라미디아에 의해 유발되거나 또는 유발되었던 경우, 상기 클라미디아는 클라미디아 트라코마티스, 클라미디아 무리다룸 및 클라미디아 수이스, 클라미디아성 폐렴균 및 클라미디아 시타시로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 클라미디아는 클라미디아 트라코마티스이다.
백신
본 발명의 일 측면은 참고-레벨 이상의 항원-의존 IP-10 반응이 포유동물이 항원을 이전에 가지고 있었거나 또는 여기에 언급된 어떤 미생물에 대한 백신접종 때문에 항원에 대한 교차 반응을 발생시키는 항원을 이전에 가지고 있었는지를 나타내는 방법에 관한 것이다.
생명력 없는 물질에 기초한 백신에 대한 반응은 항원-특이 IFN-γ 방출의 낮은 레벨로 유발시킬 수 있으며, IP-10이 높은 양으로 방출되기 때문에 임상 전의, 임상 시도, 및 그 다음에 환경에서 백신 반응을 검출하기 위하여 사용될 수 있다.
결핵
결핵(통상 TB로 생략됨)은 가장 보편적으로 폐에 영향을 미치며(폐 TB), 또한 신체의 모든 다른 기관, 예를 들어 중추신경계(뇌막염), 림프계, 순환계(속립 결핵), 비뇨생식계, 뼈 및 관절에 영향을 미칠 수 있는, 결핵균 박테리아에 의해 야기되는 감염성 질병이다. 결핵균의 감염은 또한 보편적으로 잠복성, 잠복 중인 또는 준-임상의 TB 감염으로 알려진 무증후성 단계로 남을 수 있다.
현재의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 다양한, 예를 들어, 결핵의 뚜렷한 제시: 활성 결핵 질병, 활성 현미경 양성 또는 현미경 음성 TB 감염, 잠복성 결핵 감염, 및 근래의 결핵 감염의 진단과 모니터링 방법에 관한 것이다.
면역 분석은 MTB의 분비 단백질의 선택된 펩타이드 서열에 반응하는 항원을 주는 세포(예를 들어, 단핵세포/대식세포)와의 상호작용에서 항원-특이 T 림프구에 의한 IP-10 생산의 평가에 기초한다. 이러한 펩타이드 서열은 그들의 면역원성 및 그들의 특이성을 고려하여 선택되어질 수 있으며, 잠재적으로 다른 펩타이드가 유사하게 사용될 수 있다.
방법과 키트는 타액-양성 폐 결핵을 가진 환자의 건강한 접촉에서 근래의 감염의 진단, 잠복성 감염을 가진 건강한 사람의 진단, 폐 또는 폐외-결핵의 경우 치료에 대한 반응 및 잠복성 감염과 활성 결핵 질병 상태 사이에서 구별하기 위한 모니터링과 같은 활성 결핵 질병의 진단을 위하여 사용될 수 있다.
클라미디아
클라미디아는 클라미디아문에 속하는 어떤 박테리아로의 감염에 대한 보편적인 용어이다. 클라미디아 트라코마티스는 인간의 눈과 생식기 질병의 주요한 감염 요인이다. 클라미디아 트라코마티스는 단지 인간 세포 안에서 사는 것으로 자연스럽게 발견되고, 세계 사람들에서 가장 보편적인 성적 접촉으로 감염되는 병 중의 하나인데, 약 사백만의 클라미디아 감염이 미국에서 매년 발생한다. 모든 감염된 사람이 감염 증상을 나타내는 것은 아니다. 클라미디아에 감염된 약 절반의 남성과 3/4의 여성은 증상을 갖지 않고 그들이 감염된 것을 모른다. 이것은 심각할 수 있으나, 제때에 검출되는 경우 항생제로 쉽게 치료된다. 동등하게 중요한, 눈의 클라미디아 감염은 세계에서 예방가능한 시각상실의 가장 보편적인 요인이다.
현재의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 클라미디아 감염의 진단과 모니터링의 방법에 관한 것이다.
면역 분석은 펩타이드와 같으나 이에 제한되지 않는 미정제의 항원 또는 정제된 항원에 반응하는 항원제시세포(예를 들어, 단핵세포/대식세포)와의 상호 작용에서 항원-특이 T 림프구에 의한 IP-10 생산의 평가에 기초한다. 잠재적으로 펩타이드 서열은 그들의 면역원성 및 그들의 특이성을 고려하여 선택될 수 있으며, 잠재적으로 다른 펩타이드가 유사하게 사용될 수 있다.
항원
본 발명에 적합한 항원, 또한 테스트-항원(들) 및 평가를 위해 선택된 항원으로 불리우는 항원의 선택은, 당업자가 평가하기 좋을 수 있는 감염의 유형에 의존하며, 따라서 선택된 항원은 질병과 관련된다. 예를 들어, MTB 감염을 모니터링하는 경우, 어떤 이용할 수 있는 MTB 항원은 필요한 반응 및 반대의 반응을 발생시킬 수 있다. 몇몇의 항원은 존재하는 상업적 분석에서 이미 사용된다. 본 발명에 따른 테스트-항원(들)과 관련하여 위 또는 아래에서 논의된 어떤 형태 및/또는 측면은 평가를 위해 선택된 항원에 대한 유추에 의해 적용하는 것으로 이해되었다.
감염이 결핵과 관련된 것으로 생각되는 경우, 항원 또는 적어도 하나의 항원은 RD-1 항원, ESTA-6, CFP10, TB7.7, Ag 85, HSP-65, Ag85A, Ag85B, MPT51, MPT64, TB10.4, Mtb8.4, hspX, Mtb12, Mtb9.9, Mtb32A, PstS-1, PstS-2, PstS-3, MPT63, Mtb39, Mtb41, MPT83, 71-kDa, PPE68 및 LppX로 이루어진 군으로부터 선택된다.
현재 바람직한 구현예에서, 항원 또는 적어도 하나의 항원은 ESTA-6, CFP-10, TB7.7, Ag 85, HSP-65 및 RD-1 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 구현예에서, 항원은 ESTA-6이다.
본 발명의 구현예에서, 항원은 CFP-10이다.
본 발명의 다른 구현예에서, 항원은 TB7.7이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 항원은 RD-1 항원이다.
몇몇 연구소는 소위 미생물- 또는 질병-특이 항원으로 불리는 개체의 감염성 병원균에 의해 중요하게 발현된 항원의 동일성에 대하여 연구한다. 결핵균의 경우, 특이 항원은 잠복 중의, 잠복성, 활성, 근래의, 폐, 폐외, 국부화된 또는 치료된 단계와 같으나 이에 제한되지 않는 감염의 다른 단계에서 발현된다.
본 발명은 특이 단계(예를 들어, 결핵균의 잠복성 감염)의 확인을 위한 수단을 제공하는 상기 항원을 이용하여 수행될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 동일한 미생물로부터의 몇몇의 항원은 반응 샘플을 발생시키는 경우 부가될 수 있다. 다양한 조직 유형 선호를 가진 몇몇 항원의 부가에 의해, 분석의 강도가 증가된다. 결핵의 경우, ESAT-6, CFP-10 및 TB7.7 단백질의 항원-펩타이드의 결합은 테스트가 가장 넓은 범위의 조직 유형을 포함하고, 그러므로 다른 환자 개체군에서 더 강하고 보다 믿을 수 있는 테스트 결과를 주는 가능성을 증가시킨다.
감염이 클라미디아와 관련된 것으로 생각될 때, 항원 또는 적어도 하나의 항원은 세로바 D 추출물, 주요 외막 단백질(MOMP), 시스테인-풍부 외막 단백질(OMPs), OMP2, OMP3, 다형OMPs(POMPs), 클라미디아성 폐렴의 아데노신 디포스페이트/아데노신 트리포스페이트 전위효소, 포린 B 단백질(PorBs), 및 CT521로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명으로부터 명백한 바와 같이, 감염의 근원은 다양할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 항원 또는 적어도 하나의 항원은 고정된-에피마스티고트(epimastigotes), 고정된-트리포마스티고트(trypomastigotes), 분열된-에피마스티고트, 분열된-트리포마스티고트, 에피마스티고트로부터의 정제된 항원성 분획, 에피마스티고트로부터의 반정제된 항원성 분획, 트리포마스티고트 배설-분비 항원(TESA), 우세한 가변성의 항원 유형(VAT), 가변성 표면 당단백질(VSG), TS13과 같은 트랜스-시알리다아제(TS), 무편모형 원충 표면 단백질-2(ASP2), KMP-11m, CRA, Ag30, JL8, TCR27, Ag1, JL7, H49, TCR39, PEP-2, Ag36, JL9, MAP, SAPA, TCNA, Ag13, TcD, B12, TcE, JL5, A13, 1F8, Tc-24, Tc-28, Tc-40, Cy-hsp70, MR-HSP70, Grp-hsp78, CEA, CRP, SA85-1.1, FCaBP(편모의 Ca2+-결합 단백질), FL-160(160 kDa의 편모의 표면 단백질), 및 FRA(편모의 반복성 항원)으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 항원들은 트리파노소마와 관련된 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 항원 또는 적어도 하나의 항원은 고정된-에피마스티고트, 고정된-트리포마스티고트, 분열된-에피마스티고트, 분열된-트리포마스티고트, 에피마스티고트로부터의 정제된 항원성 분획, 에피마스티고트로부터의 반정제된 항원성 분획, 트리포마스티고트 배설-분비 항원(TESA), 우세한 가변성의 항원 유형(VAT), 가변성 표면 당단백질(VSG), TS13과 같은 트랜스-시알리다아제(TS), 무편모형 원충 표면 단백질-2(ASP2), FCaBP(편모의 Ca2+-결합 단백질), FL-160(160 kDa의 편모의 표면 단백질) 및 FRA(편모의 반복성 항원)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
감염이 주혈흡충증과 관련된 경우, 항원 또는 적어도 하나의 항원은 분열된 주혈흡충 알, 배설된/분비된 당단백질(ES), 외피(TG) 당단백질, 가용성 알 항원(SEA), 만손주혈흡충(S.mansoni)의 가용성 추출물(SWAP), 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), RP26, Sj 31, Sj 32, 파라마이오신, Sm62-IrV5, Sm37-SG3PDH, Sm28-GST, Sm14-FABP, PR52-필라민 PL45-포스포글리세레이트 키나아제, PN18-사이클로필린, MAP3, Sm23, MAP4, Sm28-TPI, Sm97, CAA, CCA 및, 만손주혈흡충 열 충격 단백질 70으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 항원 또는 적어도 하나의 항원은 배설된/분비된 당단백질(ES), 외피(TG) 당단백질, 가용성 알 항원(SEA), 만손주혈흡충의 가용성 추출물(SWAP), 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 및, RP26으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
리슈만편모충에 관해서는, 항원 또는 적어도 하나의 항원은 분열된 프로마스티고지에즈(promastigozyes), 리슈마닌(leichmanin), rGBP, rORFF, rgp63, rk9, rk26, rk39, PN18-사이클로필린, MAP3, Sm23, MAP4, Sm28-TPI, Sm97, CAA 및, CCA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
사실, 분석되어질 종에 대한 어떤 항원 특이는 본 발명에 따르면 유용할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 다른 질병으로부터 다른 항원의 범위는 개체의 질병에 대한 낮은 특이성을 가지나 “감염”에 대하여 높은 민감성을 가진 스크리닝 수단을 가능하게 하기 위하여 결합될 수 있다. 예를 들어 미생물 병사(soldiers)로부터 항원의 팔레트(pallette)를 결합하는 키트는 사명(예를 들어, 말라리아, 결핵, 리슈만편모충, 주혈흡충 및/또는 트리파노소마)이 의사로 하여금 다양한 범위의 테스트 대신에 하나의 빠른 스크리닝-테스트를 수행하는 것을 가능하게 하는 동안에 노출된다.
다른 바람직한 구현예에서, 결합된 키트는 기관을 감염시키는 다양한 미생물(예를 들어, 골반내 염증 질병을 유발시키는 임균 및 클라미디아 종)로부터 항원을 포함할 수 있으며, 또는 보편적인 증상(예를 들어, 캄필로박테리아에 의해 유발된 치료할 수 있는 설사 및 시겔라 감염은 예를 들어 로타바이러스와 같은 바이러스에 의해 유발된 치료할 수 없는 설사로부터 구별될 수 있다)을 유발하는 감염성 병원균으로부터의 항원을 포함한다.
피실험자
“피실험자”와 관련된 참고는 인간 또는 영장류, 가축류 동물(예를 들어, 양, 젖소, 돼지, 말, 당나귀, 염소), 실험실 테스트 동물(예를 들어, 생쥐, 쥐, 토끼, 돼지쥐, 햄스터), 애완동물(예를 들어, 강아지, 고양이), 조류종(예를 들어, 가금새, 새장의 새), 파충류 및 양서류를 포함하는 비-인간 종을 포함한다. 그러므로, 본 발명은 가축류 및 수의학 및 야생동물 적용을 가지는 것뿐만 아니라 인간 약에서도 적용할 수 있다.
일반
본 명세서에서 어떤 이전의 기술분야에 대한 참고는 이러한 이전의 기술이 어떤 나라에서 보편적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 인지 또는 어떤 형태의 제안으로서 받아들여지지 않거나 받아들여지지 않아야 한다.
본 발명의 적용에서 인용된 모든 특허와 비-특허성 참고문헌은, 그들의 전체에서 참고문헌에 의해 여기에 편입된다.
명백할 것인 바와 같이, 본 발명의 일 측면의 바람직한 형태와 특징은 본 발명의 다른 측면에 적용할 수 있다. 본 발명은 그것의 정신 또는 근본적 특징으로부터 벗어남이 없이 다른 특이 형태에서 구체화될 수 있다. 그러므로, 앞서 말한 구현예들은 여기에 기술된 발명에서 제한하는 것 보다는 모든 관점에서 설명적인 것으로 간주된다. 본 발명의 범주는 그러므로 앞서 말한 기술에 의한 것 보다는 부가된 청구항으로 나타나며, 청구항의 동등한 의미와 범위 내에서 일어나는 모든 변화는 여기에서 참고문헌에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명에 따른 방법과 관련하여 위에서 논의된 어떤 형태 및/또는 측면은 진단의 방법에 대한 유추에 의해 적용하는 것으로 이해된다.
본 명세서의 전반에 걸쳐 단어 “포함하다”, 또는 “포함한다” 또는 “포함하는”과 같은 어미 변화는, 진술된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 군의 포함을 의미하나, 어떤 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 군의 배제를 의미하는 것은 아닌 것으로 이해될 것이다.
본 발명은 이하에서 다음의 비-제한적인 도면과 실시예에 의한 방법에 의해 기술될 것이다.
도 1
플라즈마 IFN-γ, IP-10, 및 IFN-γ 사이의 상관관계. 전체 혈액은 식염수(자극되지 않은)(1a), 결핵균 특이 항원(1b) 또는 미토겐(1c)으로 20-24시간 자극되었다. 사이토카인 생산은 ELISA(IFN-γ) 또는 멀티플렉스(IP-10)에 의해 플라즈마 상청액에서 측정되었다.
도 2
각각 Quantiferon ELISA 및 Luminex에 의해 측정된 항원-특이 IFN-γ 및 IP-10 사이토카인 생산(즉, Ag-Nil)의 비교. 값은 pg/㎖이다. 직선은 중간값을 나타내며, 범위에 대해서는 표 2를 참조한다.
도 3
IP-10 분석의 민감성과 특이성을 나타내는 ROC 도표. x축은 1-특이성을 나타내고, y-축은 민감성을 나타낸다.
도 4
항원-특이 IP-10 및 IFN-γ 생산의 비교. IFN-γ는 희석되지 않고 조사되고, IP-10은 1:8 희석에서 분석된다.
도 5
음성 또는 불확정 Quantiferon 테스트를 갖는 환자에서의 항원-특이 IFN-γ 및 IP-10/CXCL10 생산.
관에서의 6 Quantiferon(QFT-IT) 음성의 전체 혈액 및 하나의 QTF-IT 불확정 TB 환자는 식염수 또는 결핵균 특이 항원으로 20-24시간 자극되었다. 사이토카인 생산은 ELISA(IFN-γ) 또는 멀티플렉스 기술(IP-10)에 의해 플라즈마 상청액에서 측정되었다. 항원-특이 생산은 비자극된 샘플을 뺀 항원 자극된 샘플을 나타낸다. 직선은 중간값을 나타낸다(Wilcoxon 서명된 등급 테스트).
다음의 실시예에서, IP-10 분석의 수행은 테스트 원리의 실시예로서 결핵균 및 클라미디아 트라코마티스의 감염을 사용하여 증명되었다.
일반적인 방법
실시예 1-17에서 원리를 증명하기 위하여 전체 혈액 자극을 사용하였고, 실시예 18에서 정제된 혈액 단핵 세포(PBMCs)를 사용하였다.
전체 혈액 자극
1. 헤파린화 혈액 1 ㎖ 부피가
a. 비자극화된 샘플 또는 닐 샘플(호환성 있는)을 발생시키기 위한, 염류,
b. 항원 샘플(Ag)을 발생시키기 위한 단백질 ESTA-6, CFP-10 및 TB-7.7으로부터 유래된 펩타이드
c. 미토겐 샘플을 발생시키기 위한 피토헤마글루티닌(PHA)
으로 코팅된 세 개의 진공채혈관(Cellestis, Australia)에 채혈되었다.
2. 관은 37 ℃에서 20-24시간 배양되었다.
3. 관은 2000 rpm에서 10분 원심분리되었다.
4. 플라즈마는 채취되고, -40 ℃에서 또는 그 아래에서 냉동되었다.
말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)의 분리
1. PBMCs는 밀도 구배 원심분리기(Lymphoprep; Nycomed)에 의해 전체 혈액으로부터 분리되고, 사용될 때까지 액상 질소에서 냉동되었다.
2. PBMCs는 해동되고, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% 비필수 아미노산, 1% 글루타민, 1% 피로바트(pyrovat), 1% HEPES, 및 10% 인간 AB 혈청(국부의 혈액 은행, Rigshospitalet, Copenhagen)으로 보충된 RPMI 1640에서 재-분산되었다.
3. 세포의 생존 능력 및 수는 니그로신 염색에 의해 결정되었다.
4. 세포는 총 부피 100 ㎕ 내의 1.25 × 105 세포/웰에서 둥근-바닥 마이크로타이터 플레이트(Nunc)에서 3배로 배양되었다.
클라미디아 트라코마티스 세로바 가닥 D 추출물 항원의 제조
1. 클라미디아 트라코마티스 세로바 D 가닥(UW-3/Cx)은 HeLa229 세포에서 증식되고 다용리(multielution) 기술을 사용하여 30 좁은 분자량 분획으로 분획되었다.
2. SPG 버퍼 안의 클라미디아 트라코마티스 세로바 D는 30분 동안 30.000g에서 원심분리되었다.
3. 펠렛은 1:1의 멸균수와 라엠리(laemmli)-감소 샘플 버퍼에 재-분산되었고, 이이서 5분 동안 끓였다.
4. 반복된 초음파 분해 후에, 분산액은 30분 동안 30.000g에서 원심분리되었다.
5. 상청액 정제하지 않은 클라미디아 트라코마티스 세이버 가닥 D 추출물이 항원으로 사용되었다.
세로바 D 항원으로 PBMC 자극
1. PBMCs는 위에서 기술된 바와 같이 평판 배양되고, 세포는
a. 항원 샘플을 발생시키는 세로바 D 항원, 2 ㎍/㎖
b. 비-자극된 샘플을 발생시키기 위한 항원이 없이
자극되었다.
2. 세포는 습한 공기(5% CO2와 95% 공기)에서 37℃에서 배양되었다.
3. 상청액은 IP-10의 정량화를 위하여 5일 후에 채취되었다.
4. 플라즈마는 채취되고, -40 ℃에서 또는 그 아래에서 냉동되었다.
생물학적 마커 측정
Luminex:
IP-10 및/또는 MCP-1 및/또는 IL-2는 luminex 플랫폼으로 측정되었고 Biosource 프로토콜에 따라 수행되었다.
1. 개체의 IP-10, IL-2, MCP 및/또는 IFN-γ 키트로부터의 비드 현탁액은 미리-적셔진 필터 96 플레이트 웰에 결합되었다.
2. 비드는 세척 용액으로 두 번 세척되었고 배양 버퍼가 부가되었다.
3. 샘플은 분석 희석에서 1:1, 1:8, 1:10, 또는 1:20으로 희석되었고 100 ㎕를 플레이트에 넣었다.
4. 플레이트는 타이터 플레이트 진탕기에서 600 rpm으로 상온에서 2시간 배양되었다.
5. 두 번 세척한 후, 100 ㎕ 검출 항체 혼합물이 웰마다 부가되었고, 플레이트는 타이터 플레이트 진탕기에서 한 시간 동안 상온에서 배양되었다.
6. 두 번 세척한 후, 100 ㎕ 스트렙아비딘-RPE 용액이 웰마다 부가되었다.
7. 30분 배양하고 세 번 세척한 후, 100 ㎕의 세척 용액이 각각의 웰에 부가 되었고 플레이트는 Luminex의 XY 플랫폼에 놓여졌다.
8. 각각의 웰로부터, 최소 100 분석물 특이 비드가 비드- 및 RPE 형광에 대하여 분석되었다.
IP-10 ELISA
IP-10 측정은 Biosource(Invitrogen, USA)로부터의 단일 단계 유형 ELISA를 이용하여 수행되었다.
IFN-γ ELISA
IFN-γ 측정은 단일 단계 샌드위치 유형 ELISA; Quantiferon IFN-γ ELISA(Cellestis, Australia)를 이용하여 수행되었다. IFN-γ 레벨은 제조업자에 의해 제공된 소프트웨어(버전 2.50)를 이용하여 분석되었다. Cellestis ELISA 키트는 우리가 ELISA IFN-γ 결과를 pg/㎖로 제안하는 본 발명의 실시예에서 국제 단위(U)(50 pg/㎖에 대응하는 1 Unit/㎖)로 작용한다.
Quantiferon 테스트(QFT-IT 테스트)
IFN-γ 생산은 Quantiferon ELISA를 이용하여 측정되었다. 제조업자의 지침에 따르면, 비자극된 샘플의 IFN-γ 반응은 결핵균-특이 항원으로 자극된 샘플 및 미토겐 샘플에서 IFN-γ 반응이 뺄셈된다. QFT-IT 결과는, 미토겐 자극된 IFN-γ 반응에도 불구하고, 특이 항원에 대한 반응이 17.5 pg/㎖(0.35 IU/㎖) 이상이고 비 자극된 값의 25% 이상인 경우 “양성”이고; 특이 항원에 대한 반응이 17.5 pg/㎖(0.35 IU/㎖) 미만이고 미토겐 자극된 IFN-γ 반응이 25 pg/㎖(0.51 IU/㎖) 이상인 경우 “음성”으로 간주되었다. 테스트는 특이 항원에 대한 반응이 17.5 pg/㎖(0.35 IU/㎖) 미만이고 미토겐 자극된 IFN-γ 반응이 25 pg/㎖(0.51 IU/㎖) 이하인 경우; 또는 항원-특이 또는 미토겐 자극된 반응에도 불구하고 비자극된 샘플에서 IFN-γ 반응이 400 pg/㎖(8 IU/㎖) 이상인 경우 “불확정”으로 간주되었다.
실시예 1
높은 레벨의 플라즈마 IP-10은 결핵균으로 감염된 환자로부터 결핵균 특이 항원을 가진 전체 혈액의 자극에 의해 유도된다.
덴마크(n=2) 및 기니비사우(n=9)로부터의 타액 양성 폐결핵을 가진 12명의 환자와, 11명의 건강한 비-결핵 노출된 덴마크인 대조구(Hvidovre 병원의 감염성 질병과 임상 조사 단위부로부터의 젊은 의사, 조사자 및 학생)으로부터의 전체 혈액을 테스트하였다. 어떠한 환자도 HIV 양성이 아니었다. 연구는 코펜하겐과 프레데릭스베르의 민족 위원회, 및 기니비사우의 민족 위원회에 의해 승인되었다.
결과
Luminex IP-10, Luminex IFN-γ 또는 상업적인 Quantiferon-IFN-γ ELISA에 의해 측정된, 닐, Ag 또는 미토겐으로 배양된 전체 혈액 샘플의 플라즈마에서 IFN- γ 및 IP-10(중간값 및 범위)의 레벨은 표 1에 나타내었다.
결핵균 특이 항원으로 배양한 후의 IP-10의 생산은 환자에서 결핵균의 감염의 존재와 강력하게 관련된다: 전체 혈액 배양액의, 플라즈마에서 매우 높은 IP-10 레벨, 1025 pg/㎖(범위: 497.3-2084.4 pg/㎖)는 결핵균으로 감염된 환자에서 결핵균 특이 항원으로 자극되는 동안 유도된 반면, 매우 낮은 레벨의 IP-10 40.4 pg/㎖(범위: 19.7-158.8)는 결핵균으로 감염된 알려진 노출 또는 신호가 없는 11명의 건강한 덴마크인 개체들(대조구)의 전체 혈액 배양액에서 보여졌다. 두 집단 사이의 차이는 매우 중요하다: p가 0.0001 미만이라는 것은 IP-10 방출이 실제로 유도된 항원이라는 것을 보여준다.
1024 pg/㎖(범위 497-2080 pg/㎖)의 항원 자극된 IP-10의 양은 223.5(99-1283 pg/㎖)의 ELISA에 의해 결정된 IFN-γ 레벨과 Luminex 90.7 pg/㎖(37-464 pg/㎖)(p=0.01 및 0.001) 보다 상당히 더 높다.
IP-10과 비교된, IFN-γ의 상당히 낮은 플라즈마 레벨은 Quantiferon-ELISA에 의해 결정되었으나, TB 감염된 및 비-TB 감염된 것 사이의 차이점은 여전히 중요하다. Luminex에 의해 측정된 IFN-γ는 QFT-IFN-γ ELISA에 의해 측정된 IFN-γ 보다 더 낮으며, 그러므로 그 이상에서 논의되지 않을 것이다.
결론적으로, IP-10은 감염된 사람으로부터의 전체 혈액이 결핵균 특이 항원으로 자극되는 경우 결핵균으로의 감염을 위한 높은 특이 마커이다. IP-10은 측정하기 훨씬 더 쉬우며 방출되는 높은 레벨로 인하여 더 민감한 마커로서 큰 가능성을 가진다.
Figure 112009020153206-PCT00001
표 1: 전체 혈액 배양액에서 IFN-γ 및 IP-10의 생산.
전체 혈액은 식염수(비자극된), 결핵균 특이 항원 또는 미토겐으로 20-24 시간 자극되었다. 사이토카인 생산은 ELISA(IFN-γ) 및 멀티플렉스(IFN-γ, IP-10)에 의해 측정되었다. a값은 중간값(범위)이다. b상당히 다른(P < 0.0001). c상당히 다른(P < 0.0005). d상당히 다른(P < 0.008). Kruskal-Wallis 테스트
실시예 2
활성 TB 감염된 환자로부터 비자극된 전체 혈액 배양액(닐 샘플)의 플라즈마에서 상승된 자발적인 IP-10 방출; 활성 질병에 대한 마커로서 IP-10
표 1로부터 나타낸 바와 같이, 활성 결핵 환자는 p가 0.0005인 건강한 대조구(27.1 pg/㎖(17.7-140.6))과 비교하여 비자극된 전체 혈액 샘플(닐)에서 5.6배 더 높은 IP-10의 플라즈마 레벨(150.9 pg/㎖(61.1-991.9))을 가졌다. 기니비사우 및 덴마크(p=0.67)로부터의 활성 결핵을 가진 환자 사이의 플라즈마 닐 IP-10에서 상당한 차이는 없다.
결론: 이것은 항원 자극된 IP-10 방출과의 결합에서 자발적인 IP-10 방출의 결정이 활성 TB를 가진 환자들로부터 건강한 개체를 구별하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 3
IFN-γ와 IP-10 사이의 상관관계
전체 혈액 배양액에서 IFN-γ와 IP-10 방출 사이의 강한 상관관계가 있으나, IP-10 방출이 더 높은 크기이다. 닐, 항원 또는 미토겐 자극 후의 IP-10에 대한 개체의 반응과 대응하는 ELISA IFN-γ는 도 1a-c에 나타내었다. 항원 자극된 전체 혈액의 플라즈마에서(창병 r=0.87, 95% C.I 0.71 내지 0.95, p<0.0001)(도 1b)와, 같은 레벨은 아니지만 미토겐 자극된 전체 혈액의 플라즈마에서(r=0.54, 95% C.I 0.15 내지 0.78, p=0.008)(도 1c)의 IP-10 및 ELISA IFN-γ 레벨 사이에 강한 상호관계가 있다.
결론: 전체 혈액 배양액에서 IP-10과 IFN-γ의 방출은 서로 관련있으나, IP-10 방출이 더 높은 크기이다. 이는 IP-10을 생체 내에서의 TB 테스트에서 IFN-γ 보다 더 좋은 마커로 만든다.
실시예 4
항원-특이 IP-10 생산은 항원-특이 IFN-γ 생산보다 더 높다.
배양액에 존재하는 항원에 대한 반응에서 방출되는 사이토카인(즉, 항원-특이(Ag-특이) 사이토카인 반응)의 양을 결정. 항원-특이 사이토카인 반응은 델타 값(=비-자극된 전체 혈액 배양액의 플라즈마로 방출된 양에 의해 뺄셈된 항원 자극된 전체 혈액 배양액에서 사이토카인 생산)으로서 계산된다. 델타 값은 항원-특정 IFN-γ와 IP-10 사이토카인 생산을 비교하도록 허가한다. 도 2에 나타낸 바와 같이, IP-10 분석은 p가 0.006인 Ag-특이 IFN-γ(216.5 pg/㎖(80.5-1273.0 pg/㎖))(Mann-Whitney)와 비교된 더 높은 값의 Ag-특이 IP-10(870.4 pg/㎖(260.5-1575.9 pg/㎖))을 측정한다. 중간값과 범위는 표 2에 나타내었다.
결론: IP-10은 더 높은 양으로 방출되고(p=0.006), 그러므로 측정하기 더 쉽고 IFN-γ 보다 더 좋은 마커로 보인다.
Figure 112009020153206-PCT00002
표 2: 각각 Quantiferon ELISA와 Luminex에 의해 측정된 Ag-특이 INF-γ와 IP-10 사이토카인 생산의 비교(Kruskal-Wallis 테스트).
실시예 5
IP-10 분석의 매우 높은 민감성과 특이성
IP-10 분석의 매우 높은 민감성과 특이성은 테스트 원리의 실시예로서 TB를 이용하여 증명된다. 본 발명에서 기술된 IP-10 분석의 높은 민감성과 특이성은 항원-특이 IP-10(닐을 뺀 항원-자극된) 값의 레벨에 기초한 ROC 도표를 이용하여 결정된다. 현재의 ROC 도표 분석은 실시예 1에서 기술된 12명의 TB 환자와 11명의 건강한 대조구에 기초한 것이다. 도 3에서, IP-10 테스트가 활성 결핵으로 감염된 환자와 건강한 대조구 사이를 완전히 분리한 것이 증명되었다. 이러한 실험에서, IP-10 테스트는 1.0의 도표 아래의 영역(Area Under the Curve, AUC)을 가진다.
결론: 결핵균으로의 감염의 진단에서 사용된 IP-10 분석은 생체 내에서의 TB 테스트에서 현재 사용되고 있는 것보다 더 좋은 수행성인, 100% 민감하고 100% 특이성을 갖는 것으로 나타났다. IP-10 테스트는 여기서 결핵 감염을 갖는 환자 및 갖지 않는 환자 사이를 명확하게 구별할 수 있다. 이러한 제한된 물질에 기초하여, 27.6 pg/㎖와 260.5 pg/㎖ 사이의 컷-오프가 되도록 하는 것과 완전한 분리를 달성하는 것이 가능하다.
실시예 6
IP-10은 면역억제에서 잠복성 TB에 대한 효과적인 마커이다.
코르티코스테로이드와 메토트렉사트ⓒ로 치료받는 류마티스 관절염(RA)을 가진 6명의 환자로부터의 전체 혈액은 닐, 하나의 결핵균 특이 항원(ESAT6), 또는 미토겐(PHA)으로 자극되었다. IP-10 농도는 위에서 기술된 Luminex를 이용하여 상청액에서 측정되었다. 환자 1-3은 Quantiferon 테스트 음성으로 알려졌고 환자 4-6은 Quantiferon 테스트 양성이었다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 면역 억제에도 불구하고 모든 환자는 양성 미토겐 조절에 대한 반응에서 높은 레벨의 IP-10을 상승시켰다. 높은 레벨의 ESAT6 자극된 IP-10(범위 668-2800 pg/㎖)은 잠복성 TB(양성 Quantiferon 테스트)를 가진 모든 환자에서 관찰되었다. 결론에서, IP-10 기초한 테스트는 면역-억제의 환자에서 잠복성 TB 감염의 진단을 위하여 사용될 수 있다.
Figure 112009020153206-PCT00003
표 3: 류마티스 관절염을 가진 6명의 환자는 닐, ESAT6(Quantiferon 테스트에서 사용된 항원들 중 하나), 또는 미토겐(PHA)으로 자극되었고, IP-10은 Luminex에 의해 측정되었다. 더 위의 3명의 환자는 Quantiferon 테스트 음성이고, 더 낮은 곳의 3명은 Quantiferon 테스트 양성이다. 모든 환자는 활성 TB 질병 증상이 없으나, 심각한 RA로 괴로워하고 중증의 면역억제약을 받고 있다(생물학적 치료, 즉 TNF-α 차단제에 대한 후보자).
실시예 7
청년시절에 알려진 TB 노출된 건강한 사람에서 잠복성 TB에 대한 마커로서의 IP-10
청년 시절에 알려진 TB 노출을 가진 2명의 테스트자(RV와 AKA)에서, 증명된 PPD 전환과 비결핵 화학적 예방법과 비 동시-질병률은 위에서 기술된 방법을 이용하여 IP-10 반응성에 대하여 테스트되었다. 제공자는 이전의 테스트로부터 Quantiferon 양성으로 알려졌다. 강한 항원(ESAT-6) 특이 IP-10 반응(302.9 pg/㎖와 916.1 pg/㎖)와 반응하는 테스트자는 표 9에 나타낸다. 테스트자 RV는 2개월 떨어져서 두번 테스트되었고, 결과의 좋은 재생산이 있다(데이터는 나타내지 않음).
결론: IP-10은 잠복성 결핵 감염에 대한 마커로서 강력하다.
Figure 112009020153206-PCT00004
표 4: 청년 시절에 알려진 TB 노출을 가진 2명의 건강한 환자는 결핵 항원 반응성(ESAT6)에 대하여 테스트되었다.
실시예 8
항원-특이 IP-10 방출과 결합에서 샘플에서 자발적인 IP-10 레벨은 활성 TB를 가진 환자로부터 잠복성 TB 감염을 가지거나 또는 가지지 않는 건강한 사람을 구별할 수 있다.
실시예 6(표 3)에서, 자발적인 (닐) IP-10 레벨은 류마티스 관절염을 가진 잠복성 결핵 감염된(34 pg/㎖(범위 31-63 pg/㎖))와 감염되지 않은(38 pg/㎖(범위 35-87 pg/㎖)) 환자 모두에서 낮은 것을 나타낸다. 이러한 레벨은 비-감염된 건강한 제공자(27.1 pg/㎖(범위 17.7-140.6 pg/㎖), 표 1)와 잠복성 감염된 제공자(22.5와 10.4 pg/㎖), 표 4)에서 나타낸 바와 같이 유사하게 낮은 레벨이다. 활성 결핵 없는 모든 환자를 모으고, 이러한 낮은 레벨을 활성 TB를 가진 환자에서 나타나는 자발적인 IP-10의 높은 레벨(150.9 pg/㎖(범위 61.1-991.9))(표 1)과 비교하는 경우, 고도로 상당한 차이(p<0.0001, Mann Whitney)를 발견한다.
결론, 자발적인 및 항원-특이 IP-10 방출의 결합은 활성과 잠복성 결핵 감염 사이를 구별하는데 사용될 수 있다.
실시예 9
플라즈마 샘플의 희석은 IP-10 테스트의 민감성을 잃지 않고 수행될 수 있다.
샘플의 희석은 희석 용액의 부가에 의해 농도를 순차적으로 낮추는 것이다. 배양 후에 플라즈마 샘플의 희석이 고 및 저 IP-10 농도를 갖는 플라즈마 샘플 사이의 배수(fold)의 관계를 해치는 경우와 이러한 희석이 IP-10 분석의 민감성을 해치는 경우를 테스트하였다. 샘플은 Biosource Luminex 키트에서 제공된 분석 희석에서 희석되었다.
표 5로부터 나타낸 바와 같이, 샘플의 희석은 항원과 미토겐 자극된 전체 혈액의 플라즈마와 비자극된(닐) 전체 혈액의 플라즈마에서 IP-10의 레벨을 점차적으로 낮추는 결과를 초래한다.
Figure 112009020153206-PCT00005
표 5: 닐, 항원 및 미토겐 자극된 전체 혈액으로부터 플라즈마는 분석 희석에서 1:2-1:16으로 희석되었고, Luminex를 이용하여 IP-10 레벨에 대하여 분석되었다. 표 5에서, 항원-특이 IP-10 농도는 16배 희석된 샘플에서 조차도 매우 높게 존재한다(275 pg/㎖와 128 pg/㎖)는 것을 나타낸다.
도 4는 항원-특이 IFN-γ와 IP-10 반응에 대하여 테스트된 7명의 대조구와 8명의 결핵 환자로부터의 데이터를 나타낸다. 항원-특이 IP-10 생산은 샘플의 다음의 1:8배 희석으로 측정되고, IFN-γ 반응은 비희석된 샘플에서 측정된다. 다시 1:8배 희석에서 조차도 IP-10이 결핵균 감염(p=0.0003)에 대한 강력한 마커라는 것을 나타내는 고도의 특이 IP-10 값을 발견하였다. 게다가, 1:8로 희석된 경우 IP-10 값(중간값 1097 pg/㎖(범위 225-3045 pg/㎖))은 p가 0.014인 비희석된 샘플 물질에서의 IFN-γ 분석된 값(중간값 269 pg/㎖(범위 81-1273 pg/㎖))과 비교하여 더 높다(Wilcoxon 매치된 짝 테스트).
이러한 결과는 IP-10이 진단 분석에 대하여 매우 강건한 마커라는 것과 IP-10 테스트가 샘플 물질이 매우 부족한 테스트 설정에서 사용될 수 있다는 것을 증명한다. 이는 단지 매우 적은 샘플 물질이 유용한 경우(예를 들어 매우 낮은 혈액 부피를 갖는 유아에 대한 상업적인 생산에서 직접적으로 적용할 수 있는)에 샘플이 희석될 수 있는, IP-10 테스트의 전체적인 적용 범위에 대하여 개시한다.
결론: 플라즈마 샘플은 IP-10 테스트의 민감성을 잃지 않고 희석될 수 있다는 것이 증명되었다.
실시예 10
IP-10은 IFN-γ보다 더 민감하고 생체 내에서 결핵 감염이 진단을 개선한다.
IP-10이 현재의 QFT-IT 테스트의 민감성을 개선시키기 위한 가능성을 가지는 경우를 조사하기 위하여, 음성 또는 불확적 QFT-IT 테스트 결과를 갖는 결핵 환자에서 IP-10 반응을 테스트하였다(환자의 특징과 개체의 측정에 대해서는 표 6을 참조한다). 이러한 환자는 바꿔 말하면 IFN-γ 테스트에서 잘못된 음성이다. 도 5는 TB로 감염된 7명의 환자에서 항원-특이 IP-10 및 IFN-γ 반응과 음성 또는 불확정 QTF-IT 테스트를 나타낸다. QFT-IT ELISA에 의해 결정된, 항원-특이 IFN-γ 반응은 0-12.8 pg/㎖ 범위에 이르는 반면, 항원-특이 IP-10 반응은 0-532 pg/㎖의 범위에 이른다. 7명의 환자들 중에서, 3명은 또한 10pg/㎖ 미만의 항원-특이 반응을 가지는 IP-10 비반응성인 반면, 다른 4명의 환자는 318 pg/㎖(범위 196-532 pg/㎖)의 중간값 IP-10 레벨에 반응하였다. 음성 QFT-IT 테스트와 양성 IP-10 반응을 갖는 4명의 환자 중에서, 2명은 각각 32 세포/㎕과 300 세포/㎕의 CD4 세포 총수를 갖는 HIV 동시-감염되었다. 미토겐 특이 IP-10 방출은 394 내지 2800 pg/㎖ 범위에 이르는 모든 제공자에서 높았다. 이러한 놀라운 발견은 IFN-γ 기초한 테스트와 비교하여 생체 내에서 IP-10 기초한 테스트의 증가된 민감성을 강조한다.
Figure 112009020153206-PCT00006
표 6. 활성 TB와 음성 또는 불확정 QFT-IT 테스트 결과를 갖는 환자들은 IP-10 반응성에 대하여 테스트되었다.
a GB - 기니비사우; DK - 덴마크
b pTB - 폐 TB, epTB - 폐외 TB
c 전체 혈액은 식염수, 결핵균 특이 항원(ESAT-6, CFP10, 및 TB 7.7) 또는 미토겐(PHA)으로 20-24 시간 자극되었다. 사이토카인 생산은 ELISA (IFN-γ) 및 멀티플렉스(IP-10)에 의해 측정되었다.
d A 양성 QFT-IT 반응은 제조업자의 지침에 따른 닐 위의 17.5 pg/ml의 항원-특이 반응으로 정의된다.
e A 양성 IP-10 반응은 11명의 건강한 대조구의 평균 결과 + 3 표준편차에 독단적으로 기초한 닐 위의 36 pg/ml의 항원-특이 IP-10 반응으로 정의된다(실시예 4로부터의 환자).
g n.d. - 수행되지 않음
h 불확정
실시예 11
강력한 항원-특이 IP-10 반응은 짧은 및 긴 배양에서 발생될 수 있다.
표 7에서, 6-120 시간 배양에서 조사된 전형적인 TB 환자로부터 비-자극된 및 항원 자극된 반응이 나타났다. 표 7로부터 알 수 있는 바와 같이, 매우 짧은 배양시간에서 항원 자극을 가진 IP-10 반응을 유도하는 것이 가능하다. 1 ng 초과는 6시간에서 생산되고, 매우 높은 반응 3-6 ng는 120시간 배양 동안에 유지된다. 이러한 발견은 IP-10 테스트의 수행이 매우 강건하며 매우 짧은(6시간 미만) 및 매우 긴 배양 시간에서 수행될 수 있다는 것을 증명한다.
Figure 112009020153206-PCT00007
표 7. 6-120시간 배양에서 조사된 전형적인 TB 환자로부터의 비-자극된(식염수) 및 항원-자극된 반응
실시예 12
강력한 항원-특이 IP-10 반응은 배양 온도의 범위에서 발생될 수 있다.
표 8로부터 알 수 있는 바와 같이, 넓은 범위의 온도에서 항원-자극을 갖는 IP-10 반응을 유도하는 것이 가능하다. 200 pg/㎖ 초과의 항원-특이 IP-10은 30 ℃ 미만에서 배양이 가능하다는 것과, 예를 들어 30-37 ℃ 범위의 온도에서 배양은 강력한 항원-특이 반응을 발생할 것이라는 것을 나타내는, 30 ℃에서 생산되었다.
Figure 112009020153206-PCT00008
표 8. 20-37 ℃에서 24시간 배양에서 조사된 전형적인 TB 환자로부터의 비-자극된 및 항원-자극된 반응. IP-10 값은 pg/㎖이다.
실시예 13
적은 양의 전체 혈액은 배양 전에 희석될 수 있으며 여전히 강력한 IP-10 반응을 발생시킬 수 있다.
1 ㎖(1:0), 0.5 ㎖(1:1) 및 0.1 ㎖(1:10) 전체혈액의 샘플은 총 부피 1 ㎖로 RPMI-1640에서 희석되었다. 희석된 전체 혈액은 QFT-IT 관에서 24시간 자극되었다. 값은 희석 요인에 대하여 정확하지 않다. 표 9로부터 알 수 있는 바와 같이, 배양 전에 RPMI-1640에서 전체 혈액을 희석하는 것과 여전히 80 pg/㎖를 초과하는 항원-특이 IP-10 반응을 발생시키는 것이 가능하다. 이는 그 이상의 희석이 가능하고 매우 적은 양의 혈액 또는 세포를 사용하는 테스트 키트가 개발될 수 있다는 것을 나타낸다.
Figure 112009020153206-PCT00009
표 9. RPMI-1640에서 희석된 전체 혈액의 작은 분획을 사용하는 전형적인 TB 환자로부터의 비-자극된 및 항원-자극된 반응. IP-10 레벨은 pg/㎖이다.
실시예 14
25 ℃에서 IP-10 안정성
4명의 제공자로부터의 PHA 자극된 전체 혈액으로부터의 플라즈마의 분획은 분석 전에 25 ℃에서 1/2시간, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 또는 24시간 동안 저장되었다. 표 10으로부터, IP-10은 25 ℃, 24시간에서 조차도 분해되지 않는 매우 안정한 분자라는 것이 분명하다.
Figure 112009020153206-PCT00010
표 10. 25 ℃에서의 IP-10 안정성(측정은 pg/㎖이다).
실시예 15
5 ℃에서 IP-10 안정성
4명의 제공자로부터의 PHA 자극된 전체 혈액으로부터의 플라즈마의 분획은 분석 전에 5 ℃에서 12시간, 24시간, 72시간, 144시간, 또는 216시간(9일) 동안 저장되었다. 표 11로부터, IP-10은 5 ℃, 216시간(9일)에서 조차도 분해되지 않는 매우 안정한 분자라는 것이 분명하다.
Figure 112009020153206-PCT00011
표 11. 5 ℃에서의 IP-10 안정성.
실시예 16
냉해동 주기에서 IP-10 안정성
4명의 제공자로부터의 PHA 자극된 전체 혈액으로부터의 플라즈마의 분획은 분석 전에 ×5까지 냉동(-80 ℃)되고 해동되었다. 표 12로부터, IP-10은 ×5의 냉해동 주기에서 조차도 분해되지 않는 매우 냉동/해동 안정한 분자라는 것이 분명하다.
Figure 112009020153206-PCT00012
표 12. IP-10 냉동-해동 안정성
실시예 17
진단의 생물학적 마커로서의 IP-10은 플랫폼-독립적이다.
IP-10 레벨은 Luminex를 이용하여 단지 측정할 수 있는 것은 아니며, 실시예17에서 활성 TB를 가진 4명의 환자와 4명의 건강한 대조구로부터의 샘플은 ELISA 기술(Biosource)을 이용하여 측정하였다.
표 13으로부터 인정될 수 있는 바와 같이, 모든 4명의 환자는 457 pg/㎖ 위의 항원-특이 IP-10을 생산한 반면, 대조구 모두는 13 pg/㎖ 미만의 IP-10을 생산한다.
Figure 112009020153206-PCT00013
표 13. ELISA 기술에 의해 측정된 4명의 대조구와 4명의 환자로부터의 항원-특이 IP-10 생산
실시예 18
더 강력한 결합된 마커를 창조하기 위하여 IP-10의 측정과 다른 알려진 생물학적 마커의 결합, 및 양성 반응자의 수의 증가
알려지지 않은 이유에 대하여, 일부 개체는 하나의 생물학적 마커에 강하게 반응하고 다른 다음의 항원 공격에 반응하지 않는다. 예를 들어, 일부 개체는 IP-10 또는 IFN-γ 반응을 보이지 않을 수 있으며, 또는 단지 낮은 레벨의 IP-10 또는 IFN-γ를 생산할 수 있다. 이러한 경우, 2, 3, 4 또는 그 이상의 생물학적 마커의 자발적인 측정은 분석의 민감성을 증가시킬 것이고 양성 반응자의 수를 증가시킬 것이다. IP-10과 예를 들어 IFN-γ 측정의 결합에 의해, 그러므로 단일 생물학적 마커 면역성 결여에 거의 공격받지 않는 진단의 예측을 만드는 것이 가능하다.
이러한 결합된 생물학적 마커 전략에 대한 하나의 접근은 표 6으로부터의 IP-10과 Quantiferon 결과가 다음의 매트릭스에 결합되는 표 15에 나타낸다: 환자가 적어도 하나의 테스트에 양성으로 반응하는 경우, 그때에 환자는 감염된 것으로 간주된다. 제안된 실시예에서, IP-10 테스트에 의해 양성인 음성의 QFT-IT 반응자는 없다.
Figure 112009020153206-PCT00014
표. QFT-IT 및 IP-10 테스트 결과는 결합되고 환자가 적어도 하나의 테스트에 의해 양성인 경우, 그때에 환자는 감염된 것으로 간주되는 것과 같이 해석된다. IP-10 테스트에 대한 컷 지점은 11명의 건강한 대조구의 평균 결과 + 3 표준편차에 독단적으로 기초한(실시예 4로부터의 환자), 닐 위의 36 pg/㎖의 항원-특이 IP-10 반응으로 정의된다.
결합된 생물학적 마커를 구성하는 다른 더 복잡한 방법은 표 16에 나타낸다. 항원-특이 IP-10과 IFN-γ 반응은 부가 및 증식에 의해 결합된다. 7명의 비-노출된 대조구와 8명의 활성 TB를 가진 환자가 평가되었다. 표 14로부터, 항원-특이 IP-10과 IFN-γ 반응의 중간값과 범위; 및 부가되고 증식된 IP-10과 IFN-γ 반응의 중간값과 범위를 알 수 있다. 부가에 의해 가장 높게 반응하는 대조구와 가낭 낮게 반응하는 환자 사이의 범위는 IFN-γ에 대하여는 62 pg/㎖로부터 IP-10에 대하여는 1727 pg/㎖로부터, 1863 pg/㎖까지 증가되었고, 증식에 의해 164642(pg/㎖)2까지 증가되었다. 증식에 의한 범위에서 이러한 놀라운 두드러진 증가는, 또한 압도적인 379279배에 대한 평균에 기초한 상대적인 배수 차이를 증가시키며, 이는 환자와 대조구 사이에 619배 차이를 갖는 항원-특이 IP-10, 또는 1074배 차이를 갖는 IFN-γ와 비교된다.
Figure 112009020153206-PCT00015
표 15. 항원 특이 IP-10과 항원-특이 IFN-γ는 IP-10/IFN-γ 생물학적 마커 결합을 구성하기 위하여 부가되거나 또는 증식되었다. 0 미만의 항원-특이 측정은 0까지 정상화되었다.
실시예 19
IP-10 분석을 이용한 클라미디아 트라코마티스 감염의 진단
PBMC는 클라미디아 트라코마티스 감염을 가진 7명의 환자와 클라미디아 감염의 기록된 이력이 없는 7명의 제공자로부터 분리되었다. PBMCs는 5일 배양액에서 자극되었고, 상청액은 luminex를 이용하여 IP-10 생산과 ELISA를 이용하여 IFN-γ 생산이 분석되었다.
표 16으로부터, 높은 레벨의 PBMC 배양액 상청액 IP-10(>0.5 ng/㎖)은 클라미디아 트라코마티스 생식기 감염으로부터 괴로워하는 환자에서 클라미디아 트라코마티스 세로바 D 추출물로 자극에 의해 유도된다는 것을 알았다. 일부 대조구는 이러한 비특이 자극에 반응하나, 레벨이 더 낮다는 것은 분명하다. 0.5 ng/㎖를 초과하는 높은 항원 특이 IP-10 생산이 있다.
결론에서, IP-10은 클라미디아 감염에 대한 신규한 진단의 생물학적 마커이다.
Figure 112009020153206-PCT00016
표 16. IP-10과 IFN-γ의 닐, 항원 및 항원-특이 레벨은 PBMC 5일 배양액에서 유도되었다.
[참고문헌]
Abramo C, Meijgaarden KE, Garcia D, Franken KL, Klein MR, Kolk AJ 등.
인터페론 감마와 IFN-감마에 의해 유도된 모노카인은 브라질인 결핵 환자에서 결핵균 ESAT-6와 CFP-10의 융합 단백질에 반응한다. Microbes.
Bourgarit, A., G. Carcelain, V. Martinez, C. Lascoux, V. Delcey, B. Gicquel, E. Vicaut, P. H. Lagrange, D. Sereni, 및 B. Autran. 2006. 투베르쿨린-특이 Th1-반응의 폭발은 결핵과 HIV 동시-감염된 환자에서 면역 복구 증후군을 유도한다. AIDS 20:F1-F7.
Hughes, A. J., P. Hutchinson, T. Gooding, N. J. Freezer, S. R. Holdsworth, 및 P. D. Johnson. 2005. ESTA-6와 세포내 사이토카인 사이토메트리를 이용한 결핵균 감염의 진단. Clin. Exp. Immunol. 142:132-139.
Pai, M., R. Joshi, S. Dogra, D. K. Mendiratta, P. Narang, S. Kalantri, A. L. Reingold, J. M. Colford Jr, L. W. Riley, 및 D. Menzies. 2006. 인터페론-γ 분석을 이용한 결핵에 대한 건강관리자의 일련의 테스트. Am. J. Respir. Crit Care Med.

Claims (20)

  1. a) 적어도 하나의 테스트-항원을 가진 포유동물로부터 얻어진 샘플을 배양하는 단계
    b) 상기 샘플의 IP-10 레벨을 결정하는 단계
    c) 결정된 IP-10 레벨과 참고-레벨을 비교하여, 상기 포유동물이 상기 테스트-항원(들)에 대한 면역학적 반응을 발생시키는 상기 적어도 하나의 테스트-항원을 이전에 가지고 있었거나 또는 테스트-항원(들)에 면역학적 교차 반응을 발생시키는 다른 항원을 이전에 가지고 있었는지를 결정하는 단계
    를 포함하는 면역학적 방법.
  2. a) 테스트-항원이 PPD가 아닌 조건 하에 적어도 하나의 테스트-항원을 가진 포유동물로부터 얻어진 샘플을 배양하는 단계
    b) 상기 샘플의 IP-10 레벨을 결정하는 단계
    c) 결정된 IP-10 레벨과 참고-레벨을 비교하여, 상기 포유동물이 미생물에 감염되었는지 아닌지를 결정하는 단계
    d) 결정된 IP-10 레벨이 참조-레벨 이상인 경우 상기 포유동물이 감염되었는지 아닌지를 결정하는 단계
    를 포함하는 감염 진단 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 샘플은 적어도 2개의 분획으로 분할되고,
    a) 반응 샘플을 발생시키기 위하여 테스트-항원을 가진 샘플의 제1 분획을 배양하는 단계
    b) 닐 샘플을 발생시키기 위하여 비활성 용액을 가진 샘플의 제2 분획을 배양하는 단계
    c) 두 분획에서 IP-10 레벨을 결정하는 단계
    d) 반응 샘플에서 결정된 IP-10으로부터 닐 샘플에서 결정된 IP-10 레벨을 뺌으로써 샘플의 항원-의존 IP-10 반응을 결정하는 단계
    e) 항원-의존 IP-10 반응 또는 그로부터 유래된 값과 참고-레벨 또는 그로부터 유래된 값을 비교하는 단계로,
    포유동물이 테스트-항원을 이전에 가지고 있어서 테스트-항원에 대한 면역학적 반응을 발생시켰는지 또는 항원에 대한 면역학적 교차 반응을 발생시키는 다른 항원을 이전에 가지고 있었는지를 결정하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 샘플을 3개의 분획으로 분할하고, 양성 대조구를 발생시키기 위하여 T 세포 활성제를 가진 샘플의 제3 분획을 배양하는 단계를 더 포함하는 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 닐에 더하여 참고-레벨 이상의 항원-의존 IP-10 반응은 포유동물이 활성 감염, 잠복성 감염, 근래의 감염, 및/또 는 만성 잠복성 감염을 가진다는 것을 나타내는 방법.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 감염은 미생물에 기인한 또는 기인하였던 방법.
  7. 제6항에 있어서, 미생물은 마이코박테리아(Mycobacteria), 리슈만편모충(Leishmaniasis), 클라미디아(Clamydia), 트리파노소마편모충(Tryphanosomasis) 및 주혈흡충(Schistosomiasis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 마이코박테리아는 결핵 복합균(결핵균, 소결핵균 및 마이코박테리아 아프리카눔), 및 판별 부위(RD1)가 삭제되지 않은 마이코박테리아(마이코박테리아 칸사시이, 마이코박테리아 스줄가이, 마이코박테리아 마리눔, 마이코박테리아 플라베센스, 마이코박테리아 가스트리) 또는 인간에 발병성 마이코박테리아(마이코박테리아 아비움, 나병균 또는 다른 비-결핵균)에 속하는 방법.
  9. 제7항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 마이코박테리아는 결핵균인 방법.
  10. 상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 테스트-항원은 ESAT-6, CFP-10, TB7.7, Ag 85, HSP 65, 및 RD-1 항원들로 이루어진 군으로부터 선 택되는 방법.
  11. 제7항에 있어서, 미생물은 클라미디아인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 클라미디아는 클라미디아 트라코마티스, 클라미디아성 폐렴균, 클라미디아 시타시, 클라미디아 무리다룸 및 클라미디아 수이스로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  13. 제11항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 세로바 D 추출물, 주요 외막 단백질(MOMP), 시스테인-풍부 외막 단백질(OMPs), OMP2, OMP3, 다형OMPs(POMPs), 클라미디아성 폐렴의 아데노신 디포스페이트/아데노신 트리포스페이트 전위효소, 포린 B 단백질(PorBs), 및 CT521로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  14. 제7항에 있어서, 미생물은 리슈만편모충인 방법.
  15. 제7항에 있어서, 미생물은 트리파노소마인 방법.
  16. 제7항에 있어서, 미생물은 주혈흡충인 방법.
  17. 상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 혈액으로부터 유래된 방법.
  18. 상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 항원의 자극에 대한 반응에서 MCP-1 레벨을 결정하는 단계,
    b) IP-10과 MCP-1의 결정된 레벨을 결합하는 단계, 및
    c) 결합된 참고-레벨과 상기 결합된 레벨을 비교하는 단계를 더 포함하는 방법.
  19. 상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 항원의 자극에 대한 반응에서 IL-2 레벨을 결정하는 단계,
    b) IP-10과 IL-2의 결정된 레벨을 결합하는 단계, 및
    c) 결합된 참고-레벨과 상기 결합된 레벨을 비교하는 단계를 더 포함하는 방법.
  20. 상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 항원의 자극에 대한 반응에서 INF-γ 및 선택적으로 MCP-1 및/또는 IL-2의 레벨을 결정하는 단계,
    b) IP-10과 INF-γ 및 선택적으로 MCP-1 및/또는 IL-2의 결정된 레벨을 결합하는 단계, 및
    c) 결합된 참고-레벨과 상기 결합된 레벨을 비교하는 단계를 더 포함하는 방 법.
KR1020097006853A 2006-09-05 2007-09-05 Ｉｐ-10에 기초한 면역학적 모니터링 KR101248491B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200601145 2006-09-05
DKPA200601145 2006-09-05
DKPA200700262 2007-02-20
DKPA200700262 2007-02-20
PCT/DK2007/000399 WO2008028489A2 (en) 2006-09-05 2007-09-05 Ip-i0 based immunological monitoring

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090074026A true KR20090074026A (ko) 2009-07-03
KR101248491B1 KR101248491B1 (ko) 2013-04-03

Family

ID=38716188

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097006853A KR101248491B1 (ko) 2006-09-05 2007-09-05 Ｉｐ-10에 기초한 면역학적 모니터링

Country Status (17)

Country Link
US (2) US8026076B2 (ko)
EP (4) EP2261658B1 (ko)
JP (1) JP5805368B2 (ko)
KR (1) KR101248491B1 (ko)
CN (1) CN101523217B (ko)
AT (1) ATE504000T1 (ko)
AU (1) AU2007294293B2 (ko)
BR (1) BRPI0714744B8 (ko)
CA (1) CA2662429C (ko)
DE (1) DE602007013620D1 (ko)
DK (2) DK2261658T3 (ko)
EA (1) EA020412B1 (ko)
IN (1) IN2015DN03125A (ko)
PL (1) PL2128612T3 (ko)
PT (1) PT2128612E (ko)
WO (1) WO2008028489A2 (ko)
ZA (1) ZA200902297B (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150123069A (ko) * 2014-04-24 2015-11-03 연세대학교 산학협력단 향상된 결핵 진단 방법

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0722105D0 (en) 2007-11-10 2007-12-19 Sec Dep For Environment Food A Antigens
KR20110036590A (ko) * 2008-06-25 2011-04-07 베일러 리서치 인스티튜트 결핵균 감염의 혈액 전사 시그너처
WO2010009494A1 (en) * 2008-07-25 2010-01-28 Cellestis Limited A diagnostic method
CN102246040B (zh) * 2008-12-15 2014-11-05 安特鲁姆生物技术（私人）有限公司 用于诊断结核病的方法和装置
GB0906215D0 (en) 2009-04-09 2009-05-20 Lalvani Ajit Diagnostic test
ES2413437T3 (es) * 2010-03-10 2013-07-16 Institut Pasteur HMGB1 y anticuerpos anti-HMGB1 en pacientes infectados por VIH especialmente con trastornos neurológicos
US20130078657A1 (en) * 2010-05-04 2013-03-28 Hvidovre Hospital Hyperthermia augmented in-vitro immune recognition
US20140087363A1 (en) * 2010-12-09 2014-03-27 Hvidovre Hospital Method for generating, storing, transporting, eluting and detecting clinical relevant information in plasma using filter paper
WO2012139591A1 (en) 2011-04-13 2012-10-18 Hvidovre Hospital Monitoring liver fibrosis in a hepatitis c infected patient
CN103619880A (zh) * 2011-04-29 2014-03-05 百时美施贵宝公司 Ip-10抗体剂量递增方法
CN103122033B (zh) * 2011-11-21 2015-08-19 厦门大学 一种嵌合重组抗原及其用途
US20140342936A1 (en) * 2011-12-15 2014-11-20 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and kits for diagnosing latent tuberculosis infection
WO2013168876A1 (ko) 2012-05-11 2013-11-14 가톨릭대학교 산학협력단 이식 후 면역 상태를 모니터링 하는 키트 및 이를 이용한 면역 상태의 모니터링 방법
JP6102438B2 (ja) 2012-05-30 2017-03-29 三菱化学株式会社 軸受部材、端部部材、感光体ドラムユニット、プロセスカートリッジ、及び軸受部材の製造方法
JP6020237B2 (ja) 2013-02-15 2016-11-02 三菱化学株式会社 軸受部材、端部部材、感光体ドラムユニット、及び軸受部材の製造方法
US10449228B2 (en) 2013-09-10 2019-10-22 Immusant, Inc. Dosage of a gluten peptide composition
KR101542510B1 (ko) 2014-01-15 2015-08-18 대한민국 초기 hiv-1 감염자에서 급속한 aids 질환 진행을 예측하기 위한 ip-10의 용도
CN106461675B (zh) * 2014-02-26 2019-07-12 斯坦陵布什大学 用于诊断肺结核的方法
AU2015249592A1 (en) * 2014-04-24 2016-12-15 Immusant, Inc. Use of Interleukin-2 for diagnosis of Celiac disease
EP3699930B1 (en) 2014-08-14 2024-02-07 MeMed Diagnostics Ltd. Computational analysis of biological data using manifold and a hyperplane
KR101748296B1 (ko) 2014-09-04 2017-06-19 연세대학교 산학협력단 마이코박테리움 압세수스 복합체 감염 폐질환 진단용 바이오마커 조성물
WO2016054038A1 (en) 2014-09-29 2016-04-07 Immusant, Inc. Use of hla genetic status to assess or select treatment of celiac disease
EP3221344A2 (en) 2014-11-21 2017-09-27 Immusant Inc. Peptides for use in treatment and diagnosis of type 1 diabetes
CN104897893A (zh) * 2015-06-10 2015-09-09 复旦大学附属华山医院 一种基于结核特异性il-31检测的诊断结核分枝杆菌感染的试剂盒
CN108699583B (zh) 2016-03-03 2022-11-01 米密德诊断学有限公司 用于区分细菌和病毒感染的rna决定子
EP3482200B1 (en) 2016-07-10 2022-05-04 Memed Diagnostics Ltd. Protein signatures for distinguishing between bacterial and viral infections
EP3482201B1 (en) * 2016-07-10 2022-12-14 Memed Diagnostics Ltd. Early diagnosis of infections
WO2018060998A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Memed Diagnostics Ltd. Methods of prognosis and treatment
US11353456B2 (en) 2016-09-29 2022-06-07 Memed Diagnostics Ltd. Methods of risk assessment and disease classification for appendicitis
CN108548917B (zh) * 2018-03-01 2021-07-06 广州市雷德生物科技有限公司 一种记忆性免疫细胞的检测体系及其应用
EP3899044A2 (en) 2018-12-20 2021-10-27 Mikrogen GmbH Method of detecting infection with pathogens causing tuberculosis
WO2021255237A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 Mikrogen Gmbh Method of detecting infection with pathogens causing tuberculosis
WO2022169842A1 (en) * 2021-02-02 2022-08-11 Revelation Biosciences, Inc. Rapid detection kits and methods for diagnosing infections of the respiratory tract
WO2022240887A1 (en) * 2021-05-10 2022-11-17 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Methods for detecting and staging cellular viral immune responses

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4777130A (en) * 1984-12-05 1988-10-11 Andra Biologicals Isolation of mycobacterial a 60 antigen for diagnostic purposes
CA2378763A1 (en) * 1999-07-13 2001-01-18 Statens Serum Institut Tuberculosis vaccine and diagnostics based on the mycobacterium tuberculosis esat-6 gene family
WO2002033421A1 (en) * 2000-10-18 2002-04-25 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy A novel assay for detecting immune responses involving antigen specific cytokine and/or antigen specific cytokine secreting t-cells
US20040038201A1 (en) 2002-01-22 2004-02-26 Whitehead Institute For Biomedical Research Diagnostic and therapeutic applications for biomarkers of infection
EP1575479A4 (en) * 2002-01-31 2006-10-25 Develogen Israel Ltd HSP-PEPTIDES AND ANALOGUES FOR MODULATING IMMUNE RESPONSES ON ANY PRESENTING CELLS
AU2002952548A0 (en) * 2002-11-08 2002-11-21 Cellestis Limited Diagnostic assay
WO2005012907A1 (en) * 2003-08-01 2005-02-10 Renovar, Inc. Systems and methods for characterizing kidney diseases
US7575862B2 (en) * 2003-12-09 2009-08-18 Asiagen Corporation Assay systems, kits and methods for detecting microorganisms
GB2427471B (en) 2004-03-04 2009-07-22 Laura Manuelidis Pre-symptomatic markers for diseases associated with transmissable spongiform encephalopaties
CN1989410A (zh) * 2004-05-24 2007-06-27 贝勒研究院 免疫应答评价方法
CA2478138A1 (en) 2004-08-17 2006-02-17 University Health Network Cxcl10-based diagnosis and treatment of respiratory illnesses
US7332294B2 (en) * 2004-08-17 2008-02-19 University Health Network CXCL10-based diagnosis and treatment of respiratory illnesses
CA2607581A1 (en) * 2005-05-05 2006-11-16 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Se Cretary, Department Of Health & Human Services Methods and compositions for detecting immune responses
EP1767937A1 (en) 2005-09-27 2007-03-28 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Method of diagnosis of tuberculosis related immune restoration syndrome (IRS)
BRPI0708912B8 (pt) * 2006-03-14 2021-07-27 Univ Oregon Health & Science métodos in vitro para detecção de mycobacterium tuberculosis e de células t expressando cd8 que especificamente reconhecem seq id no: 11 em um indivíduo
CN1866023B (zh) * 2006-05-25 2010-11-03 上海市肺科医院 一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150123069A (ko) * 2014-04-24 2015-11-03 연세대학교 산학협력단 향상된 결핵 진단 방법

Also Published As

Publication number Publication date
EP2059816A2 (en) 2009-05-20
DE602007013620D1 (de) 2011-05-12
BRPI0714744B1 (pt) 2018-10-16
US20120015386A1 (en) 2012-01-19
EP2261658A2 (en) 2010-12-15
EP2128612B1 (en) 2011-03-30
US8026076B2 (en) 2011-09-27
CA2662429C (en) 2016-06-28
EP2228651A1 (en) 2010-09-15
CA2662429A1 (en) 2008-03-13
BRPI0714744A8 (pt) 2016-04-05
AU2007294293A1 (en) 2008-03-13
BRPI0714744A2 (pt) 2013-05-07
EA200970246A1 (ru) 2009-10-30
ZA200902297B (en) 2015-10-28
KR101248491B1 (ko) 2013-04-03
EP2261658A3 (en) 2011-05-11
WO2008028489A3 (en) 2008-05-15
EP2128612A3 (en) 2009-12-09
IN2015DN03125A (ko) 2015-10-02
DK2128612T3 (da) 2011-07-18
PT2128612E (pt) 2011-07-06
WO2008028489A2 (en) 2008-03-13
CN101523217B (zh) 2014-03-19
JP5805368B2 (ja) 2015-11-04
EP2128612A2 (en) 2009-12-02
EA020412B1 (ru) 2014-11-28
US20100086950A1 (en) 2010-04-08
EP2261658B1 (en) 2015-01-28
JP2010502200A (ja) 2010-01-28
PL2128612T3 (pl) 2011-09-30
BRPI0714744B8 (pt) 2021-07-27
ATE504000T1 (de) 2011-04-15
CN101523217A (zh) 2009-09-02
AU2007294293B2 (en) 2013-06-27
DK2261658T3 (en) 2015-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101248491B1 (ko) Ｉｐ-10에 기초한 면역학적 모니터링
US9146236B2 (en) Methods for differentiating between disease states
JP5258584B2 (ja) 臨床的相関
AU2012244350B2 (en) Ip-10 based immunological monitoring
WO2008052566A1 (en) Ccl8 based immunological monitoring
WO2014140833A2 (en) Methods for differentiating between disease states
Smith et al. Use of the MILLIPLEX® bovine cytokine/chemokine multiplex assay to identify Mycobacterium bovis-infection biomarkers in African buffaloes (Syncerus caffer)
ES2364173T3 (es) Control inmunológico basado en ip-10.
US20130078657A1 (en) Hyperthermia augmented in-vitro immune recognition
JP5656209B2 (ja) ウシタイレリア症の病態評価を可能とする方法
KR20170071507A (ko) 펩티드 조성물 및 그의 용도
van Hooij Development of immunodiagnostic tests for leprosy: from biomarker discovery to application in endemic areas
Clarke Investigation of temporal changes in immune responses to Mycobacterium bovis in cattle and African buffaloes (Syncerus caffer).
Chiacchio New molecular diagnostic and immunological tools for tuberculosis research

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160308

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170307

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180312

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190219

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200311

Year of fee payment: 8